用于改善反刍动物健康和/或性能的菌株和方法
阅读：386发布：2020-05-13
专利汇可以提供用于改善反刍动物健康和/或性能的菌株和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且描述了包括下列菌株的菌株：屎肠球菌菌株8G‑1(NRRL B‑50173)、屎肠球菌菌株8G‑73(NRRL B‑50172)、短小芽孢杆菌菌株8G‑134(NRRL B‑50174)和具有这些菌株的每一种的所有鉴定特征的菌株。所述菌株的一种或多种可用于 治疗 或 预防 酸中毒。它们还可用于改善 反刍动物 健康和/或性能的其他量度。描述了单独或组合使用所述菌株的方法。还提供了制备所述菌株的方法。，下面是用于改善反刍动物健康和/或性能的菌株和方法专利的具体信息内容。
1.一种分离的菌株，选自由下列组成的组：屎肠球菌(Enterococcus faecium)菌株8G-
1 NRRL B-50173、屎肠球菌菌株8G-73 NRRL B-50172以及它们的组合。
2.如权利要求1所述的菌株，其中所述菌株是屎肠球菌菌株8G-1 NRRL B-50173。
3.如权利要求1所述的菌株，其中所述菌株是屎肠球菌菌株8G-73 NRRL B-50172。
4.一种组合物，包括下列物质：
选自由下列组成的组的分离的菌株或菌株的组合：屎肠球菌菌株8G-1 NRRL B-50173、屎肠球菌菌株8G-73 NRRL B-50172；以及
莫能菌素。
5.选自由下列组成的组的菌株在制备用于施用至动物的药物中的用途：屎肠球菌菌株
8G-1 NRRL B-50173、屎肠球菌菌株8G-73 NRRL B-50172以及它们的组合。
6.如权利要求5所述的用途，其中在施用给所述动物之后，所述药物在所述动物中或为所述动物提供与未施用所述药物的动物相比下列益处的至少一种：(a)降低酸中毒；(b)如延迟的乳酸积累和延长的挥发性脂肪酸产生所指示的，稳定瘤胃代谢；(c)如pH恢复和乳酸降低所度量的，更迅速地从酸中毒攻击恢复；以及(d)降低与酸中毒相关的临床体征表现。
7.如权利要求5所述的用途，其中所述动物是反刍动物。
8.如权利要求5所述的用途，其中所述动物是公牛、小阉牛、母牛或牛犊。
9.如权利要求5所述的用途，其中所述动物是小母牛。
10.如权利要求5所述的用途，其中所述菌株是屎肠球菌菌株8G-1 NRRL B-50173、屎肠球菌菌株8G-73 NRRL B-50172或它们的组合，并且其中以使得每天用5×108CFU/动物/天至5×1010CFU/动物/天给予动物的水平给动物施用所述药物。
11.如权利要求7所述的用途，其中从30天龄开始给所述动物施用所述药物。
12.如权利要求5所述的用途，其中所述动物是肉牛动物。
13.如权利要求5所述的用途，其中所述动物是乳牛。
14.如权利要求5所述的用途，其中所述菌株是屎肠球菌菌株8G-1 NRRL B-50173。
15.如权利要求5所述的用途，其中所述菌株是屎肠球菌菌株8G-73 NRRL B-50172。
16.组合物在制备用于施用至动物的药物中的用途，所述组合物包含下列物质的：
有效量的选自由下列组成的组的菌株：屎肠球菌菌株8G-1 NRRL B-50173、屎肠球菌菌株8G-73 NRRL B-50172和它们的组合；以及
莫能菌素。
17.一种制备直接饲喂微生物的方法，所述方法包括：
(a)使选自由下列组成的组的菌株在液体营养肉汤中生长：屎肠球菌菌株8G-1 NRRL B-50173、屎肠球菌菌株8G-73 NRRL B-50172；以及
(b)从所述液体营养肉汤分离所述菌株以制备所述直接饲喂微生物。
18.如权利要求17所述的方法，还包括冷冻干燥所述菌株。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述菌株是屎肠球菌菌株8G-1 NRRL B-50173。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述菌株是屎肠球菌菌株8G-73 NRRL B-50172。
21.一种制备直接饲喂的微生物的方法，所述方法包括：
(a)使选自由下列组成的组的菌株在液体营养肉汤中生长：屎肠球菌菌株8G-1 NRRL B-50173、屎肠球菌菌株8G-73 NRRL B-50172；
(b)从所述液体营养肉汤分离所述菌株以制备所述直接饲喂微生物；以及(c)添加莫能菌素至所述直接饲喂微生物。
用于改善反刍动物健康和/或性能的菌株和方法
[0002] 相关申请的交叉引用
[0004] 文献
[0006] 本申请涉及用于控制酸中毒的菌株和方法。更具体地，本申请涉及用于改善反刍动物健康和/或性能的细菌菌株以及制备和使用所述菌株的方法。
[0007] 相关背景描述
[0008] 在过去的50年间给反刍动物饲喂高浓度的可发酵碳水化合物已经成为在牛肉和乳牛工业中常见的实践。改善肉的生产效率和品质的需求导致了这种趋势。还没有在不存在某些困难的情况下出现生产的改善。通过饲喂较高水平的谷物增加反刍动物对可发酵碳水化合物的消耗导致了诸如酸中毒的代谢疾患的发病率增加。高度浓缩物的消耗和瘤胃酸中毒之间的关系已在综述中得到很好地证明(Dunlop,1972；Slyter,1976)。许多研究者已显示在高水平的可迅速发酵碳水化合物(RFC)饲喂给牛之后，瘤胃pH降低，并且随后在动物中出现瘤胃微生物群破坏和生理改变(Allison,等人,1975；Hungate等人,1952；Elam,1976)。大多数研究者将这种降低归因于由瘤胃细菌如牛链球菌(Streptococcus bovis)的有机酸过量产生。然而，过量碳水化合物对瘤胃微生物群起始这种反应的作用还没有很好地被证明。
[0009] 在过去，饲喂的精细管理是对抗酸中毒的唯一方法。更具体地，用粗粮稀释谷物并且以逐步方法仔细控制饮食浓度百分比的增加以确保在14-21天的期间内平稳过渡至高浓度水平。大多数商业饲育场配制并制造含有不同比例的谷物与饲料的几种“适应”饮食。
[0010] 尽管精细饲喂管理在控制酸中毒方面通常很有效，但由于生产、运输、斩断饲料、处置增加的动物废物的高成本以及降低的生产效率，其对生产者来说极为昂贵。生产者和商业饲育场管理者需要容许有效生产饲喂家畜的高浓缩定额食物(ration)的执行性策略。
[0011] 其他策略结合了适应饮食的使用与饲喂抗微生物组分，如离子载运体。离子载运体通过降低革兰氏阳性的、产乳酸生物体如牛链球菌和乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)的瘤胃群体来抑制摄入并降低瘤胃中乳酸的产生(Muir等人1981)。
[0012] 尽管离子载运体的使用降低了饲育场中急性酸中毒的发病率，但消费者关注肉类生产中抗生素的使用并且饲育场管理者继续寻找降低成本同时改善动物性能和屠体组成的需要导致了降低酸中毒并改善饲育场牛性能的替代性方法的研究。
[0013] 使用直接饲喂微生物作为调节瘤胃功能并改善牛性能的方法在过去10年得到更多赞同。有两种目前用于牛肉工业来控制瘤胃酸中毒的基本的直接饲喂微生物技术：(1)使用产乳酸DFM技术和(2)添加能够利用瘤胃乳酸的特定细菌物种。尽管这些技术的每一个的报道的作用模式不同，但它们都试图解决瘤胃乳酸积累的问题。
[0014] 第一种方法，即，使用产乳酸DFM技术，试图通过刺激天然瘤胃微生物群来增加瘤胃乳酸利用率。如所报道的，相对缓慢生长的产乳酸菌如肠球菌(Enterococcus)物种的添加产生了轻微升高的瘤胃乳酸浓度。这种逐步的增加迫使瘤胃微生物群适应性改变为较高比例的酸耐受乳酸利用者。然而，这些肠球菌菌株不能充分地控制并防止酸中毒。
[0015] 第二种方法，即，添加能够利用瘤胃乳酸的特定细菌物种，是基于在大量可迅速发酵的碳水化合物(RFC)的酸中毒攻击期间显著将瘤胃乳酸积累最小化的丙酸杆菌(Propionibacterium)物种的发现。丙酸杆菌是在乳牛和肉牛二者的瘤胃的天然习居菌(inhabitant)并且在瘤胃中通过利用乳酸产生重要的挥发性脂肪酸如乙酸和丙酸来起作用。
