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生物靶标与固相酰脲的选择性结合

阅读：0发布：2023-08-14

专利汇可以提供生物靶标与固相酰脲的选择性结合专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种从样品选择性地分离生物靶标的方法，所述样品包括生物靶标材料或疑似包括生物靶标，所述方法包括以下步骤：(i)提供在其表面处包括酰脲部分的固体，(ii)使所述样品与所述固体接触，由此使所述样品中的大部分生物靶标结合所述酰脲部分，和(iii)将所述固体与所述样品分离。，下面是生物靶标与固相酰脲的选择性结合专利的具体信息内容。

权利要求

1.从样品选择性地分离生物靶标的方法，所述样品包含生物靶标材料或疑似包含所述生物靶标，所述方法包括下述步骤：(i)提供在其表面处包含酰脲部分的固体；(ii)使所述样品与所述固体接触，由此使所述样品中的大部分生物靶标结合所述酰脲部分；和(iii)将所述固体与所述样品分离，其中所述酰脲部分存在于尿囊素上，且其中所述尿囊素是在水性液体中，且通过以过饱和浓度存在而呈固体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物靶标具有在选自以下的范围内的大小：
(1)10nm至200nm，(2)200nm至1微米，(3)1微米至20微米，和(4)20微米或更大。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物靶标是具有在以下范围内的分子量的大生物靶标：(1)100千道尔顿至500千道尔顿，(2)500千道尔顿至100万道尔顿，(3)100万道尔顿至1000万道尔顿，和(4)1000万道尔顿或更大。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物靶标是细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞包含选自以下的一种：(i)哺乳动物细胞，(ii)昆虫细胞，(iii)酵母细胞和(iv)细菌细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物靶标包含细胞的亚结构。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞的亚结构包含选自以下的一种：(i)细胞器，(ii)包涵体和(iii)内毒素。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞的亚结构包含选自以下的细胞器：(i)外泌体，(ii)核糖体，(iii)线粒体和(iv)叶绿体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中至少50％的所述生物靶标结合所述尿囊素。
10.根据权利要求9所述的方法，其中至少75％的所述生物靶标结合所述尿囊素。
11.根据权利要求9所述的方法，其中至少90％的所述生物靶标结合所述尿囊素。
12.根据权利要求9所述的方法，其中至少95％的所述生物靶标结合所述尿囊素。
13.根据权利要求9所述的方法，其中至少99％的所述生物靶标结合所述尿囊素。
14.根据权利要求9所述的方法，其中基本上所有的所述生物靶标结合所述尿囊素。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述尿囊素呈粉末形式。
16.根据权利要求1所述的方法，其中通过过滤或沉降，将与所述固体结合的生物靶标与所述样品分离。
17.根据权利要求16所述的方法，其中如下洗涤所述生物靶标：将它重新悬浮于清洁缓冲液中，然后通过沉降或过滤回收所述固体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述清洁缓冲液包含处于饱和或接近饱和的尿囊素。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中洗涤步骤可以重复一次或多次。
20.根据权利要求16所述的方法，其中通过溶解所述尿囊素的至少一些，将所述生物靶标与所述尿囊素的至少一些分离。
21.根据权利要求20所述的方法，其中随后通过渗滤来浓缩所述生物靶标。
22.根据权利要求21所述的方法，其中再溶解所述生物靶标是与渗滤同时的。
23.根据权利要求21所述的方法，其中随后通过额外的分级分离方法纯化所述生物靶标。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是液体或气体。
25.根据权利要求1或24所述的方法，其中所述样品是含有细胞的细胞培养物收获物或裂解的细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞已经预先除去。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述样品是部分地纯化的。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述样品是高度纯化的。
29.根据权利要求1或24所述的方法，其中所述样品是水性的。
30.根据权利要求1或24所述的方法，其中所述样品包含水。
31.根据权利要求1或24所述的方法，其中所述样品包含空气。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物靶标是要纯化的期望的生物靶标。
33.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物靶标是要除去的不希望的生物靶标。
34.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物靶标可以包含超过一种要除去的生物靶标。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中以在0.001-0.1％范围内的总体浓度，用一种或多种具有相同净电荷的可溶性的有机多价离子处理所述样品。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述可溶性的有机多价离子包括在0.001-0.1％范围内的浓度的、选自依沙吖啶、氯己定或辛酸的一种或多种。
37.根据权利要求33或34所述的方法，其中在期望蛋白基本上不结合固定化的有机多价离子的条件下，用在固体表面上的一种或多种具有相同或不同净电荷的固定化的有机多价离子处理所述样品。
38.根据权利要求33或34所述的方法，其中用可溶性的和固定化的有机多价离子处理所述样品，且其中至少一种固定化的有机多价离子具有与所述可溶性的有机多价离子相反的净电荷。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述固定化的有机多价离子包括相反净电荷的种类。
40.根据权利要求36所述的方法，其中至少一种有机多价阳离子包含金属亲和官能团。
41.根据权利要求36所述的方法，其中用可溶性的有机多价离子的处理首先发生，或与向可溶性的和固定化的有机多价离子的暴露基本上同时发生。
42.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在选自以下的pH值实施所述方法：(i)
7、(ii)6.5-7.5、(iii)6-8、(iv)5-9、(v)4-10和(vi)小于4。
43.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在选自以下的电导率实施所述方法：
(i)12-15mS/cm、(ii)5-20mS/cm、(iii)1-30mS/cm(iv)1-50mS/cm(v)1-100mS cm(vi)小于
1mS/cm和(vii)超过100mS/cm。
44.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中将要与所述尿囊素结合的所述生物靶标与所述尿囊素一起温育选自以下的时间段：(i)1分钟、(ii)5分钟、(iii)10分钟、(iv)15分钟、(v)30分钟、(vi)60分钟和(vii)超过60分钟。
45.根据权利要求1所述的方法，其中要与所述尿囊素结合的所述生物靶标是进行处理以将其灭活的病毒。
46.根据权利要求45所述的方法，其中病毒灭活处理是选自以下的一种：暴露于(i)pH
3-5、(ii)pH 9-11、(iii)依沙吖啶、(iv)氯己定、(v)苯扎氯铵、(vi)表面活性剂、(vii)三(正丁基)磷酸盐、(viii)亚甲蓝、(ix)聚乙烯亚胺、(x)脲、(xi)胍、(xii)辛酸、(xiii)氯化钠或(xiv)精氨酸。

说明书全文

生物靶标与固相酰脲的选择性结合

[0001] 相关申请的声明

[0002] 本申请要求2012年5月31日提交的美国临时申请号61/653,729和也在2012年5月31日提交的美国临时申请号61/653,740的优先权，其内容通过引用整体并入本文。

[0003] 领域

[0004] 本文中公开的实施方案涉及使用带有酰脲的固体表面选择性地结合独立地存在或存在于组装物中的生物靶标的方法。这样的生物靶标的尺寸可以广泛地变化，且在特定实施方案中，它们的尺寸可以包括约20微米或更多至数百万道尔顿。这样的生物靶标具体地包括细胞、细胞的亚结构、病毒和/或聚集体，其中所述方法的目的是从局部环境取出它们，可能纯化它们用于随后的应用。本文中公开的方法还可以与其它分级分离步骤组合，以实现大生物靶标的更高纯化程度，或进一步纯化已经从其中除去大生物靶标的样品的不同期望组分。

[0005] 背景

[0006] 基于涉及的功能机制，可以将沉淀方法分类成2类：沉淀和共沉淀。经典的沉淀方法经常采用大量添加剂，所述添加剂以使得要沉淀的物质不溶的方式改变溶剂的特性。所述添加剂本身可以保持可溶性，且当将上清液与沉淀物分离时会除去大部分添加剂。然后将沉淀物再悬浮于流体中，所述流体缺乏用于介导沉淀的试剂。痕量的试剂可以容易地除去，因为它们不会与要沉淀的产物形成永久结合。例子包括使用以下试剂的沉淀：盐诸如硫酸铵、柠檬酸钠和磷酸钾等；有机聚合物诸如聚乙二醇、聚丙二醇、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮等；和有机溶剂诸如丙酮、氯仿和醇等。

