本发明涉及分离生物粒子的装置和方法。应该在粒子或分子的基础 上理解生物粒子(随后也被变通性的称为生物物质)、粒子或物质的意 思。在此其包括细胞，比如例如病毒或细菌，可是也尤其包括分离的人 和动物细胞，比如白细胞或肿瘤细胞，还包括低分子和高分子化合物， 比如蛋白质和分子，尤其是免疫活性化合物，比如抗原、抗体和核酸， 或同样包括抗原特异性四聚物，比如例如MHC四聚物或同样包括 streptamers。本发明尤其涉及用于人或动物细胞的免疫磁性分离技术 (IMS)、自动样品制备技术以及(电)磁或磁性分离技术(EMS)和 微观流体技术。使用免疫磁性粒子来实施免疫磁性分离技术。它们被理 解为免疫磁性粒子、能磁化的或有磁性的(例如铁磁性或超顺磁性的)粒 子或也可以是软磁性物质，比如例如铁素体(ferrites)，其特征是(例 如通过与抗体或抗原特异性四聚物偶联)能特异性结合特异性生物物质 或特异性生物粒子。能够结合的免疫磁性粒子优选基本上是球形(并且 因此以后可以替换的被称为免疫磁性球或抗体偶联的磁性球)，优选其 粒度小于100μm。

因为生物粒子不同的免疫特性，特异性粒子(例如抗原或抗原特异 性四聚物或streptamers)可以用特异性抗体鉴定或结合特异性抗体(免 疫反应或抗原-抗体反应)。

包含4个MHC分子和抗原的结构物在免疫学中被称为四聚物。T 细胞与这些结构物的结合超过其与单个复合物结合的1000倍。由此所 述四聚物结合相应的T细胞受体。这相当于以肽的形式通过对经MHC 复合物结合到抗原呈递细胞的细胞结合抗原的识别所进行的T细胞介导 的二次免疫应答。

同时，可以产生重组的、可溶性MHC分子，其可以被结合到已知 的抗原上，并且可以通过链霉亲和素使其四聚化。由此产生的肽特异性 四聚物MHC分子可以用荧光着色剂标记并且在流式细胞器中用于测 量。依靠四聚物技术，可以确定抗原特异性T细胞的频率，从而能够获 得有关疾病症状种涉及的抗原的证据。依靠MHC分子，有可能分拣并 分析例如识别肿瘤抗原的T细胞。因此肽-MHC四聚物在追踪人自身免 疫性疾病例如关节炎中的抗原特异性T细胞方面具有极大的治疗潜力。

四聚物与粒子的结合将确保抗原特异性T细胞更好的结合粒子，其 继而可以由于粒子而与剩余的未结合细胞分开。

可逆的MHC-肽多聚物，即所谓的streptamers，是一种制备和分离 细胞毒性T淋巴细胞的新技术。与迄今为止所应用的四聚物相比，它们 能够再次与T细胞分离开，因此不影响细胞的功能。

如果这些粒子与磁性球结合，那么由于免疫特异性反应，偶联到这 些粒子上的生物粒子作为结合的生物粒子将具有同样的磁性、优选超顺 磁性或铁磁性特性。因此，通过应用磁体，例如电磁体或永久磁体，可 以分开并分离结合到与磁性粒子偶联的抗体上的生物粒子。

本发明的目的是提供一种以通流方法操作的分离装置或相应的分离 方法，借助所述装置或方法，有可能以简单的方式实现自动的和持续的 生物粒子分离。

为了实现这个目标，根据本发明的装置使用简单的微观流体通道， 其具有两个进口或进口通道和两个出口或两个出口通道，并且也具有一 个或多个磁体，例如电磁体或永久磁体。在下文中，应该理解通道(这 适用于通流通道，以及向所述通流通道开口进入的进口通道和导出所述 通流通道的流出通道)是指进行流体流动的容积，其包括围绕这个容积 的壁。