[0016] 目前开发的最新DFM技术是基于瘤胃中酸中毒发病率的陈旧微生物理解开发的。直到最近，研究瘤胃微生物生态学的方法依赖于培养技术。这些技术由于未知的生长需求和对于许多瘤胃微生物不合适的厌氧条件而受到限制。因此，依赖于这些培养技术的生态学研究是基于对瘤胃微生物群的有限理解。
[0017] 当前的DFM在单独使用或与酵母一起使用来最小化瘤胃酸中毒的风险并改善含有高浓缩物的饲育场牛饮食的利用时提供混合的结果。然而，单独饲喂或与酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)组合饲喂的DFM菌株丙酸杆菌P15、和屎肠球菌(Enterococcus faecium)EF212和屎肠球菌(E.faecium)EF212的研究表明，与酵母组合或不与酵母组合的DFM的添加对防止瘤胃酸中毒没有作用(Yang,W.,2004)。
[0019] 发明概述
[0020] 由本公开内容最后所列出的权利要求书所界定的本发明旨在解决至少一些上述问题。提供了分离的菌株，包括：屎肠球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)、具有屎肠球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)的所有鉴定特征的菌株、屎肠球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)、具有屎肠球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鉴定特征的菌株、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株8G-134(NRRL B-50174)、具有短小芽孢杆菌菌株8G-134(NRRL B-50174)的所有鉴定特征的菌株、以及它们的组合。
[0021] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是屎肠球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)。
[0022] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是具有屎肠球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)的所有鉴定特征的菌株。
[0023] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是屎肠球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)。
[0024] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是具有屎肠球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鉴定特征的菌株。
[0025] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是短小芽孢杆菌菌株8G-134(NRRL B-50174)。
[0026] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是具有短小芽孢杆菌菌株8G-134(NRRL B-50174)的所有鉴定特征的菌株。
[0027] 还提供了包括上面所列菌株的一种或多种与莫能菌素的组合物。
[0028] 还提供了将有效量的上面所列菌株的一种或多种施用给动物的方法，以及将包括有效量的上面所列菌株的一种或多种与莫能菌素的组合物施用给动物的方法。
[0029] 在至少一些实施方案中，将一种或多种菌株施用给动物在所述动物中或为所述动物提供了与未施用所述菌株的动物相比下列益处的至少一种：(a)降低酸中毒；(b)如延迟的乳酸积累和延长的挥发性脂肪酸产生所显示的，稳定瘤胃代谢；(c)如pH恢复和乳酸降低所度量的，更迅速地从酸中毒攻击恢复；(d)降低与酸中毒相关的临床体征的表现；(e)增加泌乳的乳牛中的牛奶产量；(f)增加泌乳的乳牛中的牛奶脂肪含量；(g)降低泌乳的乳牛中的体细胞计数(SCC)；(h)如降低的SCC证明的，改善免疫应答和健康；以及(i)增加泌乳的乳牛的牛奶生产效率。
[0030] 在一些实施方案中，其中所述动物可以是反刍动物。优选地，其中可以从约30天龄开始给所述动物施用所述菌株。
[0032] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是屎肠球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)、屎肠球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)或它们的组合，并且其中以使得每天用约5×108CFU/动物/天至约5×1010CFU/动物/天给予动物的水平给动物施用所述菌株。
[0033] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是短小芽孢杆菌菌株8G-134(NRRL B-50174)，并且其中以使得每天用约5×108CFU/动物/天至约5×1010CFU/动物/天给予动物的水平给动物施用所述菌株。
[0034] 在一些实施方案中，其中所述动物可以是肉牛动物。
[0035] 在一些实施方案中，其中所述动物可以是乳牛。优选地，其中在施用给所述乳牛之后，所述菌株可以在所述乳牛中或给所述乳牛提供与未施用所述菌株的乳牛相比下列益处的至少一种：(a)所述菌株增加被施用所述菌株的所述乳牛的每日脂肪产量和牛奶脂肪百分比；(b)所述菌株降低被施用所述菌株的所述乳牛的对数体细胞计数(LogSCC)评分；(c)如降低的LogSCC所证明的，改善免疫应答和健康；(d)增加被施用所述菌株的所述乳牛的牛奶生产效率，以及(e)在所述乳牛是二产或更大经产数的母牛时，所述菌株增加被施用所述菌株的所述乳牛的牛奶产量。优选地，其中被施用所述菌株的所述乳牛的牛奶产量增加可以是在基本上没有增加被施用所述菌株的所述乳牛的干物质摄入的情况下实现的。
[0036] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是屎肠球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)或具有屎肠球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)的所有鉴定特征的菌株。
[0037] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是屎肠球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)或具有屎肠球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鉴定特征的菌株。
[0038] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是短小芽孢杆菌菌株8G-134(NRRL B-50174)或具有短小芽孢杆菌菌株8G-134(NRRL B-50174)的所有鉴定特征的菌株。
[0039] 还提供了制备直接饲喂微生物的方法。在该方法中，使选自由下列组成的组的菌株生长在液体营养肉汤中：屎肠球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)、屎肠球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)和短小芽孢杆菌菌株8G-134(NRRL B-50174)。将所述菌株从液体营养肉汤分离以制备直接饲喂微生物。在该方法的至少一些实施方案中，所述菌株被冷冻干燥。