[0007] 共沉淀方法通常如下工作：结合要沉淀的物质，并将它的溶解度降低至其自发地形成沉淀的点。可以使用该技术选择性地沉淀具有研究或商业利益的蛋白或病毒。同样，可以使用该技术从含有目标蛋白或DNA质粒的制品中选择性地沉淀一种或多种污染物物质。从蛋白和DNA质粒制品除去的重要污染物具体地包括病毒和内毒素。与经典沉淀相比，共沉淀通常有利之处是，它经常使用较低量的沉淀剂，但是不利之处是，沉淀的产物的回收不仅采用其在没有沉淀剂存在下的再悬浮，而且可能造成对额外处理步骤的需求，所述额外处理步骤转移保持以痕量与目标产物结合的残余沉淀剂。这经常通过引入破坏产物和共沉淀剂之间的相互作用的试剂来完成。共沉淀剂的例子包括阴离子聚合物、阳离子聚合物和脂肪酸等。用于转移残余沉淀剂的物质包括高浓度的中性盐诸如氯化钠、离液剂和有机溶剂等。

[0008] 经典沉淀方法和共沉淀方法都已经用在病毒的纯化中。许多类型的化学表面具有结合病毒的能力。一些包括经过化学修饰以通过正电荷或负电荷或疏水性(诸如离子交换剂和疏水相互作用色谱介质)介导与病毒的相互作用的表面。这些材料具有合乎需要的结合不同病毒种类和相当低的成本的特性，但是也具有不希望的结合大量蛋白和需要广泛过程开发的特性。可替换地，与其它蛋白相比，抗体作为生物亲和配体在表面上的固定化可以对病毒是特异性的，且仅需要有限的过程开发，但是具有固定化的抗体的表面通常仅结合单一病毒种类，且它们相对是非常昂贵的。

[0009] 酰脲已经表现出作为在人皮肤养护产品中广泛使用的非炎性试剂或抗炎剂的活性。一个常见的例子是尿囊素，其难溶于水溶液，且在约36mM的浓度时饱和。超过该浓度的量作为晶体存在。已经将一些酰脲共价地固定化在二氧化硅颗粒上。已经证实了1-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]脲在二氧化硅上的固定化(Bicker等人.J.Chromatogr.A,1218 882-895 2011)，并且该构建体用于多种小分子化合物的亲水相互作用色谱。已经在二氧化硅上固定化了掺入脲片段的双齿烷氧基硅烷(Kotoni等人J.Chromatogr.A,1232 196-211
2012)，其也用于亲水相互作用色谱，并且被发现可用于糖的分析。已经描述了与多价阳离子组合的尿囊素用于从含有抗体的细胞培养物上清液澄清聚集体的用途
(J.Chromatogr.A,129133-40 2013)。
发明内容

[0010] 本文中公开的实施方案提供了从样品选择性地分离生物靶标的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供在其表面处具有一个或多个酰脲部分的固体；(ii)使所述样品与所述固体接触，由此使所述样品中的大部分生物靶标结合所述固体的表面上的酰脲；和(iii)将所述固体与所述样品分离。在某些实施方案中，所述生物靶标被认为是“大的”。本文中结合生物靶标使用的术语“大的”应当理解为包括单个生物靶标或具有约20微米至数百万道尔顿的聚集体大小的生物靶标组装物。示例性的生物靶标包括细胞和细胞亚结构诸如细胞器、包涵体、内毒素、聚集体和病毒。在其表面处具有一个或多个酰脲的固体具体地包括酰脲晶体或固定化在表面上的酰脲。在某些实施方案中，所述酰脲具体地包括尿囊素。

[0011] 在某些实施方案中，所述样品是局部环境，且所述方法提供了从该环境选择性地除去生物靶标的方式。在某些这样的实施方案中，所述样品是与固体材料接触的空气，所述固体材料在其表面上具有一个或多个酰脲。在一个特定实施方案中，空气传播的生物靶标是病毒或其它病原性因子，且所述酰脲是尿囊素。

[0012] 在某些实施方案中，所述样品是与固体材料接触的液体，所述固体材料在其表面上具有一个或多个酰脲。在一个这样的实施方案中，所述样品是水，所述生物靶标包括病原性微生物或其衍生的亚结构诸如内毒素，且所述酰脲是处于过饱和浓度的尿囊素。在另一个这样的实施方案中，所述样品是含有期望蛋白(诸如含有重组蛋白)的蛋白制品，且所述酰脲是处于过饱和浓度的尿囊素。在某些这样的实施方案中，所述蛋白制品可以含有细胞、细胞碎片、微生物和其亚结构，包括要从液体除去的内毒素。在某些这样的实施方案中，可以将有机多价离子与酰脲组合，以增强不希望的物质的除去。在某些这样的实施方案中，可以将用酰脲和/或有机多价离子处理过的样品与包含有机多价离子的其它固体组合，以进一步增强不希望的物质的除去。

[0013] 在某些实施方案中，可以如下从在其表面处具有一个或多个酰脲的固体回收所述生物靶标：通过溶解所述固体，或通过破坏所述靶标与所述酰脲的相互作用。在一个这样的实施方案中，所述酰脲是尿囊素。在一个这样的实施方案中，所述方法提供了从所述固体回收病毒的额外步骤，其中所述样品含有期望的要纯化的病毒。在另一个这样的实施方案中，所述方法提供了从所述固体回收胞器的额外步骤，其中所述样品含有期望的要纯化的细胞器。

[0014] 附图的简要说明

[0015] 图1显示的时程图指示了根据本文中公开的方法，高分子量聚集体的减少和宿主细胞蛋白污染物的减少。

[0016] 图2A和2B显示了根据本文中公开的方法用IgM-84抗体处理之前和之后的尺寸排阻色谱曲线。

[0017] 图3显示了根据本文中公开的方法用抗-HER2单克隆IgG抗体处理之前和之后的尺寸排阻色谱曲线。

[0018] 详细描述

[0019] 已经令人惊讶地发现，在其表面处具有一个或多个酰脲的固体会介导足够强的对生物靶标(包括大生物靶标)的亲和力，简单地通过取出所述生物靶标所结合的固体，可以从样品选择性地提取所述生物靶标。随后可以抛弃或回收所述提取的生物靶标。大生物靶标应当理解为包括单个靶标或具有20微米至数百万道尔顿(D)的聚集体大小的靶标组装物，且具体地包括细胞和细胞的亚结构(诸如细胞器)、微生物和微生物的亚结构(诸如内毒素)和聚集体。较小的生物靶标(具体地包括蛋白)可表现出对固体表面上的酰脲更低的亲和力，这会促进它们与结合至酰脲的较大靶标的分离。

[0020] 在某些实施方案中，所述生物靶标具有在选自以下的范围内的大小：(1)约10nm至约200nm，(2)约200nm至约1微米，(3)约1微米至约20微米，和(4)约20微米或更大。本领域技术人员会明白，所述生物靶标的确切大小将是靶标本身的性质的函数。在要纯化较小生物靶标的情况下，本文中公开的方法可以与其它纯化技术组合以提供期望的纯化程度。

[0021] 不受任何特定理论约束，实验数据指示，通过范德华相互作用(具体地包括氢键)可以介导尿囊素的亲和力。这样的键与大多数共价键相比在更大程度上受pH、电导率和有机修饰剂的存在影响，但是与非共价相互作用(诸如静电或疏水相互作用)相比在更低程度上受它们影响。这可以解释以下现象：在许多情况下，酰脲对特定生物靶标的亲和力几乎不受pH和盐浓度或有机修饰剂的存在的变化影响，所述变化会急剧地影响静电或疏水相互作用。但是，酰脲对给定的生物靶标的表观亲和力可以受靶标的固有溶解度(为pH或盐浓度的函数)的变化或有机修饰剂的存在的影响。

[0022] 鉴于所述结合发生在固体的酰脲表面处，显然，酰脲表面的总表面积越高，它的能力越大。因此，较小的颗粒通常会提供比类似质量的较大颗粒更高的能力，较小的晶体通常会提供比类似质量的较大晶体更高的能力，且通常有利的是使用具有最小适用尺寸的颗粒或晶体。

[0023] 在某些实施方案中，本发明提供了使用过饱和的或固定化的酰脲结合病毒和/或内毒素、同时基本上不结合蛋白的方法。术语过饱和的表示这样的情形：其中微粒、粉末状或结晶材料以特定浓度存在，在该浓度，当溶解最大量的材料时，固体物质仍然存在。

[0024] 在某些实施方案中，本发明提供了通过除去蛋白来纯化病毒的方法。在其它实施方案中，本发明提供了在除去病毒和内毒素的同时纯化蛋白的方法。在其它实施方案中，本发明提供了与从样品或局部环境除去和任选地灭活病毒联合地结合病毒的方法，诸如在从气体或液体过滤病毒的背景下，或用于清洁或保护性应用。

