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杂交瘤细胞株6B1及其分泌的抗口 蹄疫A型病毒的单克隆抗体与应用

阅读：1027发布：2020-07-21

专利汇可以提供杂交瘤细胞株6B1及其分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了杂交瘤细胞株6B1及其分泌的抗口蹄疫 A型病毒的单克隆抗体与应用，属于生物技术领域。该杂交瘤细胞株能持续、稳定分泌抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体，利用该单克隆抗体能够特异性地识别口蹄疫A型病毒多种毒株，并具有高特异性、高灵敏度的优点。基于该单克隆抗体的胶体金试纸条和测试卡以及间接ELISA法试剂盒检测口蹄疫A型病毒的抗原或抗体特异性好、灵敏度高。本发明可在口蹄疫A型病毒的检测、疫苗生产质量监控、流行病学研究中发挥重要作用，应用前景广阔。，下面是杂交瘤细胞株6B1及其分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.杂交瘤细胞株6B1，其保藏编号为：CGMCC No.17500；保藏日期为：2019年04月24日；
保藏地址为：中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，是以口蹄疫A型病毒(AF72)抗原为免疫原免疫动物获得的分泌抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株6B1 CGMCC No.17500分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体6B1anti。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体6B1anti，其特征在于，所述单克隆抗体6B1anti具有与口蹄疫A型病毒的多种毒株反应的广谱性，其中所述口蹄疫A型病毒的多种毒株包括Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII、AF72毒株。
4.一种检测口蹄疫A型病毒抗体的试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求2或3所述的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体6B1anti和用辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗猪和/或小鼠抗牛和/或小鼠抗羊的酶标抗体工作液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标板，所述酶标板为用所述单克隆抗体6B1anti包被并进一步与灭活口蹄疫A型全病毒反应后的酶标板，其中所述灭活口蹄疫A型全病毒包括毒株Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII和AF72。
6.权利要求5所述的试剂盒在检测用疫苗免疫后样本中抗口蹄疫A型病毒抗体水平中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1：向酶标板加样本反应，洗板；
S2：加酶标记抗体工作液反应，洗板；
S3：显色；
S4：终止反应；和
S5：测定OD450值。
7.一种检测口蹄疫A型病毒抗原的胶体金试纸条，其特征在于，包括：
吸水垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维素膜结合物释放垫、玻璃纤维素膜样品垫，其中所述硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)；其中所述检测线和玻璃纤维素膜结合物释放垫上包被有权利要求2或3所述的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体6B1anti。
8.一种检测口蹄疫A型病毒抗原的测试卡，其特征在于，包括：将权利要求7所述的胶体金试纸条装入塑料卡中，制成测试卡，该测试卡对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
9.权利要求7所述的胶体金试纸条或权利要求8所述的测试卡在检测含口蹄疫A型病毒疫苗或含口蹄疫A型病毒疫苗生产过程中制苗用样品中的口蹄疫A型病毒抗原水平中的应用，其特征在于，具体检测过程包括：取疫苗进行破乳后离心，取下层水相作为待检样品或取疫苗生产过程中制苗用样品作为待检样品；将待检样品滴在点样口位置，观察检测线和质控线是否出现色带来判断阴阳性，并通过仪器检测检测线颜色深浅来定量检测口蹄疫A型病毒抗原水平。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疫苗包括单价疫苗和多价疫苗，所述疫制苗用样品包括疫苗生产原料、灭活液、浓缩液，所述破乳采用正戊醇作为破乳剂，所述仪器为免疫层析分析仪。

说明书全文

杂交瘤细胞株6B1及其分泌的抗口 蹄疫A型病毒的单克隆抗体

与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域中的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用，特别是涉及杂交瘤细胞株6B1及其分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体以及该抗体在检测口蹄疫A型病毒抗体和抗原中的应用。

背景技术

[0002] 口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病，最易感染的动物是牛、猪、羊等。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的“头号杀手”。我国对口蹄疫的预防主要通过疫苗预防接种，发生口蹄疫的则被捕杀。

[0003] FMDV有7个血清型，各型之间几乎没有交叉保护力，感染了其中一型口蹄疫病毒的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病，我国主要有O型和A型口蹄疫病毒流行。市场上常见有口蹄疫O型和A型的双价疫苗在销售和使用。其中，口蹄疫疫苗中常见的A型毒株包括Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII和AF72多种毒株，不同的毒株的免疫原性和反应原性存在差异。

[0004] 疫苗接种是特异性预防FMDV的可靠和有效手段，对疫苗抗原含量的准确测量是保障疫苗安全有效的前提。口蹄疫疫苗生产企业目前常采用蔗糖密度梯度离心法测量口蹄疫病毒的蛋白含量，蔗糖密度梯度离心法根据分子大小、沉降系数将不同的物质分开，而口蹄疫病毒的大小基本一致，因此无法对多价疫苗中的某种毒株进行单独定量，沉降系数类似的杂质也难以与口蹄疫病毒区分。且蔗糖密度梯度离心法操作复杂，时间久，难以实现快速检测的目的。因此疫苗生产过程中，有快速检测的需求。对怀疑口蹄疫感染的动物常常现场采样然后送至专业实验室进行PCR检测。PCR方法需时长；并且成本高，对人员、环境和设备要求高，难以实现现场快速检测。众所周知，口蹄疫是一种感染急、传播速度快的疾病，因此如能进行现场快速检测显得非常有必要。另外病料组织的运输还可能导致潜在的生物传播风险。