[0040] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是屎肠球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)或具有屎肠球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)的所有鉴定特征的菌株。
[0041] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是屎肠球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)或具有屎肠球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)的所有鉴定特征的菌株。
[0042] 在一些实施方案中，其中所述菌株可以是短小芽孢杆菌菌株8G-134(NRRL B-50174)或具有短小芽孢杆菌菌株8G-134(NRRL B-50174)的所有鉴定特征的菌株。
[0043] 另外提供了制备直接饲喂微生物的方法。在该方法中，使选自由下列组成的组的菌株生长在液体营养肉汤中：屎肠球菌菌株8G-1(NRRL B-50173)、屎肠球菌菌株8G-73(NRRL B-50172)和短小芽孢杆菌菌株8G-134(NRRL B-50174)。将所述菌株从液体营养肉汤分离以制备直接饲喂微生物。添加莫能菌素至所述直接饲喂微生物。
[0045] 在所附的附图中图示了本文所述的优选的示例性实施方案，其中整个附图中同样的指示数字代表同样的部分，并且其中：
[0046] 图1是显示测试群体(非酸中毒的，集群2)和驱动群体(酸中毒的，集群1)之间的pH差异的图。
[0047] 图2是显示测试群体(非酸中毒的，集群2)和驱动群体(酸中毒的，集群1)之间的乳酸积累差异的图。
[0048] 图3是显示体外葡萄糖随处理时间变化的图。
[0049] 图4是显示体外乳酸积累随处理时间变化的图。
[0050] 图5是显示总VFA(乙酸+丙酸+丁酸)积累随时间变化的图。
[0051] 图6是显示对照和候选DFM牛中平均瘤胃pH随时间变化的图。
[0052] 图7是显示对照和候选DFM牛中平均瘤胃乳酸随时间变化的图。
[0053] 图8是显示瘤胃VFA浓度随处理时间变化的图。(总VFA＝乙酸+丙酸+丁酸)。
[0054] 在详细解释本文所述的实施方案之前，应理解本发明并不限于应用于在下面的说明书中所述的或在附图中所图示的组分的构造和排列的细节。本发明能够具有其他实施方案或能够以多种方式实践或实施。并且，应理解本文所采用的措辞和术语是为了说明的目的并且不应被认为是限制性的。
[0055] 详述
[0056] 本文提供了菌株。还提供了制备和使用所述菌株的方法。
[0057] 在至少一些实施方案中，用一种或多种本文所提供的菌株制备的直接饲喂微生物(DFM)容许牛肉和牛奶生产者继续管理饲喂方案以优化生长和性能，而不会由于伴随瘤胃酸中毒的消化失常而牺牲健康。DFM的至少一些实施方案是基于经由乳酸利用或促使瘤胃维持乳酸利用微生物群来管理瘤胃乳酸浓度而选择的。DFM的至少一些实施方案被开发用于管理瘤胃能量浓度。与目前售给牛生产者的减轻酸中毒的DFM不同，本发明的至少一些实施方案并非被开发用于在问题出现之后管理问题，而是在其发生之前减轻问题。
[0058] 菌株：
[0059] 本文提供的菌株包括：屎肠球菌菌株8G-1、屎肠球菌菌株8G-73和短小芽孢杆菌菌株8G-134，它们在本文中还分别被称为8G-1、8G-73和8G-134。
[0060] 菌株屎肠球菌菌株8G-1、屎肠球菌菌株8G-73和短小芽孢杆菌菌株8G-134于2008年8月29日被保藏在美国北方农业研究培养物保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection，NRRL)，1815 North University Street,Peoria,Illinois,61604，并分别被给予登录号B-50173、B-50172和B-50174。该保藏是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约的规定进行的。本文所提供的一种或多种菌株可以用作直接饲喂微生物(DFM)。
[0061] 为了本公开内容的目的，“生物上纯的菌株”意指不含有足以干扰所述菌株的复制或可被正常细菌学技术检测的量的其他细菌菌株。“分离的”在与本文所述的生物体和培养物一起使用时，不仅包括生物上纯的菌株，还包括不像它们天然存在的那样生长或维持的任何生物体培养物。在一些实施方案中，菌株是也提供与8G-1、8G-73和8G-134所提供的益处相当的益处的菌株8G-1、8G-73或8G-134的突变体、变体或衍生物。在一些实施方案中，菌株是具有菌株8G-1、8G-73或8G-134的所有鉴定特征的菌株。此外，各单独菌株(8G-1、8G-73或8G-134)或这些菌株的任何组合也可提供一种或多种本文所述的益处。还应清楚的是，添加其他微生物菌株、载体、添加剂、酶、酵母或类似物也将提供酸中毒的控制并且不会构成实质上不同的DFM。
[0062] 杆菌(Bacillus)菌株具有使得它们可用作DFM的许多品质。例如，几种杆菌物种还具有GRAS状态，即，它们一般被美国食品药品监督管理局认可为安全的，并且还被美国饲料管理官员协会(AAFCO)批准用于动物饲料。本文所述的杆菌菌株是需氧的和兼性的产孢菌类并且因此是稳定的。杆菌物种是被认为GRAS的仅有的产孢菌类。发现的一种预防或治疗酸中毒的杆菌菌株是短小芽孢杆菌菌株8G-134。
[0063] 肠球菌菌株也具有使得它们可用作DFM的许多品质。
[0064] 已知肠球菌菌株定殖在单胃动物和反刍动物的胃肠道，并且适于在这种环境下存活。已显示肠球菌是兼性厌氧的生物体，这使得它们在需氧和缺氧条件下都是稳定的和有活性的。发明人将屎肠球菌菌株8G-1和屎肠球菌菌株8G-73鉴定为可用于这些目的。
[0065] 菌株的制备
[0066] 在至少一个实施方案中，使用常规的液体或固体发酵技术分别培养每一种本文所述的菌株。在至少一个实施方案中，杆菌菌株和肠球菌菌株在液体营养肉汤中生长，在杆菌的情况下，生长至形成最高孢子数目的水平。杆菌菌株是通过发酵细菌菌株制备的，这可以通过成比例增加种菌培养来开始。这包括重复且无菌地将培养物转移至大得多的体积中以充当发酵的接种物，这可以在大的不锈钢发酵罐中在含有最佳生长所必需的蛋白、碳水化合物和矿物质的培养基中进行。非限制性的示例性培养基是MRS或TSB。然而，也可以使用其他培养基。在将接种物添加至发酵器皿中之后，控制温度和搅拌以容许最大的生长。在一个实施方案中，菌株在搅拌条件下在32°至37°生长。在培养物达到最大群体密度之后，通过从发酵培养基分离细胞来收获培养物。这通常通过离心来进行。
[0067] 在一个实施方案中，为制备杆菌菌株，将杆菌菌株发酵至5×108CFU/ml至约4×109CFU/ml的水平。在至少一个实施方案中，使用2×109CFU/ml的水平。通过离心收获细菌，并且移除上清液。然后可以使用沉淀的细菌来制备DFM。在至少一些实施方案中，将沉淀的细菌冷冻干燥，然后用于形成DFM。然而，在使用杆菌之前并不必需将杆菌冷冻干燥。还可以在具有或不具有防腐剂，并且以浓缩的、非浓缩的或稀释的形式使用菌株。
[0068] 然后可以确定培养物的计数。CFU或菌落形成单位是由标准微生物铺板方法所得的样品的活细胞计数。该术语是由在单个细胞被铺板在适当的培养基中将在琼脂培养基中生长并变为活的菌落的事实衍生而来。由于多个细胞可能产生一个可见的菌落，因此术语菌落形成单位是比细胞数目更有用的单位量度。
[0069] 使用菌株：
[0070] 在至少一些实施方案中，使用一种或多种菌株来形成DFM。可以将一种或多种载体添加到菌株中，所述一种或多种载体包括但不限于：蔗糖、麦芽糖糊精、石灰石和稻壳。
[0071] 为了混合菌株和载体(使用时)，可以将他们添加至螺带式混合器或叶片式混合器中并优选地混合约15分钟，尽管可以增加或降低时间。将组分共混以便得到培养物和载体的均一混合物。最终产物优选是干燥的、可流动的粉末，并且可以基于终产物中期望的DFM终浓度来配制。
