用于使用软磁结构拉动DNA、RNA和其它生物分子穿过纳米孔
的方法和系统
技术领域
[0001] 本
发明总体涉及控制分子穿过纳米孔的移动的方法，所述分子例如DNA(脱
氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)和
蛋白质以及其它生物分子。
[0002] 本发明具体描述了使用由软磁材料制成的结构选择性地保持、拉动和释放
磁珠标记的DNA的方法。
背景技术
[0003] 尽管在本发明全文中描述了DNA的操纵。这些方法可以推广至RNA和其它带电荷的线性分子。
[0004] 纳米孔技术具有通过在DNA被拉动穿过纳米孔时识别核苷酸来提供准确、长读长的遗传信息的可能性。以缓慢且稳定的速率控制DNA穿过纳米孔的
进程对于执行准确的测序是至关重要的。
[0005] Lei等人的
专利申请PCT/US16/59794描述了用于实现该控制的方法，该专利申请的主题通过引用全部内容并入本文中。本发明改进了那些方法。
[0006] Lei等人的PCT/US16/59794的简要概述：
[0007] Lei等人描述了拉动DNA链穿过纳米孔的方法，该方法良好地控制DNA的易位速度。通过作用在DNA分子的带电荷主链上的纳米孔的
偏压将DNA拉动穿过纳米孔。将DNA从纳米孔的顺式侧拉动至反式侧。分别地，“顺式(cis)”是指纳米孔口的起始侧上的相互隔离的空间，“反式(trans)”是指纳米孔口的接收侧上的相互隔离的空间。在顺式侧，DNA的暴露末端附着至扫描板。附着可以通过诸如共价键合的永久方式或通过诸如利用磁珠标记的非永久方式来进行。DNA在扫描板和纳米孔之间拉伸。通过拉动纳米孔内的
电场来确定DNA中的张
力，该电场与纳米孔两端的偏压(即电势差)成正比。纳米孔和扫描板之间的间距由精密的机械
致动器控制，通常由具有纳米
精度的压电装置控制。通过增加间距，拉伸的DNA在恒定
张力下被拉动穿过纳米孔。通过减小间距，拉伸的DNA在恒定张力下被吸入到纳米孔中。通过将DNA保持在恒定张力下，易位率得到良好的控制，并且
布朗运动的作用降低。
[0008] Lei等人的PCT/US16/59794还公开了“DNA自动对准”的方法。该方法利用可控磁体以在测序过程中吸引、保持、拉动和释放标记DNA的磁珠。
[0009] 文中解释了磁珠上的力由磁珠的体积、其磁化强度和
磁场梯度决定：
[0010] 作用在磁珠上的力
[0011] 如下面的公式给出的，作用在一定体积的
磁性材料(例如磁珠)上的磁体的力与
磁场梯度 材料的磁化强度 以及珠中的磁性材料的体积V珠大致成正比。
[0012] (完整公式)
[0013] 对于强磁场，磁珠的磁化强度接近其饱和极限，不再与驱动磁场成正比。
[0014] 力公式可以简化为：
[0015] (对于饱和磁性材料的简化公式)
[0016] 其中：
[0017] M饱和是饱和时的珠的磁化强度。
[0018] 是磁场的梯度。
[0019] 强力是期望的，因为这能够通过提高纳米孔偏压来增加DNA中的张力。如果保持力弱，当DNA被大的偏压拉动时，磁珠将从扫描板上掉落。
发明内容
[0020] 本发明是磁珠标记的DNA可以被拉动穿过纳米孔同时所述DNA通过非常强的静电力来保持的方法。本发明使用小的软磁结构来产生极大的磁场梯度，所述磁场梯度将磁珠捕捉在可以以纳米精度移动的扫描板上。
[0021] 与传统磁体相比，通过这种方法，磁捕获力可以增加多个数量级。因此可以增加DNA张力以更好地控制DNA穿过纳米孔的进程。为了清楚起见，软磁结构不是磁体，而是当放置在由磁体产生的磁场中时可以显著地改变磁场的结构。
[0022] 表格列表
[0023] 表1a、表1b：磁场测量。对各种
永磁体进行磁场测量，以评估可以使用的最大实际磁场梯度。
[0024] 表2：磁力计算。计算常用磁珠的最大磁场力。
[0025] 表3：DNA拉动速度减小因子计算。考虑到磁珠相对于纳米孔的错位，计算DNA拉动速率。
附图说明
[0026] 图1：总体布局。这是Lei等人的专利申请PCT/US16/59794的附图的副本，其示出了用于DNA测序的机械组件。
