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合成多肽及其用途

阅读:1029发布:2020-07-15

专利汇可以提供合成多肽及其用途专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本揭示内容是关于新颖的合成多肽,以及其于制备微脂体的用途。依据本揭示内容的实施方式,该合成多肽包含一破膜模体、一遮蔽模体,以及一用以连接该破膜模体及该遮蔽模体的连接子。连接子可经光照、蛋白酶或去 磷酸 酶等引信讯号而裂解。一旦连接至微脂体, 接触 引信讯号会促使连接子产生裂解反应,使遮蔽模体与破膜模体分离,进而活化微脂体上破膜模体的破膜活性,破坏微脂体的完整结构,并将包覆于微脂体中的药剂释放至靶向 位置 。本揭示内容亦提供利用本 发明 微脂体来诊断或 治疗 一个体的 疾病 的方法。,下面是合成多肽及其用途专利的具体信息内容。

1.一种合成多肽,包含一破膜模体、一遮蔽模体,以及一用以连接该破膜模体及该遮蔽模体的连接子,其中,该破膜模体包含14-30个基酸残基,其中
该破膜模体的疏性氨基酸残基的数量为5-10;
该破膜模体的带正电荷的氨基酸残基的数量为4-10;
该破膜模体的带负电荷的氨基酸残基的数量等于或小于1;以及
当该氨基酸残基排列为各重复具有7个氨基酸残基的α螺旋体时,各重复具有一第一转折及一第二转折,且各重复是以下述标示的位置编号依序排列:①-⑤-②-⑥-③-⑦-④以形成该第一转折及一第二转折,其中位置1-4是位于第一转折,位置5-7是位于第二转折,且于该α螺旋体的各重复中相同位置编号形成一对应位,其中于该破膜模体中,包含一或多该带正电荷的氨基酸残基的对应位的数量为3或4,且至少二个该包含一或多该带正电荷的氨基酸残基的对应位是彼此相邻;
该遮蔽模体是一包含至少10个带负电荷的氨基酸残基的肽,或是一磷酸基;以及该连接子是光裂解型或蛋白酶裂解型结构部,或是一磷酸酯键;其中
当该遮蔽模体是该肽时,则该连接子是该光裂解型或该蛋白酶裂解型结构部;或是当该遮蔽模体是该磷酸基时,则该连接子是该磷酸酯键,其是形成于该磷酸基,以及该破膜模体的丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸任一残基之间,其中具有该磷酸基连接的丝氨酸、酪氨酸及/或苏氨酸的数量至少为2,且包含一或多该具有该磷酸基连接的丝氨酸、酪氨酸及/或苏氨酸残基的对应位与该包含一或多该带正电荷的氨基酸残基的对位置不同。
2.如权利要求1所述的合成多肽,其中
该疏水性氨基酸残基是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸;
该带负电荷的氨基酸残基是天冬氨酸或谷氨酸;以及
该带正电荷的氨基酸残基是赖氨酸、精氨酸或组氨酸。
3.如权利要求2所述的合成多肽,其中该破膜模体包含(X1)1-4(X2)1-13(X1)1-4的氨基酸序列,其中各X1个别是选自由赖氨酸、精氨酸及组氨酸残基所组成的群组;且各X2个别是选自由丝氨酸、苏氨酸、天冬酰氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天门冬氨酸及谷氨酸残基所组成的群组。
4.如权利要求3所述的合成多肽,其中各X2个别是选自由丝氨酸、苏氨酸、天冬酰氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸残基所组成的群组。
5.如权利要求4所述的合成多肽,其中该破膜模体包含SEQ ID NO:1-12的任一条氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的合成多肽,其中该遮蔽模体包含至少10个谷氨酸残基。
7.如权利要求6所述的合成多肽,其中该遮蔽模体是由12个谷氨酸残基所组成。
8.如权利要求1所述的合成多肽,其中该连接子具有式(I)或式(II)的结构:
9.如权利要求1所述的合成多肽,其中该连接子可为基质金属蛋白酶或细胞自溶酶所裂解。
10.如权利要求9所述的合成多肽,其中该连接子包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列。
11.如权利要求9所述的合成多肽,其中该连接子是一缬氨酸-瓜氨酸双肽残基。
12.一种微脂体,包含
一中心核,
一包覆该中心核的脂质层,以及
如权利要求1所述的合成多肽,其是与该脂质层连接。
13.如权利要求12所述的微脂体,其中该中心核包含一治疗药剂或一显影分子。
14.如权利要求13所述的微脂体,其中该治疗药剂是选自由抗肿瘤药剂、抗发炎药剂、抗生物药剂、抗化药剂、生长因子、神经传递分子及蛋白抑制剂所组成的群组。
15.如权利要求14所述的微脂体,其中该治疗药剂是该抗肿瘤药剂或该蛋白抑制剂。
16.如权利要求13所述的微脂体,其中该显影分子是一显影剂或一萤光分子。
17.一种如权利要求12所述的微脂体于制备一药物的用途,其中该药物可用以诊断或治疗一个体的疾病
18.如权利要求17所述的用途,其中该个体是一人类。

说明书全文

合成多肽及其用途

技术领域

[0001] 本揭示内容是关于治疗疾病。更具体来说,本揭示内容是关于合成多肽及其于制备用以治疗疾病的微脂体(liposome)的用途。

背景技术

[0002] 微脂体为包含至少一脂质双层的球形囊泡,据以包覆一性中心核;微脂体被视为化疗药物传递系统中,最重要的载体之一。相较于未包覆的药物,由微脂体包覆的药物可藉由增强渗透滞留效应(enhanced permeability retention(EPR)effect),于特定组织或器官产生较佳的生物分布。目前的微脂体主要是由饱和性脂质所组成,其会形成一稳定膜体以包覆治疗药物。该些微脂体遵守着非费克释放模式(non-Fick’s  release behaviour),即,无早期扩散释放,因此当微脂体的水性中心核装载高毒性药物(例如,化疗药物)时,可保护健康组织不受到药物伤害。然而,非费克释放特性是一把双面刃。虽然可用以保护健康组织,但其亦使微脂体包覆的药物具有较低的生物利用率。为了长时间存在于血液循环而设计的高稳定性,实际上阻碍了微脂体的释放,该设计使微脂体包覆的药物更安全之余,亦降低了其作用功效。一般来说,传统的微脂体虽然稳定,但却是以被动生物降解方式释出药物,且通常缓慢、不完全且不易控制。为克服此困境,相关领域需要一种反应快速且稳定的引信讯号反应型的微脂体,藉以改善微脂体的药物功效,并维持其既有的安全特性。智慧型微脂体可于特定位置接受引信讯号而快速放释包覆药物,避免缓慢且不完全的药物被动式泄漏,且较不会使生物体长期曝露于低剂量药物中,进而引发药物抗性。
[0003] 引信讯号释放特性是微脂体的临床应用研究重点之一。已有研究提出不同的引信讯号反应型微脂体,藉由接受引信讯号(举例来说,温度、pH、光照、酶、近红外光、超音波、化还原电位,以及磁场)来诱发微脂体释放出包覆物质。绝大多数引信讯号反应型微脂体是由百分比很高的非天然性合成脂质所组成,作为利于释放的调控开关。然而,使用非天然脂质来制备微脂体,往往引起转译医学的毒性问题。另一方面,基于生物相容性及有效生物膜活性,肽提供另一种用以制备具有引信讯号释放功效的微脂体的选择。不幸的是,即使过去数十年引发热烈的观注并投入相当程度的努,相关领域尚未利用肽基微脂体(peptidyl liposome)策略制备出令人满意的引信讯号释放型微脂体。到目前为止,相关领域仍无适用于固着在微脂体表面的引信讯号反应型破膜肽,其可接收光线或疾病相关酶讯号而产生反应,且不会过早释出包覆药物。
[0004] 有鉴于此,相关领域亟需一种经改良的引信讯号反应型微脂体,藉以更安全且准确的方式释放包覆的药物。发明内容
[0005] 发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要,以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述,且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。
[0006] 本揭示内容的一方面是关于一种合成多肽,其包含一破膜模体(membrane lytic motif)、一遮蔽模体(masking motif),以及一用以连接该破膜模体及该遮蔽模体的连接子(linker)。
[0007] 依据本揭示内容的实施方式,该破膜模体包含14-30个基酸残基,其中该破膜模体的疏水性氨基酸残基的数量为5-10;该破膜模体的带正电荷(positive-charged)的氨基酸残基的数量为4-10;且该破膜模体的带负电荷(negative-charged)的氨基酸残基的数量等于或小于1。当将氨基酸残基排列为具有复数个重复的α螺旋体时,每两个转折(turn)有7个氨基酸残基。基本上,各重复中的氨基酸残基是依据图1所标示的位置编号依序排列,其中将位于第一转折的氨基酸残基命名为位置1-4,且将位于第二转折的氨基酸残基称为位置5-7。于α螺旋体的各重复中相同位置编号形成一对应位。于破膜模体中,包含一或多个带正电荷的氨基酸残基的对应位的数量为3或4,且至少二个包含一或多个带正电荷的氨基酸残基的对应位是彼此相邻。
[0008] 遮蔽模体是一包含至少10个带负电荷的氨基酸残基的肽,或是一磷酸基(phosphoryl group)。连接子是一光裂解型(photocleavable)或蛋白酶裂解型(protease-cleavable)结构部(moiety),或是一磷酸酯键(phosphoester bond)。
[0009] 依据本揭示内容某些实施方式,遮蔽模体是肽,且连接子是光裂解型或蛋白酶裂解型结构部。光裂解型结构部可以具有式(I)或式(II)的结构:
[0010]
[0011] 蛋白酶裂解型结构部可以是一氨基酸序列,其可为基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)或细胞自溶酶(cathepsin)所裂解。在某些实施例中,连接子是一包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列的肽。在一特定实施例中,连接子是一缬氨酸-瓜氨酸(valine-citrulline,VC)双肽残基。
[0012] 依据本揭示内容某些实施方式,遮蔽模体是磷酸基。在该些实施方式中,连接子是磷酸酯键,其形成于该磷酸基,以及该破膜模体的丝氨酸(serine,S)、酪氨酸(tyrosine,Y)或苏氨酸(threonine,T)任一残基侧链之间,其中具有磷酸基连接的丝氨酸、酪氨酸及/或苏氨酸的数量至少为2,且包含一或多个该具有磷酸基连接的丝氨酸、酪氨酸及/或苏氨酸残基的对应位与包含一或多个该带正电荷的氨基酸残基的对应位不同。
[0013] 一般来说,该疏水性氨基酸残基是亮氨酸(leucine,L)、异亮氨酸(isoleucine,I)、缬氨酸(valine,V)、苯丙氨酸(phenylalanine,F)、色氨酸(tryptophan,W)或酪氨酸;该带负电荷的氨基酸残基是天冬氨酸(aspartate,D)或谷氨酸(glutamate,E);且该带正电荷的氨基酸残基是赖氨酸(lysine,K)、精氨酸(arginine,R)或组氨酸(histidine,H)。
[0014] 依据本揭示内容某些实施方式,破膜模体包含(X1)1-4(X2)1-13(X1)1-4的氨基酸序列,其中各X1个别是选自由赖氨酸、精氨酸及组氨酸残基所组成的群组;且各X2个别是选自由丝氨酸、苏氨酸、天冬酰氨酸(asparagine,N)、谷氨酰胺(glutamine,Q)、半胱氨酸(cysteine,C)、甘氨酸(glycine,G)、脯氨酸(proline,P)、丙氨酸(alanine,A)、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸(methionine,M)、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天门冬氨酸,以及谷氨酸残基所组成的群组。较佳地,各X2个别是选自由丝氨酸、苏氨酸、天冬酰氨、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸残基所组成的群组。
[0015] 在本揭示内容某些实施例中,破膜模体包含SEQ ID NO:1-12的任一条氨基酸序列。
