微孔膜截留集聚生化检测装置及其检测方法
阅读：993发布：2020-05-08
专利汇可以提供微孔膜截留集聚生化检测装置及其检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种微孔膜截留集聚微球的生化检测装置，包括溶液反应区，所述溶液反应区的一个端面上设置了一个溶液流出口，所述溶液流出口的表面设置有孔径基本均匀的微孔膜；溶液反应区中设置有包被微球、固定于包被微球表面的捕获 试剂 、以及标记试剂；捕获试剂及标记试剂具有互为直接或间接配位体关系的物质；含待测物质的样品溶液加入后捕获试剂、标记试剂和待测样品在溶液中发生结合反应，在包被微球表面形成配位体反应复合物,在溶液穿越微孔膜流出的过程中，游离标记试剂穿越微孔膜流出了，承载了配位体反应复合物的包被微球被微孔膜截留在表面，形成聚集浓缩效果。，下面是微孔膜截留集聚生化检测装置及其检测方法专利的具体信息内容。
1.一种微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，包括溶液反应区，所述溶液反应区的一个端面上设置了一个信号检测区,所述信号检测区上设置了一个面积小于12平方毫米的溶液流出口，所述溶液流出口的端面贴合有孔径基本均匀的微孔膜，所述微孔膜贴合盖住了溶液流出口；溶液反应区中设置了至少一种直径基本均匀且大于微孔膜孔径的微球、固定于微球表面的捕获试剂、以及粒径小于微孔膜孔径的标记试剂，捕获试剂及标记试剂中分别设置有互为直接或间接配位体关系的配位化合物。
2.如权利要求1所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，溶液反应区中的包被微球及标记试剂的反应方式及其微观分子尺寸匹配关系：当溶液进入溶液反应区时,捕获试剂、标记试剂和待测样品在溶液中发生结合反应，在微球表面形成配位体反应复合物；
当溶液从溶液流出口流出时，包被微球及其与标记试剂的反应复合物形成的微球在滤膜表面形成集聚堆积,游离的标记试剂能从堆积的微球之间的孔隙被溶液携带穿越后从滤膜的微孔中再次穿越流出，不会形成阻截残留。
3.如权利要求1所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，所述标记试剂来源于荧光物质或肉眼直接可见的颜色微粒；所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、以及其他带颜色信号的纳米颗粒中的一种或几种；所述荧光物质包选自荧光分子及其微球、量子点微球、上转换发光微球、时间分辨荧光分子及其微球、荧光蛋白中的一种或几种。
4.如权利要求2所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，还包括对微孔膜表面集聚堆积的反应复合物中的标记试剂光谱信号同时进行至少一个波长信号光学探测的检测设备；微孔膜受到特定波长的光线照射，集聚在表面的荧光物质将被激发后发射出特定波长的荧光信号，荧光信号强度与集聚在微孔膜表面的反应复合物数量存在特定的对应关系。
5.如权利要求1所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，所述溶液反应区包括免疫侧流溶液流道，在所述的免疫侧流溶液流道的某个末端设置了所述的溶液流出口，所述溶液流出口处贴合有所述微孔膜。
6.如权利要求5所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，所述免疫侧流溶液流道包括能定向传递水溶液的亲水多孔膜,所述亲水多孔膜选自硝酸纤维素膜、样品吸收垫玻璃纤维膜、化学纤维膜及滤纸中的一种或多种；所述免疫侧流溶液流道由两片亲水膜的亲水表面夹持所述亲水多孔膜所构建的空隙通道，溶液从空隙通道的一端流向另一端。
7.如权利要求6所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，两片亲水膜设置于所述免疫侧向流道末端，两片亲水膜的亲水表面夹持亲水多孔膜的上下表面，两片亲水膜中底部的亲水膜的下表面贴合有所述微孔膜，贴合在微孔膜上表面的亲水膜的中部设置有面积不超过12平方毫米的缺口作为溶液流出口；
或者，两片亲水膜的亲水表面还可夹持亲水多孔膜的左右两侧，两片亲水膜夹持形成的空隙通道底面的的中部设置有缺口作为溶液流出口；
所述溶液流出口中至少包括一个最大间隙不超过1.5mm的空隙形状或角度不超过95度的夹角。
8.如权利要求7所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，微孔膜的下表面贴合有吸水材料，流入亲水膜缺口的溶液穿越微孔膜后被吸水材料吸收传递。
9.如权利要求1所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，所述溶液反应区包括容积不超过550微升的开口微孔杯，其底部中部位置设置了一个面积不超过12平方毫米的通孔，底部平面以通孔的中心为轴设置成一定锥形倾斜角度；在通孔的表面贴合了孔径基本均匀且孔径范围在0.02-1.2um的微孔膜。
10.如权利要求9所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，所述微孔杯底的通孔的下方设置沉孔，所述沉孔的形状与所述微孔膜相匹配，沉孔容纳微孔膜后微孔膜的下表面与微孔杯的下表面基本平齐；所述微孔膜的下方设置有具有导热作用的保护膜片，所述保护膜片的材质为金属箔或有机导热膜，所述保护膜片的一部分与微孔杯的底面贴合，另一部分与微孔膜贴合；所述保护膜片的中部设有一开孔，所述开孔位于微孔杯通2的孔正下方。
11.如权利要求1所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，包括反应容器，所述反应容器是反应容积不超过100微升的离心式微流控芯片，所述离心式微流控芯片包括所述溶液反应区、所述溶液流出口和进液口，所述溶液反应区包括第一溶液反应区，所述溶液流出口置于所述第一溶液反应区的中心底部且面积不超过12平方毫米，所述进液口设于所述第一溶液反应区的底部边缘区域，所述第一溶液反应区的一个端面贴合有微孔膜，所述微孔膜盖住所述溶液流出口且将所述溶液流出口与所述第一溶液反应区分隔开。
12.如权利要求11所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，所述第一溶液反应区的容积不超过100微升，第一溶液反应区还设有排气口所述排气口设于所述第一溶液反应区流入的溶液最后充满该检测区的位置；
所述第一溶液反应区至少设有两个进液口，溶液从不同的进液口流入第一溶液反应区时，对第一溶液反应区底部或顶部的微孔膜的表面达到了均匀冲刷的结果。
13.如权利要求11所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，所述离心式微流控芯片还包括第二溶液反应区、第二出液口和第二进液口，溶液自所述第二进液口充满所述第二溶液反应区，并从所述第二出液口排出再流向第一溶液反应区。