[0005] CN105950563A公开了一种杂交瘤细胞株7E3及其分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体与应用，其具体涉及的单克隆抗体7E3特异性较好，但是只能够检测毒株Re-A/WH/09，而不能检测毒株AKT58、AKTIII和AF72，因此检测谱较窄。CN107541500A公开了一种A型口蹄疫病毒单克隆抗体及其应用，具体提及一种单克隆抗体2A2，是口蹄疫A型的特异性单克隆抗体，但其未提示适用于哪种A型病毒毒株(例如Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII或AF72等)，因此该单抗的检测谱不明确。且实施例显示采用ELISA方法检测病毒抗原时，该方法需要专门的仪器(酶标仪)和一定专业水平的实验人员进行操作，要求较高，时间需要2小时，同样不能满足现场快速检测的需求。

[0006] 口蹄疫疫苗免疫后评估抗体效价的水平有助于疫病的预防和控制。现在市场上最常用的是中国农业科学院兰州兽医研究所研制的系列口蹄疫抗体液相阻断ELISA 试剂盒，该方法是OIE(国际兽疫局)推荐的方法，采用了两种多抗和灭活全病毒检测血清抗体水平，操作复杂，需要3-4个小时才可以完成检测。另外一种常用试剂盒为固相竞争ELISA试剂盒，待测样品中的抗体与酶标抗体竞争结合包被抗原。韩国进口固相竞争ELISA试剂盒采用包被重组抗原配合酶标单抗检测血清抗体；一些国产固相竞争ELISA试剂盒包被全病毒抗原配合多抗或单抗检测血清抗体，例如CN107541500A公开了采用全病毒配合单抗固相竞争法原理检测血清抗体。液相阻断和固相竞争都是竞争法的一种表现形式，这些竞争法产品在抗原或抗体层面存在不同程度的缺陷，①全病毒抗原难以获得高纯度的蛋白，现有工艺水平的蛋白纯度一般在10％之下，其中90％以上是杂蛋白比如细胞碎片蛋白、培养基蛋白等，这些杂质可能都会干扰检测，影响检测的特异性和灵敏度；②基因重组抗原与全病毒相比位点较少，可能存在漏点。另外重组抗原在空间构象上、翻译后的蛋白修饰上与天然全病毒的蛋白存在差异，因此也可能会引入非特异性因素导致检测结果的异常；③采用多抗进行检测可能由于多抗的“纯度”等原因导致检测结果的异常，此处“纯度”指的是制备多抗时所采用的抗原因其纯度不足而产生较多的非目标抗体的干扰。且多抗批次变异大，不利于大批量生产。综上所述，如以高纯度的全病毒抗原配合单克隆抗体检测血清抗体，则可能获得特异性好、灵敏度高的结果，但目前难以实现。间接法是临床常用的一种免疫检测方法，常常采用包被抗原配合酶标二抗来检测待测样品中的抗体。间接法试剂因其所用的抗原和二抗常常过量，所以容易放大生产且稳定性好。竞争法为了获得理想的效果，一定要控制抗原和抗体的用量，过量会导致灵敏度低；用量不足会导致特异性变差。间接ELISA方法也面临一个高纯度全病毒抗原的问题，如抗原纯度不好，则检测结果的特异性变差。常规液相色谱法(比如分子筛、离子交换、亲和纯化等)虽然可以对全病毒进行纯化，但操作复杂、需要专门的仪器(高效液相色谱仪等)和试剂(各种纯化柱)，且在纯化过程中易导致口蹄疫全病毒的裂解。如能采取简单的方法获得高纯度的全病毒抗原，采用稳定性更好的间接ELISA方法，则会获得一种灵敏度和特异性均佳的口蹄疫全病毒抗体检测方法。

发明内容

[0007] 针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一株杂交瘤细胞株6B1，其保藏编号为：CGMCC No.17500；保藏日期为：2019年04月24日；保藏地址为：中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，是以口蹄疫A型病毒(AF72)抗原为免疫原免疫动物获得的分泌抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

[0008] 本发明另一方面提供一种由上述杂交瘤细胞株6B1CGMCC No.17500分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体6B1anti。

[0009] 上述单克隆抗体6B1anti具有与口蹄疫A型病毒的多种毒株反应的广谱性，其中所述口蹄疫A型病毒的多种毒株包括Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII、AF72毒株。

[0010] 本发明另一方面还提供一种检测口蹄疫A型病毒抗体的试剂盒，包括：

[0011] 上述抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体6B1anti和用辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗猪和/或小鼠抗牛和/或小鼠抗羊的酶标抗体工作液。

[0012] 上述试剂盒还包括酶标板，所述酶标板为用所述单克隆抗体6B1anti包被并进一步与灭活口蹄疫A型全病毒反应后的酶标板，其中所述灭活口蹄疫A型全病毒包括毒株Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII和AF72。