[0016] 依据本揭示内容某些实施方式,本发明合成多肽的遮蔽模体包含至少10个带负电荷的氨基酸残基(即,天门冬氨酸及/或谷氨酸残基)。依据本揭示内容某些实施例,遮蔽模体包含至少10个谷氨酸残基。在一特定实施例中,遮蔽模体由12个谷氨酸残基所组成。
[0017] 本揭示内容的另一方面是关于本发明合成多肽于制备一微脂体的用途。结构上,该微脂体包含一中心核、一包覆该中心核的脂质层,以及一本揭示内容的合成多肽,其与该脂质层连接。
[0018] 中心核可以包含治疗药剂或显影分子。依据特定目的,该治疗药剂可以是一抗肿瘤药剂、一抗发炎药剂、一抗微生物药剂、一抗氧化药剂、一生长因子、一神经传递分子,或是一蛋白抑制剂。该显影分子可以是一显影剂或一萤光分子。
[0019] 本揭示内容亦提供用以诊断或治疗一个体的疾病的方法。用以诊断一疾病的方法包含对该个体投予一有效量的本发明微脂体,其中该微脂体的中心核包含显影分子。为达到治疗个体的疾病的目的,对该个体投予一有效量的本发明微脂体,其中该微脂体的中心核包含一治疗药剂,藉以减缓或改善与该疾病相关的病症。
[0020] 本发明方法适用对象个体是一哺乳动物;较佳地,是一人类。
[0021] 在参阅下文实施方式后,本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的,以及本发明所采用的技术手段与实施方面。
[0022] 附图的简单说明
[0023] 为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂,所附图式的说明如下:
[0024] 图1是依据本揭示内容一实施方式所绘示的螺旋轮状图(helical wheel diagram),其阐述于破膜模体的各螺旋重复中,氨基酸序列的排列方式。
[0025] 图2A到2G是依据本揭示内容另一实施方式所绘示的螺旋轮状图,其分别阐述本发明多肽的破膜模体的氨基酸排列,包含蛙皮素2(Magainin 2;图2A)、截断型蛙皮素2(图2B)、突变型蛙皮素2(图2C)、蜂毒肽(Melittin;图2D)、突变型蜂毒肽(图2E)、培西加南(Pexiganan;图2F),以及石斑鱼抗菌肽-1(Epinecidin-1,EP1;图2G)。
[0026] 图3A到3E是依据本揭示内容另一实施方式所绘示的螺旋轮状图,其分别阐述具有磷酸基遮蔽的破膜模体的氨基酸排列,其中该破膜模体包含蛙皮素2-3pY(图3A)、蛙皮素2-2pY(图3B)、蛙皮素2-2pS(图3C)、突变型蜂毒肽-2pY(图3D),以及EP1-2pY(图3E)。
[0027] 图4A到4D是依据本揭示内容实施例2.2所绘示的数据,其关于特定微脂体的释放特性。图4A:释放百分比与照射时间的点状图,结果指出3分钟的UV照射即可诱发有效的释放。图4B:微脂体的表面界达电位(zeta-potential)与照射时间的点状图,结果亦显示3分钟的UV照射即可光裂解移除引信讯号反应型遮蔽模体,其中该引信讯号反应型遮蔽模体是由多谷氨酸所组成。图4C:照射后所需培养时间与释放百分比的点状图,结果指出照射后仅需30分钟的培养时间,据足以使微脂体完全释放DOX。图4D:肽置换量与释放百分比的柱状图,结果显示1-MDL于肽/脂质比为1/300时,具有最大的照射后释放量。DDL:包覆DOX且与二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)连结的微脂体;1-MDL:包覆DOX且与光反应蛙皮素2(W12)(肽1)连结的微脂体;2-MDL:包覆DOX且与光反应打乱序列的(scrambled)蛙皮素2(肽2)连结的微脂体。DDL及2-MDL为本实验的对照组。
[0028] 图5是依据本揭示内容实施例2.2所绘示的线性图,其阐述光诱发的微脂体释放百分比与培养温度的关联性,其中1-MDL及2-MDL的肽置换比为肽/脂质=1/300。数据指出培养温度至少需为37℃,以达到最大释放量。
[0029] 图6是依据本揭示内容实施例2.2所绘示的点状图,其阐述于37℃未投予光照射时,具有不同肽置换量(肽/脂质比=1/500、1/400及1/300)的DDL与1-MDL的长期稳定度。
[0030] 图7是依据本揭示内容实施例2.2所阐述的照片,其关于(1)DDL,(2)1-MDL,(3)1-MDL+前UV照射,以及(4)1-MDL+前TritonTM-X100培养的微脂体DOX溶液。1-MDL的肽置换比为肽/脂质比=1/300。在投予UV照射之前(小图(a))及之后(小图(b)),DOX微脂体释放的DOX会剧烈增加(2)1-MDL的萤光量。
[0031] 图8是依据本揭示内容实施例2.3所阐述的低温电子显微镜(cryo-electron microscopy,cryo-EM)照片。DOX是稳定圈限(trap)于DDL-黑暗(小图(a))、DDL-UV(小图(b))、1-MDL-黑暗(小图(c))、2-MDL-黑暗(小图(e))及2-MDL-UV(小图(f))之中。1-MDL及2-MDL的肽置换比为肽/脂质比=1/300。DOX是显著地于1-MDL-UV(小图(d))所释放。2-MDL-黑暗(小图(e))及2-MDL-UV(小图(f))会将DOX圈限于微脂体之中。比例尺:所有照片皆为100纳米(nm)。
[0032] 图9是依据本揭示内容实施例2.5所绘示的线性图,其关于KB细胞的存活率。经以微脂体包覆的DOX或未包覆的DOX处理后,投予(4分钟)或未投予照射,并培养40个小时后,细胞的存活率。1-MDL的肽置换比为肽/脂质比=1/300。DDL-黑暗、DDL-UV及1-MDL-黑暗的IC50>160μM,而1-MDL-UV的IC50约为2μM,与DOX-黑暗(IC50约为0.7μM)及DOX-UV(IC50约为3μM)相似。光活化使1-MDL的DOX功效提升80倍。
[0033] 图10A及10B是依据本揭示内容实施例3所绘示的数据,其关于投予或未投予ALP处理的微脂体3-MDL(图10A)及4-MDL(图10B)的药物释放分析结果。ALP:性磷酸酶(alkaline phosphatase)。
[0034] 图11是依据本揭示内容实施例5所阐述的低温-EM照片,其分别关于未包覆的微脂体(小图(a))及包覆Cy5.5的微脂体(小图(b))的影像分析结果。比例尺:所有照片皆为100纳米。
[0035] 图12A及12B的照片是关于肽置换比为肽/脂质比=1/900、1/600及1/300时,光诱发1-MGL微脂体的释放结果。图12A:于TR=550时,T1-加权迟豫率(weighted relaxation rate)(S0为引信讯号活化前,微脂体的初始讯号量;S最大为加入1%TritonTM-X100后,完全释放Gd3+-DTPA的微脂体的最大讯号量)。图12B:投予或未投予光照射,并于37℃培养1小时后,Gd3+-DTPA微脂体的T1-图谱(T0为引信讯号活化前,微脂体的初始迟豫时间;T最大为3+
加入1%TritonTM-X100后,完全释放Gd -DTPA的微脂体的最大迟豫率)。白光框线指出光照射后,1-MGL的讯号改变。
[0036] 根据惯常的作业方式,图中各种特征与元件并未依比例绘制,其绘制方式是为了以最佳的方式呈现与本发明相关的具体特征与元件。此外,在不同图式间,以相同或相似的元件符号来指称相似的元件/部件。

具体实施方式

[0037] 为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备,下文针对了本发明的实施方面与具体实施例提出了说明性的描述;但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而,亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
[0038] I.定义
[0039] 虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值,此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而,任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处,「约」通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。或者是,「约」一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内,视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考量而定。除了实验例之外,或除非另有明确的说明,当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如,用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过「约」的修饰。因此,除非另有相反的说明,本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值,且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
在此处,将数值范围表示成由一端点至另一段点或介于二端点之间;除非另有说明,此处所述的数值范围皆包含端点。
[0040] 除非本说明书另有定义,此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。此外,在不和上下文冲突的情形下,本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型;而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。
[0041] 「肽」(peptide)、「多肽」(polypeptide)及「蛋白」(protein)在本揭示内容为可互换的词汇,是指氨基酸聚合物,而不论该聚合物的长度。即使某些实施方式可包含或排除多肽的化学或表达后修饰,然而,该些词汇未阐述或排除本发明多肽的化学或表达后修饰。在本揭示内容中,一多肽的任一特定位置皆是由该多肽的N端开始编号。除非特别指出异构体,否则当未明确指示氨基酸为D-或L-氨基酸时,则该氨基酸可以是L-氨基酸,或可以是D-或L-氨基酸。此外,本揭示内容对于多肽氨基酸残基的符号为本发明所属技术领域具有通常知识者所熟知的缩写。
[0042] 在本揭示内容中,「合成多肽」(synthetic polypeptide)是指一多肽,其不包含完整的自然分子。可藉由诸如化学合成、重组基因技术或完整抗原片段等人为技术来制备「合成多肽」(synthetic polypeptide)。
[0043] 「模体」(motif)一词在本揭示内容是指本揭示内容的合成多肽的一部分。具体来说「,模体」(motif)一词在本揭示内容可指一氨基酸序列或一化学基团(例如,一磷酸基)。较佳地,所述氨基酸序列具有至少10个氨基酸残基。
[0044] 本发明所属技术领域具有通常知识者当可理解,本揭示内容的「结构部」(moiety)一词是指一分子、一分子片段或一聚合物的一部分,举例来说,一氨基酸残基、肽或化合物的一部分。
[0045] 「α螺旋体」(alpha-helix或α-helix)或「α螺旋体结构」(alpha-helical structure)是指一多肽的二级排列结构,其中该多肽的氨基酸残基是以特定氢键模式相互作用,并藉以定义螺旋体结构。举例来说,在一标准α螺旋体中,氢键模式是位于「n」位置的残基的羰基氧,以及「n+4」位置的另一残基的酰胺氢之间。对310-螺旋体来说,氢键是个别形成于「n」及「n+3」位置的残基之间。对派-螺旋体(pi-helix或π-helix)来说,氢键是个别形成于「n」及「n+5」位置的残基之间。在标准α螺旋体、310-螺旋体及派-螺旋体中,α螺旋体各转折的残基数量分别约为3.6、3.0及4.4个。α螺旋体可以为右手或左手螺旋体结构。在本揭示内容中,「转折」(turn)及「螺旋转折」(helical turn)为可互换的词汇,用以指螺旋体结构中的单一回圈(circle)。
[0046] 本领域技术人员当可理解「螺旋轮状图」(helical wheel diagram)一词是指任何用以说明多肽的α螺旋体特性的图或视觉表示。一般来说,可将多肽的氨基酸序列以旋转方式绘制,其中连续氨基酸之间的旋转度约为100°,最后是以俯视角度来看螺旋体中心轴
