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利用 磁性颗粒进行受体结合试验的装置和方法

阅读：233发布：2021-07-22

专利汇可以提供利用磁性颗粒进行受体结合试验的装置和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供用于进行受体结合试验的方法、装置和系统。具体地，磁响应性颗粒——其被配置成与对应于一种或多种感兴趣分析物的标记偶联物形成复合物——可以通过施加一个或多个磁场在试验装置内移动至一个或多个分离的检测区域。通过使检测区域定位以便该运动的方向对于至少一部分运动来说与该装置内流体流动的方向相反，试验信号的检测可以在不需要单独的冲洗步骤的情况下进行。此外，由流体流动方向上携带的标记偶联物产生的信号污染被大幅降低。，下面是利用磁性颗粒进行受体结合试验的装置和方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于进行流体样品中分析物测定的方法，其包括：
(a)将所述流体样品导入试验装置中，其包括：
(i)接收所述流体样品的样品添加区，
(ii)第二装置区，其与所述样品添加区分开且与之流体连通，所述第二装置区包含与所述分析物对应的标记偶联物群，和
(iii)分析物检测区，其与所述样品添加区和所述第二装置区分开且与两者流体连通，
这是通过将所述流体样品施加到所述样品添加区而实现的，其中所述试验装置被设置为：在所述流体样品施加到所述样品添加区后，提供从所述样品添加区向所述第二装置区的流体流动，从而使所述第二装置区中的所述标记偶联物与至少一部分所述流体样品接触，以及提供从所述样品添加区向所述分析物检测区的流体流动；
(b)在至少一部分所述流体样品存在下，使所述标记偶联物与所述磁响应颗粒群接触，从而在所述第二装置区中形成反应混合物，其中所述磁响应颗粒被配置成：以与所述反应混合物中所述分析物的存在或数量相关的量，与所述标记偶联物形成复合物；
(c)将磁场施加到所述试验装置，所述磁场被设置成诱导所述磁响应颗粒在从所述第二装置区向所述分析物检测区的路径上运动，其中对于所述路径的至少一部分来说，所述运动的方向与所述流体从所述样品添加区向所述第二装置区的流动方向相反；和
(d)在所述分析物检测区检测来自所述标记偶联物的信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二装置区或分析物检测区中至少一个在封闭室内，其中所述封闭室在至少一个尺寸上是中等尺度的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二装置区或分析物检测区中至少一个在所述装置的封闭室内，所述封闭室包括500μm以下的至少一个尺寸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二装置区或所述分析物检测区中至少一个在所述装置的封闭室内，所述封闭室包括250μm 以下的至少一个尺寸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二装置区或所述分析物检测区中至少一个在所述装置的封闭室内，所述封闭室包括100μm 以下的至少一个尺寸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述装置包括充分细长的室，所述磁响应颗粒被移动穿过所述室。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述室包括5的纵横比。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述室包括10的纵横比。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述室包括20的纵横比。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述室包括50的纵横比。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述室包括100的纵横比。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述试验装置被设置，以提供从所述样品添加区向所述第二装置区和所述分析物检测区之一或两者的被动流体流动。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述被动流体流动通过毛细管力、流体静力或者通过这些力的组合进行调节。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述试验装置被设置，以提供从所述样品添加区向所述第二装置区和所述分析物检测区的被动流体流动。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述被动流体流动通过毛细管力、流体静力或者通过这些力的组合进行调节。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述试验装置被设置，以提供从所述样品添加区向所述第二装置区和所述分析物检测区之一或两者的主动流体流动。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述主动流体流动通过施加经由机械泵、电渗泵、离心力、增加的气压所产生的力或者通过两种或多种这样的力的组合进行调节。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述试验装置被设置，以提供从所述样品添加区向所述第二装置区和所述分析物检测区之一或两者的主动和被动流体流动。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁响应颗粒群包括顺磁性或超顺磁性颗粒。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁响应颗粒群是球形的。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁响应颗粒群包括直径在0.1至100μm的大小范围。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁响应颗粒群包括直径在1至50μm的大小范围。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁响应颗粒群包括直径在0.3至10μm的大小范围。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁响应颗粒群包括直径在0.5至5μm的大小范围。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁响应颗粒群包括直径在1至5μm的大小范围。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁响应颗粒群在施加所述流体样品之前被置于所述试验装置内。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤(b)包括通过施加磁场将所述磁性颗粒群移动到所述第二装置区中。
28.根据权利要求1所述的方法，其中在施加所述流体样品之前所述磁响应颗粒被预先放置在所述实验装置的表面上，并且在将所述流体样品施加到所述样品添加区后，从所述样品添加区流向所述第二装置区的流体在步骤(b)之前将所述磁响应颗粒溶解到所述流体样品中；
其中步骤(b)包括将在充分细长的装置室内的所述磁响应颗粒移动到所述第二装置区；并且
其中步骤(c)包括将在充分细长的装置室内的所述磁响应颗粒移动到所述分析物检测区。
29.用于进行流体样品中分析物测定的装置，其包括：
接收所述流体样品的样品添加区；
第二装置区，其与所述样品添加区分开且与之流体连通，所述第二装置区包含与所述分析物对应的标记偶联物群；和
分析物检测区，其与所述样品添加区和所述第二装置区分开且与两者流体连通；和
磁响应颗粒，其被置于所述装置内，所述颗粒包括固定于其上的受体，使得所述颗粒被配置成在所述试验进行期间与所述标记偶联物形成复合物；
其中所述分析物检测区相对于所述样品添加区和所述第二装置区被定位在所述装置中，使得物质从所述第二装置区移动至所述分析物检测区的第一路径中的至少一部分所述第一路径与物质从所述样品添加区移动至所述第二装置区的第二路径方向相反。
30.根据权利要求29所述的装置，其中所述样品添加区进一步包括过滤元件或排放口。
31.根据权利要求29所述的装置，其中所述样品添加区包括为所述第二装置区或所述分析物检测区体积容量的至少一倍的体积容量。
32.根据权利要求29所述的装置，其中所述装置在至少一个尺寸上是中等尺度的。
33.根据权利要求29所述的装置，其中所述样品添加区、所述第二装置区或所述分析物检测区中至少一个包括纹理结构。
34.根据权利要求29所述的装置，其包括充分细长的装置室，所述装置室将所述样品添加区与所述第二装置区流体连通并且将所述第二装置区与所述分析物检测区流体连通。
34.根据权利要求34所述的装置，其中所述充分细长的装置室包括至少5的纵横比。
35.根据权利要求34所述的装置，其中所述充分细长的装置室包括至少10的纵横比。
36.根据权利要求34所述的装置，其中所述充分细长的装置室包括至少20的纵横比。
37.根据权利要求34所述的装置，其中所述充分细长的装置室包括至少50的纵横比。
38.根据权利要求34所述的装置，其中所述充分细长的装置室包括至少100的纵横比。
39.用于进行流体样品中分析物测定的试验系统，其包括：
根据权利要求29所述的装置，其中所述标记偶联物包括标记部分，该标记部分在用具有被所述标记部分吸收的波长的电磁能照射后产生可检测光学信号；和
测定仪器，其包括：
接收器，用于接收所述装置；
磁场源，其在所述试验进行期间产生强度足以诱导所述磁响应颗粒在从所述第二装置区向所述分析物检测区的路径上运动的磁场；
电磁能源，其被配置为在所述试验进行期间照射所述分析物检测区，以在所述分析物检测区产生来自所述标记偶联物的可检测光学信号；
检测器，其被定位为接收所述可检测光学信号并且产生与之响应的电信号。
40.根据权利要求39所述的试验系统，其中所述磁场源包括永久磁体。
41.根据权利要求40所述的试验系统，其中所述磁场源包括永久磁体，所述永久磁体包括铁金属合金、陶瓷铁氧体或者稀土合金。
42.根据权利要求39所述的试验系统，其中所述磁场源的强度通过该磁场源相对于所述装置的相对定位进行控制。
43.根据权利要求39所述的试验系统，其中所述磁场源的强度通过可移动屏蔽进行控制。
44.根据权利要求39所述的试验系统，其中所述磁场源的强度进行电子控制。
45.用于进行流体样品中分析物测定的方法，其包括：
(a)将所述流体样品导入试验装置；
(b)在至少一部分所述流体样品存在下，使标记偶联物与磁响应颗粒群接触，其中所述磁响应颗粒被配置成与所述标记偶联物形成复合物；
(c)将磁场施加到所述试验装置，所述磁场被设置成诱导所述磁响应颗粒的运动，其中所述运动的方向与所述流体流动的方向相反；和
(d)检测来自标记偶联物的信号。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述试验装置是根据权利要求29所述的试验装置。

说明书全文

技术领域

[0001]本发明涉及用于进行试验的系统和方法，其包括定性、半定量和定量测定一种或多种分析物，其中所述分析物结合于包含与分析物对应的受体的磁性颗粒和标记偶联物，所述分析物通过施加磁场以将磁性颗粒带到检测器附近从而产生来自标记偶联物的信号而被检测。

背景技术

[0002]下面对本发明背景技术的讨论仅仅是为了帮助读者理解本发明而提供，并且不被认为是描述或构成本发明的现有技术。

[0003]术语“受体结合试验(receptor binding assay)”是指基于分析物特异性结合特定结合伴侣(被称为分析物的“受体”)的能力，用于产生表示感兴趣分析物的存在或数量的可检测信号的方法。常见类型的受体结合试验是免疫测定，其中结合感兴趣分析物的抗体被用于提供分析物受体，并且可检测信号与分析物/抗体复合物(complex)的形成有关。许多竞争性、非竞争性和夹心式受体结合试验方法在本领域中是熟知的。除了将抗体用作分析物的受体外，也使用其它结合伴侣，包括核酸、适配体以及除包含免疫球蛋白基序的那些肽之外的肽。该列举并不意味着具有限制性。

[0004]实施这类受体结合试验的许多方法、装置和仪器在本领域中也是熟知的。参见，例如美国专利号6,143,576；6,113,855；6,019,944； 6,007,690；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527； 5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524；和5,480,792，其每一篇因此以其全部引入作为参考，包括所有表格、附图和权利要求。合适的装置和仪器也被描述在The Immunoassay Handbook，2nd ed.，David Wild，ed.，Nature Publishing Group，2001中题名为“Near Patient Tests： TriageCardiac System”的第41章中，其因此以其全部引入作为参考，以及描述于共同拥有的美国专利号6,905,882中，其因此以其全部引入作为参考，包括所有表格、附图和权利要求。本领域技术人员也认识到包括但不限于Beckman ACCESSAbbott AXSYMRoche ELECSYSDade Behring STRATUS系统的自动仪器属于能够进行受体结合试验的商业上可得分析仪。此外，某些方法和装置诸如生物传感器和光学免疫测定可被用于测定分析物的存在或数量。参见，例如美国专利号5,631,171和5,955,377，其每一篇因此以其全部引入作为参考，包括所有表格、附图和权利要求。

[0005]在这类测定装置中，样品流体和其它试剂沿期望流动路径的流动可以被动地(例如通过毛细作用、流体静力或者施加样品后不需要进一步操纵所述装置的其它力)、主动地(例如通过施加经由机械泵、电渗泵、离心力、增加的气压等所产生的力)或者通过主动和被动驱动力的组合来驱动。另外的元件诸如从血液分离血浆或血清的滤器、混合室等可以根据特定应用所需而被包括在内。

[0006]分析物与其受体的结合可直接或间接地进行检测，并且经常利用可检测标记的用途。这类标记可偶联于受体或竞争性受体配体，这取决于所进行的试验的类型。如本文所用，术语“直接标记(direct label)”是指这样的信号发生成分(signal development element)：在没有加入特异性结合所检测的分析物/受体配合物的一种或多种成分的另外的结合分子的情况下，信号可从中产生。这类直接标记的实例包括酶标记、荧光标记、电化学标记、金属螯合物、胶体金属标记以及依赖于光学检测诸如表面等离振子共振和椭圆光度法的生物传感器。相反，术语“间接标记(indirect label)”是指这样的信号发生成分：其不是与分析物结合，而是与自身结合于分析物的分子结合。标记二次抗体例如与针对感兴趣分析物的小鼠抗体结合的可检测标记羊抗小鼠 IgG是间接标记的实例。

[0007]在进行受体结合试验时，受体(例如抗体)经常被固定在固相基质上用作亲和载体或简化样品分析。如本文所使用，术语“固相”是指本领域技术人员通常用于汇集分子的各种各样的材料，其包括固体、半固体、凝胶、薄膜、膜、网状物、毡、复合物、颗粒、纸等。固相可以是无孔的或多孔的。合适的固相包括被开发的和/或被用作固相结合试验中的固相的那些。参见，例如Immunoassay，E.P. Dianiandis and T.K.Christopoulos eds.，Academic Press，New York，1996 的第9章；Leon et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.8，2997(1998)；Kessler et al.，Agnew.Chem.Int.Ed.40，165(2001)；Smith et al.，J.Comb.Med.1， 326(1999)；Orain et al.，Tetrahedron Lett.42，515(2001)；Papanikos et al.， J.Am.Chem.Soc.123，2176(2001)；Gottschling et al.，Bioorg.Med.Chem. Lett.11，2997(2001)，其每一篇因此以其全部引入作为参考。这类固相基质可以被修饰以提供连接位点，例如通过溴乙酰化、硅烷化 (silation)、利用硝酸加入氨基，以及中间蛋白质、树枝状聚合物和/ 或星状聚合物的连接。该列举并不意味着具有限制性，并且本领域技术人员已知的任何方法都可以被使用。

[0008]本发明特别感兴趣的是对磁场响应的固相基质。当磁响应材料置于磁场感应下时，该材料将倾向于朝向或远离磁场最强的区域运动。例如，顺磁性和铁磁体材料沿磁场强度增加的方向运动，而反磁性材料诸如聚苯乙烯沿磁场强度减少的方向运动。当普通铁磁体材料由非常小的微晶(1-10nm)组成时，就发生超顺磁性，其中在相对低的温度下的热能就足以改变全部微晶磁化的方向。磁化方向上所产生的波动使得磁场平均值为零。因此，该材料的行为方式类似于顺磁性，只是全部微晶的磁矩倾向于与磁场平行，而不是每个单个原子独立受外部磁场的影响。因为超顺磁性材料没有“记忆性”，但仍具有相对高的磁化率，所以这些材料有利于用作磁响应材料。磁响应材料已经被用作固相，以便便于冲洗而将结合的和未结合的标记试剂分离，帮助试剂通过装置运动，以及将结合于固相的材料汇集至特定位置以进行测定信号的检测。参见，例如国际出版物WO87/07386；和 WO2004/035217；美国专利号4,452,773；5,238,815；5,445,970； 5,498,815；和5,279,936；Choi et al.，Biomedical Microdevices 3：191-200， 2001；Brunet et al.，Micromanipulating Magnetic Particles in Microfluidic Systems；和Furlani和Ng，Phys.Rev.E 73：061919(2006)，其每一篇因此以其全部引入作为参考，包括所有表格、附图和权利要求。例如， Hayes等描述了免疫测定，其中一抗连接的顺磁性颗粒被制成微通道内的填充床，产生高的表面积/体积比，从而增加流动的样品和试剂与固定颗粒的相互作用。Anal.Chem.73，5896(2001)，其因此以其全部引入作为参考。