14.如权利要求13所述的微孔膜截留集聚生化检测装置，其特征在于，所述离心式微流控芯片还设置了定容点和溢流区；所述定容点设置在溶液反应区内流入溶液最后充满的位置，进入第二溶液反应区的溶液量超过该溶液量后，多余溶液将从定容点留向溢流区。
15.如权利要求13所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其特征在于,第二出液口设有控制区，在第二溶液反应区内溶液进入后，控制区打开后溶液才能从第二出液口流出。
16.一种如权利要求9或10所述的微孔膜截留集聚生化检测装置的检测方法，其特征在于，所述微孔杯加入样品溶液且将样品溶液从贴合滤膜的通孔流尽后，另加入洗涤溶液将集聚在微孔膜上的微球洗涤并悬浮起来，随后将洗涤溶液从滤膜的通孔流尽后对再次集聚在微孔膜表面的微球进行光谱信号检测。
微孔膜截留集聚生化检测装置及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生化免疫检测技术领域，具体地说，是关于一种微孔膜截留集聚生化检测装置及其检测方法。
背景技术
[0002] 免疫分析技术是其利用抗原与抗体之间高特异性产生的识别和结合反应实现生物分子的检测，具备灵敏度高、特异性强、适用面广、所需设备简单、线性范围较宽等优点，已成为当今最具竞争力和挑战性的分析测试技术之一，在生命科学、临床医学以及环境、食品、药物等领域得到广泛应用。免疫标记分析技术主要包括：放射物标记、酶标记、发光标记、荧光标记等方法。用放射物标记抗原或抗体发展的放射免疫分析(radio immunoassay,RIA)是美国科学Yalow和Berson于1959年创立的一种微量分析法,它是将具有高灵敏度的放射性核素示踪技术和特异性免疫化学技术相结合而建立的新方法。该技术利用核素标记物的放大效应，改善了待测物的检测下限，同时以抗体或抗原作为结合试剂，大大提高了检测方法的特异性。
[0003] 以荧光标记的荧光免疫分析(fluorescein immunoassay,FIA)是由Conn等首创于20世纪40年代的一种标记免疫学技术，其所用标记物是荧光素和荧光染料，是将抗原或抗体标记以荧光物质与相应抗原或抗体结合，在荧光显微镜或紫外线照射下，检测荧光强度和荧光现象的一种检测方法。荧光标记免疫法灵敏度高，但荧光素常会产生生物学毒性，导致抗体或抗原的灵敏度和选择性下降。
[0004] 酶标记分析技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。1966年，Nakane等和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术(enzyme-labelled antibody technique)，用于生物组织中抗原的定位和鉴定。1971年，Engvall Van Weemen等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。20世纪80年代，基于酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世。目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。
[0005] 发光标记分析是20世纪80年代末,国外开始用化学发光试剂来标记抗原或抗体，从而建立了发光免疫分析技术。狭义的发光免疫分析(LIA)主要是指化学发光免疫分析(CLIA)。另外，还有酶放大化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析(ECLIA)。CLIA是Sohrocler和Halman在20世纪70年代末期建立的，该方法兼有发光分析的高灵敏度和免疫反应的特异性。其基本原理同酶标记分析法，是用化学发光反应的试剂(可以是发光剂或催化剂等)标记抗原或抗体，标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤(如离心分离、洗涤等),最后以测定发光强度形式测定。
[0006] 目前免疫分析技术主要采用以微孔板为实验平台的非均相分析模式，需要包埋、洗脱、分离等多步操作，分析过程繁琐，分析时间长，不能满足快速检测和诊断的要求。生物反应中通过微孔膜进行不同分子量的蛋白及微粒微球的穿越，是一个很常用的技术手段，尤其是在蛋白纯化中常用的离心滤管。但离心滤管一般是溶液手动加入，离心后添加复溶液将穿越的蛋白溶解回收。
[0007] 免疫侧向层析技术是20世纪末发展起来的结合免疫技术和色谱层析技术的一种分析方法，该方法具有特异性、操作简单、快速等特点，广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全等重要领域。传统免疫层析技术以胶体金为标记物，通过条带显色对目标物定性检测或半定量分析。荧光免疫层析技术作为一项新型免疫检测技术，既有传统胶体金试纸条的现场快速检测优点，又发展了荧光技术的高灵敏度特点。
[0008] 免疫层析技术是基于抗原抗体特异反应的。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原，也记作T线)和质控线(抗抗体，也记作C线)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再被包被抗体动态捕获结合形成双抗夹心的“三明治”反应复合物。一般ELISA温育时间10分钟，反应充分。免疫侧向层析在固相膜上展开长度一般超过2cm，T线宽度不超过1mm，液体前行1mm的时间仅仅3秒左右，待测蛋白在3秒内要被动态捕获蛋白捕获结合。因此包被蛋白的免疫亲和力要求很高，很多蛋白在静态捕获的酶联免疫吸附试验(ELISA)中表现不错，但在免疫侧向层析的应用中却不能采用。因此很多项目中，将标记抗体预先与样品溶液进行混合反应，或增加包被试剂与标记试剂混合层析的距离以便更充分的进行结合反应，这都能提高检测灵敏度，但却增加了额外的操作步骤。如果能在免疫层析的方法中摒弃蛋白动态捕获却采用偏向静态孵育的混合孵育方式进行免疫结合捕获，将会有更好的应用效果。
[0009] 斑点金免疫渗滤夹心法试验是在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等没滤出膜片。其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。相比较免疫侧向层析中5-20um孔径的硝酸纤维素膜，渗滤法中的膜孔径一般是0.45um，因此穿越膜的溶液流动速度慢不少，因此亲和力较弱的免疫反应能在渗滤法实验中得到合适的结果。但斑点金免疫渗滤实验中需要多个溶液的添加操作，如果能设法改造成一步加样操作简便的方案就更好了。