[0047] 在此处「,连接」(link或couple)或「键结」(conjugate)为可互换的词汇,是指透过直接或间接的连结关系,将两个元件连结在一起。
[0048] 当与个体连用时,「投予」(administered或administering)在本揭示内容是指一传递送模式,其包含,但不限于,静脉内、肌肉内、腹腔内、动脉内、颅内或皮下递送本揭示内容的药剂(例如,本发明微脂体)。
[0049] 在本揭示内容中,「诊断」(diagnosis)一词是指本领域技术人员用以评估及/或决定一个体罹患一特定疾病、病症或症征的可能性的方法。「诊断」(diagnosis)一词亦包含侦测罹患一疾病、病症或症征的倾向,决定一药物治疗的治疗功效,或是预测对药物治疗的反应。本揭示内容的诊断方法可单独进行,或与其他用以分析疾病、病症或症征的诊断及/或分期方法同时进行。诊断「确定」不必然表示该诊断是100%准确的。
[0050] 「治疗」(treatment或treat)一词此处是包含对一哺乳动物(特别是人类)进行预防性(例如,预防性药物(prophylactic))、治疗性(curative)或舒减性(palliative)治疗;且包含(1)预防、治疗或减缓一个体罹患一疾病(例如癌症),其中该个体为罹患该疾病的高险族群,或是已罹患该疾病而尚未确诊断定;(2)抑制一疾病(例如抑制其发生);或是(3)减轻一疾病(例如减轻与该疾病相关的征状)。
[0051] 「有效量」(effective amount)在此处是指一药剂的用量足以产生欲求的疗效反应。有效量亦指一种化合物或组合物,其治疗利益效果超越其毒性或有害影响。药剂的有效量不必然能够治愈疾病或病症,但能够延缓、阻碍或防止该疾病或病症的发生,或是可缓减与疾病或病症相关的病征。可将治疗有效量可分成一、二或更多剂,而以适当的剂型在指定期间内施用一次、二次或更多次。具体的治疗有效量取决于多种因素,例如欲治疗的特定状况、个体的生理条件(如,个体重、年龄或性别)、接受治疗的个体类型、治疗持续时间、并行治疗(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说,可将治疗有效量表示成活性成分的总重量,譬如以克、毫克或微克来表示;或表示成活性成分重量相对于体重的比例,譬如表示为每公斤体重多少毫克(mg/kg)。或者是,可将有效量表示成活性成分(例如,本揭示内容的微脂体)的浓度,例如摩尔浓度、重量浓度、体积浓度、重量摩尔浓度、摩尔分率、重量分率及混合比值。本领域技术人员可依据动物模式的剂量来计算药剂(如本揭示内容的微脂体)的人体等效剂量(human equivalent dose,HED)。举例来说,本领域技术人员可依据美国食品药物管理局(US Food and Drug Administration,FDA)所公告的「估算成人健康志愿者在初始临床治疗测式的最大安全起始剂量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)来估算人体使用的最高安全剂量。
[0052] 「个体」(subject)一词是指包含人类的动物,其可接受本发明微脂体及/或方法的治疗。除非特定指出,否则「个体」(subject)一词同时意指男性及女性。
[0053] II.发明叙述
[0054] 本揭示内容旨在提供一种引信讯号反应型(stimuli-responsive)微脂体,进而以更安全且准确的方式来诊断或治疗疾病。该引信讯号反应型微脂体的特征在于具有与脂质层连接的特定多肽。在投予一引信讯号后,该多肽会产生裂解反应,破坏微脂体的结构,以达到对诊断或治疗药剂产生靶向传输(targeted delivery)及/或控制释放(controlled release,CR)的功效。
[0055] 据此,本揭示内容的第一方面是关于一种合成多肽,其是重新设计且以化学修饰天然抗微生物多肽而得到的多肽。本发明合成多肽包含一破膜模体、一遮蔽模体,以及一连接子,其中该连接子是用以连接该破膜模体及该遮蔽模体。
[0056] 破膜模体包含14-30个氨基酸残基,其中破膜模体的疏水性氨基酸残基(即,亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸,及/或酪氨酸残基)的数量为5-10;破膜模体的带正电荷的氨基酸残基(即,赖氨酸、精氨酸,及/或组氨酸残基)的数量为4-10;且破膜模体的带负电荷的氨基酸残基(即,天门冬氨酸及/或谷氨酸残基)的数量等于或小于1。
[0057] 本发明合成多肽的破膜模体的特征在于,当排列为α-螺旋体结构时,具有独特的特性。具体来说,当将破膜模体的氨基酸序列排列为α-螺旋体结构时,该螺旋体每二转折具有一七肽重复(heptad repeat),其中第一螺旋转折具有4个氨基酸残基,而第二螺旋转折则具有3个氨基酸残基。将第一螺旋转折的4个氨基酸残基分别称为位置1-4,而将第二螺旋转折的3个氨基酸残基称为位置5-7。为清楚阐述及理解,可将各重复的位置1-7表示为图1的螺旋轮状图,其中各重复的氨基酸序列是依序以位置编号(即,由位置1至位置7)进行排列。于α螺旋体的各重复中相同位置编号形成一对应位。依据本揭示内容的实施方式,在破膜模体中,包含一或多个带正电荷的氨基酸残基(即,赖氨酸、精氨酸,及/或组氨酸残基)的对应位的数量为3或4,且至少二个包含带正电荷的氨基酸残基的对应位彼此相邻。
[0058] 以下提供数种本发明破膜模体的实例。首先参见图2A,其中是将蛙皮素2(SEQ ID NO:1)的α-螺旋体结构投射为螺旋轮状图。依据图2A,蛙皮素2的α-螺旋体结构具有4重复,其中在第一重复中,位置1到7分别包含氨基酸残基G、I、G、K、F、L及H;在第二重复中,位置1到7分别包含氨基酸残基S、A、K、K、F、G及K;在第三重复中,位置1到7分别包含氨基酸残基A、F、V、G、E、I及M;而在第四重复中,位置1及2则分别包含氨基酸残基N及S。在图2A中,以「*」标记带正电荷的氨基酸残基(即,赖氨酸、精氨酸,及/或组氨酸残基)。位于位置1的氨基酸残基G、S、A及N共同形成对应位1。相似地,位于位置2的氨基酸残基I、A、F及S共同形成对应位2;而位于位置3的氨基酸残基G、K及V则共同形成对应位3;以下类推。如图2A所示,包含带正电荷的氨基酸残基的对应位的数量为3,即对应位3、4及7。具体来说,对应位3具有1个带正电荷的氨基酸残基,而对应位4及7则分别具有2个带正电荷的氨基酸残基。此外,所述对应位3、4及7于螺旋轮状图中彼此相邻。当破膜模体为图2A所示的蛙皮素2时,遮蔽模体(例如,包含至少10个谷氨酸残基的肽)是藉由连接子连接至位于破膜模体对应位2的丝氨酸(S)残基的C端。
[0059] 图2B及图2C提供了本发明破膜模体的其他实例,其分别阐述截断型蛙皮素2(SEQ ID NO:2)及突变型蛙皮素2(SEQ ID NO:3)的螺旋轮状图。图2B及图2C的氨基酸序列的排列方式与图2A所述的排列方式相似,因此,为求简洁,在此不再赘述。依据图2B及图2C,截断型蛙皮素2及突变型蛙皮素2皆具有3个相邻对应位(即,对应位3、4及7),其分别包含1、2及2个带正电荷的氨基酸残基。当破膜模体为图2B所示的截断型蛙皮素2,或是图2C所示的突变型蛙皮素2时,遮蔽模体是藉由连接子连接至位于破膜模体对应位3的缬氨酸(V)残基的C端。
[0060] 本发明例示性的破膜模体亦包含蜂毒肽(SEQ ID NO:4)及其突变型(SEQ ID NO:5)。如图2D所示,蜂毒肽的螺旋轮状图具有4个对应位,即,对应位1、2、3及7,其分别包含1、
1、1及2个带正电荷的氨基酸残基,且对应位3及7彼此相邻。相似地,突变型蜂毒肽的螺旋体轮具有3个对应位,即,对应位3、4及7,其彼此相邻,且分别包含1、2及2个带正电荷的氨基酸残基(图2E)。当破膜模体为图2D所示的蜂毒肽时,则遮蔽模体是藉由连接子连接至位于破膜模体对应位5的谷氨酰胺(Q)残基的C端。亦或是,当破膜模体是图2E所示的突变型蜂毒肽时,则遮蔽模体是藉由连接子连接至位于破膜模体对应位3的精氨酸(R)残基的C端。
[0061] 破膜模体的另一实例为培西加南(SEQ ID NO:6),图2F阐述其螺旋轮状图。在此种实施方式中,培西加南具有4个对应位,即,对应位1、3、4及7,其分别包含1、1、3及3个带正电荷的氨基酸残基,且对应位3、4及7彼此相邻。当破膜模体为图2F所示的培西加南时,则遮蔽模体是藉由连接子连接至位于破膜模体对应位7的赖氨酸(K)残基的C端。
[0062] 破膜模体的另一实例为EP1(SEQ ID NO:7),图2G阐述其螺旋轮状图。EP1具有对应位1、4及5共3个彼此相邻的对应位,其分别包含2、1及2个带正电荷的氨基酸残基。当本揭示内容的合成多肽为图2G所示的破膜模体时,遮蔽模体是藉由连接子连接至位于破膜模体对应位7的缬氨酸(V)残基的C端。
[0063] 依据本揭示内容某些实施方式,本发明合成多肽的遮蔽模体为一肽,其包含至少10个(例如,10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)带负电荷的氨基酸残基,藉以破坏破膜模体的二级结构。较佳地,遮蔽模体包含至少10个谷氨酸残基。在本揭示内容一特定实施例中,遮蔽模体是由12个谷氨酸残基所组成。
[0064] 用以连接本发明合成多肽的破膜模体及遮蔽模体的连接子是一引信讯号反应型连接子;举例来说,一光裂解型或蛋白酶裂解型结构部。依据某些实施方式,本揭示内容的连接子是一光裂解型结构部,其源自非天然氨基酸3-胺基-3-(2-硝苯基)丙酸(3-amino-3-(2-nitrophenyl)propionic acid,ANP)或4-(4-(1-胺乙基)-2-甲氧基-5-硝苯氧基)丁酸(4-(4-(1-aminoethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butanoic acid)。在一特定实施方式中,光裂解型结构部具有式(I)或式(II)的结构:
[0065]
[0066] 依据替代性的实施方式,本揭示内容的连接子是一蛋白酶裂解型结构部;举例来说,一可为基质金属蛋白酶或细胞自溶酶所裂解的结构部。在某些特定的实施例中,连接子包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列。在一特定实施例中,连接子是缬氨酸-瓜氨酸双肽残基。
[0067] 亦或是,本发明合成多肽的遮蔽模体为一磷酸基(PO32-),其是藉由一磷酸酶裂解型连接子(例如,磷酸酯键)连接至破膜模体中可磷酸化的氨基酸残基的侧链(例如,丝氨酸(S)、酪氨酸(Y),及/或苏氨酸(T)残基的侧链),藉以形成一磷酸化氨基酸残基。在某些实施方式中,本发明合成多肽的磷酸化S、Y及/或T残基的数量至少为2(例如,2、3、4、5、6、7或更多)。当将破膜模体排列为α-螺旋体结构时,包含与遮蔽模体(即,磷酸基)连接的S、Y及/或T残基的对应位,是与包含一或多个带正电荷的氨基酸残基的对应位不同。换言之,磷酸化的S、Y及/或T残基与K,R及/或H残基不会出现于同一对应位中。
[0068] 首先参见图3A,其是将蛙皮素2-3pY(SEQ ID NO:8)的α螺旋体结构投射为螺旋轮状图。在图3A中,将带正电荷的氨基酸残基(即,K、R及/或H残基)以「*」标记,而将具有磷酸基连接的氨基酸残基(即,磷酸化的氨基酸残基)以「p」标记。依据图3A,磷酸化的氨基酸残基的数量为3,即3个分别位于对应位2及5的Y残基,其中对应位2及5与包含带正电荷的氨基酸残基(即,对应位3、4及7)的对应位不同。
[0069] 图3B提供了本发明合成多肽的另一实施例,其是关于蛙皮素2-2pY(SEQ ID NO:9)的螺旋轮状图。如图3B所示,蛙皮素2-2pY包含2个磷酸化的Y残基,其是分别位于对应位2及5;以及5个带正电荷的氨基酸残基,其是分别位于对应位3、4及7。
[0070] 本发明合成多肽的另一实例为蛙皮素2-2pS(SEQ ID NO:10)。蛙皮素2-2pS的氨基酸序列包含2个磷酸化的S残基。如图3C所示,2个磷酸化S残基位于对应位1,而5个带正电荷的氨基酸残基(即,如图3C所示的1个H残基,以4个K残基)则分别位于对应位3、4及7。
[0071] 本发明合成多肽的另一实例为突变型蜂毒肽-2pY(SEQ ID NO:11)。如图3D所示,对应位2包含2个磷酸化的Y残基,而彼此相邻的对应位3、4及7则分别包含1、2及2个带正电荷的氨基酸残基.