[0072] 在制备DFM的方法的至少一个实施方案中，本文所述的菌株生长在培养基中，例如液体营养肉汤。将所述菌株从液体营养肉汤分离以制备直接饲喂微生物。在将菌株从肉汤分离之后可以将其冷冻干燥。
[0073] 可以将屎肠球菌菌株8G-1、屎肠球菌菌株8G-73和短小芽孢杆菌菌株8G-134的一种或多种饲喂给动物以降低或甚至消除酸中毒的出现。对于此，将有效量的一种或多种的这些菌株施用给动物。在施用给动物之后，所述菌株在动物中或为动物提供下列益处的至少一种：(a)降低动物中的酸中毒；(b)如延迟的乳酸积累和延长的挥发性脂肪酸产生所表明的，稳定瘤胃代谢；(c)如pH恢复和乳酸降低所度量的，更迅速地从酸中毒攻击中恢复；以及(d)不表现与酸中毒相关的临床体征。
[0074] 动物可以是牛，包括肉牛和乳牛，即，一种或多种公牛、小阉牛(steer)、小母牛、牛犊或母牛；山羊；绵羊；美洲驼羊(llamas)；羊驼；在饲喂可迅速发酵的碳水化合物(RFC)时可能遭遇瘤胃不平衡的其他四胃室的反刍动物。
[0075] 在至少一个实施方案中，当饲喂屎肠球菌菌株8G-1或屎肠球菌菌株8G-73时，以使得每天用约5×108CFU/动物/天至约5×1010CFU/动物/天给予动物的水平给动物施用菌株。在至少一个实施方案中，当饲喂短小芽孢杆菌菌株8G-134时，以使得每天用约5×108CFU/动物/天至约5×1010CFU/动物/天给予动物的水平给动物施用菌株。在至少一个实施方案中，饲喂屎肠球菌菌株8G-1、屎肠球菌菌株8G-73和短小芽孢杆菌菌株8G-134的两种或更多种菌株，并且将菌株以如下的水平施用给动物：该水平使得用约5×108CFU/动物/天至约5×1010CFU/动物/天作为混合菌株的总剂量给予动物。可以将其他水平的一种或多种菌株饲喂给动物。可以从约30天大直至成年反刍生产期的剩余时间或其他时间段将菌株施用给动物。
[0076] 在至少一个实施方案中，菌株作为直接饲喂微生物(DFM)饲喂，并且DFM用作每日定额食物的覆盖料(top dressing)。此外，菌株可以以完全混合的定额食物、沉淀的饲料、与液体饲料混合、与蛋白预混物混合、经由维生素和矿物预混物的递送来饲喂。
[0077] 在至少一个实施方案中，菌株作为DFM饲喂，并且DFM以约50mg/头至660mg/头的日剂量与A型药用莫能菌素 组合饲喂。饲喂莫能菌素以增加饲喂效率。莫能菌素作为离子载运体，在细菌细胞膜中产生了渗透性，从而产生了胞内空间和胞外空间之间的离子不平衡。这种反应影响了瘤胃微生物群体并影响饲料发酵以改善家畜的饲喂效率。
[0078] 在至少一个实施方案中，菌株作为DFM饲喂，并且DFM以约60mg/头至90mg/头的日剂量与A型药用泰洛星磷酸盐 组合饲喂。将泰洛星磷酸盐饲喂给肉牛以降低由坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)和酿脓放线菌(Actinomyces pyogenes)引起的肝脓肿。
实施例
实施例
[0079] 仅为了示例的目的提供了下列实施例。本文所包括的实施例仅仅是帮助更完整地理解本文所述的发明。这些实施例不以任何方式限制本文所述的或本文所要求保护的范围。
[0080] 实施例1
[0081] 酸中毒模型实验设计：
[0082] 对10头杂种小阉牛进行重量分组并将它们分配至两个围栏中。在攻击前所有处理组的日饲养定额饲料由按干物质计45％粗饲料和55％浓缩物组成。早上给牛饲喂15磅/头/天的定额食物一次，并且在傍晚将剩余的饲料推至接近饲喂用拴牛枷。在用浓缩饮食处理物攻击之前对两个围栏均禁食24小时。浓缩饮食处理物由以饲料90％计的高度可发酵的碳水化合物源蒸汽压片玉米组成。在禁食24小时后，以100磅/围栏将浓缩饮食随意饲喂给两个围栏(0h)。视觉监测攻击饮食消耗并且根据需要添加额外的饲料。
[0083] 使用与真空瓶相连的收集管经由口腔插管从个体动物获得瘤胃液样品。每个围栏使用不同的瓶和收集管以最小化处理之间微生物群的交叉污染。将在真空瓶中收集的瘤胃液滗入标有取样时间和动物识别编号(耳朵标签编号)的无菌的50ml Falcon管中。在-36h、-24h和-12h从所有的围栏收集瘤胃样品。时间-36h和-24h的样品代表每个动物的生理基线。时间-12h的样品代表每个动物在禁食状态的瘤胃液。将时间0h指定为饲喂攻击的开始。在+6至+22小时每4小时从所有的动物收集瘤胃样品。所有围栏均在+28、+36和+48小时取样。在采集后立即分析来自个体瘤胃样品的pH。将所有样品冷冻并准备运输至Agtech Products,Inc.(Waukesha,WI)供进一步分析。
[0084] 测量个体瘤胃样品中的挥发性脂肪酸和碳水化合物的浓度。通过从在各时间阶段由每只动物收集的瘤胃液无菌移出两份重复的1.0ml样品来制备用于HPLC分析的样品。将样品置于1.5ml的微量离心管中并通过离心(10分钟，以12,500rpm)沉淀碎片。将上清液(750μl)转移至干净的管中并用等体积的5mM H2SO4酸化。彻底混合酸化的液体并将其通过0.2μm滤器直接过滤到2ml HPLC自动取样瓶中并加盖。使用Waters 2690HPLC系统(Waters Inc.,Milford,MA)分析样品。将样品注射到加热至65℃的5mM H2SO4流动相中并使用BioRad HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)分离。使用一组浓度的感兴趣的每种化合物来标准化HPLC。用作标准的化合物包括右旋糖(葡萄糖)、乳酸、甲基乙二醛、丁酸、丙酸和乙酸。
[0085] 非酸中毒牛瘤胃微生物群中细菌基因的发现
[0086] 抑制性消减杂交：
[0087] 利用基因组消减试剂盒(Clontech,Palo Alto,CA)来测定两组汇集的瘤胃样品之间的微生物群体差异。进行了等级集群分析(Hierarchal clustering analysis)以基于随时间变化的pH和乳酸谱测定动物之间的相似性和差异。集群分析将牛2069、2071、2078、2113和2127置于集群1中并且将牛2107、2115、2088、2133和2124置于集群2中。进行重复量度分析以比较来自集群1和集群2的pH和乳酸。独立分析所有的变量。在整个攻击饮食期间，集群1具有比集群2显著更高的平均乳酸谱(P＝0.0004)，并伴随着更低的平均pH(P＝
0.0075)(图1和2)。汇集集群内个体动物的瘤胃液以供抑制性消减杂交(SSH)程序。
0.0075)(图1和2)。汇集集群内个体动物的瘤胃液以供抑制性消减杂交(SSH)程序。
[0088] 开发了抑制性消减杂交(SSH)策略来比较在取样时间+6h、+10h、+14h和+18h自集群1的牛汇集的瘤胃DNA样品与自集群2的牛汇集的那些瘤胃DNA样品。利用集群2作为测试群体(非酸中毒牛)且集群1作为驱动群体(酸中毒牛)进行抑制性消减杂交。认为SSH从生物体产生了独特DNA片段，该独特的DNA片段导致了较低的乳酸水平和较高的pH(瘤胃能量调节生物体)。通过使用时间+10h的样品进行消减，所发现的DNA片段(基因)来自于能够以RFC形式调节瘤胃环境中过量能量的利用并减轻可能的酸中毒作用的生物体。
[0089] 独特测试序列文库的克隆和筛选：
[0090] 克隆消减后回收的菌株特异性DNA序列以供进一步分析。将DNA序列插入到pCR2.1载体(Invitrogen)中并化学转化至大肠杆菌感受态TOP10细胞中。将转化混合物铺板到含有50μg/ml卡那霉素并覆盖有在DMF中的40mg/ml X-gal的22×22cm LB琼脂板上。将板在37℃孵育24h。挑取重组菌落(白色菌落)至含有LB培养基和50μg/ml卡那霉素的无菌微量滴定板中。将含有重组PCR产物的所有孔分成1ml小份。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化一个小份，将第二小份经由离心沉淀，重悬于LB+Kan+10％甘油中并储存在-80℃下。
