一种调节Allobaculum菌的凝结芽孢杆菌
阅读：750发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种调节Allobaculum菌的凝结芽孢杆菌专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种调节Allobaculum菌的 凝结 芽孢杆菌，具体涉及一种能够调节Allobaculum spp.相对丰度的凝结芽孢杆菌及其应用，属于 微 生物 技术领域。该凝结芽孢杆菌的芽孢体对模拟胃肠液有良好的耐受能 力 ，体外模拟胃肠液中芽孢萌发能力为35.32±3.4％。该凝结芽孢杆菌可制备成微生态制剂，动物实验结果表明，该微生态制剂可显著恢复小鼠肠道内保护性菌Allobaculum spp.的数量，增加小鼠 粪便 中短链 脂肪酸 的含量，在调节肠道菌群结构方面具有非常广阔的应用前景。，下面是一种调节Allobaculum菌的凝结芽孢杆菌专利的具体信息内容。
1.一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)NJ23，已于2019年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60538。
2.含有权利要求1所述凝结芽孢杆菌NJ23的微生物制剂。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物制剂包括液体制剂或固体制剂。
4.如权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，固体制剂中含有活菌数≥1010CFU/g的
7
凝结芽孢杆菌干菌体，液体制剂中含有活菌数≥10CFU/mL的凝结芽孢杆菌干菌体。
5.如权利要求2-4任一所述的微生物菌剂，其特征在于，以脱脂奶粉、海藻糖或蔗糖为保护剂。
6.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌NJ23在制备药品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药品用于调节Allobaculum spp.数量。
8.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌NJ23在制备食品、保健品或饲料中的应用。
9.权利要求2-5任一所述的微生物菌剂在制备药品中的应用。
10.权利要求2-5任一所述的微生物菌剂在制备食品、保健品或饲料中的应用。
一种调节Allobaculum菌的凝结芽孢杆菌
技术领域
背景技术
[0002] 人体肠道内分布着种类繁多、数目庞大的微生物，成人肠道内的微生物数量高达1014个，质量达到1.2kg，接近人体肝脏的质量。正常情况下，肠道微生物与宿主是互利共生的关系，人体肠道为微生物提供良好的栖息环境，肠道微生物是人体代谢和免疫屏障的重要参与者。年龄、饮食或疾病等因素会影响肠道微生物的结构组成，紊乱的肠道微生物产生的毒性代谢物会诱发免疫及代谢功能的恶化。
[0003] Allobaculum spp.是人体肠道中重要的短链脂肪酸产生菌，短链脂肪酸是肠道微生物的最终代谢产物，能通过降低肠道pH值抑制致病菌的生长，促进有益菌的增殖，从而改善肠道微环境；短链脂肪酸为肠粘膜细胞提供能量来源，促进肠上皮细胞增殖，有利于维护肠屏障，抵抗炎症。因此，Allobaculum spp.对维护肠屏障的完整性和肠道免疫系统的构建有重要作用，是肠道中的保护性菌群，肠道中Allobaculum spp.数量的减少与便秘、结肠炎、过度肥胖、重金属中毒等很多疾病紧密相关。膳食补充益生菌能通过摄入足够数量的活性益生菌制剂，改善肠道菌群的结构组成，调节肠道微生态平衡。益生菌调节肠道菌群多样性的机制包括通过定植竞争性地减少病原菌与肠黏膜的接触，同时通过产生的代谢物抑制病原菌的活性，促进有益菌的增殖。
[0004] 目前一些专利涉及到具有调节肠道菌群功能的保健食品及其制备方法，例如专利CN108018248A公开了一种干酪乳杆菌，可显著恢复小鼠体内抗生素导致的肠道菌群变化；专利CN108208843A公开了一种复合益生菌粉，该组合物能明显增加肠道中乳杆菌属和双歧杆菌属的数量；专利CN106943423A公开了一种魔芋多糖和人参多糖组合物，能显著增加小鼠肠道内拟杆菌属、乳酸菌属和双歧杆菌属的数量，有效改善脾气虚引起的肠道菌群紊乱。