[0009]因此，对考虑到改进分析物检测的方法、装置和试验存在需要。本公开内容提供这些及另外的益处。

发明内容

[0010]在第一方面，本发明涉及用于进行流体样品中一种或多种分析物的一种或多种测定的方法。在下文详述的各种实施方式中，这些方法包括下列步骤：(a)将流体样品导入试验装置，所述试验装置包括接收所述流体样品的样品添加区；第二装置区，其与所述样品添加区分开且与之流体连通；和分析物检测区，其与所述样品添加区和第二装置区分开且与两者流体连通。第二装置区包括与一种或多种感兴趣分析物对应的标记偶联物群。试验装置被设置为在流体样品施加到样品添加区后，提供从样品添加区向第二装置区的流体流动，以及从所述样品添加区向所述分析物检测区的流体流动。以这种方式，第二装置区和分析物检测区变成流体连接的。此外，至少一部分流体样品在第二装置区接触标记偶联物。
(b)在至少一部分流体样品存在下，使标记偶联物与磁响应颗粒群接触，因此在所述第二装置区中形成反应混合物。这些磁性响应颗粒被配置成：以与反应混合物中感兴趣分析物的存在或数量相关的量，与标记偶联物形成配合物。
(c)接触步骤后，此刻与标记偶联物结合的磁性响应颗粒可以通过将磁场施加到试验装置而与反应混合物分离。磁场被设置成诱导磁响应颗粒沿着从第二装置区向分析物检测区的路径运动。对于该路径的至少一部分来说，这种运动方向被设置成不同于在该方法的(a)部分从样品添加区向第二装置区的流体流动方向，并且在某些实施方式中与之相反。在分析物检测区检测来自标记偶联物的信号。

[0011]在另一方面，本发明涉及用于进行本文所述方法的装置。在下文详述的各种实施方式中，这些装置包括下列元件：(a)样品添加区，用于接收一种或多种感兴趣分析物的存在或数量待测定的流体样品；
(b)第二装置区，其与所述样品添加区分开且与之流体连通，其中所述第二装置区包括与至少一种感兴趣分析物对应的标记偶联物群；和
(c)分析物检测区，其与所述样品添加区和第二装置区分开且与两者流体连通，其中所述分析物检测区被定位，使得对于至少一部分从所述第二装置区向所述分析物检测区的运动路径而言，该运动路径与流体流动的方向相反；以及
(d)磁响应颗粒，其被置于所述装置内，其中所述颗粒包括固定于其上的受体，使得在所述试验进行期间，该颗粒被配置成与标记偶联物形成配合物。

[0012]在相关方面，本发明涉及用于进行本文所述方法的试验系统。在下文详述的各种实施方式中，这些系统包括下列元件：(a)如上所述的试验装置，其中标记偶联物包括标记部分，该标记部分在用具有被所述标记部分吸收的波长的电磁能照射后产生可检测光学信号，并且其中所述装置包括窗或开口，以允许外部电磁能源照射所述分析物检测区；和
(b)试验仪器，其包括：
(i)接收器，用于接收所述试验装置；
(ii)磁场源，其在试验进行期间产生强度足以诱导磁响应颗粒沿着从第二装置区向分析物检测区的路径运动的磁场；
(iii)电磁能源，其被配置为在试验进行期间照射分析物检测区以在分析物检测区产生来自标记偶联物的可检测光学信号；和
(iv)检测器，其被配置为接收可检测光学信号并且产生与之响应的电信号。

[0013]本发明的其它实施方式根据下面的详述、示例性实施方式和权利要求将是明显的。

附图说明

[0014]图1是在美国专利号5,458,852中描述的试验装置的部分示意俯视图。

[0015]图2是试验装置的示意图，其显示在本发明的一种实施方式中装置区域的空间排列。

[0016]图3是试验装置的示意图，其显示在本发明的可选实施方式中装置区域的空间排列。

[0017]图4是试验装置的示意图，其显示在进行多重试验的装置的实施方式中装置区域的空间排列。

[0018]图5是图解根据本发明一种实施方式的荧光计的代表性功能结构的图示。

[0019]图6是图解根据本发明一种实施方式的测定机构的代表性功能结构的图示。

[0020]图7是显示来自本发明一种实施方式的实验的BNP测定响应数据的图示，其利用固定磁场梯度来移动磁响应颗粒。

[0021]图8是本发明夹具的一种实施方式的机械制图，所述夹具用于夹持两个永久磁体，两个永久磁体位于正方形开口中并且利用 4-40个固定螺丝保持在适当的位置，具有0.125英寸宽的槽的两个永久磁体允许试验装置发明的一种实施方式在磁体之间穿过。

[0022]图9是显示来自本发明一种实施方式的实验的BNP测定响应数据的图示，该实验利用相对于试验装置发明的一个实施方式移动的两个磁体产生的磁阱。

[0023]图10是显示对于本发明一种实施方式的四个不同BNP浓度来说，BNP测定响应数据相对于温育时间的图，其来自利用磁阱进行的实验，所述磁阱通过相对于试验装置发明的一种实施方式移动的两个磁体产生。

[0024]图11是利用本发明的装置和仪器进行的测试顺序的示意图。

[0025]图12显示实施例4和5所用的磁阱。尺寸以mm计。左图上的符号对应：A.磁体；B.铝隔离物；和C.铁桥。

[0026]图13是显示来自本发明一种实施方式的实验的BNP测定响应数据的图示，实验利用通过相对于试验装置发明的一种实施方式移动的两个磁体和铁桥产生的磁阱。

[0027]图14是显示来自本发明的一种实施方式的实验的BNP测定响应数据的图示，实验利用通过相对于试验装置发明的一种实施方式移动的两个磁体和铁桥产生的磁阱。圆表示BNP浓度为223pg/ml 时获得的数据；正方形表示BNP浓度＜5pg/ml时的数据。

[0028]图15是显示来自本发明一种实施方式的实验的BNP测定响应数据的图示，实验利用相对于试验装置发明的一种实施方式移动的两个磁体和铁桥产生的磁阱。数据产生自磁珠，所述磁珠已经干燥然后又放回到溶液中。

具体实施方式

[0029]本文所公开的是进行受体结合试验的方法、装置和仪器。具体地，磁响应颗粒——其被配置成与对应于感兴趣分析物的标记偶联物形成配合物——通过施加一个或多个磁场，从包括样品流体和标记偶联物的反应混合物被移动至一个或多个离散的检测区。通过定位检测区，使得，针对该移动的至少一部分而言，该移动的方向不同于随着流体填充该装置而发生的流体流动的方向，可以进行试验信号的检测，而无需分离结合和游离标记的独立冲洗步骤。

[0030]磁响应颗粒向检测区(或多个)的运动方向可以与流体进入并填充包括标记偶联物的装置部分(例如“第二装置区”)时的流体流动方向相反。如下文所讨论，这并不是暗示在磁响应颗粒被移动至检测区(或多个)的同时流体必需是流动的。相反，该装置被优选设置，使得提供未结合的标记偶联物从第二装置区(也就是最初包括标记偶联物的装置部分)向检测区(或多个)的流动的力是标记偶联物在填充装置的流体中的扩散速率。上述另一情形，穿过该装置的流体流动没有将未结合的标记偶联物从第二装置区“冲洗”至检测区(或多个)。磁性颗粒从反应混合物向检测区(或多个)的运动优选足够快，以致于磁性颗粒到达检测区快过可构成背景信号的标记偶联物的扩散速度，从而减少源自未结合标记偶联物的背景信号。在某些实施方式中，当流体流动具有零速度时，诸如用流体充满装置之后发生的情况，进行磁响应颗粒的移动。

[0031]优选地，本发明的装置包括至少一个室，所述室“是充分展平(substantially flattened)的”并且最优选地“是充分细长的 (substantially elongated)”，磁性颗粒穿过所述室移动。这些术语中每一个都在下文被定义。通过提供在流体流动方向上具有长轴的室—— 所述长轴的长度是一个并且最优选地两个其它室的轴(在三维笛卡尔 (Cartesian)坐标系中)长度的至少10倍，该室构造可使得由于穿过该装置的磁性颗粒的运动所引起的混合最小化，并且因此使得相对于流动方向的背景信号运动最小化。尽管不希望受具体理论约束，应当认为这是因为填充该室的流体与该室壁之间的摩擦阻力可起到抵消颗粒周围逆流的作用。

[0032]如本文所述，在分析物检测区由产生自流体流动方向上携带的标记偶联物的非特异性信号引起的信号污染被大大降低。这可减少或消除对冲洗步骤的需要，冲洗步骤对于许多包括磁响应固相基质的方法来说是普遍的。本文所述的方法、装置和仪器可满足本领域对快速和灵敏的受体结合试验的需要。

[0033]如本文所使用，“速度”是矢量，其数量级是主体的速率并且其方向是主体的运动方向。静态流是指装置内流体的平均速度是零。磁场(多个)引导待检测标记的方向和速度可进行最佳选择，以将标记传递到检测位置，其快过由于力诸如扩散可到达同样位置的背景信号。例如，材料的流动可以在流体一维流动的反向上，在二维平面内在与流体的方向不同的方向上，或者在流体的二维平面之外的方向上。此外，材料的流动可以以不同的速度，比流体流动慢或快。

[0034]关于装置内除流体之外的材料(例如磁响应颗粒)的运动，如本文所用，术语“与流体流动的方向相反”是指沿着从装置内第一位置向装置内第二位置的路径的运动(例如磁响应颗粒的运动)，其中该路径包括在一个或多个方向上的运动，并且其中第一和第二位置的方位被设置成这样：当流体在样品添加区被导入装置时，流体从第二位置流向第一位置。如上面关于静态流状态的讨论，这并未意味着暗示流动与流体每一瞬间的流动方向相反。反之，该术语是指当流体填充第二位置与第一位置之间的空间时流体流动发生(occurs)或已发生 (occurred)的方向。

[0035]为了达到最小样品体积，可以采用中等规模的试验装置。如本发明试验装置所适用的术语“中等规模(中等尺度，mesoscale)” 是指这样的装置：在该装置中，流体流动穿过一个或多个横截面尺寸在0.1μm与500μm之间的一个或多个室。这并不意味着暗示该室在所有尺寸上是中等尺度的。例如，室可以是细长的，其中从第一位置到第二位置的尺寸在毫米、厘米或更大的尺度上，而高度和/或宽度是中等尺度的。可选地，室可以制成长度和宽度尺寸为毫米、厘米或更大的尺度，但是在高度上为中等尺度的。在该讨论中，长度、宽度和高度为了方便起见而使用，其中每一个仅仅意指三维坐标系的一个轴。通过使用细长室，使得最初包括标记偶联物的那个装置部分(例如“第二装置区”)与包括检测区(或多个)在内的那个装置部分之间的尺寸大于中等尺度，装置可增加未结合标记偶联物必须扩散以在检测区(或多个)产生背景信号的距离。特别优选的是，至少一个第二装置区和至少一个分析物检测区在中等尺度室内，并且最优选地至少一个第二装置区和至少一个分析物检测区在单个、优选充分细长的中等尺度室内。多个这样的细长室可以如下文所述与单个样品添加区流体连通。

[0036]如上下文中所用的术语“室(chamber)”是指具有一个或多个用于流体进入和/或出去的开口的封闭腔。室不同于纤维或多孔基质诸如滤器或膜，所述纤维或多孔基质将流体吸收或“芯吸”到众多内部空隙中。本发明的中等尺度试验装置有时被称为“毛细”装置，因为在装置的一个或多个室内的这类中等尺度的尺寸可用于提供全部或部分由毛细管力引起的流体流动。

[0037]这同样不意图暗示中等尺度试验装置的所有室必须具有至少一个中等尺度的横截面尺寸。因此，中等尺度尺寸的室可以连接至一个或多个较大尺寸的室，其例如用于接收进入中等尺度室之前的初始样品，和/或用于接收来自中等尺度室的样品流出物。也不意图暗示，除一个或多个室之外，中等尺度的试验装置不能包括一个或多个纤维或多孔基质。例如，可以提供纤维或多孔滤器，以在进入中等尺度室之前去除颗粒物质(例如细胞，诸如来自血液的红血球)，和/或可以提供纤维或多孔元件，以接收来自中等尺度室的样品流出物。

[0038]在合适的实施方式中，第二装置区和/或分析物检测区在同一室内或单独的室内，其至少一个尺寸为500μ以下，优选地为250μm 以下，并且仍更优选地为100μm以下。在合适的实施方式中，中等尺度室(或多个)是基本展平或者基本细长的。如本文所用的这些术语是指纵横比(aspect ratio)为至少5、至少10、至少20、至少50或至少100或以上的室。三维形状的“纵横比”是其最长尺寸与其最短尺寸的比值。如果最长轴与最短轴的比值(采用三维笛卡尔坐标系)是至少10，更优选地至少20，以及最优选地至少50，那么室是“基本展平的”。如果最长轴在与流体流动轴相同的轴上，并且最长轴与其它两个轴中每一个的比值为至少10，更优选地至少20，以及最优选地至少 50，那么基本展平的室是“充分细长的”。基本细长的形状(其可被称为“狭路(lane)”)特别地可降低达到装置“上游”部分的背景信号，这是通过延长此类背景信号为了被检测所必须经过的距离而实现的。据认为，这是因为填充该室的流体与该室壁之间的摩擦阻力可起到抵消颗粒周围逆流的作用。这可起着抑制颗粒运动期间流体运动的作用。

[0039]本发明涉及用于测定至少一种靶配体(即分析物)的存在或数量的诊断测试装置、系统和方法。图1和2显示根据本发明的试验装置10的实施方式。装置10可包括不同元件，其包括：样品添加区1、样品反应阻挡层2、第二装置区3、分析物检测区4和所用的试剂储蓄器5。该装置可由毛细管通道组成，当顶部元件6置于相隔毛细管距离的底部元件7之上时，所述毛细管通道被形成并且其将试剂和样品移动到装置各处。通过许多技术，包括但不限于粘合、通过超声焊接、铆接等，顶部和底部元件可以结合在一起，各个室可以被密封，并且毛细管可以形成。装置的元件可以与分析物检测区4以不同的组合使用以实现各种期望的功能。如本领域技术人员将认识到，这些元件可以组合以进行一步或多步测定。装置10还可用于形成试验过程的反应混合物。可选的试剂室17可如图3所描绘被包含到装置10中。