[0013] 上述试剂盒在检测用疫苗免疫后样本中抗口蹄疫A型病毒抗体水平中的应用也属于本发明的保护内容，包括以下步骤：

[0014] S1：向酶标板加样本反应，洗板；

[0015] S2：加酶标记抗体工作液反应，洗板；

[0016] S3：显色；

[0017] S4：终止反应；和

[0018] S5：测定OD450值。同步进行阳性质控的检测，其中阳性质控为口蹄疫A型抗体阳性的血清。

[0019] 待测样品结果判断：计算S/P值(平均抗体效价)即样本OD450/阳性质控OD450均值，若≥0.4，则判为阳性，阳性结果表示样本中检测到抗口蹄疫A型病毒抗体；否则为阴性，阴性结果表示样本中未检测到抗口蹄疫A型病毒抗体。通过对疫苗免疫后样本(例如血清)中抗口蹄疫A型病毒抗体水平的检测可用于评价疫苗质量，其中检测得到的样本OD450值越大，即S/P值越大，表明经口蹄疫A型病毒灭活疫苗免疫后样本获得的抗体水平越高，疫苗质量越高。

[0020] 本发明又一方面还提供一种检测口蹄疫A型病毒抗原的胶体金试纸条，包括：

[0021] 吸水垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维素膜结合物释放垫、玻璃纤维素膜样品垫，其中所述硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)；其中所述检测线和玻璃纤维素膜结合物释放垫上包被有上述的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体6B1anti。

[0022] 本发明又一方面还提供一种检测口蹄疫A型病毒抗原的测试卡，包括：将上述的胶体金试纸条装入塑料卡中，制成测试卡，该测试卡对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

[0023] 上述的胶体金试纸条或测试卡在检测含口蹄疫A型病毒疫苗或含口蹄疫A型病毒疫苗生产过程中制苗用样品中的口蹄疫A型病毒抗原水平中的应用也属于本发明的保护范围，具体检测过程包括：取疫苗进行破乳后离心，取下层水相作为待检样品或取疫苗生产过程中制苗用样品作为待检样品；将待检样品滴在点样口位置，观察检测线和质控线是否出现色带来判断阴阳性，并通过仪器检测检测线颜色深浅来定量检测口蹄疫A型病毒抗原水平。

[0024] 上述疫苗包括单价疫苗和多价疫苗，所述疫制苗用样品包括疫苗生产原料、灭活液、浓缩液，所述破乳采用正戊醇作为破乳剂，所述仪器为免疫层析分析仪。

[0025] 基于以上技术方案提供的杂交瘤细胞株6B1能够持续、稳定分泌抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体能够特异性地识别口蹄疫A型病毒多种毒株，包括Re-A/WH/09、AF72、AKT58、AKTIII等，而不与口蹄疫O型和亚洲1型的毒株反应(包括O/Mya98/BY/
2010、O/GX/09-7、OHM、KZ、JSL/06)。因此，基于该单克隆抗体的胶体金试纸或测试卡或组装的试纸盒能够实现快速、特异、广谱地检测口蹄疫A型病毒的多种毒株，可用于定性检测现有双价或多价疫苗产品中是否存在灭活口蹄疫A型病毒抗原，以及定量检测现有疫苗产品中或疫苗生产过程中制苗用样品中的口蹄疫A型病毒抗原水平，以对疫苗的质量进行监控检测和指导疫苗生产。基于该单克隆抗体的间接ELISA方法可实现抗口蹄疫A型全病毒抗体的特异性和高灵敏的检测，以评估使用抗口蹄疫A型病毒灭活疫苗免疫后血清中的抗体效价，对疫苗质量进行评价。因此由该杂交瘤细胞株6B1分泌得到的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体，以及基于该单克隆抗体的产品或方法能够在口蹄疫A型病毒感染的现场快速检测、疫苗生产质量控制、疫苗免疫后抗体效价的评估以及流行病学研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
附图说明

[0026] 图1为杂交瘤细胞6B1 显微镜照片；

[0027] 图2为单克隆抗体6B1anti的SDS-PAGE电泳检测结果；

[0028] 图3为单克隆抗体6B1anti的亚型鉴定结果；

[0029] 图4为胶体金试纸条结构示意图；

[0030] 图5为胶体金测试卡正面结构图；

[0031] 图6为用单克隆抗体6B1anti制备的胶体金测试卡检测口蹄疫A型病毒的灵敏度检测结果。

具体实施方式

[0032] 针对现有技术中尚未有能够抗口蹄疫A型病毒多种毒株的单克隆抗体，本发明使用可以诱发机体产生免疫反应的口蹄疫A型病毒(AF72)抗原作为免疫原免疫动物，筛选得到能持续、稳定分泌抗口蹄疫A型病毒的多种毒株的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并基于该杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体获得一种能够实现快速、特异、广谱地检测口蹄疫A型病毒的多种毒株抗原的胶体金试纸或测试卡或组装的试纸盒，以及实现口蹄疫A型全病毒抗体的特异性和高灵敏的检测的间接ELISA方法。

[0033] 本发明将通过以下具体实施方式详细说明本发明。

[0034] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。

[0035] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

[0036] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

[0037] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0038] 实施例1、杂交瘤细胞株的筛选和鉴定

[0039] 在该实施例中，杂交瘤细胞株的筛选方法包括以下步骤：

[0040] 1.1、动物免疫

[0041] 1)基础免疫：以口蹄疫A型病毒(AF72)抗原(中国兽药监察所提供)作为免疫原，以200μg/200μl与福氏完全佐剂(购自Sigma公司)混合并充分乳化，多点皮下注射乳化液，每只Balb/c小鼠(8-12周龄，雌性，SPF级动物培养，购自军事医学科学院实验动物中心)每次注射量为200μg。

