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载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法

阅读：931发布：2020-05-12

专利汇可以提供载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于胰腺癌研究技术领域，尤其是载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，针对抑制胰腺癌发展研究方法成本高效果不明显的问题，现提出以下方案，包括以下步骤，小鼠模型建立：C57BL/6小鼠术前禁食24小时，不禁水；2％戊巴比妥钠(1.5mL/kg体重) 腹腔内注入麻醉，每组动物均经上腹正中切口1.5cm进腹，胰腺癌模型组在暴露胰腺后，于胰体尾部以1mL 注射器注射置入载脂蛋白AI模拟肽L-4F悬液在普通环境饲养；在3-5个月期间随时观察小鼠精神状况，体重以及有无腹水。本发明小鼠模型建立更加稳定，节约了研究成本，并且观察更直观，多参数实验，提高了实验研究的精确度。，下面是载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：小鼠模型建立：C57BL/6小鼠术前禁食24小时，不禁水；2％戊巴比妥钠(1.5mL/kg体重)腹腔内注入麻醉，每组动物均经上腹正中切口1.5cm进腹，胰腺癌模型组在暴露胰腺后，于胰体尾部以1mL注射器注射置入载脂蛋白AI模拟肽L-4F悬液在普通环境饲养；在3-5个月期间随时观察小鼠精神状况，体重以及有无腹水，对照组仅进行胰体尾部以1mL注射器注射至于等量的生理盐水；
S2：巨检：处死小鼠胡，开腹剥离肿瘤，记录质地、浸润、血清情况、观察有无腹腔粘连，各脏器转移状况，将手术切除的部分新鲜肿瘤组织立即放入含有庆大霉素的1％小牛血清RPM1640培养液10mL的小瓶内待用，部分肿瘤组织置于10％的福尔马林固定液中待用；
S3：病理学检测：S2中产生的标本使用常规福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片3张，一张行HE染色用，另外两张行免疫组化染色用；
S4：将诱导出的癌组织标本用Hanks液反复漂洗，剪成糊状，100目铜丝网过滤成无菌细胞悬液，经过不连续密度梯度离心，收用集肿瘤细胞，用Hanks液洗涤2次，用含有10％小牛血清的RPMI1640培养液制成肿瘤细胞悬液，调整细胞浓度到1X106/mL；0.2mL接种C57BL/6小鼠左腋皮下，第14d处死动物，成瘤大小15-20mm2；连续传代2代，模型建立比较稳定；
S5：肿瘤组织的双荧光染色鉴定：将爬片的肿瘤组织与DiLemma标记的乙酰化低密度脂蛋白于37℃孵育两小时，然后用多聚甲醛固定于细胞，5min后用PBS浸洗，然后再加入FITC标记的荆豆凝集素10mg/L于37摄氏度孵育一小时，PBS洗去多余染料后，中性甘油封片，用荧光显微镜或激光共聚焦观察，显示黄色荧光的为DiL-Ac-LDL阳性，显示绿色荧光的为FITC-UEA-I阳性，两者双染色阳性细胞被认为是正在分化的肿瘤组织；
S6：肿瘤单细胞悬液的制备和培养：肿瘤组织培养七天后，用0.25％胰酶消化细胞制成细胞悬液，以同等数量细胞接种于孔板中，实验前将含10％血清的ECM-2MV培养基换为不含血清的M199培养基，随机分组，正常对照组，常规培养；
S7：活力检测：将细胞以同等数量(1X104)接种于96孔板中，按实验分组处理细胞后，每孔加入20μLMTT(5g/L)，于细胞培养箱中继续培养，4h后弃去上清，每孔加入DMSO200μL，摇床振荡摇匀10min，于波长490nm处测定各孔吸光度，以对照组细胞活力为100％，其余各组细胞活力值占对照组活力值的百分比表示。
2.根据权利要求1所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述S1步骤中注射深度均为2mm。
3.根据权利要求1所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述S3中载玻片用APES进行防脱片处理。
4.根据权利要求1所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述DiLemma标记的乙酰化低密度脂蛋白的份量为2.5g/L。
5.根据权利要求1所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述多聚甲醛的份量为1％-2％。
6.根据权利要求1所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述S6步骤中随机分组分为L-4F组、H2O2组、L-4F+H2O2组和LY294002+L-4F+H2O2。
7.根据权利要求6所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述L-4F组：培养基中分别为10、25、50、75和100mm/L的L-4F组二十四小时。
8.根据权利要求6所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述H2O2组：培养基中加入100μmol/L的H2O2二十四小时。
9.根据权利要求6所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述L-4F+H2O2组：培养基先后加入25、50和75mg/L的L-4F预处理四小时，再加入100μmol/L的H2O2二十四小时。
10.根据权利要求6所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述LY294002+L-4F+H2O2组：培养基先加入LY294002两小时，预处理后，再加入75mg/L的L-4F四小时，最后加入100μmol/L的H2O2二十四小时。

