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益生菌在提高雄性生育力中的用途

阅读：774发布：2020-05-18

专利汇可以提供益生菌在提高雄性生育力中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及与长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)相组合的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)在制备用于在受试者中提高雄性生育力的组合物中的用途。特别地，所述菌株为鼠李糖乳杆菌CECT 8361和长双歧杆菌CECT 7347这些菌株。同样地，还描述了包含所述菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361和长双歧杆菌CECT 7347的组合物。，下面是益生菌在提高雄性生育力中的用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.与长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)菌株相组合的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株在制备用于在受试者中提高雄性生育力的组合物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中“鼠李糖乳杆菌:长双歧杆菌”之比为大约50:50。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述组合物为药物组合物或功能性营养组合物。
4.根据权利要求3的用途，其中所述药物组合物包含在药学上可接受的载体和/或赋形剂。
5.根据权利要求3或4的用途，其中将所述药物组合物配制成用于其口服施用。
6.根据权利要求3的用途，其中所述功能性营养组合物为食物或营养补充物。
7.根据权利要求6的用途，其中所述食物选自由乳制品、肉制品、植物产品、饲料和饮料组成的组。
8.根据权利要求1至7中任一项的用途，其中所述雄性生育力的提高包括精子活动能力、精子生存力、精子的膜的组成、形态正常的精子的浓度和/或在一次射出的精液中精子总数目的提高，和/或包括精子DNA片段化的减少和精子染色质的完整性的改善。
9.根据权利要求1至8中任一项的用途，其中所述受试者为鱼或哺乳动物，优选地，从由人、猪、马、兔子、阉牛和公牛组成的组中选择的哺乳动物。
10.根据权利要求1至9中任一项的用途，其中在所述组合物中所述鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌菌株的微生物施用剂量为106-1012cfu/天，优选地，109cfu/天。
11.根据权利要求10的用途，其中所述组合物的施用制度为每天至少一次。
12.根据权利要求1至11中任一项的用途，其中所述鼠李糖乳杆菌菌株为菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361，和/或所述长双歧杆菌菌株为菌株长双歧杆菌CECT 7347。
13.组合物，其包含菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361和长双歧杆菌CECT 7347或者衍生自它们的菌株，所述菌株的组合具有提高雄性生育力的能力。
14.根据权利要求13的组合物，其中“鼠李糖乳杆菌CECT 8361:长双歧杆菌CECT 7347”之比为大约50:50。
15.根据权利要求13或14的组合物，其中所述组合物为药物组合物或功能性营养组合物。
16.根据权利要求15的组合物，其中所述药物组合物包含在药学上可接受的载体和/或赋形剂。
17.根据权利要求15或16的组合物，其中将所述药物组合物配制成用于其口服施用。
18.根据权利要求15的组合物，其中所述功能性营养组合物为食物或营养补充物。
19.根据权利要求18的组合物，其中所述食物选自由乳制品、肉制品、植物产品、饲料和饮料组成的组。
20.根据权利要求13至19中任一项的组合物，其中在所述组合物中菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361和长双歧杆菌CECT 7347的微生物总浓度为106-1012cfu，优选地，109cfu。
21.根据权利要求13至20中任一项的组合物，其中菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361具有比其他乳杆菌属(Lactobacillus)菌株更大的抗氧化活性。

说明书全文

益生菌在提高雄性生育力中的用途

[0001] 说明书

[0002] 本发明涉及包含具有益生能力的微生物物种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的两种菌株的组合物用于提高雄性生育力的用途。因此，本发明被包括在人和动物生殖的领域之内，其在制药和农产食品产业中都具有应用。现有技术

[0003] 益生菌是活的微生物，当其以适当的剂量被摄入时，对于消费者的健康赋予益处。基本上，已在功能性食物中或在营养补充物中将它们用作成分，因而分别对于农产食品工业和制药工业来说一直具有巨大的价值。绝大多数迄今所使用的益生菌经常是在消化道水平上有效并且正面地影响消化道病理学状况(尤其是例如结肠炎、便秘或肠道炎症)。然而，在科学文献中存在有个别案例，其涉及在阴道感染中、在皮肤问题中或者甚至在肥胖症中或在孤独症中使用益生菌。

[0004] 益生菌在人生殖领域中的使用是有限的，并且主要集中在女性因素方面和在前面描述的具有阴道感染的案例中。在该意义下，存在这样的研究，其中已将益生菌用作用于细菌性阴道病的疗法，这在某些临床研究中提供了正面的结果(Mastromarino等人,2013.New Microbiol.36(3):229-38；Borges等人,2014.Arch Gynecol Obstet.,289(3):479-89)。相反地，还未描述过益生菌在人中对于男性生育力的效应。在斑马鱼动物模型中已查明，益生菌的摄入显著地增加了与生殖质量相关的分子标志物(Riesco等人,2013.Evaluation of a probiotic diet on zebrafish sperm quality markers.4th International workshop on the biology of Fish Gametes(Albufeira,Portugal))，但是迄今为止，还不存在有任何这样的科学出版物，其评价益生菌的摄入对于在人中的精子质量参数的效应，或者将所述补充物的摄入与精子活动性的改善相关联。