[0072] 图3E提供了另一种本发明合成多肽的实施例,其是关于EP1-2pY(SEQ ID NO:12)的螺旋轮状图。在EP1-2pY的螺旋排列中,于对应位3及6具有2个磷酸化的Y残基,而于对应位1、4及5则具有5个带正电荷的氨基酸残基。
[0073] 除了上述α-螺旋体结构及螺旋轮状图之外,亦可以式(X1)1-4(X2)1-13(X1)1-4来表示本发明合成多肽,其中各X1个别是选自由赖氨酸、精氨酸及组氨酸残基所组成的群组;且各X2个别是选自由丝氨酸、苏氨酸、天冬酰氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天门冬氨酸及谷氨酸残基所组成的群组。较佳地,各X2个别是选自由丝氨酸、苏氨酸、天冬酰氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸残基所组成的群组。此外,当本发明合成多肽包含二或多个X1氨基酸残基及一或多个X2氨基酸残基时,在式(X1)1-4(X2)1-13(X1)1-4的第一及第二组(X1)1-4中,各X1可以是相同或不同的氨基酸残基;相似地,在式(X1)1-4(X2)1-13(X1)1-4的(X2)1-13中,各X2可以是相同或不同的氨基酸残基。
[0074] 当破膜模体是蛙皮素2(SEQ ID NO:1)时,在式(X1)1-4(X2)1-13(X1)1-4中,第一及第二组(X1)1-4的X1分别是K及H;而式(X1)1-4(X2)1-13(X1)1-4的(X2)1-13则具有「FL」的氨基酸序列。至于蜂毒肽(SEQ ID NO:4),式(X1)1-4(X2)1-13(X1)1-4的第一组(X1)1-4的X1是K,式(X1)1-4(X2)1-13(X1)1-4的(X2)1-13具有「VLTTGLPALISWI」(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列,而式(X1)1-4(X2)1-13(X1)1-4的第二组(X1)1-4则具有「KRKR」(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列。
[0075] 依据本揭示内容某些操作实施例,破膜模体包含SEQ ID NO:1-12的任一条氨基酸序列。
[0076] 本揭示内容的任一实施方式所述的合成多肽皆可用以制备一引信讯号反应型微脂体,其可于接触光照或投予酶(例如,MMP或磷酸酶)处理等引信讯号后,释放出包覆于其中的药剂(例如,治疗药剂,或是显影剂)。具体来说,一旦与微脂体的脂质层连接,本发明合成多肽处于非活化状态;直到接触引信讯号后,该引信讯号会促使连接子产生裂解反应,使遮蔽模体与破膜模体分离,进而活化微脂体中破膜模体的破膜活性,破坏微脂体的完整结构,并将包覆于微脂体中的药剂释放至靶向位置。
[0077] 依据本揭示内容某些实施方式,微脂体包含一用以包覆治疗药剂或显影分子的中心核;一用以包覆该中心核的脂质层;以及一与该脂质层连接的合成多肽;其中该合成多肽可以是本揭示内容所述的任一种多肽。
[0078] 本发明所属技术领域具有通常知识者皆知用以制备微脂体的方法。适用于制备本发明微脂体的方法包含,但不限于,挤压法(extrusion)、逆相蒸发法(reverse phase evaporation)、超音波(ultrasonic)处理、溶剂(例如,乙醇)注射、微射流法(microfluidization)、清洁剂透析法(detergent dialysis)、乙醚注射法(ether injection)、脱水/再水合反应(dehydration/rehydration),以及其组合。
[0079] 为了将多肽连接至微脂体,可于制备微脂体之前或之后,将肽生物性键结至微脂体的脂质层上,据以制备最终产物-肽基微脂体,其中微脂体的组成成分(例如,脂质)包含少于1%的肽基脂质。可于制备微脂体之前,藉由混合微量的肽基脂质(低于总脂质的1%)来得到与肽连接的脂质膜;亦或是,可藉由混合微量的反应性脂质(低于1%)来形成表面反应性微脂体,以进行后续的肽生物键结。为使肽及脂质相互连接,可于微脂体形成之前或之后,藉由形成酰胺键(amide bond)、硫醚键(thioether bond),或点击化学反应(click chemistry)的方式来连接多肽及脂质。可以N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide ester,NHS)、琥珀酰基(succinyl group)、氰基(cyano group)、戊二酰基(glutaryl group)或羧酸(carboxylic acid)等酰胺反应基团来修饰微脂体的组成成分(例如,脂质)。亦或是,可以顺丁烯二酰亚胺(maleimide group)、溴化/碘化烷基(alkyl bromide/iodide)、碘乙酰胺(iodoacetamide)或吡啶基二硫代丙酸酯(pyridyldithiopropionate,PDP)等硫醇反应基团来修饰微脂体的组成成分(例如,脂质)。据此,多肽可藉由硫醇-顺丁烯二酰亚胺反应(thiol-maleimide reaction,其发生于多肽的硫醇基及微脂体的硫醇反应基之间)与微脂体连接。当可想见,亦可藉由羧酸反应基团、迭氮化物反应基团(azide reactive group)或二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne,DBCO)等其他基团来修饰微脂体,使具有对应基团的多肽经由适当反应与微脂体连接。依据本揭示内容一实施方式,本发明多肽是以硫醇-顺丁烯二酰亚胺反应与微脂体连接,其中是于本发明多肽的N端加上一半胱氨酸残基修饰,以使多肽连接至微脂体的顺丁烯二酰亚胺化脂质。
[0080] 可依据使用需求来选择治疗药剂。举例来说,治疗药剂可以是抗肿瘤药剂、抗发炎药剂、抗微生物药剂、抗氧化药剂、生长因子、神经传递分子或蛋白抑制剂。
[0081] 例示性的抗肿瘤药剂包含,但不限于,姜黄素(curcumin)、干扰素(interferon,IFN)、细胞激素抗体(例如曲妥珠单抗(trastuzumab, )、T-DM1、贝伐单抗(bevacizumab, )、西妥昔单抗(cetuximab, )、帕尼单抗
(panitumumab, )、利妥昔(rituximab, )及百克沙
(tositumomab, ))、抗雌性素(anti-estrogen,例如他莫昔芬(tamoxifen)、
雷洛昔芬(raloxifene)及甲地孕(megestrol))、黄体释素促效剂(LHRH agonist,例如戈舍瑞林(goscrclin)及醋酸亮丙瑞林(leuprolide))、抗雄性素(anti-androgen,例如氟他胺(flutamide)及比卡鲁胺(bicalutamide))、光动力治疗(photodynamic therapies,例如维替泊芬(vertoporfin,BPD-MA)、酞菁(phthalocyanine)、光敏剂Pc4(photosensitizer Pc4)及去甲氧基竹红菌素(demethoxy-hypocrellin A,2BA-2-DMHA))、氮芥(nitrogen mustard,例如环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、雌莫司汀(estramustine)及美法仑(melphalan))、亚硝基尿素(nitrosoureas,例如卡莫司汀(carmustine,BCNU)及洛莫司汀(lomustine,CCNU))、烷基磺酸(alkylsulphonate,例如白消安(busulfan)及苏消安(treosulfan))、三氮烯(triazene,例如达卡巴嗪(dacarbazine)及替莫唑胺
(temozolomide))、含铂化合物(platinum containing compound,例如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)及奥沙利铂(oxaliplatin))、长春花生物碱(vinca alkaloid,例如长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)及长春瑞滨(vinorelbine))、类紫杉醇(taxoid,例如紫杉醇(paclitaxel)或与纳米粒子白蛋白结合的紫杉醇(Abraxane)、与十二六烯酸结合的紫杉醇(DHA-paclitaxel,Taxoprexin)、与聚谷氨酸结合的紫杉醇(PG-paclitaxel,paclitaxel poliglumex,CT-2103,XYOTAX)、肿瘤活化前趋药物ANG1005(Angiopep-2bound to three molecules of paclitaxel)、紫杉醇-EC-1(paclitaxel bound to the erbB2-recognizing peptide EC-1)及与葡萄糖结合的紫杉醇(例如依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、9-氨基喜树咸(9-aminocamptothecin)、康托替康(camptoirinotecan)、伊立替康(irinotecan)、甲磺酸(crisnatol)及丝裂霉素C
(mytomycin C))等紫杉醇等效物)、抗代谢药物(anti-metabolite)、二氢叶酸还原酶抑制剂(DHFR  inhibitor,例如氨甲喋呤(methotrexate)、二氯甲氨蝶呤
(dichloromethotrexate)、三甲蝶呤(trimetrexate)及依达曲沙(edatrexate))、肌苷-5’-单磷酸去氢酶抑制剂(IMP dehydrogenase inhibitor,例如霉酚酸(mycophenolic acid)、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韦林(ribavirin)及EICAR))、核糖核苷酸还原酶抑制剂(ribonuclotide reductase inhibitor,例如羟基尿素(hydroxyurea)及去
(deferoxamine))、尿嘧啶相似物(uracil analog,例如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、氟尿苷(floxuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、雷替曲塞(ratitrexed)、替加氟尿嘧啶(tegafur-uracil)及卡培他滨(capecitabine))、胞嘧啶相似物(cytosine analog,例如阿糖胞苷(cytarabine,ara C或cytosine arabinoside)及氟达拉滨(fludarabine))、嘌呤相似物(purine  analog,例如巯基嘌呤(mercaptopurine)及硫嘌呤
(Thioguanine))、维生素D3相似物(Vitamin D3analog,例如EB 1089、CB 1093及KH 1060)、异戊二烯抑制剂(isoprenylation inhibitor,例如洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神经毒素(dopaminergic neurotoxin,例如1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-
phenylpyridinium ion))、细胞周期抑制剂(例如星形孢菌素(staurosporine))、放线菌素(actinomycin,例如放线菌素D)、博莱霉素(bleomycin,例如博莱霉素A2、博莱霉素B2及培洛霉素(peplomycin))、蒽环类药物(anthracycline,例如柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、聚乙二醇化微脂体多柔比星(pegylated liposomal doxorubicin)、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone))、多重抗药性抑制剂(MDR inhibitor,例如维拉帕米(verapamil))、离子三磷酸腺苷酶抑制剂(Ca2+ATPase inhibitor,例如毒胡萝卜素(thapsigargin))、伊替尼(imatinib)、沙利度胺(thalidomide)、来那度胺
(lenalidomide)、酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,例如阿西替尼(axitinib,AG013736)、波舒(bosutinib,SKI-606)、尼布(cediranib,RECENTINTM,AZD2171)、达沙替尼(dasatinib, BMS-354825)、厄洛替尼(erlotinib,
)、吉非替尼(gefitinib, )、伊马替尼(imatinib,
CGP57148B,STI-571)、拉帕替尼(lapatinib, )、来他替尼
(lestaurtinib,CEP-701)、那替尼(neratinib,HKI-272)、尼洛(nilotinib, )、
马沙尼(semaxanib,semaxinib,SU5416)、舒尼替尼(sunitinib, SU11248)、
