一种针对Her2+肿瘤的多功能融合蛋白及其应用
技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，尤其涉及一种针对Her2+肿瘤的融合蛋白及其在肿瘤
治疗中的应用。
背景技术
[0002] 肿瘤的发生是由于机
体细胞分裂过程中产生基因突变而导致细胞生长失去控制的结果。
乳腺癌是女性发病率最高的癌症(Int J Cancer.2010，127:2893–2917)，其中三分之一患者具有高表达Her2(ERBB2)表征。Her2是酪胺酸激酶家族成员之一，其高表达可以导致细胞过度生长而形成肿瘤。针对Her2的
抗体Trastuzumab是第一个批准用于治疗乳腺癌的抗体药物，能够明显增加Her2阳性患者的生存率，临床应用的有效率为11-26％。但是，即使初始阶段有效，大部分患者也会在一年内复发(Oncogene.2007，26:3637–3643)。造成对Trastuzumab耐药性的原因很多，其中肿瘤细胞通过高表达CD47来逃避免疫杀伤是原因之一。
[0003] CD47是一种多功能蛋白，与其配体共同作用可以产生一系列功能，例如促进细胞生长、迁移及防止自体免疫(Nat Med 2015，21：1122–3)，与表达在巨噬细胞和
抗原递呈细胞表面
信号调节蛋白(signal regulatory protein-α，SIRPα)的结合可以诱导免疫抑制信号，防止巨噬细胞对CD47阳性细胞的内吞(Trends Cell Biol 2001，11：130–135；Science 2000，288：2051–2054)。外周血中红细胞，血小板，淋巴细胞及干细胞广泛表达CD47，这也是以上细胞避免被巨噬细胞吞噬的主要机制(J Exp Med 2001，193：855–862；Leuk Lymphoma
2004，45：1319–1327；Cell 2009，138：271–285)。肿瘤产生免疫抑制的一种方式是通过CD47与其配体信号通路激活来抑制免疫系统对肿瘤的反应。越来越多的证据表明，CD47普遍高表达在各种实体瘤细胞表面(PNAS 2012，109：6662–6667)，而高表达CD47的实体瘤可以逃避巨噬细胞的识别和内吞，是肿瘤逃避免疫监控，进而生长和扩散的主要机理之一(Trends Immunol 2010，31：212–219)。CD47信号通路的激活也是有些抗体药物临床作用不理想的原因之一(PNAS 2011，108：18342–18347)。同时，肿瘤细胞CD47的表达量与患者生存时间成明显负相关性(Trends Cell Biol 2001，11：130–135)。现有证据表明，利用抗体阻断CD47与SIRPα的相互作用可以增加巨噬细胞对肿瘤细胞的内吞，抑制肿瘤的扩散与转移(J Clin Invest 2016，126：2610–20；PLoS ONE 10(9)：e0137345)。但是，由于抗体的亲和
力较高，利用抗体的免疫抑制作用会造成对其他表达CD47细胞的清除，例如导致红细胞缺少，造成极度贫血现象(eLife 2017；6：e18173)。由于SIRPα-CD47亲和力较弱和巨量表达CD47的细胞的存在，所以单纯利用SIRPα进行屏蔽CD47的效果也不理想。
[0004] 截止目前，单一功能针对Her2阳性肿瘤细胞的药物存在疗效低等缺点，且临床上还没有一种利用高亲和力
片段增加靶细胞周围蛋白量而达到阻断低亲和力抑制信号通路的蛋白药物。
发明内容
[0005] 为了克服
现有技术中所存在的Her2抗体药物耐药性的不足和SIRPα与CD47亲和力弱的缺点，本发明提供一种针对Her2+肿瘤细胞的融合蛋白，能增加对低亲和抑制信号通路的阻断作用，提高免疫细胞对肿瘤的吞噬，从而可以提高免疫系统对肿瘤的抑制及清除，提高临床应用的疗效。本发明合成的融合蛋白包含针对Her2的抗体部分和针对CD47的SIRPα片段。利用抗体与Her2的高亲和力识别与结合Her2阳性的肿瘤细胞，同时增加肿瘤细胞附近SIRPα蛋白量，促进低亲和力的SIRPα与CD47结合，达到屏蔽CD47信号的功能，减少因肿瘤细胞高表达CD47而产生的免疫抑制，增加免疫细胞识别与吞噬Her2阳性肿瘤细胞的功能。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种针对Her2+肿瘤的多功能融合蛋白，其包括识别肿瘤抗原Her2的抗体功能区、屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白的SIRPα胞外功能区、结合免疫细胞Fc受体的功能区以及用于连接功能区的非功能性
