快速无菌微测试
阅读：501发布：2020-05-23
专利汇可以提供快速无菌微测试专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种检测药物组合物中活 微 生物 的方法，包括步骤：提供可过滤的药物组合物；过滤药物组合物以提供至少三个其上沉积药物组合物的膜，将三个膜置于固体培养基上以产生至少三个滤渣培养物，在有 氧 和无氧条件下培养并检测活微生物细胞、微菌落或菌落，其中膜上存在活细胞、微菌落或菌落指示药物组合物中存在活微生物。，下面是快速无菌微测试专利的具体信息内容。
1.一种检测药物组合物中活微生物的方法，所述方法包括：
a)提供可过滤的药物组合物；
b)过滤所述药物组合物以提供至少三个其上沉积所述药物组合物过滤渣的过滤膜；
c)将所述至少三个过滤膜置于固体培养基上以产生至少三个滤渣培养物；
d)i)在20-25℃有氧条件下培养至少一个滤渣培养物；ii)在30-35℃有氧条件下培养至少一个滤渣培养物和iii)在30-35℃厌氧条件下培养至少一个滤渣培养物；条件是所述滤渣培养物的培养期均不大于约13天；和
e)检测膜上的活微生物细胞、微菌落或菌落，其中膜上存在活微生物细胞、微菌落或菌落指示所述药物组合物中存在活微生物。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述b)还包括在过滤所述药物组合物后过滤洗液。
3.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述膜是聚偏二氟乙烯膜、玻璃纤维膜、聚碳酸酯膜、聚对苯二甲酸乙二酯膜、混合纤维素酯(醋酸纤维素和硝酸纤维素)、磷酸纤维素膜、DEAE膜、尼龙网膜或聚四氟乙烯膜。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述膜具有约0.45μm的孔径。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述固体培养基选自FTM-A(含
1.075％琼脂(终浓度)的液体巯基醋酸盐培养基)、BHI(脑心浸液琼脂)、蒂福科酿酒厌氧琼脂、R2A琼脂、施乐血琼脂、开索-琼脂ICR(胰蛋白酶大豆琼脂)、有5％血的哥伦比亚琼脂和CDC厌氧血琼脂。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述d)中滤渣培养物的培养时间足以生成可检测量的ATP。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述滤渣培养物培养约2-7天。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述e)中活微生物细胞、微菌落或菌落用发光测定检测。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述发光测定检测所述膜上活微生物细胞、微菌落或菌落生成的三磷酸腺苷(ATP)。
10.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述发光测定包括萤光素酶测定。
11.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述发光测定检测探针与微生物内源核酸之间形成的核酸杂交产物。
12.如权利要求11所述方法，其特征在于，所述发光测定包括过氧化物酶反应。
13.如权利要求8到12中任一项所述方法，其特征在于，所述发光用电荷耦合器件相机和图像分析软件检测。
14.如权利要求8到13中任一项所述方法，其特征在于，对所述活微生物细胞、活微生物微菌落或活微生物菌落进行计数。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述药物组合物是液体组合物。
16.如权利要求15所述方法，其特征在于，所述液体组合物是胃肠外组合物、口服组合物、鼻用组合物或眼用组合物。
17.如权利要求15所述方法，其特征在于，所述液体组合物是疫苗。
18.如权利要求17所述方法，其特征在于，所述疫苗选自炭疽疫苗；结核病疫苗；疏螺旋体病疫苗；白喉类毒素和破伤风类毒素疫苗；白喉类毒素和破伤风类毒素和百日咳疫苗；白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳疫苗；白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳和乙型流感嗜血杆菌偶联物疫苗；白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳和乙型流感嗜血杆菌偶联物及脊髓灰质炎病毒灭活疫苗；甲肝病毒疫苗；甲肝病毒和乙肝病毒疫苗；乙肝病毒疫苗；幽门螺杆菌疫苗；乙型流感嗜血杆菌疫苗；流感病毒疫苗；脊髓灰质炎病毒疫苗；脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟菌)疫苗；麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒疫苗；
麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒和水痘病毒疫苗；肺炎球菌(肺炎链球菌)疫苗；狂犬病疫苗；呼吸道合胞病毒疫苗；天花疫苗；弓形虫病(刚地弓形虫)疫苗；伤寒(伤寒沙门菌)疫苗；结核病(结核分枝杆菌)疫苗；水痘(鸡痘、水痘带状疱疹病毒)疫苗。
19.如权利要求17所述方法，其特征在于，所述疫苗是禽流感疫苗或猪流感疫苗。
20.一种检测药物组合物中活微生物的方法，所述方法包括：
a)提供可过滤的药物组合物；
b)过滤所述药物组合物以提供至少三个其上沉积所述药物组合物滤渣的膜；
c)将所述至少三个滤器/膜置于固体培养基上以产生至少三个滤渣培养物；
d)i)在20-25℃有氧条件下培养至少一个滤渣培养物；ii)在30-35℃有氧条件下培养至少一个滤渣培养物和iii)在30-35℃厌氧条件下培养至少一个滤渣培养物；条件是所述滤渣培养物的培养期均不大于约13天；和
e)检测所述膜上的三磷酸腺苷(ATP)，其中膜上存在ATP指示所述药物组合物中存在活微生物。
21.一种无菌药物组合物，其中所述药物组合物经过活微生物筛选，并用前述权利要求中任一项所述的方法确认无菌性。
快速无菌微测试
[0001] 相关申请
[0003] 发明背景
[0004] 美国的联邦法规和其它国家的类似法规需要无菌试验以确保药物产品基本没有微生物如细菌和真菌。三种常用方法-直接转移无菌试验、膜过滤无菌试验、产品冲洗无菌试验用于完成这些无菌测试。传统无菌试验用两种液体培养基(20-25℃培养的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)和30-35℃培养的液体巯基醋酸盐培养基(FTM))和冲洗液体进行，需要14天的培养时间(参见例如USP<71>“无菌试验”(Sterility Tests)，《药典论坛》(Pharmacopeial Forum).USP 30-NF 25，第1次修订，美国药典委员会(The United States Pharmacopeial Convention，Inc.))、EP 2.1.6“无菌”(Sterility)(欧洲药典2.1.6“无菌”EP第6版(2007))和其它相关药典。液体巯基醋酸盐培养基(FTM)包含两相-液体培养基的下层相是厌氧相，上层相包含用于供氧培养的氧气。