托西尼布(toceranib, )、凡德他尼(vandetanib,
ZD6474)、瓦他拉尼(vatalanib,PTK787,PTK/ZK)、曲妥珠单抗(trastuzumab,
)、贝伐单抗(bevacizumab, )、利妥昔单抗(rituximab,
)、西妥昔单抗(cetuximab, )、帕尼单抗(panitumumab,
)、兰尼单抗(ranibizumab, )、尼洛(nilotinib,
)、索拉非尼(sorafenib, )、依维莫司(everolimus,
)、阿仑单抗(alemtuzumab, )、吉妥单抗(gemtuzumab 
ozogamicin, )、西罗莫司(temsirolimus, )、ENMD-2076、
PCI-32765、AC220、多韦替尼乳酸盐(dovitinib lactate,TKI258,CHIR-258)、BIBW2992(TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120 AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-
690154、CEP-11981、替洛尼(tivozanib,AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、及/或XL228)、蛋白酶抑制剂(proteasome inhibitor,例如替佐米(bortezomib,Velcade))、哺乳类斥消灵靶向蛋白抑制剂(mTOR inhibitor,例如雷帕霉素(rapamycin)、西罗莫司(temsirolimus,CCI-779)、依维莫司(everolimus,RAD-001)、雷帕霉素衍生物
(ridaforolimus,AP23573,Ariad)、AZD8055(AstraZeneca)、BEZ235(Novartis)、BGT226(Norvartis)、XL765(Sanofi Aventis)、PF-4691502(Pfizer)、GDC0980(Genetech)、SF1126(Semafoe)及OSI-027(OSI))、奥利默森(oblimersen)、吉西他滨(gemcitabine)、洋红霉素(carminomycin)、亚叶酸钙(leucovorin)、培美曲塞(pemetrexed)、环磷酰胺
(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甲基芐肼(procarbizine或
procarbazine)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、喜树碱
(campathecin)、普卡霉素(plicamycin)、天门冬酰胺酶(asparaginase)、氨基蝶呤(aminopterin)、甲氨蝶呤(methopterin)、紫菜霉素(porfiromycin)、美法仑(melphalan)、异长春碱(leurosidine)、环氧长春碱(leurosine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、曲贝替定(trabectedin)、海绵内酯(discodermolide)、洋红霉素(carminomycin)及六甲基三聚氰胺(hexamethyl melamine)。依据本揭示内容某些操作实施例,治疗药剂是多柔比星(doxorubicin,DOX)。
[0082] 例示性的抗发炎药剂包含,但不限于,姜黄素、非类固醇类的抗发炎药物(non-steroidal anti-inflammatory drug,NASID),包含阿氯芬酸(alclofenac)、阿氯米松双丙酸酯(alclometasone dipropionate)、阿孕奈德(algestone acetonide)、α淀粉酶(alpha amylase)、安西法尔(amcinafal)、安西非特(amcinafide)、氨芬酸钠(amfenac sodium)、盐酸氨普立糖(amiprilose hydrochloride)、阿那白滞素(anakinra)、阿尼禄酸(anirolac)、阿尼扎芬(anitrazafen)、阿扎丙宗(apazone)、巴柳氮二钠(balsalazide disodium)、节达酸(bendazac)、苯恶洛芬(benoxaprofen)、盐酸节达明(benzydamine hydrochloride)、凤梨蛋白酶(bromelains)、溴呱莫(broperamole)、布地奈德(budesonide)、卡布洛芬(carprofen)、环洛芬(cicloprofen)、辛喷他宗(cintazone)、克利洛芬(cliprofen)、丙酸氯倍他索(clobetasol propionate)、丁氯倍他松(clobetasone butyrate)、氯比酸(clopirac)、氯硫卡松丙酸盐(cloticasone propionate)、醋酸三氟米松(cormethasone acetate)、可托多松(cortodoxone)、癸酸盐(decanoate)、地夫可特(deflazacort)、庚酸睾酮(delatestryl)、能普-睾酮(depo-testosterone)、地奈德(desonide)、去轻米松(desoximetasone)、二丙酸地塞米松(dexamethasone dipropionate)、双氯芬酸(diclofenac  potassium)、双氯芬酸钠(diclofenac sodium)、双醋二氟拉松(diflorasonediacetate)、二氟米酮钠(diflumidone sodium)、二氟尼柳(diflunisal)、二氟泼尼醋(difluprednate)、双酞叹酮(diftalone)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)、轻西奈德(drocinonide)、甲地松(endrysone)、恩莫单抗(enlimomab)、依诺利康钠(enolicam sodium)、依匹挫(epirizole)、依托度酸(etodolac)、依托芬那醋(etofenamate)、联苯乙酸(felbinac)、非那莫(fenamole)、芬布芬(fenbufen)、芬氯酸(fenclofenac)、苯克洛酸(fenclorac)、芬度柳(fendosal)、苯吡恶二酮(fenpipalone)、芬替酸(fentiazac)、夫拉扎酮(flazalone)、氟扎可特(fluazacort)、氟芬那酸(flufenamic acid)、氟咪挫
(flumizole)、醋酸氟尼缩松(flunisolide acetate)、氟尼辛(flunixin)、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、氟考丁醋(fluocortin butyl)、氟米龙醋酸醋(fluorometholone acetate)、苯氟喹酮(fluquazone)、氟比洛芬(flurbiprofen)、氟瑞托芬(fluretofen)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、咲喃洛芬(furaprofen)、咲罗布芬(furobufen)、哈西奈德(halcinonide)、丙酸齿倍他索(halobetasol propionate)、醋酸齿泼尼松(halopredone acetate)、异丁芬酸(ibufenac)、布洛芬(ibuprofen)、布洛芬错(ibuprofen aluminum)、皮考布洛芬(ibuprofen  piconol)、伊洛达普(ilonidap)、吲噪美辛(indomethacin)、吲噪美辛钠(indomethacin sodium)、吲噪布洛芬(indoprofen)、吲四挫(intrazole)、醋异氟龙(isoflupredone acetate)、氧卓乙酸(isoxepac)、伊索昔康(isoxicam)、酮基布洛芬(ketoprofen)、盐酸洛非咪挫(lofemizole hydrochloride)、氯诺昔康(lomoxicam)、氯替泼诺碳酸乙醋(loteprednol etabonate)、甲氯灭酸钠
(meclofenamate sodium)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、甲氯松二丁醋(meclorisone dibutyrate)、甲芬那酸(mefenamic  acid)、美沙拉嗪(mesalamine)、美西拉宗
(meseclazone)、甲二氛睾酬(mesterolone)、美雄酬(methandrostenolone)、美替诺龙(methenolone)、美替诺龙醋酸醋(methenolone acetate)、磺庚甲泼尼龙
(methylprednisolone suleptanate)、吗尼氟醋(momiflumate)、丁美酮(nabumetone)、诺龙(nandrolone)、萘普生(naproxen)、萘普生钠(naproxen sodium)、甲氧萘丙醇(naproxol)、尼马宗(nimazone)、奥沙拉嗪钠(olsalazinesodium)、肝蛋白(orgotein)、奥帕诺辛(orpanoxin)、氧甲氢龙(oxandrolane)、奥沙普秦(oxaprozin)、羟基保泰松(oxyphenbutazone)、轻甲稀龙(oxymetholone)、盐酸瑞尼托林(paranyline 
hydrochloride)、戊聚糖多硫酸钠(pentosan polysulfate sodium)、甘油保泰松钠(phenbutazone sodium glycerate)、吡非尼酮(pirfenidone)、吡罗昔康(piroxicam)、肉桂酸吡罗昔康(piroxicam cinnamate)、吡罗昔康乙醇胺(piroxicam olamine)、比诺布洛芬(pirprofen)、泼那扎特(prednazate)、普立非酮(prifelone)、普罗度酸(prodolic acid)、普罗喹宗(proquazone)、普罗沙挫(proxazole)、枸橡酸普罗沙挫
(proxazolecitrate)、利美索龙(rimexolone)、氯马扎利(romazarit)、水杨酸胆碱硫酸仪(salcolex)、沙那西定(salnacedin)、双水杨醋(salsalate)、血根氯鞍(sanguinarium chloride)、司克拉宗(seclazone)、丝美辛(sermetacin)、康力龙(stanozolol)、舒多昔康(sudoxicam)、舒林酸(sulindac)、舒洛芬(suprofen)、他美辛(talmetacin)、氟烟酞醋(talniflumate)、他洛柳醋(talosalate)、特丁非隆(tebufelone)、替尼达普(tenidap)、替尼达普钠(tenidap sodium)、替诺昔康(tenoxicam)、氧喹苯胺(tesicam)、辛叉异喹酮(tesimide)、睾酮、睾酮混合物(testosterone blends)、四氢甲吲胺(tetrydamine)、硫平酸(tiopinac)、替可的松匹伐醋(tixocortol pivalate)、托美丁(tolmetin)、托美丁钠(tolmetin sodium)、三氯氟松(triclonide)、三氟氨醋(triflumidate)、齐多美辛(zidometacin)及苯酰吡酸钠(zomepirac sodium)。
[0083] 抗微生物药剂可以是抗细菌药剂、抗病毒药剂、抗真菌药剂,或是抗寄生虫药剂。
[0084] 例示性的抗老化剂包含,但不限于,胺类(例如,N,N-二乙基羟基胺(N,N-diethylhydroxylamine)及胺基胍(amino-guanidine))、精氨酸吡酮(arginine pilolate)、抗坏血酸(ascorbic acid)及其盐类、脂肪酸的抗坏血酸酯(ascorbyl ester of fatty acid)、生物类黄酮(bioflavonoid)、丁基化羟基苯甲酸(butylated hydroxy benzoic acid)及其盐类、二羟基反丁烯二酸(dihydroxy fumaric acid)及其盐类、没食子酸(gallic acid)及其烷基酯(例如,没食子酸丙酯(propyl gallate)及尿酸)、
[0085] 甘氨酸吡酮酸盐(glycine pidolate)、6-羟基-2,5,7,8-四甲基二氢苯并呱喃-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)、硫辛酸(lipoic acid)、赖氨酸(lysine)、黑色素(melanin)、甲硫氨酸(methionine)、降二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid)、脯氨酸(proline)、水飞蓟素(silymarin)、山梨酸(sorbic acid)及其盐类、巯基化合物(例如麸胺基硫(glutathione))、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、过氧化氢酶(catalase)、茶萃取物、葡萄皮/种子萃取物、迷迭香萃取物、生育酚醋酸盐(tocopherol acetate)、生育酚、生育酚山梨酸盐(tocopherol sorbate)及其组合。