氨基酸片段。上述三个功能区通过非功能性氨基酸片段连接，从而避免各个功能区的蛋白折叠与功能相互干扰，能同时与肿瘤免疫抑制蛋白CD47和抗原Her2结合，促进与免疫细胞结合后引起的NK细胞(ADCC)和巨噬细胞(ADCP)对肿瘤组织的杀伤和清除，发挥融合蛋白的多功能特征。
[0008] 为了进一步优化上述多功能融合蛋白，本发明采取的技术措施还包括：
[0009] 进一步地，所述识别肿瘤抗原Her2的抗体为能够特异性识别肿瘤细胞抗原Her2的单链抗体(scFv)。
[0010] 进一步地，所述肿瘤表面免疫抑制蛋白为CD47，融合蛋白屏蔽CD47的胞外功能区为SIRPα，其免疫检查点通路是指CD47/SIRPα信号通路。此类抑制性受体CD47在肿瘤细胞表面过度表达，导致肿瘤细胞逃避免疫细胞的杀伤与清除。融合蛋白SIRPα片段部分阻断免疫细胞SIRPα与CD47的结合，进而阻断抑制性信号传递。融合蛋白抗体部分结合肿瘤细胞的Her2抗原，增加蛋白SIRPα片段在肿瘤组织周围的富集，增强对肿瘤CD47的结合与屏蔽强度。
[0011] 进一步地，所述免疫细胞的结合区为IgG1Fc，能够高亲和结合免疫细胞Fc受体。其中，通过IgG1Fc与Fc受体结合，促进肿瘤靶细胞周围的免疫细胞ADCC和ADCP反应，增强杀伤性免疫细胞对肿瘤靶细胞的杀伤效应，同时防止单靶点结合而导致的脱靶效应。
[0012] 进一步地，所述融合蛋白的功能区由氨基酸灵活片段连接，保证各个功能区的功能相对独立，连接所述融合蛋白功能区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5所示序列。
[0013] 进一步地，所述SIRPα完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：1(GenBank:BC038510.2)所示序列。
[0014] 进一步地，所述Her2抗体scFv重链完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：2(PDB:4HKZ_B)所示序列。
[0015] 进一步地，所述Her2抗体scFv轻链完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：3(PDB:4HKZ_A)所示序列。
[0016] 进一步地，所述融合蛋白中人IgG1Fc完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：4(GenBank:4X4M_A)所示序列。
[0017] 更进一步地，所述SIRPα的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示序列中的31-150位点一个或多个重复片段，或具有类似功能的突变体；所述Her2抗体scFv重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示序列中的1-119位点一个或多个重复，或具有类似功能的突变体；所述Her2抗体scFv轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示序列中的1-107位点一个或多个重复，或具有类似功能的突变体；所述IgG1Fc的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示序列中的3-219位点或具有类似功能的突变体；所述用于连接功能区的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示序列位点一个或多个重复序列。
[0018] 进一步地，所述多功能融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示序列或具有类似功能的突变体。
[0019] 上述各氨基酸的序列如下表所示：
[0020]
[0021]
[0022] 本发明的第二个目的是提供一种上述融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：
[0023] 步骤1)通过人工合成的方式合成SEQ ID NO：6所示氨基酸序列相对应的
碱基，组成融合蛋白构造基因；
[0024] 步骤2)将步骤1)所述的融合蛋白构造基因转入
