众所周知溶液中的生物材料例如疫苗易受各种因素的影响，包括 热、氧化剂、盐、pH、光和蛋白水解酶。
已知几种方法普遍减少这些不利的影响，更特别地提高疫苗特别是 在贮存过程中的稳定性。例如，在冷藏箱中低于0℃下贮存，像-70℃这 样低，是一种公知方法。即使在更低温度，例如在液氮中，很多生物材 料包括活细胞能成功地贮存很多年。但是，在例如在涉及自由放牧的牲 畜的接种的那些情况下，这样的方法不总是方便的。
冻干或冷冻干燥是保存用作疫苗的活细胞和病毒的另一条已知途 径。在冷冻干燥期间，首先冷冻含有生物材料的溶液，然后通过升华蒸 发水，通常在高真空和零度以下的温度下。先前的方法使用过冷冻干燥 或者其他技术来配制疫苗，但是关于稳定的最终剂量形式的制备和施用 仍然存在其他难题。
例如，美国专利4251509(Hanson和Abegunde)公开了一种要对干 燥地区自由放牧的牲畜口服给药的稳定颗粒病毒疫苗。但是公开的剂量 形式不是冷冻干燥的而是通过将糊状物浓缩并且挤出、干燥成片剂制备 的。
要求根据特定病毒筛选的抗氧化剂促进热稳定性。这样的制剂制备 可能更复杂，并且特别是不太适合当在免疫之前期望溶解疫苗的那些情 况。
美国专利3458621和3608030(Tint)公开了冷冻干燥的病毒制剂制 备用于肠道免疫口服给药的片剂的用途。但是，制备的片剂是口服给药 的并且提供了肠溶包衣来延缓崩解。在体外试验期间，它们没有快速崩 解并且发现只是在“25分钟之内”崩解并且刺激肠液。此外，扣除肠溶 包衣的作用测定在受刺激肠液中的崩解时间。另外，Tint进一步强调， 通过压制包衣和非压制包衣片剂之间的比较表明，除非片剂是“压制包 衣的”，否则它们将损失它们的效价。Tint指出，非压制包衣片剂“不仅 不能在所有的抗体阴性个体体内激发抗体应答，而且此外，产生的效价 的强度显著变小”(参见第4栏，第40行)。
R.P.Scherer Corp.申请的PCT公开WO99/21579(Seager，等)公 开了一种用作兽药疫苗例如抗新城疫的“快速”分散的组合物，其是冷 冻干燥的并且“松软压制”的。参照美国专利4371516(UK同族专利 1548022)，所述剂量形式公开是“开放基质网状物”，例如“固体泡沫”， 与压制形式或硬压片相反。此外，该疫苗方向是口服并且定向滞留在粘 膜组织。佐剂提供在其上吸收的足够的滞留时间。公开的疫苗配方没有 提供用于后免疫的液体剂量制剂，也没有提供容易形成稳定的可计量的 作为液体剂量给药的疫苗溶液的方式，也没有提供稳定的压制的或硬压 片冻干物来有利于其后施药。
美国专利5587180(Allen，Jr.等)描述了制备用于快速溶解片剂的颗 粒载体基质的方法。该方法教导不用冷冻干燥而使用标准喷雾干燥技术。 所述颗粒载体基质适合置于口腔中时的给药。此外，没有稳定疫苗配方 提供为液体剂量形式的疫苗溶液。
美国专利5336666(Neway等)公开了可以形成要以液体形式重新 配制的片剂的冷冻干燥液体疫苗。但是，所述疫苗局限于特定细菌的极 性糖肽并且不能提供完全或快速溶解。
尽管根据本领域技术人员公知的冻干方法能够进行生物材料的冷冻 干燥来提供合适的疫苗制剂，但是在冻干最后活病毒的效价(titer)一般和 其冻干之前溶液中的不一样。一般情况下，在冻干之前不可能进行滴定 (titration)，因为溶液在其被冻干之前不稳定。另外，在冻干期间效价将 不可预知地变化。结果，只有通过冷冻干燥之后的滴定才证实以经验为 基础的对初始效价的估计。作为所有上述的结果，几乎不可能实现确定 的精确的目标效价。如果用小瓶中已经含有的冻干物进行冻干，对一批 材料的再操作一般是不可能的，并且在某些情况下，如果其没有达到具 体标准则全部这一批材料必须丢弃。
美国专利5897852(Wilderbeek，等)试图使用不同的带有“溶球 (lyosphere)”的“冷冻干燥体”制成冻干块的效价不足来解决这样的问 题。但是，每一个溶球具有其自身的效价从而必然滴定多体来达到期望 的效价。即使在最好的情况下，该方法也不能实现精确获得的效价，因 为由于利用混合抗体实现定向效价，其只能是估计值。此外，与产生块 或粉末的更直接的溶液冷冻干燥相比，溶球的生产相对更难。另外，经 常需要特殊基质来防止溶球材料在干燥之后被粉化。一般情况下，该方 法需要制备各自具有不同的效价，添加剂和佐剂分开的溶液。该方法没 有解决一批活病毒的效价很少是均匀的，并且小瓶和小瓶之间也存在差 异，特别是冻干机中跨越冷却板区的小瓶之间存在差异这样的问题。因 此，需要的对每一个小瓶的溶球数目的确定总是大约值。