[0042] 2)加强免疫：2周后加强免疫，佐剂为福氏不完全佐剂，同样以200μg/200μl进行混合，每只Balb/c小鼠(同上述步骤1))的注射量同样为200μg。再间隔2周进行第二次加强免疫。在进行细胞融合前3天，腹腔注射含200μg口蹄疫A型病毒抗原(AF72)的生理盐水溶液，以进一步增强免疫效果。

[0043] 1.2、杂交瘤细胞的制备和筛选

[0044] 用常规方法收集步骤1.1中免疫后小鼠的脾细胞，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞按10:1的比例在500g/L PEG4000(融合剂，购于Sigma公司)的诱导下进行融合。用HAT(购自Sigma公司，货号H0262)选择性培养液培养，培养条件为5％二氧化碳、37℃。融合后10-15天，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗口蹄疫A型病毒的杂交瘤细胞株，间接ELISA法的操作步骤为：用110μL浓度为1μg/mL的口蹄疫A型病毒包被板，拍干后，用1％BSA封闭液(100mL pH 7.4的10mM PBS中加入1g BSA，BSA购于Sigma公司)封闭，以免疫小鼠血清1:2000(抗体效价，下同)作为阳性对照，以无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG(购自北京博尔西科技有限公司)100μL，最后测定450nm OD值，以OD450值大于阴性对照2倍为阳性判断依据。

[0045] 对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆，具体方法是：

[0046] 1)取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液(购自Sigma公司，货号H0137)制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。

[0047] 2)用HT培养液将计数后的细胞稀释成200个/mL、40个/mL、20个/mL和10个/mL的细胞悬液。

[0048] 3)用吸管将各浓度的细胞悬液分别种入微量培养板，每孔0.05mL，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔(表示孔中可能只有1个或没有细胞)。

[0049] 4)5％CO2、饱和湿度、37℃条件下培养。

[0050] 5)每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔进行克隆繁殖，弃掉两个及两个以上和没有细胞生长的孔。

[0051] 6)克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3-1/2时，通过间接ELISA法测培养液上清抗体，选择阳性克隆，并传4-6代建成克隆株。

[0052] 1.3、杂交瘤细胞的鉴定

[0053] 重复步骤1.2，进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA法筛选，获得多株针对口蹄疫A型病毒可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，如下表1所示，分别命名为：6B1、1A9、4D11和5G3。用间接ELISA法(方法见步骤1.2)检测各杂交瘤细胞培养上清的特异性，其中仅有6B1细胞株的培养上清仅与口蹄疫A型病毒AF72毒株反应，而与口蹄疫O型和亚洲1型的毒株不反应(包括O/Mya98/XJ/2010、O/GX/09-7、OHM、KZ、JSL/06)，1A9、4D11和5G3细胞株不仅仅与口蹄疫A型病毒AF72毒株反应，还与口蹄疫O型和亚洲1型的毒株反应(见下表1)，可见6B1细胞株表现出对口蹄疫A型病毒AF72毒株较好的特异性。进一步地，用口蹄疫A型病毒不同的毒株(Re-A/WH/09、AKT58、AKTIII、AF72)检测，发现该杂交瘤细胞株6B1的培养上清均有强反应(见下表2)，显示该杂交瘤细胞株6B1在检测口蹄疫A型病毒不同毒株的广谱性。

[0054] 表1杂交瘤细胞株培养上清的特异性验证

[0055]

[0056] 表2杂交瘤细胞株6B1培养上清的广谱性验证

[0057]

[0058] 注：≥阴性对照的2倍判为阳性；否则为阴性。

[0059] 1.4、细胞培养上清抗体效价的测定：用间接ELISA法(方法见步骤1.2)检测杂交瘤细胞株6B1培养上清的抗体效价(以上清的稀释比例作为效价)，以新鲜的细胞培养液作为阴性对照，以免疫小鼠的尾血作为阳性对照。以OD450值大于阴性对照2倍为阳性判断依据，结果如下表3所示，杂交瘤细胞株6B1培养上清稀释比例为1:320时，检测到的OD450值依然是阴性对照的2倍，表明细胞上清中产生了较高的目标抗体，杂交瘤细胞株6B1培养上清的效价≥1:320。

[0060] 表3杂交瘤细胞株6B1培养上清的效价

[0061]

[0062] 1.5、杂交瘤细胞株6B1的传代培养

[0063] 将杂交瘤细胞株6B1在含有10％胎牛血清的RPMI-1640(Gibco，含有100U/mL青霉素和100μg/mL 链霉素)中继续进行培养、传代，培养到第10代后，杂交瘤细胞株6B1仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:320以上，表明获得了能够稳定传代，并可以持续、稳定分泌抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，图1示出了杂交瘤细胞株6B1经培养获得的杂交瘤细胞的显微镜照片。

[0064] 1.6、保存杂交瘤细胞

[0065] 获得持续、稳定分泌抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须保存一部分杂交瘤细胞，这是因为在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性；另外，在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。

[0066] 在该实施例中，杂交瘤细胞保存方法包括以下步骤：

[0067] 1)去掉细胞培养瓶中旧的培养液，加入含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，使细胞悬浮。

[0068] 2)1000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用细胞冻存液(二甲基亚砜：胎牛血清：RPMI-1640＝1：2：7(体积比))复溶制成悬液，浓度5.0×105细胞/mL。

[0069] 3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。具体地：

[0070] 称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100mL，用滤纸过滤，4度保存。使用时，用pH 7.4的10mM PBS稀释至0.4％。制备单细胞悬液，并作适当稀释。将细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合均匀(终浓度0.04％)。在三分钟内，镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。计算活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。