哺乳动物表达载体，并
转染至仓鼠卵巢细胞(CHO)进行蛋白表达；
[0025] 步骤3)将步骤2)所述的仓鼠卵巢细胞放置在孵箱中培养一段时间，取上清液，通过层析纯化后制得重组融合蛋白。
[0026] 为了进一步优化上述多功能融合蛋白的制备防范，本发明采取的技术措施还包括：进一步地，所述融合蛋白构造基因的构建步骤包括：根据SIRPα、抗Her2的scFv和IgG1Fc的功能区氨基酸相对应的碱基，通过基因合成与非功能氨基酸片段碱基连接成多功能融合蛋白构造基因；
[0027] 进一步地，所述哺乳动物表达载体为真核动物表达载体pCDNA3.1(-)。
[0028] 进一步地，所述步骤3)的具体操作如下：转染的仓鼠卵巢细胞细胞置于37℃、5％CO2孵箱中培养，96小时后取上清液，通过ProteinA亲和层析纯化，获得多功能重组融合蛋白。
[0029] 本发明的第三个目的是提供上述多功能融合蛋白的制备工艺，从而用于治疗表达CD47和高表达Her2的肿瘤临床应用。
[0030] 进一步地，所述应用为融合蛋白的单独应用或与化疗、靶向药物、抗体药物、细胞治疗组成的联合应用，以用于制备治疗表达Her2肿瘤而引起的
疾病的药物。
[0031] 进一步地，所述疾病包括所有具有高表达Her2抗原的实体瘤。
[0032] 进一步地，所述癌症包括乳腺癌，胃癌，软巢癌等。
[0033] 与现有技术相比，本发明所述的融合蛋白具有以下有益效果：本发明所制得的多功能融合蛋白，利用高亲和力的抗Her2scFv部分结合肿瘤细胞，造成在肿瘤微环境中进行SIRPα蛋白富集，增强低亲和力的CD47与SIRPα结合，阻断抑制性信号通路，增加依赖抗体Fc信号产生的免疫细胞吞噬肿瘤靶细胞的功能。
[0034] 本发明所述的融合蛋白能够满足肿瘤患者免疫治疗的需要，该重组融合蛋白既能识别Her2阳性的肿瘤细胞，又能屏蔽CD47免疫抑制信号通路，同时高亲和力的Fc部分可以增加免疫细胞对肿瘤细胞的免疫反应；由此临床应用可以增强抑制肿瘤生长的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
附图说明
[0035] 图1为本发明一
实施例中制备的重组融合蛋白凝胶
电泳分析图。
[0036] 图2为本发明一实施例中检测SK-BR-3细胞株表达Her2和CD47的流式细胞图(红色----对照抗体，蓝色----Her2或CD47抗体)。
[0037] 图3为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白对SK-BR-3细胞株的亲合浓度梯度曲线图。
[0038] 图4为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白对SK-BR-3细胞株CD47屏蔽浓度梯度实验结果。
[0039] 图5为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白促进免疫细胞对SK-BR-3肿瘤细胞体外吞噬试验结果图。
具体实施方式
[0040] 本发明提供了一种针对Her2+肿瘤的多功能融合蛋白，其包括识别肿瘤抗原Her2的抗体功能区、屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白的胞外功能区、结合免疫细胞的功能区以及用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段；其中，所述识别肿瘤抗原的抗体为针对Her2的单链抗体可变区scFv；所述肿瘤免疫抑制蛋白为CD47，屏蔽CD47的融合蛋白功能区为SIRPα；所述免疫细胞的结合区为IgG1Fc片段。本发明还提供了上述融合蛋白的制备方法及其在制备治疗表达CD47和高表达Her2肿瘤而引起疾病的药物应用。本发明所述的多功能融合蛋白，包含两个靶向性识别肿瘤细胞的功能区和一个与免疫细胞结合的功能区，功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接，通过哺乳动物细胞表达的方式生产纯化进行融合蛋白的制备。
[0041] 下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0042] 实施例1
[0043] 本实施例为重组融合蛋白的基因构建和生产纯化。