[0025] 在某些实施方案中，本发明提供了通过除去蛋白和其它小分子污染物来纯化细胞器的方法。细胞器的子集与固体表面上的过饱和量的酰脲(诸如尿囊素)共沉淀，诸如以细胞器所在的制品的体积的1-20％范围内的量。当用含有尿囊素的饱和溶液的缓冲液洗涤固体材料时，消除基本上未与尿囊素结合的蛋白和小分子污染物。随后通过加入缺乏尿囊素的缓冲液来溶解尿囊素，回收细胞器。可以通过超滤来浓缩纯化的细胞器。本领域技术人员显而易见，生物活性的细胞器的回收可以依赖于含有可溶解性组分的缓冲液以便保留生物活性或至少避免包含可能降低生物活性的条件和化合物。

[0026] 在某些实施方案中，本发明提供了通过除去污染性蛋白和其它小分子来纯化包涵体的方法。

[0027] 在某些实施方案中，本发明提供了通过使用酰脲共沉淀剂纯化病毒的方法，其中用不溶性酰脲共沉淀病毒，分离具有结合的期望病毒的固体材料，然后通过引入从所述酰脲解离所述病毒的竞争剂来从所述固体回收所述病毒。该方案可以受益于低溶解度酰脲(包括尿囊素和尿酸)的应用。在某些实施方案中，有利的是使用低溶解度酰脲，因为它会限制再悬浮的病毒中的残留酰脲的量。

[0028] 在某些实施方案中，本发明提供了通过使用酰脲共沉淀剂纯化病毒的方法，其中用不溶性酰脲共沉淀病毒，分离具有结合的期望病毒的固体材料，然后通过溶解酰脲(例如通过加入水或适当的不含酰脲的缓冲液)来从所述固体回收所述病毒。病毒共沉淀和回收的效力可以被环境的pH和盐浓度影响，以及所采用的酰脲的相对量影响。在与使用多价离子的共沉淀的直接对比中，增加盐浓度可以增加酰脲共沉淀的效力。在与使用多价离子(特别是更常用的多价阳离子)的共沉淀的进一步对比中，酰脲沉淀可以在酸性pH是更有效的，即使共沉淀表现出对阴离子交换剂的强结合的病毒种类。

[0029] 在某些涉及病毒回收的实施方案中，通过多种方法，例如通过超滤，与病毒浓缩一起，容易地除去通过任一个方案回收的病毒中的残留酰脲。可替换地或额外地，特别是如果需要较高的纯化程度，且因为酰脲对大多数色谱方法是惰性的，它们可以通过几乎任意色谱方法除去。由于酰脲主要是非离子的，可以将样品施加于离子交换剂，结果是，残留酰脲未结合且被洗掉，而病毒发生结合且随后洗脱在不含酰脲的含盐缓冲液中。或者，可以将所述样品施加于尺寸排阻色谱柱，在该柱上，病毒由于它的大尺寸而较早地洗脱，较好地与酰脲分离，所述酰脲因为它的小尺寸而非常晚地洗脱。或者，可以将盐加入样品中以造成病毒结合至疏水相互作用色谱柱，而酰脲流穿且从而被消除。普通技术人员会认识到，可以使用其它色谱方法或沉淀方法除去残留酰脲，同时增加病毒的纯度。这突出以下这点：如果需要的话，酰脲共沉淀可以与其它病毒纯化方法组合，以达到满足特定应用的要求所需的纯度水平。可替换地，通过膜过滤方法，使用具有允许可溶性酰脲穿过、但是保留目标生物靶标的孔径的膜，可以除去可溶性酰脲。该方案具有浓缩生物靶标的额外益处。

[0030] 在某些涉及蛋白或质粒纯化的实施方案中，本发明提供了用过饱和酰脲共沉淀病毒和内毒素的方法，因为病毒和内毒素会结合不溶性酰脲。然后可以通过过滤或离心除去不溶性的共沉淀物，将可溶性的蛋白或DNA质粒回收在上清液中。可以任选地将不溶性的共沉淀物灭菌和抛弃。使用该方案时应当稍微注意，因为尽管DNA通常似乎对酰脲(诸如尿囊素)具有低亲和力，但是通过污染物与酰脲的相互作用可以除去与污染物强烈地结合的DNA。污染物结合的DNA包括，例如，与组蛋白、核小体、其它蛋白或其它异质组装物结合的DNA。

[0031] 在某些实施方案中，本发明提供了从含有病毒或疑似含有病毒的样品选择性地分离病毒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供在其表面处具有酰脲部分的固体；(ii)使所述样品与所述固体接触，由此使所述样品中的大部分病毒结合所述固体的表面上的酰脲；和(iii)将所述固体与所述样品的液体级分分离。

[0032] 在某些实施方案中，所述样品中的至少50％、70％、80％、90％、95％或基本上所有的病毒结合所述固体的表面上的酰脲。

[0033] 在某些实施方案中，所述方法用于纯化期望的病毒，且所述样品含有期望的病毒。

[0034] 在某些实施方案中，所述酰脲是过饱和酰脲诸如尿囊素或尿酸。在某些这样的实施方案中，所述酰脲是具有大于0.56％、1％、2％、5％、10％、20％或更高的浓度的尿囊素。

[0035] 在某些实施方案中，通过所述固体的沉降或过滤，除去所述样品的液体级分。在某些实施方案中，用含有饱和的或接近饱和的尿囊素的再悬浮缓冲液洗涤从液体级分分离的固体，以稀释残留在沉淀物间隙中的流体内的污染物，然后将所述固体与液体级分分离。在某些实施方案中，使从液体级分分离的固体与足以溶解酰脲的量的再悬浮缓冲液接触。所述缓冲液可以具有不同的pH或盐浓度，其中通常选择这样的条件以有利于病毒的稳定性，且基本上不影响酰脲的溶解度。

[0036] 在某些实施方案中，所述样品含有期望的生物产物，所述病毒是污染物，且所述方法是用于纯化生物产物的方法。在某些这样的实施方案中，期望的生物产物是蛋白、DNA质粒或抗体。在某些实施方案中，所述固体是固体材料，其具有在这样的固体材料的表面上的多个酰脲部分。在某些实施方案中，所述固体酰脲是过饱和酰脲(诸如尿囊素或尿酸)的不溶性部分。在某些这样的实施方案中，所述酰脲是具有大于0.56％、1％、2％、5％、10％或20％或更高的浓度的尿囊素。在某些其它实施方案中，所述酰脲是具有大于0.0025％、
0.01％、0.1％、1％、2％、5％、10％或更高的浓度的尿酸。在某些实施方案中，所述酰脲具有大于约2倍饱和度、或大于约1％、或大于约2％、或大于约3％、或大于约5％、或大于约10％的浓度。

[0037] 在某些实施方案中，所述样品含有选自细胞、细胞亚结构、细胞碎片、聚集体和内毒素的额外污染物，且通过用固体共沉淀来减少额外污染物的量。

[0038] 在某些实施方案中，在使所述固体与所述液体级分分离的步骤之前，使所述样品与所述固体接触至少约15分钟。在某些其它实施方案中，将所述样品与所述固体温育小于15分钟或约15-30分钟，或超过30分钟或约60分钟，或超过约60分钟。作为一般规则，大多数大生物靶标与尿囊素的结合呈现为基本上瞬时的，并在比进行除去步骤更少的时间内达到完全。尽管如此，谨慎的实验室实践推荐系统地评价温育时间，并且即使证实对特定应用不具有重大影响，应当为特定应用指定和坚持一致的处理时间。

[0039] 在某些实施方案中，当所述固体接触所述样品时，所述样品具有小于约4.0、或大于约4.0且小于约7.0、或大于约7.0且小于约9.0的pH值。在某些实施方案中，可以在小于约1mS/cm、或大于约1mS/cm且小于约10mS/cm、或大于约10mS/cm且小于约25mS/cm、或大于约
25mS/cm且小于约40mS/cm、或大于约40mS/cm且小于约100mS/cm、或超过约100mS/cm的电导率施加所述固体。

[0040] 在某些实施方案中，通过沉降或过滤，可以使承载生物靶标的液体与不溶物分离。

[0041] 在某些实施方案中，本发明提供了使用具有病毒结合能力的经化学修饰的表面的方法，以便从局部环境回收病毒，诸如与从空气或液体过滤病毒相结合。从其中除去病毒的局部环境包括气体、液体和固体表面。可以将这样的环境递送至本发明的材料、与本发明的材料接触或流过本发明的材料，以便实现从这样的局部环境除去或“过滤”病毒的目的。

