技术领域
[0001] 本
发明属于宠物抗体保存技术领域，具体涉及一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂及其制备方法。
背景技术
[0002] 人们生活
水平提高的同时精神追求也不断刷新，尤其是社会空巢老人及丁克家族的增多，提升了宠物人类精神伴的地位，据2018年中国宠物白皮书统计，犬是人们饲养需求最多的一类宠物，养犬业的发展，随之而来的犬细小病毒病的防治也必须提上日程。
[0003] 犬细小病毒(CPV)对犬具有高度的
接触性传染性，各种年龄的犬均可感染，尤以刚断乳至90日龄的犬发病较多，病情也较严重。临床来看本病一年四季均可发生，病犬的
粪便中含毒量最高。目前该病还没有有效的
治疗方法和药物，常用的单克隆抗体和血清，保存期短，仅适合初期或者成犬使用，中期后效果并不明显，因此开发CPV抗体及其辅助诊断、治疗及保存新型
试剂将有助于该病的防治。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂的制备方法，解决现有犬细小病毒精制卵黄抗体低温冷冻保存，长途运输不方便等难题。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂，缓解
现有技术造成的免疫应激反应大，
疫苗空窗期发病等问题。
[0006] 为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂，该冻干剂有效组分及其重量份数比为：黄芪多糖30-50份、
蔗糖15-40份、海藻糖5-15份、蜂胶2-5份、谷
氨酸1-5份、聚乙烯吡咯烷
酮1-2份、维生素C0.5-1份、大豆蛋白胨1-5份。
[0008] 一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂，其特征在于：该制备方法的步骤为：
[0009] (1)按照重量配比分别称取黄芪多糖、蔗糖、海藻糖、蜂胶、谷氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、维生素C、大豆蛋白胨，溶于45-65℃蒸馏水中得溶液A；
[0010] (2)将步骤(1)中溶液A在120℃下高压灭菌15-30分钟，2-8℃保存，得冻干剂；
[0011] (3)步骤(2)中所得冻干剂与犬细小病毒精制卵黄抗体溶液比为按体积比1：5-1：9充分混匀，冻干处理，即得本发明一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂。
[0012] 作为优选，步骤(3)中所述犬细小病毒卵黄抗体的制备方法的步骤为：
[0013] a.取未经免疫的23周龄健康产蛋鸡，对其进行犬细小病毒弱毒疫苗3次免疫注射，免疫间隔为7天，用量0.5ml/只/次，检测血清抗体效价至1:256时收集高免蛋；
[0014] b.取步骤(3)-a所得高免蛋，用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环
氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆；
[0015] C.对步骤(3)-b中所得卵黄匀浆中添加1.5倍体积的生理盐水和浓度为0.1％的正辛酸，边加边搅拌0.5～1.5小时，室温放置2～6小时后，以4200～5500r/min的转速离心30min，丢弃沉淀，在上清液中加入1.2％
硫酸酯葡聚糖，搅拌10-20分钟，用孔径5μm和1μm的筒式
滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kD的中空
纤维超滤柱进行浓缩3～4倍后再用NaOH调整PH值为6.8～7.0，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌，得抗体效价1:256的滤液，即犬细小病毒精制卵黄抗体溶液。
[0016] 本发明的优点及有益效果在于：
[0017] 1、本发明降低了产品的冷链运输和存储要求，增加了宠物免疫使用的便利性。
[0018] 2、本发明冻干剂中黄芪多糖等成分可增强犬免疫
力，降低继发感染其他
疾病的
风险。
具体实施方式
[0019] 本发明通过以下
实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0020] 本发明所涉及的犬细小病毒疫苗，黄芪多糖，蔗糖、海藻糖、蜂胶、谷氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、维生素C、大豆蛋白胨均可以在市场上购买得到。
[0021] 实施例1
[0022] 一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂，该冻干剂有效组分及其重量份数比为：黄芪多糖30g、蔗糖15g、海藻糖5g、蜂胶2g、谷氨酸1g、聚乙烯吡咯烷酮1g、维生素C0.5g、大豆蛋白胨1g。
[0023] 一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂的制备方法，其制备方法的步骤为：
[0024] 1、冻干剂的制备
[0025] (1)按照重量配比分别称取黄芪多糖、蔗糖、海藻糖、蜂胶、谷氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、维生素C、大豆蛋白胨，溶于65℃蒸馏水中得溶液A；
[0026] (2)将步骤(1)中溶液A在120℃下高压灭菌15分钟，2-8℃保存，得冻干剂；
[0027] 2、犬细小病毒精制卵黄抗体溶液的制备
[0028] (1)取未经免疫的23周龄健康产蛋鸡，对其进行犬细小病毒弱毒疫苗3次免疫注射，免疫间隔为7天，用量0.5ml/只/次，检测血清抗体效价至1:256时收集高免蛋；
[0029] (2)取步骤2-(1)所得高免蛋，用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆；
[0030] (3)对步骤2-(2)中所得卵黄匀浆中添加1.5倍体积的生理盐水和浓度为0.1％的正辛酸，边加边搅拌0.5小时，室温放置2小时后，以4200r/min的转速离心30min，丢弃沉淀，在上清液中加入1.2％硫酸酯葡聚糖，搅拌10-20分钟，用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩3倍后再用NaOH调整PH值为6.8，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌，得抗体效价1:256的滤液，即犬细小病毒精制卵黄抗体溶液。