[0005] 另一方面，已经研究了乳酸细菌和双歧杆菌的抗氧化效应，但是在人中从未与精子质量相联系，虽然在动物中这样做了(Riesco等人,2013,引用如上)。在最近几十年期间，已开展了临床研究以便建立用抗氧化剂进行的治疗在男性中的精子参数的改善方面以及在其伴侣中的受精或怀孕率方面的有益效应。最常被研究的抗氧化剂是维生素C、维生素E、硒、谷胱甘肽、锌、N-乙酰基-半胱氨酸和L-肉碱(Gharagozloo等人,2011.Hum Reprod.26(7):1628-40；Ko和Sabanegh,2012.J Androl 33(3):292-308；Showell等人,2013.Cochrane Database Syst Rev,5,8:CD007807)。这些研究中的一些在体外试验中评价了这些抗氧化剂的效应(作为补充物而添加在冷冻保护剂溶液中)，并且得出结论，这些添加剂在保护精子对抗在冷冻-解冻实验方案期间所产生的氧化性分子方面存在有有益效应(Walczak-Jedrzejowska等人,2013.Cent European J Urol.66(1):60-7)。其他研究评价了口服施用抗氧化剂对于精子参数的效应。例如，在2010年，Ross等人(Ross等人,2010,Reprod Biomed Online,20(6):711-23)综述了口服摄入抗氧化剂对于精子参数的有益效应。西班牙专利ES2225625描述了用于改善人精子质量的组合物，其至少包含锌源，和任选地包含维生素B12、镁、甜菜碱、胆碱、SAM、维生素B2和维生素B6。类似地，西班牙专利ES2397657描述了用于改善个体的精子质量的联合制剂，其包含L-肉碱、辅酶Q、维生素E、锌源、维生素B、硒源、谷胱甘肽、L-精氨酸或者其盐或衍生物作为活性物质。然而，这些治疗的效果并不总是随时间持续不变，并且不知道是否减少了精子DNA片段化(在精子质量方面的最重要的参数之一)。

[0006] 因此，在现有技术中存在提供用于通过改善精子质量来提高雄性生育力的备选方法的需要，所述方法不具有上面提及的缺点。

[0007] 发明描述

[0008] 本发明的发明人已发现，鼠李糖乳杆菌菌株和长双歧杆菌菌株的联合施用提供了雄性生育力的提高。在一个特别的实施方案中，所述菌株为鼠李糖乳杆菌CECT 8361和长双歧杆菌CECT 7347。如在实施例1中所显示的，参与研究的部分受试者摄入包含鼠李糖乳杆菌菌株和长双歧杆菌菌株的组合的组合物产生了精子活动能力的提高和精子DNA片段化的降低(这是在评价精液质量中的两个关键参数)。因此，以益生组合形式摄入这些菌株改善了精液质量，并因此提高了雄性生育力。此外，该生育力的提高甚至在结束了最后一次摄入后六周仍然保持，由此取得长期效应。对于这些结果的一种可能的解释是，菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361的抗氧能力与菌株长双歧杆菌CECT 7347的抗炎能力的组合对于所述精子活动能力的提高和精子DNA片段化的降低负有责任。因此，在此所描述的发明使得能够将具有益生特性的细菌菌株用于提出疗法以便在施行辅助生殖技术或自然生殖之前或者甚至在进行用于未来授精的精子捐献之前提高雄性生育力。

[0009] 基于该发现，已发展出了许多发明方面，其将会在下面详细描述。

[0010] 鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌这两个物种的菌株的联合施用用于提高受试者的雄性生育力的用途

[0011] 本发明的发明人已发现，鼠李糖乳杆菌菌株和长双歧杆菌菌株的联合施用提供了雄性生育力的提高。然而，由于鼠李糖乳杆菌(特别是鼠李糖乳杆菌CECT 8361)相比于乳杆菌属(Lactobacillus)的其他物种而言的非凡的抗氧化能力，不能舍弃在制备用于提高雄性生育力的药物组合物中单独地使用鼠李糖乳杆菌的可能性。本发明的作者认为，鼠李糖乳杆菌(特别是菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361)的抗氧化能力保护了精子免受活性氧类别影响，所述活性氧类别可以改变精子的膜、DNA的完整性和精子活动能力。因此，发明人认为，所述菌株的抗氧化能力提高了精液质量，特别地提高了精子活动能力和减少了精子DNA片段化，这最终提高了雄性生育力。另一方面，由于长双歧杆菌(特别是菌株长双歧杆菌CECT 7347)的抗炎能力，在本发明中也考虑了单独地使用长双歧杆菌(特别是长双歧杆菌CECT
7347)来提高雄性生育力的可能性。本发明的作者认为，长双歧杆菌CECT 7347降低炎性因子TNF-α的水平和增加抗炎细胞因子IL-10的产生的能力保护了精子免受氧化应激影响。因此，在本发明中也考虑了至少包含鼠李糖乳杆菌CECT 8361或长双歧杆菌CECT 7347的组合物以及其在提高受试者的雄性生育力中的用途。

[0012] 在一个方面，本发明涉及与长双歧杆菌相组合的鼠李糖乳杆菌在制备用于在受试者中提高雄性生育力的组合物(在下文中，“本发明的组合物”)中的用途。

[0013] 鼠李糖乳杆菌是一种通常作为益生菌进行使用的细菌，其主要存在于酸奶和其他乳制品中。鼠李糖乳杆菌的科学分类为：界：细菌界(Bacteria)；门：厚壁菌门(Firmicutes)；纲：芽孢杆菌纲(Bacilli)；目：乳杆菌目(Lactobacillales)；科：乳杆菌科(Lactobacillaceae)；属：乳杆菌属(Lactobacillus)；种：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。另一方面，长双歧杆菌是一种具有圆形形状的、过氧化氢酶-阴性的革兰氏阴性细菌，其存在于胃肠道中，在那里产生乳酸。长双歧杆菌的科学分类为：界：细菌界(Bacteria)；门：厚壁菌门(Firmicutes)；纲：放线细菌纲(Actinobacteria)；目：双歧杆菌目(Bifidobacteriales)；科：双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)；属：双歧杆菌属(Bifidobacterium)；种：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。