[0042] 酰脲代表一类包含至少一个酰脲残基的有机分子。例子包括、但不限于：脲、乙内酰脲、尿囊素、尿酸、咪唑烷基脲(1,1'-亚甲基双(3-[1-(羟甲基)-2,5-二氧代咪唑烷-4-基]脲)、双咪唑烷基脲(1,3-双(羟甲基)-1-(1,3,4-三(羟甲基)-2,5-二氧代咪唑烷-4-基)脲)、嘌呤、以及含有这些结构的衍生物和化合物构建体。为了方便本发明的实施，具有足够低溶解度的酰脲具体地包括尿囊素和尿酸。在某些情况下，高可溶性酰脲可能弱化固体表面上的酰脲与大靶标生物实体的相互作用。

[0043] 在某些这样的实施方案中，所述固体的表面另外具有多个第二化学官能团，其中所述第二化学官能团选自正电性部分、疏水部分和金属螯合部分。

[0044] 在一个或多个上述实施方案中，通过将一种或多种可溶性的有机多价离子与酰脲组合，可以为后续纯化步骤调节样品。

[0045] 在一个或多个上述实施方案中，所述可溶性的多价离子可以是正电性的。在一个这样的实施方案中，所述可溶性的正电性的多价离子可以包括选自以下的一种或多种：(i)依沙吖啶、(ii)氯己定、(iii)亚甲蓝、(iv)苯扎氯铵、(v)聚乙烯亚胺或(vi)其它正电性的多价有机离子。在一个这样的实施方案中，所述正电性的有机多价离子的浓度范围可以是0.001-0.1％。

[0046] 在一个或多个上述实施方案中，所述可溶性的有机多价离子可以是负电性的。在一个这样的实施方案中，所述可溶性的多价离子可以包括选自癸酸、辛酸或辛酸的一种或多种，其在0.01-5.0％的浓度范围内。

[0047] 在一个或多个上述实施方案中，可以如下进一步调节含有酰脲和一种或多种可溶性的有机多价离子的样品：(i)从所述样品除去固体，(ii)提供第一组分，其为具有负电性表面的第一固体基底；(iii)提供第二组分，其为具有正电性表面的第二固体基底；(iv)使所述蛋白制品与所述第一组分和第二组分接触，其中所述第一组分和第二组分被构造成使得，所述样品可以同时接触两种组分，其中操作条件基本上阻止期望的蛋白与所述第一组分或第二组分的结合；和(v)使期望的生物靶标与所述第一组分和第二组分分离。在一个这样的实施方案中，所述样品条件阻止目标生物靶标与可溶性的或固定化的离子的实质结合。在一个这样的实施方案中，基本上阻止目标生物靶标与多价离子的结合由以下步骤组成：调节盐浓度，或调节pH，或加入有机修饰剂以有效地阻断生物靶标与多价离子的实质结合。

[0048] 在一个或多个上述实施方案中，可以如下进一步调节含有酰脲和一种或多种可溶性的有机多价离子的样品：(i)从所述样品除去固体，(ii)使所述样品与至少一个固体表面接触，所述固体表面包含至少一种表面结合的能够结合金属的配体，其中所述表面结合的能够结合金属的配体最初基本上不具有金属，其中选择操作条件以基本上阻止期望的蛋白与至少一个固体表面的结合，和(iii)将所述样品与至少一种表面结合的配体分离；其中当存在超过一种表面结合的配体时，每种表面结合的配体独立地具有相同电荷或电荷中性。在一个这样的实施方案中，所述样品条件阻止目标生物靶标与可溶性的或固定化的离子的实质结合。在一个这样的实施方案中，基本上阻止目标生物靶标与多价离子的结合由以下步骤组成：调节盐浓度，或调节pH，或加入有机修饰剂以有效地阻断生物靶标与多价离子的实质结合。

[0049] 在一个或多个上述实施方案中，调节蛋白制品包括前述调节规程或其部分的任意组合。

[0050] 在一个或多个上述实施方案中，调节样品包括：在使期望的蛋白基本上不结合一种或多种可溶性的多价有机离子且基本上不被一种或多种可溶性的多价有机离子沉淀的条件下，以在约0.001％至约0.1％(重量/体积)范围内的总体浓度，用一种或多种具有相同净电荷类型的可溶性的有机多价离子处理蛋白制品。

[0051] 在一个或多个上述实施方案中，调节样品包括：在使期望的蛋白基本上不结合固定化的有机多价离子的条件下，用一种或多种具有相同或不同净电荷的固定化的有机多价离子处理所述样品。

[0052] 在一个或多个上述实施方案中，至少一种可溶性的或固定化的有机多价阳离子包含金属亲和官能团。

[0053] 在一个或多个上述实施方案中，通过增加电导率、改变pH、添加阻断性的有机添加剂或它们的组合，阻止期望的蛋白与一种或多种可溶性的有机多价离子的结合和沉淀。

[0054] 定义

[0055] 定义术语以便可以更容易地理解本发明。在详细描述中阐述了其它定义。

[0056] “内毒素”表示存在于革兰氏阴性菌外膜中的有毒的热稳定的脂多糖物质，其在细胞裂解后从所述细胞释放。内毒素通常是酸性的(由于它们的高磷酸和羧基残基含量)和高疏水的(由于脂质-A区域的脂肪酸含量)。各种内毒素分子的分子量可以低至10,000D或更小，但是它们通常在有强去污剂存在下和没有金属离子存在下以该形式存在。在生物溶液中，它们通常作为呈不同物理构象的大聚集体存在，所述大聚集体具有高达10,000,000D以上的分子量。已知一些这样的聚集体具有1000nm(1微米)或更大的物理尺寸，且可以被构造为具有金属离子和给它们赋予扩大的尺寸的其它样品组分的胶束、带、片和复杂组装物。

[0057] “多核苷酸”表示由在链中共价地键合的多个核苷酸单体组成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的例子。“DNA质粒”表示DNA的闭环双链单元，其具有独立于染色体DNA而在细胞内复制的能力。

[0058] “蛋白”表示一组复杂有机大分子中的任一种，所述复杂有机大分子含有碳、氢、氧、氮，且经常含有硫，并且主要由通过肽键连接的一条或多条氨基酸链组成。蛋白可以具有天然来源或重组来源。可以用非氨基酸部分修饰蛋白，诸如通过糖基化、聚乙二醇化或缀合其它化学部分。蛋白的例子包括、但不限于抗体、凝固因子、酶和肽激素。

[0059] “过饱和酰脲”表示混悬液，其含有在特定制剂的流行条件下超过酰脲的最大溶解度的量的酰脲。在某些实施方案中，本发明提供了一种含有酰脲的样品，所述酰脲以大于这样的酰脲在这样的样品的特定条件下在这样的样品中的溶解度的量存在，使得这样的酰脲的一些级分以未溶解形式存在于所述样品中。

[0060] “酰脲”表示具有天然或合成来源的环状或无环有机分子，其包含一个或多个酰脲部分或其衍生物。在某些实施方案中，本发明提供了酰脲诸如尿素、尿酸、乙内酰脲、尿囊素(CAS号97-59-6；铝克洛沙、尿囊素铝、尿囊素、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙醛酰基酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲、咪唑烷基脲(1,1'-亚甲基双(3-[1-(羟甲基)-2,5-二氧代咪唑烷-4-基]脲)、双咪唑烷基脲(1,3-双(羟甲基)-1-(1,3,4-三(羟甲基)-2,5-二氧代咪唑烷-4-基)脲)、嘌呤、及其衍生物。在某些实施方案中，本发明提供了式R-CO-NH-CO-NH2或RCO-NH-CO-NH-CO-R'或R'R″NH-CO-NR″'R″″的有机分子，其中有关的“R-基团”可以是H或任意有机部分。

[0061] “病毒”或“病毒粒子”表示超显微的(直径约20-300nm)、代谢惰性的感染性病原体，其在活宿主(主要是细菌、植物和动物)的细胞内复制，由以下部分组成：RNA或DNA核心、蛋白外壳以及在更复杂的类型中的外包膜。例子包括、但不限于：dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒、(+)ssRNA病毒、(-)ssRNA病毒、ssRNA RT病毒和dsDNA-RT病毒；腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、细小病毒、里奥病毒、诺如病毒、小RNA病毒、披膜病毒、正粘病毒、弹状病毒、逆转录病毒、嗜肝性DNA病毒、乳头状瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒和噬菌体。术语病毒应理解为包括用作基因治疗的载体、用作疫苗和作为抗生素替代品的病毒颗粒。其还应被理解为包括所谓的假病毒粒子，其可以被描述为已经经过重组修饰以保留它们的产生保护性免疫的能力、同时消除它们的造成感染的能力的病毒颗粒。

