阻断CCL28趋化通路的胃癌治疗方法
阅读：786发布：2020-05-08
专利汇可以提供阻断CCL28趋化通路的胃癌治疗方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种通过阻断CCL28趋化通路的胃癌 治疗 方法。具体地，提供了一种CCL28基因或CCL28蛋白的用途，用于制备检测胃癌的 试剂 或 试剂盒 ，所述的胃癌是Wnt/β-catenin 信号 通路与趋化因子CCL28相关分子表达同时异常上调型的胃癌。同时本发明提供了一种检测试剂盒、一种药物组合物的用途、和一种体内外抑制癌细胞生长的方法。本发明提供的胃癌 治疗方案 ，不但能有效抑制胃癌发展和转移，同时不降低病人的自身免疫 力 ，还会提高整体的免疫力。，下面是阻断CCL28趋化通路的胃癌治疗方法专利的具体信息内容。
1.一种CCL28基因或CCL28蛋白或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备检测胃癌的试剂或试剂盒，所述的胃癌是Wnt/β-catenin信号通路与趋化因子CCL28相关分子表达同时异常上调型的胃癌。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的胃癌的病理表现具有选自下组的一个或多个病理表现：
(1)胃部组织中Wnt/β-catenin信号通路相关表达上调；
(2)胃部组织中趋化因子CCL28相关表达上调；
(3)胃部肿瘤；
(4)胃壁细胞丢失；及
(5)胃部组织调节T细胞增多。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Wnt/β-catenin信号通路相关表达，包括转录因子TCF1和TCF4的表达水平、β-catenin的含量、β-catenin核异位水平、β-catenin/TCF4复合物的转录活性、GSK3β磷酸化水平或其组合。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的趋化因子CCL28相关分子，包括CCL28及其受体的基因、蛋白、或其组合。
5.一种用于检测胃癌的试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测CCL28相关蛋白或mRNA的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测胃癌。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的标签或说明书中注明内容，选自下组：
a)当检测对象的CCL28相关蛋白的mRNA表达量A1与癌旁组织的CCL28相关蛋白的mRNA表达量A0之比(A1/A0)≥2，则提示该检测对象患胃癌的几率高于普通人群；
b)当检测对象的CCL28相关蛋白的mRNA表达量与癌旁组织的CCL28相关蛋白的mRNA表达量之比A1/A0≥2，如果该A1/A0比值越高，则提示所述检测对象患胃癌的恶性程度越高；
和
c)当检测对象的CCL28相关蛋白的mRNA表达量与癌旁组织的CCL28相关蛋白的mRNA表达量之比A1/A0≥2，如果该A1/A0比值越高，则提示所述检测对象患胃癌的预后越差、转移率越高。
7.一种CCL28抑制剂的用途，其特征在于，用于制备抑制癌细胞生长或增殖的药物组合物，或用于制备治疗胃癌的药物组合物；所述的胃癌是Wnt/β-catenin信号通路与趋化因子CCL28相关分子表达同时异常上调型的胃癌。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述CCL28抑制剂选自下组：
靶向CCL28和/或其受体蛋白的抗体或小分子抑制剂；靶向CCL28和/或其受体基因的靶向核酸分子或基因编辑器；或其组合。
9.一种体外非治疗性的抑制癌细胞生长或增殖的方法，其特征在于，包括步骤：在CCL28抑制剂存在下，培养癌细胞，从而抑制癌细胞生长或增殖。
10.一种筛选治疗癌症的候选化合物的方法，包括步骤：
(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中CCL28相关分子的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中CCL28相关分子的表达量和/或活性；
其中，如果测试组中细胞的CCL28相关分子的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对CCL28相关分子的表达和/或活性有抑制作用的治疗癌症的候选化合物。
阻断CCL28趋化通路的胃癌治疗方法
技术领域
背景技术
[0002] 快速发展的免疫治疗方法为无数肿瘤病人带来了希望。胃癌的分子特征表明，EBV相关亚型的胃癌显示PD-L1表达升高，提示抗PD的免疫治疗对这些患者可能有效。然而，相较于黑素瘤和肺癌，由于胃癌免疫微环境和分子机制的复杂性，这些免疫治疗方法在胃癌中的发展遇到许多实用性难题。肿瘤的免疫逃逸机制也是肿瘤的免疫治疗的一大障碍。调节T细胞(Treg)是一类参与到肿瘤的免疫逃避中的重要免疫抑制型细胞。它的增多会导致抗肿瘤的效应免疫细胞的功能和数量降低，同时也会导致肿瘤的免疫治疗或其他疗法的功效的减弱甚至丧失。长期罹患胃癌和其他经受免疫治疗的患者而言，自身免疫力低下及其衍生疾病是致死的重要原因。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种有效的针对难治性胃癌同时减少副作用的治疗方案。
[0005] 本发明的第一方面，提供了一种CCL28基因或CCL28蛋白或其检测试剂的用途，用于制备检测胃癌的试剂或试剂盒，所述的胃癌是Wnt/β-catenin信号通路与趋化因子CCL28相关分子表达同时异常上调型的胃癌。
[0006] 在另一优选例中，所述的胃癌的病理表现具有选自下组的一个或多个病理表现：