包含不同的生物物质和/或也包含非生物物质(包括待经特异性免疫 反应确定的生物粒子)的液体经第一进口通道被引入微观流体通流通 道。包含被设计成与待确定的生物物质特异性结合的免疫磁性粒子的液 体经另一进口通道被引入。由于待依靠免疫反应分离的生物物质是抗 原，并且由于免疫磁性粒子是与相应抗体或抗原特异性四聚物或 streptamers结合(抗原-抗体/四聚物/streptamer反应)的铁磁性或超顺 磁性球，所以能够实现所述的特异性结合。

两种液体的流变学特性和几何比率(尤其是两个进口通道的横截面 积和通流通道的横截面积)现在被配置成经两个进口通道供给的液体流 在通流通道中不发生混合(扩散过程除外)。这也可以通过在通流通道 的进口通道区和出口通道区之间提供分隔壁、使得各自供给或排出的液 体流仅在进口通道区中和出口通道区中相接触而实现。因此，在各流之 间不期望的扩散影响被最小化，使待分开的生物粒子以甚至更纯的方式 被分开变成可能。

在第一磁体(或磁场或其场梯度)的帮助下，由于它们的铁磁性或 超顺磁性特征，此时免疫磁性粒子在进口通道区中获得一个垂直于流方 向的速度分量。因此免疫磁性粒子能够克服两个层流的束缚或从一种液 体流被吸引到另一种液体流中。在后者中，存在待被分离的特异性生物 粒子，其与免疫磁性粒子结合。依靠合适布置的第一磁体或布置于下游 的第二磁体，在出口通道区中，至少部分与待分离的生物粒子结合的免 疫磁性粒子随后通过施加相反方向的磁场或场梯度被再次吸引回原始 液体流中。包含与待分离的生物物质结合的免疫磁性粒子的液体流随后 经一个出口通道被排放出，而另一液体流(其包含剩下的生物和/或非生 物物质和未结合的待分离生物物质粒子)在另一出口通道的帮助下被排 放出。

至关重要的是，由于其中占优势的条件(液体的流变学特性，并且 尤其是通道的横截面积)的结果，在微观流体通流通道中存在层流条件。 出于此原因，两个液体流不混合或仅是非实质性混合。因此，基本上只 有免疫磁性粒子在第一磁场的帮助下克服两个液体流之间的界限，并且 结合的和剩余未结合的免疫磁性粒子在相反方向上在第二电磁体磁场 的帮助下再次克服两个液体流的界限。因此免疫磁性粒子被分开引入到 包含待分离的生物粒子的液体中，接着在特定的时间期间从它们的生物 物质液体流改变到邻接的液体流中，在那与待分离的生物粒子结合，随 后在第二磁场的帮助下，与生物粒子结合的磁性粒子被再次吸引回它们 的原始流中。包含未结合生物粒子以及其它生物物质的液体随后经一个 出口或排放通道被排放出，同时，结合的、由此分离的生物粒子能够从 另一个出口被排放出。

在一个优选的变通实施方案中，根据本发明的装置可提供有反应室 (reaction chamber)。其被安置于通流通道上包含生物物质的液体流或 第一磁体的一侧上，用来延长这个液体流流经整个通流通道所需要的时 间。该反应室被置于流方向上两个磁体之间，从而使被引入流中的免疫 磁性粒子获得增加的驻留长度、并且由此使免疫磁性粒子有更大概率结 合特异生物物质。

上述免疫磁性分离装置具有一系列的优点：

该装置能够以简单方式进行分离，而没有需要手动实施、因此耗时 并且还需要额外液体的额外混合、孵育和清洗的步骤。利用该装置，有 可能进行自动和持续粒子的分离或分开，其中只需要少量或根本不需要 缓冲剂、转移和/或稀释液体。因此样品稀释溶液和额外的缓冲溶液在本 装置中并不是必需的。