[0091] DNA杂交：
[0092] 使用标准程序进行狭线印迹杂交。为确定克隆的DNA插入物的特异性，将带正电荷的Zeta- 印迹膜(Bio-Rad Laboratories；Hercules,CA)与探针杂交，该探针由原始测试DNA和驱动DNA用Alu I消化并用DIG High Prime DNA标记试剂盒(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)标记而制得。选择显示出与测试DNA而不是驱动DNA序列同源的重组插入物进行序列分析。对克隆的插入物进行杂交。在各时间阶段，进行消减，SSH 6、10、14和18。SSH 6、10、14和18分别有12、29、105和29个测试特异性的克隆的插入物。
[0093] 确定来自各测试阳性插入物的DNA序列(Lark Technologies；Houston,TX)。使用blastX函数比较来自各插入物的序列与来自NCBI数据库的序列。翻译核苷酸序列并通过使用blastX函数将序列与NCBI数据库中发现的那些序列进行比较来推断基因功能。使用直系同源簇(Clusters of Orthologous Groups，COG)网站，基因功能归类至基因类别中。使用鉴定的特异性COG基因构建用于菌落杂交和狭线印迹杂交实验的寡核苷酸探针。以从非酸中毒牛选择为基础，从SSH 10的29个基因中选择4个基因用于基于功能属性的菌落杂交。经由使用NCBI blastX函数鉴定选自克隆79、84、94和110的分别具有如下指定的功能的基因：β-木糖苷酶、葡萄糖/半乳糖转运蛋白、4-α-葡聚糖转移酶和4-α-葡聚糖转移酶。选择用于菌落杂交的所有基因均具有通过COG鉴定为碳水化合物和运输代谢功能的指定特性，所述功能将为含有这些基因的细菌提供代谢过量能量的优点，如在用RFC攻击时在瘤胃中发现的。
[0094] 菌落杂交：
[0095] 使用在酸中毒试验期间在时间+10h、+14h和+18h从牛收集的瘤胃液。从这些时间阶段的每一个选择牛2107、2124、2115、2088和2133。这些牛代表之前被选择为“测试群体”或非酸中毒组的动物。从-20℃取出个体瘤胃样品并使其在室温下解冻。将解冻的瘤胃样品分别以两个重复铺板在三种独立的培养基上。所使用的培养基由以下组成：乳酸钠琼脂(NLA)、乳酸丙酸菌选择琼脂(LPSA)以及改良的强化梭菌培养基(RCS)。RCS与商购获得的无葡萄糖的强化梭菌培养基类似地制备。因此，RCS中主要的碳水化合物源是淀粉。下表1示出了在各培养基上铺板的瘤胃液的孵育条件和稀释物。
[0096]
[0097] 孵育后，从各板挑取个体菌落，除LPSA外，将其接种于包含各自的培养基的10ml肉汤管中，LPSA被接种到NLB中。从各时间阶段和每只动物(5头牛×3个时间阶段)选择菌落。对于RCS培养基，每个动物-时间阶段挑取5个菌落。LPSA在板上表现出较少的菌落和多样性并且每个动物-时间阶段所选择的菌落的数目是可变的。除在时间阶段18的动物2107之外，每个动物-时间阶段从NLA培养基选择两个菌落。由于可视多样性增加，从这个动物-时间阶段挑取6个菌落。并非所有接种的管都在孵育后表现出生长。
[0098] 将显示出生长的管分成9ml和1ml的两个独立的小份。使用1ml小份进行DNA分离程序，该DNA分离程序使用高纯度PCR模板制备试剂盒(Roche Molecular Biochemicals；Mannheim,Germany)。将9ml小份转移到无菌的15ml Falcon管中并离心直至形成固体团粒。
然后将所述团粒在含有10％甘油的NLB或RCS肉汤中重构。将重构的样品置于-80℃以供进一步使用。然后，使用提取的DNA进行各分离物的RAPD-PCR分析以确定系统发育关系。使用Bio-Numerics(Applied Maths Inc.,Austin,TX)对RAPD DNA条带模式进行分析以确定分离物的相关性。使用Dice系数和非加权对组法(un-weighted pair group method，UPGMA)确定分离物的相似系数。使用80％或更高的相似性将109个分离物分组为65个独立的集群。
在65个集群中，23个只在RCS上生长，11个只在LPSA上生长，14个只在NLA上生长，4个集群在RCS和LPSA二者上都生长，6个在RCS和NLA上生长，3个在LPSA和NLA上生长，并且发现4个集群存在于所有三种培养基上。
然后将所述团粒在含有10％甘油的NLB或RCS肉汤中重构。将重构的样品置于-80℃以供进一步使用。然后，使用提取的DNA进行各分离物的RAPD-PCR分析以确定系统发育关系。使用Bio-Numerics(Applied Maths Inc.,Austin,TX)对RAPD DNA条带模式进行分析以确定分离物的相关性。使用Dice系数和非加权对组法(un-weighted pair group method，UPGMA)确定分离物的相似系数。使用80％或更高的相似性将109个分离物分组为65个独立的集群。
在65个集群中，23个只在RCS上生长，11个只在LPSA上生长，14个只在NLA上生长，4个集群在RCS和LPSA二者上都生长，6个在RCS和NLA上生长，3个在LPSA和NLA上生长，并且发现4个集群存在于所有三种培养基上。
[0099] 使用Bio-Dot SF微过滤装置(BIO-RAD；Hercules,CA)准备狭线杂交。选择集群内个体分离物的基因组DNA来代表该集群并将其印迹到膜上。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Molecular Biochemicals；Mannheim,Germany)制备用于杂交的探针。所选择的探针由上述克隆的插入物分析获得并且由来自SSH10的四个克隆插入物(克隆79、84、94和110)组成。汇集标记的探针，然后杂交。在45℃下进行杂交5小时。容许比色反应在膜上显影过夜。如通过比色反应所鉴定的，在RCS膜上的37个分离物(集群)中有30个表现出杂交，并且在LPSA/NLA膜上28个分离物中的25个表现出杂交。
[0100] 然后将表现出杂交的分离物制备用于16s rRNA测序。简言之，使用引物8F(AGAGTTTGATYMTGGCTCAG)和1406R(ACGGGCGGTGTGTRC)经由PCR扩增55个分离物的每一个的16srRNA。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)纯化PCR产物。通过凝胶电泳分析纯化的产物。当可得到足够的产物时，将纯化的样品送至冰上过夜，以供单程单分子测序(single pass sequencing)(Lark Technologies,Houston,TX)。使用blastn函数比较来自各集群的16s序列与来自NCBI数据库的序列。从该比较中显现的感兴趣的生物体由以下组成：屎肠球菌菌株8G-1、屎肠球菌菌株8G-73和短小芽孢杆菌菌株8G-134。
[0101] 实施例2
[0102] 体外菌株测试：
[0104] 随后尽可能快地进行体外方案以降低各试验之间的实验误差。简言之，从每头小母牛收集瘤胃液并将其置于标记的预热的保温瓶中。将保温瓶运输至Agtech Products,Inc.以供处理。以两个重复添加瘤胃液至被调节至39℃的含有McDougall缓冲液和3.0％葡萄糖(在McDougall缓冲液和瘤胃液混合至体积为180ml后的终浓度)的瓶中。将候选DFM菌7
株屎肠球菌菌株8G-1、屎肠球菌菌株8G-73和短小芽孢杆菌菌株8G-134以1.0×10 CFU/ml(终浓度)添加至指定的瓶中。观察单元是瓶，并且以四次重复进行处理。处理由下列组成：
对照(添加葡萄糖但不添加DFM)、屎肠球菌菌株8G-1、屎肠球菌菌株8G-73和短小芽孢杆菌菌株8G-134。然后用CO2冲洗瓶并加盖。将瓶保持在39℃和140rpm的震动水浴中。在取样前大约10分钟，将瓶暂时打开以释放作为发酵副产物产生的气体。在最初且直至36小时标记的每6小时从各瓶中抽出瘤胃液。测量和记录瘤胃pH和挥发性脂肪酸。使用重复的量度分析进行统计分析以确定随时间改变的DFM作用或使用单因素方差分析来确定在特定时间点的处理影响。
