SPA-抗体三聚体、含有该三聚体的细胞处理试剂盒及其制
备方法和用途
技术领域
[0001] 本 发 明涉 及 生 物 医 学 技 术 领 域，特 别 是 涉 及葡 萄 球 菌 A蛋 白(staphylococalprotein A，以下简称SPA)-抗体三聚体及基于该聚体的细胞处理试剂盒及其制备方法和用途。技术背景
[0002] SPA能与人及多种
哺乳动物血清IgG分子中的Fc
片段结合。结合的
亲和性次序依次是猪、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及
牛。SPA除与IgG结合外，还能与血清中少量的IgM和IgA结合，SPA菌对各类免疫球蛋白的
吸附率：IgG为90％～98％，IgM为2％～30％，IgA为1.5％～20％。
[0003] 出现共沉反应的SPA与IgG必须有两个结合部位，它们分别在Fc和Fab段上，缺一虽能与SPA结合，但不出现共沉反应，这种Fab的参与并非SPA-抗体反应。现已研究表明，IgG与SPA的结合部位是CH2和CH3的交界处。
[0004] SPA应用很广，但所有应用的原理都离不开SPA具有与IgG的Fc段的结合能
力，主要应用方面如下：
[0005] 1.SPA菌的协同凝集作用
[0006] 用已知的标准血清，吸附到SPA菌的表面，使之成为吸附抗体的载体，再以此去诊断相应的未知
抗原而产生肉眼可见的凝集颗粒，诊断的抗原可以是颗粒性的，也可以是可溶性的。此种凝集相当于反向间接血凝，但省去间接血凝中的抗体纯化，红血球鞣化等复杂手续，而只需要SPA菌体及粗制免疫血清即可。所以此法简单、快速，特异性敏感性均较满意。
[0007] 2.作为广谱第二抗体
[0008] 用SPA代替抗体IgG的第二抗体，有如下优点：①SPA制备容易，性质稳定，易纯化，对人和多种哺乳动物的IgG都能应用，不受种属限制。②SPA的结合力强，相当于游离抗3
体与抗原的结合力，对人和兔的亲和常数均为10L/克分子，结合后对IgG的活性无影响。
无论在0℃、37℃、44℃及56℃几乎均能立即结合而无需长时间的孵育，因此可以缩短试验
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时间；③SPA容易标上 I、
荧光素、辣根过
氧化物酶、
铁蛋白等，因此可与多种技术相结合；
④SPA分子高度均一，它不是免疫球蛋白，不受Fc受体影响，所以有较高的抗IgG特异性。
[0009] 3.用于提取纯化IgG利用SPA与IgG的结合特性提取IgG，比常规采用
硫酸铵、Sephadex柱，DEAE柱或免疫梯度离心等法要简便得多，而且纯度好。
[0010] 4.检测和提纯IgM IgM在病毒的早期诊断中具有重要意义，为了检测特异性IgM抗体，必须首先在血清中除去IgG。采用SPA菌吸附IgG是目前快速而又理想的办法，利用此法也为IgM的提纯开辟了道路。
[0011] 5.其它方面用于免疫复合物的检测、体外激活补体功能试验、细胞表面标记以及
肿瘤表面抗原的检测等。
[0012] 干细胞(stem cell)是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能分化出至少一种高度分化子代细胞的细胞。根据细胞来源将干细胞分成胚胎性干细胞和成体干细胞，而成体干细胞包括自体干细胞和异体干细胞。