[0014] 在本发明中，在受试者中“提高雄性生育力”是指改善所述受试者的精液质量，这意味着增加了使雌性受孕并获得后代的可能性。如本领域专业人员所理解的，在本发明的情形下，受试者的精液质量相对于在摄入本发明的菌株之前所述受试者的精液质量而言得到改善。受试者的精液质量可以通过许多参数来进行测量，例如但不限于，精子活动能力、精子生存力、其形态、精子的膜的组成、精子的浓度、一次射出的精液的体积和精子DNA的完整性。在现有技术中已经描述了一些方法用于测量所有这些参数，并且它们的使用对于本领域专业人员来说是常规实践。有些方法评价精子DNA的完整性：TUNEL试验(末端转移酶dUTP缺口末端标记(Terminal Transferase dUTP Nick End Labeling))；精子染色质结构分析试验(SCSA)；彗星试验；和精子染色质扩散测试(SCD)。其他试验鉴定在精子染色质包装中的缺陷：用甲苯胺蓝、吖啶橙和色霉素A进行染色。此外，存在有各种可以与较高的精液质量相关联的分子标志物，例如各种不同类型的RNA(mRNA、微小RNA等)，尽管它们并不是在临床中常规施行的。

[0015] 因此，在一个特别的实施方案中，所述雄性生育力的提高包括精子活动能力、精子生存力、精子的膜的组成、形态正常的精子的浓度和/或在一次射出的精液中精子总数目的提高，和/或包括精子DNA片段化的减少和精子染色质的完整性的改善。

[0016] 精子DNA片段化的减少避免了活动能力、生育力的丧失，并且降低了在早期胚胎发育期间和在子代中发生改变的可能性。

[0017] 在本发明中将会理解，当出现下述情况时，精子染色质的完整性得到改善：精子DNA以紧密且稳定的方式进行组构，从而取得这样的遗传物质的包装，该包装确保了DNA以如此的物理和化学方式进行递送，以致于能够在授精过程的合适时刻去紧缩并且没有缺陷地传递DNA。

[0018] 在本发明中，术语“受试者”等价于术语“个体”；由此可以在本发明中无区别地使用这两个术语。除了任何个体之外，“受试者”还指属于任何物种的产生用于生殖的配子的任何雄性动物。受试者的实例包括但不限于，具有商业价值的动物，例如鱼类(鳟鱼、沙丁鱼、鲤鱼、鲑鱼等)、禽类(鸡、鸵鸟、雏鸡、鹅、鹌鹑等)、兔子、野兔、家养动物(狗、猫等)、绵羊类家畜、山羊类家畜(山羊等)、猪类家畜(野猪、猪等)、马类家畜(马、矮种马等)、牛类家畜(公牛、阉牛等)；具有狩猎价值的动物，例如马鹿、鹿、驯鹿等；具有生态学价值的动物，即濒临灭绝的或其种群在自然界中是罕见的那些动物，例如白虎、犀牛、大熊猫、美洲狮、猞猁等；和人类。然而，在一个特别的实施方案中，所述受试者为鱼或哺乳动物，优选地，从由人、猪、马、兔子、阉牛和公牛组成的组中选择的哺乳动物。

[0019] 可以将在本发明中所描述的用途应用于任何雄性受试者以提高其生育力，不论所述生育力是经降低的(低生育力的)还是未降低的(能育的)。在能育的雄性受试者中，生育力的提高可以由于提高了生殖能力而是令人感兴趣的。另一方面，生育力的提高还可以由于通常对于希望拥有更高怀孕可能性的人类夫妇来说代表了一种优势而是令人感兴趣的。在低生育力的雄性个体中，可以使用本发明的组合物来治疗所述低生育力，即改善成功实现受孕的可能性。

[0020] 在另一个有利的应用中，可以向哺乳动物物种的雄性个体(特别地，向男人)施用本发明的组合物，而没有先验地知道所述雄性个体是能育的还是低生育力的。作为阐释，在该应用中，当受孕延迟实现时，可以向夫妇中的男性个体施用本发明的组合物，例如以避免必须进行检验和/或在进行任何检验之前。这是重要的，因为精子的检验对于所涉及的个体来说是昂贵的并且是令人厌烦的，因为检验系统的特异性和灵敏度是多变的，并且因为可能在精子数量和/或质量方面具有波动。

[0021] 还可以在具有拥有子女的意向的夫妇中的男性个体中使用本发明的组合物，即为了增加受孕的可能性和/或为了抵消雄性生育力的任何问题，而再次不需要进行预先的检验。

[0022] 还可以使用本发明的组合物以用于长期预防或抵消关于生殖而言精子数量和质量的波动的影响。

[0023] 另一方面，还可以预防性地使用所述组合物以用于在处于风险中的个体或者患有泌尿生殖道功能障碍和/或其他可能对于精子质量具有影响的功能障碍的个体中(例如，在经历(或应当经历)药理学治疗的个体中)和在药理学治疗或放射疗法期间阻止精子质量的降低。此外，可以使用本发明的组合物和/或制剂，例如以用于改善可能由于诸如营养不良、环境因素和/或暴露于有害物质之类的因素而受到影响的精子质量。

[0024] 鼠李糖乳杆菌菌株与长双歧杆菌菌株之间的比例可以在宽的范围内变动。在本发明的组合物中“鼠李糖乳杆菌:长双歧杆菌”之比包括但不限于，10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、
90:10和95:05。然而，在一个特别的实施方案中，“鼠李糖乳杆菌:长双歧杆菌”之比为大约
50:50。

[0025] 如本领域专业人员所理解的，可以将本发明的组合物配制成用于其药学施用，即作为被受试者消费或摄入的其他药理学产品的一部分，或者用于其饮食施用，即作为在膳食中被受试者消费的食物的一部分。因此，在一个特别的实施方案中，所述组合物为药物组合物或功能性营养组合物。