株屎肠球菌菌株8G-1、屎肠球菌菌株8G-73和短小芽孢杆菌菌株8G-134以1.0×10 CFU/ml(终浓度)添加至指定的瓶中。观察单元是瓶，并且以四次重复进行处理。处理由下列组成：
对照(添加葡萄糖但不添加DFM)、屎肠球菌菌株8G-1、屎肠球菌菌株8G-73和短小芽孢杆菌菌株8G-134。然后用CO2冲洗瓶并加盖。将瓶保持在39℃和140rpm的震动水浴中。在取样前大约10分钟，将瓶暂时打开以释放作为发酵副产物产生的气体。在最初且直至36小时标记的每6小时从各瓶中抽出瘤胃液。测量和记录瘤胃pH和挥发性脂肪酸。使用重复的量度分析进行统计分析以确定随时间改变的DFM作用或使用单因素方差分析来确定在特定时间点的处理影响。
[0105] 瘤胃体外实验的焦点是确定候选DFM菌株屎肠球菌菌株8G-1、屎肠球菌菌株8G-73和短小芽孢杆菌菌株8G-134是否能正向影响在能量过量环境中的瘤胃发酵。将过量的葡萄糖体外添加至各瘤胃中，以复制用可迅速发酵的碳水化合物进行的牛饱食。如图3所示，各候选菌株的添加显著增加了随时间改变的葡萄糖利用(P＝0.0001)。与对照相比(图4)，对随时间改变的乳酸产生的影响也显著受到了添加候选DFM至被攻击的体外模型的影响(P＝0.0025)。到36小时的时间点，在短小芽孢杆菌中乳酸产量降低了17％，并且在两种肠球菌候选物中乳酸的积累降低了32％。
[0106] 经由HPLC进行挥发性脂肪酸分析。通过添加肠球菌候选物显著地影响了总VFA(乙酸+丙酸+丁酸)(P＝0.0279)(图5)。肠球菌候选物8G-1和8G-73表现为增加了随时间改变的所产生的总VFA的量。在将短小芽孢杆菌候选物与对照比较时，对总VFA产量没有显著影响。
[0107] 体外结果表明，候选物DFM 8G-1、8G-73和8G-134与对照处理相比通过增加葡萄糖利用而没有相应地增加乳酸产量来正向影响瘤胃发酵。瘤胃中过量的葡萄糖通常迅速发酵产生乳酸。乳酸的积累促使了急性酸中毒反应。通过利用葡萄糖而不伴随乳酸产生，候选物DFM展示出改善酸中毒的影响的潜能。瘤胃体外模型表明这些菌株可能能够成功地调节饲喂高量的可迅速发酵碳水化合物的牛中过量的瘤胃能量。
[0108] 实施例3
[0109] 饲喂可迅速发酵的碳水化合物的牛中的候选DFM测试-急性酸中毒攻击：
[0110] 材料和方法：
[0111] 牛和围栏分配：
[0112] 在内销农场购买20头杂种小阉牛。在观察发病率或死亡率的试验开始前将牛圈养在研究机构两周的时间。在整个处理中按重量将牛随机分组。将5头牛分到一个围栏中，并且将围栏指定为四种处理的一种。处理包括：如下面详述的接受不同DFM的3个围栏，以及不接受NFM的第四围栏(对照)。处理分配可参见下表2。
[0113]
[0114] 在攻击前所有处理组的日饲喂定额食物由下列物质组成：62.5％粗饲料和30％碎玉米以及7.5％蛋白补充物(下表3)。蛋白补充物含有以375mg/头/天饲喂的莫能菌素。蛋白补充物还含有泰洛星磷酸盐 。
[0115]
[0116] *两种定额食均含有莫能菌素和Tylan。
[0117] 早上给牛饲喂15磅/头/天的定额食物一次，并且在傍晚将剩余的任何饲料推至接近饲喂用拴牛枷。在禁食前14天，按上表2中指定的剂量给处理组饲喂候选DFM作为每日定额食物的覆盖料。
[0118] 以5×109CFU/头/天的最小剂量饲喂短小芽孢杆菌菌株8G-134。以5×1010CFU/头/天饲喂肠球菌候选物8G-1和8G-73。
[0119] 候选DFM制备：
[0120] 之前选择用于攻击试验的候选DFM菌株是肠球菌属8G-1和8G-73；和短小芽孢杆菌菌株8G-134。将菌株储存在-80℃。将各培养物接种至含有MRS(Man、Rogosa和Sharp)或TSB(胰酶大豆肉汤)的10ml肉汤管中。对于杆菌和肠球菌候选物，分别将肉汤管在32℃和37℃孵育24小时。将培养物划线以便在各自的琼脂培养基上分离并孵育。挑取分离的菌落到10ml肉汤中并容许其生长至对数中期(18至24h)并将其转移至新鲜肉汤(10％体积/体积转移)。使肠球菌候选物在37℃于MRS肉汤中生长。杆菌在32℃下于水平的TSB管中在130rpm的振荡培养箱中生长。对于肠球菌的生长，将2ml转移至含有198ml肉汤的250ml瓶中并孵育18小时。
[0121] 将这200ml的培养物接种到含有1.8L肉汤的2L的瓶中并容许其孵育18小时。对于杆菌候选物，将5ml转移至含有50ml TSB的250烧瓶中，然后在32℃下于130rpm的振荡培养箱中孵育24小时。使用50ml接种含有600ml的1L烧瓶并容许其再孵育24小时。
[0122] 在收获细胞之前，获取肠球菌候选物的18小时培养物的光密度(OD)。将该OD与之前的生长曲线比较以确定培养物的cfu/ml。将样品铺板以供计数和基因指纹分析。经由RAPD-PCR分析确定每批发酵之间的质量控制。对于5.0e10 cfu/头/天的肠球菌候选物的目标最小剂量，将计算量的培养物分散到250ml Nalgen离心瓶中并在4℃下以4500rpm旋转10分钟。杆菌候选物的目标最小剂量是5.0e9 cfu/头/天，并且将共100ml的杆菌培养物以类似于肠球菌的方式旋转沉降。弃去上清液。将团粒重悬于含有10％甘油的30ml生长培养基中。将该量转移至50ml锥形管中。然后用10ml肉汤冲洗离心瓶并转移至同一锥形管中。将样品标记上菌株、收获候选物的日期以及发酵批号。使用平板计数来确定各管中的总cfu。将管合并以递送最小剂量为5.0e10 cfu/头/天的肠球菌候选物和5.0e9 cfu/头/天的杆菌候选物。将所有锥形管于-20℃下冷冻。
[0123] 攻击饮食和瘤胃液收集阶段：
[0124] 使用收集管经由瘤胃插管从个体动物获得瘤胃液样品，所述收集管配备有渗滤器并通过真空瓶连接至真空源。在瘤胃液采集之后立即测量pH并冷冻样品以运输至Agtech Products,Inc.以供VFA分析。在取样时间-12h、+6h、+10h、+14h、+18h、+22h、+30h、+36h和+48h从所有牛收集样品，并且时间0h代表攻击的开始。在时间-24h时移除牛的所有饲料以开始禁食并在时间0时鼓励牛饱食攻击定额食物。
[0125] 在用浓缩饮食攻击(时间0)之前对所有围栏禁食24小时。浓缩饮食由28磅片重的蒸汽压片玉米组成(上表3)。饲喂攻击定额食物以递送20磅/头。视觉监测攻击定额食物消耗，并在整个剩余的试验中根据需要添加额外的饲料。
[0126] 从+6至+22小时每4小时从所有牛收集瘤胃样品。在采集后立即分析各瘤胃样品pH。然后冷冻瘤胃液并将其运输至Agtech Products,Inc.以供经由HPLC进行VFA分析。使用个体动物作为观察单元进行瘤胃pH、VFA和葡萄糖水平的重复测量分析。在各候选DFM处理围栏与对照围栏之间进行随时间改变的成对比较以确定候选物改变瘤胃发酵模式的效力。
[0127] 结果与讨论：
[0128] 将平均重量为731.95磅的20头杂种肉牛按重量在整个处理中随机分组使得在处理组之间没有显著的重量差异(表4)。有3个处理围栏和1个对照围栏，并且5头/围栏。每个围栏的处理分配可参见上表2。
[0129]
[0130] 在时间0时给牛饲喂攻击定额食物并且在指定的时间点收集瘤胃液以测量瘤胃发酵值。在24小时后监测并记录每个围栏的饲料消耗。平均饲料消耗/小阉牛按该围栏的平均小阉牛重量的百分比计算(上表4)。对照围栏(围栏1)表现为与其他处理组相比具有最高的饲料消耗，平均每个小阉牛消耗其体重的4.8％。最低的攻击定额食物消耗/围栏是在围栏4中，平均每个小阉牛吃掉大约其体重的3.6％。平均所有围栏中的牛将消耗大约5.625磅浓缩物/天的攻击前定额食物的一部分，平均起来这构成了平均小阉牛体重的0.8％。尽管攻击定额食物消耗具有围栏变化，但该差异不大于来自攻击前定额食物的浓缩物消耗的增加并且不成为围栏之间发酵差异的原因。
[0131] 24小时后，移除牛的饲料并随意饲喂草地干草。给予牛自由选择的干草作为对持续降低瘤胃pH的预防。干草的添加将刺激额外的反刍并帮助缓冲瘤胃。尽管添加了干草，瘤胃pH仍持续降低。