[0040]装置的组件(即装置的物理结构，无论是否是来自装置其它部分的分离部件)可以由共聚物、掺合物、层压材料、镀金属箔、金属化膜或金属制造。可选地，装置组件可由沉积了下列材料之一的共聚物、掺合物、层压材料、镀金属箔、金属化膜或金属制造：聚烯烃、聚酯、含苯乙烯聚合物、聚碳酸酯、丙烯酸聚合物、含氯聚合物、缩醛均聚物和共聚物、纤维素塑料及其酯、硝酸纤维素、含氟聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚甲基丙烯酸甲酯、含硫聚合物、聚氨酯、含硅聚合物、玻璃和陶瓷材料。

[0041]可选地，装置组件用塑料、弹性体、胶乳、硅芯片或金属制成；弹性体可包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、硅弹性体或胶乳。

[0042]可选地，装置组件可用胶乳、聚苯乙烯胶乳或疏水性聚合物制成；疏水性聚合物可包括聚丙烯、聚乙烯或聚酯。

[0043]可选地，装置组件可包括TEFLON(聚四氟乙烯)、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或聚碳酸酯。可选地，装置组件可由材料诸如能粉碎或注射成型的塑料制成，或者由玻璃、硅、铜、银和金薄膜的表面制成。能粉碎或注射成型的材料可包括聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚丙烯酸酯。

[0044]如本文所用的术语“反应混合物”是指被怀疑包含靶分析物的流体样品与用于测定该样品中分析物的存在或数量的一种或多种试剂的混合物。例如，反应混合物可包括与一种或多种感兴趣分析物相应的一种或多种配体类似物偶联物或受体偶联物，和/或含有与一种或多种感兴趣分析物相应的受体的磁响应颗粒。如本文所用，反应混合物可包括另外成分，包括例如缓冲剂、HAMA抑制剂、洗涤剂、盐 (例如钙、镁、钾等的氯化物和/或硫酸盐)、类蛋白质成分(例如血清白蛋白、明胶、乳蛋白等)。该列举不意味着是限制性的。

[0045]关于受体和/或标记偶联物，短语“与感兴趣分析物相应” 是指在方法中使用的受体和/或标记偶联物，其产生表示反应混合物中分析物的存在或数量的信号。取决于所进行的受体结合试验类型，标记偶联物可包括与结合感兴趣分析物的受体(例如抗分析物的抗体) 偶联的可检测标记；可以是与这样的分子(例如分析物类似物)偶联的可检测标记，所述分子与感兴趣分析物竞争性结合于受体；或者可以是与结合伴侣(例如二次抗体，诸如与小鼠抗分析物抗体结合的羊抗小鼠IgG)偶联的可检测标记，所述结合伴侣与感兴趣分析物的受体结合。这一列举不意味着是限制性的。众多夹心式、竞争性和同类受体结合试验类型对于本领域技术人员来说是已知的。可检测标记

[0046]如上所讨论，生物试验利用各种方法进行检测，并且用于定量结果的最常见方法之一是将酶、荧光团或其它可检测标记偶联至研究中的分子(例如一种或多种分析物类似物)上，其可被固定，用于通过对该分子具有亲和性的受体进行检测。可选地，一种或多种感兴趣分析物的受体(例如，利用感兴趣分析物制备或选择的抗体或其结合片段)可被偶联至酶、荧光团或其它可检测标记。酶偶联物属于所使用的最常见的偶联物。可检测标记可以包括本身可检测的分子(例如荧光部分、电化学标记、金属螯合物等)，以及通过产生可检测反应产物可被间接检测的分子(例如，酶诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)，或者通过特异性结合本身可以是可检测的分子可被间接检测的分子(例如生物素、洋地黄毒苷、麦芽糖、寡组氨酸(oligohistidine)、 2，4-二硝基苯、苯基砷酸盐(phenylarsenate)、ssDNA(单链DNA)、 dsDNA(双链DNA)等)。

[0047]各种键合化学已经被描述，用于将可检测标记附着至特定的感兴趣分子，这通常的目的是开发结合试验(例如免疫测定)试剂。因此，分子可通过选择的键合化学来连接，用于固相固定、制备抗体- 可检测标记偶联物和其它标记蛋白质和核酸试剂等。这类键合化学经常提供具有连接于肽的氨基酸侧链的一个或多个官能团的感兴趣分子。在其它特征中，这些“键合试剂(linkage reagent)”可基于下述进行分类：1.官能团(或多个)和化学特异性；
2.交叉桥的长度和组成；
3.官能团(或多个)是否化学或光化学反应；和
4.所得键是否可切割的。

[0048]采用键合化学可靶向的反应基团包括伯胺、硫氢基、羰基、碳水化合物和羧酸。此外，许多反应基团可利用交联剂诸如光反应性叠氮基苯非选择性地连接。

[0049]键合化学可以被提供各种间隔臂(或“桥”)长度，用于将感兴趣分子与其结合伴侣间隔开来。桥最明显的属性是其处理要连接部分的空间因素的能力。因为空间效应指示潜在反应位点之间的距离，所以对于相互作用来说可以考虑不同长度的桥。合适的连接物在本领域中是熟知的，并且可商业得自公司诸如Pierce Biotechnology，Inc. (Rockford，IL)。

[0050]优选的可检测标记偶联物大小为约100nm以下，更优选地大小为约70nm以下，仍更优选地大小为约40nm以下，以及最优选地大小为约20nm以下。如在本上下文中所使用的术语“大约”是指给定值+/-10％。某些优选的可检测标记包括荧光胶乳颗粒，诸如在美国专利号5,763,189；6,238,931；和6,251,687；以及国际公布号 WO95/08772中描述的那些，其每一篇因此以其全部并入作为参考。

[0051]一种或多种分析物的存在或数量优选地利用对每种分析物具有特异性的抗体并且检测特异性结合来确定。可以利用任何合适的免疫测定，例如竞争性和非竞争性免疫测定、夹心免疫测定等。抗体与分析物的特异性免疫结合可利用标记直接或间接检测。

[0052]对于本发明的分析物的检测和分析来说，许多方法和装置为技术人员所熟知。样品沿装置内流动路径的流动可被动地(例如通过毛细作用、流体静力或者施加样品后不需要进一步操纵所述装置的其它力)、主动地(例如通过施加经由机械泵、电渗泵、离心力、增加的气压等所产生的力)或者通过主动和被动驱动力的组合来驱动。各种任选装置元件诸如从血液分离血浆或血清的滤器、混合室等可根据技术人员的要求包括在内。示例性的装置被描述在The Immunoassay Handbook，2nd ed.，David Wild，ed.，Nature Publishing Group，2001中题名为“Near Patient Tests：TriageCardiac System”的第41章；以及美国专利号6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124； 5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526； 5,525,524；和5,480,792中，其每一篇因此以其全部引入作为参考，包括所有表格、附图和权利要求。这些装置和方法可利用各种夹心式、竞争性或非竞争性测定类型中的标记分子，以产生与感兴趣分析物的存在或数量相关的信号。受体的选择

[0053]配体-受体对是指为能够相互识别并结合的化学部分的配体和受体。配体和受体可以是能够相互识别并结合而形成配合物的任何部分。此外，配体和受体可经由第三中间物质的结合而相互作用。典型地，构成配体-受体对的配体和受体是经历相互间的特异性非共价结合相互作用的结合分子。配体和受体可以是天然出现的或者人工产生的，并且任选地可与其它种类聚集。

[0054]配体和/或受体的实例包括但不限于细胞膜受体的激动剂和拮抗剂、毒素和毒液、病毒表位、激素诸如类固醇、激素受体、肽、酶和其它催化多肽、酶底物、辅因子、包括小有机分子药物在内的药物、阿片剂、阿片剂受体、凝集素、糖、包括多糖在内的糖类、蛋白质，以及抗体——包括单克隆抗体和合成抗体片断，细胞、细胞膜和其中包括细胞膜受体的部分，以及细胞器。配体-受体对的实例包括凝集素-碳水化合物；肽-细胞膜受体；A蛋白质-抗体；半抗原-抗半抗原；洋地黄毒苷-抗洋地黄毒苷；酶-辅因子；酶-底物；和抗体-抗原。如本文所用，分析物可以是配体或者可以与配体缔合。因此，在分析物是抗原的情况下，与抗原结合的抗体是受体。

[0055]抗体的产生和选择可以几种方式完成。例如，一种方式是纯化感兴趣多肽或者采用本领域熟知的方法例如固相肽合成方法合成感兴趣多肽。参见，例如Guide to Protein Purification，Murray P.Deutcher， ed.，Meth.Enzymol.Vol 182(1990)；Solid Phase Peptide Synthesis，Greg B. Fields ed.，Meth.Enzymol.Vol.289(1997)；Kiso et al.，Chem.Pharm.Bull. (Tokyo)38，1192(1990)；Mostafavi et al.，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids 1，255(1995)；Fujiwara et al.，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)44，1326 (1996)。选择的多肽然后可以被注射到例如小鼠或兔中以产生多克隆或单克隆抗体。本领域技术人员将认识到许多方法可用于产生抗体，例如如在Antibodies，A Laboratory Manual，Ed Harlow and David Lane， Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988中所述。本领域技术人员也将意识到，模拟抗体的结合片段或Fab片段也可通过不同方法从遗传信息制备(Antibody Engineering：A Practical Approach，Borrebaeck，C.，ed.，Oxford University Press，Oxford，1995；J. Immunol.149，3914(1992))。

[0056]此外，许多出版物已经报道使用噬菌体展示技术来产生和筛选用于结合选定靶的多肽文库。参见，例如Cwirla et al.，Proc.Nati. Acad.Sci.USA 87，6378(1990)；Devlin et al.，Science 249，404(1990)； Scott & Smith，Science 249，386(1990)；和Ladner等的美国专利号 5,571,698。噬菌体展示方法的基本概念是在编码要筛选的多肽的DNA 与多肽之间建立物理关联。这种物理缔合是通过噬菌体颗粒提供的，其以包封编码多肽的噬菌体基因组的衣壳部分来展示多肽。多肽与它们的遗传物质之间物理关联的建立允许同时大量筛选巨大数目的带有不同多肽的噬菌体。展示与靶具有亲和性的多肽的噬菌体与该靶结合，并且这些噬菌体通过对靶进行亲和性筛选而富集。从这些噬菌体中展示的多肽的身份可以从其各自的基因组确定。利用这些方法，鉴定为对期望靶具有结合亲和性的多肽然后可以通过常规方法大量合成。参见，例如美国专利号6,057,098，其因此以其全部并入，包括所有表格、附图和权利要求。

[0057]通过这些方法产生的抗体然后可以通过如下步骤进行选择：首先筛选与感兴趣纯化多肽的亲和性和特异性，以及如果必需的话，比较抗体与期望从结合中排除的多肽的亲和性和特异性的结果。筛选过程可包括将纯化的多肽固定在微量滴定板的单独孔中。然后将含有潜在抗体或抗体组的溶液放入各自的微量滴定孔中并且温育大约 30分钟至2小时。然后洗涤微量滴定孔并且将标记二次抗体(例如，如果应用的抗体是小鼠抗体的话，其为与碱性磷酸酶偶联的抗小鼠抗体)加入到孔中并温育大约30分钟，然后洗涤。将底物加入到孔中，在固定多肽(或多个)的抗体存在的情况下将出现显色反应。

[0058]如此鉴定的抗体然后可进一步分析在选择的试验设计中的亲和性和特异性。在靶蛋白质的免疫测定开发中，纯化的靶蛋白质充当标准物，借助该标准物判定利用已经选择的抗体的免疫测定的灵敏度和特异性。因为各种抗体的结合亲和性可以不同；某些抗体对(例如在夹心试验中)可能在空间上相互干扰等等，抗体的试验性能可能是比抗体的绝对亲和性和特异性更重要的度量。

[0059]本领域技术人员将认识到，在生产抗体或结合片段以及筛选和选择对不同多肽的亲和性和特异性时可以采取许多方法，但是这些方法不会改变本发明的范围。磁响应颗粒

[0060]小聚合物微球(即低微米(low-μm)到亚微米(sub-μm) 直径的珠)诸如上面所讨论的磁响应颗粒已在表面结合试验中用作固相基质。磁珠可以：(1)增加有效的反应性表面与体积比并且使得在小得多的体积中进行反应成为可能；(2)对于分析物传送和递送来说容易移动；(3)大大减少通过相邻珠之间狭窄流体路径的扩散距离；以及(4)使得生物分子相互作用定位于分析系统中的特定点。

[0061]许多出版物已经报道了磁响应颗粒在毛细管流动中的用途，如在Watari et al.，Anal.& Bioanal.Chem.378，1693(2004)；Verpoorte， E.，Lab Chip 3，60N(2003)；以及美国专利号6,953,676；5,222,808；和 5,145,784中部分描述的，其每一篇因此以其全部并入。

[0062]磁响应颗粒、珠可从来源商业得到，诸如Dynal，Inc.(Lace Success，N.Y.)、Miltenyi Biotec，Inc.(Auburn，Cal.)、Applied Biosystems (先前的PerSeptive Biosystems，Inc.，(Foster City，Cal.)、Bayer Diagnostics (Medfield，Mass.)、Bangs Laboratories(Carmel，Ind.)以及BioQuest，Inc. (Atkinson，N.H.)。颗粒可以由诸如铁、氧化铁、氮化铁、碳化铁、镍和钴以及其混合物和合金之类的材料制成。磁响应乳胶珠可从商业来源诸如Seradyne(Indianapolis，IN)中得到。

[0063]在一些情况中，磁响应颗粒由聚苯乙烯制成，但是纤维素、琼脂糖、硅石、多孔玻璃或硅烷化颗粒也是可用的。一些商业上可得的颗粒用不同大小和形状的磁性氧化物的薄片制成，在其表面上具有化学基团层。颗粒还可以通过如下步骤制备：将小粒的磁性氧化物与天然或合成的聚合物混合，接着进行可获得合适颗粒大小的步骤。磁响应颗粒也已经通过将磁性氧化物加入到高度水不溶性化合物和乙烯基单体的混合物中而制备。含有磁性氧化物的微滴的水分散体然后可以通过单体的聚合被制成磁响应颗粒。当用于例如免疫测定时，颗粒表面的化学组成是关键的，因为不与分析物受体之外的生物成分结合的惰性表面是高度期望的。本发明某些实施方式的磁响应颗粒可以是顺磁性的或超顺磁性的，即，它们在磁场中是磁性的但是只要去除磁场就是非磁性的。针对与其它分子结合的沉降和动力学，为了在悬浮液中同等地进行，相同大小和形式的颗粒是优选的。磁响应颗粒可具有最大长度，该长度为发生混合的室的长度或宽度的一小部分。磁响应颗粒一般可具有直径范围在约0.1-100μm、约1-50μm、约0.3-10μm、约0.5-5μm或约1-5μm的大小。磁响应颗粒的形状通常将是球形的，但是其它不规则、杆状等外形的颗粒也可以使用。如本上下文中使用，术语“大约”意指给定测量值±10％。