[0026] 所述药物组合物为一整组的以任何浓度的至少由本发明的菌株所形成的组分，其另外还可以包含一种或多种具有一些生物学、药理学和/或兽医学活性的组分或化合物；特别地，当口服施用给受试者时可以发挥所述生物学活性的化合物。这些额外的化合物可以是一种或多种本身已知当施用(通过口服途径)给物种(特别是哺乳动物物种)的受试者或雄性个体时对于雄性个体的生育力和/或对于雄性个体的精子质量具有有益影响的化合物；和/或可以是一种或多种在其施用给受试者后可以在后来增加、增强和/或促进本发明的菌株的活性的组分。如本领域专业人员所理解的，所述额外的化合物应当是与本发明的菌株相容的。因此，在本发明的情形下，兽医学组合物也包括在术语“药物组合物”之内。

[0027] 所述额外的化合物可以是一种或数种保证精子发生或者精子发生的任何部分和/或过程的化合物。这些化合物中的一些非限制性实例包括，但不限于：

[0028] -镁，即以生物可利用的镁源的形式，例如生物可利用的镁盐(例如，柠檬酸镁)；

[0029] -一种或多种维生素，特别是维生素B12和/或维生素B2；

[0030] -合适的甲基来源，例如甲硫氨酸、甜菜碱和/或胆碱；该后者例如以磷脂酰胆碱的形式，或者以其适当的来源(例如卵磷脂)的形式；

[0031] -合适的甲基化试剂，例如S-腺苷甲硫氨酸(SAM)；

[0032] -葡萄糖源；或者

[0033] -上述化合物的任何适当的组合。

[0034] 这些额外的组分还可以是一种或数种改善精子的(还原的)谷胱甘肽水平的化合物。该类型化合物的一个非限制性实例为维生素B6，其可以以吡哆醇(稳定的)或其衍生物(例如，吡哆醛或吡哆胺)的形式存在或进行施用。精子的谷胱甘肽状态的改善是重要的，以便改善精子质量，包括(虽然并不只是)精子平均寿命、精子活动性和/或使卵子受精的能力的增加。适合于其在本发明的组合物和制剂中使用的其他组分可以包括合适的铜源，特别是Cu2+的离子，例如硫酸铜(II)、碳酸铜(II)或柠檬酸铜(II)。

[0035] 帮助提高雄性生育力的其他化合物的实例包括但不限于，叶酸、锌、谷胱甘肽、精氨酸和α-硫辛酸。

[0036] 在一个特别的实施方案中，所述药物组合物包含在药学上可接受的载体和/或赋形剂。

[0037] 术语“赋形剂”涉及这样的物质，其有助于所述组合物的组分(即本发明的菌株)中的任一种的吸收或使所述组分稳定化，和/或在给予粘稠度或提供使其更令人愉快的味道的意义上有助于所述药物组合物的制备。因此，赋形剂可以具有下列功能：使组分保持粘合在一起(例如，淀粉、糖或纤维素)，增甜，提供着色剂，保护活性成分(例如，用于将活性成分与空气和/或湿气相隔离)，填充锭剂、胶囊或任何其他呈现形式，崩解以促进组分的溶解等，而不排除在本段落中未提及的其他类型的赋形剂。因此，将术语“赋形剂”定义为这样的被包括在盖仑氏形式中的材料，所述材料被添加至活性成分或其联合以使其制备和稳定性成为可能、修饰其器官感觉特性或者决定药物组合物的物理化学特性和其生物利用率。“在药学上可接受的”赋形剂应当允许药物组合物的化合物的活性，即其与本发明的菌株相容。

[0038] “盖仑氏形式”或“药学形式”是这样的布置，使活性成分和赋形剂适应于所述布置以便构成组合物或药物。其通过由制造商呈现药物组合物时所处的形式和进行施用时所处的形式的组合来进行定义。

[0039] “载体”或“承载体”优选地为惰性物质。载体的功能是促进其他化合物的掺入，允许更好的按剂量给药和施用，和/或给予所述药物组合物以粘稠度和形状。因此，载体是这样的物质，所述物质在药物中使用以稀释本发明的药物组合物的任一种组分直至所确定的体积或重量；或者虽然即使没有稀释所述组分，但能够允许更好的按剂量给药和施用和/或给予所述药物以粘稠度和形状。当呈现形式为液体时，所述在药学上可接受的载体为稀释剂。

[0040] 此外，所述赋形剂和所述载体应当是在药学上可接受的，即所述赋形剂和所述载体是允许的并且就不对所施用至的受试者造成损害进行了评价。

[0041] 在每一种情况下，使药物组合物的呈现形式适合于所采用的施用类型。因此，可以使所述组合物以溶液形式或在临床上允许的任何其他施用形式并且以在治疗上有效的量来呈现。可以将本发明的药物组合物配制成固体、半固体或液体形式，例如压制片、胶囊、粉末、颗粒剂、溶液、栓剂、凝胶剂或微球剂。在一个特别的实施方案中，所述药物组合物以适合于口服施用的形式存在。

[0042] 适合于口服施用的形式涉及可以允许其口服施用的物理状态。所述适合于口服施用的形式选自由下列各项组成的列表(但不限于下列各项)：滴剂、糖浆剂、草药汤剂、酏剂、悬浮液、临时配制的悬浮液、可饮用的小瓶、压制片、胶囊、颗粒剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂、糖锭和冻干物。

[0043] 除了在前面的段落中所描述的外，在本发明中还考虑了这样的可能性，即可以将本发明的组合物以与其他化合物相联合的形式施用给受试者，虽然这些其他化合物不构成本发明的组合物的一部分。所述化合物的实例已经在前面的段落中提及。