[0007] (1)胃部组织中Wnt/β-catenin信号通路相关表达上调；
[0008] (2)胃部组织中趋化因子CCL28相关表达上调；
[0009] (3)胃部肿瘤；
[0010] (4)胃壁细胞丢失；及
[0011] (5)胃部组织调节T(Treg)细胞增多。
[0013] 在另一优选例中，所述胃癌包括原位胃癌、肠型胃癌以及弥散性胃癌。
[0014] 在另一优选例中，所述胃癌包括幽门螺杆菌阴性的胃癌。
[0015] 在另一优选例中，所述的胃部组织包括胃癌肿瘤组织、胃部癌旁组织、或其组合。
[0016] 在另一优选例中，所述的Wnt/β-catenin信号通路相关表达选自下组：转录因子TCF1的表达水平、转录因子TCF4的表达水平、β-catenin的含量、β-catenin 核异位水平、β-catenin/TCF4复合物的转录活性、GSK3β磷酸化水平或其组合。
[0017] 在另一优选例中，所述的趋化因子CCL28相关分子包括：CCL28基因(包括基因组的核苷酸序列、cDNA序列、和/或mRNA)、CCL28受体的基因包括基因组的核苷酸序列、cDNA序列、和/或mRNA)、CCL28蛋白、CCL28受体蛋白、或其组合。
[0018] 在另一优选例中，所述的CCL28的受体包括CCR3、和/或CCR10。
[0020] 在另一优选例中，所述的试剂包括CCL28相关分子的特异性引物、特异性抗体、探针和/或芯片。
[0021] 在另一优选例中，上述的试剂包括：检测用芯片，例如核酸芯片和蛋白质芯片。
[0022] 在另一优选例中，所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针，所述的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针包括与CCL28相关基因或mRNA特异性结合的探针。
[0023] 在另一优选例中，所述的蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体，所述的癌症相关蛋白的特异性抗体包括抗CCL28相关蛋白的特异性抗体。
[0024] 在另一优选例中，所述的CCL28相关蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0025] 在另一优选例中，在所述试剂或试剂盒中，包括：作为标准品的CCL28基因(或核酸分子)或CCL28蛋白。
[0026] 在另一优选例中，所述的CCL28基因(或核酸分子)或CCL28蛋白包括野生型和/或突变型。
[0027] 在另一优选例中，在所述试剂或试剂盒中，还包括：用于检测CCL28基因或CCL28蛋白的检测试剂。
[0028] 本发明的第二方面，提供了一种用于检测胃癌的试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测CCL28相关蛋白或mRNA的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测胃癌。
[0029] 在另一优选例中，所述的胃癌是Wnt/β-catenin信号通路与趋化因子CCL28 相关分子表达同时异常上调型的胃癌。
[0030] 在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明内容，选自下组：
[0031] a)当检测对象的CCL28相关蛋白的mRNA表达量A1与癌旁组织的CCL28 相关蛋白的mRNA表达量A0之比(A1/A0)≥2，则提示该检测对象患胃癌的几率高于普通人群；
[0032] b)当检测对象的CCL28相关蛋白的mRNA表达量与癌旁组织的CCL28相关蛋白的mRNA表达量之比A1/A0≥2，如果该A1/A0比值越高，则提示所述检测对象患胃癌的恶性程度更高；和
[0033] c)当检测对象的CCL28相关蛋白的mRNA表达量与癌旁组织的CCL28 相关蛋白的mRNA表达量之比A1/A0≥2，如果该A1/A0比值越高，则提示所述检测对象患胃癌的预后更差、转移率更高。
[0034] 在另一优选例中，所述的检测试剂包括：特异性引物、特异性抗体、探针和/或芯片。
[0035] 在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测离体的人肿瘤组织样品或血液样品。
[0036] 在另一优选例中，所述的肿瘤组织样品为胃癌样品。
[0037] 本发明的第三方面，提供了一种CCL28抑制剂的用途，用于制备抑制癌细胞生长或增殖的药物组合物，或用于制备治疗胃癌的药物组合物；所述的胃癌是 Wnt/β-catenin信号通路与趋化因子CCL28相关分子表达同时异常上调型的胃癌。
[0038] 在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：靶向CCL28和/或其受体蛋白的抗体或小分子抑制剂；靶向CCL28和/或其受体基因的靶向核酸分子或基因编辑器；或其组合。
[0039] 在另一优选例中，所述的CCL28的受体包括CCR3、和/或CCR10。
[0040] 在另一优选例中，所述抗体选自下组：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、抗体偶联物、小分子抗体、抗体融合蛋白，及其组合。
[0041] 在另一优选例中，所述小分子抗体选自下组：单链抗体ScFv，Fab抗体， Fv片段，及其组合。
[0042] 在另一优选例中，所述ScFv抗体包括在治疗细胞中表达(包括过表达)的分泌型单链抗体。
[0043] 在另一优选例中，所述治疗细胞包括间充质干细胞、CAR-T细胞。
[0046] 在另一优选例中，所述药物组合物还包括其他Wnt/β-catenin信号通路抑制剂。
[0047] 在另一优选例中，所述药物组合物可以协同抑制肿瘤组织中的异常的 Wnt/β-catenin信号通路激活。