[0064]所有这些磁响应颗粒的共同特征是特异性结合分子(受体) 可以与它们连接。最常使用的分子是抗体。受体的连接可以经由颗粒表面与抗体之间通过如上所讨论的各种键合化学进行的共价和非共价结合而实现，诸如颗粒表面上的特定化学基团例如结合到受体上的 -NH2或-SH基团的情况。

[0065]在不同实施方式中，磁响应颗粒群可以在样品流体加入到试验装置之前、与样品流体一起或样品流体加入到试验装置之后被引入到试验装置中。在某些实施方式中，这种磁响应颗粒群可以在施加所述流体样品之前位于试验装置的任何部分内，因为如果必要的话它们可以通过磁场施加被传递到第二装置区。在不同实施方式中，磁响应颗粒群被布置于第二装置区之内或之上，使得其通过磁场施加而产生移动不是形成反应混合物所必需的。仍在其它实施方式中，磁响应颗粒群至少部分是通过将样品流体加入到试验装置后发生的流体流动而被传输到第二装置区。在不同实施方式中，随着含有合适缓冲液的浆体或悬浮液——其可任选地通过例如冻干或其它手段干燥——在装置的一个或多个表面上形成可扩散涂层，磁响应颗粒群可被安置在该装置中。“可扩散涂层(diffusible coating)”是在与引入装置内的流体样品接触或一起温育后被再悬浮的涂层。

[0066]与分析物受体或二次抗体结合的磁响应颗粒充当可与感兴趣分析物或分析物-受体结合配合物相互作用的固相基质。如前所述，磁响应颗粒可以被配置成与标记偶联物形成配合物，其量与反应混合物中感兴趣分析物的存在或数量有关，该配合物在本文中被称为“反应配合物”或“磁响应颗粒配合物”。可以使用设置此类磁响应颗粒的许多策略，这取决于所进行的受体结合试验类型。例如，在非竞争性受体结合试验的一种结构中，与磁响应颗粒结合的分析物受体可形成与目标分析物和标记分析物受体偶联物的夹心配合物。在另一构型中，与磁响应颗粒结合的二次抗体可与感兴趣分析物和标记分析物受体偶联物一起形成夹心配合物。在竞争性受体结合试验的一种设计中，感兴趣分析物可与偶联于可检测标记的相似物竞争，以便与结合于磁响应颗粒的受体结合。这一列举没有意味着具有限制性。试验装置的示例性元件

[0067]装置优选地包括样品添加区；第二装置区，其与所述样品添加区分开且与之流体连通；和分析物检测区，其与所述样品添加区和第二装置区分开且与两者流体连通，其中分析物检测区被定位，使得从第二装置区向分析物检测区的运动路径就该运动路径的至少部分来说与流体流动方向相反。除了这些元件外，其它任选元件在下文中被讨论。图1显示如美国专利5,458,852所述的毛细管试验装置的示意图，该专利因此以其全部并入。通常用于毛细管试验装置的许多特征在该专利中被描述，并且在下面的部分以通用术语来讨论。

[0068]本文所述装置内的任何区域的表面可以是平滑的(相对于干燥的试剂沉淀物)或者由纹理结构诸如桩(post)或槽组成。装置表面上的纹理可促进在装置准备期间试剂或多种试剂(并且可包括磁响应颗粒)的干燥，并且可促进样品向区域的运动。装置表面上的纹理有利于干燥试剂在表面上的均匀布置，如下：含有液体试剂的流体被放置与纹理表面接触，并且小的试剂流体弯月面在每个纹理结构附近形成。在纹理不存在时，流体将倾向于在整个室的角落处形成较大的弯月面，其当干燥时将产生不均匀的干燥试剂层。当纹理结构被设计到装置中时，许多小弯月面的存在导致在整个室内干燥的更均匀的试剂层。样品添加区

[0069]毛细管试验装置的样品添加区包括样品导入该装置的区域。样品添加区的示例性实施方式被描述为图1的元件1、图2的元件 201、图3的元件301和图4的元件401和404。样品添加区可以是不同结构的端口，即圆形、椭圆形、方形等，或者该区域可以是装置中的槽。此外，过滤元件可以被放在样品添加区之内、之上或附近，以过滤来自样品的微粒或者从血液过滤血细胞，以便血浆可进一步穿过该装置。这类过滤元件的示例性实施方式被描述为图2的元件202和图4的元件405。合适的滤器在本领中是熟知的。参见，例如美国专利 6,391,265，其因此以其全部并入作为参考。样品添加区可包括出口(未显示)，以有利于该区域的气体漏出和液体填充。可选地，这样的出口可位于装置的其它区域中以便于毛细管空间(或多个)的填充。

[0070]样品添加区的体积至少可以是第二装置区的体积或更大。样品添加区的体积或容量可以是第二装置区和/或分析物检测区的室 (或多个)体积的1至5倍。在题目为“Near Patient Tests：Triage Cardiac System”的第41章中描述的示例性装置中，该样品添加区的体积或容量可以进行选择，以便过量的样品提供冲洗，以从磁响应颗粒中完全去除任何未结合试剂并且进一步将靶分析物结合到来自试验过程的磁响应颗粒。因为本装置被配置为不需要这样的冲洗步骤，所以该样品添加区的容量可大大降低而减少所需样品的体积。

[0071]样品添加区还可含有用于试验过程的某些干燥试剂。例如，表面活性剂可在该样品添加区干燥，当加入样品时表面活性剂溶解。样品中的表面活性剂通过降低液体的表面张力将有助于样品和反应混合物穿过装置的运动。样品添加区可被放置以与任选的样品-反应阻挡层、与第二装置区和/或与分析物检测区直接流体接触。样品反应阻挡层

[0072]如图1所述，样品反应阻挡层2是任选的装置元件，其可将样品添加区1中的过量样品与在装置的远端区域中形成反应混合物的样品部分分开。尽管样品反应阻挡层2在任何实施方式中可以是任选的，然而样品反应阻挡层2可以给装置提供形成精确反应混合物体积的能力。

[0073]样品反应阻挡层2可包括狭窄的毛细管，其一般在大约0.01 mm至0.2mm的范围，并且毛细管的表面可以是光滑的或者具有单个凹槽或一系列凹槽，所述凹槽与样品流动平行或垂直。在样品反应阻挡层2的合适实施方式中，与样品流动平行的凹槽12被结合到与其它表面相距毛细管距离例如0.02mm至0.1mm的一个装置表面上。填充样品反应阻挡层2的样品体积优选地被保持最小，为装置中包含的下游体积的约0.01至10％，以便装置远端区域中存在的试剂不会显著扩散回到样品添加区1中的样品中。也就是说，反应混合物返回到过量样品中的扩散优选地被保持最小，以使在反应混合物中发生的化学或生化反应基本上没有受到样品添加区1中过量样品的影响。凹槽深度可以从约0.01mm至0.5mm或者从约0.05mm至0.2mm。当一个以上凹槽用于该元件时，该元件中凹槽的数目可为每厘米10与500个凹槽之间或者每厘米约20至200个凹槽。来自样品添加区1的样品通过毛细管作用在凹槽12上流动然后进入装置的远端区域。在进一步合适的实施方式中，凹槽——下文称为“指状物”16位于相邻装置区域的壁中，其与样品反应阻挡层2的凹槽12或毛细管空间流体连通。这些指状物16一般是0.5mm至2mm宽或者1mm至1.5mm宽并且一般为0.1mm至1.5mm深或者约0.2mm至1mm深。指状物16有助于样品向装置中的毛细管流动。也就是说，指状物允许流体从毛细作用相对高的毛细管运动至毛细作用较低的毛细管。因此，样品反应阻挡层处的毛细管通常较窄并且具有比反应室的毛细管或空间更大的毛细作用。毛细作用的这种差别可使得装置中样品或流体的流动在样品反应阻挡层毛细管中停止。推测而言，指状物破坏了两个毛细管或空间的界面处流体的表面张力，并且因此使得流体移动到较低毛细作用的毛细管或空间中。可以理解，指状物的效用可延伸至装置的任何部分，其中流体必须从高毛细作用流至低毛细作用。实际上，这通常是流体流动的方向是从狭窄的毛细管(较高的毛细作用)至较宽的毛细管(较低的毛细作用)时的情况。

[0074]装置中毛细管和室的表面通常可以是亲水性的，以允许样品和反应混合物经过装置流动。与室相对的表面可以是疏水性的，以便反应混合物排斥该表面。反应混合物对与室相对的表面的排斥促使反应混合物并且尤其是蛋白偶联物到达可发生任选捕获的表面，因此改进反应混合物成分到达捕获区的捕获效率。随着反应混合物在诊断元件中前进，与诊断元件相对的疏水性表面可具有变成亲水性的趋势，因为在样品或反应混合物中可内源或外生而存在的各种成分诸如例如蛋白质或聚合物结合于疏水性表面。与诊断元件相对的合适疏水性表面可由TEFLON构成。本领域技术人员熟知的是TEFLON表面较差地结合蛋白质。因此，当反应混合物流过装置的室和毛细管时，与室相对的TEFLON表面将变得不如由例如聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯等组成的表面亲水。

[0075]在另一实施方式中，室可以是亲水性的但是与室相邻的区域是疏水性的，所以试验的试剂被引导仅通过诊断元件的亲水性区域。本领域技术人员将认识到不同技术可用于形成亲水性室，诸如，除了进行处理的室外，采用遮蔽表面的掩膜(mask)对疏水性表面进行等离子体处理，或者通过将疏水性粘合剂施加到亲水性表面以限定室或者通过使用粘性疏水性化合物诸如油或油脂。在另一实施方式中，室的毛细管可通过超声焊接制成。室的边界通过用于形成超声焊接的能量导向装置指示。

[0076]毛细管空间可通过各种方式限定，诸如将表面加工成适当的容限(tolerance)或者采用表面之间的垫片。在适当的实施方式中，表面的超声焊接形成毛细管。在这种情况下，毛细管空间通过能量导向装置进行限定并且表面之间的距离是能量导向装置的大小、焊接能量、能量施加时间和焊接期间施加压力的函数。室的表面可以是平行的或非平行的。在后一情况下，试剂通过室的流速在整个长度上将是不均匀的。室的表面可以用材料诸如能被磨碎或注射成型的塑料制成，例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯等；或者用铜、银和金薄膜的表面制成，各种长链的烷硫醇被吸附在该室表面上，如Laibinis & Whitesides，J.Am.Chem.Soc.114，1990(1992)和其中的参考文献所述。在该后一实例中，朝外定向的硫醇基团可用于共价固定蛋白质、受体或者各种分子或生物分子，它们具有附着的马来酰亚胺或烷基卤基团并且它们用于结合来自反应混合物的成分。

[0077]样品反应阻挡层的上表面也可用于固定在试验过程中使用的试剂，以便样品在样品反应阻挡层上流动、溶解试剂并且运动至第二装置区。样品和试剂进入到第二装置区3室的运动可充当混合工具。第二装置区

[0078]参考图2，流体样品运动至与样品添加区201间隔开的第二装置区204，以便导入样品添加区201的流体沿着流动路径流向第二装置区204。在某些实施方式中，样品将穿过分析物检测区203以到达第二装置区204。在可选实施方式中，例如如图3所示，分析物检测区 303可以不位于与连接样品添加区301和第二装置区304的流动路径相同的流动路径上。装置的各种试剂并且尤其是标记偶联物可位于第二装置区204中，例如作为干燥或冻干的粉末，以便当流体样品进入第二装置区204时试剂快速重构。磁响应颗粒也可被放置于第二装置区 204中，以便当流体样品进入第二装置区3时反应混合物可被构成。在可选实施方式中，例如如图3所示，磁响应颗粒也可被放置于装置的另一区域，例如放置在任选的试剂室302中。

[0079]如前所述，在不同实施方式中，磁响应颗粒群可以在样品流体加入到试验装置之前、与样品流体一起或在样品流体加入到试验装置之后引入到试验装置中。磁响应颗粒群可以在施加所述流体样品之前被置于试验装置内。在某些实施方式中，该群可以在施加所述流体样品之前位于试验装置的任何部分内，因为如果必要的话它们可以通过磁场施加被传递到第二装置区。这可被称为任选的“第三装置区”。在其它实施方式中，磁响应颗粒群位于第二装置区之内或之上，使得其通过磁场施加而引起的运动不是形成反应混合物所必需的。仍在其它实施方式中，磁响应颗粒群至少部分是通过将样品流体加入到试验装置之后发生的流体流动被传输到第二装置区。

[0080]混合反应混合物的混合特征也可与第二装置区3联合被并入，诸如在WO92/21434中描述的那些，其因此被并入作为参考。样品填充装置区域，到达第二装置区，这是由于毛细管力、由流体静压产生的力、通过施加由机械泵、电渗泵所产生的力、离心力、增加的气压、或者通过两种或多种这样的力的组合而实现的。

[0081]第二装置区的体积可以是任何体积，其容纳试剂并且其提供期望的试验灵敏度。第二装置区室和/或从第二装置区延伸至磁性颗粒在装置中定位的位置的室或狭路的形状可以进行设计，以便降低或最小化由于磁性颗粒进入或离开室的运动而引起的反应混合物的运动。在使第二装置区与磁响应颗粒接触后，在磁响应颗粒传递到装置的检测区之前，磁力可用于“混合”反应混合物，以提高捕获效率以及降低试验变率。第二装置区合适的形状被显示在图1中，如元件3，然而，精确的形状不是关键的。宽度和深度优选地为中等尺度的尺寸，并且可在约0.01mm至10mm的范围内。在某些实施方式中，宽度和/ 或深度在0.03mm与0.6mm之间。任选试剂室

[0082]参考图3，任选试剂室302可用于将额外试剂引入试验过程中。一般地，任选试剂室302可与样品添加区301、与导向第二装置区304的流动路径、和/或与导向分析物检测区303的流动路径流体接触。所引入试剂的流动可以通过类似于上述样品反应阻挡层的样品反应阻挡层进行控制。分析物检测区