[0071] 4)将细胞无菌分装至1.8mL细胞冻存管(购自江苏康健医疗用品有限公司)，每瓶0.5mL-1.0mL，拧紧瓶盖。

[0072] 5)细胞冻存：4℃放置2小时，然后-20℃再放置2小时，之后液氮罐气态部分(-70℃)放置2小时，最后转入液氮长期保存。

[0073] 根据以上方法，以口蹄疫A型病毒(AF72)抗原为免疫原免疫小鼠，获得了持续、稳定分泌抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为6B1。该细胞株已于2019年04月24日由申请人保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.17500，分类命名为：杂交瘤细胞。

[0074] 实施例2、抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体的制备与鉴定

[0075] 2.1、单克隆抗体的制备及纯化

[0076] 1)、采用动物体内诱生单克隆抗体法大量制备单克隆抗体：选择成年BALB/c小鼠(SPF级动物培养，购自军事医学科学院实验动物中心)，腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.5mL。7-10天后腹腔接种传代第16代的杂交瘤细胞6B1，每只小鼠1×106-5×106个。间隔7天后，腹部明显膨大，小鼠行动不便时断颈椎采集腹水。

[0077] 2)、抗体纯化：将腹水离心(10000r/min离心30分钟)，除去细胞成分和其它的沉淀物，收集上清。将上清用15-30倍体积的pH 7.0-7.6的10mM PBS(配方：NaH2PO4·2H2O 0.296g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，双蒸水定溶至1000mL，测定pH值为7.2-7.4)稀释，用Protein A亲和层析柱(GE公司，货号为11-0034-93)进行亲和纯化，上柱液为pH 7.0-7.6的10mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为pH 3.5的100mM的柠檬酸缓冲液(配方：一水柠檬酸21g加入
1000mL去离子水中，用5M NaOH或4M HCl调整pH值至3.5)，洗脱下来的抗体尽快用1M pH
9.6的Tris-HCl调整pH值至中性，得到抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体，命名为6B1anti。

[0078] 2.2、单克隆抗体鉴定

[0079] 1)、抗体纯度鉴定

[0080] 对抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体6B1anti的纯度进行8％SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图2所示。

[0081] 根据图2，示出了单克隆抗体6B1anti的SDS-PAGE电泳检测结果，其中，泳道6B1为单克隆抗体6B1anti，泳道M为蛋白分子量标准(kDa)。由图2可见单克隆抗体6B1anti的电泳结果无明显杂带，单克隆抗体6B1anti的纯度在85％以上，表明该抗体纯度良好，可以满足需求。

[0082] 2)、抗体类及亚类鉴定

[0083] 采用间接ELISA法，使用抗小鼠各种Ig亚型的抗体鉴定杂交瘤细胞6B1分泌的抗口蹄疫A型病毒的单克隆抗体6B1anti的Ig亚型，结果如图3所示。

[0084] 根据图3可知，检测样本中存在单克隆抗体6B1anti，并且单克隆抗体6B1anti的重链(H)为IgG类型，进一步检测其亚型为IgG2b亚型，表明单克隆抗体6B1anti为IgG2b亚型。

[0085] 实施例3、间接ELISA法检测口蹄疫A型病毒抗体

[0086] 3.1、用实施例2获得的单克隆抗体6B1anti及间接ELISA法检测口蹄疫A型病毒抗体，检测方法包括以下步骤：

[0087] 1)、6B1anti抗体包被酶标板：将单克隆抗体6B1anti用pH 7.0-7.4的10mM PBS缓冲溶液稀释成4μg/mL，在酶标板的每孔加110μL，4℃下包被过夜；倾去包被液，拍干，然后在每孔中加入300μL 1％BSA(在pH 7.0-7.4的10mM PBS缓冲溶液中)，放入4℃封闭过夜后，拍干。

[0088] 2)、口蹄疫全病毒抗原捕获：将灭活口蹄疫A型全病毒(购自中国农业科学院兰州兽医研究所)用pH 7.0-7.4的10mM PBS缓冲溶液1:2稀释，向酶标板的每孔加110μL，4℃下过夜。拍干，晾干后用铝箔袋真空包装备用，保存在2-8度环境下。

[0089] 3)与待检样品反应：向酶标板中分别加入经样品稀释液(配方为Na2HPO4·12H2O，2.9g；NaH2PO4·2H2O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；
硫酸庆大霉素，2支(8万单位/支)；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8，过滤除菌，2-8℃保存。)稀释的待测血清样本(猪血清样本按照1:64比例进行稀释，牛羊血清样本按照1:
128比例进行稀释)，100μL/孔，贴上板贴。并设立阴性质控和阳性质控，其中阴性质控2孔(为样品稀释液)；阳性质控血清2孔，阳性质控为口蹄疫A型抗体阳性的血清(阳性质控的OD450值为1.0-1.5)，不稀释直接检测。37℃反应1小时。反应结束后用PBST洗液(配方：
Na2HPO4·12H2O 58g，NaH2PO4·2H2O 5.92g，NaCl 170g，Tween-20 5.0mL，Proclin 300
0.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4；使用前用双蒸水稀释20倍)洗涤5次，拍干。