[0010] 近年来微流控芯片技术迅速普及，它是一种全新的微量分析技术，可以实现从样品处理到检测的微型化、自动化、集成化及便携化，因此它可以在食品安全检测方面展现出强大的发展活力，提供了一种崭新的技术工具和平台。微流控芯片的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复合体系的微全分析系统。微型反应器是芯片实验室中常用的用于生物化学反应的结构，如毛细管电泳、聚合酶链反应、酶反应和DNA杂交反应的微型反应器、免疫学检测反应等。无论在传统的ELISA方法，还是新兴的化学发光方法中，绝大部分的免疫检测方法中都需要多种溶液的添加混合反应，因此也就需要多步操作。如何在微流控芯片中尽量减少溶液的种类，并且能让微流控免疫芯片能更自动地运行，减少人员的手动操作，是目前重要的发展方向。在溶液种类少，手动介入步骤也少的目标指导下设计出合适的微流控免疫芯片，将相关免疫学信号更好地检测到，也是具有相当挑战的方向。
[0011] 国内专利文献CN201310228708.8公开了一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置及其检测方法：将标记蛋白的包被微球放入深孔滤板，与标记试剂进行静态的混合孵育反应，随后通过离心力作用将样品溶液及洗涤溶液从滤板的滤膜流尽，标记试剂等小分子或小粒径的物质随溶液流出了深孔滤板，包被微球则在穿越底部滤膜时被部分截留，随后通过光学对膜表面进行检测得到相关检测信号的实验。这个方法的意义在于免疫反应试剂在均相环境中进行了静态孵育，更加降低了对免疫抗体抗原的亲和力要求；同时孵育反应后溶液中承载着反应复合物的包被微球被集聚到滤膜中，起到了良好的反应物质浓缩作用。但是，该专利文献中的包被微球粒径与滤膜的孔径的关系没有明确界定，微球将渗入滤膜一定深度，这将导致部分微球会穿越滤膜，从而导致检测结果不准确。同时，也将导致滤膜不同深度的微球反射的光谱信号的差异。
发明内容
[0012] 本发明的目的是提供一种微孔膜截留集聚生化检测装置及其检测方法，以解决现有的微孔膜截留集聚生化检测装置的检测效果差的问题。
[0013] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0014] 作为本发明的第一个方面，一种微孔膜截留集聚生化检测装置，包括溶液反应区，所述溶液反应区的一个端面上设置了一个面积小于12平方毫米的溶液流出口，所述溶液流出口的端面贴合有孔径基本均匀的微孔膜，所述微孔膜贴合盖住了溶液流出口；溶液反应区中设置了至少一种直径基本均匀且大于微孔膜孔径的微球、固定于微球表面的捕获试剂、以及粒径小于微孔膜孔径的标记试剂，捕获试剂及标记试剂中分别设置有互为直接或间接配位体关系的配位化合物。
[0015] 根据本发明，溶液反应区中的包被微球及标记试剂的反应方式及其微观分子尺寸匹配关系：当溶液进入溶液反应区时,捕获试剂、标记试剂和待测样品在溶液中发生结合反应，在微球表面形成配位体反应复合物；当溶液从溶液流出口流出时，包被微球及其与标记试剂的反应复合物形成的微球在滤膜表面形成集聚堆积时,游离的标记试剂能从堆积的微球之间的孔隙被溶液携带穿越后从滤膜的微孔中再次穿越流出，不会形成阻截残留。
[0016] 根据本发明，所述标记试剂来源于荧光物质或肉眼直接可见的颜色微粒；所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、以及其他带颜色信号的纳米颗粒中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微球、上转换发光微球、时间分辨荧光分子及其微球、荧光蛋白中的一种或几种。
[0017] 根据本发明，所述微孔膜截留集聚生化检测装置还包括对微孔膜表面集聚堆积的反应复合物中的标记试剂光谱信号同时进行至少一个波长信号光学探测的检测设备；微孔膜受到特定波长的光线照射，集聚在表面的荧光物质将被激发后发射出特定波长的荧光信号，荧光信号强度与集聚在微孔膜表面的反应复合物数量存在特定的对应关系，荧光光谱仪接收后通过微型处理器解析出对应波峰的荧光来检测不同的微球反应复合物，计算得到不同待检测物的浓度。
[0018] 进一步的，截留集聚在微孔膜表层的反应复合物受到特定波长的光线照射被激发后发射出特定波长的荧光信号。
[0019] 根据本发明，所述溶液反应区包括免疫侧流溶液流道，在所述的免疫侧流溶液流道的某个末端设置了所述的溶液流出口，所述溶液流出口处贴合有所述微孔膜。
[0020] 进一步的，所述免疫侧流溶液流道包括能定向传递水溶液的亲水多孔膜,所述亲水多孔膜选自硝酸纤维素膜、样品吸收垫玻璃纤维膜、化学纤维膜及滤纸中的一种或多种；所述免疫侧流溶液流道由两片亲水膜的亲水表面夹持所述亲水多孔膜所构建的空隙通道，溶液从空隙通道的一端流向另一端。
[0021] 进一步的，两片亲水膜设置于所述免疫侧向流道末端，两片亲水膜的亲水表面夹持亲水多孔膜的上下表面，两片亲水膜中底部的亲水膜的下表面贴合有所述微孔膜，贴合在微孔膜上表面的亲水膜的中部设置有面积不超过12平方毫米的缺口作为溶液流出口；
[0022] 或者，两片亲水膜的亲水表面还可夹持亲水多孔膜的左右两侧，两片亲水膜夹持形成的空隙通道底面的的中部设置有缺口作为溶液流出口；
[0023] 所述溶液流出口中至少包括一个最大间隙不超过1.5mm的空隙形状或角度不超过95度的夹角。
[0024] 进一步的，微孔膜的下表面贴合有吸水材料，流入亲水膜缺口的溶液穿越微孔膜后被吸水材料吸收传递。
[0025] 根据本发明，所述溶液反应区包括容积不超过550微升的开口微孔杯，其底部中部位置设置了一个面积不超过12平方毫米的通孔，底部平面以通孔的中心为轴设置成一定锥形倾斜角度；在通孔的表面贴合了孔径基本均匀且孔径范围在0.02-1.2um的微孔膜。在溶液穿越微孔膜流出时，游离的标记试剂流出，形成配位体反应复合物的标记试剂及包被微球被微孔膜截留在表面，形成聚集浓缩效果，不但实现了从液体到膜表面的浓缩效果，还在检测区截面实现了面积的浓缩效果，达到了良好的提高灵敏度的效果。因此可实现两种溶液两步操作的快速反应方法，将免疫反应的步骤简化为抗体抗原的静态孵育，随后洗涤液对反应区域进行洗涤后就能进行信号检测。同时静态孵育免疫反应中形成免疫反应微球复合物到达滤膜截留区域时，直径小于滤膜孔径的标记试剂能自由穿越滤膜，但粒径大于滤膜孔径的包被微球及其免疫反应复合物却被截留下来并浓缩集聚栽滤膜表面，因此该发明能大大提高免疫反应的效率及灵敏度。
[0026] 进一步的，所述微孔杯底的通孔的下方设置沉孔，所述沉孔的形状与所述微孔膜相匹配，沉孔容纳微孔膜后微孔膜的下表面与微孔杯的下表面基本平齐；所述微孔膜的下方设置有具有导热作用的保护膜片，所述保护膜片的材质为金属箔或有机导热膜，该保护膜片的导热作用有利于对所述微孔杯进行温度控制，使得各孔免疫反应的温度准确且一致，所得结果精密性更好；所述保护膜片的一部分与微孔杯的底面贴合，另一部分与微孔膜贴合；所述保护膜片的中部设有一开孔，所述开孔位于微孔杯通的孔正下方。