[0083]参考图2，分析物检测区204可以与第二装置区201流体连通，并且优选地从相隔毛细管距离的相对面形成，流体样品从中流动。如本文所讨论，流经该装置的流体填充穿过该装置的流动路径，并且在第二装置区201产生反应混合物。该反应混合物与磁响应颗粒相接触以捕获与一种或多种感兴趣分析物对应的检测标记偶联物。在标记偶联物与磁响应颗粒在第二装置区3中接触后，磁场被设置为诱导磁响应颗粒配合物沿着向分析物检测区203的路径运动。这种运动方向被设置成与来自样品添加区201的流体流动中的至少一部分流动的方向不同并且优选地与之相反。如图2所示，在朝向分析物检测区 203的路径上的磁响应颗粒配合物的运动方向全程与流体填充该装置的方向相反，而如图3B所示，该运动方向仅在部分距离上与流体填充该装置的方向相反。

[0084]在夹心式测定中，夹心配合物被制成，其包括固定在磁响应颗粒上的第一分析物受体、分析物以及结合于可检测标记上的第二分析物受体(标记偶联物)。在竞争性测定中，可检测标记分析物(标记偶联物)和样品中的分析物竞争以便与固定在磁响应颗粒上的分析物受体形成配合物，或者固定在磁响应颗粒上的分析物与样品中的分析物竞争以与可检测标记的分析物受体(标记偶联物)形成配合物。在任何情况下，包括带有结合于其上的标记偶联物的磁响应颗粒的配合物被递送到分析物检测区，用于产生来自可检测标记的信号。这种描述不意味着的限定性的，并且其它合适的测定类型为本领域技术人员所熟知。

[0085]这种配合物被递送在分析物检测区内后，代表测试样品中靶分析物的存在或数量的信号可以进行测量。本领域技术人员可以理解，不同的方法可用于检测分析物检测区中的信号。示例性类型的光学检测方法包括但不限于目视和仪器手段，诸如通过CCD照相机的分光光度法和反射率法、荧光计和分光光度计。本领域技术人员所知的其它检测方法可以被使用。在检测光学标记时，分析物检测区可以用照射该区域的、针对所采用标记具有合适波长的光源进行询问 (interrogated)，并且光学检测器可以被定位以接收透射光、反射光或发射光，这取决于检测方法。

[0086]尽管被传递至分析物检测区的磁响应颗粒通常被一同询问以便检测结合于其上的标记种类，但是在一些实施方式中，分析物检测区可以被配置为提供“流式细胞(flow cell)”，磁响应颗粒以单个形式穿过其中。随着每个颗粒穿过，单个颗粒可以用光源询问，并且来自该单个颗粒的透射光、反射光或发射光可以以类似于流式细胞术的方式进行检测。通过使用多个不同的可检测颗粒，每一个对应不同的分析物，此类流式细胞排列在测量多个分析物的存在或数量时可以是有利的。典型的多元系统基于采用多个(高达100或更多)彩色编码颗粒集合的技术，其中每一个可以与不同的特定反应物(例如特定抗原的抗体)结合。如果100个不同的颗粒集合被使用，那么100个不同的种类可以在单管或微板孔中同时测量。固定的“结合珠 (bead-bound)”捕获分子与溶液中与反应伴侣(分析物)反应。与分析物具有特异性的报道分子被用于量化相互作用(例如形成夹心对、与可检测标记偶联的二次抗体)。单个颗粒可一次一个地被询问，并且集合中的每个颗粒通过其光谱特征被鉴定。来自每个反应的附带报道分子信号被同时量化。

[0087]多元试验的可选方法可包括使用与每个感兴趣分析物对应的不同可检测标记偶联物。这些不同的可检测标记偶联物可包括例如结合于独特(对于分析物来说)标记连接的感兴趣分析物的抗体，所述独特标记与其它分析物所用的标记可区分。光学标记可以通过不同的光谱特性进行区分，其包括吸收或发射波长、荧光寿命等。这种方法可以与上述彩色编码颗粒集合组合以进一步扩大可进行区分的分析物的数目。例如，2个可区分的颗粒与2个可区分的可检测标记偶联物的组合可允许技术人员区分与4个不同试验相关的信号。

[0088]前面是就光学可检测标记进行描述的，但是本技术人员将理解可以利用许多其它的检测模式，这取决于标记的特性。检测模式包括电流测定、电导测定、电势测定、阻抗测定、声学法、荧光、反射率、发光、电化学发光(ECL)、干扰测量、表面等离振子共振(SPR) 法。这一列举不意味着具有限定性。

[0089]在不同实施方式中，分析物检测区的体积可以类似于第二装置区的体积或与之不同。分析物检测区室和/或从第二装置区延伸至分析物检测区的室或狭路的形状可以进行设计，以便降低或最小化由于磁性颗粒进入或离开室的运动而引起的反应混合物的运动。分析物检测区优选地是充分展平的，并且分析物检测区的宽度和深度每个优选地为中等尺度尺寸，并且可在约0.05mm至10mm的范围或者从约 0.1mm至0.6mm。在优选的实施方式中，一个尺寸(深度或宽度)为 0.01至10mm并且优选地0.1至0.5mm，而另一尺寸(深度或宽度) 为0.25至2mm并且优选地0.5至1mm。

[0090]分析物检测区的表面像装置的其它组件一样可任选地是光滑的、凹槽形的或者凹槽形且光滑的。不同的纹理表面可以单独地或者与光滑的或凹槽形表面组合地使用。例如，可以使用由桩、凹槽、棱锥等——被称为突起——组成的表面；或者由孔、缝、网格图案等 ——被称为凹陷——组成的表面。该表面可包括这样的纹理结构，其包括菱形、六边形、八边形、长方形、正方形、圆、半圆形、三角形或椭圆的形式。纹理表面可包括成行有序的、交错的、或完全随机的几何形状的纹理结构；可以组合不同的几何形状以产生期望的表面特征。典型地，纹理结构的突起或凹陷范围可为从约1nm至0.5mm或者从约10nm至0.3mm；不同的凹陷或突起之间的距离范围可为从约 1nm至0.5mm或者从约2nm至0.3mm。凹槽的位置可与反应混合物的流动垂直，以便反应混合物穿过分析物检测区的流动以有组织的方式发生，其中明显的直面表示为毛细管空间中的凹槽。

[0091]在某些实施方式中，一个或多个分析物检测区室(或多个) 可被包括在装置中。如图4中所示，流体样品可在普通样品添加区— —被描述为元件401和404——施加到装置，然后被分成两个或多个不同的流动路径，其中具有分开的第二装置区403和/或一个或多个第二装置区408。任选的血液过滤元件——被描述为图4中的元件405—— 可被包括在内，如上所讨论。分析物检测区402和406可被设于装置的不同室中。在某些实施方式中，两个或多个第二装置区可以被提供，例如以平行的路径，以提供多元测定(也就是说，从单一样品中检测多种分析物)。此外，明显的比色或荧光标记也可以使用，以便沿单一流动路径提供多元测定。各种检测模式组合是可能的并且为本领域技术人员所知。尽管此类装置各种的流动路径被描述为“平行的”，但是本领域技术人员可容易制备其它一维、二维和三维的几何结构，并且引导磁响应颗粒以不同于流体流动的速度运动至检测区。该区域可以是独立的室或者可以是没有给室确定界限的装置表面。

[0092]如图3B所示，分析物检测区303可以不在从样品添加区 301至第二装置区304的直接流动路径上。在这样的实施方式中，在进入可控磁场后，磁响应颗粒从第二装置区304流动至一个或多个分析物检测区303，在穿过第二流动路径运动之前，其至少一部分穿过该装置的流动与穿过该装置的流体流动的方向相反。所用试剂储蓄器

[0093]参考图1，任选的所用试剂储蓄器5可接收来自装置的上游区的反应混合物、其它试剂和任何过量的样品。所用试剂储蓄器5 的体积可至少为加入到装置中或在装置中的样品和额外试剂的体积。所用试剂储蓄器5可采取利用吸收剂的许多形式，所述吸收剂诸如硝化纤维、多孔聚乙烯或聚丙烯等的吸收性材料，或者所用试剂储蓄器可由一系列毛细管凹槽组成。在所用试剂储蓄器5中凹槽的情况下，毛细管凹槽可以被设计成具有不同毛细管压力以拉动试剂经过装置，或者允许试剂在没有毛细管拉动下被接收并且防止试剂在装置中的逆流。凹槽形毛细管的大小和数量决定了所用试剂储蓄器5的体积和毛细作用。如图4所示，流体样品可从多个流动路径传递至常用的试剂储蓄器407。分析仪器

[0094]本发明的另一实施方式涉及采用测量试验仪器诸如CCD 相机、荧光计或分光光度计在上述测试或试验装置上进行测量的系统和方法。根据本发明的一种实施方式，该试验装置可与测定仪器例如增强型荧光计联合使用，以便获得关于样品中分析物的浓度或存在的结果。试验装置包括进行免疫学或化学反应必需的试剂，此类反应引起已经用试剂处理的样品的荧光上的变化。试剂可以包括化学品、抗体、肽、分析物、分析物类似物，并且这些试剂可以与荧光标记或者固相诸如磁响应颗粒结合或者不与其结合。

[0095]图5是图解增强型测定仪器的一种实施方式的功能方块图的图表，其针对共同拥用的美国专利号6,830,731中描述的那种荧光计，其因此以其全部并入作为参考。图5图解了根据一种实例物理构造— —中央总线结构，可被自动荧光计包括在内的功能的实例。根据图5 中所示实施方式的增强型荧光计包括处理器504、电源508、用户界面 512、存储器516、通信接口520、测定机构524、试验装置522、存贮装置528和可移动存储介质。在图5所示的实例中可移动介质包括 ROM芯片536和插口532。任何或全部这些功能可被增强型荧光剂包括在内，这依赖于特定应用。在美国专利号6,830,731(对应于图1) 中提供的相应描述将给本领域技术人员提供利用一种或多种可选构造来执行任意或全部所述功能的能力。

[0096]参考图5，测定机构524可用于在试验装置上进行荧光计读数以便于检验一种或多种分析物的存在或浓度。在一种分析方式中，测定机构524可以是滑块机构，其用于接收小盘状装置，例如试验装置。测定机构524可包括进行反应配合物读数所必需的光学元件以及滑块，试验装置可在滑块上滑动以将测定区定位在合适的位置上，因此荧光可以以重复的方式进行测量。在一种实施方式中，该机构是电动化的，以便试验装置可以被自动加载并且从荧光计中卸载以及在测试期间相对于光学器件和磁体定位。在这种实施方式中，试验装置在具有磁力的滑块上沿着路径被传输以将磁响应颗粒配合物拉动至分析物检测区4，用于通过荧光进行测定。在试验装置中荧光测量可检测标记的路径被称为该装置的“诊断狭路(diagnostic lane)”。

[0097]图6是图解根据本发明的一种实施方式进行测定机构或试验装置驱动的实例。根据图解实施方式的试验装置驱动包括驱动电子仪器504、位置编码器508、磁力610和编码标记读数器512例如诸如条形码读数器。在一种实施方式中，驱动电子仪器604包括定位试验装置的电动机以及控制电动机的电动机控制器。摩擦驱动、皮带驱动、齿轮驱动或其它机构可用于将电动机的转动转化成试验装置的运动。驱动电子仪器604因此被用于装载和卸载分析仪器，以及相对于荧光计的光学器件定位试验装置，例如沿着诊断狭路定位。在该实施方式中，试验装置相对于静止光学器件移动。在可选实施方式中，光学器件可以被移动，而不是试验装置，或者除试验装置外，光学器件可以被移动。

[0098]在各种合适的实施方式中，测定仪器提供来自磁场源的可控磁场。如本文所使用，术语“可控磁场(controllable magnetic field)” 是指可被施加至试验装置、强度在空间和/或时间上变化的磁场。举例来说，本技术人员将理解，一个位置处的磁场强度将随着该位置与磁场源之间的距离增加而下降。因此，通过磁极面的特定形状和/或通过提供改变磁场源与试验装置之间距离的一种或多种定位系统，本发明的测定仪器可以提供可控磁场。在这种情况中，磁场源、试验装置或者两者可以通过定位系统(或多个)而移动。可选地，磁场源可以进行电子控制，如在电磁铁的情况中。仍在另一可选方式中，改变施加到试验装置的磁场强度的可移动屏蔽可以作为测定仪器或试验装置的组件被提供。在这样的仪器中可提供可控磁场的其它元件对本领域技术人员来说将是明显的。

[0100]磁场610的感应被用于将由标记偶联物、感兴趣分析物和磁响应颗粒组成的反应配合物从第一位置(即第二装置区3)移动至第二位置(即分析物检测区4)，就该路径的至少一部分来说，其方向与穿过该装置的流体流动的方向相反，因此降低了未结合标记对信号的污染，因为与样品流体一起流动的未结合标记将被引导远离分析物检测区，并且消除了对冲洗步骤的需要，所述冲洗步骤对于许多引入磁响应固相基质的方法来说是常见的。

[0101]可达大约一特斯拉(一万高斯)的磁场强度可以通过永久磁体的方式产生。高场强的永久磁体通常用铁金属合金诸如铝镍钴、陶瓷铁氧体诸如锶铁氧体、或者稀土合金诸如钕铁硼和钐钴进行制备。大于一特斯拉的场强可以通过包括超导磁体在内的电磁体的方式产生。永久磁体和电磁体两者均以宽范围的尺寸和设计容易得到。例如，用钕铁硼制备的高场强的永久磁体可从Kinetic MicroScience(Los Gatos，Cal.)、Neomax America(Santa Clara，Cal.)、Dexter Magnetic Technologies Inc.(Fremont，Cal.)和Magnet Sales & Mfg.Co.(Culver City， Cal.)得到。永久磁体相对于电磁体具有许多优势，其中最明显的是它们不需要外部电源，并且进一步包括低成本、便携性以及设计灵活性。另一方面，电磁体具有这种优势：它们的场强可以通过电驱动电流的方式进行控制。

[0102]正如本领域技术人员所理解，通过磁场B施加到载流子流体中的磁性颗粒上的净力Fmag如下给出：

F_{mag} = \frac{Δχ \cdot V_{p}}{μ_{0}} \cdot (▿ \cdot B) \cdot B

其中Vp是颗粒体积；Δχ是磁性颗粒与载流子流体之间的磁化率差；μ0 是自由空间的渗透率；和是场梯度。为了进行磁分离，使作用于磁性颗粒的磁力最大化通常是期望的。根据上述关系，对于给定颗粒大小和磁化率，这是通过使磁场强度与场梯度的乘积最大化而实现的。可进一步理解的是，磁性颗粒可被捕获在磁场强度为最大值的区域，即其中场梯度为零。最后，应当注意，磁性颗粒上的力与ΔX·Vp 成正比。因为这个原因，颗粒大小和大小分布对于实现有效的磁分离来说是重要的考虑因素。