[0090] 4)加酶反应：向每孔中加入合适浓度的酶标记物，100μL/孔，贴上板贴，37℃反应0.5小时。酶标记物为小鼠抗猪IgG辣根过氧化物酶标记物(购自北京博尔西科技有限公司)、小鼠抗牛IgG辣根过氧化物酶标记物(购自北京博奥森生物技术有限公司)、小鼠抗羊IgG辣根过氧化物酶标记物(购自北京三联博悦生物技术有限公司)或其中任意两种或三种的混合物。酶标记抗体稀释液的配方为：Na2HPO4·12H2O，2.9g；NaH2PO4·2H2O，0.296g；
NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；酶稳定剂(购自上海西宝生物科技有限公司)，5g；Tween-20 0.25mL；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。三种酶标记物的稀释比例1:2500-1:10000。反应结束后用PBST洗液洗涤5次，拍干。

[0091] 5)显色：加入显色液A(配方为：无水乙酸钠4.5g，冰醋酸1.2mL，过氧化脲0.8g，用双蒸水定溶至1000mL。)、显色液B(配方为：柠檬酸1.62g，EDTA-2Na 0.372g，甘油100mL，四甲基联苯胺盐酸盐0.50g，用双蒸水定溶至1000mL。)各50μL/孔进行显色，37℃温育15min。

[0092] 5)终止反应与测量：加入终止液(配方为：1000mL双蒸水中含有98％硫酸27.8mL。)，50μL/孔，测定OD450值。

[0093] 6)结果判断：

[0094] 实验有效性判断：阴性质控OD450均值≤0.4；阳性质控OD450均值≥0.8(由于检测环境温度、湿度、储存时间长短等存在差异，检测得到的阳性质控OD450值可能不在1.0-1.5范围之内)。

[0095] 待测样品结果判断：计算S/P值即待测样品OD450/阳性质控OD450均值，若≥0.4，则判为阳性，阳性结果表示检测到抗口蹄疫A型病毒抗体；否则为阴性，阴性结果表示未检测到抗口蹄疫A型病毒抗体。使用本实施例公开的方法还可以定量评估经口蹄疫A型病毒灭活疫苗免疫后血清中的抗体效价水平，检测得到的OD450值越大，表明经口蹄疫A型病毒灭活疫苗免疫后获得的抗体水平越高。

[0096] 依据上述的抗体水平评判结果，还可以对疫苗免疫后的效果、疫苗质量等进行评价，包括抗体阳性率(抗体阳性率≥70％，表明疫苗能够对种群提供有效的保护；抗体阳性率<70％，则疫苗不能够对种群提供有效的保护)、平均抗体效价(样品S/P的均值)以及抗体整齐度(CV％＝样品S/P值的标准差/平均值)。

[0097] 3.2、灵敏度检测

[0098] 用单克隆抗体6B1anti及间接ELISA方法检测经含口蹄疫A型病毒疫苗免疫后的猪阳性血清50份和牛阳性血清50份，以确定检测方法的灵敏度，检测方法与步骤3.1相同，检测结果如下表4所示。

[0099] 表4 100份临床样品的检测灵敏度

[0100]

[0101] 由上表4可知，50份阳性猪血清共检出49份，50份阳性牛血清全部检出，合计100份血清共检出99份，即临床灵敏度为99％(＝99/100)，表明本方法有很高的灵敏度。

[0102] 3.3、特异性检测

[0103] 用单克隆抗体6B1anti及间接ELISA方法检测60日龄A型抗体阴性猪血清126份、免疫过口蹄疫O型疫苗A型抗体阴性的80日龄猪血清90份，以确定检测方法的特异性，检测方法与步骤3.1相同，结果如下表5所示。

[0104] 表5 216份临床样品的检测特异性

[0105]

[0106] 由上表5结果可知，126份60日龄A型抗体阴性猪血清共检出117份，90份经免疫口蹄疫O型疫苗A型抗体阴性的80日龄猪血清中共检出78份，合计216份A型抗体阴性血清，共检出阴性数为195份，因此临床特异性＝195/216*100％＝90％，表明本方法有非常高的特异性。

[0107] 3.4、方法学符合率检测

[0108] 用单克隆抗体6B1anti及间接ELISA方法(下表6中本方法)检测随机血清300份、阴性血清100份、弱阳性血清30份、中等强度阳性血清30份、强阳性血清30份、口蹄疫O型抗体阳性血清30份、其他干扰血清40份(猪瘟抗体阳性、蓝耳抗体阳性、伪狂犬gE抗体阳性和圆环抗体阳性血清各10份)；并同时用中国农业科学院兰州兽医研究所研制的口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA试剂盒(下表6中参考方法)进行检测，分析两种方法的符合率，检测方法与步骤3.1相同，结果如下表6所示。

[0109] 表6 560份样品的方法符合率

[0110]

[0111] 阴性符合率＝247/262*100％＝94.3％；

[0112] 阳性符合率＝276/298*100％＝92.6％；

[0113] 总符合率＝(247+276)/560*100％＝93.4％。

[0114] 经过计算，两种方法的总符合率达到93.4％，表明本发明提供的采用单克隆抗体6B1anti的间接ELISA方法与中国农业科学院兰州兽医研究所研制的口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA试剂盒具有较高的一致率，但本发明提供的方法操作简单、耗时较短，更适合于临场快速筛查。

[0115] 实施例4、间接ELISA试剂盒

[0116] 在该实施例中，灭活口蹄疫A型全病毒经单克隆抗体6B1anti特异性地吸附在酶标板上，以小鼠抗猪IgG和/或小鼠抗牛IgG和/或小鼠抗羊IgG的辣根过氧化物酶标记物作为酶标记物，用间接ELISA法检测口蹄疫A型病毒抗体的试剂盒包括：