[0027] 根据本发明，所述微孔膜截留集聚生化检测装置包括反应容器，所述反应容器是反应容积不超过100微升的离心式微流控芯片，所述离心式微流控芯片包括所述溶液反应区、所述溶液流出口和进液口，所述溶液反应区包括第一溶液反应区，所述溶液流出口置于所述第一溶液反应区的中心底部且面积不超过12平方毫米，所述进液口设于第一溶液反应区的底部边缘区域，所述第一溶液反应区的一个端面贴合有微孔膜，所述微孔膜盖住所述溶液流出口且将所述溶液流出口与所述第一溶液反应区分隔开。
[0028] 进一步的，所述第一溶液反应区的容积不超过100微升，第一溶液反应区还设有排气口，所述排气口设于所述第一溶液反应区流入的溶液最后充满该检测区的位置；
[0029] 所述第一溶液反应区至少设有两个进液口，溶液从不同的进液口流入第一溶液反应区时，对第一溶液反应区底部或顶部的微孔膜的表面达到了均匀冲刷的结果。
[0030] 进一步的，所述离心式微流控芯片还包括第二溶液反应区、第二出液口和第二进液口，溶液自所述第二进液口充满所述第二溶液反应区，并从所述第二出液口排出再流向第一溶液反应区。
[0031] 进一步的，所述离心式微流控芯片还设置了定容点和溢流区；所述定容点设置在溶液反应区内流入溶液最后充满的位置，进入第二溶液反应区的溶液量超过该溶液量后，多余溶液将从定容点留向溢流区。
[0032] 进一步的,第二出液口设有控制区，在第二溶液反应区内溶液进入后，控制区打开后溶液才能从第二出液口流出。
[0033] 作为本发明的第二个方面，一种上述所述的微孔膜截留集聚生化检测装置的检测方法，所述微孔杯加入样品溶液且将样品溶液从贴合滤膜的通孔流尽后，另加入洗涤溶液将集聚在微孔膜上的微球洗涤并悬浮起来，随后将洗涤溶液从滤膜的通孔流尽后对再次集聚在微孔膜表面的微球进行光谱信号检测。
[0034] 本发明的微孔膜截留集聚生化检测装置，其有益效果是：
[0035] 1、提高了反应的灵敏度，减少了免疫反应中队配位体亲和力的依赖：
[0036] (1)采用在溶液反应区用微孔膜截留基于包被微球的免疫反应复合物的方式，在微孔膜表面集聚了包被微球的光谱信号，不但实现了从液体到膜表面的光谱信号的浓缩效果，还在检测区截面实现了面积的浓缩效果，达到了良好的提高灵敏度的效果；
[0037] (2)实现了将免疫层析试纸的微球反应复合物通过侧流流道中设置的微孔膜进行捕获或微球截留集聚，能在一步免疫层析的基础上对免疫反应复合物的信号进行截留浓缩，从而达到更高检测灵敏度的结果；它从根本上改变了免疫反应复合物的动态捕获模式，而是由包被试剂与标记试剂跟随待测样品在溶液流动中进行充分混合并自由反应，反应不再由微孔膜的包被蛋白对动态层析的配位体进行捕获，而是通过微孔膜截留集聚反应复合物，大大提高了反应的灵敏度；
[0038] (3)同时被微孔膜截留的反应复合物集聚在相同位置，提供了进行单点多重免疫荧光检测的机会；
[0039] (4)能改变免疫层析反应中免疫复合物的捕获模式，即不再由微孔膜的包被配位体对动态层析的配位体进行捕获，而是通过微孔膜对在层析过程中实现了充分的混合配位反应后的反应复合物进行物理截留捕获，因此反应复合物的出现不在依赖配位体的亲和力了；
[0040] (5)实现了将免疫层析试纸的微球反应复合物通过侧流流道中设置的微孔膜进行微球截留集聚，能在一步免疫层析的基础上对免疫反应复合物的信号进行截留浓缩，从而达到更高检测灵敏度的结果；
[0041] (6)是免疫层析检测的一种更好实现方式，它在免疫侧向层析检测基础上增加一个新的功能结构——渗滤微孔膜，通过微孔膜对在侧向流动过程中实现了充分的混合孵育反应后的反应复合物进行捕获或物理截留，如果是物理截留则反应复合物的出现不再依赖配位体的亲和力了；
[0042] 2、捕获试剂包被在可悬浮于水溶液中的微球上，微球设置在溶液流道上，当待测样品溶液进入侧向溶液流道，分别将捕获试剂、标记试剂混合溶解，样品溶液中的待测物质、捕获试剂和标记试剂在溶液的侧向流动中发生混合孵育及免疫结合反应，在微球表面形成免疫或配位体反应复合物，经过一定距离的免疫侧向流动，溶液中各组分依次到达微孔膜，粒径小于微孔膜孔径的组分穿越微孔膜流向吸水材料如滤纸；包被微球直径大于微孔膜孔径，游离的包被微球及形成反应复合物的包被微球被溶液出口处的微孔膜截留。
[0043] 3、实现了两种溶液两步操作的快速反应方法，将免疫反应的步骤简化为抗体抗原的静态孵育，随后洗涤液对反应区域进行洗涤后就能进行信号检测；同时，静态孵育免疫反应中形成免疫反应微球复合物到达滤膜截留区域时，直径小于滤膜孔径的标记试剂能自由穿越滤膜，但粒径大于滤膜孔径的包被微球及其免疫反应复合物却被截留下来并浓缩集聚栽滤膜表面，因此该发明能大大提高免疫反应的效率及灵敏度。
[0044] 4、微孔杯用于免疫检测，免疫检测的反应在液相孵育完成，被检测的微球反应复合物随溶液流动穿越微孔膜后被杯底通孔表面的微孔膜截留集聚在微孔膜表面，而且所述微球反应复合物可经过悬浮和充分洗涤，只留下粒径大于微孔膜孔径的微球，其余部分穿越微孔膜流走，不会被截留在微孔膜表面或滞留在微孔膜内部。附图说明
[0045] 图1为实施例1的微孔膜截留集聚检测装置的结构示意图。
[0046] 图2为图1的微孔膜截留集聚检测装置的俯视图示意图。
[0047] 图3为实施例2的微孔膜截留集聚检测装置的结构示意图。
[0048] 图4为实施例2的微孔膜截留集聚检测装置的另一结构示意图。
[0049] 图5为实施例2的微孔膜截留集聚检测装置的局部俯视图示意图。
[0050] 图6为实施例2的溶液流出口的结构示意图。
[0051] 图7为实施例2的溶液流出口的另一结构示意图。
[0052] 图8为实施例2的微孔膜截留集聚检测装置的两亲水膜的结构示意图。
[0053] 图9为实施例3的微孔膜截留集聚检测装置的俯视图示意图。
[0054] 图10为实施例3的微孔膜截留集聚检测装置的俯视图示意图。
[0055] 图11为实施例3的微孔膜截留集聚检测装置的俯视图示意图。
[0056] 图12为实施例3的微孔膜截留集聚检测装置的第二溶液反应区与第一溶液反应区相连接的结构示意图。
[0057] 图13为待测样品、固定有捕获试剂的微球、标记试剂结合的示意图。
[0058] 图14为待测样品、固定有捕获试剂的微球、标记试剂结合的另一示意图。
[0059] 图15为实施例9的定量标准曲线图。
[0060] 图16为实施例10的定量标准曲线图。
具体实施方式
[0061] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
[0062] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0063] 同时在本发明的描述中，需要说明的是，术语中的“上、下、内和外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
[0064] 实施例1