[0103]直径约0.3μm以上至约1μm的磁性颗粒可采用简单的永久磁体进行分离，而对于范围在几十至几百纳米的更小颗粒来说合理的分离比率可能需要更高的磁场，其只有通过使用包括超导磁体在内的电磁体可以实现。在本发明的某些实施方式中，其中使用的是这样的磁性颗粒——直径在1-10μm的范围内并且典型商业上可得到的超顺磁性珠的磁化率在1×10-4m3/kg至2×10-4m3/kg的范围内，范围在 0.1-1.0T(特斯拉)的场强是合适的。

[0104]磁场610的功能是将磁响应颗粒沿着诊断狭路从第一位置移动至第二位置。第一位置可以是例如第二装置区3，并且第二位置可以是检测区4。磁场源可以是前述永久型磁体或电磁体之一。在任一情况中，磁体面或“磁极”的近端和形状将根本上决定场分布以及尤其场强度和梯度。在本发明合适的实施方式中，用于影响磁响应颗粒运动的磁场可以被设计，以便将分析物集中在诊断狭路的一个或多个特定区域，用以通过光学元件进行测量。为了实现这一点，可以使用各种有利的磁极面设计。磁场610源可以是固定的磁场梯度或可移动的磁场阱。在前一情况中，一对相对的磁极面——具有近似的横向尺寸的诊断狭路并且沿着诊断狭路方向具有适当变化的间隙——可被配置，以影响沿着期望长度的诊断狭路上单调变化的磁场强度。还应当理解，单磁极磁铁可被配置以产生合适的磁场阱。所产生的磁场然后倾向于将磁响应颗粒从较弱的磁场区域移动至较强的磁场区域，其中颗粒最终将被捕获在最大场强区域中的平衡点处。特别有利的设计将产生这样的磁场：其在大部分期望长度的诊断狭路上具有近似恒定的磁场、场梯度乘积(B＊)，从而沿着该路径在磁性颗粒上产生相对恒定的磁力。在与该狭路横向的维上的磁极面也可以变窄并且被设计成沿着诊断狭路的中心产生具有最大值的横向磁场梯度，因此进一步将磁响应颗粒集中在该区域中。磁响应颗粒被诱捕在其中的最大磁场区域可近似对应于诊断区域4。在该系统运行的一部分期间，将磁场从试验装置中部分或完全地去除可能是必须的。这可以用过下列之一种或多种措施来实现：(1)在永久磁体的情况中，将试验装置和/或永久磁体移动至遥远的位置或者将磁体与磁响应颗粒屏蔽开来；(2)在电磁体的情况中，简单地降低或关掉驱动电流。

[0105]在可选实施方式中，磁响应颗粒可以通过一个或多个永久或电磁体型磁体从第一位置移动至第二位置，所述磁体产生多个定位的磁阱，并且其中阱区域通过迁移磁体和/或试验装置任一或两者而移动。在该实施方式中，磁极可以被成形为只在需要包括第二装置区3 的区域的尺寸上产生场梯度。合适的磁极形状可包括，例如一对相对的半球状磁极，其间的间隙容纳狭窄尺寸的试验装置。其它磁极形状是可能的并且包括具有锥形磁心的小直径永久磁体和电磁体。成形的磁极可被用于产生期望的磁场梯度，例如用于提供均质区域(也就是说，其中磁场梯度为0的区域)。并入微流装置的微型制造的磁体也可以使用。还应当理解，单磁极磁体可被配置为产生合适的磁场阱。在磁场的一种实施方式中，两块磁体可紧邻装置的下游狭路末端放置并且磁体间的距离可在1-25mm的范围内。在磁场的另一种实施方式中，两块磁体可紧邻装置的下游狭路末端放置并且磁体间的距离可在 1-10mm的范围内。在磁场合适的实施方式中，两块磁体可紧邻装置的下游狭路末端放置并且磁体间的距离可为3mm。使用两个或多个磁体诸如锯齿金丝或网状金丝也是可能的。施加可变磁场的各种磁体和方案被公开在Pamme，N.，Lab Chip，6，24(2006)中，其在此被并入作为参考。

[0106]磁场610强度可通过本技术人员所知的各种方法进行控制。如能够理解的，例如，某一位置处的磁场强度将随着该位置与磁场源之间的距离增加而下降。因此，本发明的试验装置可通过提供改变磁场源与试验装置之间距离的一种或多种定位系统611而提供可控磁场。在此类情况中，磁场源、试验装置或两者可以通过定位系统(或多个)进行移动。可选地，磁场源可以进行电子控制，如在电磁体的情况中。仍在另一可选方式中，改变施加到试验装置的磁场强度的可移动屏蔽可以作为测定仪器或试验装置的组件被提供。在这样的仪器中可提供可控磁场的其它元件对本领域技术人员来说将是明显的。

[0107]位置编码器608被用于测定试验装置在试验装置驱动内的位置。位置编码器608可通过例如自动检测试验装置上的编码标记获得来自试验装置本身的位置信息。可选地，位置编码器608可采用熟知的编码器技术基于穿过电动机的驱动轴的旋转确定试验装置的位置。编码装置读数器612被用于读取在试验装置上提供的编码标签。在一种实施方式中，编码标签读数器612是条形码读数器，其读取试验装置上的条形码标记。可选实施方式可包括例如磁条读数器、感应读数器或光学字符识别器。编码标签读数器612自动检测来自试验装置上的标记的编码标签信息并且将该信息提供给测定仪器的处理器 504。编码信息可包括信息诸如例如病人身份证明、对样品进行的测试的鉴定、同一类型的鉴定或其它适当或恰当的信息。该信息可被用于记录测试结果以及控制所进行的测试的类型或所使用的测试参数。

[0108]在一种实施方式中，驱动电子仪器604和位置编码器608 被用于引导试验装置安置于磁场中以便可以测试该试验装置，以及被用于在测试期间重新安置该试验装置以便可以测试试验装置的多个区域。这种安置试验装置的能力——以便可测试样品的不同部分——允许使用增强型测试运算法则以产生改良的测试结果。可使用的增强型测试路线——其中试验装置的不同区域被测试——的实例被充分描述在同一受让人的共同未决专利申请中，它们是：现为美国专利号 5,763,189——申请序列号08/311,098，题目为“Fluorescence Energy Transfer and Intramolecular Energy Transfer in Particles Using Novel Compounds”，以及申请序列号08/409,298，题目也为“Fluorescence Energy Transfer and Intramolecular Energy Transfer in Particles Using Novel Compounds”，其在此被并入作为参考。试验装置和测定仪器系统的示例性实施方式

[0109]已经被单独描述的装置元件可以以不同方式进行组装以实现期望功能。在某些实施方式中，一个手动行为对于获得测定结果来说是必要的，例如，将样品加入到装置中是一个步骤。该装置通常大约3cm至10cm长，1cm至4cm宽，并且大约1mm至4mm厚。该装置的厚度可达5mm、可达10mm或可达大约15mm厚。一般地，具有光滑表面的顶部部件被置于底部部件之上，所述底部部件具有在其上建造上述元件的表面。进行该试验所需的试剂被固定或置于各自元件之中。这些表面被组合在一起，相距毛细管距离，并且在如此操作时，样品添加区、样品反应阻挡层、第二装置区、分析诊断区、流动路径和所用试剂的储蓄器的区域被一起形成，并且能够在一起发挥作用。另外，这些表面被组合在一起，以便相对的表面接触而构成并且密封样品添加区、分析物检测区和所用试剂的储蓄器。

[0110]在进行夹心式测定的一种实施方式中，该测定通过将样品添加至该装置的样品添加区而进行。样品溶解并且混合在样品添加区中提供的任何试剂。该样品移动进入该装置并且沿着流动路径流动，填充分析物检测区和第二装置区并将它们流体连通。该样品溶解该装置内存在的试剂(即标记偶联物)。包含一种或多种感兴趣分析物的受体的磁响应颗粒接触全部或部分样品，如果存在感兴趣分析物(或多种)的话，则捕获该感兴趣分析物(或多种)。在第二装置区中的标记偶联物在至少一部分流体样品存在下进而接触磁响应颗粒群，并且夹心配合物形成。这些磁响应颗粒被设置为：以与反应混合物中感兴趣分析物的存在或数量相关的量，与标记偶联物形成配合物。如果必要的话，试验装置可被引入测定仪器中以便提供这样的磁场：所述磁场被设置成诱导磁响应颗粒在到达第二装置区3的路径上运动。

[0111]在形成夹心配合物后，此刻结合于标记偶联物和感兴趣分析物的磁响应颗粒可以通过将磁场施加至试验装置与反应混合物分离。该试验装置被引入测定仪器中以便测试一种或多种分析物的存在或浓度。因为磁响应颗粒以与感兴趣分析物的存在或数量相关的量与标记偶联物形成配合物，所以根据标准受体结合试验方法，所检测的信号可以与分析物的存在或数量关联。

[0112]在进行竞争性测定的一种实施方式中，该测定通过将样品添加至装置的样品添加区进行。该样品溶解并且混合在样品添加区中提供的任何试剂。样品进入该装置并且沿着流动路径流动，填充分析物检测区和第二装置区并将它们流体连通。样品溶解该装置内存在的试剂(即标记偶联物、磁性颗粒等)。包含一种或多种感兴趣分析物的受体的磁响应颗粒接触全部或部分样品，其中如果存在感兴趣分析物 (或多种)的话，标记偶联物与该感兴趣分析物(或多种)竞争，以与受体结合。这些磁响应颗粒被设置为：以与反应混合物中感兴趣分析物的存在或数量反相关的量，与标记偶联物形成配合物。如果必要的话，试验装置可被引入测定仪器中以便提供这样的磁场：所述磁场被设置成诱导磁响应颗粒在向着第二装置区的路径上运动。

[0113]在形成受体配合物后，此刻结合于标记偶联物的磁响应颗粒可以通过将磁场施加至试验装置与反应混合物分离。该试验装置被引入测定仪器中以便测试一种或多种分析物的存在或浓度。因为磁响应颗粒以与感兴趣分析物的存在或数量反相关的量与标记偶联物形成配合物，所以根据标准受体结合试验方法，所检测的信号可以与分析物的存在或数量关联。

[0114]在进行竞争性测定的另一种实施方式中，该测定通过将样品添加至装置的样品添加区进行。该样品溶解并且混合在样品添加区中提供的任何试剂。样品进入该装置并且沿着流动路径流动，填充分析物检测区和第二装置区并将它们流体连通。该样品溶解该装置内存在的试剂(即标记抗体)。包含与一种或多种感兴趣分析物竞争性结合于受体的分子的磁响应颗粒接触全部或部分含有标记抗体的样品。这些磁响应颗粒被设置为：以与反应混合物中感兴趣分析物的存在或数量反相关的量，与标记抗体形成配合物。如果必要的话，试验装置可被引入测定仪器中以便提供这样的磁场：所述磁场被设置成诱导磁响应颗粒在向着第二装置区的路径上运动。

[0115]在形成配合物后，此刻结合于标记抗体的磁响应颗粒可以通过将磁场施加至试验装置与反应混合物分离。该试验装置被引入测定仪器中以便测试一种或多种分析物的存在或浓度。因为磁响应颗粒以与感兴趣分析物的存在或数量反相关的量与标记偶联物形成配合物，所以根据标准受体结合试验方法，所检测的信号可以与分析物的存在或数量关联。

[0116]测定仪器可采用精确安置试验装置的驱动电子仪器自动加载试验装置。在引入到测定仪器后，位置编码器通过自动检测该装置上的编码标记来确定来自试验装置的位置信息。位置编码器和驱动电子仪器将试验装置运输到可控磁场中，所述可控磁场诱导磁响应颗粒配合物在试验装置内在进入分析物检测区的路径上运动，以便标记分析物的荧光可以被测量。对于该路径的至少一部分来说，磁响应颗粒的速度不同于来自样品添加区的流体样品的流动，使得未结合标记偶联物信号的污染降低，因为相比未结合标记向检测区的扩散，磁响应颗粒更快地被传递到检测区，未结合标记向检测区的扩散可产生显著的背景信号。这可消除对冲洗步骤的需要，所述冲洗步骤对于许多并入磁响应固相基质的方法来说是常见的。然后检测来自分析物检测区中的标记偶联物的信号。

[0117]图11描述了一种模式，其中本发明的装置和仪器可用于进行夹心式测定。在该图的图A中，描述的是装置的“狭路”1101，其中末端1102与样品添加区流体连通，并且末端1103代表该狭路的远端。该狭路的容量优选地10μL以下，更优选地5μL以下，并且最优选地大约1-2μL，并且充分亲水以允许流体填充该狭路。该狭路被允许填充样品，因此流体流动被阻止。这可以通过下述实现：简单地，到达该狭路的末端，在该狭路的远端合并毛细管“间隙”，或者将充当流体“填塞”(在该图中被描述为特征1107)的疏水性材料施加于该狭路的表面。在用样品流体填充该装置之后或期间，磁响应颗粒1104通过磁阱1105被保持在该狭路的近端，并且标记偶联物1106被重构以在该狭路的远端附近提供反应混合物。在该图的图B中，磁阱1105已经被用于吸引磁响应颗粒穿过该狭路。样品中的分析物在该运动过程中被磁响应颗粒捕获。磁响应颗粒被传递至反应混合物，在那里形成夹心配合物1108。在图C中，磁阱1105已经被用于将磁响应颗粒“向上游”传递至检测区，在那里光源1108指引电磁辐射，以从结合于磁响应颗粒的标记产生信号，该信号通过光学检测器1109检测。例如，如果磁阱干扰信号的产生和检测，则该磁阱可在该处被除去或屏蔽。

[0118]在各种可选模式中，结合于磁响应颗粒的标记的检测可以随着磁响应颗粒流动穿过检测器而进行，而不是从保持在磁阱中的磁响应颗粒进行检测。通过使用与待检测分析物对应的可检测的不同标记，该模式对于多种分析物的多元检测来说是特别有利的。在该模式中，检测类似于在毛细管电泳核酸测序装置中使用的检测，其中4种碱基A、T、G和C通过使用四种“桑格(Sanger)”双脱氧反应的可检测的不同标记进行检测。在该“流式细胞”模式的某些实施方式中，磁力可被用于驱动磁响应颗粒流动穿过狭窄流动路径，该流动路径迫使流动以单个颗粒进行，并且检测器可被用于鉴定结合于每个单个磁响应颗粒的标记。