[0044] 因此，向受试者施用所述化合物可以与本发明的组合物同时地或顺次地进行。

[0045] 在将本发明的组合物配制成功能性营养组合物的情况下，所述营养组合物可以是食物或者被掺入到旨在人类饮食和动物饲喂的食物或食品中。因此，在一个特别的实施方案中，所述功能性营养组合物选自食物(其可以是用于特殊营养目的的食物，或药用食物，或功能性食物)或营养补充物。

[0046] 本发明的“功能性营养性组合物”或“功能性营养组合物”这一术语涉及这样的食物，其除了向食用它的受试者提供营养物之外，还对机体的一种或数种功能产生有益的影响，从而提供更好的健康状态和舒适。在本发明中，所述功能性营养组合物旨在提高雄性生育力。

[0047] 术语“补充物”(术语“膳食补充物”、“营养补充物”、“食物补充物”或“有营养的补充物”中的任何一个的同义词)是旨在对饮食进行补充的组分。膳食补充物的一些实例包括但不限于，维生素、矿物质、植物性产品、氨基酸和食物组分，例如酶和腺体提取物。它们既不是作为常规食物的替代物而存在，也不是作为餐食或营养膳食的单一组分而存在，而是作为膳食的补充物而存在。

[0048] 可以包含鼠李糖乳杆菌菌株和长双歧杆菌菌株的食物或者包含它们的组合物(如在前面的段落中所阐明的)的实例包括但不限于，草料、乳制品、植物产品、肉制品、开胃食品、巧克力、饮料、婴儿食物、谷类、油炸食品、焙烤食品、饼干等。乳制品的实例包括但不限于，源自经发酵的乳的产品(例如，但不限于，酸奶或奶酪)或者源自未发酵的乳的产品(例如，但不限于，冰淇淋、黄油、人造黄油或乳清)。所述植物产品为例如，但不限于，以任何呈现形式的谷类(经发酵的或未发酵的)，或开胃食品。所述饮料可以是，但不限于，非发酵乳。然而，在一个特别的实施方案中，所述食品选自由乳制品、肉制品、植物产品、饲料和饮料组成的组。

[0049] 在另一个特别的实施方案中，通过膳食来向受试者施用本发明的组合物。

[0050] 如本领域专业人员所理解的，微生物鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌应当以在治疗上有效的量存在于本发明的组合物中以便可以在当施用给受试者时发挥其提高雄性生育力的效应。在本发明中，“在治疗上有效的量”是指所述药物组合物的组分的这样的量，所述量在当施用给受试者时足以产生该效应。所述药物组合物的所述组分涉及本发明的菌株。在治疗上有效的量随着尤其是例如受试者的年龄、体重、总体健康状态、性别和膳食而变化，同样地随着施用方式和时间、排泄速度和药物组合而变化。因此，在一个特别的实施方案中，在所述组合物中鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌菌株的微生物总浓度为106-1012cfu，优选地，109cfu。在另一个特别的实施方案中，在所述组合物中鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌的微生物施用剂量为106-1012cfu/天，优选地，109cfu/天，和在另一个更加特别的实施方案中，施用制度为每天至少一次，特别地，每天两次，和更特别地，每天三次，每次摄入餐食(早餐、午餐和晚餐)时进行一次。

[0051] 在一个特别的实施方案中，所述鼠李糖乳杆菌菌株为菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361或衍生自其的菌株，和/或所述长双歧杆菌菌株为菌株长双歧杆菌CECT 7347或衍生自其的菌株。在下面将详细地描述本发明的该特别的实施方案。

[0052] 本发明的组合物II

[0053] 在另一个方面，本发明涉及包含鼠李糖乳杆菌CECT 8361和长双歧杆菌CECT 7347或者衍生自它们的菌株的组合物(在下文中，“本发明的组合物II”)，所述菌株的组合具有提高雄性生育力的能力。

[0054] 菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361分离自健康的且以母乳哺育进行喂养的低于三月龄的儿童的粪便。该菌株于2013年5月27日按照布达佩斯条约保藏在作为国际保藏单位的西班牙典型培养物保藏中心(Colección de Cultivos Tipo)(Edificio 3CUE,Parc Científic Universitat de Valencia,Catedrático Agustín Escardino,9,46980 Paterna(Valencia)西班牙)。所分配的保藏号为CECT 8361(在下文中，“本发明的菌株CECT
8361”或“鼠李糖乳杆菌CECT 8361”)。本发明的菌株CECT 8361的科学分类为：界：细菌界(Bacteria)；门：厚壁菌门(Firmicutes)；纲：芽孢杆菌纲(Bacilli)；目：乳杆菌目(Lactobacillales)；科：乳杆菌科(Lactobacillaceae)；属：乳杆菌属(Lactobacillus)；
种：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。在分离本发明的菌株CECT 8361期间，发明人观察到，鼠李糖乳杆菌CECT 8361令人惊奇地具有比乳杆菌属的其他分离物更大的抗氧化活性，即给细胞提供了更大的针对氧化应激的保护作用。因此，在一个特别的实施方案中，菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361具有比乳杆菌属的其他菌株更大的抗氧化活性。因此，发明人认为，该菌株的抗氧化能力对于解释精液质量的提高来说是重要的，特别是在精子活动能力的提高方面和在精子DNA片段化的减少方面，这最终提高了雄性生育力。

[0055] 菌株长双歧杆菌CECT 7347分离自经历母乳哺育的低于三月龄的健康儿童的粪便，并且于2007年12月20日按照布达佩斯条约保藏在作为国际保藏单位的西班牙典型培养物保藏中心(总部在Burjassot,Valencia)。所分配的保藏号为CECT 7347(在下文中，“本发明的菌株CECT 7347”或“长双歧杆菌CECT 7347”)。本发明的菌株CECT 7347的科学分类为：界：细菌界(Bacteria)；门：厚壁菌门(Firmicutes)；纲：放线细菌纲(Actinobacteria)；目：
双歧杆菌目(Bifidobacteriales)；科：双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)；属：双歧杆菌属(Bifidobacterium)；种：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。本发明的菌株CECT 7347具有抗炎活性。