[0065] 如图1和图2所示，为本发明的一种微孔膜截留集聚生化检测装置，包括溶液反应区，所述溶液反应区包括容积不超过550微升的开口微孔杯1，其底部中部位置设置了一个面积不超过12平方毫米的通孔2，底部平面以通孔2的中心为轴设置成一定锥形倾斜角度；在通孔2的表面贴合了孔径基本均匀且孔径大于20nm的微孔膜3，所述微孔膜3贴合盖住了通孔；溶液反应区中设置了至少一种直径基本均匀且大于微孔膜孔径的微球、固定于微球表面的捕获试剂、以及粒径小于微孔膜孔径的标记试剂，捕获试剂及标记试剂中分别设置有互为直接或间接配位体关系的配位化合物。在溶液穿越微孔膜流出时，游离的标记试剂流出，形成配位体反应复合物的标记试剂及包被微球被微孔膜截留在表面，形成聚集浓缩效果，不但实现了从液体到膜表面的浓缩效果，还在检测区截面实现了面积的浓缩效果，达到了良好的提高灵敏度的效果。因此可实现两种溶液两步操作的快速反应方法，将免疫反应的步骤简化为抗体抗原的静态孵育，随后洗涤液对反应区域进行洗涤后就能进行信号检测。同时静态孵育免疫反应中形成免疫反应微球复合物到达滤膜截留区域时，直径小于滤膜孔径的标记试剂能自由穿越滤膜，但粒径大于滤膜孔径的包被微球及其免疫反应复合物却被截留下来并浓缩集聚栽滤膜表面，因此该发明能大大提高免疫反应的效率及灵敏度。
[0066] 所述微孔杯底的通孔2的下方设置沉孔6，所述沉孔6的形状与所述微孔膜3相匹配，沉孔6容纳微孔膜3后，微孔膜3的下表面与微孔杯1的下表面基本平齐。所述微孔膜3的下方设置有具有导热作用的保护膜片4，所述保护膜片4的材质为金属箔或有机导热膜，该保护膜片4的导热作用有利于对所述微孔杯1进行温度控制，使得各孔免疫反应的温度准确且一致，所得结果精密性更好；所述保护膜片4的一部分与微孔杯1的底面贴合，另一部分与微孔膜3贴合；所述保护膜片4的中部设有一开孔5，所述开孔5位于微孔杯1的通孔2的正下方。
[0067] 微孔杯1的横截面呈圆形，微孔杯1的外壁下部对称设置有至少一对高度一致的下凸点7，微孔杯1的外壁上部对称设有至少一对高度一致的上凸点8，微孔杯的上凸点8与下凸点7与固相集聚免疫检测用的穿孔板相匹配。使用时，通过上、下凸点与穿孔板配合，能对每个微孔杯进行单独的高度一致的固定，能通过一个平面对微孔杯底部进行温浴接触及其他接触，如通过真空吸嘴对微孔杯底部进行溶液抽取。当将微孔杯插入一个与微孔杯外形相匹配的穿孔板时，所述微孔杯1能被上凸点8悬挂起来；当将微孔杯1旋转一定角度后，所述微孔杯的下凸点7与穿孔板的下表面接触，上凸点8与穿孔板的上表面接触，此时微孔杯不能下降，也不能拔出，起到固定微孔杯的作用。
[0068] 溶液反应区中的包被微球及标记试剂的反应方式及其微观分子尺寸匹配关系：当溶液进入溶液反应区时,捕获试剂、标记试剂和待测样品在溶液中发生结合反应，在微球表面形成配位体反应复合物；当溶液从溶液流出口流出时，包被微球及其与标记试剂的反应复合物形成的微球在滤膜表面形成集聚堆积，游离的标记试剂能从堆积的微球之间的孔隙被溶液携带穿越后从滤膜的微孔中再次穿越流出，不会形成阻截残留。
[0069] 所述标记试剂来源于荧光物质或肉眼直接可见的颜色微粒；所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、以及其他带颜色信号的纳米颗粒中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微球、上转换发光微球、时间分辨荧光分子及其微球、荧光蛋白中的一种或几种。
[0070] 所述微孔膜截留集聚生化检测装置还包括对微孔膜表面集聚堆积的反应复合物中的标记试剂光谱信号同时进行至少一个波长信号光学探测的检测设备；微孔膜受到特定波长的光线照射，集聚在表面的荧光物质将被激发后发射出特定波长的荧光信号，荧光信号强度与集聚在微孔膜表面的反应复合物数量存在特定的对应关系，荧光光谱仪接收后通过微型处理器解析出对应波峰的荧光来检测不同的微球反应复合物，计算得到不同待检测物的浓度。
[0071] 截留集聚在微孔膜表层的反应复合物受到特定波长的光线照射被激发后发射出特定波长的荧光信号。
[0072] 实施例2
[0073] 如图3所示，为本发明的一种微孔膜截留集聚检测装置，包括溶液反应区，所述溶液反应区包括免疫侧向流道和孔径小于1.2um的微孔膜23，免疫侧向流道的溶液直接流入其末端设置的溶液流出口29，所述溶液流出口29处贴合有所述微孔膜23，以供溶液穿越渗滤。所述免疫侧向流道中设置了至少一种标记试剂，微孔膜上包被了捕获试剂；捕获试剂及标记试剂中分别设置有互为直接或间接配位体关系的物质。
[0074] 如图4所示，为本发明的另一种微孔膜截留集聚检测装置，包括溶液反应区，所述溶液反应区包括免疫侧流溶液流道，在所述的免疫侧流溶液流道的某个末端设置了所述的溶液流出口29，所述溶液流出口29处贴合有孔径基本均匀且孔径范围在0.02-1.2um的微孔膜23；所述免疫侧向流道中设置了至少一种直径基本均匀且大于微孔膜孔径的包被微球、固定于微球表面的捕获试剂、以及直径小于微孔膜孔径的标记试剂；捕获试剂及标记试剂中分别设置有互为直接或间接配位体关系的物质。
[0075] 具体的，所述免疫侧向流道中贴合在微孔膜23上的亲水膜24的下表面涂布有胶水或不干胶，溶液中的微球不会从亲水膜24与微孔膜23的贴合间隙中流走，只能从作为溶液流出口29的亲水膜缺口处贴合的的微孔膜23流出。如图5所示，这个缺口可以是多边形、圆形或长方形，当缺口为圆形时，所述缺口中至少有一个最大间隙不超过1.5mm的空隙形状291(如图6和图7所示)或角度不超过95度的夹角，这样更有利于流动到缺口边缘的溶液沿侧边流入缺口，接触到贴合在亲水膜侧边底部的具有良好亲水性的微孔膜23；当缺口成为长方形时，其宽度可设置为0.2-2.5mm，它两个侧边上表面的溶液由于表面张力缘故，将拉动溶液从侧边向前跨越空隙，此时在重力的作用下，跨越了侧边的溶液将下沉接触到底部的亲水膜，随后在亲水多孔膜的亲水拉动力作用下，液体将进入缺口穿越微孔膜23。
[0076] 使用时，亲水膜24的亲水表面能传递溶液达缺口边缘，但亲水膜24的缺口侧边很难处理达到同样的表面亲水性，因此溶液不容易沿侧边流入缺口，接触到的贴合在亲水膜侧边底部的具有良好亲水性的微孔膜。当缺口的空隙或角度造成的临界条件达到后，即设置最大间隙不超过1.5mm的空隙形状或角度不超过95度的夹角，其靠近的两个侧边上表面的溶液由于表面张力缘故，将拉动溶液从侧边向前跨越空隙，此时在重力的作用下，跨越了侧边的溶液将下沉接触到底部的亲水膜，随后在微孔膜的亲水拉动力作用下，液体将进入缺口穿越微孔膜23。当由两层亲水膜24夹持形成侧向流道时，至少在设置了缺口的亲水膜对面的亲水膜是透明的(即两片亲水膜中，上方的亲水膜是透明的)，能对其对面亲水膜缺口处的微孔膜表面进行荧光或其他光谱检测。
[0077] 所述免疫侧流溶液流道包括能定向传递水溶液的亲水多孔膜21，所述亲水多孔膜21选自硝酸纤维素膜、样品吸收垫玻璃纤维膜、化学纤维膜及滤纸中的一种或多种；所述免疫侧流溶液流道由两片亲水膜24的亲水表面夹持所述亲水多孔膜21所构建的空隙通道，通过亲水膜24表面的溶液表面张力作为液体流动的动力，溶液从空隙通道的一端流向另一端。