[0119]本发明的系统和方法适合于这种定量测定，这是由于通过试剂捕获分析物的效率高，例如，靶配体和受体偶联物的复合物与针对所述靶配体的固定化受体结合，以及是由于利用可控磁力磁响应颗粒快速且完全地运动——与流体样品直接向光学传感器的流动相反，并且因此标记被检测，尤其在具有如本文所述的高纵横比的装置中。本发明的系统和方法也是适合的，因为将磁响应颗粒与流体样品分离的反应混合物的运动将污染降至在装置中作为可检测标记偶联物存在的总可得信号的10％以下，1％以下，0.1％以下，0.01％以下，0.001％以下或者0.0001％以下，这是由于随着样品流体流动的未检测标记被指引远离分析物检测区(或多个)，从而消除了对冲洗步骤的需要，所述冲洗步骤对于许多引入磁响应固相基质的方法来说是常见的。优选地，测定信号的背景污染是不可察觉的，这意味着它不参与被检测的测定信号。实施例

[0120]下列实施例有助于阐明本发明的某些实施方式。这些实施例决没有意图限制本发明的范围。实施例1：采用固定磁场梯度检测BNP抗原
制备带有微流通道的装置

[0121]下面描述了方法和装置，其被设置为进行检测BNP的夹心式测定。尽管针对作为分析物的BNP以及夹心类型进行描述，本技术人员将理解，下列方法可以被修改以进行通常利用上述各种试验类型的分析物测定。

[0122]在这些实施例中使用的装置由制造Biosite TRIAGE试验装置所用的部件制成并且如下讨论被修改。本文只提供与实施例有关的装置细节。这些装置包括NAS 60塑料基座，其标称尺寸100mmx35 mm；以及盖子，其也是用NAS 60塑料制成，其通过超声焊接连接到基座上。基座具有由浅脊和凹槽组成的布局，其最重要的方面是沿着基座的长轴设置的狭路。当盖子被焊接到基座上时，通道就在30-60mm 长、2mm宽和30-50微米深的狭路(lane)区域中形成。在本实施例中，基座和盖子被切割，以便装置的长度为20mm，而盖子的长度及因此通道的长度为18mm。在下述中，该狭路的一端应当被称为下端或下游狭路，并且另一端应当被称为上端或上游狭路。

[0123]产生改进装置所用的步骤如下：1.用#58 钻头在盖子中钻孔，使得该孔位于该狭路的中心并且与下端相距1.5mm。2.切割该盖子以便它覆盖最终板上18mm的长度。3.采用EFD喷射系统(EFD，Inc.， East Providence，RI)，用酪蛋白溶液(1mg/mL)的薄雾喷射已清洁的基座。4.将疏水性油墨施加于该狭路的边缘，以便将血浆保持在该狭路内并且防止它沿着该边缘流动。5.用盖子喷雾(50％乙醇、0.025wt％ PEG)喷射该盖子。6.采用自动移液器(Pipetman)，将0.2μl一抗偶联物——在这种情况下，为抗-BNP一抗-结合荧光能量转移胶乳 (“BNP-FETL”)——点在距离该狭路下端6mm的狭路上。6.将盖子超声焊接到基座上。8.将该装置的两端用端铣刀(end mill)去除，产生20mm长的板。注意通道的下端被焊接闭合，其造成需要盖子中的孔以允许流体流动。在上端，盖子比基座短2mm，产生可以分配流体的边缘。荧光信号的检测

[0124]荧光信号通过在光学装置(optic block)下扫描该装置产生并且被检测。在扫描期间，借助Parker载物台(2-轴Compumotor分度器AT6200以及Parker线型载物台P/N 106006BTEP，Parker Hannifin Corp.，5500Business Park Dr.，Rohnert Park，CA 94928)，装置以大约 6mm/sec的速度移动。光学系统取自Biosite TRIAGE荧光计，并且由 670nm 激光器、760nm荧光的共焦检测所用的光学器件和滤光器、光电二极管和信号放大电路组成。来自光电二极管电路的电压信号用 National Instruments Ni-DAQPCI-MIO-16XE-50 数据采集卡数字化。用于控制Parker载物台和数据采集的软件由Microsoft Visual Basic 6内部编写。磁珠-BNP测定的材料和方法
1.结合磁性Dynabeads与BNP抗体

[0125]采用下列步骤将顺磁性Dynabeads结合于BNP二抗。首先，将1.06mL BNP抗体溶液(为F(ab’)2，10mg/mL)加入到0.94mL 50/10/150缓冲液(该缓冲液处于pH 7.0下，并且含有50mM磷酸钾、 10mM硼酸和150mM 氯化钠)中。BNP抗体(BNP Ab)用5mM DTT (DTT，Product#20290，Pierce Biotechnology，Inc.)还原并且在室温下搅拌30分钟。所得溶液通过使用1.5cm直径的柱和40mL G-50凝胶的尺寸排阻层析进行提纯。1.5mL磁珠(Dynabeads M-270Amine，Prod# 143.07，Dynal Biotech ASA，Oslo，Norway))在50/10/150缓冲液中冲洗三次。珠被重构至4.5mL以制成1％混合物。溶解在DMF(Product# 22705-6，Sigma-Aldrich，Co.)中的SMCC(Product#22360，Pierce Biotechnology，Inc.)(10mg/mL SMCC(DMF))被加入到珠中至0.5 mM的终浓度并且在室温下搅动2h。该反应在室温下用20mM牛磺酸 (Product#T-0625，Sigma Chemical Corp.)猝灭30min。珠用50/10/150 缓冲液冲洗三次并且在50/10/150中重构以制成2％混合物。将2.1mL 该混合物加入到纯化的、还原的BNP Ab-溶液中并且在4℃下搅动过夜。该反应在室温下用1mM BME(Product#M6250，Sigma-Aldrich Co.) 猝灭30分钟，然后在室温下用1mM NEM(Product#128287， Sigma-Aldrich，Co.)猝灭15分钟。珠用50/10/150缓冲液冲洗三次，并且在1.0mL 50/10/150缓冲液中被重构以制成按重量计2％的混合物。2.用BNP标准物温育Dynabead-BNP抗体复合物。

[0126]5μL Dynabead-BNP抗体悬浮液在Eppendorf管中与15μL BNP标准校准溶液(Biosite Incorporated)混合。混合物被涡旋并且在室温下温育20分钟。Eppendorf管然后储存在冰上直至使用。

[0127]为了测试测定响应，不同BNP校准溶液被用于不同的实验中。当与珠悬浮液混合时，所测试的BNP浓度范围为0至2303pg/ml。观察测定响应

[0128]Dynabead-BNP抗体+抗原配合物的悬浮液被移液到装置上的上游狭路端部处。观察到悬浮液通过毛细作用沿着该狭路的流动并且在不到10秒内到达BNP-FETL斑点。在这一点上，Dynabeads穿过该狭路被均匀展开。然后磁体(钕铁硼磁铁，11mm×11mm，来自 Kinetic MicroScience，19395Montevina Road，Los Gatos，CA 95033， Scitoys Levitaion Bundle#2)被置于该装置的下游狭路端部附近一分钟。一个磁极指向狭路，在该磁体方向上产生磁场梯度。该磁体将顺磁性珠拉向BNP-FETL斑点区。观察到该狭路的剩余部分在30秒内不含棕色Dynabeads。

[0129]然后移走磁体并且扫描该装置的荧光信号，操作需要大约一分钟。然后该磁体被置于该装置的上游狭路端部一分钟以吸引顺磁性珠远离BNP-FETL斑点。观察到珠移动至上游狭路并且在盖子的边缘处形成簇。

[0130]在移走磁体后，再次扫描该装置的荧光信号。在珠的位置观察到新的信号峰。图7显示该信号强度对上面使用的校准溶液中的 BNP浓度的图示。该信号强度与BNP的浓度相关。实施例2：采用移动磁场阱检测BNP抗原
含有微流通道的装置的制备

[0131]如实施例I，在该实施例中使用的装置由制造Biosite’s TRIAGE装置所用的部件制成并且如下讨论被改进。在本实施例中，只有盖子被切割以容许将溶液分配在基座上的平台。基座的形状没有改变，因此，每个基座为100mm长，具有一个回转端和一个平端。在下文中，回转端应当被称为“前端(nose)”或下游狭路端部，并且平端应当被称为上端或上游狭路。

[0132]用于产生修改装置的步骤如下参考在实施例1中描述的各种试剂：1.将盖子的平端切下，以便盖子从前端至切削端的长度为70 mm。2.用酪蛋白溶液喷射已清洁基座，并且将油墨施加到该狭路的边缘。3.用盖子喷雾喷射该盖子。4.穿过该装置的狭路施加油脂笔 (grease pencil)，其中油脂点集中在距离前端54mm处。油脂笔目的是阻止流体在该狭路中流动。足够的油脂被施加以完全覆盖该狭路，同时而仍容许在油脂与盖子之间的空气间隙。5.采用自动移液器，将大约0.02μl BNP-FETL点在距离该装置前端50mm的狭路上。6.将盖子超声焊接到基座上。油脂笔点与盖子的切削端之间的距离以及因此通道的长度为34mm。荧光信号的检测

[0133]荧光信号以与上述实施例1中相同的方式进行检测。磁珠-BNP测定的材料和方法

[0134]测定以与上述实施例1中相同的方式进行。磁阱

[0135]磁阱是通过将两块立方形磁油脂(钕铁硼磁铁，11mm× 11mm，来自Kinetic MicroScience，19395 Montevina Road，Los Gatos， CA 95033，Scitoys Levitaion Bundle#2)相互靠近放置而产生的，其中一个磁体的北极指向另一磁体的南极。磁体间的距离为3mm。磁体用铝夹具保持在合适的位置，如图8中所示。磁体在它们之间产生具有高磁场梯度的容积，其吸引顺磁性的珠子。在下面，这将被称为“磁阱”。

[0136]通过将试验装置放置在两块磁体之间，其中部分狭路位于高磁场梯度的区域中，将珠吸引到该狭路的这个位置是可能的。然后通过慢慢移动该装置穿过磁体，沿着该狭路的长度扫描磁阱是可能的。磁珠被捕获在该磁阱中，然后可被移动至该狭路中任何期望的位置。如果该装置被快速移动远离磁体，则珠将不能随着磁阱移动并且将保持沉积在该狭路上。通过改变从磁阱拉出装置的速度，随着珠从磁阱中被去除，将珠沿着预定长度在狭路中展开甚至是可能的。

[0137]实际上，该装置被附着至与检测荧光信号所用的相同的 Parker线型载物台。该装置用可调透镜架(Melles Griot，55 Science Parkway，Rochester，NY 14620，part number 07LHA001)支撑，并且透镜架采用光学部件(Thorlabs，Inc.，435 Route 206，Newton，NJ 07860，部件号TR4和RA90)附着至载物台。支撑磁铁的夹具保持固定并且被附着至光学工作台(Thorlabs，部件号TR12、TR4、RA9O和MB1824) 上。观察测定响应

[0138]Dynabead-BNP抗体+抗原配合物的悬浮液被移液到装置上的盖子边缘处。观察到悬浮液通过毛细作用沿着该狭路的流动并且在 10-20秒内到达BNP-FETL斑点。在这一点上，Dynabeads穿过该狭路被均匀展开。然后该装置被插入到距离磁阱几毫米远的可调透镜架中。采用Visual Basic 6编写程序，以便以一系列预定的运动控制该载物台。表1显示该系列。位置是磁阱中心与装置前端之间的距离。速度是当移动磁铁到该位置时装置的速度。移动编号位置速度延迟 1 21mm 20mm/sec 0 2 56mm 1.5mm/sec 0 3 19mm 40mm/sec 120sec 4 47mm 40mm/sec 0 5 30mm 1.5mm/sec 0 6 -21mm 70mm/sec 0
表1

[0139]移动1后，磁铁位于盖子的末端(通道的上游狭路末端) 之上。在移动2期间，磁珠通过磁阱收集并且移动至BNP-FETL斑点。在移动3时，随着磁体远离，珠在FETL区域中该狭路2mm区间上展开。在移动编号3后，存在120秒的延迟以允许磁珠与BNP-FETL颗粒一起温育而不会影响磁场。在运动4和5，磁体返回并且再次收集磁珠然后将它们移动至与BNP-FETL斑点相距25mm的位置。在运动6 期间，该装置以足以对磁珠位置几乎没有影响的速度移出磁场。

[0140]在将装置移出磁阱之后，扫描装置的荧光信号。在珠的位置观察到信号峰。图9显示信号强度对BNP浓度的图表。如在上面实施例1中，信号强度与BNP的浓度相关。观察测定响应对时间

[0141]在移动珠远离BNP-FETL斑点并且扫描它们的荧光信号后，将它们移动回BNP-FETL斑点使得珠和BNP-FETL颗粒进一步温育是可能的。然后，在该第二温育阶段之后，珠被移动远离BNP-FETL 斑点并且被再次扫描。以这种方式，磁阱被用于交替地移动磁珠到达以及离开BNP-FETL斑点，以进行温育和信号观察。总的温育时间被记录并且对荧光信号强度作图。如果BNP抗原存在于血浆中，信号被观察到随时间增加。

[0142]图10显示四个不同浓度的BNP抗原的荧光信号响应对总温育时间。在全部温育时间，信号强度与BNP浓度相关。实施例3：分析物的多元检测

[0143]对于许多应用诸如生物标记筛选来说，期望进行同时测量的多重试验。在同一样品体积中测量数十或数百种标记在生产量和每个试验的体积方面具有益处。该实施例描述了如何用微升规模的样品体积测量数十或数百种试验。前述实施例提供了关于该应用所用试剂和步骤上的细节。

[0144]在该实施例中，针对特定分析物的磁珠携带独特标记。这使得该测定信号在检测器中能够分离。独特标记的实例包括荧光染料或光学条形码技术，诸如Luminex xMAP技术、Bio-Rad BioPlex 2200 系统试剂以及Oxonica Inc.’s NANOBARCODE技术，其包括多金属微米棒(multimetal microrod)。具体地，BioPlex系统使用标记的磁珠。尽管其它系统没有这样做，将磁特性引入到这样的标记中对本领域技术人员来说是简单的。

[0145]该试验以与前述实施例相同的方式运行，即磁珠被移动至包含标记试剂(或多个)的装置区中，温育，然后与流动方向相反地运动以便移动进入检测区的干净背景中。在磁珠位于检测区中后，则对它们进行测量，一次一个。这就是该技术与前述实施例的不同之处。