结合的生物粒子因此能够不用额外的洗出步骤即可从包含各种生物 物质的起始混合液体中分离和分开。经分开的排放通道获得被分离的生 物粒子。

抗体偶联磁性粒子或免疫磁性粒子能够直接向它们的相关进口通道 供给，而不需要另外的预混合步骤或孵育步骤。

该装置可以配备有用于控制磁场强度或磁场梯度的自动控制装置。 此外，该装置也可以装备有调节通流通道中对通流速率或每单位时间流 经的液体量进行控制的调节装置。也可以通过位于进口通道和/或出口通 道部位的合适的调节装置来实现对通流速率或每单位时间流经的液体 量的控制。因此有可能以简单并受控的方式实现对生物粒子的标记或结 合以及它们的分离。

根据本发明的装置可被用作人和动物体内或体外医疗诊断系统。以 同样简单的方式，根据本发明的装置也可用于治疗目的，例如用来从患 者等的血或组织分离特定类型的细胞。因此，尤其该装置可以是可植入 的，并且能够确保进行持续分离或测量过程。特别对于可植入装置，后 者和它的电控制单元可以以集成的方式来制造，因此具有适合植入和以 经济的方式制造的尺度。如果根据本发明的装置被用在人或动物体外， 那么它就可以被配置成为一种实验室用具。然后该实验室用具可用于细 胞分离，例如对血液样品、混合的细胞群(例如来自患者组织)或具有 特定特性的细胞(例如特定的表面标记物或生理状态)进行分离。

可以按照以下两个实施例之一中所述建造或使用根据本发明的装 置。

图1显示根据本发明的第一免疫磁性分离装置；

图2显示根据本发明的具有反应室的第二免疫磁性分离装置；

图3显示根据本发明的第三免疫反应磁性分离装置；

图4显示根据本发明的另外的第四免疫磁性分离装置。

在随后所述的对应于实施例的附图中，对于装置中的相似或相同的 组件使用相同的标号。

图1显示免疫磁性分离装置。图1显示通过本发明的免疫磁性分离 装置在贯穿装置重心的中心平面的截面。该装置有微观流体通流通道5， 其有流入区E和置于其下游的排放区A。在流入区E中，第一进口通道 1和第二进口通道2向通流通道5开口。由此第二进口通道沿流经通流 通道5的流方向开口。第一进口通道1以相对于经过通流通道5的通流 方向呈α＝30°的角度开口。在流出区A中，两个排放通道3和4引流出 通流通道5。由此排放通道3沿流经通流通道5的流向导离开，排放通 道4相对于这个方向以α＝30°的角度导离。垂直于各自通流方向的进口 通道1、2和排放通道3、4的直径约为垂直于其通流方向的通流通道5 的直径的一半。

在流入区E的下游，第一电磁体6被置于通流通道5的外侧并紧临 通流通道5的旁侧。在这个第一电磁体6的下游和排放区A紧邻的上游， 第二电磁体7同样地被置于通流通道5的外侧并紧临通流通道5的旁侧。 两个电磁体6和7被置于不同的侧面上，在本情况中是在通流通道5的 相对侧。

然而，在此也可以变通地将两个电磁体6和7至少部分的整合于通 流通道5的壁5a中。在此情况中，两个电磁体6和7随后被整合在通 流通道5的壁5a中位置基本相对的侧面上。然而，也可以将两个电磁 体6和7完全置于通流通道5内或在由壁5a围起的通流通道5的容积 中通流通道5的壁5a内。这两个电磁体6和7同样地被置于通流通道5 内该通流通道中位置基本相对的侧面上(这优选发生在该通流通道的壁 区域或甚至使电磁体6和7置于通道的内壁上或被嵌入在那里)。然而 也可能的是使用与针对电磁体6和电磁体7所述的不同的变体：这样电 磁体6可以完全被置于通道的壁5a的外侧，而电磁体7被整合在通流 通道5的壁中的位置相对侧或被置于通道内壁5a的内表面上位置相对 侧上。