[0062] “有机多价离子”表示具有天然或合成来源的有机分子、离子或盐，其具有至少一个电荷和至少一个额外化学官能团，从而使它成为多价的。在某些实施方案中，有机多价离子(至少一个额外化学官能团)是额外的电荷，使得所述有机多价离子带有2个或更多个类似或不同的电荷。所述有机多价离子可以带有净正电荷、净负电荷或净中性电荷。在所述有机多价离子是净正电荷的情况下，它可以与阴离子一起提供，所述阴离子是诸如氯离子、溴离子、硫酸根、有机酸根、乳酸根、葡萄糖酸根和与所述方法相容的任意其它阴离子。在某些实施方案中，有机多价离子的某些正电荷由胺、亚胺或其它氮部分供给。所述有机多价离子可以另外具有混合的化学特性，且包括疏水残基、其它功能部分，和/或它可以具有参与其它类型的化学相互作用的能力，包括、例如，参与氢键、疏水相互作用、π-π键合、金属配位和插入的能力。在某些实施方案中，带正电荷的有机多价离子的例子包括、但不限于：二氨基酸，二肽、三肽或更大的同型肽或异型肽，诸如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸；聚乙烯亚胺；聚烯丙胺；polydimethrine、聚甲基丙烯酰氨基丙基三甲基氨；聚二烯丙基二甲基氨；聚乙烯基苄基三甲基氨；聚乙烯基胍；聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶；DEAE-葡聚糖；DEAE-纤维素；依沙吖啶(CAS号442-16-0；7-乙氧基吖啶-3,9-二胺)；三(2-氨基乙基)胺；胍；氯己定；阿来西定；citricidal、鱼精蛋白；精胺；精脒；鲑精蛋白；壳聚糖；和前述物质的变体和衍生物。例如，依沙吖啶的变体和衍生物应当理解为包括9-氨吖啶(氨吖啶)、3,6吖啶二胺(二氨基吖啶)、吖啶琐辛、吖啶氯(苯艾克坦)、吖啶橙、米帕林、乐杀螨(acricide)、吖啶酮、吖啶-9-甲酸、氯甲氧吖胺(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙基氨基)-2-丙醇二盐酸盐)、酚藏花红、吩噁嗪、吩噻嗪、吖啶黄(3,6-二氨基-10-甲基吖啶鎓氯化物和3,6-吖啶二胺)、及其盐(例如氯化物、溴化物、硫酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐)。在有机多价离子是净负电荷的情况下，它可以与阳离子一起提供，所述阳离子是诸如钠或钾或与所述方法相容的任意其它阳离子。在某些实施方案中，所述有机多价离子的某些负电荷由羧基、磷酸根或磺酸根部分供应。所述有机多价离子可以另外具有混合的化学特性，且包括疏水残基或其它功能部分，和/或它可以具有参与其它类型的化学相互作用的能力，包括、例如，参与氢键、疏水相互作用、π-π键合、金属配位和插入的能力。在某些实施方案中，带负电荷的有机多价离子的例子包括、但不限于：脂肪酸诸如癸酸、羊脂酸或辛酸、阴离子聚合物、及其盐(例如氯化物、溴化物、硫酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐)。

[0063] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法：其中酰脲共沉淀通过病毒颗粒对过饱和酰脲的化学亲和力而发生。较小的污染物诸如蛋白、核苷酸、盐、糖和其它小分子样品组分不会共沉淀，且因而保持可溶于液体中。如果需要的话，然后可以如下回收病毒产品：通过加入足够的水或适当的不含酰脲的缓冲液以再溶解过饱和酰脲，而病毒随着酰脲溶解也可以自发地恢复可溶性。可替换地，可以抛弃固体，留下含有减少量的病毒的液体。

[0064] 在本发明的某些依赖于过饱和酰脲和病毒的共沉淀的实施方案中，可以使用表现出低至中等溶解度的酰脲物质。高可溶性酰脲可能不利地需要使用非常高的酰脲总量，而接近不溶性的酰脲需要过量的水来溶解病毒所结合的过饱和酰脲。尿囊素是具有合适的溶解度特性的酰脲的一个例子。它在约36mM的浓度饱和，对应于0.56％的重量/体积(w/v)比例。作为一般规则，效力可能在较高酰脲比例(诸如1-5％，或高达10％或更高)时增加。

[0065] 尿素和乙内酰脲是具有不方便的高溶解度的酰脲的例子。乙内酰脲的溶解度是尿囊素的大致10倍，尿素的溶解度是尿囊素的约100倍。尿酸是具有过低溶解度的酰脲的一个例子，其在约0.0025％w/v饱和，这意味着，1克的溶解将需要接近40L水。

[0066] 在某些目的在于从固体回收期望的大生物靶标的实施方案中，为了给特定应用提供最好结果而定制的方法的开发开始于酰脲的选择。在某些实施方案中，水再溶解形式将是最简单的开发和操作，且通常会提供最佳的回收率。尿囊素非常适合于该形式。5-10％的量是方便的开始位置。可以评价其它酰脲，但是实验数据迄今为止指示，尿囊素始终是最有效的候选物。

[0067] 在某些实施方案中，病毒与酰脲的共沉淀可受环境的pH和盐浓度影响。在一个实施方案中，所述处理发生于pH 3-9范围内的pH值和小于1至超过50mS的电导率。实验数据指示，就pH和电导率而言的变化主要源自病毒的固有溶解度的变化，且与尿囊素对病毒的亲和力无关。在确定的pH和电导率规范下，在某些实施方案中可能有利的是，确定完全沉淀病毒所需的酰脲的量。这容易通过在不同的酰脲增量时的实验来确定。几乎没有必要采用超过10％，尽管它是可能的。

[0068] 如果选择水再溶解形式用于从酰脲分离病毒，在某些实施方案中有利的是，确定支持最有效病毒沉淀的再悬浮缓冲液的pH和电导率条件。这可以用在一定范围的pH和电导率值下进行的简单实验完成。用实验设计(DoE)的统计方法，可以减少实验工作负荷。评价至少5-8的pH范围和从15mS/cm直到至少50mS/cm的电导率值。这些电导率值将生理学电导率范围对应于约半摩尔氯化钠。可以评价更低电导率值，但是可能造成对病毒样品进行稀释或缓冲液更换的额外逻辑负担。作为一般规则，应当特别注意回收的病毒的感染性。在感染性病毒的回收是所述方法的一个特定目的的情况下，应当特别地选择用于溶解尿囊素的缓冲液条件，以有利于感染性的保持。这样的条件经常是独立于本发明已知的，且可以在不降低本发明整体的效力的情况下应用。

[0069] 在某些涉及病毒纯化的实施方案中，可能合乎需要的是，通过从固体酰脲化学解离来回收病毒，因为与简单地溶解尿囊素的方案相比，这会减小要处理的液体体积。但是，这样的方案可能导致较低的回收率，并引起较高的以下风险：降低回收的病毒的感染性。鉴于酰脲的强极性性质和它们的广泛氢键合潜力，高可溶性酰脲是要考虑的合理候选物，包括尿素，或特别是与尿囊素具有更大结构相似性的酰脲，诸如咪唑烷基脲。就感染性不是纯化的病毒的一种必要特性而言，可能不关心它的损失。在任一种情况下，将需要实验来确定解离剂的适当浓度。本领域普通技术人员会明白，也可能进行包括溶解尿囊素和使用解离剂的回收策略。

[0070] 在某些涉及蛋白纯化和/或病毒除去的实施方案中，为特定应用定制方法的方便起始点是，简单地将5％的选择的酰脲加入样品中，温育15分钟或更久，除去沉淀物，然后针对目标蛋白或质粒的回收率以及病毒的量和/或内毒素含量来评价上清液。可以用后续系列实验进一步评价方法条件，在所述实验中，可以改变酰脲的量、pH和电导率。通过应用实验设计的统计方法，可以减少实验的总数。实验数据指示，结合动力学如此快，以致于使得长温育是不必要的。得自长于15分钟的温育的结果没有指示病毒或内毒素的除去的显著改善。尽管如此，可以容易地评价该参数，以确保为特定应用记录足够的结合间隔。在目的在于在低pH增强病毒除去以及病毒灭活的效力的那些实施方案中，合适条件的评价可能有利地聚焦于靶标的本性和酰脲的量，在以前建立的低pH条件应用。

[0071] 在某些涉及蛋白或质粒纯化和病毒除去的实施方案中，本发明提供了以下优点：残留酰脲似乎对大多数色谱法表面是惰性的，且因此可以如下容易地除去：使目标蛋白或质粒与色谱法支持物结合，并允许酰脲流穿。选择适合于特定蛋白或质粒的方法，是在普通技术人员的权限内。适合于纯化IgG的一个一般实例是，应用本发明，随后从蛋白A柱洗脱IgG，在适合于通过低pH灭活病毒的条件下加入尿囊素，温育，除去不溶性的尿囊素，然后调节样品条件，并将样品施加于阳离子交换柱，由此结合IgG。用平衡缓冲液洗涤会除去痕量水平的尿囊素，然后象通常那样洗脱IgG。适合于纯化DNA质粒的另一个一般实例是，将所述质粒结合至阴离子交换柱或羟磷灰石柱。用过量酰脲洗掉，然后分别用NaCl或磷酸盐洗脱，以得到不含酰脲的质粒。