[0005] 通常，为使用膜过滤方法测试药物产品的无菌性，液体、乳化或溶解的药物或医药产品(例如活性成分、胃肠外制剂、滴眼剂、鼻喷雾等)经0.45微米孔径膜过滤，膜转移到适当测试培养基(FTM和TSB)并培养14天。如果微生物在培养基中生长，则药物产品并非无菌且取样进行微生物鉴定。培养需要大量时间，对培养基中生长的生物进行微生物鉴定也需要大量时间，这是劣势且限制药物产品对需要病人的可用性。例如，在医疗危机时期，目前需要14天培养期的无菌试验会延误能减少或结束危机的药物或疫苗的可用性。因此，需要快速无菌试验方法。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明涉及检测药物组合物中活微生物的方法，包括步骤a)提供可过滤的药物组合物；b)过滤药物组合物以提供至少三个其上沉积药物组合物滤渣的过滤膜；c)将至少三个过滤膜置于固体培养基上以产生至少三个滤渣培养物；d)i)在20-25℃有氧条件下培养至少一个滤渣培养物；ii)在30-35℃有氧条件下培养至少一个滤渣培养物和iii)在30-35℃厌氧条件下培养至少一个滤渣培养物；条件是滤渣培养物的培养期均不大于约13天和e)检测膜上的活微生物细胞、微菌落或菌落，其中膜上存在活微生物细胞、微菌落或菌落指示药物组合物中存在活微生物。
[0008] 所述方法还可包括在过滤药物组合物后过滤洗液的步骤。
[0009] 在一些实施方式中，膜是聚偏二氟乙烯膜、玻璃纤维膜、聚碳酸酯膜、聚对苯二甲酸乙二酯膜、混合纤维素酯(醋酸纤维素和硝酸纤维素)、磷酸纤维素膜、DEAE膜、尼龙网膜或聚四氟乙烯膜。所述膜优选具有约0.45μm的孔径。
[0010] 固体培养基可选自FTM-A(含1.075％琼脂(终浓度)的液体巯基醋酸盐培养基)、BHI(脑心浸液琼脂)、蒂福科(Difco)酿酒厌氧琼脂、R2A琼脂、施乐(Schaedler)血琼脂、开索(Caso)-琼脂ICR(胰蛋白酶大豆琼脂)、有5％血的哥伦比亚琼脂和CDC厌氧血琼脂。
[0011] 在一些实施方式中，所述方法可包括培养滤渣培养物约2-7天的步骤。
[0012] 在一些实施方式中，活微生物细胞、微菌落或菌落用发光测定检测，如检测膜上活微生物细胞、微菌落或菌落生成的三磷酸腺苷(ATP)的生物发光测定。发光测定可包括萤光素酶测定。
[0013] 在一些实施方式中，发光测定检测探针与微生物内源核酸之间形成的核酸杂交产物。发光测定可包括过氧化物酶反应。
[0015] 在一些实施方式中，药物组合物是液体组合物。所述液体组合物可以是胃肠外组合物、口服组合物、鼻用组合物、眼用组合物或疫苗。
[0016] 本发明也涉及检测药物组合物中活微生物的方法，包括步骤a)提供可过滤的药物组合物；b)过滤药物组合物以提供至少三个其上沉积药物组合物滤渣的过滤膜；c)将至少三个过滤膜置于固体培养基上以产生至少三个滤渣培养物；d)i)在20-25℃有氧条件下培养至少一个滤渣培养物；ii)在30-35℃有氧条件下培养至少一个滤渣培养物和iii)在30-35℃厌氧条件下培养至少一个滤渣培养物；条件是滤渣培养物的培养期均不大于约13天和e)检测膜上的三磷酸腺苷(ATP)，其中膜上存在ATP指示药物组合物中存在活微生物。
[0018] 图1显示10分钟时间框内UV处理奥斯陆莫拉菌(M.osloensis)的结果。显示培养4天后存在的菌落形成单位(CFU)数量。该图显示4分钟后(3轮)CFU减少量大于或等于50％。
[0020] 图3显示10分钟时间框内胃肠外药物产品处理的结果。显示培养5天后的菌落形成单位(CFU)数量。该图显示2分钟后(3轮)CFU减少量大于或等于50％。
[0021] 图4A是70℃热处理3分钟的藤黄微球菌(M.luteus)细胞的显微照片。图4B是接种于胰蛋白酶大豆琼脂的未处理藤黄微球菌细胞在30-35℃培养3天后的显微照片。
[0022] 图5显示未处理大肠杆菌培养物、热处理大肠杆菌、UV处理大肠杆菌和扶他林处理大肠杆菌的光密度数据。
[0023] 图6显示未处理大肠杆菌培养物、热处理大肠杆菌、UV处理大肠杆菌和扶他林处理大肠杆菌的光密度数据。
[0024] 图7显示未处理大肠杆菌生长曲线与热处理大肠杆菌的比较。大肠杆菌培养物在3小时过程中的斜率为0.2313，随后它回升到未处理培养物的正常斜率。
[0025] 图8显示未处理金黄色葡萄球菌(S.aureus)生长曲线与热处理金黄色葡萄球菌的比较。应激金黄色葡萄球菌培养物在4小时过程中的斜率为0.1070，随后它回升到未处理培养物的正常斜率(4小时后，0.4034)。
[0026] 图9显示未处理白色念珠菌(C.albicans)生长曲线与热处理白色念珠菌的比较。应激白色念珠菌培养物在超过8小时过程中的斜率为0.0419。
[0027] 图10显示未处理短小芽孢杆菌(B.pumilus)生长曲线与饥饿短小芽孢杆菌的比较。所述细胞在2-8℃经历营养耗尽7天。应激短小芽孢杆菌培养物在5小时过程中的斜率为-0.0056，随后它回升到未处理培养物的正常斜率。
[0028] 图11是显示施乐血琼脂背景试验结果的显微照片。密理弗(MILLIFLEX)快速膜MXHVWP124在密理弗(MILLIFLEX)盒中的施乐血琼脂上30-35℃孵育5天。图11A显示密理弗(MILLIFLEX)快速图像，所述膜在此情况中用100ml液体A冲洗。图11B显示用100ml液体D冲洗的膜。
[0029] 发明详述
[0030] 本发明涉及比需要14天培养期的常规试验更快速的无菌试验方法。所述方法特别适合可过滤液体组合物，如液体药物组合物(例如溶液、悬浮液、乳液、胃肠外组合物、口服组合物、鼻用组合物、眼用组合物、疫苗)的快速无菌测试。通常，该方法包括经过滤膜过滤药物组合物，随后将过滤膜转移到固体培养基并在适当生长条件下培养足够长的时间以使膜上的活微生物增殖或生成足量的生物分子如三磷酸腺苷，从而检测微生物(例如6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天)。
[0031] 一方面，本发明是检测药物组合物中活微生物的方法。所述方法包括经过滤膜过滤药物组合物(例如液体药物组合物)，以提供超过一个(例如至少三个)其上沉积药物组合物滤渣和药物组合物中可能存在的任何活微生物的过滤膜。如需要，可随后过滤洗液，例如用于将生长抑制剂、代谢抑制剂或检测抑制剂从膜上洗去，从而促进滤渣中微生物的检测。含滤渣的过滤膜安置到固体培养基上以生成至少三个滤渣培养物。然后，滤渣在三种不同条件下培养：20-25℃的有氧条件；30-35℃的有氧条件和30-35℃的厌氧条件，培养期足以使过滤膜上的活微生物增殖或生成足量的生物分子如三磷酸腺苷，以便检测微生物。通常，滤渣培养物的培养期不超过约13天，优选培养期大大少于13天。然后，使用任何合适方法评估滤渣培养物的膜上活微生物细胞、微菌落或菌落的存在。过滤膜上存在活微生物细胞、微菌落或菌落指示药物组合物中存在活微生物。