[0048] 在另一优选例中，所述药物组合物能够抑制调节T(Treg)细胞浸润肿瘤组织，同时提高外周免疫的活性。
[0049] 本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性的抑制癌细胞生长或增殖的方法，包括步骤：在CCL28抑制剂存在下，培养癌细胞，从而抑制癌细胞生长或增殖。
[0050] 在另一优选例中，所述的方法包括向癌细胞的培养体系中添加CCL28相关分子抑制剂，从而抑制癌细胞生长或增殖。
[0051] 在另一优选例中，所述的癌细胞是胃癌细胞。
[0052] 在另一优选例中，所述的胃癌细胞选自：AGS细胞系、SC7901细胞系、AZ-521细胞系、原代胃癌细胞、或其组合。
[0053] 本发明的第五方面，提供了一种筛选治疗癌症的候选化合物的方法，包括步骤：
[0054] (a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中CCL28相关分子的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中CCL28相关分子的表达量和/或活性；
[0055] 其中，如果测试组中细胞的CCL28相关分子的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对CCL28相关分子的表达和/或活性有抑制作用的治疗癌症的候选化合物。
[0056] 在另一优选例中，所述的细胞包括：癌细胞或正常细胞；
[0057] 在另一优选例中，所述的细胞为胃癌细胞或胃细胞。
[0058] 在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
[0059] (b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对癌细胞生长或增殖的抑制作用。
[0060] 在另一优选例中，所述步骤(b)中包括步骤：测试组中，癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察癌细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察癌细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗癌症的候选化合物。
[0061] 本发明的第六方面，提供了一种抑制或治疗胃癌的方法，包括步骤：给需要治疗的对象(哺乳动物)施用安全有效量的CCL28相关分子抑制剂的用途；所述的胃癌是Wnt/β-catenin信号通路与趋化因子CCL28相关分子表达同时异常上调型的胃癌。
[0063] 图1显示了β-catenin信号通路在胃癌中诱导CCL28表达。图中A为，过表达β-catenin的胃癌细胞系SGC7901趋化因子qPCR检测。图中B为，过表达或敲低β-catenin的胃癌细胞系SGC7901和AGS中β-catenin，CCL28蛋白水平检测。图中 C,D为，胃癌病人组织芯片中β-catenin，CCL28免疫组化检测，并阳性率相关性分析结果。
[0064] 图2显示了CCL28是β-catenin信号通路直接转录调控靶基因。图中A为， CCL28基因启动子中β-catenin/TCF转录因子复合体结合位点示意图。图中B为，染色质免疫沉淀实验证明了β-catenin结合在CCL28基因启动子中的预测位点1 和3上。图中C为，过表达β-catenin上调了CCL28启动子活性，将结合位点1和3 的核心序列突变(CCL28.mut)使β-catenin的调控作用丧失。图中D为，过表达β-catenin上调了Wnt通路报告基因TOPflash以及CCL28启动子活性。Wnt抑制剂 iCRT14处理使两个报告基因的活性降低。图中E为，利用RNA干扰，与对照 shRNA序列shScr相比，靶向Wnt通路转录因子TCF/LEF家族成员TCF1(shTCF1)和TCF4(shTCF4)的shRNA敲低其表达之后，CCL28启动子活性降低，而敲低 LEF1的表达(shLEF1)对CCL28启动子活性无影响。图F为，过表达转录因子TCF1 和TCF4上调CCL28启动子活性，过表达LEF1对CCL28启动子活性无影响。说明转录因子TCF和TCF4协同β-catenin调控CCL28的表达。
[0065] 图3显示了Wnt通路抑制剂iCRT14降低小鼠胃癌中CCL28的表达。在 H.felis/MNU诱导的小鼠原位胃癌模型中，Wnt通路抑制剂iCRT14处理的小鼠胃部CCL28蛋白的表达通过免疫印迹法(A)和ELISA(B)检测发现有显著降低。图中，vehicle表示药物溶剂(介质)。
[0066] 图4显示了CCL28的表达与胃癌的发展相关。图中A为，Oncomine数据库分析发现肠型(Intestinal Type)和弥散型(Diffuse Type)胃癌中CCL28 mRNA 的表达均高于正常组织。图中B为，胃癌病人组织的免疫组化分析表明在恶化程度更高的II和III级胃癌中CCL28的蛋白表达水平比I级更高。*P<0.05；*** P<0.001。
[0067] 图5显示了β-catenin信号通路激活的胃癌细胞诱导CCL28表达来实现调节T细胞的迁移。图中A为，SGC7901细胞系同时过表达β-catenin(Vector)和敲低CCL28(shScr)条件下β-catenin和CCL28的免疫蛋白印迹分析。图中B为，调节T细胞(Tregs)，CD4+T细胞，CD8+T细胞流式图。图中C,D为，调节T 细胞(Tregs)，CD4+T细胞，CD8+T细胞比例及绝对数量统计结果。*P<0.05；** P<0.01。