进口通道1、2、排放通道3、4、通流通道5和两个电磁体6和7(或 相应的中央轴或重心)在本情况中被置于一个平面中。

至关重要的是，因为进口通道、出口通道和通流通道足够小的直径 以及因为足够低的流速，故所形成的流通道中的条件可以形成这样的两 种液体流或液体层，其中一种在另一种上面分开滑动而没有湍流(层 流)。如果因此包含各种生物粒子11、12的混合液体9经由第一进口通 道1被导入，包含免疫磁性粒子8的液体10经由第二进口通道被导入， 那么这两种被导入的液体流不发生混合(除了扩散过程)，而是在排放 区域A的方向上作为互相平行的分开的液体层滑动。随后混合液体9的 第一液体流以不与免疫磁性粒子8的第二液体流10发生混合的方式经 第一排放通道3被排放出，第二液体流10相应的经第二排放通道4被 排放出。

所以至关重要的是，在微观流体通流通道5中，通流液体具有如此 小的雷诺数(Reynold’s number)以致于在通流通道5中的流情况可被 看作层性的。因此，引起湍流和二次流或涡流的惯性的影响是可以忽略 的，并且混合可能只是由于扩散过程的结果。为了确保这样，在所例举 的情况中，微通流通道5具有0.1-0.3mm的宽度和0.1-0.2mm的高度 (矩形通流通道，宽度和高度垂直于纵向或垂直于通流方向)。对于微 通流通道5，总的通流速率(由调节装置调节，没有显示)是1-200μl/ 分钟。这些微观流体流的特性满足在微通流通道5中层流情况的必要先 决条件。为此原因，经第一进口通道1引入的混合液体9和经第二进口 通道2引入的并包含免疫磁性粒子8的液体10在通流通道5中不发生 混合，而是形成两个分开的流层。因此，当电磁体6、7被关闭时，每 个液体流中的不同粒子(生物粒子11、12和免疫磁性粒子8)不发生混 合，而是在它们各自的液体流中持续的流动直至它们各自的排放通道3 或4。

除了待分离的生物粒子11，在本情况中混合的液体9还含有生物(或 甚至不同的)粒子12，欲从中分离待分开的粒子11。然而并不需要存在 有这种另外的粒子12，从而也可以应用本发明来改变液体流9中待分离 粒子11的浓度。如果现激活第一电磁体，那么免疫磁性粒子8被置于电 磁场或场梯度中，所述的场施加垂直于流经通流通道5的通流方向并朝 向第一电磁体6方向的力。结果免疫磁性粒子8被吸引出它们的第二液 体流10并越过液体流边界进入混合液体的第一液体流9。因此免疫磁性 粒子8与位于混合液体流9中的粒子11、12混合并且因此能够通过特异 性抗原-抗体反应而与待分离的粒子11结合(由此产生组合或结合的粒 子13，其分别具有至少一个免疫磁性粒子8和一个生物粒子11)。能够 控制或调整电磁体6的场强度或梯度强度，从而所产生的力恰好足够从 第二液体流10吸引免疫磁性粒子8进入第一液体流9。由此能够以脉冲 或正弦波的形式调节电磁体6的磁场(这同样适用于电磁体7)。随后免 疫磁性粒子以通流方向的流速和由与其垂直的磁场所引发的速度之间 的平衡状态自由流动。

如已经所描述的，在免疫磁性粒子8已经由于免疫特异性反应而被 引入混合液体9的第一液体流之后，，它们与待分开的生物粒子11结合 从而形成结合粒子13。微通流通道5的狭小或小的横截面积(足够小的 直径)和流经通流通道5的足够低的通流量增加了个体的免疫磁性粒子 8与相关生物粒子11结合的概率(可供免疫反应的时间增加)。