[0117] 1)、预包被酶标板：预先用单克隆抗体6B1anti按照4μg/mL的浓度预先包被、封闭酶标板，然后捕获灭活口蹄疫A型全病毒，晾干后密封保存在真空铝箔袋中，每个试剂盒两块96孔的酶标板(详细方法可参见实施例3步骤3.1)；

[0118] 2)、酶标记抗体工作液：市售的小鼠抗猪IgG辣根过氧化物酶标记物和/或小鼠抗牛IgG辣根过氧化物酶标记物和/或小鼠抗羊IgG辣根过氧化物酶标记物作为酶标二抗使用，并用酶标记抗体稀释液稀释成合适浓度作为工作液，通常为0.05-0.5μg/mL，每个试剂盒20mL。

[0119] 酶标记抗体稀释液配方为：Na2HPO4·12H2O，2.9g；NaH2PO4·2H2O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；酶稳定剂(购自上海西宝生物科技有限公司)，5g；Tween-20 0.25mL；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。

[0120] 3)、稀释液：用于待测样品的稀释和阴性质控，其配方为Na2HPO4·12H2O，2.9g；NaH2PO4·2H2O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；硫酸庆大霉素，2支(8万单位/支)；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。过滤除菌，2-8℃保存。每个试剂盒1瓶，60mL/瓶。

[0121] 4)、洗涤液：为20倍的浓缩洗液，用前稀释。其配方为：Na2HPO4·12H2O 58g，NaH2PO4·2H2O 5.92g，NaCl 170g，Tween-20 5.0mL，Proclin 300 0.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4。每个试剂盒1瓶，60mL/瓶。

[0122] 5)、显色液A：每个试剂盒1瓶，12mL/瓶。配方为：无水乙酸钠4.5g，冰醋酸1.2mL，过氧化脲0.8g，用双蒸水定溶至1000mL。

[0123] 6)、显色液B：每个试剂盒1瓶，12mL/瓶。显色液B配方为：柠檬酸1.62g，EDTA-2Na 0.372g，甘油100mL，四甲基联苯胺盐酸盐0.50g，用双蒸水定溶至1000mL。

[0124] 7)、终止液：每个试剂盒1瓶，12mL/瓶。配方为：1000mL双蒸水中含有98％硫酸27.8mL。

[0125] 8)、口蹄疫A型抗体阳性血清：每个试剂盒1瓶，1mL/瓶。

[0126] 实施例5、检测口蹄疫A型病毒抗原的胶体金试纸条或测试卡或试纸盒

[0127] 以单克隆抗体6B1anti分别为包被抗体和标记抗体制备胶体金试纸条或测试卡或组装成试纸盒，可快速、现场检测口蹄疫A型病毒抗原，并可用于疫苗或疫苗生产过程中的口蹄疫A型病毒抗原水平的快速检测以及感染动物的现场初筛等。

[0128] 5.1、制备胶体金试纸条和测试卡

[0129] 如图4所示，为胶体金试纸条结构示意图，其中图4中A幅为胶体金试纸条正面结构示意图，图4中B幅为胶体金试纸条侧面结构示意图，图4中C幅为胶体金试纸条的层析方向，根据图4，用于检测口蹄疫A型病毒抗原的胶体金试纸条由吸水垫1、硝酸纤维素膜(NC膜)2、玻璃纤维素膜结合物释放垫3、玻璃纤维素膜样品垫4组成，硝酸纤维素膜2上设有检测线(T线)6和质控线(C线)5。

[0130] 胶体金试纸条和测试卡的制备方法包括以下步骤：

[0131] 1)、包被硝酸纤维素膜(NC膜)2

[0132] 用浓度为1-5mg/mL的单克隆抗体6B1anti包被检测线(T线)。用浓度为1-5mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白(购自北京博尔西科技有限公司)包被质控线(C线)。具体方法为：用上海金标生物科技有限公司的XYZ三维划膜喷金仪将单克隆抗体6B1anti和羊抗鼠免疫球蛋白分别喷于300mm长、20mm宽的硝酸纤维素膜(购自Millipore公司)2上，形成相互分离的检测线6和质控线5，质控线和检测线间距一般为0.3-1.0cm，优选0.5cm。置于干燥室(相对湿度≤30％)干燥6小时备用。

[0133] 2)、结合物释放垫3的制备

[0134] 2.1、用胶体金标记单克隆抗体6B1anti，方法为：在磁力加热搅拌下，向三角瓶中加入145mL纯化水，煮沸。加入1％四氯化金溶液5mL，煮沸。再加入1％柠檬酸三钠溶液7mL，煮沸5分钟，即为胶体金溶液，冷却后保存于2-8℃。取1毫升胶体金溶液于离心管中。加入10μl 0.2M碳酸钾溶液，室温静止5min。加入10μl单克隆抗体6B1anti，混匀后静置30min。加入10μl 20％BSA溶液，平衡5min。加入10μl 20％PEG 20000溶液，平衡30min；用离心机
10000rpm离心10min，去上清液。加入100μl金标复溶液(含有2％蔗糖、1％酪蛋白、0.5％BSA、0.1Triton X100、0.1％SDS的硼酸缓冲液)，复溶后备用。