[0068] 图6显示了CCL28抗体治疗抑制H.felis/MNU诱导的小鼠原位胃癌进展。图中A为，CCL28抗体治疗模式图。图中B为，CCL28抗体治疗胃解剖图及肿瘤面积统计。*P<0.05。图中C为，CCL28抗体治疗HE染色，阿尔辛兰染色及H+K+ATPase免疫组化染色。图中D为，胃体(Corpus)和胃窦(Antrum)部位病理统计结果。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
[0069] 图7显示了CCL28抗体治疗缓解免疫微环境的抑制性。图中A为，调节T 细胞(Tregs)流式分析图和统计图。图中B为，IFNγ+CD4+T细胞流式分析图和统计图。图中C为，+ +IFNγCD8T细胞流式分析图和统计图。*P<0.05；*** P<0.001。
[0070] 图8显示了CCL28抗体阻断在黑色素瘤与乳腺癌移植瘤模型中无显著的治疗效果。图中A为，黑色素瘤B16皮下移植瘤的生长曲线。图中B为，乳腺癌4T1皮下移植瘤的生长曲线。图中C为，黑色素瘤B16荷瘤小鼠的生存率。图中D为，乳腺癌4T1荷瘤小鼠的生存率。
[0071] 图9显示了CCL28蛋白在人类各组织中的表达水平。在The Human Protein Atlas数据库中发现CCL28蛋白在脑部、胃肠道、和胰腺有较高表达。
具体实施方式
[0072] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现Wnt/β-catenin在胃癌细胞中上调CCL28的表达继而使肿瘤中的调节T细胞增多。利用阻断CCL28趋化通路的方法，可非常有效地减少了肿瘤中调节T细胞的浸润并抑制了肿瘤的发展。进一步研究发现，这种治疗效果仅针对胃癌模型，对于其他实体瘤如黑色素瘤和乳腺癌并无明显效果。
[0073] 在此基础上，发明人完成了本发明。
[0074] 术语说明
[0075] 除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0076] 如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0077] 如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
[0078] 趋化因子与CCL28
[0079] 趋化因子是一类调节细胞迁移的细胞因子，在肿瘤微免疫环境的构成以及肿瘤的发生发展中起到了至关重要的作用。
[0080] C-C基序趋化因子配体28(C-C motif chemokine ligand 28，CCL28)，位于 5p12，编码8个外显子。CCL28是一种趋化因子，介导了表达其受体CCR3或 CCR10的细胞的迁移。CCL28在消化道、肺、乳腺等组织上皮细胞中表达(如图9所示)。
[0082] Wnt/β-catenin通路
[0083] 在细胞中，胞浆中的β-catenin水平受APC、Axin和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)组成的多蛋白破坏复合物严格控制。多蛋白破坏复合物能磷酸化β-catenin，进一步诱导其泛素化和蛋白酶体介导的降解。Wnts通路刺激则会抑制破坏复合物的活性，打破胞浆β-catenin稳定，胞浆β-catenin易位至细胞核与 LEF/TCF家族一起激活转录，这种β-catenin转录靶点的激活程序就是连环蛋白反应转录效应(catenin responsive transcription，CRT)，是细胞对特定Wnt刺激反应性的一个关键方面。
[0084] 大部分(如果不是全部)Wnt相关的致癌作用是由CRT错误调控导致的，因此靶向β-catenin-TCF/LEF复合物成为理想的治疗靶点。Wnt/β-catenin通路是肠癌、胃癌等类型癌症中最常见的致癌基因通路之一，在癌症的发生发展中起着重要的作用，也是癌症治疗中备受关注的靶点之一。在经典Wnt信号通路中，CTNNB1和APC是其中常见的显著突变的基因。以胃癌为例，约70％的胃癌病人都伴有Wnt/β-catenin信号通路的突变。除了基因突变，许多Wnt信号通路组分的改变可能通过上调正调节因子或下调负调节因子来实现，并最终导致经典Wnt通路的激活。有研究表明幽门螺旋杆菌感染可以导致胃上皮细胞中 Wnt/β-catenin信号通路的激活。总之，这些发现表明了Wnt/β-catenin信号通路在癌症发病机制中的关键作用。
[0085] Wnt/β-catenin信号通路异常在大多数癌症类型中都有发现，是肿瘤发生发展中一个非常重要的癌基因通路。通过对多种肿瘤样品的分析，β-catenin的表达增加与肿瘤中淋巴细胞的浸润具有负相关性，提示Wnt/β-catenin也会导致肿瘤的免疫逃避已经对免疫治疗的耐受性。
[0086] 本发明首次证明了在胃癌病理进程中，β-catenin和转录因子TCF/LEF复合体通过与CCL28启动子区域结合，从而上调胃癌中CCL28的表达，这种 Wnt/β-catenin-CCL28通路在胃癌病理进程中表达上调是独特的。在本发明的一个实施例中，使用相同的处理方式和剂量，CCL28抗体能显著缓解胃癌的进展，但对于其他实体瘤如黑色素瘤和乳腺瘤并无类似效果。
[0087] Wnt/β-catenin信号通路抑制剂iCRT14
[0088] 在本文中，使用的Wnt/β-catenin信号通路抑制剂为iCRT14。iCRT14是一种连环蛋白反应转录抑制剂。
[0089] 在最初的研究中(An RNAi-based chemical genetic screen identifies three small-molecule inhibitors of the Wnt/wingless signaling pathway.Gonsalves et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011；108:595),实验初筛鉴定出34个对dTF12-荧光素酶报告基因活性有统计学显著抑制作用的分子(总命中率约0.3％)，称这些化合物称为CRT抑制剂(iCRT)。