[0078] 如图1或4所示，两片亲水膜24设置于所述免疫侧向流道末端，两片亲水膜24的亲水表面夹持亲水多孔膜21的上下表面，两片亲水膜24的底部的亲水膜的下表面贴合有所述微孔膜23，贴合在微孔膜23上表面的亲水膜24的中部设置有面积不超过12平方毫米的缺口作为溶液流出口29。如图8所示，两片亲水膜24的亲水表面也可夹持亲水多孔膜21的左右两侧，两片亲水膜24夹持形成的空隙通道底面的的中部设置有缺口作为溶液流出口29。为了构建空隙通道，两片亲水膜可以夹持亲水多孔膜1，形成一个空隙通道，在通道末端可以贴合一个双面胶或设置其他封堵材质，将两片亲水膜间隙高度固定并封堵，使空隙通道的溶液不再外流。
[0079] 所述溶液流出口29形状中至少包括一个最大间隙不超过1.5mm的空隙形状291或角度不超过95度的夹角。
[0080] 微孔膜23的下表面贴合有吸水材料22，流入亲水膜缺口的溶液穿越微孔膜23后被吸水材料22吸收传递。
[0081] 溶液反应区中的包被微球及标记试剂的反应方式及其微观分子尺寸匹配关系：当溶液进入溶液反应区时,捕获试剂、标记试剂和待测样品在溶液中发生结合反应，在微球表面形成配位体反应复合物；当溶液从溶液流出口流出时，包被微球及其与标记试剂的反应复合物形成的微球在滤膜表面形成集聚堆积,游离的标记试剂能从堆积的微球之间的孔隙被溶液携带穿越后从滤膜的微孔中再次穿越流出，不会形成阻截残留。
[0082] 微孔膜23的下表面贴合有吸水材料22，如滤纸等，从缺口流入亲水膜24的溶液穿越微孔膜23后被滤纸等吸水材料22吸收传递。市场还有直接在滤纸表面成型的微孔膜23，就可以直接采用该商品化产品，将表面带胶水的亲水膜24贴合在微孔膜23表面，更加能保证吸水效果。
[0083] 如图3和图4所示，亲水多孔膜21的的首端还设置有孔径小于微孔膜的孔径的前处理微孔膜28；样品溶液从样品吸收垫26流经前处理微孔膜28后再流向试剂结合垫27，最后流向亲水多孔膜21；固定了标记试剂的亲水多孔膜设置在前处理微孔膜28的后端，由前处理微孔膜28的溶液溶解后流经亲水多孔膜21。
[0084] 所述标记试剂来源于荧光物质或肉眼直接可见的颜色微粒；所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、以及其他带颜色信号的纳米颗粒中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微球、上转换发光微球、时间分辨荧光分子及其微球、荧光蛋白中的一种或几种。
[0085] 其中，标记试剂可以悬浮在溶液中被加入侧向流道中；标记试剂也可以包被固化在流道中的多孔膜上或包被固化在侧向流道的某个表面，随后被溶液溶解后跟随溶液向前流动。包被微球可以悬浮在溶液中被加入侧向流道中；包被微球也可以包被固化在流道中的多孔膜上或包被固化在侧向流道的某个表面，随后被溶液溶解后跟随溶液向前流动。
[0086] 本实施例的微孔膜截留集聚生化检测装置还包括对微孔膜表面集聚堆积的反应复合物中的标记试剂光谱信号同时进行至少一个波长信号光学探测的检测设备；微孔膜受到特定波长的光线照射，集聚在表面的荧光物质将被激发后发射出特定波长的荧光信号，荧光信号强度与集聚在微孔膜表面的反应复合物数量存在特定的对应关系，荧光光谱仪接收后通过微型处理器解析出对应波峰的荧光来检测不同的微球反应复合物，计算得到不同待检测物的浓度。
[0087] 截留集聚在微孔膜表层的反应复合物受到特定波长的光线照射被激发后发射出特定波长的荧光信号。
[0088] 实施例3
[0089] 如图9-12所示，为本发明一种微孔膜截留集聚检测装置，包括反应容器，所述反应容器是反应容积不超过100微升的离心式微流控芯片，所述离心式微流控芯片包括所述溶液反应区，所述溶液反应区包括第一溶液反应区200，所述第一溶液反应区200上设有溶液流出口202和进液口203，所述溶液流出口202置于所述第一溶液反应区200的中心底部且面积不超过12平方毫米，所述进液口203设于所述第一溶液反应区200的底部边缘区域，所述第一溶液反应区200的一个端面贴合有微孔膜300，所述微孔膜300盖住所述溶液流出口202且将所述溶液流出口202与所述第一溶液反应区200分隔开。
[0090] 所述第一溶液反应区200的容积不超过100微升，第一溶液反应区200上设有排气口201，所述排气口201设于所述第一溶液反应区200流入的溶液最后充满第一溶液反应区200的位置，所述溶液流出口202置于所述第一溶液反应区200的中心底部。
[0091] 所述第一溶液反应区200至少设有两个进液口203，溶液从不同的进液口203流入第一溶液反应区200时，对第一溶液反应区200底部或顶部的微孔膜300的表面达到了均匀冲刷的结果。
[0092] 所述离心式微流控芯片还包括第二溶液反应区600，第二溶液反应区600上设有第二排气口601、第二出液口602和第二进液口603，所述第二排气口601设于所述第二溶液反应区600的溶液进入后最后才充满的位置。
[0093] 所述离心式微流控芯片还设置了定容点604和溢流区1000；所述定容点604设置在第二溶液反应区600内流入溶液最后充满的位置，进入第二溶液反应区600的溶液量超过该溶液量后，多余溶液将从定容点留向溢流区1000。
[0094] 第二出液口602设有控制区800，在第二溶液反应区600内进入溶液后，控制区800打开，溶液才能从第二出液口602流出。
[0095] 微流控芯片的流道内还添加至少一种直径基本均匀且大于滤膜孔径的包被微球(粒径为800nm)、固定于包被微球表面的配位体如某蛋白的单抗A、以及直径小于微孔膜孔径的量子点微粒(直径20nm)标记的乙肝表面抗原蛋白的单抗B；当该蛋白的样品溶液加入该微流控芯片时，包被微球、单抗A、标记量子点微粒的单抗B一起进入第一溶液反应区进行混合孵育反应。当溶液受到驱动力时将穿越滤膜从出口流出，直径小于滤膜孔径的量子点微粒标记的单抗B能自由穿越滤膜，但粒径大于滤膜孔径的包被微球及单抗A、抗体免疫反应复合物(包被微球及量子点微粒)却被截留下来并浓缩集聚在滤膜表面。
[0096] 本实施例的捕获试剂、标记试剂固化在所述第二溶液反应区600内或者捕获试剂和标记试剂中的至少一种固化在第二溶液反应区600的上游，所述记捕获试剂、标记试剂至少一个从第二溶液反应区600的第二进液口流入。
[0097] 本实施例的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片的检测方法，所述第一溶液反应区200的溶液入口203流入样品溶液并充满第一溶液反应区200后，捕获试剂、标记试剂、待测样品在样品溶液中发生结合反应，在包被微球表面形成配位体反应复合物；当样品溶液受到驱动从溶液出口穿越微孔膜后，另有洗涤溶液从溶液入口流入第一溶液反应区，持续穿越微孔膜并对集聚在微孔膜表面的微球进行洗涤，游离的标记试剂流出，形成配位体反应复合物的标记试剂及包被微球被微孔膜截留在表面，避免游离标记试剂被阻截残留在微孔膜表面。