[0135] 2.2、制备结合物释放垫3：结合物释放垫3的材质为玻璃纤维素膜，其上包被有胶体金标记的特异性单克隆抗体6B1anti，具体方法为：将复溶后的胶体金标记的单克隆抗体6B1anti用金标复溶液1:4稀释后按照8μl/cm的速度喷膜。置于干燥室(相对湿度≤30％)干燥6小时备用。

[0136] 3)、制备胶体金试纸条和测试卡

[0137] 在PVC 背板7上先粘贴硝酸纤维素膜2，在靠近硝酸纤维素膜质控线5的一端粘贴吸水垫1，在靠近检测线6的一端粘贴结合物释放垫3和样品垫4，得到用于检测口蹄疫A型病毒抗原的胶体金试纸，然后可按所需大小进行切割，得到用于检测口蹄疫A型病毒抗原的胶体金试纸条，加干燥剂后密封保存。

[0138] 将上述步骤制备的胶体金试纸条装入塑料卡中，制成测试卡，并组装成试纸盒。如图5所示，示出了多个测试卡的正面结构示意图，在该测试卡对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗，以便观察检测线和质控线的反映情况。

[0139] 5.2、胶体金试纸条和测试卡的使用

[0140] 胶体金试纸条的使用方法：将样品垫端浸入样品中，样品垫4即吸取液体向上端移动，流经结合物释放垫3时使其与干片上的胶体金标记单克隆抗体6B1anti复溶，并带动其向硝酸纤维膜2渗移。若样本中有待测特异抗原(阳性样本)，其可与胶体金标记单克隆抗体6B1anti结合，此抗原抗体复合物流至检测线6即被固相抗体所获，在膜上显出红色检测线条(T线)。过剩的胶体金标记单克隆抗体6B1anti继续前行，至质控线5与羊抗鼠免疫球蛋白(固相二抗)结合，而显出红色质控线条(C线)。反之，若样本中无待测特异抗原(阴性样本)，则无检测线条(T线)，而仅显示质控线条(C线)。如果检测线(T线)与质控线(C线)均不显色或仅检测线(T线)显色，则表示胶体金试纸条(卡)失效。

[0141] 胶体金测试卡和试纸盒的使用方法：检测时，取待检样品2-4滴，滴在测试卡的点样口，根据观测窗内的检测线(T线)和质控线(C线)是否出现色带来确定样品中是否存在口蹄疫A型病毒。

[0142] 5.3、检测临床病料中的口蹄疫A型病毒抗原

[0143] 取大约1克的病猪水泡皮，加入1ml稀释液(其配方为：Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaH2PO4·2H2O 0.296g，NaCl 8.5g，Tween-20 0.25mL，Proclin 300 0.03mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4)。用研钵研磨5分钟取上清进行检测。检测方法参见该实施例中步骤5.2的胶体金试纸条和测试卡的使用。

[0144] 取104份临床样品，分别用PCR方法(口蹄疫A型荧光定量PCR抗原检测试剂盒，购自中国农业科学院兰州兽医研究所)(下表7中参考方法)和本发明提供的胶体金测试卡(下表7中本方法)进行检测，结果见下表7。

[0145] 表7 50份临床病料的方法比对

[0146]

[0147] 阴性符合率＝54/59*100％＝91.5％；

[0148] 阳性符合率＝39/45*100％＝86.7％；

[0149] 总符合率＝(54+39)/104*100％＝89.4％。

[0150] 由表7数据可知，二者总符合率达到89％以上，表明本发明提供的采用单克隆抗体6B1anti的胶体金方法与传统的PCR检测方法具有较高的一致率，但本方法操作简单、耗时较短、更加适合于现场快速初筛。

[0151] 5.4、检测疫苗或疫苗生产过程中制苗样品中的口蹄疫A型病毒抗原水平[0152] 从市场上抽取不同的口蹄疫全病毒灭活疫苗(疫苗类型如下表8所示)，先进行破乳：无菌取1ml疫苗，加入100μl的正戊醇作为破乳剂，剧烈震荡1分钟，室温静止30分钟。5000rpm离心3分钟，取下层水相检测，不仅可以检测抽取的不同的口蹄疫全病毒灭活疫苗中是否存在口蹄疫A型病毒抗原，还可以对抗原水平进行定量检测。也可以直接选择疫苗生产过程中的制苗样品进行口蹄疫A型病毒抗原水平的检测，同时，还可以通过仪器或者其他方式检测T线颜色深浅来定量测量口蹄疫A型病毒抗原水平，以指导疫苗的生产，保证疫苗的质量。

[0153] 检测方法参见该实施例步骤5.2中胶体金试纸条和测试卡的使用，具体检测结果见下表8，检测结果与疫苗标识完全符合。

[0154] 表8疫苗破乳后检测结果

[0155]

[0156] 取口蹄疫A型疫苗的破乳水相，用稀释液(其配方为：Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaH2PO4·2H2O 0.296g，NaCl 8.5g，Tween-20 0.25mL，Proclin 300 0.03mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4)倍比稀释，然后根据该实施例中5.2步骤中的胶体金试纸条和测试卡的使用方法对口蹄疫A型疫苗的破乳水相中的口蹄疫A型病毒抗原进行检测，结果如图6所示，可见稀释512倍时依然可以检测出口蹄疫A型病毒抗原，稀释128倍后依然可明显检出口蹄疫A型病毒抗原，表明本发明公开的检测方法的灵敏度很高，提供的胶体金试纸条和测试卡的检测效果很好。

[0157] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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