[0027] 图2：利用磁珠自动对准。这是Lei等人的专利申请PCT/US16/59794的附图的副本，其示出了用于对准磁珠标记的DNA使其可以在纳米孔正上方拉动的方法。
[0028] 图3：利用磁珠自动对准。这示出本发明。描绘了机械组件，该机械组件包括表面地
定位于扫描板的面向纳米孔芯片的侧上的软磁结构。描绘了永磁体，该永磁体定位成使得磁通量穿透软磁结构。
[0029] 图4：矩形FEMM布局图。这示出二维
有限元分析模型分析的物理布局。
[0030] 图5：软磁结构附近的磁通量。利用二维FEA分析来计算4×1阵列的软磁结构附近的磁通量，并以重叠的维度来显示该磁通量。
[0031] 图6：软磁结构的磁极附近的磁通量。利用二维FEA分析来计算4×1阵列的软磁结构附近的磁通量。呈现该分析的紧靠近软磁结构的磁极附近的部分。
[0032] 图8：沿软磁结构的末端下方的竖直线建模的磁场强度和场梯度的曲线图。二维FEA分析的结果。
[0033] 图9：FEMM物理模型的图示。这示出用于分析圆柱形软磁结构的三维轴向对称FEA模型的布局。
[0034] 图10：示出场线的轴向对称物理模型的图示。这示出用于分析圆柱形软磁结构的三维轴向对称FEA模型的二维截面。
[0035] 图11：圆柱形软磁结构的末端附近的通量的特写。圆柱形软磁结构三维轴向对称FEA分析的磁场和通量线输出的特写图。
[0036] 图12：沿软磁结构末端的下方的竖直线建模的磁场强度和场梯度的曲线图。圆柱形软磁结构的三维轴向对称FEA分析结果。
[0037] 图13：扫描板
制造过程。该图示出使用显微
光刻技术来创建具有软磁结构的扫描板的阶段。
[0038] 图14：突出于扫描板的表面上方的软磁结构的截面。这些图示出从扫描板突出的软磁结构以及如何使用显微光刻技术制造该扫描板。
[0039] 图15：DNA错位的图示。该图示意性地描绘了由于软磁结构的间隔而导致磁珠的错位。
[0040] 图16：具有软磁结构和可评估扫描板的动态腔。这描绘了如何可以将Lei等人的专利申请PCT/US16/59794公开的动态腔设计
修改为将软磁结构添加至扫描板。
[0041] 图17：光学
位置反馈。说明了测序组件，该测序组件示出了如何可以利用光学系统更换磁体以确定扫描板和纳米孔芯片的相对位置。
[0042] 图18：穿过扫描板捕捉的纳米孔芯片窗口的图像。这些图像和强度附图表明光学系统如何可以确定扫描板和纳米孔芯片的间距。
[0043] 图19：软磁材料结构簇的图示。该软磁材料结构簇与
基板上的特定的纳米孔紧密对准。
具体实施方式
[0044] 本发明大大增加了可以保持磁珠抵靠扫描板的力，以便拉动DNA和其它分子穿过纳米孔。
[0045] 在详细解释与本发明一致的至少一个实施方式之前，需要理解的是，本发明的应用不限于以下描述中阐述的或在附图中说明的构造的细节和对象的布置。
[0046] 符合本发明的方法和装置能够具有其它实施方式，并且可以以各种方式实现。同样，需要理解的是，本文中采用的措辞和术语以及下面包括的
摘要是出于描述的目的，而不应该被认为是限制性的。
[0047] 同样地，本领域技术人员将理解，本发明所基于的构思可以容易地用作设计用于实现本发明的多个目的的其它结构、方法和系统的
基础。因此，重要的是，
权利要求被认为包括这样的等同构造，因为权利要求不脱离与本发明一致的方法和装置的精神和范围。
[0048] 此外，在转向详细说明说明性实施方式的附图之前，应当理解，本发明不限于
说明书中阐述的或附图中示出的细节或方法。还应当理解，术语仅用于描述的目的，不应视为限制。已经努力使用相同的方法。
[0049] 估计磁珠上的最大力。
[0050] 通过增大一定量的磁性材料的体积、增大该体积的磁性材料的磁化强度、或通过增大磁场梯度可以增大该力。
[0051] 将磁珠制成更大增加其成本。还增大了其表面积，这可能导致不期望的粘附，因为这增大了珠上的结合位点的数量。较大的珠还占据更多的空间，这可能是有问题的，因为这限制了DNA的浓度。
[0052] 珠的磁化强度可以稍微增大，但是高浓度的
铁可以在没有外部场的情况下保持磁化强度，这导致了结