[0013] 目前国内外的最新进展促使“骨髓干细胞”移植血管新生的作用机理、
机体内环境对干细胞疗效的影响以及转基因骨髓源干细胞的作用进行进一步的研究，以提高干细胞的
治疗效果。
[0014] 临床上的治疗过程中主要采集骨髓或外周血来源的单个核细胞进行移植，并认为其中的CD34+或CD133+/VEGF-R2+细胞为血管新生的干/祖细胞，但这类细胞的增殖分化功能、他们的归巢到血管损伤部位的能力以及达到治疗效果的有效数量等都是尚未充分了解的内容。
[0015] 表面抗原(Lineage surface antigen)是当干细胞分化为各系的祖细胞和成熟细胞时，会出现各系的专一性标志，如淋巴系CD19\CD7\粒细胞系CD13、CD11、CD15、CD16，红细胞系的CD47、CD51、CD71，巨核细胞系的CD31\CD41\CD42\CD61\CD63\CD107，T\NK系的CD2\CD25\CD7，这些在特定类型的血细胞表面出现的抗原通称为系表面抗原，Lin抗原阳性就可以确定为祖细胞和成熟细胞，还有许多Lin抗原阴性的细胞称之为原始干细胞，如CD34\CD133\SCA-1\CD38等等。我们可以根据各科室不同要求去除相关的成熟细胞系。
[0016] 干细胞能有效治疗各种细胞损伤性
疾病，这已是全世界主流医学界公认的事实。但是如何得到干细胞，如何分离、纯化取得存活的、很理想的干细胞是全世界科学家共同研究的课题。目前从骨髓、脐带血中分离提取干细胞的技术有很多，如：免疫
磁珠法和流式细胞仪法等。这些方法所存在的共同问题是：第一不能有效保留所有类型的干细胞，第二造价贵，技术条件要求较高。在临床推广应用上有一定的难度。
发明内容：
[0017] 本发明提供了一种将血液中红细胞和其他细胞/因子结合的中介物：spa-抗体三聚体，通过该三聚体可以将红细胞和所需要的白细胞或其他细胞/因子结合，通过血沉或梯度离心等方法可以将血液中的特定细胞/因子去除。
[0018] 本发明的技术方案为：
[0019] 1.Spa-抗体三聚体及其制备方法：
[0020] 材料：重组SPA；A抗体：抗红细胞单克隆或多克隆抗体；B抗体：可根据临床和实验需要选用不同的单克隆或多克隆抗体，如：特异性淋巴细胞抗体(抗cd2抗体、抗cd3抗体、抗cd4抗体、抗cd11抗体、抗cd15抗体、抗cd16抗体、抗cd8抗体、抗cd19抗体、抗cd5抗体、抗cd7抗体、抗cd13抗体、抗cd33抗体、抗cd10抗体、抗cd21抗体、抗cd22抗体、抗cd23抗体、抗cd32抗体、抗cd35抗体、抗40cd抗体、抗cd45抗体、抗cd54抗体、抗cd56抗体、抗cd64抗体、抗cd133抗体、抗cd117抗体、抗cd90抗体)、抗
马立克氏病毒抗体、抗HBS抗体、抗
猪瘟病毒抗体、抗副溶血性弧菌抗体、抗伤寒抗体等。
[0021] Spa以无菌PBS液稀释，将A抗体(抗红细胞单克隆抗体或多克隆抗体)和B抗体以抗体稀释液稀释，各种稀释浓度均可(推荐spa为0.1mg/ml，抗体浓度：0.1mg/ml稀释)。
[0022] 原料
质量配比为：SPA∶A抗∶B抗为1.5∶1∶1；如：SPA为1.5ml，A抗为1ml，B抗为1ml。(浓度均为0.1mg/ml)
[0023] 反应
温度4℃～40℃等均可，较佳反应温度为室温～40℃，推荐37℃温育(
水浴或温箱均可)。