[0086] 例示性的生长因子包含,但不限于,血管生长素(angiopoietin)、巨噬细胞群落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)、颗粒性白血球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、颗粒性白血球巨噬细胞群落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、胎盘生长因子(placental growth factor,PLGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、内皮因子(endoglin)、内皮素(endothelin)、瘦素(leptin)、滤泡抑素(follistatin)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、转形生长因子-α(trans forming growth factor-α,TGF-α)、转形生长因子-β(TGF-β)、软骨生长因子(cartilage growth factor,CGF)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、脑神经滋养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、介白素(interleukin,IL)及肝配(ephrin)。
[0087] 例示性的神经传递分子包含,但不限于,谷氨酸、天门冬氨酸、D-丝氨酸、γ-丁氨酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、甘氨酸、一氧化氮(nitric oxide,NO)、一氧化碳(carbon monoxide,CO)、硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)、多巴胺(dopamine,DA)、正肾上腺素(norepinephrine或noradrenaline)、肾上腺素(epinephrine或adrenaline)、组织胺(histamine)、血清素(serotonin,SER,5-HT)、苯乙胺(phenethylamine)、N-甲基苯乙胺(N-methylphenethylamine)、酪胺(tyramine)、3-碘类甲腺质(3-iodothyronamine)、章鱼胺(octopamine)、色胺(tryptamine)、催产素(oxytocin)、体抑素(somatostatin)、物质P(substance P)、乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)、大麻素(anandamide),及其组合物。
[0088] 此外或亦或是,中心核可包含一显影分子,例如一显影剂或一萤光分子。显影剂可以是任何用以改善医学影像中结构或流体对比度的物质。例示性的显影剂包含,但不限于,顺磁性显影剂、超顺磁性显影剂,以及质子密度显影剂。
[0089] 更具体来说,显影剂可以是含钆显影剂(gadolinium-based contrast agent,GBCA)、聚合型枝状钆复合体(polymeric(dendrameric)gadolinium complex)、含锰核磁共振显影剂(manganese-based  MRI  contrast  agent),或是超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)。例示性的GBCA包含,但不限于,钆特酸(gadoteric acid)及其盐类(例如,甲基葡胺盐(meglumine salt);举例来说,Gd-DOTA)、钆喷酸(gadopentetic acid)及其盐类(例如,二甲葡胺盐(dimeglumine salt);举例来说,Gd-DTPA)、钆双胺(gadodiamide;举例来说,GdGd-DTPA-BMA)、钆贝酸(gadobenic acid)及其盐类(例如,二甲葡胺盐;举例来说,Gd-BOPTA)、钆塞酸(gadoxetic acid)及其盐类(例如,二钠盐;举例来说,Gd-EOB-DTPA)、钆特醇(gadoteridol;举例来说,Gd-HP-DO3A)、钆氟塞胺(gadoversetamide;举例来说,Gd-DTPA-BMEA)、钆布醇(gadobutrol;举例来说,Gd-DO3A-butrol)、钆磷维塞(gadofosveset)及其盐类(例如,三钠盐;举例来说,MS-325),以及钆考酸(gadocoletic acid)及其盐类(例如,三钠盐;举例来说,B22956/1)。例示性的聚合型枝状钆复合体包含,但不限于,钆美利醇(gadomelitol;举例来说,P792)、钆登酯(gadodenterate;举例来说,SH L 643A),以及钆化合物17(gadomer 17)。含锰核磁共振显影剂可以是锰福地吡(mangafodipir)及其盐类(例如,三钠盐;举例来说,Mn-DPDP)、Mn-DTPA-SA、Mn-EDTA,或是Mn-卟啉衍生物(包含,TPP、TPPS2、TPPS3、TPPS4、中紫质(mesoporphyrin)、血紫质(hematoporphyrin)、尿紫质(uroporphyrin)、ATN-10、HOP-8P等)。至于SPIO,其可以是类铁剂(ferumoxytol)、瑞瑟维斯(ferucarbotran),或是菲力磁(ferumoxide)。依据本揭示内容一特定实施例,显影分子是二乙烯三胺五乙酸钆(III)(diethylenetriaminepentaacetic acid gadolinium(III),Gd3+-DTPA)。
[0090] 至于萤光分子,其可以是任何在光激发下重新发光的分子;举例来说,花青染剂(cyanine,包含Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy7)、绿色萤光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、增强型绿色萤光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)、红色萤光蛋白(red fluorescent protein,RFP)、黄色萤光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)、萤光异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate,FITC)、藻红素(phycoerythrin,PE),或是异藻蓝蛋白(allophycocyanine,APC)。依据一操作实施例,萤光分子是Cy5.5。
[0091] 本揭示内容亦提供利用本发明微脂体来诊断或治疗一个体的疾病的方法。用以诊断疾病的方法包含对该个体投予一有效量的本发明微脂体,其中心核包含一显影分子(例如,Gd3+-DTPA)。为治疗一个体的疾病,是对该个体投予一有效量的本发明微脂体,其中心核包含一治疗药剂(例如,DOX),藉以改善或减缓与该疾病相关的病症。
[0092] 可以本发明微脂体及/或方法治疗的疾病包含肿瘤、发炎性疾病、感染性疾病、与氧化压力或生长因子表达异常相关的疾病或病状,以及神经性疾病。
[0093] 该个体为一哺乳动物;例如,一人类、小鼠、大鼠、天竺鼠、猴子、黑猩猩、兔子、猪、猫、狗、马、年、绵羊或山羊。较佳地,该个体为人类。
[0094] 下文提出多个实验例来说明本发明的某些方面,以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实施本发明,且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后,可在不需过度解读的情形下,完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献,其全文皆视为本说明书的一部分。
[0095] 实施例
[0096] 材料及方法
[0097] 试剂
[0098] 由Avanti Polar Lipids,Inc购买磷质、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000](DSPE-PEG2000)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(p-马来酰亚胺基)环己烷-羧酰胺](1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidomethyl)cyclohexane-carboxamide](16:0PE MCC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(p-马来酰亚胺基)环己烷-羧酰胺](1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidomethyl)
cyclohexane-carboxamide])(18:1PE  MCC)、氢化大豆L-α-卵磷脂(L-α-
phosphatidylcholine,hydrogenated(Soy),HSPC),以及1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DSPC)。由Sigma购买胆固醇、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)及碳酸氢钠。由Toronto Research Chemicals购买多柔比星-HCl。由Anaspec购买芴甲氧羰基-氨基酸(Fmoc-amino acid),以及2-(6-氯-1H-苯并三唑-
1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸盐(2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate,HCTU)。由Advanced chemtech购买4-{4-[1-(9-芴甲氧羰基)乙基]-2-甲氧基-5-硝基苯氧基}丁酸(4-{4-[1-(9-
fluorenylmethyloxycarbonyl)ethyl]-2-methoxy-5-nitrophenoxy}butanoic acid(芴甲氧羰基-光连接子),以及1-[双(二甲氧基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶阳离子3-氧化物六氟磷酸盐(1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate,HATU)。由Alfa aesar购买N,N-二异丙基乙基胺(N,N-diisopropylethylamine,DIPEA)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA),以及三异丙基烷(triisopropylsilane,TIPS)。由Uniregion biotech购买DTT。由Biological Industries购买胎血清(Fetal bovine serum,FBS),并将其置于56℃30分钟,以进行去活性反应。由Acros Organics购买三(2-羧乙基)磷盐酸盐(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydro-chloride,TCEP)。分别由Gibco及Merck购买DMEM、MEM,及3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-
diphenyltetrazolium bromide,MTT)。由BioVision购买联膜蛋白V-Cy5(Annexin V-Cy5)雕亡套组。所有本实验使用的化学药品皆为分析试剂等级。在本实验中,是利用人类癌化KB细胞来评估微脂体的建构。
[0099] 合成及分析肽
[0100] 利用自动化肽合成器,以芴甲氧羰基固相肽合成法,于经偶合剂处理的树脂来合成本发明多肽,其中是利用偶合剂HATU来偶合脯氨酸,并以偶合剂HCTU来偶合其余氨基酸。利用DIPEA作为基底。在切割肽时,是以TFA/TIPS/H2O(95:2.5:2.5,体积比)溶液处理树脂
90分钟,以得到粗制肽,接着以乙醚沉淀后,利用高效液层析法(high performance liquid chromatography,HPLC)进行纯化。藉由分析式逆相HPLC(analytical reversed phase HPLC,RP-HPLC)及电喷洒游离质谱仪(electrospray ionization-mass 
spectrometry,ESI-MS)来确认光裂解之前及之后的肽。
[0101] 表1总结了本发明合成肽及其氨基酸序列。
[0102] 表1合成肽
[0103]
[0104]
[0105] *斜体氨基酸序列为本实验的负对照组。
[0106] 制备微脂体及肽基微脂体