但是，目前未出现涉及调节Allobaculum spp.含量的报道。
但是，目前未出现涉及调节Allobaculum spp.含量的报道。
[0005] 因此，提供一种益生菌以上调肠道中Allobaculum spp.的相对丰度，从而改善肠道菌群结构紊乱是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
[0006] 本发明的第一个目的是提供一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)NJ23，已于2019年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院
59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60538。
59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60538。
[0007] 所述凝结芽孢杆菌具有以下特性：
[0008] (1)菌落特征：在MRS培养基上生长良好，形成米黄色、不透明、圆形菌落；
[0009] (2)菌体特征：细菌形态呈杆状，两端钝圆，单个、成对或链状排列，革兰氏染色反应呈阳性，芽孢端生；
[0010] (3)菌种鉴定：进行16S rRNA基因测序，测得序列用BLAST与GenBank和RDP数据库中的基因序列进行相似性分析，确定该菌株为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans；
[0011] (4)产芽孢能力：该菌株在产孢培养基中摇瓶培养46-50h，产芽孢数量为7.79±0.01Log10cfu/mL；
[0012] (5)芽孢对模拟胃肠液耐受能力：在模拟胃液中耐受3h，继续在模拟肠液中耐受4h，存活率达68.05±1.57％；
[0013] (6)芽孢萌发能力：在体外模拟胃肠液中芽孢萌发能力为35.32±3.4％；
[0014] (7)具有增加小鼠肠道短链脂肪酸含量和上调Allobaculum spp.含量的功能。
[0015] 本发明的第二个目的是提供含有上述凝结芽孢杆菌NJ23的微生物制剂。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂包括液体制剂或固体制剂。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，固体制剂中含有活菌数≥1010CFU/g的凝结芽孢杆菌7
干菌体，液体制剂中含有活菌数≥10CFU/mL的凝结芽孢杆菌干菌体。
干菌体，液体制剂中含有活菌数≥10CFU/mL的凝结芽孢杆菌干菌体。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂的制备方法是将上述凝结芽孢杆菌在MRS培养基中活化培养，将活化的菌种以1-4％的接种量接种至产孢培养基中，在35-42℃下，180-250r/min摇瓶培养45-50h后，在80-85℃下水浴加热10-15min后，5500-6000g离心10-15min取沉淀，用无菌生理盐水洗涤2-3次后收集芽孢体，得到凝结芽孢杆菌芽孢体微生态制剂；或者将收集得到的上述芽孢体用保护剂重悬，喷雾干燥或冷冻干燥得到凝结芽孢杆菌芽孢粉微生态制剂。
[0020] 本发明的第三个目的是提供上述的凝结芽孢杆菌NJ23在制备药品中的应用。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述药品用于调节Allobaculum spp.数量。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述药品用于增加肠道中的短链脂肪酸。
[0023] 本发明的第四个目的是提供上述的凝结芽孢杆菌NJ23在制备食品、保健品或饲料中的应用。
[0024] 本发明的第五个目的是提供上述的微生物菌剂在制备药品中的应用。
[0025] 本发明的第六个目的是提供上述的微生物菌剂在制备食品、保健品或饲料中的应用。