[0132] 在瘤胃液收集之后，立即分析样品pH。如可从图6中观察到的，所有处理组均表现出瘤胃pH的降低。对照组的pH在时间为30小时时达到最低并在之后开始逐渐升高。至最后的瘤胃样品收集时，对照围栏的平均pH仍然是急性酸中毒的，pH为4.94。急性酸中毒伴随pH保持在5.2以下并且慢性或亚急性酸中毒的特征为pH低于5.6(Owens,等人,1998)。从时间+22至+48，与对照的趋势相比围栏2、3和4中的菌株8G-1、8G-73和8G-134出现了平均数值较高的趋势。这表明在这些围栏中用候选DFM处理的牛更迅速地从酸中毒攻击恢复。在时间+
48用8G-1、8G-73和8G-134处理的牛的平均pH分别为5.96、6.02和6.14，这大于对照围栏1.0个pH单位。对这三种菌株随时间(+6至+48)的重复测量分析在与对照围栏相比时没有表现出显著差异。然后，当从时间+22h至+48小时将用8G-1、8G-73和8G-134处理的围栏与对照围栏进行比较pH时，差异是显著的或接近显著(对于8G-1、8G-73和8G-134，P分别为0.1562、
0.0965和0.0466)。
48用8G-1、8G-73和8G-134处理的牛的平均pH分别为5.96、6.02和6.14，这大于对照围栏1.0个pH单位。对这三种菌株随时间(+6至+48)的重复测量分析在与对照围栏相比时没有表现出显著差异。然后，当从时间+22h至+48小时将用8G-1、8G-73和8G-134处理的围栏与对照围栏进行比较pH时，差异是显著的或接近显著(对于8G-1、8G-73和8G-134，P分别为0.1562、
0.0965和0.0466)。
[0133] 所有处理组的平均乳酸谱显示在图7中。在接受攻击定额食物后30小时，对照围栏的平均瘤胃乳酸积累达到峰值105mM。候选DFM菌株8G-1、8G-73和8G-134与对照围栏相比再次表现出乳酸积累的明显的平均数值差异。在整个攻击的前14小时，在对照牛和8G-1处理的牛之间平均乳酸积累是相似的。在剩余的试验期间，随后的积累水平在8G-1处理的牛中大大降低，尽管不显著(P＝0.1892)。处理围栏8G-73在时间30时表现出降低的乳酸积累水平并且在剩余的试验期间保持低于对照围栏。候选菌株8G-134在+22h开始也显示出降低的乳酸水平并且直至+48h一直保持低于对照围栏。
[0134] 测量和分析个体VFA。对照围栏和处理8G-73和8G-134中的挥发性脂肪酸(VFA)浓度增加并且在6小时达到峰值(图8)。在6小时后，这些处理围栏的每一个显示出降低的总VFA水平(乙酸、丙酸和丁酸)。在这些处理与对照之间没有显著差异。然而，处理8G-1表现出VFA降低的延迟，其在+14h之前不出现VFA降低。在试验过程中，总VFA浓度或个体VFA(由乙酸、丙酸或丁酸组成)水平没有显著差异。
[0135] 除了在酸中毒试验过程中监测和测量瘤胃发酵特征之外，在整个试验中观察牛与酸中毒相关的明显临床作用。在酸中毒攻击早期(+0h至+14h)，攻击饮食的作用最小。牛没有显示抑郁的体征并继续饲喂攻击定额食物。到接受攻击定额食物后+22小时，除了接受处理8G-1的那些牛之外的所有牛均显示痛苦、抑郁的体征并且具有稀拉的液体粪便排泄。围栏2中的牛不再消耗饲料，但不表现出临床症状，尽管类似的是具有以类似方式降低的pH水平。
[0136] 急性瘤胃酸中毒的定义是瘤胃pH降低至不仅对瘤胃功能有害而且对家畜健康有害的水平。急性酸中毒的标志是乳酸的积累和VFA产生的降低。适当的瘤胃功能是管理可用能量和饲料中可用的氮组分的组合。当出现瘤胃代谢不平衡时，消化紊乱通常会随后出现并且可能以形成酸中毒的形式显露。在此试验中，如通过瘤胃发酵参数显示的，菌株8G-1、8G-73和8G-134增强了瘤胃功能的恢复。
[0137] 如pH恢复和乳酸降低所度量的，饲喂屎肠球菌8G-1的牛平均从酸中毒攻击中更快地恢复。除了测量的瘤胃发酵模式外，饲喂候选DFM 8G-1的牛不表现出与酸中毒相关的临床体征。
[0138] 候选菌株屎肠球菌8G-73在整个试验过程中改善了瘤胃发酵。在+48h，平均乳酸水平为12.54mM，是测试的所有候选菌株中最低的。恢复也伴随着相应的pH增加，最终pH为6.02，比对照pH高1.08个pH单位。
[0139] 在酸中毒攻击期间，候选菌株短小芽孢杆菌8G-134也增强了瘤胃恢复。在饲喂8G-134的牛中，平均乳酸水平在时间+22h时达89mM的峰值，而对照围栏继续增加，在时间+30小时时达105mM的峰值。到+30小时时，平均乳酸水平已降至57mM。对于乳酸积累，饲喂8G-134的牛的瘤胃pH比对照的瘤胃pH更迅速地恢复，并且发现在+22至+48h差异显著(P＝
0.0466)。
0.0466)。
[0140] 实施例4
[0141] 概述：
[0142] 按照之前的泌乳和预期生产能力(PPA)将30头初产(prima)和经产Holstein母牛分组，并分配为三种处理中的一种。每种处理被分配10头牛并且处理由从产前3周至产后22周的下列处理组成：对照组(处理1)，其接受基本的总混合定额食物(TMR)；处理2和处理3，它们接受基本的总混合定额食物TMR并且分别被饲喂5×109和1×1010CFU/头/天的短小芽孢杆菌8G-134。主要目的是确定此时间阶段中短小芽孢杆菌8G-134对乳牛牛奶产量和性能的影响高于对照牛。第二个目的是确定是否存在与饲喂短小芽孢杆菌8G-134相关的剂量反应。短小芽孢杆菌8G-134方案显著增加了牛奶产量、牛奶脂肪并降低了体细胞计数。这些显著的短小芽孢杆菌8G-134生产作用不是以母牛身体条件评分、体重、干物质摄入增加或显著改变血液代谢谱为代价的，并且这将表明短小芽孢杆菌8G-134也为乳牛提供了效率益处。
[0143] 材料与方法：
[0144] 家畜：
[0145] 在从产前3周到产后22周的连续泌乳试验中将30头Holstein母牛随机分配为三种饮食处理中的一种。不同处理组中第二次泌乳和更老的母牛的先前牛奶产量没有显著差异或者第一次泌乳的奶牛的预期生产能力(PPA)没有显著差异。组之间第一次泌乳的动物和第二次泌乳的动物的数目有偏差，但不影响总体的平均产量，因为在统计模型中调整了泌乳。从约产前3周至产后22周对动物进行研究。
[0146] 营养：
[0147] 无乳母牛和泌乳母牛的总混合定额食物(TMR)的饮食成分和配制的组合物分别显示在下表5中。每组的基础TMR是相同的，不同的是覆盖料处理。各组接受添加有下列物质的8盎司细磨玉米的覆盖料：1盎司的麦芽糖糊精(处理1，对照)、5×109CFU/头/天的短小芽孢杆菌(处理2)和1×1010CFU/头/天的短小芽孢杆菌(处理3)。
[0148] 表5.供给无乳母牛和泌乳母牛的TMR的配制组分。
[0149]
[0150]
[0151] 样品和数据收集：
[0152] 每周一次收集并混合每日TMR样品和拒绝品(refusals)，每月一次合并每周的混合物，并且由Cumberland Valley Analytical Services,Maugansville,MD对每月样品进行下列分析：干物质(DM)、粗蛋白(CP)、酸性去污剂纤维结合蛋白(ADF-CP)、中性去污剂纤维结合蛋白(NDF-CP)、可溶性蛋白(SP)、酸性去污剂纤维(ADF)、中性去污剂纤维(NDF)、木质素、脂肪、淀粉、糖、灰分、钙(Ca)、磷(P)、镁(Mg)、钾(K)、硫(S)、钠(Na)、氯(Cl)、铁(Fe)、锰(Mn)、锌(Zn)和酮(Cu)。
[0153] 一天对牛进行2次挤乳，并且在每次挤乳时电子记录牛奶体积并将上午-下午的量相加为每日的总量。每周一次将来自上午和下午挤乳的牛奶样品混合，以供State College,PA的Dairy One牛奶实验室使用Fossamatic4000(FOSS；Eden Prairie,MN)对下列物质的含量进行分析：脂肪、蛋白、体细胞、非脂肪固体和乳尿素氮(MUN)。
[0154] 从大约产前3周至产后22周对动物进行研究。通过在产后1、3、7、11、15和18周的胸围估计动物的重量。在收集体重的同时由两个独立的观察者估计身体条件。