[0107] 以已知技术来制备微脂体DOX(即,包覆多柔比星的微脂体)。简单来说,是利用HSPC或DSPC的脂质组合物、胆固醇、DSPE-PEG2000及顺丁烯二酰亚胺化脂质,以摩尔比分别为38-60%、40-55%、0-5%及0.1-2%的条件进行制备。将脂质成分(12毫克)溶解于装有氯仿的圆底烧瓶中,并以旋转蒸发器进行蒸发以形成脂质膜,以捕获剂缓冲液(硫酸铵)进行水合反应后,冷冻-解冻处理数次。轻轻搅拌脂质悬浮液,并利用小型挤压器以聚碳酸酯膜(孔径为0.1微米)挤出,据以得到粒径均一的微脂体。利用150mM NaCl溶液作为冲提掖,以微脂体的粒径排除色层分析法来产生微脂体的交叉膜硫酸胺梯度。将DOX(5mM,50微升)加入收集的包含微脂体(5mM,500微升)的硫酸胺溶液中,并于60℃反应45分钟,以主动将DOX装载至微脂体中。接着以经三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸、100mM NaCl,pH 7.4)处理的凝胶进行过滤,以由未包覆DOX的微脂体中,纯化包覆DOX的微脂体。将包覆DOX的微脂体保存于4℃。DOX的装载率约为95%。
[0108] 在连接肽-顺丁烯二酰亚胺化微脂体时,是以三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸、100mM NaCl,pH 7.4)还原半胱胺酰基-肽,之后以适当摩尔比(肽/脂质比介于1/1200到1/300之间)加至包覆DOX的微脂体溶液。轻轻摇晃反应液,接着加入DTT(1mM),于37℃反应30分钟,以由微脂体表面移除未反应的顺丁烯二酰亚胺基。利用粒径排除色层分析法来纯化本揭示内容所有的微脂体。表2总结了可作为治疗药剂的包覆DOX的肽基微脂体。
[0109] 表2本揭示内容的肽基微脂体
[0110]
[0111]
[0112] *光连接子:4-(4-(1-胺乙基)-2-甲氧基-5-硝苯氧基)丁酸
[0113] 分析药物释放
[0114] 为评估本发明肽基微脂体的药物释放(以DOX作为包覆模式药物)特性,对光反应微脂体投予或不投予UV照射(每平方厘米5毫瓦,10分钟),并于37℃培养1小时。将微脂体培养于包含或不包含ALP(每毫升50U)的37℃环境3小时,以测量磷酸酶反应微脂体的萤光表达量。将微脂体培养于包含或不包含MMP2(每毫升300纳克)的37℃环境1小时,以测量MMP2反应微脂体的萤光表达量。以公式(1)来计算药物释放百分比,表3总结分析结果。
[0115] 分析微脂体
[0116] 利用已知方法来定量分析磷脂质浓度。简单来说,将8.9N的H2SO4(0.45毫升)分别加至微脂体(15及30微升)及标准溶液(NaH2PO4,32.5到227.5纳摩尔)中,之后加热至200℃反应25分钟。冷却后,将10%H2O2(0.15毫升)加入检体及标准溶液,重新加热至200℃反应30分钟。冷却后,依序加入H2O(3.9毫升)、四水合钼酸铵(ammonium  molybdate tetrahydrate,2.5%重量/体积,0.5毫升)及抗坏血酸(10%重量/体积,0.5毫升)的混合物,之后重新加热至100℃反应7分钟。于OD820,利用标准溶液的校正曲线计算微脂体的磷脂质浓度。在测量微脂体的粒径大小及表面界达电位时,是将100微升的微脂体溶液稀释于1毫升的三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸、100mM NaCl,pH 7.4)中,之后置于微量比色管或表面界达电位比色管,以三重复检测各检体。
[0117] 以萤光量评估微脂体释放DOX
[0118] 投予或不投予UV照射(每平方厘米5毫瓦,0-60分钟),并于37℃培养1小时后,测量由引信讯号释放型微脂体所释放的DOX的萤光强度(I)。藉由加入1%TritonTMX-100,并于70℃培养2分钟,得到由微脂体完全释放的DOX的萤光强度(I最大)。以公式(1)来计算肽光活化所产生的释放百分比:
[0119] 引信讯号诱发释放(%)=[(I-Io)/(I最大-Io)]x 100%
[0120] (1)
[0121] 其中Io为微脂体于引信讯号活化前的初始萤光强度。
[0122] 以低温电子显微镜(cryo-electron microscopy,cryo-EM)评估由微脂体释放的DOX
[0123] 将经照射(每平方厘米5毫瓦,10分钟)或黑暗处理的微脂体溶液于37℃培养1小时,以完全释放DOX。利用低温-TEM来得到微脂体的低温-EM影像。简单来说,在(Ar,O2)环境中,使400筛目的网格于碳侧辉光放电10秒。将4微升的微脂体溶液(每毫升0.2-0.4毫克的总脂质)加入网格表面。于4℃,将网格置于100%湿度的环境印渍3-4秒,之后投入以液态氮冷却的液态乙烷浴中。以公式(2)来计算光引信讯号型微脂体的DOX释放百分比:
[0124] 引信讯号诱发型释放=(EL微脂体-ELDDL-黑暗)/(100%-ELDDL-黑暗)(2)
[0125] 其中,EL是低温-EM影像中,未包覆的微脂体的百分比。
[0126] 未包覆的DOX及肽基微脂体的细胞DOX摄取量
[0127] 在以萤光显微镜分析细胞对DOX的摄取量时,是将KB细胞(每孔洞5x 105细胞)种植于35毫米的培养盘中,以10%FBS于37℃培养24小时。之后,以含有未包覆的DOX的MEM培养液(不含FBS),或是含有DDL、1-MDL或2-MDL的MEM培养液(不含FBS)替换培养,并投予或不投予光照射(每平方厘米5毫瓦,4分钟),于37℃另培养20小时。洗涤细胞后,将其置于含有10%FBS的MEM中,以萤光显微镜进行观察。以赫斯特33342(Hoechst 33342)染色细胞,于37℃反应20分钟,以观察细胞核。利用预设过滤管来观察赫斯特及DOX的萤光量。
[0128] 在进行时间相关性的细胞摄取DOX实验时,是将KB细胞(每孔洞3x 104细胞)种植于8孔洞的培养盘中,于包含10%FBS的DMEM于37℃培养24小时。之后,以含有未包覆的DOX的MEM培养液(不含FBS),或是含有DDL或1-MDL的MEM培养液(不含FBS)替换培养液,并投予或不投予光照射(每平方厘米5毫瓦,4分钟)。利用共轭焦显微镜每15分钟以40倍率观测一次萤光影像。
[0129] 为以流式细胞仪来分析光诱发型微脂体的DOX释放量及细胞雕亡的关联性,将KB细胞(每孔洞2x 105细胞)种植于12孔洞盘,于包含10%FBS的DMEM于37℃培养24小时。之后,以含有未包覆的DOX的MEM培养液(不含FBS),或是含有DDL或1-MDL的MEM培养液(不含FBS)替换培养液,并投予或不投予光照射(每平方厘米5毫瓦,4分钟);接着置于37℃培养20小时。利用1毫升PBS洗涤细胞后,以1毫升胰蛋白酶-EDTA处理3分钟,之后藉由1000rpm转速离心收集产物。以500微升的包含1%FBS的PBS悬浮细胞沉淀物。加入7微升的联膜蛋白V-Cy5,并避光培养5分钟。利用流式细胞仪分析各检体的细胞(共计10,000个细胞)。
[0130] 为以多参数细胞影像分析光诱发型微脂体的DOX释放量细胞雕亡的关联性,将KB细胞(每孔洞1x 104细胞)种植于96孔洞盘,于包含10%FBS的DMEM于37℃培养24小时。之后,以含有未包覆的DOX的MEM培养液(不含FBS),或是含有DDL或1-MDL的MEM培养液(不含FBS)替换培养液,并投予或不投予光照射(每平方厘米5毫瓦,4分钟);接着置于37℃培养20小时。洗涤细胞后,将其置于包含10%FBS的MEM中。以赫斯特33342及联膜蛋白V-Cy5染色细胞,分别于37℃反应20及5分钟,藉以观察细胞核及雕亡细胞。利用共轭焦定量影像细胞仪来分析各孔洞的细胞(共计>2,000个细胞)。
[0131] MTT试验
[0132] 在评估以微脂体包覆的DOX的半抑制浓度(IC50)时,是将KB细胞(每孔洞1.1x 104细胞)种植于96孔洞盘,于包含10%FBS的DMEM于37℃培养24小时。之后,以含有未包覆的DOX的MEM培养液(不含FBS),或是含有DDL或MDL的MEM培养液(不含FBS)替换培养液,并投予或不投予光照射(每平方厘米5毫瓦,4分钟);接着置于37℃培养20小时。另以包含10%FBS的MEM替换培养液后,于37℃培养20小时。将20微升的MTT原液(每毫升5毫克,溶于PBS)加至各孔洞,之后于37℃培养2小时;接着,移除170微升的培养液,并加入200微升的DMSO溶解紫色甲 产物,于37℃在120rpm转速的往复振动器上反应10分钟。利用盘读取器测量光波为540纳米时,DMSO溶液中甲 产物的吸光量,据以评估细胞存活率。
[0133] 将Cy5.5远端装载至微脂体
[0134] 将脂质成分溶解于装有氯仿的圆底烧瓶中,并以旋转蒸发器进行蒸发以形成脂质膜。以捕获剂缓冲液(100mM的蔗糖八硫酸酯铵(sucrose octasulfate ammonium))进行水合反应后,冷冻-解冻处理十次。轻轻搅拌脂质悬浮液,并利用小型挤压器以聚碳酸酯膜(孔径为0.1微米)挤出,据以得到粒径均一的微脂体。利用150mM NaCl溶液作为冲提掖,以微脂体的粒径排除色层分析法,移除未包覆的蔗糖八硫酸酯铵,据以产生微脂体的穿膜捕获剂梯度。将Cy5.5(总脂质的0.02摩尔当量)加至收集的微脂体。接着利用粒径排除色层分析法进行过滤,以纯化Cy5.5微脂体。利用公式(3)来计算Cy5.5微脂体的包覆效率百分比:
[0135] 包覆效率(%)=(ML/MT)*100%  (3);
[0136] 其中,ML为Cy5.5于微脂体分馏中的含量,而MT则为Cy5.5于纯化前的总量。经计算,Cy5.5的装载效率约为80%。
[0137] 制备包覆Gd3+-DTPA的光诱发型微脂体及其释放分析
[0138] 将脂质成分(24毫克)溶解于装有氯仿的圆底烧瓶中,并以旋转蒸发器进行蒸发以形成脂质膜。以1毫升的200mM Gd3+-DTPA(pH 7.4)对脂质膜进行水合反应,之后冷冻-解冻处理十次。轻轻搅拌脂质悬浮液,并利用小型挤压器以聚碳酸酯膜(孔径为0.1微米)挤出,或以超音波振荡法,得到粒径均一(约100纳米)的微脂体。利用经三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸、100mM NaCl,pH 7.4)处理的粒径排除色层分析进行过滤,以纯化包覆Gd3+-DTPA的微脂体。为进行光引信讯号释放,以三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(50三(羟甲基)甲基甘氨酸、100mM NaCl,pH 7.4)于室温还原肽1(0.2mM)15分钟,藉以减少肽的间的双硫键结;之后,以适当摩尔比(肽/脂质比介于1/900到1/300之间)加入包覆Gd3+-DTPA的微脂体溶液。置于转速设定为120rpm转速的往复振动器上,于37℃反应1小时;接着加入DTT(1mM),于37℃反应30分钟,以由微脂体表面移除未反应的顺丁烯二酰亚胺基。
将肽1加至Gd3+-DTPA微脂体(GL)以制备与肽1键结的Gd3+-DTPA微脂体(称为「1-MGL」),或是与DTT键结的Gd3+-DTPA微脂体(称为「DGL」)。利用粒径排除法纯化肽基微脂体。投予或不投予UV照射(每平方厘米5毫瓦,10分钟),并于37℃培养1小时,以测量微脂体包覆的Gd3+-DTPA的引信讯号释放率。以T1-加权自旋回波序列得到的影像来计算微脂体溶液的T1迟豫时间,其中TR=90、120、150、180、230、290、330、380、450、550、680、850、1000、1500、2000、3000、
5000、8000ms,TE=8ms,激发次数=1,视野=6.5×6.5平方厘米,且影像矩阵尺寸=256×
256。
[0139] 实施例1分析本发明微脂体
[0140] 依照材料及方法所述步骤来分析本发明合成微脂体的药物释放特性。表3总结分析结果。
[0141] 表3本发明微脂体的药物释放特性
[0142]
[0143]
[0144] *引信讯号:对微脂体编号:1-8投予光照射;对微脂体编号:9-15投予磷酸酶处理;对微脂体编号:16-19投予MMP2处理。
[0145] 表3的分析数据指出,经引信讯号后,微脂体编号:1-5、9-13、16-18分别具有80%、50%、80%、50%、45%、70%、70%、45%、70%、35%、50%、40%及25%的释放率。该些肽基微脂体为本发明引信讯号释放型微脂体的成功实例,且可利用本揭示内容所述设计来制备该些与微脂体键结的肽的遮蔽模体。同时,经引信讯号后,微脂体编号:6-8、14-15及19分别仅具15%、10%、15%、10%、10%及10%的释放率。该些肽基微脂体为引信讯号释放的失败实例。对于该些不符合本揭示内容所述的破膜模体准则的肽来说,不是对膜的活性过大而无法遮蔽,就是对膜的惰性而无法产生微脂体释放效果;据此,与该些肽连接的微脂体无法达到引信讯号释放的功效。相较于其他肽,蛙皮素2(W12)衍生物为最佳的用以制备引信讯号释放型微脂体(例如,微脂体编号:1、9、10、11、16及17)的破膜模体。因此,本研究进一步选择微脂体编号:1、6(作为实验负对照组)、10、11、16及17进行后续分析,结果分别阐述于实施例2、3及4中。
[0146] 表1-3的结果指出,即使SEQ ID NO:15-22的肽可与12E残基键结,然而,12E残基并无法遮蔽或抑制该些抗微生物肽的破膜活性。该结果总结,唯有符合本揭示内容所述的破膜模体准则的肽可经由遮蔽模体(例如12E残基)所遮蔽。除了12E残基,本实验也分析4E残基、8E残基及10E残基的遮蔽功效。结果显示,唯有12E残基具有完全遮蔽破膜活性的功效,而至少10E残基对遮蔽破膜活性功效可产生令人满意的结果(结果未显示)。因此,由该些分析数据可知,本发明用以制备引信讯号释放型微脂体的合成多肽的遮蔽模体至少包含10个E残基。表1-3的结果亦指示,仅与单一个磷酸基键结的肽(例如,SEQ ID NO:13及14的肽)的药物释放功效明显低于至少与二个磷酸基键结的肽(例如,SEQ ID NO:8、9及10的肽)。基于该结果可知,本发明合成多肽至少需要二个磷酸基方可对破膜模体的破膜活性产生遮蔽功效。