[0090] iCRT14属于噻唑烷二酮类的β-连环蛋白反应性转录抑制剂，是一种 Wnt/β-catenin通路抑制剂。经验分子式(希尔表示法)C21H17N3O2S。它是连环蛋白β-catenin和转录因子TCF/LEF复合体的有效抑制剂。它可以剂量依赖性方式破坏β-连环蛋白-TCF/LEF的相互作用，并在结肠肿瘤细胞系中引起G0/G1的停滞，从而导致结肠癌细胞中细胞增殖和肿瘤生长减少的持续减弱。
[0091] 而本发明首次发现，在胃癌中，调控因子TCF1和TCF4非LEF1协同β-catenin 调控CCL28基因的转录。
[0092] S33Y.β-catenin
[0093] 本发明中，使用向胃癌细胞中转入S33Y.β-catenin质粒，以抑制β-catenin磷酸化，从而实现过表达β-catenin的目的。
[0094] 所述的S33Y.β-catenin的DNA质粒是指携带将β-catenin氨基酸序列第33位的丝氨酸(S33)突变为酪氨酸(Y)的片段的DNA质粒。S33是GSK3β的磷酸化位点，此位点磷酸化之后β-catenin进入降解途径。将S33突变为酪氨酸(Y)之后的突变体S33Y.β-catenin能逃脱磷酸化和降解途径，继而在细胞内更高效地富集。此突变也在一些胃肠道肿瘤病人的样品中检测到。本发明用以研究 Wnt/β-catenin通路异常激活在肿瘤细胞中的作用。
[0095] H.felis/MNU诱导胃癌模型
[0096] 幽门螺杆菌被认为是慢性胃炎的主要病因之一。因此用幽门螺旋杆菌建立胃癌小鼠模型对研究人类胃癌发生发展有十分重要的意义。C57BL/6小鼠对各种幽门螺杆菌菌株在胃部的定植具有显著的抵抗性。因此，使用H.felis(幽门螺杆菌的近亲)来建立胃癌小鼠模型就十分重要了。这种菌株是从猫的胃中分离出来的，并且很容易在小鼠的胃中定植。其可诱发小鼠严重的胃炎和萎缩。felis 感染的小鼠表现为胃的SPEM、异型增生和浸润性肿瘤，且观察期较长。该模型可在胃体沿胃小弯的鳞柱状交界处(SCJ)观察到广泛的异型增生病变，并发生大的息肉状胃窦肿瘤。
[0097] 通过对螺杆菌感染的小鼠模型的研究，研究人员确定了胃癌发生中其他辅助因子的影响，如性别、饮食和合并感染。幽门螺杆菌感染前使用N-甲基-N- 亚硝基脲(MNU)，可诱发更严重的癌前病变并增加胃癌发病率。MNU在小鼠模型中诱导胃癌发生的作用十分重要，通过每周两次胃内给药(0.5mg MNU)可导致大多数Balb/c小鼠因前胃鳞癌而死亡。MNU使用前手术切除前胃有助于促进腺胃高分化腺癌的发生，使用40周后发生率为100％。因此，胃腺体对 MNU的致癌作用十分敏感。240ppm MNU溶解于饮用水中，连续5周(每隔一周)给药，在6个品系的小鼠实验中的结果显示，该方法可诱发胃癌。因此，本方案使用H.felis感染和MNU给药结合的方法建立小鼠胃癌模型。
[0098] 免疫逃避
[0099] 免疫逃避已被公认为癌症的新标志。了解肿瘤免疫微环境对于发现新的治疗靶点以及预测和免疫治疗反应至关重要。正常的免疫系统会扼制肿瘤的发生发展。随着癌症的进程，肿瘤会产生许多免疫逃避机制，导致肿瘤生长的加强。
[0100] 小鼠模型和肿瘤病人样本的数据表明，髓样抑制细胞(MDSCs)和M2型巨噬细胞参与胃癌的免疫抑制。调节性T(Treg)细胞是一类免疫抑制型细胞，其在多种癌症类型中被发现参与加速肿瘤进展的过程。调节T细胞(Treg)是一类参与到肿瘤的免疫逃避中的重要免疫抑制型细胞。它的增多会导致抗肿瘤的效应免疫细胞的功能和数量降低，同时也会导致肿瘤的免疫治疗或其他疗法的功效的减弱甚至丧失。
[0101] 本发明的一个优选实施例中，使用CCL28抗体能有效抑制靶向调节T细胞向肿瘤的迁移过程，而不影响调节T细胞的凋亡。同时，仅靶向胃癌肿瘤组织和脾脏中的Treg细胞，而不会降低血液中的Treg细胞的比率，还可以提高整体的免疫反应。
[0102] 本发明的技术方案具有如下优点：
[0103] 1.本发明提供了一种通过抑制CCL28，治疗Wnt/β-catenin信号通路-CCL28 同时异常升高型的胃癌。应用本发明提供的CCL28抗体治疗能使肿瘤面积显著减少、在发育异常和肠型转化方面的明显变化、明显被缓解正常细胞丢失的现象。
[0104] 2.本发明发现β-catenin/CCL28与胃癌的发生和恶化具有正相关性，因而提供了一种用于胃癌的诊断、筛查与预后的判断的检测方法，能够筛查群体中的胃癌发病率和精准察觉胃癌的转移情况。
[0105] 3.本发明抑制β-catenin/CCL28其效果仅靶向胃癌肿瘤组织和脾脏中的 Treg细胞，而不会降低血液中的Treg细胞的比率，可以提高整体的免疫反应。
[0106] 4.本发明阻断CCL28趋化通路治疗恶性胃癌的方法，靶向调节T细胞向肿瘤的迁移过程，而不影响调节T细胞的凋亡，可能为靶向调节T细胞的免疫疗法提供更为新颖有效的手段。
[0107] 5.本发明提供了一种通过抑制CCL28，从而抑制肿瘤细胞中Wnt/β-catenin 信号通路的治疗思路。
[0108] 6.本发明发现Wnt/β-catenin信号通路-CCL28同时异常升高型的胃癌是一种与其他肿瘤，甚至实体瘤发展显著不同的疾病表型，主要体现在阻断CCL28 趋化通路能有效抑制恶性胃癌发展，但对于其他肿瘤模型的效果并不明确，尤其是对于黑色素瘤细胞B16和乳腺癌细胞4T1模型无效。
[0109] 下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0110] 通用实验方法
[0111] 1.细胞培养
[0112] 人类胃癌细胞系AGS和SC7901培养在含10％血清(Gbico)和1％青霉素/链霉素双抗(Life Technologies)的RPMI 1640(Life Technologies)培养基中。
[0113] 2.RNA纯化和定量PCR