在相对于第一电磁体6的下游侧上，第二电磁体7被直接置于排放 区A之前通流通道5的与该磁体相对的一侧。在这个第二电磁体7的帮 助下，结合粒子13以及在流路径上在电磁体6和电磁体7之间没有与 生物粒子11结合的免疫磁性粒子8被再次向回吸引越过液体流边界进入 第二液体流10。这是经由电磁体7的电磁场或场梯度发生的，其指向与 第一磁体6的磁场或梯度相对。免疫磁性结合的或特性化的生物粒子13 以及未结合的免疫磁性粒子8或第二液体流10随后经第二排放通道4 被排放出。第一液体流9或余下的未结合生物粒子11以及其它生物物质 12经第一排放通道3被排放出。由此将(结合的)生物粒子11或13与 其它的生物物质12分开。

图2显示一种免疫磁性分离装置，其基本的构造相当于显示在图1 中的分离装置。在流方向上在第一电磁体6之后和第二电磁体7之前， 通流通道5却具有一个突出部(反应室)14，其被置于第一电磁体6侧。 在本情况中，通流通道5与反应室14被构造成一个部件。然而，也能 够将反应室14作为在通流通道5中相应开口位置的单独组件形式生产。 在所例举部分的截面中(进口通道1、2的、出口通道3、4的、和两个 电磁体6、7的排列平面)，反应室14具有Ω形的横截面。在反应室14 的顶部，T形的流断路器15被置于通流通道5中举例说明的截面内。 流断路器15被置于流方向上室14的顶部，使得它仅参与在混合液体9 的第一液体流中，并且使这个液体流转向反应室14。借助包含流断路器 15和反应室14的反应装置，第一液体流9流经流通道15的路径被延长。 由于这个反应装置，使第一液体流9在通流通道5中的驻留长度与反应 室14的容积成比例的增加。因此，提供了增加的接触效率或免疫磁性 粒子8与特定生物粒子11结合可供利用时间的延长。发生免疫反应或免 疫磁性粒子8相结合的概率由此提高。因此，通过提高装置的免疫反应 效率，提高了分离效率。所提供的反应室14引起高流速梯度和第一液 体流9良好的微观混合。因此免疫磁性粒子8的结合概率也有增加。在 此至关重要的是在流方向上在两个电磁体6和7之间配置可用的反应装 置14、15，从而在已经具有引入的免疫磁性粒子8的情况下，第一液体 流被导入这个延长结合时间周期的反应室14。

图3显示根据本发明的另外的分离装置，其配置主要如图1所示。 然而与图1相反，现在在流入区E和置于其下游的排放区A之间的位置 设置有分隔壁17，其使由进口通道1或进口通道2向分离装置供应的两 个液体流彼此分开。因此，只有在两个进口1和2的区E中由可能在磁 体6所施加的磁力作用下，磁性粒子从一个液体流转换到另一个液体流 中，并且在区A中以相反方向发生同样的交换。在这两个区E和A之 间，液体流不能发生进一步的混合，从而在这个区域中仅仅实现免疫磁 性粒子和抗原附着粒子之间的聚集。

图4显示根据本发明的另一个分离装置。在此经进口通道2实现免 疫磁性粒子11的供给，经进口通道1实施样品的供给，所述粒子在标为 E的区域内彼此联系，从而免疫磁性粒子11能够由于所施加的磁场 Fmag而进入样品中。所产生的磁场Fmag由箭头表示。具有免疫磁性 粒子11的样品随后被导入具有长路径的螺旋18，从而免疫磁性粒子11 在那里可以与抗原8偶联。螺旋18随后被导回，并且在区A中遇到同 时已经转向并原始包含免疫磁性粒子的液体。在这个区A中，负载有免 疫粒子8的粒子11通过磁场Fmag继而被再次引回到原始液体流中，并 且随后经出口4被排放出。因此被再次充分地不含免疫磁性粒子11的样 品被导入螺旋18周围的大弧19并最终经出口3被排放出。这种安排的 益处是在磁性粒子11和抗体8之间的混合区具有很长的路径。它另外的 好处是，仅需要一个磁体来产生区E中的磁场和区A中的磁场，由此实 现所有混合和分离过程。