[0147] 总结上述,唯有符合本揭示内容所述的准则的肽可作为破膜模体,进而经由多谷氨酸或双(或更多)磷酸化修饰,得到可用以制备引信讯号释放型微脂体的本发明合成多肽。
[0148] 实施例2分析微脂体DDL、1-MDL及2-MDL
[0149] 如表3所总结,经光引信讯号后,微脂体1-MDL可有效释放包覆的药剂(即,DOX)。为更进一步评估1-MDL于治疗疾病的应用,本实施例将确认1-MDL的物化特性及生物活性。表4及图4-9分别阐述分析结果。
[0150] 2.1物化特性
[0151] 实施例2.1将分析合成微脂体的粒径大小、多分散性指数(polydispersity index,PDI)及表面界达电位。表4总结分析数据。
[0152] 依据表4的结果可知,动态光散射(dynamic light scattering,DLS)及低温-EM分析皆显示包含挤压完成、DOX装载、肽键结及光照射等不同时期的微脂体的粒径大小约为130纳米。然而,由于微脂体表面的肽键结及化学转态,不同时期的微脂体具有显著不同的表面界达电位。于挤压后,微脂体表面界达电位为-2.2毫伏,而DOX装载后的表面界达电位则为-2.3毫伏(表4)。未经光照射的与肽1或肽2键结的微脂体表面界达电位会负向移至-
6.7及-6.2毫伏,而于光照射后则会正向移至-2.9及-1.7毫伏(表4)。与肽键结后,微脂体的表面界达电位会由-2.3降低至-6.7毫伏,推测原因为微脂体表面与包含12谷氨酸的肽连接所造成(表4)。
[0153] 表4确认特定微脂体
[0154]
[0155]
[0156] 对照组:未装载DOX的微脂体。
[0157] DL:DOX微脂体;未与任何肽或DTT连接,且包覆DOX的微脂体。
[0158] DDL:DTT-DOX微脂体;与DTT连接,且包覆DOX的微脂体。
[0159] 1-MDL:与肽1连接,且包覆DOX的微脂体。
[0160] 2-MDL:与肽2连接,且包覆DOX的微脂体。
[0161] 2.2以萤光表达分析药物释放效率
[0162] 利用萤光去淬灭试验(fluorescence dequenching assay)来研究微脂体的DOX释放效率。图4A绘示肽基微脂体的DOX释放百分比与不同照射时间的关联性,藉以确认光活化的最佳照射时间;结果指出,3分钟的照射即足以使1-MDL光活化,并释放出包覆药物。另一方面,2-MDL光活化仅会释放15%的DOX。该结果显示,可藉由引信讯号诱发蛙皮素2的去遮蔽反应,进而释放出微脂体的包覆药剂;且蛙皮素2的破膜活性具有高度序列相关性,而非仅基于肽整体的疏水性。经照射后,无任何肽或DDL连接的DOX微脂体几乎观测不到任何释放(<5%),结果确认了无肽连接的微脂体不具光反应性。
[0163] 亦可由具时间相关性的表面界达电位改变来确认照射后,光裂解移除遮蔽模体(即,聚谷氨酸),其中1-MDL及2-MDL的表面界达电位会显著增加,而DDL则无改变(图4B)。此外,本研究亦分析照射后,微脂体完全释放DOX所需时间;结果绘示于图4C。不论培养时间多长,1-MDL、2-MDL及DDL于黑暗中皆无释放反应。然而,光照射后的1-MDL具有类一级萤光增加(释放)曲线,其需要约30分钟完成,2-MDL具有部分基本释放量,而DDL于光照射后的120分钟的培养时间内则几乎无释放反应(图4C)。基于该分析结果,所有微脂体诱发实验皆于37℃额外培养1小时,其为使微脂体释放DOX的必要条件。
[0164] 亦分析不同的肽/指质键结比例(介于1/300到1/1200之间)与诱发微脂体释放包覆物质的关联性,结果绘示于图4D。于光照射后,1-MDL具有较大的动态释放范围(由80%降低至15%),而2-MDL的释放范围则较小(由15%降低至3%)。
[0165] 接着,本实验将进一步了解光诱发肽基微脂体释放包覆药剂与温度(介于25℃到46℃之间)的关联性;结果绘示于图5。即使温度升高至46℃,所有未进行光照射的微脂体皆无显著释放;该结果指出,在未给予引信讯号前,所有肽基及对照微脂体皆具温度稳定性。
另检测该些微脂体于黑暗环境中的长期稳定性。于诸如25℃等低温环境中,1-MDL的光活化会造成较低的释放量(图5)。当温度升高后,与温度相关的引信讯号释放反应会逐渐增加,且于37℃时达到饱和状态(图5)。2-MDL呈现相似的温度相关反应,惟具有较低的释放动态范围,且其于光活化后的饱和温度为43℃,而非37℃(图5)。如图6所示,所有的微脂体皆保存于37℃培养箱,而于放置的7天内,皆未观察到明显的释放反应。
[0166] 为证实温度可控制光引信讯号型1-MDL的释放反应,利用萤光影像纪录来观测由微脂体释放的DOX。图7分别阐述投予光照射之前(小图(a))及之后(小图(b)),微脂体释放的影像筛选照片。测试管#1包含DDL,其中无DOX释放,因此其于光照射之前及之后皆无观测到萤光量。测试管#2包含1-MDL,于光照射后,具有强烈的光诱发DOX萤光量。测试管#3及#4分别显示1-MDL于光活化前及经清洁剂处理后,完全释放DOX萤光的结果。
[0167] 2.3以低温-EM分析药物释放效率
[0168] 进一步以低温-EM来检测所有微脂体的形态。在引信讯号前,如商业贩售的DOX微脂体或对照组微脂体(二者均无与肽连接),包覆DOX的微脂体皆分散良好,并呈现粒径均一的状态,且略呈椭圆形,直径约130纳米(图8,小图(a)及(b))。1-MDL及2-MDL于光活化前,形态皆无改变(图8,小图(c)及(e))。然而,1-MDL于光活化后,会释放出包覆的DOX,并形成如图8的小图(d)所示的中空微脂体。相较之下,2-MDL于光照射后,仍会包覆DOX,而无释放反应(图8,小图(f))。基于显著数量的微脂体低温-EM影像(>103微脂体),直接以低温-EM影像定量分析光诱发的微脂体释放百分比,其中1-MDL-黑暗的释放百分比为3%,而1-MDL-UV的释放百分比则为73%(结果未显示)。2-MDL-黑暗及2-MDL-UV皆具有非常低的释放百分比,分别为3%及12%(结果未显示)。
[0169] 该些结果证实由萤光去淬灭试验所得到的DOX释放百分比,与由低温-EM影像得到的个别微脂体计算结果相符合;基于该观察结果,微脂体的释放反应是属于全有或全无释放形式。
[0170] 2.4细胞摄取肽基微脂体的DOX及引信讯号释放的DOX
[0171] DOX于细胞内的分布位置显示引信讯号释放型微脂体的重要性。记录在有或无光照射的情况下,经未包覆的DOX、DDL及1-MDL处理的KB细胞的萤光影像。DOX为蒽环抗生素药物,具有膜穿透性,且对DNA具高亲和性,可阻断拓朴异构酶II(topoisomerase II)的活性。因此,未包覆的DOX可保留且集中于细胞核中,而微脂体包覆的DOX则会位于细胞质或胞内体/溶酶体中。经DDL-黑暗、2-MDL-黑暗及1-MDL-黑暗处理的细胞于细胞质具有点状DOX萤光分布,而细胞核则无;结果指出,DOX仍稳定地包覆于微脂体中(微脂体则位于胞内体中),而DOX摄取量不足有可能是因有限的胞吞再生周期所导致(结果未显示)。因此,如同未包覆的DOX,不具引信讯号释放功能的微脂体需要更高剂量及更长的微脂体降解时间,以产生相同程度的DOX摄取量(结果未显示)。相较之下,即使经1-MDL-黑暗处理的KB细胞具有与经DDL-黑暗处理的KB细胞相似的萤光表达,经1-MDL-UV处理的KB细胞具有显著的DOX摄取量,且于细胞质及细胞核皆呈现强烈的DOX萤光量(结果未显示)。1-MDL-UV定量释放包覆的DOX,扩散至KB细胞中,并使DOX的摄取量达到最大化(结果未显示)。经未包覆的DOX处理的KB细胞对DOX具有12.5μM的最大摄取量(结果未显示)。相较于未包覆的DOX,1-MDL-UV释放出相似量的DOX供细胞摄取,且具有额外的引信讯号设计开启释放。
[0172] 与该些分析数据一致,定量评估细胞的DOX剂量及后续的雕亡反应。在本实验中,是于投予或未投予光照射的情况下,以DDL、1-MDL或未包覆的DOX处理KB细胞后,利用流式细胞仪及共轭焦定量影像细胞仪进行分析,以了解细胞的DOX萤光强度(DOX摄取量)及联膜蛋白-V萤光强度(细胞雕亡程度)的关联性(结果未显示)。经DDL及1-MDL-黑暗处理的KB细胞具有较少的DOX摄取量,其凋亡程度亦较低。另一方面,1-MDL-UV定量释放大量的DOX,使细胞对DOX的摄取量达到最大化,进而造成高百分比的细胞凋亡率(结果未显示)。相同的情况亦可见于经未包覆的DOX处理的KB细胞(结果未显示)。
[0173] 2.5与剂量相关的光活化微脂体的细胞毒性
[0174] 利用MTT试验来分析在投予或未投予UV照射的情况下,经未包覆的DOX、DDL或1-MDL处理的KB细胞的剂量相关毒性,其中DOX的外显浓度(apparent concentration)是介于0.1到160μM。依据图9的数据,若以IC50来表示1-MDL-UV的细胞毒性,约为2μM,其是与DOX-黑暗(0.7μM)及DOX-UV(3μM)的毒性相似,而无引信讯号释放的微脂体(DDL-黑暗、DDL-UV及1-MDL-黑暗)则需极高的DOX外显浓度来产生相等功效(IC50>160μM)。在光照射之前,与传统DOX微脂体相似,1-MDL具有低毒性(高IC50值);而经引信讯号后,诱发的细胞毒性会提升80倍(图9)。毒性的动态范围具有于特定作用位置开启作用的潜力。该些结果指出,一旦配予引信讯号释放机制,将可扩大传统微脂体剂量的治疗窗口。
[0175] 实施例3分析微脂体3-MDL及4-MDL
[0176] 依据包含0%、1.66%、3.33%或5%PEF2000脂质的3-MDL的DOX释放动力学,于5%聚乙二醇化的3-MDL可观察到3小时的ALP处理即足以使3-MDL的释放量达到最大化(图10A)。记录投予未包覆的DOX、DDL或3-MDL的具高及低ALP表达量的HS-5及KB细胞的萤光影像,其中所有微脂体及未包覆的DOX具有12.5μM的DOX外显浓度;相较于HS-5细胞(具有低ALP表达量),3-MDL于KB细胞(具有高ALP表达量)呈现显著的释放量(结果未显示)。
[0177] 亦分析可经ALP酶引信讯号而释放的4-MDL微脂体(肽/脂质比=1/300)的最佳PEG2000脂质百分比(结果未显示)。结果指出,2%聚乙二醇化的4-MDL具有最佳的DOX释放百分比(图10B)。2%聚乙二醇化的4-MDL虽具有略高的释放量;然而,其基础释放量亦较高。由于PEG2000脂质会阻碍ALP,因此5%聚乙二醇化的4-MDL无法产生令人满意的引信讯号释放量。4-MDL的释放量较少有可能是因去磷酸化不完全所造成。
[0178] 实施例4分析微脂体5-MDL及6-MDL
[0179] 将REF52细胞(低MMP2表达量)培养于含有未包覆的DOX或微脂体的培养液中,且该培养液(1)无包含MMP2,(2)包含商业贩售的活性MMP2(每毫升300纳克),或是(3)包含HT1080条件培养液,于37℃培养20个小时。包含DDL及5-MDL等所有微脂体,以及未包覆的DOX具有12.5μM的DOX外显浓度(结果未显示)。培养含有5-MDL(有或无PEG2000脂质)的活性MMP2或HT1080条件培养液中的所有细胞皆会释放DOX,而培养于含有DDL(有或无PEG2000脂质)的活性MMP2或HT1080条件培养液中的REF52细胞则不会释放DOX(结果未显示)。
[0180] 推测6-MDL无法产生令人满意的释放反应是由于肽6的不良释放动力学所造成(结果未显示)。
[0181] 实施例5分析包含Cy5.5或Gd3+-DTPA的微脂体
[0182] 除了DOX,也分别将诸如Cy5.5及Gd3+-DTPA等不同药剂装载于脂质与肽1键结的微脂体中。本实施例将阐述该些分析结果。
[0183] 依据低温-EM的数据,分别利用醋酸钙及蔗糖八硫酸酯铵作为捕获剂,可成功将Cy5.5包覆于微脂体中(图11)。
[0184] 此外,可藉由200mM Gd3+-DTPA对脂质膜进行水合反应,将Gd3+-DTPA被动装载于微脂体中。表5列示Gd3+-DTPA微脂体的详细尺寸及表面界达电位。
[0185] 表5在有或无光照的情况下,特定微脂体的流体动力学直径及表面界达电位[0186]
[0187]
[0188] GL:Gd3+-DTPA微脂体;DGL:与DTT键结的Gd3+-DTPA微脂体;1-MGL:与肽1键结的Gd3+-DTPA微脂体。
[0189] 图12A及12B的结果指出,相较于DGL,1-MGL经光诱发释放后,在T1-加权迟豫率(图12A)及T1-图谱讯号(图12B)皆可强烈增加Gd3+-DTPA对比度。
[0190] 总结上述,本揭示内容提供数种类型的分别与特定多肽连接的微脂体。一旦经由适当引信讯号(举例来说,光或酶)活化后,本发明微脂体可将包覆药剂或分子释放于靶向位置。因此,本发明微脂体可以更安全且准确的方法诊断或治疗疾病。
[0191] 虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例,然其并非用以限定本发明,本发明所属技术领域中具有通常知识者,在不悖离本发明的原理与精神的情形下,当可对其进行各种更动与修饰,因此本发明的保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。
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