[0056] 在本发明之内，还考虑了这样的微生物或细菌，其衍生自本发明的菌株CECT 8361和本发明的菌株CECT 7347，并且保留了提高雄性生育力的能力，这归因于它们改善精液质量和/或减少精子DNA片段化和改善染色质的完整性。衍生自本发明的菌株的菌株或微生物的实例可以是突变体，其相对于本发明的菌株而言在其基因组中具有变化，但所述变化不影响所述菌株提高雄性生育力的能力。因此，在本发明之内还考虑了保留了提高生育力的能力的衍生自本发明的菌株的突变型菌株。因此，在另一个方面，本发明涉及衍生自本发明的菌株CECT 8361和本发明的菌株CECT 7347的菌株，其具有在当联合施用给受试者时提高雄性生育力的能力。

[0057] 衍生自本发明的菌株CECT 8361和本发明的菌株CECT 7347的菌株可以天然地或者有意地产生，这通过现有技术中已知的诱变方法，例如，但不限于，使原始菌株在诱变试剂或引起应激的试剂存在下进行生长，或者借助于旨在修饰、删除和/或包括特定基因的基因工程。因此，在本发明之内还考虑了保留了其提高雄性生育力的能力的、衍生自本发明的菌株的、经基因修饰的生物。

[0058] 另一方面，在本发明之内还考虑了本发明的菌株CECT 8361和本发明的菌株CECT 7347或者衍生自本发明的菌株CECT 8361和本发明的菌株CECT 7347的菌株的细胞组分、代谢物和所分泌的分子，以及包含所述组分的组合物和其用于提高雄性生育力的用途。在所述细菌的细胞组分中可以包括细胞壁的组分(例如，但不限于，肽聚糖)、核酸、膜的组分等，例如蛋白质、脂质和碳水化合物及其组合(例如，脂蛋白、糖脂或糖蛋白)。所述代谢物包括由所述细菌在其生长期间、在其在技术过程中使用期间或在产品储存期间作为其代谢活性的结果而产生或修饰的任何分子。这些代谢物的实例为，但不限于，有机和无机酸、蛋白质、肽、氨基酸、酶、脂质、碳水化合物、脂蛋白、糖脂、糖蛋白、维生素、盐、金属或核酸。所分泌的分子包括由所述细菌在其生长期间、在其在技术过程(例如，制备食物或药物的技术过程)中使用期间或在产品储存期间分泌或释放到外部的任何分子。这些分子的实例为，但不限于，有机和无机酸、蛋白质、肽、氨基酸、酶、脂质、碳水化合物、脂蛋白、糖脂、糖蛋白、维生素、盐、金属或核酸。

[0059] 在本发明中将会理解，当出现下述情形时，菌株或其组合具有“提高雄性生育力”的能力：在其被受试者摄入后，所述菌株能够提高所述受试者的精液质量，并由此增加使雌性受孕并获得后代的可能性。

[0060] 本发明的组合物中本发明的菌株CECT 8361与本发明的菌株CECT 7347之间的比例可以在宽的范围内变动。在本发明的组合物中“鼠李糖乳杆菌CECT 8361:长双歧杆菌CECT 7347”之比包括但不限于，10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10和95:05。然而，在一个特别的实施方案中，“鼠李糖乳杆菌CECT 8361:长双歧杆菌CECT 7347”之比为大约50:50。

[0061] 如已经在前面关于本发明的组合物用于提高雄性生育力的用途所阐明的，可以将本发明的组合物II配制成用于其药学施用或用于其饮食施用。因此，在一个特别的实施方案中，所述组合物为药物组合物或功能性营养组合物。

[0062] 所述药物组合物为一整组的以任何浓度的至少由本发明的菌株CECT 8361和本发明的菌株CECT 7347所形成的组分，其另外还可以包含一种或多种具有一些生物学、药理学和/或兽医学活性的组分或化合物；特别地，当口服施用给受试者时可以发挥所述生物学活性的化合物。这些额外的化合物可以是一种或多种本身已知当施用(通过口服途径)给物种(特别是哺乳动物物种)的受试者或雄性个体时对于雄性个体的生育力和/或对于雄性个体的精子质量具有有益影响的化合物；和/或可以是一种或多种在其施用给受试者后可以在后来增加、增强和/或促进本发明的菌株CECT 8361和本发明的菌株CECT 7347的活性的组分。如本领域专业人员所理解的，所述额外的化合物应当是与本发明的菌株相容的。因此，在本发明的情形下，兽医学组合物也包括在术语“药物组合物”之内。

[0063] 所述额外的化合物可以是一种或数种保证精子发生或者精子发生的任何部分和/或过程的化合物。这些化合物的一些非限制性实例已经关于前面的发明方面作了描述，并且可应用于本发明的组合物II。

[0064] 在一个特别的实施方案中，所述药物组合物包含在药学上可接受的载体和/或赋形剂。术语“在药学上可接受的”“载体”和“赋形剂”已在本发明书中先前进行了定义，并且可应用于该发明方面。

[0065] 在每一种情况下，使药物组合物的呈现形式适合于所采用的施用类型。可以将所述药物组合物配制成固体、半固体或液体形式，例如压制片、胶囊、粉末、颗粒剂、溶液、凝胶剂或微球剂。在一个特别的实施方案中，所述药物组合物以适合于口服施用的形式存在。口服施用的实例先前已进行了阐明。

[0066] 此外，在本发明中还考虑了这样的可能性，即可以将本发明的组合物以与其他化合物相联合的形式施用给受试者。所述化合物的实例先前也已提及。因此，向受试者施用所述化合物可以与本发明的组合物同时地或顺次地进行。