说明书全文

载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及胰腺癌研究技术领域，尤其涉及载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法。

背景技术

[0002] 胰腺癌临床表现取决于癌的部位、病程早晚、有无转移以及邻近器官累及的情况。其临床特点是整个病程短、病情发展快和迅速恶化。最多见的是上腹部饱胀不适、疼痛。虽然有自觉痛，但并不是所有病人都有压痛，如果有压痛则和自觉痛的部位是一致的。

[0003] 现有的科学研究中，经常需要进行抑制胰腺癌干细胞干性特征，但现有的方法在操作方便性、成本、效果等方面存在不理想。

[0004] 经检索，中国专利申请号为201310027873.7的专利，公开了一种miR-200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法，包括人胰腺癌细胞系PANC-l培养、流式细胞仪检测和分选胰腺癌干细胞、无血清悬浮培养PANC-l干细胞球细胞、过表达miR-200a。上述专利中的一种miR-200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法存在以下不足：该方法不便于胰腺癌的研究，而常规的胰腺癌研究多采用白鼠实验的方式，该方法不能灵活观测胰腺癌的发展状况。

发明内容

[0005] 基于抑制胰腺癌发展研究方法成本高效果不明显的技术问题，本发明提出了载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法。

[0006] 本发明提出的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，包括以下步骤：

[0007] S1：小鼠模型建立：C57BL/6小鼠术前禁食24小时，不禁水；2％戊巴比妥钠(1.5mL/kg体重)腹腔内注入麻醉，每组动物均经上腹正中切口1.5cm进腹，胰腺癌模型组在暴露胰腺后，于胰体尾部以1mL注射器注射置入载脂蛋白AI模拟肽L-4F悬液在普通环境饲养；在3-5个月期间随时观察小鼠精神状况，体重以及有无腹水，对照组仅进行胰体尾部以1mL注射器注射至于等量的生理盐水；

[0008] S2：巨检：处死小鼠，开腹剥离肿瘤，记录质地、浸润、血清情况、观察有无腹腔粘连，各脏器转移状况，将手术切除的部分新鲜肿瘤组织立即放入含有庆大霉素的1％小牛血清RPM1640培养液10mL的小瓶内待用，部分肿瘤组织置于10％的福尔马林固定液中待用；

[0009] S3：病理学检测：S2中产生的标本使用常规福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片3张，一张行HE染色用，另外两张行免疫组化染色用；

[0010] S4：将诱导出的癌组织标本用Hanks液反复漂洗，剪成糊状，100目铜丝网过滤成无菌细胞悬液，经过不连续密度梯度离心，收用集肿瘤细胞，用Hanks液洗涤2次，用含有10％小牛血清的RPMI1640培养液制成肿瘤细胞悬液，调整细胞浓度到1X106/mL；0.2mL接种C57BL/6小鼠左腋皮下，第14d处死动物，成瘤大小15-20mm2；连续传代2代，模型建立比较稳定；