块。提高
密度也
加速珠的沉降。
[0053] 超顺磁珠保持最小的磁化强度并且通常具有较低的铁密度。优选小的珠以使成本最小化，并且更长时间地保持在
流体悬浮液中。
[0054] 增大磁场梯度是用于最大化保持/拉动DNA末端的力的优选方法。通常，永磁体比电磁体强得多。表1a、表1b总结了为测试许多小但高强度的钕磁体而进行的测量。使用安装在千分尺上的高斯计进行这些测量，以在距永磁体不同距离处测量磁场。该实验的目的是测量在距轴线上(中心)位置中的磁体不同距离处的磁场梯度。
[0055] 可以得出多个结论，这些结论与已知的磁学理论完全一致：
[0056] 1.来自单个磁体的磁场随着与其表面的距离增大而减小。
[0057] 2.磁场梯度在磁体表面附近最大化，并且随着与其表面的距离的增大而减小。
[0058] 最强的可用磁场梯度受限于吸引、保持、拉动和最终释放磁珠标记的DNA所必需的机械布局。
[0059] 从这些测量结果可以看出，使用小磁体可以产生的最大磁场梯度近似为450特斯拉/米。该假设基于这样的实际假设：在磁体表面和被操纵的磁珠之间需要至少0.35mm的间隙。即便如此，这么小的间隙也不容易实现。
[0060] 对于给定的磁场梯度，可以至少近似地确定磁珠上的力 这些计算在上面公开的副本部分中解释。下面的计算估计了1.05μm DynabeadTM(用于生物操作的常用珠)上的力。
[0061] 表2中示出了磁化强度计算。磁珠饱和磁化强度值取自2007年Smistrup标题为“
微流体系统中的磁分离(Magnetic separation in microfluidic systems)”的论文中的实验。
[0062] 在该示例计算中，珠尺寸大约是出于经济和性能原因可以考虑的最大尺寸。较大的可商购珠通常含有较低密度的磁性材料。另一考虑因素是可能需要厚涂层以确保磁珠的分离，使得其不结块。
[0063] 纳米孔中的电力
[0064] 如果要最小化布朗运动的作用，那么最大化DNA上的张力是有利的。显然，这具有实际限制，例如DNA的断裂力极限、磁珠与DNA连接的强度、以及电限制。通常讨论的纳米孔偏压是100mV至400mV。ssDNA上的相
应力是10pN至100pN。广泛的范围与孔径和关于
电渗流(electro-osmatic flow)的屏蔽效应的不同假设有关。(即，带正电荷的离子沿带负电荷的ssDNA由纳米孔
电压偏压拉动的相反的方向流动。)
[0065] 因此，所计算的磁珠力8.18pN处于该估计范围的低端，并且因此至少在不损害进行的假设的情况下，可以对实现该方法提出实际挑战。
[0066] 软磁材料
[0067] 软磁材料宽泛地定义为易于磁化和去磁的材料。该材料通常具有小于1000A/m的固有
矫顽力。该材料主要用于增强和/或引导由电磁体或永磁体或其它源产生的磁通量。
[0068] 通常用作用于软磁材料的品质因数的主要材料特性是相对磁导率，其是材料对施加的磁场响应的容易程度的度量。
[0069] 另一期望特性是低矫顽力，其是在去除磁通量源之后材料保持磁场的趋势。低矫顽力最适合动态应用。
[0070] 另一期望特性是高饱和磁化强度，其是材料允许高磁通量强度的能力。
[0071] 材料的磁阻与其磁导率成反比。因此，软磁材料具有低磁阻。
[0072] 磁通量
[0073] 磁通量在磁体(永磁体或电磁体)的相反磁极之间形成闭合回路，但其所采用的路径取决于其附近材料的磁阻。简单来说，磁通量倾向于“偏好”通过低磁阻材料的路径。空气和
水比软磁材料具有高得多的磁阻。因此，假如该软磁结构的几何形状可以形成磁极之间的磁通量路径的部分，定位在非磁性基板上或在非磁性流体或非磁性气体内的软磁结构将是用于磁通量的吸引器。
[0074] 软磁结构中和周围的磁通量集中造成形成临时磁极。由于从外部接近这些磁极，磁通量变得更加集中，则作用在磁珠上的力对软磁结构总是有吸引力。改变软磁结构暴露于的磁场的方向不使该力是排斥的。
[0075] 布局
[0076] 在图3中示出本发明。该图示包含由Lei等人的PCT/US16/59794公开的许多结构，该结构具有许多增加和改变。