[0032] 在本发明的一个方面，提供了检测药物组合物中活微生物的方法，包括以下步骤：提供可过滤的药物组合物；过滤药物组合物以提供至少三个其上沉积滤渣的过滤膜；将至少三个过滤膜置于固体培养基上以产生至少三个滤渣培养物；在20-25℃有氧条件下培养第一个滤渣培养物，在30-35℃有氧条件下培养第二个滤渣培养物和在30-35℃厌氧条件下培养第三个滤渣培养物，培养期均不大于约13天；检测膜上的三磷酸腺苷(ATP)。过滤膜上存在ATP指示药物组合物中存在活微生物。
[0033] 可用本发明检测广泛范围的微生物(例如酵母和霉菌、革兰氏阳性孢子菌、革兰氏阴性菌、革兰氏阳性球菌和革兰氏阳性杆菌(好氧和厌氧微生物))。所述方法可用于检测ATCC(美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection))菌株，也用于检测可能污染生产设施的环境微生物。例如，本文所述的方法可用于检测巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)ATCC16404(以前称为黑曲霉(Aspergillus niger))、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6633、白色念珠菌(Candida albicns)ATCC10231、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)ATCC 11437、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 9027、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 8739、洛菲不动杆菌(Acinetobacter Iwoffi)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、病研所芽孢杆菌(Bacillus idriensis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、非发酵棒杆菌(Corynebacterium afermentans)；库克菌属(Kocuria spez.)、嗜根库克菌(Kocuria rhizophilia)(以前称为藤黄微球菌(Micrococcus luteus))、奥斯陆莫拉菌(Moraxella osloensis)、青霉菌属(Penicillium spez.)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)。
[0034] 通常，药物组合物(例如液体药物组合物)使用高压无菌或灭菌技术经无菌过滤膜过滤，如使用真空或正压力。可使用任何合适的过滤膜和过滤装置。合适过滤膜的例子包括例如聚偏二氟乙烯膜、玻璃纤维膜、聚碳酸酯膜、聚对苯二甲酸乙二酯膜、混合纤维素酯(醋酸纤维素和硝酸纤维素)、磷酸纤维素膜、DEAE膜、尼龙网膜或聚四氟乙烯膜。膜优选由PVDF(聚偏二氟乙烯)制成。适用于要求保护的本发明的过滤膜的孔径小到足以保留药物组合物中可能存在的微生物，如孔径为约0.1微米(μm)-约20微米，约0.1微米-约15微米，0.1微米-约12微米，0.1微米-约10微米，0.1微米-约8微米，0.1微米-约6微米，0.1微米-约5微米，0.4微米-12微米，0.4微米-10微米，0.4微米-8微米，0.4微米-6微米，约0.22微米或约0.45微米。所述过滤膜优选具有约0.45μm的孔径。
[0035] 通常制备至少三个含滤渣的过滤膜。这通过经三个单独过滤膜过滤三个单独药物组合物样品来完成。这也可通过制备一个含药物组合物滤渣的过滤膜并使用无菌或灭菌技术将过滤物切成或分成三部分(例如尺寸大致相等的三个部分)。然后，将含药物组合物的过滤膜置于适当固体培养基上以产生滤渣培养物。
[0036] 可选择适当固体培养基和培养条件来支持待检测的所需微生物的生长和/或代谢。这可通过例如筛选培养基完成，如本文所述和示例。本方法使用的固体培养基优选支持广泛范围的微生物在有氧和厌氧培养条件下生长。如果需要，可使用超过一种的固体培养基。例如，可使用的第一种培养基在酵母、霉菌和好氧菌生长上等同于或优于液体胰蛋白酶大豆肉汤；可选择的第二种培养基在厌氧微生物生长上等同于或优于液体巯基醋酸盐培养基的厌氧相，可选择的第三种培养基在好氧微生物生长上等同于或优于液体巯基醋酸盐培养基的有氧相。在有氧和厌氧条件下优选使用单一固体培养基。本发明可使用的合适固体培养基包括例如FTM-A(含1.075％琼脂(终浓度)的液体巯基醋酸盐培养基)、BHI(脑心浸液琼脂)、Difco酿酒厌氧琼脂、R2A琼脂、施乐血琼脂、开索-琼脂ICR(胰蛋白酶大豆琼脂)、有5％血的哥伦比亚琼脂和CDC厌氧血琼脂。施乐血琼脂是本发明使用的特别优选的固体培养基。
[0037] 优选的固体培养基适于支持“应激”和“非应激”微生物的生长和/或代谢，如本文所述。这很需要，因为微生物在化学方法如药物组合物生产过程中可能遭受应激，例如低渗透或高渗透压应激、辐射(如UV光、伽马射线、微波)、超声波、热、低温或化学应激(由例如氯或药物产品引发)。
[0038] 滤渣培养物在适当生长条件下孵育(即培养)足够长的时间以使膜上的活微生物增殖产生微菌落或菌落，或产生足量的生物分子如三磷酸腺苷以检测微生物。通常，一个滤渣培养物在30-35℃有氧条件下培养，第二个滤渣培养物在30-35℃厌氧条件下培养，第三个滤渣培养物在20-25℃有氧条件下培养。
[0039] 在一些实施方式中，滤渣培养物的培养时间足以使活微生物生成可检测量的ATP，如至少约200阿托摩尔ATP，至少约200飞摩尔ATP，至少约200皮摩尔ATP，或至少约200纳摩尔ATP。培养期可以是约2-7天、约2-8天、约2-9天、约2-10天、约2-11天、约2-12天、约2-13天、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天或约6天。各单独滤渣培养物的培养期可视情况而变，并非所有滤渣培养物都需要培养相同时间量。优选的培养时间根据待检测的微生物而变化。
[0040] 滤渣培养物孵育后可使用任何适当方法如目测或优选使用合适测定检测过滤膜上的活微生物细胞、微菌落或菌落。例如，发光测定(例如萤光素酶测定)可用于检测活微生物细胞、微菌落或菌落。可采用任何合适方法或系统检测发光，如电荷耦合器件相机、图像处理器和/或图像分析软件。有利地，图像分析软件可用于定量测定或计数测定活微生物细胞、活微生物微菌落或活微生物菌落的数量。在一些实施方式中，发光测定例如萤光素酶测定用于检测过滤膜上活微生物细胞、微菌落或菌落产生的三磷酸腺苷(ATP)。例如，将ATP释放剂或生物发光剂(如含萤光素酶和荧光素的试剂)用于过滤膜，如果活细胞生成ATP则会发光。通过发光检测ATP的合适试剂在本领域熟知且有市售(例如密理弗(MILLIFLEX)快速试剂盒；马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore Corporation))。
[0041] 在滤渣培养物孵育后也可检测过滤膜上存在的活微生物细胞、微菌落或菌落，例如使用发光测定以检测探针与微生物内源核酸的杂交。发光测定可包括过氧化物酶反应或其它适当反应。适于经过氧化物酶和其它酶活性产生发光的试剂已熟知且有市售。