[0155] 在产后2周和8周从尾静脉收集血液样品，收获血清，冷冻，并进行葡萄糖、β-羟基丁酸(BHB)和非酯化脂肪酸(NEFA)分析。使用Abbott Precision XtraTM计(Abbott Diabetes Care Inc.,Alameda,CA)分析葡萄糖和BHB。使用Randox测定试剂盒(Cat.HN 1530,Randox Laboratories,Northern Ireland)测量血清中的非酯化脂肪酸(NEFA)浓度，该测量采用550nm波长的多样品酶联免疫吸附测定(ELISA)酶标仪。Randox试剂盒使用乙酰辅酶A合成酶和氧化酶将NEFA转化为2,3-反式-烯酰辅酶A与过氧化物；过氧化物与N-乙基-N-(2羟基-3-磺丙基)间甲苯产生紫色产物，该紫色产物是血清中NEFA浓度的指示。
[0156] 统计模型
[0158] Yi＝ui+TRTj+Lactk+周l+TRTj*Lactk+TRTj*周l+TRTj*Lactk*周l+ejklm
[0159] 其中
[0160] Yi＝产量依赖性变量的最小二乘平均值；
[0161] ui＝各产量变量的总体均值；
[0162] TRTj＝第j次处理作用，1、2、3；
[0163] Lactk＝第k次泌乳，1、2+；
[0164] 周l＝第l周，1……22；
[0165] 干扰项(interaction term)(TRTj*Lactk+TRTj*周l+TRTj*Lactk*周l)
[0166] ejklm＝误差
[0167] 每月一次使用SAS中的平均值程序检验每次处理的TMR样品和饲料拒绝品的差异。
[0168] 使用SAS统计软件的一般线性模型分析葡萄糖、BHB和NEFA的血液浓度。类变量是母牛、周和处理。处理被嵌套到母牛中并且其是检验处理显著性的误差项。使用残留误差检验受周干扰的处理的统计学显著性。
[0169] 结果：
[0170] 研究过程中无乳TMR和泌乳TMR的平均TMR组成显示在表6中。处理组之间的组成无差异。
[0171] 表6.无乳母牛和泌乳母牛的分析的TMR组成
[0172]
[0173] 平均标准误差(SEM),
[0174] NFC，非纤维碳水化合物
[0175] NDF，中性去污剂纤维
[0176] ADF，酸性去污剂纤维
[0177] 处理1，对照；处理2，5×109的短小芽孢杆菌8G-134；处理3，1×1010的短小芽孢杆菌8G-134。
[0178] 一头对照(处理1)母牛表现出不正常的牛奶产量并且将其数据从数据分析中移除。对29头母牛重复牛奶产量分析。牛奶产量显著地受处理影响(下表7)。饲喂5×109CFU/10
头/天短小芽孢杆菌8G-134的母牛(处理2)和饲喂1×10 CFU/头/天短小芽孢杆菌8G-134的母牛(处理3)产生比饲喂安慰剂对照的母牛显著更多的牛奶。处理2和3的母牛产生比处理1的母牛多大约2kg的牛奶(表7)。经产数具有显著干扰。二产奶牛的产量增加是显著的，增加了5.2kg，但是初产母牛的牛奶产量没有显著差异。
头/天短小芽孢杆菌8G-134的母牛(处理2)和饲喂1×10 CFU/头/天短小芽孢杆菌8G-134的母牛(处理3)产生比饲喂安慰剂对照的母牛显著更多的牛奶。处理2和3的母牛产生比处理1的母牛多大约2kg的牛奶(表7)。经产数具有显著干扰。二产奶牛的产量增加是显著的，增加了5.2kg，但是初产母牛的牛奶产量没有显著差异。
[0179] 表7.从生产直到产后22周，饲喂微生物添加剂的Holstein奶牛的最小二乘平均牛奶产量。
[0180]
[0181] 具有不同上标的组内平均值有差异，P<0.05
[0182] 具有*的平均值改变与0有显著差异
[0183] 处理1，对照；处理2，5×109CFU/头/天的短小芽孢杆菌8G-134；处理3，1×1010的短小芽孢杆菌8G-134。
[0184] 牛奶脂肪和产量显示在下表8中。处理2和3比对照显著增加了牛奶脂肪。牛奶产量与脂肪产量之后的产量反应在饲喂短小芽孢杆菌8G-134的处理组中增加。处理2和3的短小芽孢杆菌8G-134牛产生比对照显著更高的脂肪百分比，分别高0.24％和0.31％的水平(表8)。与牛奶产量显著增加相结合的是，处理2和3的日脂肪产量均提供了与对照相比显著增加的日脂肪产量(表8)。
[0185] 表8.按处理组计的牛奶脂肪含量。
[0186]
[0187]
[0188] 具有不同上标的列内平均值具有差异，P<0.05
[0189] 处理1，对照；处理2，5×109CFU/头/天的短小芽孢杆菌8G-134；处理3，1×1010的短小芽孢杆菌8G-134。
[0190] 线性体细胞计数的对数值(LogSCC)评分随处理和泌乳而不同。短小芽孢杆菌8G-134处理(处理2和3)具有比对照母牛显著更低的对数线性评分(下表9)。处理2和3的母牛分别具有4.97和4.96的LogSCC，相比之下对照母牛的LogSCC为5.92。二产母牛具有比初次泌乳母牛显著更高的对数线性评分。体细胞计数与泌乳泌乳牛的感染以及免疫状况和健康相关。额外增加的SCC是对感染的炎性反应的指示。此处表现的SCC降低可能表明饲喂短小芽孢杆菌8G-134的母牛在泌乳期间能更好地免疫处理感染攻击并且维持乳房和母牛的健康。
[0191] 表9.处理对体细胞计数(SCC)的作用。
[0192]
[0193] LogScc＝体细胞计数的对数值
[0194] 处理1，对照；处理2，5×109CFU/头/天的短小芽孢杆菌8G-134；处理3，1×1010的短小芽孢杆菌8G-134。
[0195] 对于无乳期和泌乳期，组的平均DMI数据在下表10中。无乳母牛的干物质摄取在所有组中介于10.79至11.64kg/d。对于处理组1、2和3，泌乳组分别消耗22.02、21.31和21.48kg/d(表10)。基于NRC方程的按产后周计的母牛预测DMI显示在表10中。处理1的摄取高于预测0.83kg；处理2的摄取低于预测1.37kg；处理3的摄取低于预测1.04kg。处理2和3的牛奶产量增加是在没有DMI增加的条件下完成的。事实上，根据NRC预测的预测或预期DMI与组平均摄入的比较表明这些母牛消耗少1.0至1.5kg/d的DMI。因此，DM利用的效率对于处理
2和3是增加的。
2和3是增加的。
[0196] 表10.按处理组计的组饲料摄入、血清葡萄糖、β-羟基丁酸、非酯化脂肪酸的最小二乘平均值。
[0197]
[0198] BHB＝β-羟基丁酸
[0199] 处理1，对照；处理2，5×109CFU/头/天的短小芽孢杆菌8G-134；处理3，1×1010的短小芽孢杆菌8G-134。
[0200] 预测DMI＝(.372*FCM+0.0968*BWT(kg)^.75)*(1-exp(-0.192*(周+3.67)))[0201] DMI差异和产量值可能表明处理2和3的母牛可能动员比对照母牛更多的身体组织来产生更多的牛奶并且吃得比预期少。然而，血清NEFA、葡萄糖和BHB表明这些母牛的能量状态与对照母牛类似(上表10)。此外，杆菌组的体重和BCS与对照组类似(下表11)。这表明它们没有动员更多的身体组织来产生额外的牛奶体积，说明饲喂处理2和3的母牛的饲料转化效率与剂量无关。
[0202] 表11.按处理组计的最小平均体重(磅)和身体条件评分。身体条件评分是两个观察者的平均评分。
[0203]
[0204] Wt＝重量，磅
[0205] BCS＝身体条件评分，级别1至5，按0.25分计；1＝瘦弱,2＝瘦,3＝平均,4＝胖,5＝肥胖
[0206] 处理1，对照；处理2，5×109CFU/头/天的短小芽孢杆菌8G-134；处理3，1×1010的短小芽孢杆菌8G-134。
[0207] 应理解，上面显示和描述各种优选的实施方案是为了例示本文所述的不同可能特征和可以组合这些特征的不同方式。除了以不同的方式组合上述实施方案的不同特征之外，认为其他改变也在本文所述的范围内。本发明不是要限于上述优选实施方案。
[0208] 文献
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