[0114] 细胞系和小鼠胃组织中的总RNA使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)抽提，随后用PrimeScript RT Reagent Kit(Takara)进行反转录合成cDNA。QPCR使用SYBR Green PCR Master Mix kit(Takara)和ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems)来进行。定量计算使用ΔΔCt的方法。
[0115] 3.免疫蛋白印记
[0116] 胃癌细胞系和小鼠胃组织中的蛋白用加有蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA裂解液(Thermo Scientific)裂解，蛋白浓度用BCA Protein Assay Reagent(Thermo Scientific)检测。检测蛋白如下：β-catenin(Abcam),CCL28(R&D Systems),active β-catenin(Merck),GAPDH(Abcam)andβ-tubulin(Abcam)。
[0117] 4.荧光色酶报告基因活性检测
[0118] Wnt/β-catenin报告质粒M50 Super 8X TOPFlash(Addgene质粒#12456)和突变体对照M51 Super 8X FOPFlash(Addgene质粒#12457)是来自Randall Moon 的馈赠。将人类CCL28基因的启动子(2.8kb,相对于转录起始位点为-2576/+205)克隆到萤火虫荧光素酶报告基因构建体pGL4中。使用Hieff Mut TM多位点定向诱变试剂盒(Yeasen，Shanghai)引入CCL28启动子上潜在TCF/LEF结合位点的突变以产生突变CCL28启动子报道构建体(pGL4-CCL28.mut)。使用jetPRIME转染试剂(Polybus Transfection)转染质粒。通过与含有海肾荧光素酶基因的 pRL-CMV报告基因共转染来标准化转染效率。使用Dual-Glo荧光素酶测定系统(Promega)测量萤火虫和海肾荧光素酶活性。
[0119] 5.染色质免疫沉淀ChIP
[0120] SGC7901细胞利用1％的甲醛溶液固定15分钟，之后加入0.125M的甘氨酸溶液终止反应。利用PBS洗去反应液，然后加入Farnham裂解液收集细胞。离心收集细胞团，将细胞重悬浮到RIPA裂解液中，利用超声仪使细胞中的DNA断裂。将DNA片段与事先耦连好的抗体和Dynabeads(购自ThermoFisher)复合物在4度旋转孵育过夜。抗体为抗β-catenin和对照IgG(Abcam)。利用磁石将DNA-蛋白- 抗体-Dynabeads复合物沉淀下来，最终用缓冲液将DNA片段洗脱下来。针对 CCL28启动子上面3个不同的β-catenin潜在结合位点设计了引物进行定量PCR，来检查样品中三处位点DNA片段的含量。相对富集的计算方法为β-catenin相对于对照IgG在潜在DNA结合位点上的相对结合。
[0121] 6.人外周血单核细胞分离和迁移实验
[0122] 使用Ficoll-Paque Plus(购自GE Healthcare)梯度离心分离新鲜外周血，随后用PBS重悬成单个细胞并使用血球计数皿计数。
[0123] SGC7901胃癌细胞系培养液上清铺在8-μm-pore transwell chambers(购自 Corning)的下层，小室中铺2百万个重悬在含1％血清的PBS中的外周血单核细胞。37℃培养箱中放置6小时，收集迁移到下层的PBMC并用流式检测调节T细胞，CD4+和CD8+T细胞，使用到的抗体如下：CD3[SK7](购自eBioscience),CD4 [RPA-T4](购自eBioscience),CD8a[OKT8](购自eBioscience),CD25[BC96](购自BioLegend)和FOXP3[206D](购自BioLegend)。
[0124] 7.原位胃癌小鼠模型和治疗方案
[0125] 为了建立Helicobacter felis(H.felis)和N-Methyl-N-nitrosourea(MNU)诱导的胃癌小鼠模型，8周龄大的野生型小鼠通过灌胃的方式给H.felis菌种(ATCC 49179)，一周三次，随后隔周给含有240ppm MNU的食用水，共计12周。
[0126] 抗体治疗方案：腹腔注射50mg/kg CCL28单克隆抗体(购自R&D Systems)，对照组使用此抗体的同型对照IgG抗体，具体时间参照图4A。
[0127] 8.流式分析
[0128] 为了检测外周血、脾脏和胃组织中的免疫细胞，脾脏和胃使用组织匀浆器 gentleMACS Octo dissociator(购自Miltenyi Biotec)来进行细胞分离。胃组织用1 mg/ml胶原酶IV(购自Thermo Fisher)and 50μg/ml(20U/ml)DNA酶I(stock: 5mg/ml)(购自Sigma-Aldrich)进行分解，组织中的红细胞使用红细胞裂解液(购自eBioscience)去除。流式检测中使用的抗体购自BioLegend或eBioscience公司。对于胞内抗原检测，需用细胞激活剂(购自BioLegend)刺激6小时。胞间抗原染色使用Cyto-FastTMFix/Perm Buffer Set(购自BioLegend)。核蛋白使用 Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set(购自BD Biosciences)处理。流式数据由FACS Aria II cytometer(购自BD Biosciences)和FlowJo软件处理。
[0129] 9.免疫组化