[0067] 在将包含本发明的菌株CECT 8361和本发明的菌株CECT 7347的组合物配制成功能性营养组合物的情况下，所述营养组合物可以是食物或者被掺入到旨在人类饮食和动物饲喂的食物/食品中。因此，在一个特别的实施方案中，所述功能性营养组合物选自食物(其可以是用于特殊营养目的的食物，或药用食物)或营养补充物。术语“功能性营养组合物”、“补充物”和可以包含本发明的菌株的食物或本发明的组合物II的实例已在前面的段落中作了描述。然而，在一个特别的实施方案中，所述食品选自由乳制品、肉制品、植物产品、饲料和饮料组成的组。在另一个特别的实施方案中，通过膳食来向受试者施用本发明的组合物。

[0068] 如本领域专业人员所理解的，本发明的菌株应当以在治疗上有效的量存在于本发明的组合物中以便可以在当施用给受试者时发挥其提高雄性生育力的效应。术语“在治疗上有效的量”，以及在本发明的情形下可以采用的施用途径、剂量和制度，先前已作了描述。在一个特别的实施方案中，在本发明的组合物中鼠李糖乳杆菌CECT 8361和长双歧杆菌CECT 7347的微生物总浓度为106-1012cfu，优选地，109cfu。

[0069] 用于在受试者中提高雄性生育力的方法

[0070] 在另一个方面，本发明涉及用于提高雄性生育力的方法(在下文中，“本发明的方法”)，该方法包括向受试者施用在治疗上有效的量的组合物，所述组合物包含鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌，特别是菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361和长双歧杆菌CECT 7347。

[0071] 本领域专业人员将会理解，所有在前面关于鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌的用途所描述的特别的实施方案均可应用于本发明的方法：施用形式、呈现形式、组合物类型、剂量、可以进行治疗的受试者等。

[0072] 在整个说明书和权利要求书中，词语“包含(包括)”及其变化形式并不意图排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。对于本领域专业人员来说，本发明的其他目标、优点和特征将会部分地从说明书中和部分地从本发明的实践中得出。下面的实施例和附图以举例说明的方式来提供，而并不意图限制本发明。

[0073] 附图简述

[0074] 图1是描述了在整个实验设计中能动的精子(％)的变化的柱状图：C(对照；n＝9)，T1(治疗1；n＝8)，T2(治疗2；n＝7)，L1(洗涤1；n＝8)，L2(洗涤2；n＝7)。具有星号的值(平均值±误差)显著地不同于对照，在对于相关样品进行Student’s t统计学分析后(p<0.05)。

[0075] 图2是描述了在整个实验设计中精子DNA片段化指数(DFI)(％)的变化的柱状图：C(对照；n＝9)，T1(治疗1；n＝9)，T2(治疗2；n＝7)，L1(洗涤1；n＝8)，L2(洗涤2；n＝6)。具有星号的值(平均值±误差)显著地不同于对照，在对于相关样品进行Student’s t统计学分析后(p<0.05)。

[0076] 图3是显示了鼠李糖乳杆菌CECT 8361在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(此后，C.elegans)中的抗氧化能力的柱状图。就在秀丽隐杆线虫中的抗氧化活性来仔细检查在本发明的两个申请人之一(即Biopolis,S.L.)的收藏中的属于乳杆菌属的23个分离物。显示了用每种分离物饲喂的秀丽隐杆线虫的存活率相对于在对照条件(大肠杆菌(E.coli)OP50)下秀丽隐杆线虫的存活率而言的百分比。正值表明了抗氧化活性，和负值表明了可能的促氧化效应。
实施例

[0077] 下面将通过由发明人进行的一些试验来举例说明本发明，这些试验显露了本发明的产品的功效。

[0078] 实施例1：在向受试者联合施用菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361和菌株长双歧杆菌CECT 7347后精子质量的改善

[0079] 为了着手进行该研究，选择菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361和长双歧杆菌CECT 7347。该选择基于菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361所具有的高的抗氧化活性和先前对于菌株长双歧杆菌CECT 7347所描述的抗炎活性。

[0080] 施用规格为胶囊，其包含处于百分之五十(50％)的这两种微生物的组合。给药剂量为每天一粒胶囊，这相应于施用109cfu/天。

[0081] 在León大学生物伦理委员会的批准之下，在通过遵循由赫尔辛基宣言建立的规范并执行在西班牙国土内的现行法律而签署了相应的知情同意后，未进行药物治疗并具有同质饮食习惯的弱精子症的男性参与了该实验。

[0082] 志愿者在禁欲三天后按照世界卫生组织的手册(WHO,2010)的指导并使用无菌容器来捐献其一次射出的精液的样品。在采样后迅速收集捐献物，以便尽可能早地在实验室中进行处理。

[0083] 向捐献者所要求的生物学样品为下列：对照，C(在益生菌摄入开始之前)；治疗1，T1(摄入益生菌3周)；治疗2，T2(摄入益生菌6周)；洗涤1，L1(在益生菌摄入结束后3周)；和洗涤2，L2(在益生菌摄入结束后6周)。

[0084] 益生菌的摄入是每天进行的。施用规格为每天一粒胶囊，其包含浓度为109cfu/胶囊的鼠李糖乳杆菌CECT 8361和长双歧杆菌CECT 7347这两个菌株。

[0085] 将精子在1×PBS缓冲液中进行稀释，直至10-20×106个细胞/mL的最终浓度。将该稀释物加载在处于37℃的10μm的Makler计数室中。在每一个所述样本中以相同的方式来评价精子活动能力，其中采用计算机辅助精子分析系统(CASA)，其由三目相差显微镜组成，该显微镜使用10×负相差物镜，配备有37℃加热板和Basler A312fc 数码相机。捕获图像，并且通过使用具有关于人精子的特定调整的计算机化活动能力分析仪来进行分析。该系统在整体水平上提供下列三个参数：(1)能活动的精子的百分比，(2)进行性的精子的百分比，和(3)静止的精子的百分比。