[0072] 在某些涉及蛋白或质粒纯化的实施方案中，可以与低pH的病毒灭活结合地施用所述方法，以实现比单独任一种方法更有效的病毒减少。根据需要，可以将酰脲共沉淀与其它蛋白或质粒纯化方法组合，以达到满足特定应用的需要所需的纯度水平。可溶性的尿囊素和尿酸对大多数色谱法表面是基本上惰性的，这意味着，它们可以如下容易地消除：使目标蛋白与色谱法支持物结合，并允许酰脲流穿所述柱。实验数据指示，在第一色谱法步骤(诸如阳离子交换色谱法步骤或亲和色谱法步骤)中减少了超过99％的可溶性的残留酰脲，且酰脲含量在第二色谱法步骤(诸如阴离子交换或羟磷灰石色谱法步骤)以后降低至可检测水平以下。

[0073] 在某些实施方案中，以相同方式，或通过在基于沉淀的方法领域中独有的机制，可以处理被捕获在过饱和酰脲上的病毒产品。例如，使病毒结合至过饱和的尿囊素，与上清液一起除去蛋白污染物，然后如下回收病毒：简单地加入水来溶解尿囊素，由此释放出病毒。现在可溶性的尿囊素然后可以通过简单超滤或其它方式除去。

[0074] 本发明的某些实施方案提供了以下优点：沉淀方法可以基于沉淀剂的过饱和水平，但是不基于这样的试剂的溶解度水平。例如，可溶性的尿囊素对病毒溶解度不具有实际影响，而过饱和的尿囊素会共沉淀病毒。因而，随后通过简单地加入水来溶解带有结合的病毒的以前过饱和的尿囊素，会从新溶解的尿囊素释放病毒。实验数据指示，酰脲(包括尿囊素)的结合病毒、但是不结合蛋白的能力，将尺寸组分反映为它的选择性。这又指示，酰脲修饰的表面会提供平行能力来净化其它种类的微生物，并潜在地灭活那些种类中的至少一些。这样的种类可以包括细菌、支原体属和原生动物。

[0075] 在某些实施方案中，过饱和的尿囊素选择性地结合大生物靶标(诸如病毒)的明显能力可以用于增强病毒的生物学功能的故意暂停，例如在目的在于灭活病毒使其丧失感染其正常宿主的能力的情况下。这样的应用包括：通过低pH处理来灭活病毒(在包括尿囊素的情况下)，或通过用有机多价阳离子(诸如依沙吖啶、亚甲蓝、苯扎氯铵、氯己定)或有机多价阴离子(诸如辛酸)处理来灭活病毒，或通过非离子型有机溶剂诸如三(正丁基)磷酸盐(可能与非离子型表面活性剂组合)，或通过独立于三(正丁基)磷酸盐的表面活性剂，或前述物质的组合来灭活病毒。尿囊素的通过氢键合发生结合的明显能力意味着，它不会干扰这些灭活处理，并且它本身不被这些灭活处理干扰。除了所述具体灭活方法以外且独立于所述具体灭活方法，过饱和的尿囊素的结合病毒并由此从样品物理地除去所述病毒的能力，应当理解为直接促进来自给定样品的感染性病毒的总体减少。

[0076] 在某些实施方案中，与表面结合的不溶性酰脲可以结合内毒素，但是奇怪地几乎不表现出结合DNA的能力。这会扩展这样的实施方案从蛋白制品和/或含有DNA质粒的制品除去内毒素和/或病毒的潜在效用。在DNA存在于与其它样品组分形成的稳定复合物中的其它实施方案中，通过除去所述DNA所结合的复合物，尿囊素具有除去DNA的作用。

[0077] 在某些实施方案中，提供了试剂盒，其用于方便地实施本文中公开的任意方法。这样的试剂盒可以包括试剂和一套关于实施所述方法的普通说明书。除了试剂盒以外，本领域技术人员会认识到，本文中公开的方法可以定制成用在不同的应用中，诸如在抗病毒和/或抗微生物呼吸过滤器、面罩、水的紧急解毒系统等当中。

[0078] 应当理解，前述的一般描述和下述的详细描述都仅仅是示例性的和解释性的，并且不限制要求保护的发明。实施例

[0079] 下述实施例解释了这样的方法：通过所述方法，可以实施本发明的各方面，或可以制备适合于实施本发明的某些实施方案的材料。

[0080] 实施例1.通过用尿囊素共沉淀来纯化病毒，即噬菌体M13。通过以7％的重量/体积比加入尿囊素，共沉淀噬菌体细胞培养物上清液。pH为约7.0。电导率为20mS。通过将尿囊素溶解在50mM Hepes、150mM NaCl(pH 7.0)中，回收病毒。噬菌体回收率为约70％。与上清液一起消除了大于99％的蛋白和小分子污染物。

[0081] 实施例2.噬菌体M13的共沉淀。在5.0、6.0的pH值和8.0％尿囊素，重复实施例1。如从上清液的除去所判断的，在2个实施例的范围内的共沉淀效率与pH反相关。

[0082] 实施例3.噬菌体M13的共沉淀。在与40、60、80和100mS/cm的电导率值对应的NaCl浓度，重复实施例1。这些盐浓度对应于约400、600、800和1000mM NaCl。如从样品除去病毒所判断的，沉淀效率与电导率直接相关。最佳共沉淀发生在400mM NaCl。这被解释为反映了病毒颗粒之间的相互静电排斥的抑制，具有支持酰脲表面上的颗粒的更高填装密度的结果。

[0083] 实施例4.噬菌体M13的共沉淀。用3％、5％和10％尿囊素，重复实施例1。如从上清液的除去所判断的，共沉淀效率与尿囊素浓度直接相关。回收率分别从约31％增加至57％、至91％。

[0084] 实施例5.噬菌体M13的共沉淀。用在400mM NaCl(pH 6.0)中的7％尿囊素沉淀噬菌体细胞培养物上清液。大多数蛋白和小分子污染物与上清液一起消除。估测的回收率超过90％。通过将尿囊素溶解在50mM Hepes(pH 7.0)中，然后通过超滤进行浓缩，回收病毒。通过分析型阴离子交换色谱法估测得自组合方法的纯度超过90％；回收率为约80％。

[0085] 实施例6.减毒的登革热病毒的共沉淀。将减毒的登革热病毒与在600mM NaCl(pH 6.0)中的7％尿囊素组合。除去上清液。通过将尿囊素溶解在50mM Hepes(pH 7.0)中，回收病毒。通过免疫测定估测的回收率为70-80％。宿主蛋白污染减少了99.3％。

[0086] 实施例7.通过加入10％的量的尿囊素，在生理条件下共沉淀含有1010个颗粒/mL的鼠细小病毒的病毒培养物。上清液的感染试验记录了99.9％的病毒除去。

[0087] 实施例8.通过加入10％的量的尿囊素，在生理条件下共沉淀含有1010个颗粒/mL的鼠白血病病毒的病毒培养物。上清液的感染试验记录了99.9％的病毒除去。

[0088] 实施例9.通过用尿囊素共沉淀从蛋白制品除去病毒。通过以5％的重量/体积比加入尿囊素，共沉淀噬菌体M13细胞培养物上清液。pH为约7.0。电导率为约15mS。在沉淀物中消除了约60％的病毒。大多数蛋白保留在上清液中。

[0089] 实施例10.减少蛋白溶液中的内毒素。将被约50EU/mL内毒素污染的、卵白蛋白在50mM磷酸盐、100mM NaCl(pH 7.2)中的样品用3％尿囊素饱和，温育15分钟，此后通过膜过滤除去沉淀物。上清液的内毒素含量减少了超过95％，达到小于2EU/mL。用10％尿囊素重复实验。内毒素减少了超过99.5％，达到小于1EU/mL。