[0026] 本发明提供了一种凝结芽孢杆菌NJ23，其产芽孢能力强，芽孢体对模拟胃肠液有良好的耐受能力，体外模拟胃肠液中芽孢萌发能力为35.32±3.4％。该凝结芽孢杆菌可制备成微生态制剂，动物实验结果表明，凝结芽孢杆菌NJ23能增加小鼠肠道中保护性菌Allobaculum spp.的相对丰度。其中凝结芽孢杆菌NJ23的效果更显著(p<0.05)，其对Allobaculum spp.的恢复能力显著好于凝结芽孢杆菌WX12和凝结芽孢杆菌LY11(p<0.05)，可以增加小鼠粪便中短链脂肪酸的含量，在调节肠道菌群结构方面具有非常广阔的应用前景。
[0027] 生物材料保藏
[0028] 凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)NJ23，分类命名为Bacillus coagulans，已于2019年01月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.60538。附图说明
[0029] 图1为凝结芽孢杆菌NJ23菌落形态。
[0030] 图2为凝结芽孢杆菌NJ23芽孢菌体形态，10×目镜，100×油镜观察。
[0031] 图3为凝结芽孢杆菌在模拟胃肠环境中的萌发曲线。
具体实施方式
[0033] (一)培养基
[0034] MRS培养基的配方为：在1L蒸馏水中加入10g蛋白胨、10g牛肉膏、20g葡萄糖、5g酵母浸膏、2g无水乙酸钠、0.25g一水硫酸锰、1mL吐温80、2.6g三水合磷酸氢二钾、0.5g七水硫酸镁、2g柠檬酸二铵，调pH至6.8。
[0035] 产孢培养基的配方为：在1L蒸馏水中加入0.7g酵母膏、1g蛋白胨、1g葡萄糖、0.2g硫酸铵、0.2g七水硫酸镁、1g磷酸氢二钾。
[0036] 实施例1凝结芽孢杆菌产芽孢能力
[0037] (1)菌种活化
[0038] 将凝结芽孢杆菌WX12、LY11或NJ23以2mL/100mL的接种量接种至MRS培养基中，在37℃下，培养18h，得到活化的凝结芽孢杆菌菌种，连续活化2代。凝结芽孢杆菌NJ23的菌落特征为在MRS培养基上生长良好，形成米黄色、不透明、圆形菌落(见图1)。菌体特征为细菌形态呈杆状，两端钝圆，单个、成对或链状排列，革兰氏染色反应呈阳性，芽孢端生(图2)。
[0039] (2)制备芽孢体
[0040] 将活化的上述菌种以2mL/100mL的接种量接种至产孢培养基中，在37℃下，250r/min摇瓶培养48h后，在85℃下水浴加热13min后，梯度稀释，MRS培养基倾注计数。
[0041] 表1凝结芽孢杆菌产芽孢能力
[0042]
[0043] 注：肩标的不同字母a-c表示不同组之间存在显著差异(p<0.05)。
[0044] 表1中的计数结果表明，相同条件下凝结芽孢杆菌NJ23产生的芽孢数量显著高于凝结芽孢杆菌WX12和LY11(p<0.05)，证明凝结芽孢杆菌NJ23产芽孢能力较强，具有开发为芽孢微生态制剂的潜力。
[0045] 实施例2凝结芽孢杆菌芽孢体对模拟胃肠液的耐受能力
[0047] 配制模拟肠液：将0.1g胰蛋白酶(1:250，Sangon)和0.3g胆盐(BIOLEAF)溶于100mL无菌生理盐水(pH调至8.0)，用0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。
[0048] 芽孢体按实施例1的方法制备，6000g离心10min弃上清，用无菌生理盐水洗涤3次，重悬于无菌生理盐水至芽孢浓度为1×107cfu/mL，得到初始芽孢液。取5mL初始芽孢液离心弃上清，用5mL模拟胃液重悬，37℃孵育3h，离心弃上清，用5mL模拟肠液重悬，37℃孵育4h后取0.5mL梯度稀释，用MRS培养基进行平板菌落计数，并计算存活率。
[0049] 表2凝结芽孢杆菌芽孢耐受模拟胃肠液能力
[0050]
[0051] 如表2所示，初始浓度为1×107cfu/mL的凝结芽孢杆菌芽孢耐受模拟胃肠液后，存活率较高，三株菌差异不显著。证明凝结芽孢杆菌芽孢体对胃肠环境具有较好的耐受能力，为其在肠道中存活并发挥益生作用提供了基础。
[0052] 实施例3凝结芽孢杆菌芽孢体在模拟胃肠环境中的萌发能力