[0130] 胃癌病人的组织石蜡切片购自Alenabio公司。小鼠胃组织包埋于石蜡中并切成5微米的组织切片，脱蜡，抗原修复，封闭之后用如下抗体β-catenin(购自Abcam),H+K+ATPaseβ(ATP4B)(购自Abcam),FOXP3(购自Abcam),CCL28 (购自R&D Systems)一抗四度过夜，第二天二抗孵育，并使用DAB Peroxidase Substrate Kit(购自Gene Tech,上海)显色，最后用苏木素染核并复水封片。β-catenin和CCL28的定量使用ImageJ软件进行灰度分析统计。
[0131] 10.B16黑色素瘤和4T1乳腺癌皮下移植瘤模型
[0132] 取对数生长期的B16或4T1细胞，PBS调整细胞浓度为3X106个/毫升。取6 周龄大的WT雌鼠，眼科剪剪去小鼠右后肢外侧鼠毛，并用75％酒精消毒，每只小鼠皮下注射0.1毫升细胞悬液。随后观察到肿瘤出现5mm直径的肿瘤时，记为时间起点，游标卡尺测量并计算肿瘤大小。
[0133] 11.统计分析
[0134] 数据表示为平均值±SD。组间的统计学显著性通过双尾非配对Student t检验(GraphPad Prism)计算。P<0.05被认为具有统计学意义。
[0135] 实施例1.β-catenin信号通路在胃癌中诱导CCL28表达
[0136] 在本实施例中，检测胃癌细胞系中的Wnt/β-catenin信号通路对趋化因子表达的影响。方法如下：1)在胃癌细胞SGC7901中过表达β-catenin，并使用质粒载体表达GSK3β磷酸化位点突变的突变型β-catenin(即S33Y.β-catenin)，从而实现了β-catenin的持续激活，随后用qPCR检测趋化因子表达的变化；2)分别在人类胃癌细胞系AGS、SGC7901中，通过敲低或者过表达β-catenin，用WB在蛋白水平来检测CCL28表达水平的变化；3)在临床胃癌组织样本中通过免疫组化染色后，β-catenin和CCL28阳性率的统计分析，验证β-catenin与CCL28的相关性。
[0137] 结果:
[0138] qPCR结果表明，相较于对照质粒，过表达β-catenin后，变化最为明显的趋化因子是CCL28(图1A)。
[0139] 在SGC7901和AGS人类胃癌细胞系(源自中国科学院细胞库)中，野生型(WT)或抵御降解的突变体S33Y.β-catenin的过表达也增加了CCL28蛋白水平(图1B)。相反，这两种细胞系中β-catenin的敲低则导致CCL28蛋白水平降低(图1B)。
[0140] 实施例2.在人胃癌细胞中CCL28是β-catenin信号通路的直接靶基因[0141] 在本实施例中，结合生物信息学分析CCL28与β-catenin信号通路结构相关性，然后在细胞模型中验证两者的关系。方法如下：利用生物信息学在CCL28 的启动子区域找到3个β-catenin/TCF转录复合体的潜在结合位点，利用染色质免疫沉淀技术分析β-catenin是否在潜在的结合位点上富集，将CCL28启动子和突变了潜在结合位点序列的CCL28启动子序列克隆到荧光素酶报告载体中来检查 CCL28启动子的转录活性。利用β-catenin/TCF，shRNA敲低TCF/LEF转录因子家族成员或过表达TCF/LEF成员之后检测CCL28启动子的转录活性。
[0142] 结果：
[0143] 生物信息学分析发现了在CCL28基因的启动子区域有三个潜在的β-catenin/TCF转录复合体的结合区域(图2A)。
[0144] 在人的胃癌细胞SGC7901中，利用染色质免疫沉淀分析发现β-catenin结合在启动子位点1和3上(图2B)。
[0145] 对着两个结合位点序列进行突变之后，β-catenin对CCL28启动子活性的上调作用消失(图2C)，这说明：β-catenin是通过在CCL28的启动子上结合位点来直接调控CCL28基因的转录。
[0146] 利用Wnt信号通路抑制剂iCRT14同样降低了β-catenin对CCL28启动子活性的上调作用(图2D)。Wnt信号通路抑制剂iCRT14处理阻碍细胞中了β-catenin和 TCF的结合以及β-catenin/TCF转录复合体在启动子DNA上的结合，从而抑制了 Wnt信号通路，CCL28作为Wnt信号通路的靶基因，其转录活性也被抑制掉了。通过shRNA敲低或者基因过表达之后检测CCL28启动子活性，发现了转录因子 TCF1和TCF4协同β-catenin调控CCL28基因的转录，而非LEF1。
[0147] 实施例3.Wnt信号通路抑制剂iCRT14抑制小鼠原位胃癌中CCL28的表达[0148] 在本实施例中，利用螺旋杆菌H.felis感染和致癌剂MNU诱导原位发生的小鼠胃癌，再通过腹腔注射Wnt信号通路抑制剂iCRT14，检测胃部的CCL28蛋白表达水平。
[0149] 结果如图3所示。蛋白免疫印迹法(图3A)和ELISA(图3B)分析均表明， iCRT14使胃部的CCL28蛋白表达显著降低，说明在体内CCL28表达也受β-catenin通路的调控。
[0150] 实施例4.CCL28与胃癌的发展程度相关
[0151] 在本实施例中，免疫组织化学分析进一步分析CCL28与β-catenin表达水平的相关性。结果表明，在不同程度的胃癌样品中，β-catenin表达水平与CCL28 表达水平存在着显著正相关性(图1C和1D)。
[0152] 基于Oncomine数据库，进一步对CCL28与胃癌发展程度的进行分析。结果表明，在肠型以及弥散型胃癌中CCL28的mRNA水平都比正常组织高(图4A)。胃癌病人组织样品的免疫组化染色也表明，在恶性等级更高中的肿瘤中CCL28 的蛋白水平也更高(图4B)。
[0153] 总之，这些结果表明CCL28是胃癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的靶基因，这提示CCL28是胃癌中的潜在致病因子。此外，随着胃癌发展或恶性等级增加， CCL28的阳性率更高。
[0154] 实施例5.β-catenin信号通路激活的胃癌细胞诱导CCL28表达来实现调节T 细胞的迁移