[0024] 反应时间：20分钟～12小时，较佳反应时间为30分钟～3小时，推荐37℃温育30分钟。
[0025] 产物浓度：0.1mg/ml。
[0026] 贮存条件：4℃贮存。
[0027] 该三聚体可以用于从人类骨髓和脐带血中分离有核细胞的体外分离试剂盒等，该技术具有方法简单，造价低廉，可以工业化生产，易于推广的特点。该技术有效的去除了
血浆、红细胞、血小板、血浆蛋白、离子，以及其他所需要去除德成熟的单核细胞、淋巴细胞、多核细胞，而保留了所有的干细胞、祖细胞、间充质干细胞等。这是一种可以直接用于临床分离、提取干细胞的骨髓/脐带/外周血干细胞体外分离试剂盒的应用方法。
[0028] 2、细胞处理试剂盒：基于上述三聚体，结合淋巴细胞分离液，抗体结合的层析板，采用
密度梯度离心法、
免疫层析法及免疫共沉淀法相结合的方法，制作细胞处理试剂盒。其特征在于该试剂盒中包含有：
[0029] SPA(葡萄球菌蛋白A)和红细胞抗体、特异性淋巴细胞抗体的三聚体。SPA和抗红细胞单克隆抗体和各种抗淋巴细胞抗体的反应浓度均为0.1～1mg/ml。SPA为1.5ml，抗红细胞单克隆抗体为1ml，抗淋巴细胞抗体为1ml。37℃水浴箱内温育30～60分钟。调整Spa-抗体三聚体浓度为1μg/ml，体积为100ml，PH7.4。4℃保存。
[0030] 淋巴细胞分离液(市售)50ml。
[0031] 抗体结合的层析板：聚苯乙烯材料的层析板，消毒灭菌后加入抗特异性淋巴细胞抗体0.1～1mg/ml，铺满表面即可，37℃反应30～60分钟，4℃保存。
[0032] 上述各试剂溶液分开存放。
[0033] 本发明采用密度梯度离心法、免疫层析法及免疫沉淀法相结合的方法，所收集提取的干细胞/祖细胞无任何外来的标记物。可以根据不同的要求去除了不同的成熟淋巴细胞系，方便简单，可直接用于临床、实验室分离、提取干细胞/祖细胞。
[0034] 3、Spa-抗体的应用范围：
[0035] 用于临床诊断作为指示剂，当某种疾病患者血液中出现特殊抗原或外来抗原，将该抗原的特异性抗体连接在Spa-抗体三聚体上，使红细胞作为指示剂，凝聚形成“红细胞—抗红细胞抗体—Spa—特异性抗体-—特异性抗原”复合物，类似花环样结构，可以肉眼观察到凝聚物或
显微镜观察到花环结构，作为临床或实验室诊断使用。
[0036] 可通过Spa-抗体和特异性抗体结合，形成“红细胞—抗红细胞抗体—Spa—特异性抗体”复合物，通过离心等方法使特异性抗体和红细胞结合后去除。可去除患者或实验用血液中特异抗体。
[0037] 可用于临床干细胞/祖细胞的提取和纯化试剂盒中，用以提纯干细胞/祖细胞，增加干细胞/祖细胞浓度，提高疗效。具体步骤：将特异性的成熟细胞系的抗体连接到Spa-抗体上，形成“红细胞—抗红细胞抗体—Spa—淋巴细胞抗体—成熟淋巴细胞”，通过离心等方法去除成熟淋巴细胞系等，使干细胞/祖细胞得到纯化，提高浓度，可用于相应的干细胞/祖细胞的临床治疗和实验研究中。
[0038] 4、细胞处理试剂盒的应用范围：
[0039] 细胞处理试剂盒可用于骨髓血/脐带血/外周血的干细胞/祖细胞的提取和纯化，具体应用方法为：首先将外周血、骨髓或脐带血加入放有层析板的试剂瓶中，再将SPA-抗体三聚体液倒入其中，静置20分钟后收取上清液，将上清液小心的加入到淋巴细胞分离液上面，后离心20～30分钟，收取细胞层，用注射用
葡萄糖盐水稀释即可使用。