[0042] 可使用的测定和检测系统能检测约10-100个酵母细胞或约1000个细菌细胞。所用测定和检测系统优选能检测单一细胞或少至约100个细胞。这可通过例如检测微生物产生的ATP来完成。例如，当市售ATP生物发光测定与市售电荷耦合器件相机、图像处理器和图像分析软件(密理弗(MILLIFLEX)快速微生物检测和计数系统；马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司)联用时，其可用于检测约200阿托摩尔ATP，相当于约1个酵母或霉菌细胞或约100个细菌细胞。
[0043] 本文所述检测方法适于评估可过滤组合物，如液体药物组合物的无菌性。液体组合物包括含水组合物、悬浮液和乳液。液体药物组合物可以是适合药物用途的任何液体，包括例如胃肠外组合物、口服组合物、鼻用组合物或眼用组合物。液体组合物可以是疫苗。
[0044] 合适的疫苗包括例如炭疽疫苗(ANT)、卡介苗疫苗(BCG)、疏螺旋体病疫苗外表面蛋白A疫苗(BORospA)、白喉类毒素和破伤风类毒素疫苗(DT)、白喉类毒素和破伤风类毒素和百日咳疫苗(DTP)、用于儿童的白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳疫苗(DTPa)、用于成人的白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳疫苗(DrTPar)、白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳和乙型流感嗜血杆菌偶联物疫苗(DTPa-HIB)、白喉类毒素和破伤风类毒素和无细胞百日咳和乙型流感嗜血杆菌偶联物及脊髓灰质炎病毒灭活疫苗(DTPa-HIB-IPV)、甲肝病毒疫苗(HAV)、甲肝病毒和乙肝病毒疫苗(HAV-HBV)、乙肝病毒疫苗(HBV)、幽门螺杆菌疫苗(HEL)、乙型流感嗜血杆菌疫苗(HIB)、乙型流感嗜血杆菌偶联物疫苗(HIBcn)、乙型流感嗜血杆菌多糖疫苗(HIBps)、乙型流感嗜血杆菌疫苗(白喉CRRM197蛋白偶联物，与白喉CRRM197毒素蛋白偶联的寡糖；HIB-HbOC))、包括禽流感(例如H5N1、H1N3)和猪流感(例如H1N1)的流感病毒疫苗(INF)、流感病毒减毒活疫苗(IFNa)、鼻内流感病毒减毒活疫苗(INFan)、流感病毒灭活疫苗(INFi)、灭活流感病毒裂解疫苗(INFs)、灭活甲型和乙型流感三价病毒裂解疫苗(INFs-AB3)、流感全病毒疫苗(INFw)、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗(IPV)、脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟菌)疫苗(MEN)、脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟菌)偶联物疫苗(MENcn)、A，C血清群脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟菌)偶联物疫苗(MENcn-AC)、A，C，Y，W-135血清群脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟菌)多糖疫苗(MENps-ASYW)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒疫苗(MMR)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒和水痘病毒疫苗(MMR-VAR)、三价口服脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗(OPV)、肺炎球菌(肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))疫苗(PNU)、七价肺炎球菌(肺炎链球菌)偶联物疫苗(PNUcn-7)、23价肺炎球菌(肺炎链球菌)多糖疫苗(PNUps-23)、脊髓灰质炎病毒疫苗(POL)、狂犬病疫苗(RAB)、人二倍体细胞狂犬病疫苗(RAB-HDCV)、纯化鸡胚细胞狂犬病疫苗(RAB-PCEC)、呼吸道合胞病毒疫苗(RSV)、天花疫苗(SMA)、天花(疫苗病毒)疫苗(SMAvac)、白喉类毒素和破伤风类毒素(对于成人抗原量减少)疫苗(Td)、弓形虫病(刚地弓形虫(toxoplasm gondii))疫苗(TOX)、伤寒(伤寒沙门菌(Salmonella typhi))疫苗(TPD)、口服伤寒(伤寒沙门菌)减毒活疫苗Ty21a菌株(TPDa)、伤寒(伤寒沙门菌)热和酚灭活干疫苗、伤寒(伤寒沙门菌)Vi荚膜多糖疫苗(TPD-Vi)、结核病(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))疫苗，非BCG(TUB)、水痘(鸡痘、水痘带状疱疹病毒)疫苗(VAR)。
[0045] 合适的胃肠外组合物包括例如腺苷酸、前列地尔、硫酸阿米卡星、阿奇霉素、博来霉素、头孢曲松、环丙沙星、顺铂、氮烯唑胺、盐酸正丁霉素、甲磺酸去铁胺、醋酸去氨加压素、地尔硫卓、双嘧达莫、阿霉素、依那普利拉、表柔比星、依前列醇钠、氟康唑、磷酸氟达拉滨、磷酸氟达拉滨、氟马西尼、盐酸格拉司琼、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、盐酸伊立替康、亚叶酸钙、醋酸亮丙瑞林、左卡尼汀、甲孕酮、美司钠、甲基强的龙醋酸盐、甲氧氯普胺、米托蒽醌、盐酸纳布啡、重酒石酸去甲肾上腺素、醋酸奥曲肽、昂丹司琼、奥沙利铂、催产素、紫杉醇、帕米膦酸二钠、泮库溴铵、溴苯肾上腺素(phenylephrine bromide)、盐酸苯肾上腺素、盐酸异丙嗪、异丙酚、罗库溴铵、磺胺甲 唑、舒马坦琥珀酸盐、硫酸特布他林、环戊丙酸睾酮、妥布霉素、维库溴铵、硫酸长春新碱、酒石酸长春瑞滨和无菌链佐星粉末。
[0046] 合适的口服组合物包括例如醋氨酚和磷酸可待因片剂、醋氨酚乙酰唑胺片剂、阿昔洛韦胶囊、盐酸氨洛林、盐酸胺碘酮、苯磺酸氨氯地平和贝那普利胶囊、苯磺酸氨氯地平片剂、阿莫西林和克拉维酸钾、阿莫西林、阿那格雷、去氧孕烯和炔雌醇片剂、阿斯匹林、阿替洛尔、左炔诺孕酮和炔雌醇片剂、阿奇霉素、巴氯芬、盐酸贝那普利、苯佐那酯、甲磺酰苯扎托品、戊酸倍他米松、倍他米松双丙酸酯、氯贝胆碱、比卡鲁胺、富马酸比索洛尔、盐酸安非他酮、布地奈德吸入悬浮液、布美他尼、盐酸苯丙胺、卡麦角林、碳酸钙600、骨化三醇、柠檬酸钙片剂、炔诺酮片剂、卡托普利和氢氯噻嗪片剂、卡托普利、卡马西平、卡维地洛、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢地尼、头孢丙烯、头孢氨苄、色他金(certagen)、盐酸西替利嗪、盐酸利眠宁、马来酸氯苯那敏、氯唑沙宗、克利诺(cholinoid)、西洛他唑、盐酸西咪替丁、西咪替丁、环丙沙星、西酞普兰、异维甲酸、克拉霉素、富马酸氯马斯汀、克林霉素、克罗米酚柠檬酸盐、盐酸克罗米酚、氯硝西泮、克霉唑、氯氮平、色甘酸钠、盐酸环苯扎林、环孢霉素、盐酸赛庚啶、达那唑、盐酸去甲金霉素、醋酸去氨加压素、盐酸右哌甲酯、硫酸右旋苯丙胺、地西泮、双氯芬酸钾、双氯青霉素、去羟肌苷、盐酸地尔硫卓、盐酸苯海拉明、双嘧达莫、磷酸丙吡胺、双丙戊酸钠、盐酸多佐胺、甲磺酸多沙唑嗪、马来酸依那普利、卡马西平、艾司唑仑、雌二醇、雌酮硫酸酯哌嗪、盐酸乙胺丁醇、乙琥胺、依托度酸、泛昔洛韦、法莫替丁、硫化亚铁、硫酸亚铁、盐酸非索非那定、非那雄胺、醋酸氟卡胺、氟康唑、醋酸氟氢可的松、醋酸氟轻松、氟西汀、氟比洛芬、氟他胺、氟伏沙明、福辛普利钠、呋喃苯胺酸、加巴喷丁、氢溴酸加兰他敏、吉非贝齐、格列美脲、格列吡嗪、硫酸盐葡糖胺、格列本脲、氟哌啶醇、盐酸肼屈嗪、氢氯噻嗪、二酒石酸氢可酮(hydrocondone