[0031] 3、一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂
[0032] 步骤1和步骤2中所得冻干剂与犬细小病毒精制卵黄抗体溶液比为按体积比1：5充分混匀，冻干处理，即得本发明一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂。
[0033] 实施例2
[0034] 一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂，该冻干剂有效组分及其重量份数比为：黄芪多糖50g、蔗糖40g、海藻糖15g、蜂胶5g、谷氨酸5g、聚乙烯吡咯烷酮2g、维生素C1g、大豆蛋白胨5g。
[0035] 一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂的制备方法，其制备方法的步骤为：
[0036] 1、冻干剂的制备
[0037] (1)按照重量配比分别称取黄芪多糖、蔗糖、海藻糖、蜂胶、谷氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、维生素C、大豆蛋白胨，溶于65℃蒸馏水中得溶液A；
[0038] (2)将步骤(1)中溶液A在120℃下高压灭菌30分钟，2-8℃保存，得冻干剂；
[0039] 2、犬细小病毒精制卵黄抗体溶液的制备
[0040] (1)取未经免疫的23周龄健康产蛋鸡，对其进行犬细小病毒弱毒疫苗3次免疫注射，免疫间隔为7天，用量0.5ml/只/次，检测血清抗体效价至1:256时收集高免蛋；
[0041] (2)取步骤2-(1)所得高免蛋，用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆；
[0042] (3)对步骤2-(2)中所得卵黄匀浆中添加1.5倍体积的生理盐水和浓度为0.1％的正辛酸，边加边搅拌1.5小时，室温放置6小时后，以5500r/min的转速离心30min，丢弃沉淀，在上清液中加入1.2％硫酸酯葡聚糖，搅拌20分钟，用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩4倍后再用NaOH调整PH值为7.0，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌，得抗体效价1:256的滤液，即犬细小病毒精制卵黄抗体溶液。
[0043] 3、一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂
[0044] 步骤1和步骤2中所得冻干剂与犬细小病毒精制卵黄抗体溶液比为按体积比1：9充分混匀，冻干处理，即得本发明一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂。
[0045] 实施例3犬细小病毒精制卵黄抗体溶液的制备
[0046] (1)取未经免疫的23周龄健康产蛋鸡，对其进行犬细小病毒弱毒疫苗3次免疫注射，免疫间隔为7天，用量0.5ml/只/次，检测血清抗体效价至1:256时收集高免蛋；
[0047] (2)取步骤2-(1)所得高免蛋，用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆；
[0048] (3)对步骤2-(2)中所得卵黄匀浆中添加1.5倍体积的生理盐水和浓度为0.1％的正辛酸，边加边搅拌1.5小时，室温放置6小时后，以5500r/min的转速离心30min，丢弃沉淀，在上清液中加入1.2％硫酸酯葡聚糖，搅拌20分钟，用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩4倍后再用NaOH调整PH值为7.0，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌，得抗体效价1:256的滤液，即犬细小病毒精制卵黄抗体溶液。
[0049] 临床试验一
[0050] 1、试验材料：
[0051] 按实施例1制得本发明犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂，用于1组；
[0052] 按实施例3制得犬细小病毒精制卵黄抗体溶液；用于2组；
[0054] 2、本发明的使用方法：1组、2组和3组均为肌注1ml。
[0055] 3、试验分组及处理
[0056] 青岛某宠物医院3只确诊犬细小病毒的松狮犬，分别如下试验处理，结果如下表1。
[0057] 表1本发明治疗犬细小病毒效果试验
[0058]
[0059] 结论
[0060] 本发明犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂对犬细小病毒的治愈效果突出。
[0061] 临床试验二
[0062] 犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂的性状、剩余水分和抗体效价
[0063] 将犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂分别放置2-8℃和25℃环境下保存，定期观察抗体的性状、剩余水分和效力。性状、剩余水分检测方法参见现行《兽用
生物制品检验规程》，抗体效价采用双向琼脂扩散试验(AGP)：
[0064] 打孔：将制备好的琼脂板按模板用打孔器打孔，并挑出孔中的琼脂。中心1孔，周围6孔，孔径3mm，孔距4mm，用
熔化琼脂补孔底。
[0065] 加样：中央孔加入标准琼扩
抗原，周围孔分别加入2倍系列稀释的待检犬细小病毒精制卵黄抗体，各孔加样25μl。将加样后的琼脂板放入填有湿纱布的盒内，置20-25℃室温或37℃温箱，24h初判，72h终判。
[0066] 结果判定：待检犬细小病毒卵黄抗体与抗原孔之间也出现沉淀线，且与标准阳性血清沉淀线末端相吻合，即判为阳性。当待检犬细小病毒精制卵黄抗体与抗原孔之间无沉淀线出现时，即判为阴性。当待检犬细小病毒精制卵黄抗体最高稀释度孔与抗原孔之间形成清晰沉淀线时，即判为琼扩效价。
[0067] 结果：本发明犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂2-8℃保存12个月、25℃保存9个月，抗体物理性状保持稳定，均为微黄色疏松团
块，易与瓶壁分离；剩余水分均为2.25％左右；抗体效价均为1:128以上，未见下降(表2)。
[0068] 表2犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂检验结果
[0069]