[0044] 根据人SIRPα、抗Her2scFv和IgG1Fc的功能区氨基酸(SEQ ID NO：1所示序列中的31-150位点、SEQ ID NO：2所示序列中的1-119位点、SEQ ID NO：3所示序列中的1-107位点、SEQ ID NO：4所示序列中的3-219位点相对应的碱基，通过基因合成与非功能氨基酸灵活片段(SEQ ID NO：5所示序列或其重复序列)碱基连接成多功能融合蛋白(SEQ ID NO：6)基因，通过酶切和进一步克隆，然后转入真核动物表达载体pcDNA3.1(-)。最后将含有融合蛋白基因的载体转染入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中。转染的细胞置于37℃、5％CO2孵箱中培养，96小时后取上清液，进一步通过ProteinA亲和层析纯化。最后纯化的蛋白为多功能重组融合蛋白。纯化的蛋白经过电泳检测确认分子量，证明依据本发明设计的重组融合蛋白可以通过CHO细胞生产和纯化。最后用分光光度计测试蛋白浓度，稀释后保存在PBS中，用作进一步体内外的活性测试及功能研究。图1中所示是利用凝胶电泳测试纯化后蛋白的结果，表明融合蛋白分子量符合设计的理论预期和生产纯化的可行性。
[0045] 用针对人Her2和CD47的抗体对乳腺肿瘤肿瘤细胞株SK-BR-3
染色后，用流式细胞仪验证其高表达Her2和CD47(图2)。
[0046] 实施例2
[0047] 本实施例为多功能重组融合蛋白对Her2阳性肿瘤细胞亲和试验。
[0048] 蛋白对Her2+细胞的亲和曲线测定：取Her2阳性的SK-BR-3肿瘤细胞，每孔1×104细胞在0.1ml的PBS置于96孔板，加入不同浓度PE标记的融合蛋白，混匀后置于室温0.5小时。细胞收集后用PBS洗涤一次，最后用流式细胞仪进行PE
荧光的测定和数据分析。图3中显示，对于Her2阳性细胞，PE的荧
光信号(MFI)与融合蛋白浓度成正相关。此实施例证明，融合蛋白可以结合Her2阳性的肿瘤细胞，证明融合蛋白对Her2有良好的靶向性。
[0049] 实施例3
[0050] 本实施例为多功能重组融合蛋白对CD47信号通路的屏蔽作用。
[0051] 将稀释在100μl PBS中1×104Her2阳性SK-BR-3细胞转移到96孔板中，然后分别加入不同浓度的融合蛋白，室温下放置20分钟，洗涤一次后加入APC标记的抗人CD47流式抗体染色，室温放置15分钟，洗涤后用流式细胞仪进行测定APC荧光信号和数据分析。图4中所示为流式分析的CD47抗体与Her2阳性细胞结合的信号强度(APC荧光强度)。图中可以看出，200ng/ml的融合蛋白几乎完全屏蔽了CD47与抗体的结合，既本发明的融合蛋白能完全屏蔽了CD47信号通路，达到本实施例设计的目的。
[0052] 实施例4
[0053] 本实施例为多功能重组融合蛋白对Her2阳性细胞被吞噬的促进作用。
[0054] 在含有1×105PBMC细胞的100μl Xvivo-15培养基中，在37℃
培养箱中孵育2小时，去除未贴壁细胞，然后加入100μl DMEM培养基中CFSE标记的2×105Her2阳性的肿瘤细胞。加入蛋白至终浓度为5μg/ml作为融合蛋白组，未有融合蛋白的孔作为对照组。继续培养4小时后加入抗CD14抗体染色20分钟，洗涤一次后收集细胞，然后用流式细胞仪进行分析。图5中表示，CD14+CFSE代表吞噬肿瘤细胞的单核细胞。与对照组相比，融合蛋白处理明显增加CD14+对肿瘤细胞的吞噬(37.4％vs 4.81％)。
[0055] 本实施例为多功能重组融合蛋白在治疗因Her2突变肿瘤产生的促进作用。上述多功能重组融合蛋白可单独应用或与化疗，靶向药物，抗体药物，细胞治疗组成联合应用。
[0056] 由上述实施例可知，本发明所述的多功能重组融合蛋白，既能识别Her2阳性的肿瘤细胞，又能屏蔽肿瘤细胞表面的CD47抑制信号，增加免疫细胞对抗原阳性细胞的吞噬性杀伤。由于肿瘤的发生与扩散是肿瘤细胞通过高表达CD47而产生的免疫逃逸的结果，而融合蛋白既可以阻断肿瘤的免疫抑制通路，又可以促使免疫细胞对肿瘤的杀伤。因此，上述融合蛋白的临床应用可以增强对肿瘤的抑制，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
[0057] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何根据本发明原理进行
修改和替代也可以达到同样效果。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