[0090] 实施例11.使用在固体表面上的酰脲从IgG-内毒素混合物回收抗体和减少内毒素。将内毒素加入到1mg/mL的在5mM HEPES 100mM NaCl(pH 7.0)中的人IgG中至22,000EU/ml。将2％(w/v)尿囊素加入到该混合物的等分试样中，并将其在室温混合15分钟。通过离心使混悬液澄清。测量蛋白和内毒素浓度以计算抗体回收率和内毒素除去。2％(w/v)尿囊素使内毒素减少了2倍。抗体回收率未受尿囊素的量影响。在后续系列实验中，将尿囊素的量逐渐增加至高达10％。抗体回收率逐渐降低至在10％尿囊素时的约93％，而内毒素除去效率增加至约99％。这些实验说明，过量的尿囊素的使用可以导致一些蛋白的损失。在这样的情况下，本领域技术人员可以做出关于内毒素除去相对于蛋白回收率的最多产平衡的有见识的决定，并相应地调节固相酰脲的有效性。使用在约12kDa至1MDa的尺寸范围内的蛋白的额外实验指示这样的确定趋势：蛋白的损失随着蛋白尺寸增加而增加。

[0091] 实施例12.尿囊素和尿酸作为用于除去内毒素的基底的对比。将内毒素加入在5mM Hepes、100mM NaCl(pH 7.0)中的6.7mg/mL人IgG溶液至13,000EU/ml的终浓度。将1、2和4％(w/v)的尿囊素或尿酸加入该混合物的等分试样中，并将其在室温混合15分钟。作为对照，将等量的马铃薯淀粉加入各个系列中。最后，通过离心将反应混合物澄清。测量蛋白和内毒素浓度以计算抗体回收率和内毒素除去。在加入淀粉的情况下，没有内毒素减少。所有浓度的尿酸产生了4倍减少。尿囊素在实验之间使内毒素减少了5-10倍(低至高)。抗体回收率总是大于90％。除了尿酸的较差性能以外，结果不随尿酸的量而变化的事实是令人迷惑的，并且凸显了尿囊素是优选的开始酰脲。

[0092] 实施例13.通过加入尿囊素加速澄清哺乳动物细胞收获物。将尿囊素加入5L含有细胞的细胞培养物收获物(其含有IgM单克隆抗体以及常见范围的污染物)中至1％的终浓度。将容器轻轻涡旋以混合组分。尿囊素和未知细胞培养组分之间的相互作用造成该量的尿囊素完全溶解，所以加入另外的1％，使得总加入量达到2％(w/v)。再次将容器涡旋以混合组分。尽管已经观察到微粒材料在加入尿囊素之前非常缓慢地沉降且在有1％尿囊素存在下仅稍微更快，但是2％尿囊素明显地加快沉降速率，并且使细胞培养物上清液光学上澄清地闪烁。1％和2％尿囊素之间的差异被解释为以下指示：由于一些溶解物质在样品中的存在，1％尿囊素几乎完全被样品溶解。随后轻轻倒出上清液。这会非故意地再悬浮沉淀物的一部分，随后将其离心以沉淀剩余的固体。除了它的病毒和内毒素除去能力以外，这凸显了本发明的提高细胞收获物澄清质量的能力。它也凸显了用至少2％的尿囊素浓度进行初步试验的实用性。它进一步凸显了以下重点：尿囊素的溶解度可能受样品组分影响，结果是最终通过实验确定尿囊素的过饱和浓度，尽管它的已知的在水中的溶解度可能提供有用的初步指导。

[0093] 实施例14.通过加入尿囊素澄清大肠杆菌裂解物。用微流化仪在16,000x g，将20克大肠杆菌糊状物在250mL 50mM Hepes(pH 7.0)中匀浆化。然后将匀浆物在15,000x g离心1小时，以除去最大的微粒物质。这产生褐色浑浊上清液。将干燥的尿囊素直接加入上清液中至5％w/v的终浓度。将混合物涡旋约1分钟，然后使其沉降。不溶物在几分钟内沉降，剩下光学上闪烁的澄清上清液，其含有超过90％的存在于原始匀浆物中的蛋白产物。将上清液容易地穿过0.22微米膜滤器，其中在尿囊素处理之前的上清液实际上在接触后堵塞滤器。本实施例凸显了尿囊素的显著改善经处理的样品的过滤性的能力。

[0094] 实施例15.有机添加剂对尿囊素亲和步骤的影响。通过尿囊素亲和，用与0.01％依沙吖啶组合的1％尿囊素处理含有细胞的哺乳动物细胞培养物收获物(其含有单克隆IgG)。使样品(在约7.2的pH和约13.5mS的电导率，这些条件对应于所谓的生理条件)穿过用色谱介质填充的柱，所述色谱介质包括等量的金属亲和配体TREN(BioWorks TREN hi-sub)和疏水配体(Macroprep T-butyl)。在前一步骤以后的抗体回收率是99％。DNA减少了3.5log，病毒减少了4-5log。另外，经处理的样品是闪烁澄清的，具有约2.0NTU的浊度，从而指示微粒的接近完全除去。

[0095] 实施例16.遵循实施例15的形式，但是在一系列实验进程中增加尿囊素的量，包括2％、4％和8％。抗体回收率以大致线性方式与尿囊素的量成反比地下降。尽管在1％(实施例15)的回收率为99％，但是在8％的回收率为约87％。

[0096] 实施例17.通过尺寸排阻色谱法，分析了如在实施例15和16中所述处理的IgG。结果表明，聚集体含量随着尿囊素增加而大致线性下降，但是聚集体含量的下降大于在实施例16中注意到的抗体损失。在遵循实施例15的聚集体含量为约5％的情况下，它下降至在8％尿囊素时的约1.3％。膜澄清的缺乏尿囊素的细胞收获物的聚集体含量为约19％。还观察到，递增量的尿囊素优先减少较高分子量的聚集体。本实施例凸显了本发明的以下功能特征：过饱和的尿囊素优先结合较高分子量的生物靶标。它也凸显了以下重要启发观点：可以调节用于处理特定生物靶标的尿囊素的实际量，以有利于聚集体除去或抗体回收率。

[0097] 实施例18.将尿囊素和依沙吖啶加入补充了5％血清的单克隆IgM上清液中，至分别为1％(过饱和)和0.02％的终浓度。通过离心使上清液澄清，然后流过填充的色谱床(20mL上清液/mL填充的床)，所述床包含多微孔的和大孔的正电性的和负电性的介质+等体积的多微孔亲脂颗粒的组合：QAE Sephadex A-25、SP Sephadex C-25、Nuvia Q、Nuvia S和Sephadex LH-20。然后将IgM捕获在阳离子交换剂上。经两步法的IgM回收率为80％，且通过分析SEC确认纯度超过90％，没有明显的聚集体。

[0098] 实施例19.将1升含有单克隆IgG的细胞培养物上清液用1％尿囊素和0.02％依沙吖啶处理15分钟。将黄色沉淀物通过膜过滤除去，并将光学上闪烁的澄清亮黄色滤液施加于10mL柱，所述柱填充了Chelex 100和Macroprep High Q的等量混合物。然后将经处理的材料施加于蛋白A柱至20mg/mL的负载，洗涤10个柱体积，并洗脱IgG。洗脱的IgG与从加载未经处理的细胞培养物上清液的蛋白A洗脱的抗体相比，含有少大致80倍的宿主细胞蛋白污染物：10ppm相对于800ppm。这些结果特别凸显了本发明的除去污染物的能力，所述污染物不可通过下游纯化方法有效地除去。建立平行实验来确定加载了经处理的样品和未经处理的样品的蛋白A柱的动态结合能力。在加载了经处理的样品的柱上的动态能力比加载了未处理的样品的柱高约20％：35mg/mL相对于28mg/mL。这些结果特别凸显了本发明的除去污染物的能力，所述污染物直接干扰下游纯化方法的功能。

[0099] 实施例20.将带负电荷的金属螯合苯乙烯二乙烯基苯颗粒(Chelex100)、带正电荷的聚甲基丙烯酸酯多孔颗粒Macroprep High-Q和带负电荷的聚甲基丙烯酸酯颗粒(MacroPrep High-S)的等量混合物与IgM-529(其预先已经用NaCl处理至20mS/cm的最终电导率)、1％尿囊素和0.025％依沙吖啶的样品混合。颗粒与样品的体积比为1:20。在10分钟、20分钟、40分钟和60分钟取样，并通过微滤除去颗粒。图1显示了高分子量聚集体在所有时间点的急剧下降，但是所有聚集体随时间逐渐更大地下降，伴随着宿主细胞蛋白污染物的同样明显大幅下降。随后的分析表明，聚集体和宿主蛋白的下降反映了来自样品的染色质残余物的组合下降。在所有时间点还从样品除去了依沙吖啶。

[0100] 实施例21.图2A和2B解释了如下处理IgM-84之前和之后得到的尺寸排阻色谱法曲线：用200mM NaCl、1％尿囊素和0.025％依沙吖啶处理IgM-84，然后用与实施例7相同的介质混合物处理，但是使样品穿过这样的装置：其中将混合的介质夹在足够窄的网的纺织聚合物截留器之间以截留颗粒。与大多数较小聚集体一起，HMW聚集体被完全消除。下面的表1表明，DNA和组蛋白最初分布在所有聚集体级分中，在IgG级分中，和在所有含有蛋白的级分中。

[0101] 表1.SEC级分的IgM和污染物含量.