[0086] 施行SCSA(“精子染色质结构试验(Sperm Chromatin Structure Assay)”)技术(Evenson)，以便评价DNA片段化。用样品的一个等分试样来进行采用吖啶橙(AO)的异染性染色。该分子当与变性的DNA相结合时发射在红色波段内的荧光，和当与处于良好状态的DNA双螺旋相结合时发射在绿色波段内的荧光。将一次射出的精液用TNE缓冲液(0.15M 6
NaCl，0.01M Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.4)稀释至大约1-2×10个细胞/mL的最终细胞浓度。将样品立即在液氮中进行冷冻直至其加工。随后，使样品在37℃的浴中进行解冻，并与
200μl的酸性去污剂溶液(0.08N HCl，0.15M NaCl，0.15Triton X 100，pH 1.4)相混合。在暴露于酸性去污剂30秒后，通过添加1.2mL的包含6g AO/mL缓冲液(0.037M柠檬酸，0.126M Na2HPO4，0.0011M EDTA(二钠)，0.15M NaCl，pH 6.0)的染色溶液来进行采用吖啶橙的染色。
在染色后正好3分钟，将样品在配备有标准光学仪器和调谐至488μm的氩激光器的流式细胞仪上进行分析。将细胞流量保持在大约200个细胞/秒，并且对于每个样品计数5000个事件。
记录并用自由软件Weasel 3.1来分析相应于所获取的颗粒的红色荧光(FL3光检测器；670长通滤光片)和绿色荧光(FL1光检测器；530/30 通带滤光片)的数据。分析DNA片段化指数(DFI)这一主要参数，其相应于红色荧光与总荧光(红色和绿色)之间的比率。

[0087] 通过使用程序SPSS版本20来进行统计学分析。在所有情况下，数据均以“平均值±SE”来呈现。对于相关样品借助于Student’s t检验来比较每个变量的平均值(p<0.05)。

[0088] 在对照样本上确证了捐献者的活动能力状态，其中证明了按照世界卫生组织的标准(WHO,2010)所述志愿者被归类为弱精子症。在该样本中记录到的能动的细胞的值为5.56±2.51％(平均值±误差)。在施用益生菌三周(T1)后，能活动的精子的百分比相比于前面的样本而言增加至大约五倍，达到31.88±6.01％的值(平均值±误差)。该提高在摄入益生菌六周(T2)时得到保持，以及后来在益生菌施用结束后3和6周(L1和L2)时所进行的两次取样中依然保持。收集到的数据分别为：28.14±8.79％；33.25±6.38％；和39.57±8.52％(平均值±误差)(图1)。在进行统计学分析后，发现在对照和其余样本之间的显著差异(对于相关样品的Student’s t检验，p<0.05)。参见图1。

[0089] 图2显示了关于DNA片段化指数，在整个实验设计中在每个关键点处所获得的平均百分比值。在对照样本(C)中，发现最高的DFI(精子DNA片段化指数)：25.74±0.59％。在施用益生菌六周后，受损DNA的百分比降低至21.11±1.00％和21.58±0.94％(分别为T1和T2)。该趋势在首次洗涤(L1)中得到保持，其DFI平均值为21.64±1.73％。在结束暴露于所述菌株后六周，在前面的取样期间看到的所记录的改善在洗涤2(L2)中开始发生变化，其中记录到相比于T1、T2和L1而言更高的DFI，具有23.09±1.28％的片段化指数，因此改变了该趋势。在T1、T2和L1中发现与对照样本的显著差异(对于相关样品的Student’s t检验，p<0.05)。

[0090] 结果证明了菌株鼠李糖乳杆菌CECT 8361和长双歧杆菌CECT 7347在当作为功能性营养组合物被摄入时对于精子活动能力的刺激作用。还证实了在所述治疗后精子DNA片段化的显著降低。

[0091] 实施例2：鼠李糖乳杆菌CECT 8361的抗氧化活性

[0092] 基于其在秀丽隐杆线虫中的抗氧化活性来仔细检查属于本发明的两个申请人之一(即Biopolis,S.L.)的收藏的乳杆菌属的23个分离物。在该研究中所包括的菌株分离自低于3月龄的仅采用母乳哺育的儿童的粪便。

[0093] 图3显示了用该研究的乳杆菌属菌株获得的结果。数据显示了用每种细菌菌株饲喂的秀丽隐杆线虫动物模型相对于在标准条件(菌株大肠杆菌OP50)下培养的秀丽隐杆线虫而言的存活率的提高的百分比。如可以观察到的，被鉴定为鼠李糖乳杆菌的分离物1是在用过氧化氢施加氧化应激后给秀丽隐杆线虫提供最高存活率的分离物(相对于对照条件而言存活率提高了27％)。

[0094] 通过对16S核糖体DNA(rDNA)进行测序和随后使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)这一在线工具将所获得的序列与存放在公共数据库中的全部基因序列进行比较来实施分离物1的明确鉴定。本发明的菌株CECT 8361被鉴定为鼠李糖乳杆菌，其中与属于该物种的公开序列获得最高的同源性(100％)。该菌株以CECT8361保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)。

[0095] SEQ ID NO:1－从鼠李糖乳杆菌CECT 8361的16S rDNA的测序中获得的序列。

[0096] GTCGAACGAGTTCTNATTATTGAAAGGTGCTTGCATCTTGATTTAATTTTGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAAATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAANGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGANGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGANNAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACNACCGCAAGGNTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGNAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCANCNCGAAGAACCTTACCNGGTCTTGACNTCTTTTGATCA

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