[0040] 该细胞处理试剂盒也可用于临床干细胞治疗，自体骨髓血回输等治疗；也可用于实验中，操作简单，
费用低，并可通过去除相应的血液成分，用于研究不同成熟细胞系及其他细胞/细胞因子等成分对干细胞/祖细胞的生长和分化的影响。具体实施方式：
[0041] 下述
实施例将有助于进一步理解本发明，但不能限制本发明的内容。
[0042] 实施例1：细胞处理试剂盒
[0043] 1、SPA(葡萄球菌蛋白A)和红细胞抗体、特异性淋巴细胞抗体的三聚体。该三聚体制备过程：SPA和抗红细胞单克隆抗体和抗cd3抗体、cd14抗体、cd19抗体、cd56抗体的反应浓度均为0.1mg/ml。SPA为1.5ml，抗红细胞单克隆抗体为1ml，抗cd3抗体、cd14抗体、cd19抗体、cd56抗体各为0.25ml。37℃水浴箱内温育30分钟。加入PBS液，调整Spa-抗体三聚体浓度为1μg/ml，体积为100ml，PH7.4。4℃保存。
[0044] 2、人淋巴细胞分离液(市售)100ml，离心密度为1.077g/ml。
[0045] 3、细胞层析板：聚苯乙烯材料的层析板，消毒灭菌后加入浓度为0.1mg/ml抗cd3抗体、cd14抗体、cd19抗体、cd56抗体，铺满表面即可，37℃反应30分钟后室温下过夜，置在500ml试剂瓶内。4℃保存。
[0046] 所用材料通过过滤除菌，材料经过120摄氏度，30分钟高温高压灭菌，试剂经过滤除菌，无菌操作制备后，分别存放在试剂盒中。
[0047] 细胞处理试剂盒应用方法：取外周血、骨髓或脐带血200ml，加入到放有层析板的试剂瓶中，再加50mlSPA-抗体三聚体混匀后37度静置30分钟，该三聚体分别和白细胞、红细胞结合，形成细胞团，沉淀到试管底部。部分未结合的成熟的细胞系和层析板上的抗体结合形成抗原抗体复合物。收集上清液。将淋巴细胞分离液加到离心管中，再把上面收集的上清液小心加到淋巴细胞分离液上面，700g离心20分钟，将残存的红细胞、血小板、血浆以及未沉淀的白细胞红细胞聚合体利用密度梯度离心法除去，收取细胞层，用
磷酸缓冲液(PBS)清洗2-3次，然后用注射用生理盐水/葡萄糖盐水稀释备用。
[0048] 所制备的细胞可用于临床自身骨髓血干细胞治疗，将经上述过程提取的干细胞/祖细胞稀释后经血管介入注射到肝硬化病人的肝脏内治疗肝硬化。可将提取后的自身骨髓血干细胞或脐带血干细胞注射到糖尿病足患者的下肢血管周围以及注射到狭窄或闭塞动脉的远端，治疗糖尿病足。也可将提取纯化后的自身骨髓血干细胞或脐带血干细胞注射到急性脊髓损伤患者的脊髓断伤处，治疗急性脊髓横断。也可用于其它细胞损伤性疾病。
[0049] 实施例2：细胞处理试剂盒
[0050] 1、SPA(葡萄球菌蛋白A)和红细胞抗体、特异性淋巴细胞抗体的三聚体。该三聚体制备过程：SPA和抗红细胞单克隆抗体和抗cd3抗体、cd14抗体、cd19抗体、cd56抗体的反应浓度均为0.1mg/ml。SPA为1.5ml，抗红细胞单克隆抗体为1ml，抗cd3抗体、cd14抗体、cd19抗体、cd56抗体为0.25ml。37℃水浴箱内温育30分钟。加入PBS液，使Spa-抗体三聚体浓度为1μg/ml，体积为100ml，PH7.4。4℃保存。
[0051] 2、淋巴细胞分离液100ml：0.3％的泛影酸钠和8％的聚
蔗糖400#组成的水溶液，密度为1.077g/ml。