bitartrate)、硫酸羟氯喹、羟基脲、盐酸羟嗪、双羟萘羟嗪、吲哚美辛、异烟肼、酮康唑、酮洛芬、酮咯酸氨基丁三醇、盐酸拉贝洛尔、拉莫三嗪、兰索拉唑、来氟米特、亚叶酸钙、左乙拉西坦、盐酸利多卡因、赖诺普利、盐酸洛哌丁胺、劳拉西泮、氯沙坦钾洛伐他汀、甲苯达唑、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美洛昔康、盐酸呱替啶、巯嘌呤、氨水杨酸、盐酸二甲双胍、甲氨蝶呤、甲基多巴、甲泼尼龙、甲氧氯普胺、酒石酸美托洛尔、甲硝唑、甲硝唑、美西律、盐酸米洛环素、米氮平、米索前列醇、盐酸莫普利(moeipril HCl)、莫匹罗星、麦考酚酸酯、萘丁美酮、纳多洛尔、盐酸钠曲酮、萘普生、盐酸尼法唑酮、硫酸新霉素、尼克酸、硝苯地平、尼莫地平、尼扎替丁、醋酸炔诺酮、盐酸去甲替林、制霉菌素、氧氟沙星、奥美拉唑、盐酸昂丹司琼、奥沙普秦、奥沙西泮、盐酸奥昔布宁、羟考酮、盐酸羟考酮、泮托拉唑钠、帕罗西汀、青霉素V钾、己酮可可碱、费尼基丝(phenylgesic)、吡罗昔康、盐酸普拉克索、普伐他汀钠、盐酸哌唑嗪、泼尼松龙、马来酸丙氯拉嗪、盐酸普罗帕酮、盐酸丙氧芬、盐酸普萘洛尔、盐酸普罗替林、喹那普利、硫酸奎尼丁、雷米普利、盐酸雷尼替丁、利巴韦林、利培酮、盐酸罗匹尼罗、番泻叶多库脂钠、森那金(sennagen)、硝酸银、辛伐他汀、盐酸索他洛尔、硫糖铝、枸橼酸他莫昔芬、盐酸坦罗辛、盐酸特拉唑嗪、盐酸特比萘芬、盐酸四环素、茶碱、盐酸氯苄噻哌啶、托美丁钠、托吡酯、托拉塞米、盐酸曲马多、群多普利、盐酸曲唑酮、维甲酸、熊去氧胆酸、丙戊酸、盐酸万拉法新、盐酸维拉帕米、华法林钠、扎来普隆和酒石酸唑吡坦。
[0047] 合适的鼻用组合物包括例如鼻喷雾、抗偏头痛药物、肽药物(激素治疗)、麻醉药、止吐剂、镇静药、盐酸氮卓斯汀、盐酸羟甲唑啉、盐酸苯肾上腺素(pheynylephrine hydrochloride)、盐水溶液、糠酸莫米松、布地奈德、异丙托溴铵和色甘酸钠鼻喷雾。
[0048] 合适的眼用组合物包括例如利多卡因、丙美卡因、丁卡因、酮咯酸氨丁三醇滴眼液、酮咯酸氨丁三醇、萘甲唑林眼药、溴莫尼定、阿奇霉素、苯磺酸贝他斯汀、贝西沙星、盐酸左旋倍他洛尔、可速普特、二氟泼尼酯、露达舒、雷珠单抗、贝美前列素、他尼钠、氧氟沙星、地塞米松、左氧氟沙星、乌诺前列酮滴眼液、环孢霉素眼用乳液、香碱、曲伏前列素滴眼液、盐酸缬更昔洛韦、曲氟尿苷、西多福韦、维替泊芬、更昔洛韦玻璃体内植入剂、福米韦生和富马酸酮替芬滴眼液。
[0049] 本文所述方法可用任何适当装置或设备进行，可以手动或自动化。在一个优选方面，本方法用市售的密理弗快速微生物检测系统进行，该系统包括样品准备台、自动喷雾台、检测塔、图像分析仪、CCD相机和带有软件的计算机(马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司)。
[0050] 另一方面，本发明是用本文所述方法筛选过活微生物的无菌药物组合物(例如疫苗、眼用组合物、鼻用组合物、口服组合物、胃肠外组合物)。实施例
[0051] 产生ATCC菌株和来自生产点的环境菌株(来自表面或生产人员接触板，来自生物负荷量和无菌试验的污染)的低温保藏物
[0052] 来自冷冻培养物(ATCC菌株)或直接来自平板(环境分离物)的微生物在胰蛋白酶大豆肉汤或固体培养基(例如沙氏葡萄糖琼脂(Sabouraud Dextrose agar))中培养适当时间。用MicroSeq系统(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))进行各菌株的基因型鉴定。然后，培养物以800x G离心20-30分钟并将沉淀重悬于保护培养基(含15％甘油的Oxoid-CM67)。稀释培养物，监测固体培养基上的CFU(菌落形成单位)并将其加入TM2ml能克冻存管(Nunc Cryotube) 小瓶，-80℃保存。表1显示所用微生物的完整列表。
[0053] 表1
[0054]
[0055] A.应激因子研究
[0056] 通过施加UV光(240-250μW/cm2)、热(50-70℃水浴)或在胃肠外药物系列稀释中各培养微生物1-10分钟，以便造成应激，每分钟取等分样品。应激直接施加给100CFU以下范围的测试微生物液体悬浮液。通过CFU减少量监测应激效果，用平板计数方法和OD测量法确定。
[0057] 平板计数：将应激微生物接种于胰蛋白酶大豆肉汤，通过每分钟析出等分样品来监测应激的不同效果(应激施加1-10分钟，每分钟取等分样品)。2-7天后计数测定结果(取决于菌株，例如在2天后计数测定最新的大肠杆菌和黑曲霉，疮疱丙酸杆菌计数测定不能早于培养后6天)。测量了引起CFU初始接种量减少量超过50％所需的确切时间。
[0058] OD测量(λ＝600nm)：测试微生物的过夜培养物首先受到应激(使用在≥50％减少量研究中确定的应激参数)，接种胰蛋白酶大豆肉汤或液体巯基醋酸盐培养基(约3-4x106CFU/ml)并在长达8小时的时间框内分析(每小时取等分样品以测量光密度)。培养在摇床上进行(仅好氧菌株)。比较应激培养物与非应激培养物。
[0059] 50％减少量的应激因子研究结果
[0060] 对于22种菌株中的每一种微生物，测试了3种应激参数。测量了引起CFU初始接种量减少超过50％所需的各应激因子确切参数(1和10分钟之间)。所测3种应激参数是UV光、热和在用于胃肠外的胃肠外药品中的微生物培养。例如，热引起细胞质膜损伤，RNA变性且这导致一些细胞死亡。UV光引起突变和DNA复制停止(M.Strus，Rocz PanstwZakl Hig.，48(3)：263-268(1997))。
[0061] 给予胃肠外药品在微生物细胞中引起化学应激-长期以来已知胃肠外药品的抗微生物特性。图1-3给出了奥斯陆莫拉菌、大肠杆菌和洛菲不动杆菌所得数据的例子。对于22种微生物菌株中的每一种，发现了使初始接种量减少≥50％所需的应激参数。
[0062] 在一些情况中观察到菌落形态发生改变(菌落生长更慢，但稍后恢复正常菌落大小)。例如，藤黄微球菌显示菌落尺寸减小[图4a和4b]。
[0063] 对于快速无菌试验的培养基评估，重要的是不仅使用广泛范围的微生物，而且使用处于应激状态的这些微生物。一些应激因子如由胃肠外药品引起的化学应激和施加UV光引起的辐射应激，大幅减少接种微生物的量。相反，热处理导致一些测试微生物的初始生长率降低。据报道，热损伤细胞恢复时间为3-4小时-这在本研究中得到确认(M.Warseck，Appl.Microbiol.，26：919-922(1973))。热应激不可用于孢子菌，其它应激参数也不可行，因为孢子菌显示针对应激的广泛抗性(P.Setlo，J.Appl.Microbiol.，101(3)：514-525综述(2006))。例如，短小芽孢杆菌用作辐射指示细菌(J.Wong，PDA J Pharm Sci Technol.，58(1)：6-14(2004))。在孢子菌的情况中，使用一种不同的“应激”因子-通过营养耗尽对其施加应激并因而诱导更高孢子含量。