[0053] 凝结芽孢杆菌芽孢体基本无代谢作用，只保持潜在的萌发力，萌发为营养细胞后，通过生长繁殖产生的代谢物发挥益生作用，因此，本实施例测定了凝结芽孢杆菌芽孢体在模拟胃肠环境中的萌发能力。
[0054] 芽孢本身具有高度的折光性，芽孢一旦萌发折光性立即随之消失，分光光度计检测600nm波长处的光密度变化，反映群体芽孢平均萌发情况的萌发率。模拟胃肠液的制备同实施例2，芽孢体按实施例1的方法制备，6000g离心10min弃上清，用无菌生理盐水洗涤3次，重悬于无菌生理盐水至芽孢浓度为1×107cfu/mL，得到芽孢悬液。取5mL芽孢悬液离心重悬于模拟胃液中，37℃下孵育，每60min检测一次OD值，3h后离心洗涤2次，重悬于5mL模拟肠液中，37℃下孵育4h，每20min检测一次OD值。全萌发时OD值下降约40-50％，萌发率＝(OD初始值-OD终止值)/OD初始值×2×100％。
[0055] 表3凝结芽孢杆菌芽孢萌发能力
[0056]
[0057] OD值下降曲线见图3，结果表明，凝结芽孢杆菌芽孢在模拟胃液中基本不萌发，转移到模拟肠液中启动萌发反应，400min左右萌发完成，三株凝结芽孢杆菌萌发过程相似，萌发能力见表3，萌发率较高，三株菌差异不显著。表明凝结芽孢杆菌芽孢体在胃中基本不萌发，保护菌体抵抗胃酸等的胁迫，进入肠道后迅速萌发，发挥益生作用。
[0058] 实施例4凝结芽孢杆菌芽孢体对Allobaculum spp.的调节能力
[0059] 7周龄雄性SPF级BALB/c小鼠30只，随机分成空白组、造模组、凝结芽孢杆菌WX12组、凝结芽孢杆菌LY11组和凝结芽孢杆菌NJ23组，每组6只。适应7天后，空白组每天灌胃无菌生理盐水，其余4组小鼠灌胃盐酸洛哌丁胺(10mg/kg b.w)，造成小鼠胃肠运动抑制模型，1h后空白组和造模组灌胃无菌生理盐水，凝结芽孢杆菌治疗组灌胃凝结芽孢杆菌芽孢(5×
108cfu/mL)，灌胃体积均为0.2mL，连续14天。其中凝结芽孢杆菌芽孢为实施例1的方法制备。
108cfu/mL)，灌胃体积均为0.2mL，连续14天。其中凝结芽孢杆菌芽孢为实施例1的方法制备。
[0060] 第14天收集小鼠粪便后，应用16S rDNA 测序技术对小鼠粪便中的Allobaculum spp.进行分析。
[0061] 表4各组小鼠粪便中Allobaculum spp.的相对丰度
[0062]组别 相对丰度％
空白组 0.0043±0.0034bc
模型组 0±0a
凝结芽孢杆菌WX12 0.0013±0.003ab
ab
凝结芽孢杆菌LY11 0.0012±0.0027
凝结芽孢杆菌NJ23 0.0053±0.0035c
空白组 0.0043±0.0034bc
模型组 0±0a
凝结芽孢杆菌WX12 0.0013±0.003ab
ab
凝结芽孢杆菌LY11 0.0012±0.0027
凝结芽孢杆菌NJ23 0.0053±0.0035c
[0063] 注：肩标的不同字母a-c表示不同组之间存在显著差异(p<0.05)。
[0064] 结果如表4所示，表明凝结芽孢杆菌能增加小鼠肠道中保护性菌Allobaculum spp.的相对丰度。其中凝结芽孢杆菌NJ23的效果更显著(p<0.05)，其对Allobaculum spp.的恢复能力显著好于凝结芽孢杆菌WX12和凝结芽孢杆菌LY11(p<0.05)。
[0065] 实施例5凝结芽孢杆菌芽孢体对小鼠肠道中短链脂肪酸含量的影响[0066] Allobaculum spp.是重要的短链脂肪酸产生菌，对维护肠屏障的完整性和肠道免疫系统的构建有重要作用，本实施例检测了灌胃凝结芽孢杆菌后动物肠道内短链脂肪酸的含量。动物实验设计同实施例4。第14天收集小鼠粪便后，使用气质联用仪测量小鼠粪便中的短链脂肪酸的含量。
[0067] 表5各组小鼠粪便中短链脂肪酸的含量
[0068]
[0069] 注：同行肩标的不同字母a-c表示不同组之间存在显著差异(p<0.05)。
[0070] 结果如表5所示，表明凝结芽孢杆菌能增加小鼠肠道中乙酸、丙酸、丁酸和总短链脂肪酸的含量。其中凝结芽孢杆菌NJ23的效果更显著(p<0.05)。结果证明，本发明的凝结芽孢杆菌NJ23芽孢制剂能通过增加肠道中Allobaculum spp.的数量，增加短链脂肪酸的产量，发挥肠道益生功效。
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