[0052] 3、抗体结合物：将抗cd3抗体、cd14抗体、cd19抗体、cd56抗体和聚苯乙烯材料的纳米颗粒混合。抗体浓度为0.1mg/ml，体积为1ml，聚苯乙烯颗粒为10mg。37℃水浴箱内温育1小时后室温过夜。4℃保存。
[0053] 所用材料通过过滤除菌，材料经过120摄氏度，30分钟高温高压灭菌，试剂经过滤除菌，无菌操作制备后，分别存放在试剂盒中。
[0054] 细胞处理试剂盒应用方法：取骨髓或脐带血200ml加入含抗体结合物的试剂瓶中，再加50mlSPA-抗体三聚体混匀后37℃静置30分钟，该三聚体分别和白细胞、红细胞结合，形成细胞团，沉淀到试管底部。部分未结合的成熟白细胞和抗体结合物上的抗体结合形成小颗粒悬浮。收集上清液。将淋巴细胞分离液加到离心管中，再把上面收集的细胞悬浮液小心加到淋巴细胞分离液上面，2000转/分离心20分钟，将残存的红细胞、血小板、血浆和抗体结合物利用密度梯度离心法除去，收取细胞层，用磷酸缓冲液(PBS)清洗2-3次，然后用注射用生理盐水/葡萄糖盐水稀释后备用。
[0055] 使用本试剂盒制备的细胞可用于临床自身骨髓血干细胞治疗，将经上述过程提取的干细胞/祖细胞稀释后经血管介入注射到肝硬化病人的肝脏内治疗肝硬化。可将提取后的自身骨髓血干细胞或脐带血干细胞注射到糖尿病足患者的下肢血管周围以及注射到狭窄或闭塞动脉的远端，治疗糖尿病足。也可将提取纯化后的自身骨髓血干细胞或脐带血干细胞注射到急性脊髓损伤患者的脊髓断伤处，治疗急性脊髓横断。也可用于其它细胞损伤性疾病。
[0056] 实施例3：Spa-抗体
[0057] 鸡马立克氏病(MD)是由马立克氏病毒引起的一种高度
接触传染的淋巴细胞增生性疾病。其主要特征是：周围神经、各种脏器、虹膜和
皮肤等发生淋巴细胞浸润和形成肿病。马立克氏病主要发生于鸡，也有发生于火鸡、野鸡、鸭、鹌鹑、天鹅等禽类的报道。该病传染性强，传播速度快，潜伏期长。急性发病鸡淘汰及死亡率达10％~80％。迄今为止，在马立克氏病的诊断上，除AGPT外，尚没有一种能在
基层便于应用的实用技术。
[0058] SPA(葡萄球菌蛋白A)和红细胞抗体、抗马立克氏病毒抗体的三聚体。该三聚体制备过程：SPA和抗红细胞单克隆抗体和抗马立克氏病毒抗体的反应浓度均为0.1mg/ml。SPA为1.5ml，抗红细胞单克隆抗体为1ml，抗马立克氏病毒抗体1ml。37℃水浴箱内温育60分钟。Spa-抗体三聚体浓度为0.1mg/ml，PH7.4。4℃保存。
[0059] 使用时，该三聚体稀释到1∶1000工作浓度，即0.1μg/ml，取血样，加入三聚体后37℃水浴箱内温育1小时，取样本在显微镜下观察，以生理盐水作为对照，有聚集现象者为阳性，即感染了马立克氏病毒。
[0060] 实施例4：Spa-抗体
[0061] 猪瘟(SwnieFever，SF)是猪的一种高度接触性传染病。是由
猪瘟病毒(ClassiealWSnieFeverviurs，CSFV)引起的猪的一种急性、亚急性、慢性及典型、非典型的疾病过程，是危害养猪业的主要传染病之一。
[0062] SPA(葡萄球菌蛋白A)和红细胞抗体、抗猪瘟病毒抗体的三聚体。该三聚体制备过程：SPA和抗红细胞单克隆抗体和抗猪瘟病毒抗体的反应浓度均为0.1mg/ml。SPA为1.5ml，抗红细胞单克隆抗体为1ml，抗猪瘟病毒抗体1ml。40℃水浴箱内温育60分钟。Spa-抗体三聚体浓度为0.1mg/ml，PH7.4。4℃保存。