[0077] 纳米孔(500)安装在纳米孔芯片(501)中，该纳米孔芯片(501)将反式空间(651)与顺式空间(650)分隔开。这两个空间都填充有适当的溶液。可以在仅通过纳米孔(500)连接的这两个空间之间施加电势或偏压(530)。扫描板(510)与纳米孔芯片(501)间隔一段距离(571)，并且该纳米孔芯片(501)基本上平行于扫描板(510)取向。扫描板(510)的面向纳米孔芯片(501)的侧包括一个或多个软磁结构(511)。
[0078] 待分析的DNA(600)附着于柔性接头分子(602)，该柔性接头分子(602)进一步附着于磁珠(620)。在测序期间，将组件(600、601、602、620)部分地拉动到纳米孔(500)中。
[0079] 可控磁体(520)提供穿过软磁结构(511)并且穿过扫描板(510)和纳米孔芯片(501)之间的顺式空间(650)的磁通量。可控磁体的下表面远离扫描板(510)的表面一定距离(524)，扫描板(510)面向纳米孔芯片(501)并且包含软磁结构(511)。来自可控磁体(520)的磁通量(522)随着其越来越远而发散。
[0080] 术语“可控磁体”(520)是广泛使用的。通过改变其驱动
电流，可以简单地控制电磁体的磁场强度和极性。如果使用永磁体，则可以通过改变永磁体和软磁结构的相对位置来改变软磁结构暴露于的场强。改变永磁体场的另一种方法是使用可磁导材料沿其它路径使磁场转向。诸如海尔贝克(Halbach)阵列的永磁体组件也可以用于产生非常强的磁场。极片或其它结构可以用于将磁通量从磁体引导至扫描板或者用于控制磁通量。
[0081] 为了集中磁通量，软磁结构(511)必须提供低磁阻路径，该低磁阻路径允许磁通量避免穿过高磁阻材料。有利的是磁结构在磁通量方向上是长的，从而避免了更高磁阻的材料。软磁结构必须在其之间具有相当大的间隙，从该间隙中吸引磁通量。由于所有磁通量都在可控磁体的磁极之间穿过，因此软磁结构不产生磁通量，而是通过重新排列而产生集中。
[0083] 对于该分析，使用大卫·米克(David Meeker)的磁性有限元分析程序FEMM 4.2。将强磁场中的
钢磁结构(1010
合金)建模，并分析所得的场。分析模式是二维的。这种类型的分析有助于检查多个体周围的磁通量。由于磁通量仅从二维形状旁边吸引，因此这低估了通量集中。
[0084] 图4中示出了建模的布局。永磁体是钕铁
硼等级52(即NdFeB-52)。磁体宽20mm，高10mm。软磁结构的位置在下磁极下方4mm处、位于轴线上。在该位置处，磁场的强度约为0.3T(3000高斯)。该磁场在该位置略微发散。
[0085] 软磁结构是无限矩形，1μm宽×5μm高，在每个方向上具有0.1μm 45°
角。存在中心到中心的间距5μm(即4μm间隙)的4个结构。
[0086] 图5示出了软磁结构附近的建模的磁通量，图6是软磁结构周围最接近区域的特写。虽然紧靠软磁结构的末端，通量线被重定向，作用非常局部化。在任何方向上的10μm距离处，磁场的
变形最小。
[0087] 图7示出了为实线的通量线和为灰度的场强。
[0088] 图8是沿矩形软磁结构中的一者(左起第3个)的底表面中心正下方的线的磁场强度和磁场梯度的曲线图。
[0089] 在1μm处磁场梯度为80000特斯拉/米，在2μm处磁场梯度为20000特斯拉/米，在3μm处磁场梯度为约7000特斯拉/米。这些梯度非常大，因此应该用强力保持磁珠。具有强力的局部区域在图3中由尺寸(523)示出。
[0090] 再远一些，随着软磁结构的局部效应减小，磁场梯度越小。仍然存在吸引力，假如这些磁珠不受纳米孔的张力，该吸引力足以将磁珠朝向扫描板拉动。这是当纳米孔芯片和扫描板之间的距离小于接头分子的长度时的情况。
[0091] 局部区域(523)由软磁
沉积物的通量集中决定。更远的通量大致对应于永磁体的原始磁场，好像不存在软磁沉积物一样。
[0092] 实施例#2-圆柱形的轴向对称分析
[0093] 对于该分析，使用大卫·米克的磁性元件结构分析程序FEMM 4.2。在强磁场中将坡莫合金的单个软磁结构建模，并分析所得的磁场。分析模式“轴向对称”，其中建模的区域在二维平面中限定，然后绕轴线扫过该二维平面。分析模式确实是三维的，但限于围绕单个轴线对称的体。