[0064] 随后的营养培养基评估和统计学分析显示施乐血琼脂是用于无菌试验的最佳固体培养基。用于分析20-25℃与30-35℃有氧培养之间差异的t检验显示在温度间有显著差异。由于40种情况中有11种差异显著，所以需要在快速无菌试验中验证2种培养温度。
[0065] OD测量
[0066] 在≥50％减少量研究中确定的应激参数用于各测试菌株。一直比较应激接种物与6
非应激接种物。微生物(约3-4x 10CFU/ml作为初始接种物)接种于胰蛋白酶大豆肉汤或液体巯基醋酸盐培养基并在摇床上30-35℃培养(仅好氧菌株)。每小时取等分样品并测量光密度(λ＝600nm)。不同处理的接种物(未处理、热处理、UV光处理、胃肠外药品处理，来自50％减少量实验的时间/参数)所得数据显示在OD测量数据的正态图中生长曲线稍有差异[图5]。
非应激接种物。微生物(约3-4x 10CFU/ml作为初始接种物)接种于胰蛋白酶大豆肉汤或液体巯基醋酸盐培养基并在摇床上30-35℃培养(仅好氧菌株)。每小时取等分样品并测量光密度(λ＝600nm)。不同处理的接种物(未处理、热处理、UV光处理、胃肠外药品处理，来自50％减少量实验的时间/参数)所得数据显示在OD测量数据的正态图中生长曲线稍有差异[图5]。
[0067] 数据的对数图[图6]显示热处理对大肠杆菌生长曲线的影响且使数据独立于接种量。由于这不易精确控制，对数图的优势就在于此。当细菌受到UV光或胃肠外药品处理(使用50％减少量实验中确定的参数)应激时，没有观察到生长的显著差异。
[0068] 斜率比较显示仅热处理(参数如50％减少量实验所确定)对微生物生长率有影响且微生物显示实际应激。在培养基评估期间不使用UV光和胃肠外药品稀释(“杀伤因子”而非“应激因子”)。通过使用直线和比较斜率最详细显示了生长率应激。所有微生物菌株在选择范围内显示生长斜率降低。本文所示例子是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和短小芽孢杆菌。在大肠杆菌的情况中，生长斜率减少约3小时，说明此微生物需要约3小时恢复[图7]。
[0069] 金黄色葡萄球菌显示生长斜率在4小时的时间框内减少[图8]。
[0070] 酵母白色念珠菌显示甚至更长的持续应激。生长斜率保持减少超过8小时，应激培养物过夜后恢复正常生长斜率[图9]。
[0071] 对于革兰氏阳性孢子菌，热应激不可行。由于其它应激因子UV光和胃肠外药品稀释不显示对微生物的应激效果，需要发现用于孢子菌的另外应激。对于芽孢杆菌和梭菌，激发细菌悬液中更高的孢子含量并进行OD测量[图10]。通过营养耗尽和在2-8℃保存过度生长的微生物培养物6天以上来形成孢子。
[0072] 以所述方式测试所有微生物。仅在3种情况中观察到困难。霉菌青霉菌和曲霉菌在液体培养基中以菌丝体生长，因此可能无法测定确切的OD。由于数据可用于白色念珠菌和所有测试微生物，只能假定青霉菌和曲霉菌表现方式相同。因此，取测试参数用于培养基评估。在另一种情况中，对于疮疱丙酸杆菌(此菌株在FTM中生长较好)，通过平板计数确定的减少≥50％的参数不能在OD测量实验中重现。相较来自≥50％减少量实验的参数，仅在延长时间中省略应激时观察到生长的时间延迟。由于氧应激较高，疮疱丙酸杆菌可能在OD测量中显示不同结果。对于OD测量，每小时取等分样品，产生针对疮疱丙酸杆菌的一定氧应激。所得应激因子研究数据概括于表2。
[0073]
[0074] 表2：包括其确定应激参数的微生物列表
[0075] 因此，应激参数热和营养耗尽用于培养基评估。所选应激因子类似无菌药品生产过程中可能存在的应激。
[0076] B.生长促进研究
[0077] 待测培养基用约10-100CFU量的微生物(应激和非应激状态)接种。对于各培养参数重复5次进行实验(培养参数是：20-25℃和30-35℃的有氧培养；30-35℃的厌氧培养)。培养2-7天后目测计数结果。所得原始数据针对各微生物分成6组：
[0078] 1.20-25℃有氧培养-应激微生物，
[0079] 2.20-25℃有氧培养-非应激微生物，
[0080] 3.30-35℃有氧培养-应激微生物，
[0081] 4.30-35℃有氧培养-非应激微生物，
[0082] 5.30-35℃厌氧培养-应激微生物，
[0083] 6.30-35℃厌氧培养-非应激微生物。
[0084] 所测的营养培养基一起分成亚组。
[0085] 用于预选择的固体营养培养基列表(采用10种非应激菌株的生长促进试验)[0086] ·FTM-A(含额外10g/L琼脂的液体巯基醋酸盐培养基，使得终浓度为1.075％琼脂)，瑞士阿尔施维尔的艾米制药公司(Amimed，Allschwil，Switzerland)[0087] ·BHI(脑心浸液琼脂)，经伽马辐射处理，德国埃珀尔海姆的海法公司(Heipha，Eppelheim，Germany)
[0088] ·蒂福科酿酒厌氧琼脂，伽马辐射，德国埃珀尔海姆的海法公司(Heipha，Eppelheim，Germany)
[0089] ·R2A琼脂，英国奥克斯德公司(Oxoid，Great Britain)
[0090] ·施乐血琼脂，经伽马辐射处理，德国埃珀尔海姆的海法公司(Heipha，Eppelheim，Germany)
[0091] ·开索-琼脂ICR(胰蛋白酶大豆琼脂)，经伽马辐射处理，德国埃珀尔海姆的海法公司(Heipha，Eppelheim，Germany)
[0092] ·有5％血的哥伦比亚琼脂，法国梅里埃公司(BioMerieux，France)[0093] ·CDC厌氧血琼脂，经伽马辐射处理，德国埃珀尔海姆的海法公司(Heipha，Eppelheim，Germany)
[0094] 用于最终研究的固体营养培养基列表(采用22种非应激和应激状态菌株的生长促进试验)
[0095] ·蒂福科酿酒厌氧琼脂，经伽马辐射处理，德国埃珀尔海姆的海法公司(Heipha，Eppelheim，Germany)
[0096] ·施乐血琼脂，经伽马辐射处理，德国埃珀尔海姆的海法公司(Heipha，Eppelheim，Germany)
[0097] ·开索-琼脂ICR(胰蛋白酶大豆琼脂)，经伽马辐射处理，德国埃珀尔海姆的海法公司(Heipha，Eppelheim，Germany)
[0098] ·CDC厌氧血琼脂，经伽马辐射处理，德国埃珀尔海姆的海法公司(Heipha，Eppelheim，Germany)
[0099] 所有经伽马辐射处理的培养基进行相应补充以维持辐射过程。
[0100] 营养培养基评估
[0101] 营养培养基评估研究分两部分完成：首先预选择(采用10种非应激菌株进行生长促进试验，在8种琼脂上测试)导致减少到4种培养基，说明仅这些培养基进入进一步考虑的范畴。此预选择排除FTM-A琼脂、脑心浸液琼脂、R2A琼脂和有5％血的哥伦比亚琼脂。
[0102] 以下4种培养基在营养培养基评估中详细测试：胰蛋白酶大豆琼脂、CDC厌氧血琼脂、施乐血琼脂和蒂福科酿酒厌氧琼脂。以应激和非应激状态接种的22种菌株各自所得数据分组并用ANOVA进行统计学分析。3种培养参数20-25℃和30-35℃的有氧培养以及30-35℃的厌氧培养与用于各微生物的2种不同应激状态(应激和非应激)使得各微生物形成6组(乘以22种菌株)。对这些组进行ANOVA分析，总结了各琼脂中22种微生物的良好生长促进特性分数。如果达到最大计数，给予该组/琼脂1分。与此种最高计数琼脂没有显著差异的组/琼脂也得到1分。