[0098] 本实施例的包被微球及量子点微粒的粒径差异关系：游离包被微球及反应复合物微球在滤膜表面形成集聚堆积时，游离的量子点微粒能从堆积的微球之间的孔隙被溶液携带从堆积的微球间隙中穿越后再次穿越滤膜流出，不会形成阻截残留，因此滤膜表面截留的量子点微粒属于反应复合物，当荧光被激发时，荧光强度与该蛋白的含量存在特定的对应关系。
[0100] 所述标记试剂包括可呈现光谱信号的荧光物质或颜色微粒，所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、以及其他带颜色信号的纳米颗粒等中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微粒及其微球、上转换发光微粒及其微球、时间分辨荧光分子及其微球、以及荧光蛋白等中的一种或几种。
[0101] 本实施例的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片还包括对微孔膜表面集聚堆积的反应复合物中的标记试剂光谱信号进行光学探测的检测设备；微孔膜受到特定波长的光线照射，集聚在微球表面的标记试剂的荧光物质将被激发后发射出特定波长的荧光信号，荧光信号强度与集聚在微孔膜表面的反应复合物数量存在特定的对应关系。
[0102] 微孔膜截留集聚微球的微流控芯片还包括对微孔膜表面截留的反应复合物中标记试剂的光谱信号同时进行多重波长信号光学探测的检测设备。
[0103] 实施例1-3的捕获试剂、标记试剂、待测样品在溶液中发生结合反应的方式有三种：
[0104] (1)待测样品与标记试剂竞争结合溶液反应区内的固定有捕获试剂的微球，在微球表面形成反应复合物，待溶液充分反应后，当反应液流经微孔膜，固定有捕获试剂的微球及反应复合物截留在微孔膜表面；
[0105] (2)如图13所示，待测样品15与固定有捕获试剂12的微球11竞争结合标记试剂14，在微球11表面形成反应复合物13，待溶液充分反应后，当反应液流经微孔膜，固定有捕获试剂12的微球11及反应复合物13截留在微孔膜表面；
[0106] (3)如图14所示，待测样品15、固定有捕获试剂12的微球11、标记试剂14结合形成反应复合物13，待溶液充分反应后，当反应液流经微孔膜，固定有捕获试剂12的微球11及反应复合物13截留在微孔膜表面。
[0107] 在竞争免疫反应中，捕获试剂可以是包被在微孔膜上的竞争抗原如偶联了载体蛋白的小分子抗原，标记试剂则是标记了荧光或其他光谱信号的待测物质的抗体；当溶液中的游离抗原在溶液中与全部标记试剂反应后，则捕获试剂将不再有免疫反应复物；当溶液中的游离抗原在溶液中与部分标记试剂反应后，微孔膜上的捕获试剂将产生部分的免疫反应复合物，因此将有一部分免疫反应复合物被捕获在微孔膜上。
[0108] 在免疫夹心法反应中，捕获试剂可以是包被在微孔膜上的抗体A，标记试剂则是标记了荧光或其他光谱信号的的抗体B；当溶液中的抗原在侧向流动的溶液混合流动时,它先与同时溶解在溶液中的标记试剂及抗体B反应,溶液在微孔膜上渗滤流动时,再被微孔膜上的抗体A捕获而截留在微孔膜上。
[0109] 实施例4一种微孔膜截留集聚微球的生化检测装置的组装方式
[0110] 如图3和图4所示，为一种微孔膜截留集聚微球的生化检测装置，在涂布有不干胶的PVC底板上粘贴硝酸纤维素膜(即多孔亲水膜21)，依次在其前端下缘粘贴试剂结合垫27、前处理微孔膜28和样品吸收垫26，其中样品吸收垫16mm，与前处理微孔膜28交叠部分2mm，长度12mm的前处理微孔膜28与试剂结合垫27交叠部分2mm，完全遮挡样品吸收垫26和试剂结合垫27相交叠的部分；长度8mm试剂结合垫27与长度20mm的硝酸纤维素膜交叠部分1mm，硝酸纤维素膜被上下两片亲水膜24夹持1-10mm，形成的亲水膜空隙通道长度5-30mm，亲水膜24底部缺口位置如图4所示(缺口29设于下方亲水膜上)，缺口的宽度0.2-1.5mm，截留微孔滤膜紧贴在亲水膜缺口处，微孔膜23的宽度为2-8mm，两者组装时如图4所示，此时样品溶液从免疫侧向流道流向微孔膜23，全部溶液只能从亲水膜24的缺口穿越微孔膜23流动。
[0111] 实施例5一种微孔膜截留集聚微球的生化检测装置用于检测尿液中HCG蛋白[0112] 如图3和图4所示，为一种微孔膜截留集聚微球的生化检测装置，它包括免疫侧向流道和孔径0.45um的微孔膜23两部分，免疫侧向流道主要由样品吸收垫26、试剂结合垫27、亲水多孔膜21、微孔膜23组成，所述样品吸收垫26、试剂结合垫27、亲水多孔膜21、微孔膜23从前向后依次设置，亲水多孔膜21由两层亲水膜24的亲水面相向夹持而成，并保持0.15mm的空隙向前延伸约5mm，亲水多孔膜21的溶液被上下夹持亲水多孔膜21的亲水膜24引流出来，溶液直接流入底部亲水膜末端设置的溶液流出口29，所述溶液流出口29处贴合有0.45um微孔膜23。
[0113] 免疫侧向流道的试剂结合垫上添加了一种HCG单抗A标记的胶体金颗粒，微孔膜23上包被了HCG单抗B；当溶液中含有HCG蛋白时在免疫侧向流道中流动时，HCG蛋白将被HCG单抗A反应结合，随后在穿越微孔膜23时，反应复合物再次被HCG单抗B捕获，在微孔膜的膜面上形成两个单抗夹心HCG蛋白的反应复合物。这些反应复合物通过使用者的肉眼或配套的胶体金定量分析仪器，能对溶液中HCG的浓度情况进行判断分析。
[0114] 实施例6一种微孔膜截留集聚微球的生化检测装置用于检测尿液中HCG蛋白[0115] 如图3和图4所示，为一种微孔膜截留集聚微球的生化检测装置，它包括免疫侧向流道和孔径0.22um的微孔膜23两部分，免疫侧向流道主要由样品吸收垫26、试剂结合垫27、亲水多孔膜21、微孔膜23组成，所述样品吸收垫26、试剂结合垫27、亲水多孔膜21、微孔膜23从前向后依次设置，亲水多孔膜21由两层亲水膜24的亲水面相向夹持而成，并保持0.15mm的空隙向前延伸约5mm，亲水多孔膜21的溶液被上下夹持亲水多孔膜21的亲水膜24引流出来，溶液直接流入底部亲水膜末端设置的溶液流出口29，所述溶液流出口29处贴合有0.22um微孔膜23。
[0116] 免疫侧向流道中的样品吸收垫26上固化有一种HCG单抗A标记的粒径约40nm的胶体金颗粒，试剂结合垫27上固化有一种直径1.5um且表面固定包被了HCG单抗A的包被微球，当尿液样品溶液中含有HCG蛋白时在免疫侧向流道中流动时，HCG蛋白将在溶液层析过程中与HCG单抗A及单抗B相对应的微球及纳米金粒混合反应结合，形成两个单抗夹心HCG蛋白的反应复合物，随后在穿越0.22um微孔膜时，游离的HCG单抗A标记的粒径约40nm的胶体金颗粒将穿越微孔膜流走，反应复合物的包被微球及游离包被微球将被截留在微孔膜表面，这些反应复合物通过使用者的肉眼或配套的胶体金定量分析仪器，能对溶液中HCG的浓度情况进行判断分析。
[0117] 实施例7一种微孔膜截留集聚微球的生化检测装置用于检测粪便类样品中FOB蛋白