[0011] S5：肿瘤组织的双荧光染色鉴定：将爬片的肿瘤组织与DiLemma标记的乙酰化低密度脂蛋白于37℃孵育两小时，然后用多聚甲醛固定于细胞，5min后用PBS浸洗，然后再加入FITC标记的荆豆凝集素10mg/L于37摄氏度孵育一小时，PBS洗去多余染料后，中性甘油封片，用荧光显微镜或激光共聚焦观察，显示黄色荧光的为DiL-Ac-LDL阳性，显示绿色荧光的为FITC-UEA-I阳性，两者双染色阳性细胞被认为是正在分化的肿瘤组织；

[0012] S6：肿瘤单细胞悬液的制备和培养：肿瘤组织培养七天后，用0.25％胰酶消化细胞制成细胞悬液，以同等数量细胞接种于孔板中，实验前将含10％血清的ECM-2MV培养基换为不含血清的M199培养基，随机分组，正常对照组，常规培养；

[0013] S7：活力检测：将细胞以同等数量(1X104)接种于96孔板中，按实验分组处理细胞后，每孔加入20μLMTT(5g/L)，于细胞培养箱中继续培养，4h后弃去上清，每孔加入DMSO200μL，摇床振荡摇匀10min，于波长490nm处测定各孔吸光度，以对照组细胞活力为100％，其余各组细胞活力值占对照组活力值的百分比表示。

[0014] 优选地，所述S1步骤中注射深度均为2mm。

[0015] 优选地，所述S3中载玻片用APES进行防脱片处理。

[0016] 优选地，所述DiLemma标记的乙酰化低密度脂蛋白的份量为2.5g/L。

[0017] 优选地，所述多聚甲醛的份量为1％-2％。

[0018] 优选地，所述S6步骤中随机分组分为L-4F组、H2O2组、L-4F+H2O2组和LY294002+L-4F+H2O2。

[0019] 优选地，所述L-4F组：培养基中分别为10、25、50、75和100mm/L的L-4F组二十四小时。

[0020] 优选地，所述H2O2组：培养基中加入100μmol/L的H2O2二十四小时。

[0021] 优选地，所述L-4F+H2O2组：培养基先后加入25、50和75mg/L的L-4F预处理四小时，再加入100μmol/L的H2O2二十四小时。

[0022] 优选地，所述LY294002+L-4F+H2O2组：培养基先加入LY294002两小时，预处理后，再加入75mg/L的L-4F四小时，最后加入100μmol/L的H2O2二十四小时。

[0023] 本发明中的有益效果为：

[0024] 1、本研究方法使用步骤简单明确，使用小白鼠为研究模型，基因序列与人类接近，且方便饲养研究基数大，节约了研究成本，并且观察更直观，并且采用100目铜丝网过滤成无菌细胞悬液，经过不连续密度梯度离心，收用集肿瘤细胞，用Hanks液洗涤2次，用含有10％小牛血清的RPMI1640培养液制成肿瘤细胞悬液，调整细胞浓度到1X106/mL；0.2mL接种C57BL/6小鼠左腋皮下，第14d处死动物，成瘤大小15-20mm2；连续传代2代；小鼠模型建立更加稳定。

[0025] 2、通过使用L-4F组、H2O2组、L-4F+H2O2组和LY294002+L-4F+H2O2多组数据，多参数实验，提高了实验研究的精确度。

[0026] 3、将爬片的肿瘤组织与DiLemma标记的乙酰化低密度脂蛋白于37℃孵育两小时，然后用多聚甲醛固定于细胞，5min后用PBS浸洗，然后再加入FITC标记的荆豆凝集素10mg/L于37摄氏度孵育一小时，PBS洗去多余染料后，中性甘油封片，用荧光显微镜或激光共聚焦观察，显示黄色荧光的为DiL-Ac-LDL阳性，显示绿色荧光的为FITC-UEA-I阳性，两者双染色阳性细胞被认为是正在分化的肿瘤组织；研究染色更明显，方便观察，降低了实验难度，大幅降低了胰腺癌研究的难度。附图说明