[0102]ElT,min [IgM] DNA大小 [DNA] [His] 254:280
9 0.31 bld 10 0.13 1.31
10 0.09 bld 10 0.11 1.30
11 0.42 bld 10 0.13 1.03
12 0.68 (150-1000) 12 0.13 0.98
13 20.29 bld 44 0.21 0.49
14 21.08 (660) 236 0.76 0.89
15 2.33 445/(660) 459 1.87 0.97
16 0.30 316/445 435 0.82 1.59
17 0.51 316 796 1.09 1.45
18 0.38 155/316 314 0.96 1.60
19 0.31 90/155 339 0.33 1.40
20 0.09 90 684 0.86 1.56
21 bld 58 123 1.33 0.90
22 bld bld 23 0.54 1.21
23 bld bld 13 bld 3.67
24 bld bld 3 bld 15.86

[0103] ElT：洗脱时间，分钟。[IgM]：浓度，微克/mL。DNA大小：以碱基对(bp)计。在括弧中的值得自在离子交换实验中检测的DNA。[DNA]浓度：ng/mL。[His]：总组蛋白浓度，微克/mL。bld：低于检测限度。

[0104] 表1也解释了DNA的尺寸分布，其导致以下意外发现：一些聚集体群体除了包括DNA和组蛋白以外还包括含有不同数目的核小体的核小体阵列。得自该处理的IgM的回收率为98％。

[0105] 实施例22.图3解释了在抗-HER2单克隆IgG抗体的实施例19的相同操作之前和之后的尺寸排阻色谱法曲线。结果属于相同种类，但是在程度上提高，可能至少部分地因为抗体的浓度高了约10倍。

[0106] 实施例23.如下处理1L细胞培养物收获物：加入1％尿囊素和0.025％依沙吖啶，并在搅拌下温育15分钟，此后通过离心除去细胞和其它微粒。使上清液穿过含有等量被亚氨基二乙酸取代的苯乙烯二乙烯基苯颗粒、被TREN取代的琼脂糖颗粒和被丁基残基取代的丙烯酸酯颗粒的组装件，组合体积为50mL，尺寸为2.6x 10cm，和流速为25mL/min。大于12％的最初聚集体含量降低至小于0.1％。除去多余的依沙吖啶。宿主蛋白污染降低60％。通过qPCR测量的DNA减少了6log。抗体回收率为99％。

[0107] 实施例24.如下处理1L细胞培养物收获物：加入1％尿囊素和0.025％依沙吖啶，并在搅拌下温育15分钟，此后通过离心除去细胞和其它微粒。使上清液穿过含有等量被亚氨基二乙酸取代的苯乙烯二乙烯基苯颗粒、被氨基取代的苯乙烯二乙烯基苯颗粒和被丁基残基取代的丙烯酸酯颗粒的组装件，组合体积为50mL，尺寸为2.6x 10cm，和流速为25mL/min。大于12％的最初聚集体含量降低至小于0.1％。抗体回收率为95％。结果在其它方面与实施例20相同。

[0108] 实施例25.用5％尿囊素处理1mg/mL的得自鲑鱼精的纯化DNA制品。超过95％的DNA保持可溶于上清液中。这凸显了从DNA制品(诸如质粒制品)分离病毒或内毒素污染物的实用性，所述分离否则是非常困难的，因为所有3种都强烈地结合正电性表面诸如阴离子交换剂。但是，这些结果是意外的，因为得自许多先前实施例的结果表明，在含有抗体的蛋白制品中，DNA水平下降了98-99％或更高。尿囊素似乎解决了该明显的矛盾，所述尿囊素对DNA几乎不具有或根本没有固有亲和力，但是对与其它分子结合的DNA具有非常高的亲和力，具体地包括DNA-压紧蛋白或DNA与染色体亚结构(特别包括核小体和它们的原核类似物)的其它化合物结合体。这进一步凸显以下观点：用于纯化多核苷酸的应用可能具体地受益于在高盐浓度进行和/或有机调节剂的存在，所述有机调节剂破坏多核苷酸与污染物的复合物的非特异性形成。

[0109] 实施例26.在低pH增强病毒灭活。将每mL含有约1010个鼠白血病病毒颗粒的细胞培养物上清液分成10个等分试样。为了灭活病毒的目的，通过将pH降低至4，处理一半等分试样。通过相同的pH降低和10％尿囊素的添加，处理另一半。针对病毒感染性，评价代表处理1、5、10、15和60分钟的等分试样。在1分钟，没有尿囊素的灭活为1.2log，与此相比，具有尿囊素的灭活为2.4log。在5分钟，没有尿囊素的灭活为3.2log，与此相比，具有尿囊素的灭活为4.5log。在10分钟，没有尿囊素的灭活为4.3log，与此相比，具有尿囊素的灭活为5.4log。
在15分钟，没有尿囊素的灭活为5.1log，与此相比，具有尿囊素的灭活为5.6log。在60分钟，没有尿囊素的灭活为5.4log，与此相比，具有尿囊素的灭活为5.6log。由于感染性测定的灵敏度为约5.5log，除了加速灭活以外，包括尿囊素可能增加在所有时间点的灭活水平。本领域技术人员显而易见，尿囊素与其它病毒灭活方法的组合可能具有类似的增强效应。

[0110] 实施例27.过饱和的尿囊素与有机多价阴离子的组合对含有单克隆IgG的细胞培养物上清液的强化澄清。通过离心和穿过0.22微米膜的膜过滤，澄清含有细胞的收获物，然后将上清液的pH降低至6.0。用0.01％、0.05％和0.1％的量的辛酸处理不同的子样品。所有样品在处理以后是浑浊的，从而指示微粒的持续或重新形成，即使在通过离心除去沉淀物以后。在有2％尿囊素存在下，重复相同系列实验。抗体回收率和污染物减少是基本上等同的，但是经处理的材料在处理以后是闪烁澄清的。

[0111] 实施例28.在DNA质粒纯化过程中除去内毒素。将粉末状尿囊素加入含有DNA质粒的经过滤的大肠杆菌裂解物中，达到10％的终浓度。将混合物搅拌15分钟，然后通过微滤除去固体尿囊素。用尿囊素除去了96.7％的内毒素。在滤液中回收了80％的DNA质粒。本实施例解释了尿囊素对内毒素的相对较高亲和力和对DNA的低亲和力，并揭示了尿囊素是从DNA质粒制品(诸如含有DNA质粒作为基因治疗载体的那些)除去内毒素的重要工具。从在前述实施例中给出的结果，普通技术人员显而易见，就在哺乳动物细胞中生产的质粒而言，尿囊素处理会提供病毒除去的额外益处。

[0112] 本领域普通技术人员会理解如何将得自实验(诸如在以上实施例中描述的那些)的结果放大至满足它们的特定要求所需的任意体积。

[0113] 本发明可以与其它纯化方法组合以达到较高的纯化水平。例子包括、但不限于：亲和色谱法、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、固定化的金属亲和色谱法和额外的混合模式色谱法。开发适合于不同方法的条件并根据需要将它们与本文中的发明结合以达到特定抗体、蛋白、病毒、噬菌体、质粒或其它生物产物的期望纯化，是在本领域普通技术人员的权限内。另外，可以利用或改进本发明的方法用于与生物产物的纯化、诊断性和/或治疗性医疗装置、和保护个人或公众免于病毒感染所用的装置结合使用。

[0114] 本文中引用的所有参考文献都以它们的整体通过引用并入且用于所有目的，达到如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物或专利或专利申请通过引用整体并入用于所有目的的相同程度。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与在本说明书中含有的公开内容矛盾的情况下，本说明书意图替代和/或优先于任何这样的矛盾材料。

[0115] 在本说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、色谱法条件、诸如此类的所有数字，在所有情况下应理解为由术语“约”修饰。因此，除非相反说明，否则在说明书和所附的权利要求书中阐述的数字参数是近似值，所述近似值可以随本发明寻求得到的期望性能而变化。

[0116] 本领域技术人员会明白，可以做出本发明的许多修改和变化，而不背离本发明的精神和范围。本文描述的具体实施方案仅仅作为示例而提供，且无意以任何方式进行限制。说明书和实施例意图仅仅视作示例性的，本发明的真实范围和精神由下述权利要求指定。

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