[0094] 在图9中以及在图10中示意性地示出了物理布局，该物理布局是在计算模型中配置的。
[0095] 永磁体是NdFeB-52型，尺寸为直径20mm×高10mm。软磁结构的顶部距离永磁体的底面4mm。软磁结构尺寸为直径2μm×高5μm。分析中使用的软磁材料是坡莫合金87。软磁结构附近的磁场强度为约0.3特斯拉。
[0096] 图10中示出了通过有限元分析预测的磁通量。出于分析目的，
软件在建模区域周围使用一系列壳体以允许通量离开并重新进入。这将计算限制在有限区域。
[0097] 轴向对称模型是一种三维方法，其限定在于该物理模型具有一个共同的对称轴线。在图11中示出分析的一些结果。圆柱形的角是45度
倒角，以避免分析中的伪影。通量线弯曲以沿着从顶部穿过软磁结构到达底部的路径。
[0098] 图12中的曲线图是沿着圆柱形软磁结构的底表面中心正下方的线的磁场强度。在1μm处磁场梯度为130000特斯拉/米，在2μm处磁场梯度为70000特斯拉/米，在3μm处磁场梯度为约20000特斯拉/米。这些梯度非常大，因此应该用强力来保持磁珠。相应距离处的梯度比无限矩形的预测值略大。
[0099] 零通量？
[0100] 当置于相对弱的磁场中时，软磁结构非常有效地产生强磁场梯度。为了释放由这些梯度保持的磁珠，可能有必要将软磁结构与磁场隔离。
[0101] 当不需要强通量时，还可能有必要屏蔽扫描板(510)和软磁体结构(511)免受来自可控磁体(520)的影响。这可以通过将可控磁体(520)移远一定距离并且通过高导磁合金(mu-metal)或其它合适的磁性材料的
覆盖物来围绕该可控磁体来实现，使得磁通量在其磁极之间具有相当低的磁阻路径。
[0102] 另一种方法是屏蔽扫描板和其它部件免受来自附近设备的外部磁场或甚至地球磁场的影响。可以使用高导磁合金屏蔽，尽管当可控磁体靠近时可能需要将高导磁合金移除以避免干扰或通量减少。
[0103] 软磁结构或磁珠可能保留一些磁场。消除这种残余磁性的一种方法是产生多次改变方向、同时在大小上逐渐减小的磁场。这有效地扰乱了暴露的材料中的磁场。这可以通过利用用合适的
电子电路驱动的电磁体来实现。也可以通过旋转永磁体来实现，该旋转永磁体逐渐移动离开或逐渐被屏蔽以减小其磁场强度。
[0104] 软磁结构和阵列
[0105] 软磁结构的尺寸、布局和组成影响其性能。
[0106] 布局
[0107] 软磁结构的许多布局都是可能的，例如：
[0108] ·孤立结构
[0109] ·结构的网格阵列
[0110] ·结构的六边形阵列
[0111] ·孤立条带
[0112] ·在区域上的条带的线性阵列
[0113] ·结构或结构组可以与纳米孔芯片上的多个纳米孔对准布置。例如，小阵列的结构可以定位在每个纳米孔上方，且该小阵列之间具有间隙。
[0114] ·结构的随机图案
[0115] 结构或结构组可以与纳米孔芯片上的多个纳米孔对准布置。例如，小阵列的结构可以定位在每个纳米孔上方，且该小阵列之间具有间隙。
[0116] 结构可以具有不同的形状，例如：
[0117] ·圆柱形
[0118] ·椭圆柱形
[0119] ·矩形块
[0120] ·多边柱形
[0121] ·金字塔形
[0122] ·倒金字塔形
[0123] ·圆锥形
[0124] ·倒圆锥形
[0125] ·细长形状
[0126] ·不规则颗粒
[0127] ·脊状
[0128] 尺寸
[0129] 直径：相比小直径的软磁结构，较大直径的软磁结构使磁通量变形远超过其端部。相应的梯度可以更小。
[0130] 高度：结构不能太短，因为其不会对磁通量产生很大的低磁阻“捷径”。短结构确实起作用，但不如更高的结构有效。
[0131] 间距：每个结构从其周围区域吸引通量。(垂直于通量方向的区域)。结构不能太靠近，因为这限制了磁场集中。如果结构太近，也将限制磁场梯度在结构下方有效的范围。