[0063] 使用时，该三聚体稀释到0.1μg/ml，取血样，加入三聚体后37℃水浴箱内温育1小时，取样本在显微镜下观察，以生理盐水作为对照，有聚集现象者为阳性，即该血样感染了猪瘟病毒。
[0064] 实施例5：Spa-抗体
[0065] 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是海洋和盐湖中分布广泛的一种嗜盐性病原菌。广泛分布在近海岸的
海水、海底
沉积物、鱼类、贝类中，适应于高浓度(6％)食盐的环境中生长，在不含食盐的培养基中不能生长。该菌是亚于霍乱弧菌的一种常见肠道致病菌，其污染会给
海水养殖业带来严重损失，还会引起人类腹泻等肠道疾病及食物中毒，出现腹泻呈水样或血样便、腹部痉挛、恶心、呕吐和头痛等症状。自2001年以来，副溶血性弧菌性食物中毒爆发已经成为中国最常见的食源性疾患，副溶血性弧菌性食物中毒的起数和人数一直处于第一位。
[0066] SPA(葡萄球菌蛋白A)和红细胞抗体、抗副溶血性弧菌多克隆抗体的三聚体。该三聚体制备过程：SPA和抗红细胞单克隆抗体和抗副溶血性弧菌多克隆抗体的反应浓度均为0.1mg/ml。SPA为1.5ml，抗红细胞单克隆抗体为1ml，抗副溶血性弧菌多克隆抗体1ml。12℃水浴箱内温育6小时。Spa-抗体三聚体浓度为0.1mg/ml，PH7.4。4℃保存。
[0067] 使用时，该三聚体稀释0.1μg/ml，取待测血样，加入三聚体后37℃水浴箱内温育1小时，取样本在显微镜下观察，以生理盐水作为对照，有聚集现象者为阳性，即该血样感染了副溶血性弧菌。
[0068] 实施例6：Spa-抗体
[0069] 伤寒是由伤寒杆菌引起的经消化道传播的急性传染病。临床特征为长程发热、全身中毒症状、相对缓脉、肝脾肿大、玫瑰疹及白细胞减少等。主要并发症为肠出血、肠穿孔。
[0070] SPA(葡萄球菌蛋白A)和红细胞抗体、抗伤寒抗体的三聚体。该三聚体制备过程：SPA和抗红细胞单克隆抗体和抗伤寒抗体的反应浓度均为0.1mg/ml。SPA为1.5ml，抗红细胞单克隆抗体为1ml，抗伤寒抗体1ml。30℃水浴箱内温育90分钟。Spa-抗体三聚体浓度为0.1mg/ml，PH7.4。4℃保存。
[0071] 使用时，该三聚体稀释到0.1μg/ml，取血样，加入三聚体后37℃水浴箱内温育1小时，取样本在显微镜下观察，以生理盐水作为对照，有聚集现象者为阳性，即感染了伤寒。
[0072] 实施例7：Spa-抗体
[0073] 将spa和抗红细胞单克隆/多克隆抗体以及不同的淋巴细胞抗体结合，可用来检测血液中淋巴细胞亚群的比例，帮助判定患者的免疫功能。
[0074] SPA(葡萄球菌蛋白A)和红细胞抗体、待测淋巴细胞亚群的抗体(如抗cd2抗体、抗cd3抗体、抗cd4抗体、抗cd11抗体、抗cd15抗体、抗cd16抗体、抗cd8抗体、抗cd19抗体、抗cd5抗体、抗cd7抗体、抗cd13抗体、抗cd33抗体、抗cd10抗体、抗cd21抗体、抗cd22抗体、抗cd23抗体、抗cd32抗体、抗cd35抗体、抗40cd抗体、抗cd45抗体、抗cd54抗体、抗cd56抗体、抗cd64抗体、抗cd133抗体、抗cd117抗体、抗cd90抗体等)的三聚体。该三聚体制备过程：SPA和抗红细胞单克隆抗体和待测淋巴细胞抗体的反应浓度均为0.1mg/