[0118] 一种微孔膜截留集聚微球的生化检测装置，它包括免疫侧向流道和孔径0.22um的微孔膜两部分，免疫侧向流道主要由样品吸收垫、标记试剂结合垫、0.22um的微孔膜、包被试剂结合垫、亲水多孔膜组成，所述样品吸收垫、标记试剂结合垫、包被试剂结合垫、亲水多孔膜、微孔膜从前向后依次设置，亲水多孔膜由两层亲水膜的亲水面相向夹持而成，并保持0.15mm的空隙向前延伸约5mm，亲水多孔膜的溶液被上下夹持层析膜的亲水膜引流出来，溶液直接流入底部亲水膜末端设置的溶液流出口，所述溶液流出口处贴合有0.22um微孔膜。
[0119] 免疫侧向流道中的标记试剂结合垫上固化有一种FOB单抗A标记的粒径约40nm的胶体金颗粒，包被试剂结合垫上固化有一种直径1.5um且表面固定包被了FOB单抗A的包被微球。当粪便类样品溶液滴加在检测装置中时，FOB蛋白在免疫侧向流道中流动，溶液将先FOB单抗A标记的胶体金粒子混合反应结合，随后溶液将穿越0.22um的过滤微孔膜，所有粒径大于该孔径的杂志颗粒将被截留，已经初步反应的胶体金粒子复合物与FOB单抗B相对应的包被微球进一步混合反应结合，形成两个单抗夹心HCG蛋白的反应复合物，随后在穿越0.22um微孔膜时，游离的HCG单抗A标记的粒径约40nm的胶体金颗粒将穿越微孔膜流走，反应复合物的包被微球及游离包被微球将被截留在微孔膜表面，这些反应复合物通过使用者的肉眼或配套的胶体金定量分析仪器，能对溶液中HCG的浓度情况进行判断分析。
[0120] 实施例8
[0121] 如图1所示，采用孔径为0.45μm的滤膜3，并在微孔杯1的底部偶联BSA-AFM1抗原的500nm SIO2微球和偶联AFM1鼠单克隆抗体的400nm荧光微球。
[0122] 当进行免疫检测时，包括如下步骤：
[0123] i.包含待检测物质的溶液进入微孔杯1，将偶联BSA-AFM1抗原的500nm SIO2微球和偶联AFM1鼠单克隆抗体的400nm荧光微球溶解，溶解后，待检测物质与偶联BSA-AFM1抗原的500nm SIO2微球竞争结合偶联AFM1鼠单克隆抗体的400nm荧光微球；
[0124] ii.待溶液充分反应后，使反应液流经所述微孔膜，所述微孔膜的孔径基本均匀，使偶联BSA-AFM1抗原的500nm SIO2微球及反应复合物截留在微孔膜表面；
[0125] iii.对微孔膜表面截留物的标记信号进行检测，计算得到待检测物的浓度。
[0126] 所述对微孔膜表面截留物的标记信号进行检测是：使微孔膜受到特定波长的光线照射，使微孔膜表面截留物所带的荧光物质被激发后发射出特定波长的荧光信号。
[0127] 所述计算得到待检测物的浓度是基于：荧光信号强度与集聚在微孔膜表面的反应复合物数量存在特定的对应关系。
[0128] 实施例9检测牛奶等中的黄曲霉素的含量
[0129] A、准确吸取500μL牛奶(样本1)、酸奶(样本2)于15mL离心管中，加入9.5mL35％甲醇水；振荡混匀，5000rpm室温离心5min；取上清50μL用于分析。
[0130] B、取出微孔杯，放置至室温，分别加入标准品和待测样本。
[0131] C、将反应容器放置37℃孵育15min。
[0132] D、放入反应容器超滤系统中，抽滤20s。
[0133] E、将反应容器从微孔杯超滤系统中取出，加入300uL洗液。
[0134] F、放入反应容器超滤系统中，抽滤45s。
[0135] G、放入荧光检测系统中读取荧光值。
[0136] 实验结果如表1所示。
[0137] 表1荧光值
[0138]
[0139] 接着，将标准品OD值与平均OD值做曲线得到如下方程y＝-0.3999x+2.9025，R2＝0.9991，结果如图15所示。
[0140] 根据曲线方式计算得到样本浓度为(ppb)。
[0141] 经计算，样本1的黄曲霉素的浓度为0.005074ppb，样本2中黄曲霉素的浓度为0.014189ppb。
[0142] 结论：采用本发明的微孔膜截留集聚检测装置进行免疫检测试验具有良好的线性，说明该检测装置及检测的一致性好，准确性好。本实施例的检测浓度0.005ppb并是能检测的低限。
[0143] 实施例10竞争法检测药残小分子克伦特罗
[0144] 1材料与方法
[0145] 1.1材料与试剂
[0146] 包被克特罗竞争抗原的包被微球，标记克伦特罗抗体的荧光微球，0.45um滤膜。
[0147] 1.2设备与仪器
[0148] 移液器；pH酸度计；荧光检测系统；滤膜截留式微孔杯(固化有包被微球偶联的抗原及偶联抗体的荧光微球)。
[0149] 1.3方法
[0150] 1.3.1样品的处理
[0151] 准确称取1±0.01g共5个样品的均质物(均质前充去样本中的血水)于5ml离心管中，加入1.5ml 0.05M HCl，加入1.5ml 2％的NaCl，震荡混匀，在室温5000rpm离心5min，取1ml上清液至2ml离心管中，调节pH至7-8，待测。
[0152] 1.3.2实验操作
[0153] (1)取出滤膜截留式微孔杯，放置至室温，分别于加样池加入45ul标准品和45ul待测样本。
[0154] (2)将滤膜截留式微孔杯放入离心机中900rpm离心10s，反应池中孵育30min，1200rpm离心到废液池。
[0155] (3)于微孔杯工作系统中取出滤膜截留式微孔杯，与洗液池中加入洗液60ul，放入微孔杯工作系统中，3500rpm离心30s。
[0156] (4)放入荧光检测系统中读取荧光值。
[0157] 1.3.3标准曲线的绘制
[0158] 分别用4％NaCl配置盐酸克伦特罗0、0.002、0.01、0.05、0.25、1.25ppb标准品溶液，加入45ul于滤膜截留式微孔杯，操作如1.3.2，通过荧光检测系统读取的荧光值绘制标准曲线。
[0159] 1.3.4盐酸克伦特罗ELISA法和胶体金法检测
[0160] 使用上海快灵生物科技有限公司盐酸克伦特罗ELISA检测试剂盒和胶体金试纸条，按操作说明书检测共5个待测样品。
[0161] 1.4结果与分析
[0162] 1.4.1标准曲线的绘制，绘制标准曲线如图16所示。
[0163] 1.4.2滤膜截留式微孔杯法检测结果
[0164] 滤膜截留式微孔杯法检测5个待测样品中盐酸克伦特罗含量，检测结果如表2所示。
[0165] 表2滤膜截留式微孔杯法检测结果
[0166]
[0167] 1.4.3盐酸克伦特罗ELISA法和胶体金法检测结果
[0168] ELISA法和胶体金法检测5个待测样品中盐酸克伦特罗含量，检测结果如表3所示。
[0169] 表3 ELISA法和胶体金法检测结果
[0170]
[0171] 1.5结果
[0172] 本实验采用滤膜截留式微孔杯法检测5个样品中盐酸克伦特罗含量，检测结果分别为0.01、0.018、0.032、3.15、2.82ppb，与购买上海快灵生物科技有限公司的ELISA试剂盒和胶体金同时检测，ELISA法检测结果为3个待测样超出检测范围，2个待测样分别为1.78、1.98ppb，相比较ELISA法，微流控芯片法检测灵敏度提高25倍，胶体金法检测结果为3个待测样无信号，2个待测样有信号，相比胶体金法，滤膜截留式微孔杯法灵敏度提高100-1000倍。
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