[0132] 组成：理想的软磁材料具有高磁导率和低矫顽力。为了获得最大效率，磁饱和必须使得来自“吸引区域”的所有磁通量都能够穿过该结构。例如，如果可控磁体场不大于0.07特斯拉，则具有1μm的横截面积和10μm的吸引面积以及0.7特斯拉的磁饱和的磁结构可以完全容纳来自吸引面积的所有通量。磁导率不仅仅由组成决定，而且还由材料的颗粒结构决定。
[0133] 将软磁结构与磁珠匹配：软磁结构的最佳尺寸和间距与DNA标记的磁珠有关。通过类似尺寸的软磁可以最好地捕捉非常小的磁珠(例如200nm的磁珠)，因为可以产生非常强的梯度，该梯度仅穿透几百纳米进入顺式空间。类似地，非常大的磁珠(例如20微米的磁珠)由更大的软磁结构(例如直径20微米的圆柱体)最好地保持。这是获得最佳结果的一般规则，但不是必要条件，因为只要新磁场能够在磁力上产生足够的力，它就起作用。
[0134] 微制造
[0135] 用于具有软磁结构的扫描板的特别好的制造方法是使用微光刻。这有多个益处：
[0136] ·基板是精
抛光的
硅或玻璃。这有助于保持扫描板和纳米孔芯片之间的精确间隙。
[0137] ·开发制造方法用于产生微米精度或亚微米精度的图案。
[0138] 图13描绘了用于制造扫描板的过程的简化示例：
[0139] (a)从经抛光的玻璃板开始，该玻璃板一侧涂布导电层(例如氧化铟
锡(ITO))。
[0140] (b)在导电侧涂布光致抗蚀剂层。光致抗蚀剂可以是正型或负型。负性是优选的，因为UV光使其硬化，具有更好的
稳定性。
[0141] (c)利用铬
图案化的掩模使光致抗蚀剂曝光。光的
波长必须与光致抗蚀剂要[0142] 求相匹配，通常是紫外线。
[0143] (d)正性光致抗蚀剂因曝光而变弱，随后在曝光区域内溶解。负性光致抗蚀剂在曝光区域内稳定，并且随后未曝光区域溶解掉。导电层以所期望的图案曝光。
[0144] (e)利用诸如坡莫合金的软磁材料电
镀暴露的图案化区域。坡莫合金是含有80％镍和20％铁的金属合金。可能需要晶种层以获得对导电层的良好粘附性。
[0145] 如所示，
电沉积应该足够厚以与光致抗蚀剂的表面齐平或接近齐平。
[0146] (f)在图案上施加一层或多层保护涂层。该(一层或多层)保护涂层保护图案免于暴露，并且还可以使磁珠的粘附最小化。
[0147] (g)(未示出)将玻璃片切(切割)成较小的扫描板。
[0148] (h)(未示出)清洁所产生的“碎屑”以除去切屑。
[0149] 突出的软磁结构
[0150] 前面的示例和图示已经示出了软磁结构与扫描板表面齐平或凹陷。这不是必需的。软磁结构从扫描板表面向外突出可能是有利的。软磁结构之间的间隙可以为流体在扫描板和纳米孔芯片之间流动提供额外的空间。突出的软磁结构可以形成脊部，该脊部基本上横跨扫描板，脊部之间具有通道。
[0151] 图14示出了突出的软磁结构。使软磁结构在其与扫描板基板(513)
接触的底部处比在尖端处更宽(参见图14a)可以更稳定。这种结构可以使用蚀刻工艺制造，其中结构的尖端受到光致抗蚀剂图案的保护，当图14-b中的软磁材料被蚀刻掉时，该图案被底切。
[0152] 过程
[0153] Lei等人的PCT/US16/59794公开了用于定向磁珠标记的DNA使得其可以直接从纳米孔拉出的对准过程。可以采用非常类似的过程来使用软磁芯。以下的步骤设计成对准已用dsDNA接头和磁珠标记的ssDNA：
[0154] 1.在纳米孔阵列的顺式侧上的腔充满含有磁珠标记的DNA的缓冲液(如上所述)。
[0155] 2.纳米孔偏压设为将带负电荷的DNA引入至纳米孔中。DNA(600)的自由端进入纳米孔(500)。这可以通过监测纳米孔开孔电流来检测。DNA分子进入纳米孔的进程由不能进入纳米孔的接头结阻止。正确选择的接头结也可以阻止其它DNA进入纳米孔。
[0156] 3.一些标记的DNA样品将不占用纳米孔并且保持分散在纳米孔芯片表面上或在顺式缓冲液储液器中。把纳米孔内的经标记的DNA称为“接合的”，而纳米孔外的经标记的DNA称为“未接合的”。在接合的DNA测序期间，如果担心干扰，可能期望从顺式储液器除去未接合的DNA。这可以通过在施加磁场之前进行的洗涤步骤完成。除去的未使用的DNA可以被隔离在储液器中，并被释放用于后续轮的测序过程。