[0027] 图1为本发明提出的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法的流程图。

具体实施方式

[0028] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

[0029] 参照图1，载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，包括以下步骤：

[0030] S1：小鼠模型建立：C57BL/6小鼠术前禁食24小时，不禁水；2％戊巴比妥钠(1.5mL/kg体重)腹腔内注入麻醉，每组动物均经上腹正中切口1.5cm进腹，胰腺癌模型组在暴露胰腺后，于胰体尾部以1mL注射器注射(深2mm)置入载脂蛋白AI模拟肽L-4F悬液在普通环境饲养；在3-5个月期间随时观察小鼠精神状况，体重以及有无腹水。对照组仅进行胰体尾部以1mL注射器注射(2mm)至于等量的生理盐水；

[0031] S2：巨检：处死小鼠胡，开腹剥离肿瘤，记录质地、浸润、血清情况、观察有无腹腔粘连，各脏器转移状况，将手术切除的部分新鲜肿瘤组织立即放入含有庆大霉素的1％小牛血清RPM1640培养液10mL的小瓶内待用，部分肿瘤组织置于10％的福尔马林固定液中待用；

[0032] S3：病理学检测：上述标本常规福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片3张，一张行HE染色用，另外两张行免疫组化染色用(载玻片用APES进行防脱片处理)；

[0033] S4：将诱导出的癌组织标本用Hanks液反复漂洗，剪成糊状，100目铜丝网过滤成无菌细胞悬液，经过不连续密度梯度离心，收用集肿瘤细胞，用Hanks液洗涤2次，用含有10％小牛血清的RPMI1640培养液制成肿瘤细胞悬液，调整细胞浓度到1X106/mL；0.2mL接种C57BL/6小鼠左腋皮下，第14d处死动物，成瘤大小15-20mm2；连续传代2代，模型建立比较稳定；

[0034] S5：肿瘤组织的双荧光染色鉴定：将爬片的肿瘤组织与DiLemma标记的乙酰化低密度脂蛋白(2.5g/L)于370C孵育两小时，然后用多聚甲醛(1％-2％)固定于细胞，5min后用PBS浸洗，然后再加入FITC标记的荆豆凝集素10mg/L于37摄氏度孵育一小时，PBS洗去多余染料后，中性甘油封片，用荧光显微镜或激光共聚焦观察，显示黄色荧光的为DiL-Ac-LDL阳性，显示绿色荧光的为FITC-UEA-I阳性，两者双染色阳性细胞被认为是正在分化的肿瘤组织。

[0035] S6：肿瘤单细胞悬液的制备和培养：肿瘤组织培养七天后，用0.25％胰酶消化细胞制成细胞悬液，以同等数量细胞接种于孔板中，实验前将含10％血清的ECM-2MV培养基换为不含血清的M199培养基，随机分为：正常对照组，常规培养，L-4F组：培养基中分别为10/25/50/75和100mm/L的L-4F组二十四小时；H2O2组：培养基中加入100μmol/L的H2O2二十四小时；
L-4F+H2O2组：培养基先后加入25/50和75mg/L的L-4F预处理四小时，再加入100μmol/L的H2O2二十四小时；LY294002+L-4F+H2O2组：培养基先加入LY294002两小时，预处理后，再加入
75mg/L的L-4F四小时，最后加入100μmol/L的H2O2二十四小时。

[0036] S7：活力检测：将细胞以同等数量(1X104)接种于96孔板中，按实验分组处理细胞后，每孔加入20μLMTT(5g/L)，于细胞培养箱中继续培养，4h后弃去上清，每孔加入DMSO200μL，摇床振荡摇匀10min，于波长490nm处测定各孔吸光度。以对照组细胞活力为100％，其余各组细胞活力值占对照组活力值的百分比表示。

[0037] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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