[0103] 在20-25℃有氧培养中-施乐血琼脂组获得30分，CDC厌氧血琼脂组获得27分，胰蛋白酶大豆琼脂组获得24分且蒂福科酿酒厌氧琼脂组获得17分[表3A和3B]。疮疱丙酸杆菌和生孢梭菌没有得分，因为它们不能在有氧条件下生长。由于在所有测试琼脂上计数较低(0-5CFU)，应激的黑曲霉、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和病研所芽孢杆菌得到0分。
[0104] 表3A：20-25℃有氧培养的非应激微生物的得分总计数
[0105]TSA CDC 施乐 酿酒
黑曲霉 1 1 1 1
白色念珠菌 1 1 1 1
枯草芽孢杆菌 1 1 1 1
大肠杆菌 1 0 1 1
金黄色葡萄球菌 1 1 1 1
铜绿假单胞菌 0 1 1 1
洛菲不动杆菌 1 1 1 0
地衣芽孢杆菌 1 1 0 0
藤黄微球菌 0 1 1 0
生孢梭菌 0 0 0 0
疮疱丙酸杆菌 0 0 0 0
克劳氏芽孢杆菌 1 1 1 0
非发酵棒杆菌 1 1 1 0
表皮葡萄球菌 1 1 1 1
库克菌属 0 0 0 1
青霉菌属 0 1 1 0
沃氏葡萄球菌 0 1 1 0
短小芽孢杆菌 1 1 1 1
头状葡萄球菌 0 0 1 0
球形芽孢杆菌 1 0 1 0
病研所芽孢杆菌 1 1 1 0
奥斯陆莫拉菌 1 1 0 0
总计 14 15 17 9
黑曲霉 1 1 1 1
白色念珠菌 1 1 1 1
枯草芽孢杆菌 1 1 1 1
大肠杆菌 1 0 1 1
金黄色葡萄球菌 1 1 1 1
铜绿假单胞菌 0 1 1 1
洛菲不动杆菌 1 1 1 0
地衣芽孢杆菌 1 1 0 0
藤黄微球菌 0 1 1 0
生孢梭菌 0 0 0 0
疮疱丙酸杆菌 0 0 0 0
克劳氏芽孢杆菌 1 1 1 0
非发酵棒杆菌 1 1 1 0
表皮葡萄球菌 1 1 1 1
库克菌属 0 0 0 1
青霉菌属 0 1 1 0
沃氏葡萄球菌 0 1 1 0
短小芽孢杆菌 1 1 1 1
头状葡萄球菌 0 0 1 0
球形芽孢杆菌 1 0 1 0
病研所芽孢杆菌 1 1 1 0
奥斯陆莫拉菌 1 1 0 0
总计 14 15 17 9
[0106] 表3B：20-25℃有氧培养的应激微生物的得分总计数
[0107]
[0108] 在30-35℃有氧培养中-施乐血琼脂组获得28分，胰蛋白酶大豆琼脂组获得28分，CDC厌氧血琼脂组获得27分且蒂福科酿酒厌氧琼脂组获得24分[表4A和4B]。疮疱丙酸杆菌和生孢梭菌没有得分，因为它们不能在有氧条件下生长。由于计数较低(0-5CFU)，应激的病研所芽孢杆菌和奥斯陆莫拉菌得到0分。
[0109] 表4A：30-35℃培养的应激微生物的得分总计数
[0110]
[0111] 表4B：30-35℃培养的非应激微生物的得分总计数
[0112]TSA CDC 施乐 酿酒
黑曲霉 1 1 1 1
白色念珠菌 0 0 1 1
枯草芽孢杆菌 1 1 1 1
大肠杆菌 1 1 1 1
金黄色葡萄球菌 1 1 1 0
铜绿假单胞菌 1 1 1 1
洛菲不动杆菌 1 1 0 1
地衣芽孢杆菌 0 0 0 0
藤黄微球菌 0 1 1 0
生孢梭菌 0 0 0 0
疮疱丙酸杆菌 0 0 0 0
克劳氏芽孢杆菌 1 0 1 0
非发酵棒杆菌 0 1 1 0
表皮葡萄球菌 1 1 1 0
库克菌属 1 1 1 1
青霉菌属 0 1 0 0
沃氏葡萄球菌 1 0 1 0
短小芽孢杆菌 1 1 1 1
头状葡萄球菌 0 1 1 0
球形芽孢杆菌 1 1 1 1
病研所芽孢杆菌 0 0 0 0
奥斯陆莫拉菌 1 0 0 0
总计 13 14 15 9
黑曲霉 1 1 1 1
白色念珠菌 0 0 1 1
枯草芽孢杆菌 1 1 1 1
大肠杆菌 1 1 1 1
金黄色葡萄球菌 1 1 1 0
铜绿假单胞菌 1 1 1 1
洛菲不动杆菌 1 1 0 1
地衣芽孢杆菌 0 0 0 0
藤黄微球菌 0 1 1 0
生孢梭菌 0 0 0 0
疮疱丙酸杆菌 0 0 0 0
克劳氏芽孢杆菌 1 0 1 0
非发酵棒杆菌 0 1 1 0
表皮葡萄球菌 1 1 1 0
库克菌属 1 1 1 1
青霉菌属 0 1 0 0
沃氏葡萄球菌 1 0 1 0
短小芽孢杆菌 1 1 1 1
头状葡萄球菌 0 1 1 0
球形芽孢杆菌 1 1 1 1
病研所芽孢杆菌 0 0 0 0
奥斯陆莫拉菌 1 0 0 0
总计 13 14 15 9
[0113] 在30-35℃厌氧培养中-CDC厌氧血琼脂组获得25分，施乐血琼脂组获得25分，胰蛋白酶大豆琼脂组获得21分且蒂福科酿酒厌氧琼脂组获得17分[表5A和5B]。由于计数较低(0-5CFU)，应激的病研所芽孢杆菌得到0分。
[0114] 表5A：30-35℃厌氧培养的非应激微生物的得分总计数。不是所有微生物都能在厌氧条件下生长，因此没有给予计数。
[0115]TSA CDC 施乐 酿酒
黑曲霉 0 0 0 0
白色念珠菌 0 0 0 1
枯草芽孢杆菌 1 1 1 1
大肠杆菌 1 1 1 1
金黄色葡萄球菌 1 1 0 1
铜绿假单胞菌 1 1 1 1
洛菲不动杆菌 0 0 0 0
地衣芽孢杆菌 1 1 1 0
藤黄微球菌 0 0 0 0
生孢梭菌 1 1 1 0
疮疱丙酸杆菌 1 1 1 0
克劳氏芽孢杆菌 1 0 0 0
非发酵棒杆菌 0 0 0 0
表皮葡萄球菌 1 1 1 1
库克菌属 1 1 1 1
青霉菌属 0 0 0 0
沃氏葡萄球菌 1 1 1 1
短小芽孢杆菌 0 1 0 1
头状葡萄球菌 0 0 0 1
球形芽孢杆菌 1 1 1 1
病研所芽孢杆菌 1 1 1 0
奥斯陆莫拉菌 0 0 0 0
总计 13 13 11 11
黑曲霉 0 0 0 0
白色念珠菌 0 0 0 1
枯草芽孢杆菌 1 1 1 1
大肠杆菌 1 1 1 1
金黄色葡萄球菌 1 1 0 1
铜绿假单胞菌 1 1 1 1
洛菲不动杆菌 0 0 0 0
地衣芽孢杆菌 1 1 1 0
藤黄微球菌 0 0 0 0
生孢梭菌 1 1 1 0
疮疱丙酸杆菌 1 1 1 0
克劳氏芽孢杆菌 1 0 0 0
非发酵棒杆菌 0 0 0 0
表皮葡萄球菌 1 1 1 1
库克菌属 1 1 1 1
青霉菌属 0 0 0 0
沃氏葡萄球菌 1 1 1 1
短小芽孢杆菌 0 1 0 1
头状葡萄球菌 0 0 0 1
球形芽孢杆菌 1 1 1 1
病研所芽孢杆菌 1 1 1 0
奥斯陆莫拉菌 0 0 0 0
总计 13 13 11 11
[0116] 表5B：30-35℃厌氧培养的应激微生物的得分总计数。不是所有微生物都能在厌氧条件下生长，因此没有给予计数。
[0117]TSA CDC 施乐 酿酒
黑曲霉 0 0 0 0
白色念珠菌 0 0 1 0
枯草芽孢杆菌 1 1 1 1
大肠杆菌 1 1 1 1
金黄色葡萄球菌 1 1 1 1
铜绿假单胞菌 0 1 1 1
洛菲不动杆菌 0 0 0 0
地衣芽孢杆菌 1 1 1 1
藤黄微球菌 0 0 0 0
生孢梭菌 0 1 1 0
疮疱丙酸杆菌 1 1 1 0
克劳氏芽孢杆菌 1 0 1 0