[0155] 在本实施例中，通过体外迁移实验检测了Wnt/β-catenin激活的肿瘤细胞是否能够通过CCL28募集人Treg细胞。方法如下：构建在胃癌细胞系SGC7901中过表达β-catenin，或过表达β-catenin同时利用shRNA敲低CCL28的胃癌细胞系，收集细胞培养液上清，铺在transwell下层，上层小室中铺1X106个外周血单核细胞，37℃培养箱中培养4小时后，收集迁移至下层的细胞，并通过流式细胞术分析其免疫细胞的比例和数量。
[0156] 结果：
[0157] 在SGC7901细胞中通过shRNA敲低S33Y.β-catenin诱导的CCL28(图5A)。
[0158] 在迁移实验中，迁移到下层的外周血单核细胞用流式的方法分析其中免疫细胞变化(图5B)。
[0159] 在胃癌细胞系SGC7901过表达β-catenin的条件下，调节T细胞无论在CD4+ T细胞中的比例还是绝对数量都明显增加，敲低β-catenin则减少(图5C,D)。这些结果提示β-catenin激活的胃肿瘤细胞在体外通过CCL28募集Treg细胞。
[0160] 流式结果未显示总CD4+或CD8+T细胞募集的任何差异(图5C,D)，提示了β-catenin/CCL28对Treg的独特作用。
[0161] 实施例6.CCL28抗体治疗抑制H.felis/MNU诱导的胃癌进展
[0162] 在本实施例中，采用H.felis/MNU胃癌模型动物，在MNU处理开始后第 29周(图中指示为28周结束，29周开始)，每周一次给予模型小鼠CCL28单克隆抗体以阻断CCL28活性，实验方案如图6A所示。
[0163] 结果：
[0164] 在用抗体处理8周后，CCL28抗体治疗组小鼠模型的胃中的肿瘤面积显著减少(图6B)。组织学分析显示CCL28抗体疗法在发育异常和肠型转化方面的明显变化(图6C)。在H+K+ATPase的免疫组化分析中看到，使用CCL28抗体治疗后，壁细胞丢失的现象在胃窦部位明显被缓解(图6D)。这提示，抑制CCL28 可有效缓解胃癌的进展
[0165] 实施例7.CCL28抗体治疗缓解免疫微环境的抑制性
[0166] 在本实施例中，对于实施例6中的用CCL28抗体进行治疗的模型动物，在第36周结束时，对小鼠胃肿瘤样本进行FACS分析。
[0167] 结果如图7所示。FACS分析证实CCL28抗体处理的小鼠胃中调节T(Treg)细胞显著减少(图7A)。有趣的是，抗CCL28治疗也降低了脾脏中Treg细胞的比率，但没有降低血液中的Treg细胞的比率，这表明在脾脏和胃中存在依赖于趋化因子CCL28的Treg募集机制。除了对于胃部的直接效用，CCL28抗体治疗在脾脏中的作用也可以提高整体的免疫反应，因为有效的免疫疗法需要外周的免疫激活和协调。总之，这些数据表明抗CCL28疗法通过抑制Treg的募集，有效地抑制了H.felis/MNU诱导的胃癌的进展。
[0168] 值得一提的是，通过检测IFNγ+的CD4+/CD8+T细胞(图7B,C)，结果表明，这些效应T细胞在脾脏或外周血中有一定程度的提高，但在胃部并没有明显变化，说明CCL28抗体治疗可以提高外周免疫的活性，但对于效应T细胞浸润到实体瘤的过程则收效甚微。
[0169] 实施例8.CCL28抗体对黑色素瘤和乳腺癌无明显治疗功效
[0170] 在本实施例中，验证CCL28抗体治疗对于其他癌症的治疗作用。方法如下：利用小鼠黑色素瘤细胞B16和乳腺癌细胞4T1建立皮下移植瘤：取对数生长期的细胞，胰酶消化后PBS重悬配用。将6-8周C57BL/6小鼠麻醉，剃毛器处理小鼠前肢腋下，并用75％酒精消毒裸露皮肤。取已调整好细胞密度的细胞悬液接种于小鼠前肢腋下，每天观察记录肿瘤生长情况。其中B16细胞5X105个/只,4T1 细胞1X106个/只。B16移植瘤小鼠和4T1移植瘤小鼠在细胞接种后第3-7天用 CCL28抗体处理，处理方式和剂量如实施例6相同。
[0171] 结果表明，用CCL28抗体或对照IgG抗体治疗之后，CCL28抗体在小鼠移植瘤的生长(图8A和B)以及生存率(图8C和D)上均没有展现出明显的治疗功效。
[0172] 总结与讨论
[0173] 本发明人发现了在胃癌细胞中，癌症中常见的致癌基因通路之一 Wnt/β-catenin与CCL28的表达的协同作用，而这种作用继而使肿瘤中的调节T 细胞增多。通过后续大量创造性的研究，本发明人意外地发现，在胃癌中，利用CCL28的单克隆阻断抗体能够有效地减少肿瘤中调节T细胞的浸润并抑制了肿瘤的发展。这些创造性的研究成果提示Wnt/β-catenin除了直接调控细胞增殖和存活之外的免疫调节机制，并提供新的免疫治疗靶点CCL28。
[0174] 更出乎意料的是，本发明通过对比实验证明，Wnt/β-catenin与CCL28的联动作用，是在特殊的病理情景—胃癌中独特地存在，而在其他肿瘤、甚至其他实体肿瘤如黑色素瘤细胞B16和乳腺癌细胞4T1模型中不存在的。
[0175] 另一方面，最近的研究提示调节T细胞的凋亡可能导致更高的免疫抑制性，直接靶向调节T细胞使其凋亡的免疫治疗方法可能无法实现最佳的治疗效果。但是，本发明通过建立起阻断CCL28趋化通路的方法，继而靶向调节T细胞向肿瘤的迁移过程，并不影响调节T细胞的凋亡，可能为靶向调节T细胞的免疫疗法提供更为新颖有效的手段。而且对于长期罹患胃癌和其他经受免疫治疗的患者而言，自身免疫力低下及其衍生疾病是致死的重要原因。因此，本发明提供的方法不但能有效抑制胃癌转移，同时不降低病人的自身免疫力，还会提高整体的免疫力。
[0176] 除此之外，本发明还首次通过大量的临床数据证实CCL28及其受体水平与胃癌的发生和严重程度的相关性，由此可以开发出精准洞察胃癌发生、转移和预后的检测体系。
[0177] 总的来看，CCL28阻断疗法在癌症治疗中具有极大的临床应用潜力，而且可能会提高其他免疫疗法的功效。
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