[0157] 4.使扫描板(510)相对靠近纳米孔表面，但是间距(571)大于最长的接头分子长度。启用可控磁体。磁珠在来自扫描板(510)上的软磁结构的强梯度的到达范围之外。磁珠受可控磁体(520)的远磁场影响。Fm是作用于悬浮的磁珠上从而朝向扫描板拉动磁珠的磁力，Fes是作用在未接合的DNA上从而拉动该DNA朝向纳米孔的电力，并且Fel是作用在接合的DNA上拉动该DNA穿过纳米孔的电力。纳米孔内的力Fel比未接合的DNA上的力Fes大多个数量级。通过激活可调磁体(520)，从零或非常弱的磁场开始，并逐渐增大磁场强度，使得Fes<
[0158] 5.然后将扫描板进一步降低，以允许对应于接合的DNA的所有磁珠与其正上方的扫描板接触。磁珠由强的局部磁梯度捕捉，并横向地吸引至最近的软磁结构。这可能导致磁珠与相应的纳米孔略微错位(下面讨论)。
[0159] 6.在所有磁珠(620)接触之后，增大磁场以使磁力Fm比接合的DNA上的电力Fel大得多(Fm>>Fel)。磁珠(620)被拉动成紧紧地抵靠扫描板(510)，从而磁珠精确地
跟踪扫描板的运动。通过以精确控制的速度移动扫描板(或移动纳米孔基板)，当DNA根据需要多次进出孔时可以测序该DNA。对DNA测序后，可以关闭磁力以释放标记的DNA，并在短时间内开始另一轮测序，而无需更换缓冲液或进行额外的样品处理。如上所述，可能存在必须被消除的残余磁场以释放磁珠。
[0160] 珠的错位？
[0161] 软磁结构单独产生磁通量的集中。当在扫描板上以重复图案制造时，软磁体结构产生当放置在磁场中时强烈吸引磁珠的位置图案。吸引点是由间隙(528)分开的离散点，而不是跨越扫描板的连续线。磁珠位置(529)的最大“误差”或“错位”约为六边形图案的软磁结构之间的距离的一半，并且为方形网格的间距的约0.7。这在图15中示出。
[0162] 尺寸为大约1μm至5μm和间隔为大约3μm至10μm的特征似乎适合于通常具有50nm至3μm范围内的直径和大约10μm至30μm的接头长度的磁珠。表3表示错位影响DNA链从纳米孔中拉出的速率的程度。使用简单的几何关系确定DNA运动。随着板距离(571)增加，DNA穿过纳米孔的运动接近板运动，即对于每1μm的板位移，出现1μm的DNA。该减速因子是利用简单的几何形状计算的，并且在表3中列出了对于各种DNA长度和错位的减速因子。
[0163] 例如，考虑将λ-DNA用作双链接头分子。接头分子的未拉伸长度为约16μm。如果软磁结构在4μm六边形图案上制造，则最大错位将略大于2μm。对于第一
碱基，相应的运动将约优于0.99μm/μm，并且随着距离的增加将改善。相对于扫描板和纳米孔芯片之间的间距，DNA运动将是非常线性的。
[0164] 软磁材料结构对准多个纳米孔
[0165] 对于许多应用，使用包含多个纳米孔的基板可能是有利的。将扫描板的在其上制造软磁材料结构的区域限制为仅在每个纳米孔正上方的那些区域可以是实用的。这种布置将减少磁性材料的消耗并且可以保持其它优势。在最简单的情况下，可以在每个纳米孔的正上方制造孤立的软磁材料结构。这种布置需要仔细对准。制造其中软磁结构簇放置在每个纳米孔上方的布置可能更容易。这允许在簇的横向定位中具有一些公差。
[0166] 图19示出了这种布置，因为其可以施加至固态纳米孔基板755。该基板755的一部分被示出。图19描绘了4个纳米孔位置754。每个纳米孔以变薄的窗口753为中心。由19个软磁材料结构752组成的六边形簇
叠加在每个纳米孔的上方。出于说明的目的，示出了具有一些横向错位的簇和纳米孔。
[0167] 具有软磁结构的动态腔
[0168] Lei等人的PCT/US16/59794公开了一种“动态腔”。该组件主要由纳米孔芯片和扫描板组成，纳米孔芯片和扫描板以允许那些结构的一些相对运动的方式机械联接。将纳米孔芯片和扫描板组装在小组件中可以通过减小纳米孔芯片和扫描板之间的机械路径长度来帮助减少机械振动。该组件还可以制造为抛弃式一次性使用产品，其消除了随后的测量中可能的DNA交叉污染。