非发酵棒杆菌 0 0 0 0
表皮葡萄球菌 0 1 1 0
库克菌属 0 0 0 0
青霉菌属 0 0 0 0
沃氏葡萄球菌 0 1 1 0
短小芽孢杆菌 1 1 1 1
头状葡萄球菌 0 1 1 0
球形芽孢杆菌 1 1 1 0
病研所芽孢杆菌 0 0 0 0
奥斯陆莫拉菌 0 0 0 0
总计 8 12 14 6
黑曲霉 0 0 0 0
白色念珠菌 0 0 1 0
枯草芽孢杆菌 1 1 1 1
大肠杆菌 1 1 1 1
金黄色葡萄球菌 1 1 1 1
铜绿假单胞菌 0 1 1 1
洛菲不动杆菌 0 0 0 0
地衣芽孢杆菌 1 1 1 1
藤黄微球菌 0 0 0 0
生孢梭菌 0 1 1 0
疮疱丙酸杆菌 1 1 1 0
克劳氏芽孢杆菌 1 0 1 0
非发酵棒杆菌 0 0 0 0
表皮葡萄球菌 0 1 1 0
库克菌属 0 0 0 0
青霉菌属 0 0 0 0
沃氏葡萄球菌 0 1 1 0
短小芽孢杆菌 1 1 1 1
头状葡萄球菌 0 1 1 0
球形芽孢杆菌 1 1 1 0
病研所芽孢杆菌 0 0 0 0
奥斯陆莫拉菌 0 0 0 0
总计 8 12 14 6
[0118] 数据显示施乐血琼脂在有氧条件下具有最佳生长促进特性，在厌氧条件下它得到的分数与CDC厌氧血琼脂组相同。因此，选择施乐血琼脂作为22种测试菌株和3种测试培养参数的合适琼脂。施乐血琼脂(13)(由德国埃珀尔海姆的海法公司改良)的组成如下：酪蛋白胨10g，大豆粉蛋白胨1g，肉蛋白胨2g，肉提取物1g，酵母提取物5g，葡萄糖2g，NaCl
5g，磷酸氢二钾2.5g，细菌级琼脂14g，羊血50ml，氨基酸，缓冲液，氯化血红素，维生素K，伽马辐射：9-20kGy。
5g，磷酸氢二钾2.5g，细菌级琼脂14g，羊血50ml，氨基酸，缓冲液，氯化血红素，维生素K，伽马辐射：9-20kGy。
[0119] 20-25℃和30-35℃的有氧培养间的差异
[0120] 用培养基评估数据进行t检验以显示20-25℃和30-35℃培养温度(有氧培养)间是否有显著差异。
[0121] 对由应激和非应激状态的所有好氧微生物(没有生孢梭菌和疮疱丙酸杆菌)组成的40个组进行t检验。这40组中11组出现显著性差异。相较20-25℃组，培养参数30-35℃时显示更高的菌落形成单位(来自相同接种物)5次。在6例中20-25℃组产生更高的值。T检验显示所述温度间有显著差异。由于40例中有11例差异显著，需要在快速无菌试验中验证2种培养温度。这些结果强调了培养温度对于传统无菌试验以及快速无菌试验的重要性。
[0122] 数据的统计学分析
[0123] 对于原始数据的统计学分析，使用Minitab 14.20版统计软件完成以下方法。
[0124] ANOVA(方差分析)比较平均数。ANOVA类似于回归分析，因为其用于研究反应变量与一个或多个独立变量之间(组间)的关系并建模。ANOVA使用假设检验，这意味着测试了零假设。ANOVA产生p值。p值代表产生1型错误的概率，或当其为真时拒绝零假设。截断值是0.05-当对应95％置信界限的p值低于0.05时，拒绝零假设。
[0125] 使用ANOVA分析的前提是：
[0126] -4个亚组(营养培养基)的正态分布，p值≥0.05
[0127] -使用巴特利特检验的方差齐性检验：p值≥0.05和
[0128] -Levene检验：p值≥0.05
[0129] ANOVA的p值≥0.05说明亚组/琼脂间没有显著差异，p值＜0.05则亚组/琼脂间存在显著差异。未显示与最高平均值有显著差异的各琼脂(包括具有最高平均值的琼脂)评为1分。显示与最高平均值有显著差异的琼脂没有得分。用狄克逊检验进行异常值分析(W.J.Dixon，Ann.Math.Statist.，21：488-506(1950)；W.J.Dixon，Biometrics，9：74-89(1953)；USP<1010>“分析数据-解释和处理”(Analytical data-interpretation and treatment)，《药典论坛》.USP 30-NF，第2次修订，美国药典委员会)。为此，含检测中一组观察值的N值以升序排列：X1＜X2＜...＜XN。然后，计算统计实验Q值(Q实验)。该比例定义为怀疑值与其最近值间的差异除以数值范围(Q：舍弃商)。因此，为测试X1或XN(作为可能的异常值)，使用以下Q实验值：
[0130] 将所得Q实验值与表中发现的临界Q值(Q临界)作比较。如果Q实验＞Q临界，则将怀疑值鉴定为异常值并可排除。如若不是，保留怀疑值并用于所有后续计算。其它能进行ANOVA的方法如下：不遵循正态分布且显著低于其它亚组的亚组(一组中4种营养培养基)被排除，因为它们与ANOVA无关。如果组内亚组的CFU值过低(0-5CFU)，给出4次0得分的最终结果。在所有其它情况中，需要进行重复试验。采用t检验(也使用Minitab 14.20版统计软件)比较2种样品的平均值；t检验比较2个平均值相对数据方差的实际差异(表示为平均值之间差异的标准偏差)。
[0131] C.密理博生产的密理弗(Milliflex)
[0132] 测试的样品(在100ml冲洗液中稀释以确保膜上微生物的适当分布)用密理弗PLUS泵经密理弗 快速滤器过滤，可能的污染会陷在过滤膜上(孔径：0,45μm)。
[0133] 过滤后采用密理弗 系统将滤纸施加到固体营养培养基上，该系统中无菌密理弗滤纸碰到密理弗 盒且漏斗中断。由于此密理弗 系统将膜转移到培养基上，经膜处理的二次污染风险很小或没有。由于盒密闭，培养期间的二次污染风险较低。通过在密理弗盒上培养滤纸，可能发生潜在污染物长成微菌落。培养时间结束时，将滤纸与密理弗 盒分离并施加到层流净化罩中的自动喷雾台上。培养后的步骤不是涉及二次污染的关键步骤，因为微菌落需要具有一定大小(约：10-100个酵母细胞，1000个细菌细胞)以在密理弗快速检测系统中检测。如果环境或操作衍生的微生物在培养后步骤中加到膜上，其不能检测，因为该微生物缺乏培养并因而缺乏检测所必需的一定量的ATP。
[0134] 自动喷雾台将ATP释放剂和之后的生物发光剂喷射到膜上。
[0135] 此处所示反应是密理弗 快速检测的基础(W.D.McElroy，Adv.Enzymol.Relat.Areas.Mol.Biol.，25：119-166(1963))：
[0136] 萤光素+ATP萤光素酶，Mg2+→+氧化萤光素+AMP+hv(λ＝562nm)
[0137] (Mg2+指镁，ATP指三磷酸腺苷，AMP指一磷酸腺苷，hv指发射电子，λ指波长)[0138] 需要将喷雾膜从自动喷雾台快速转移到密理弗 快速检测塔以捕获发射电子最大值。用CCD相机(电荷耦合器件)检测可能的光信号，密理弗 快速软件算法计算微菌落的量。
[0139] 密理弗
[0140] 由于施乐血琼脂用于密理弗 快速微生物检测系统，进行试验以确定此培养基是否引起生物发光背景。为此，培养基盒用MXHVWP124膜(聚偏二氟乙烯膜，孔径0.45μm)孵育，该膜用100ml液体A或液体D冲洗过。培养温度是30-35℃，培养5天。图11显示没有来自施乐血琼脂的生物发光背景，说明无干扰ATP留在伽马辐射的培养基中。施乐血琼脂适用于密理弗 快速系统。
[0141] 本文引用的所有文献的全部内容通过引用纳入本文。
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