[0146]珠被移动穿过测量区，所述测量区被配置为能够询问单个珠。这可以通过设置狭窄通道并且经由磁场梯度拉动珠子穿过来实现。为了防止堵塞，一些形式的混合可能是必需的，通过振定源诸如压电元件或者磁力搅拌珠子。这种狭窄通道代替系统像Luminex200TM系统或BioPlex 2200系统中的流式细胞应用。然而这种检测布置是类似的。激光激发磁性颗粒中的荧光染料，并且检测并分析荧光信号，鉴定该颗粒并且由此鉴定所测量的分析物。第二激光(或者其它光源) 激发与捕获在磁性颗粒上附着至抗体的标记，并且将检测所产生的荧光。该第二信号与珠上存在的分析物的量有关，并且因此与样品中分析物的存在或浓度有关。每个测定类型的统计学采样可以提高该测量的精确度。实施例4：利用移动的磁场阱检测BNP抗原
抗体偶联物(与抗BNP抗体结合的荧光能量转移胶乳(FETL)颗粒，68nm)的制备

[0147]FETL-抗体偶联物基本上如美国专利6,887,952中所述制备，该专利因此以其全部并入，包括所有表格、图和权利要求。羧基改性的聚苯乙烯胶乳颗粒(Interfacial Dynamics，0.068μm)通过用溶解在有机溶剂中的荧光能量转移供体和受体荧光染料(参见，例如美国专利5,673,189；6,238,931；和6,251,687，其每一篇因此以其全部并入，包括所有表格、附图和权利要求)溶液处理进行染料加载。这些荧光能量转移胶乳颗粒被称为“FETL”。

[0148]对于与抗体的连接来说，通过共价偶联至FETL羧基基团，双官能交联剂被用于将连接臂添加到FETL上。硫醇基然后在碱性条件下从连接臂中产生。含有马来酰亚胺基团的牛血清白蛋白然后通过马来酰亚胺基团与该颗粒上硫醇的反应而被连接到FETL上，产生 FETL-BSA。FETL-BSA进一步用杂-双官能连接物进行处理以引入反应性马来酰亚胺基团。过量的未反应连接物通过柱纯化去除。BNP的重组抗体通过用第二杂-双官能连接物处理而硫醇化。柱纯化的硫醇- 激活的抗体然后被连接于FETL-BSA-马来酰亚胺。未反应的硫醇和马来酰亚胺基团然后被封闭，并且抗体包被的FETL进行柱纯化。该颗粒在-70℃下冷冻储存。具有微流通道的装置的制备

[0149]在该实施例中所用的装置由类似于制造Biosite’s TRIAGE装置所用的那些部件的部件制成并且如下讨论被修改。基座的形状没有改变，因此，每个基座为100mm长，具有一个回转端和一个平端。在下文中，回转端应当被称为“前端(nose)”或下游狭路端，并且平端应当被称为上端或上游狭路。狭路为1mm宽，40mm长以及 30-50微米深。该狭路的下游狭路端通过基座中的孔——其有助于阻止流体流动——终止。该狭路的上端具有作为样品进入位置的2mm宽的截面。盖子中位于该狭路2mm宽截面正上方的孔用作样品进入口。

[0150]用于产生改进装置的步骤如下，参考在实施例1中描述的各种试剂：1.用酪蛋白溶液喷射已清洁基座。2.用盖子喷雾喷射该盖子。3.利用哈密顿注射器(Hamilton syringe)将0.3μL直径68nm的 BNP-FETL点在该狭路的上端。4.将盖子焊接到基座上。荧光信号的检测

[0151]在该实施例中，荧光信号采用落射荧光检测方案进行检测。在这种配置中，激发源——光束与样品平面平行的670nm激光经由非球面透镜校准，穿过690nm短通过滤器，并且然后利用圆柱形透镜传播成直线。光线然后利用二色镜以直角反射，穿过非球面透镜，并且该线被聚焦到样品上。所产生的荧光通过物镜被收回，并且穿过二色镜，接着通过760nm下的荧光发射过滤器，采用非球面透镜成像，并且在光电二极管阵列上进行检测。在光电二极管阵列上所产生的电流随后被放大和数字化。磁珠-BNP测定的材料和方法

[0152]抗-BNP抗体采用下列步骤连接于顺磁性Dynabeads (Product#142-04，M-280 甲苯磺酰活化的磁珠，Invitrogen(Dynal)， 1600 Faraday Avenue，PO Box 6482，Carlsbad，California 92008)。首先，该磁珠被涡旋1min以分散结块。然后，该磁珠用硼酸盐缓冲液(0.1M 硼酸，pH 9.5)冲洗2次。冲洗由下列步骤组成：利用磁体将珠拉至管边并且用移液管吸走剩余的上清溶液。珠然后在硼酸盐缓冲液被稀释至0.2％w∶v，并且NEM(N-乙基马来酰亚胺)封闭的HSA(人血清白蛋白)被加入以达到终浓度1％w∶v HAS。得到的珠混合物被剧烈涡旋并且在玻璃瓶中探头超声处理。然后该磁珠在温育期间室温下被摇动至少16小时，其中每2-3小时涡旋一次。16小时温育后，珠用 50/10/150缓冲液(pH 7.0缓冲液，含有50mM磷酸钾、10mM硼酸和150mM氯化钠)冲洗三次。

[0153]将SMCC(4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)(Product#22360，Pierce Biotechnology，Inc.，P.O.Box 117， Rockford，IL 61105)以20mg/mL单独溶解在乙腈中。然后珠被加入以充分溶解SMCC，达到终浓度1mM，并且在摇动器上温育2小时。该反应通过加入20mM牛磺酸(Product#T0625，Sigma Chemical，Corp.， St.Louis，MO，63178-9916)(终浓度)猝灭15分钟，接着用10/2/200 缓冲液(10mM磷酸钾、2mM硼酸钾、200mM NaSCN，pH7.0)冲洗珠四次。最后，足量EDTA(乙二胺四乙酸)被加入到珠中以达到 0.1mM的终浓度。

[0154]在2小时SMCC反应期间，SPDP(3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸N-琥珀酰亚胺酯)(Product#P3415，Sigma-Aldrich，Co，3050Spruce St.，St.Louis，MO 63103)连接的HSA的单独溶液是通过使5mg/mL HSA 与1mM SPDP(终浓度；储备SPDP是40mM的乙腈溶液)反应制备的。一个小时温育后，该反应用20mM牛磺酸猝灭30分钟并且采用G-50 柱进行柱纯化。SPDP连接的HAS和BNP抗体用2mM DTT(二硫苏糖醇)(Product#20291，Pierce Biotechnology，Inc.，P.O.Box 117，Rockford， IL 61105)还原30分钟，并且用DG-10脱盐柱(Bio-Rad，Hercules，CA) 纯化。

[0155]最后，0.64mg/mL还原的HSA-SPDP和0.47mg/mL还原的BNP抗体被加入到1mL 1％磁性颗粒中并且使其反应15小时。该反应用2mM甲氧基-PEG-硫氢基猝灭30分钟，并且随后用6mM n- 羟基乙基马来酰亚胺(Product#0-268-116，Organix，Woburn，MA， 01801)猝灭30分钟。珠用50/10/150缓冲液冲洗3次。

[0156]在一些情况中，进行酪蛋白的加入步骤，封闭磁珠。100μL 珠悬浮液与1ml酪蛋白溶液和35ml 1M的抗坏血酸钠溶液混合，并且所得混合物被置于摇动器上两小时。然后在50/10/150缓冲液中洗珠两次。然后加入额外的成分：1mg/ml的叠氮化钠(Product#S2271-1， Fisher Scientific，81 Wyman Street，Waltham，MA 02454)；10mg/ml的牛血清白蛋白(Product#100350，Roche Diagnostics/Boehringer Mannheim， 9115 Hague Road，Indianapolis，IN 46250)；20mM的抗坏血酸钠。珠悬浮液的终体积为100μL。

[0157]2.5μL或5μL的Dynabead-BNP抗体悬浮液与30μL BNP 标准校准溶液在微量离心管中混合。该混合物被涡旋并且在室温下温育20分钟。该微量离心管然后被储存在冰上直至使用。

[0158]为了测试测定响应，对于不同装置来说使用不同的BNP校准溶液。当与磁性颗粒悬浮液混合时BNP的浓度范围在0至6000 pg/ml。如在实施例2中，磁阱通过将两块立方形磁体(钕铁硼磁铁， 11mm×11mm，来自Kinetic MicroScience，19395 Montevina Road，Los Gatos，CA 95033，Scitoys Levitaion Bundle#2)相互靠近放置而产生，其中一个磁体的北极指向另一磁体的南极。磁体间的距离为3mm。在该实施例中，磁体用铁桥保持在合适的位置，如图14中所示。桥中的铁有助于增加“磁阱”中的磁场并且降低漏磁场。该装置如实施例2在磁阱中移动。

[0159]以类似于实施例2的方式产生并观察测定信号。差别记录在此。首先，该装置被插入到可调透镜架中并且被移动至磁阱中。然后Dynabead-BNP抗体+抗原配合物的悬浮液经过盖子中的孔用移液管移入该装置中。该悬浮液被观察到通过毛细作用沿着狭路流动并且在 10-20秒中到达可检测标记的位置(“FETL斑点”)。在流动过程中，磁阱位于样品入口孔与FETL斑点之间大约半路的位置上。这防止磁性颗粒在通过磁体移动到FETL斑点之前到达那里。类似于实施例2，该装置然后按照预定的一系列运动穿过磁阱移动。这使得磁性颗粒以每秒1mm移动穿过该狭路。使磁性颗粒与可检测标记和样品一起温育 120秒。在从磁阱中移走该装置后，扫描该装置的荧光信号。在磁性颗粒的位置上观察到信号峰。

[0160]图13显示信号强度对BNP浓度图。在该数据集中磁性颗粒没有被酪蛋白封闭。在每个BNP浓度运行2至4个装置。在该图中，黑色圆圈表示信号平均值而误差线条表示一个标准偏差。如前面的实施例，信号强度与BNP的浓度相关。

[0161]图14显示采用酪蛋白封闭的磁性颗粒的另一数据集。该结果来自五个不同批次的装置。对于每批装置次组，8个装置在BNP浓度＝223pg/mL下运行，并且另外8个装置为BNP浓度＜5pg/mL下运行。该图显示了装置批次之间典型的波动。下表给出了每批装置的高校准物(223pg/mL)的CV’s(方差系数)。它也以BNP的单位pg/ml 给出了最小检测限。最小检测限被计算为零校准物信号的标准偏差除以高校准物信号的均值再乘以223pg/ml的两倍。装置批号 1 2 3 4 5 CV 10.6％ 14.6％ 10.6％ 5.1％ 11.7％最小检测限 (pg/ml) 10.6 6.0 4.7 6.3 5.1
实施例5：采用重构磁珠检测BNP抗原
具有微流通道的装置的制备

[0162]该实施例中所用的装置由类似于制造Biosite’s TRIAGE 装置所用的那些部件的部件制成并且如下讨论被修改。对基座唯一的修改是狭路，因为它具有50μm深，其比标准装置更深。该狭路在该实施例中为2mm宽。所用的盖子与实施例4中所述的相同，其中在盖子中添加划痕，该划痕在上游狭路距离盖子通孔＜1mm处。该刮痕防止流体通过上游狭路。

[0163]用于产生改进装置的步骤如下，参考实施例1中描述的各种试剂：1.用酪蛋白溶液喷射已清洁基座。2.用盖子喷雾喷射该盖子。 3.采用自动移液器将近似0.3μl直径68nm BNP-FETL点在该狭路的上端。FETL斑点3mm长并且集中在距离基座的前端近似24mm处。5.采用自动移液器将近似0.5μl额外的表面处理(参见下面)点在狭路上，其长度8mm、集中在距离基座的前端52mm处，并且使其干燥。6.将近似0.25μL珠悬浮液点在额外的表面处理上并使其干燥。7.将盖子焊接到基座上。

[0164]上段中提到的额外表面处理含有在BNP-FETL中使用的同样的成分，但是不含FETL颗粒。该磁性颗粒悬浮液与实施例4中描述的相同，不含酪蛋白封闭。荧光信号的检测

[0165]利用同样在实施例4中描述的磁阱，以与实施例4相同的方式检测荧光信号。测定信号类似于实施例4中描述的那样进行测量。主要差别是磁性颗粒在装置外没有用BNP标准校准溶液温育。相反，将纯校准溶液加入到该装置中。随着溶液流过装置中磁性颗粒已经在其中定位的位置，近似一半的珠子被重构到样品中。珠子然后开始沿着狭路流动；然而，磁阱被用于防止它们向下流到装置中可检测标记 (抗-BNP FETL)已经在其中定位的位置。这给磁性颗粒提供了在与 FETL温育前与样品温育的时间。在样品完成沿着狭路流动并且磁性颗粒重构后，磁性颗粒经过校准溶液被向下移动至FETL斑点，在那里它们被温育120秒。然后重构的磁性颗粒被移动至下游狭路5mm的位置。

[0166]在将装置从磁阱中移走后，扫描该装置的荧光信号。在重构磁性颗粒的位置上观察到信号峰，所述重构磁性颗粒利用磁阱被定位于检测位置。

[0167]图15显示信号强度对BNP浓度图。在每个BNP浓度运行 4至8个装置。在该图中，黑色圆圈表示信号平均值而误差线条表示一个标准偏差。该图类似于实施例4中的剂量响应曲线，这证明装置中预先定位和干燥的重构磁性颗粒重构并且行为类似于在该装置中未预先定位的磁性颗粒。

[0168]尽管对于本领域技术人员制备和使用本发明来说，本发明已经被充分详细地描述并举例，但是各种可选方式、修改和改进应当是明显的，而没有脱离本发明的精神和范围。

[0169]本领域技术人员容易理解本发明非常适于进行所述目标并且获得所述本文所公开的以及固有的目标和优点。本文所提供的实施例代表合适的实施方式，是示例性的，并且不意图作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将会想到本文的修改及其它用途。这些修改被包括在本发明的精神内并且被权利要求的范围所限制。

[0170]对本领域技术人员来说很显然的是：可以在没有脱离本发明的范围和精神之下对本文所公开的发明进行不同的取代和修改。

[0171]在说明书中提到的所有专利和出版物代表了本发明所属领域中技术人员的水平。所有专利和出版物在此以相同的程度并入作为参考，如同每一单个出版物被特定地且单独地指出被并入作为参考。

[0172]此处阐述性描述的本发明可以在缺乏本文没有具体公开的任何元件(一个或多个)、限制(一个或多个)时实施。因此，例如，在本文的各个情况中，术语“包括(comprising)”、“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“由……组成(consisting of)”中任何一个可以用其它两个术语替换。已经使用的术语和表达被用作描述的术语并且没有限制性，并且没有意图使用将所示和所述特征或其部分的任何等价物排除在外的那些术语和表达，但是应当认识到各种修改可能在所要求保护的本发明范围内。因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选的实施方式和任选的特征被明确公开，但是本领域技术人员可以采取本文所公开的概念的修改和变化，并且这样的改进和变化被认为是在所附权利要求所限定的本发明范围内。

[0173]其它实施方式在权利要求书中被提出。

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