[0169] 由Lei等人的PCT/US16/59794提出的组件需要最小的修改以利用软磁结构：图16示出了这一点：软磁结构[511]被添加至扫描板[510]的底面[515]。可能必须提供空隙[518]，使得可控磁体可以定位在扫描板[510]的后侧附近。
[0170] 应该注意的是，组件[580]的组成应该使其不受强磁场的不利影响。这规定不能被磁化的大部分材料应该用在抛弃式组件中。
[0171] 光学隔离反馈
[0172] 上述的微制造方法可以用于在原本透明的基板上产生软磁材料的图案。可以通过穿过扫描板成像来监测扫描板和纳米孔芯片之间的间距，因为光可能仅部分地被遮挡。软磁结构通常仅占用扫描板区域的小部分。这可以允许穿过扫描板成像以观察纳米孔芯片的窗口。图17示出了这一点：可以通过如701所示的平移镜头或者通过移动成像系统中的相应的
数码相机(未示出)、管镜(未示出)或另一光学元件来向上或向下移动由透镜700指示的成像系统的焦点。通过检查扫描板510上的软磁结构511的焦点位置或扫描板510上的另一识别特征，并将其与纳米孔芯片501上的窗口503的焦点位置进行比较，可以确定间距571。
[0173] 由于在测序期间磁体520必须占用扫描板510上方的位置，因此必须将光学系统更换为磁体520，反之亦然。
[0174] 透镜700或透镜系统必须具有足够的工作距离，使得扫描板510和
支撑结构不物理地干扰该透镜700或透镜系统。具有高数值的孔径和足够的工作距离的物镜是优选的。使用自动
图像分析和爬山
算法，即使使用相对低的数值孔径的物镜，也可以确定最清晰的焦平面。
[0176] 图18的面板(a)和面板(b)是用数值孔径为0.4的20倍物镜记录的图像。这些是通过具有4.5μm坡莫合金结构的扫描板看到的固态纳米孔芯片的变薄的氮化硅窗口的图像，该坡莫合金结构为六边形图案，中心到中心的间距为9μm。该结构高度为8μm。明亮的方块是穿过窗口的光线。圆形阴影是光被扫描板上的软磁结构阻挡的地方。以相距23μm的高度记录图像。面板(a)聚焦在窗口边缘。面板(b)聚焦在坡莫合金结构的顶部。距离结构底部的隐含的间距为15μm。穿过图像绘制的白线表示相应的面板(c)和面板(d)中所示的强度分布的路径。
[0177] 对于窗口聚焦图像，边缘过渡710和边缘过渡711比核心聚焦图像中的边缘过渡更陡峭且更清晰地限定。
[0178] 对于核心聚焦图像，凹陷部712、凹陷部713、凹陷部714比窗口聚焦图像中的凹陷部更陡峭且更平底。
[0179] 参考文献
[0180] Lei M.，Roorda R.，Chen Z.，Ho N.，Wang Y.，美国专利申请PCT/US16/59794“Methods and systems for controlling DNA,RNA and other biological molecules passing through nanopores”。
[0181] Smistrup K.，Hansen M.F.，Bruus H.，Tang P.T.和Kruhne U.W.W.(2007).Magnetic separation in microfluidic systems。
[0182] Meeker D，“Finite Element Method Magnetic”，软件，4.2版本。
[0183] 本发明的方面
[0184] 本发明的一方面是提供一种保持和拉动磁珠标记的DNA的方法。
[0185] 本发明的一方面是提供一种方法，以通过固定地保持DNA的一端来减少布朗运动对DNA穿过纳米孔的进程的作用并因此促进对DNA施加强张力。
[0186] 本发明的一方面是提供一种利用强保持力将磁珠标记的DNA保持抵靠扫描板的方法。
[0187] 本发明的一方面是提供一种将磁珠标记的DNA保持抵靠扫描板使得利用亚微米直径的磁珠来实现足够的保持力的方法。
[0188] 本发明的一方面是提供一种将磁珠标记的DNA保持抵靠扫描板使得利用直径等于或大于1微米的磁珠来实现足够的保持力的方法。
[0189] 本发明的一方面是提供一种将磁珠标记的DNA保持抵靠扫描板、并且磁珠标记的DNA可以快速地从扫描板上释放的方法。
[0190] 本发明的一方面是软磁结构可以制造为抛弃式装置的一部分。