冷冻干燥对含有一种以上免疫原性成分的疫苗也是有用的。例如， EP290197A公开了一种冷冻干燥四价疫苗。该方法公开了将四种活病毒 疫苗成分混合后冷冻干燥。
现行用于制备疫苗制剂的冷冻干燥技术的缺点是该方法非常复杂， 具有很多不定因素，使得众所周知难以以可重复方式进行以获得可接受 的产物和剂量均匀性。这对于大量剂量在一个小瓶中冷冻干燥情况下的 兽药疫苗尤其存在问题。这种问题对于人疫苗不常见，但是在需要大量 接种例如在军事事态情况下或者流行性传染病的情况下同样可估计到。 例如，注册的用于家禽接种的典型的单一疫苗小瓶包含1000或2000剂 量。在冷冻干燥之前，粗略估计一下材料的效价，但是最终效价只有在 冷冻干燥之后才能确定，因为在冷冻干燥期间效价经常很不可预测地降 低。此外，活病毒或细菌粗材料通常不能保持足以长时间的稳定以在冷 冻干燥之前获得精确效价结果。
事实上，原本含有2000剂量以上的容器在冷冻干燥之后经常变为 只含有1900剂量。在那种情况下，小瓶可能只标记为1000剂量小瓶， 因为那一般是其它官方注册剂量。对于这样一种情况，将会浪费47％的 材料并且相应地提高费用。混合疫苗使该问题更加严重，因为必须使用 具有最低效价的该成分的剂量来表征整个这一批。作为另一个缺点，当 要提供2000单一剂量的小瓶接着被标记为1000剂量小瓶并且用来接种 1000个动物时，这样给药的动物没有必要过量接触。此外，当更有效地 干燥这批疫苗中的一些时，在冷冻干燥之前肯定增加的剂量数不是令人 满意的改变。在那种情况下，只是结束了材料的浪费。
对于解决疫苗剂量效价数在确定的上限和下限之间的注册系统的注 册人最近的工作，这些问题将变得越来越重要。由于在生产和冷冻干燥 过程中很多的变数，大规模生产基础上将难以符合这些限定。正如所指 出的，当需要混合疫苗时，该问题将更加明显。
先前冷冻干燥混合疫苗的另一个缺点是必须贮存大量的配制的混合 物。因为一般在冷冻干燥之前将混合疫苗的各种成分混合而发生这种情 况。因此，对于制备抗例如两种疾病的全范围单/多成分疫苗的制备，必 须贮存三种不同的产物：(1)包括抗-A疫苗的产物，(2)包括抗-B疫苗 的产物，和(3)包括抗-A疫苗和抗-B疫苗的产物。在抗三种疾病的疫 苗的情况下，必须制备并储存七种不同的疫苗/混合物。对于四种疾病， 这个数为十五种不同的疫苗/混合物。结果，经常需要提供和保持大量贮 存接纳能力。
美国专利5397569和5871748(Whitfill等)公开了通过卵内施用由 活疫苗病毒和与之结合的中和抗体组成的疫苗复合物在鸟类受试者体内 产生抗新城疫病毒(NDV)的活性免疫性。Whitfill公开了病毒与中和抗 体或者其片段的比例将决定免疫接种的成功。但是，对于有效用于抗NDV 的这样一种方法，必须将该比例的值保持在一个窄的范围，这样使得不 杀死鸡而成功免疫接种。此外，利用冻干的NDV(和使用其它病毒制剂 一样)效价的不可预测性表明像Whitfill这样的方法不容易应用于NDV。 因此，期望能够保证制备这样一种疫苗的NDV和抗体的更精确的效价。
先前疫苗配方及其制备方法的另一个缺点在于实际冷冻干燥过程占 据空间的性质。一般情况下，冻干疫苗首先需要将溶解的疫苗分散于玻 璃小瓶中。然后将小瓶松松地盖上橡皮塞并且置于冷冻干燥箱或冷凝器 中的架子中的格中。难以将非常高剂量的溶解的疫苗材料浓缩成非常小 的体积。
作为结果，在多疫苗剂量的冷冻干燥中典型使用的小瓶总是含有相 对大体积的液体。有效冷冻干燥要求要冻干的液体将大表面积暴露于真 空。因此，由于只有冷冻小丸的上部与真空接触，所以在相对大的具有 宽的低部的玻璃瓶或小瓶中冷冻干燥疫苗。这些小瓶有时5厘米高，另 外需要另外高2厘米用于橡皮塞。结果，冷冻干燥仪器中的产物材料和 空间的比例十分不足以导致较低费用的有效生产过程。
玻璃小瓶中含有的配制的冷冻干燥疫苗的常规组合物的另一个缺点 是冷冻干燥期间橡皮塞可能阻碍水分子从小瓶至冷凝器的自由转移。这 可能增大小瓶中升华气体的分压，从而降低冷冻效率，并且增大了冻干 材料萎陷的危险。玻璃也阻碍热传递进一步影响冻干效率。通过在冻干 中使用隔盘而不用玻璃瓶和塞子将提高效率。此外，冷冻干燥非常费时 间。疫苗成分一般保持在仅低于凝固点来降低水的升华时间。但是，更 长的干燥时间几乎不可避免地导致效价的降低。具有塞子和铝盖的玻璃 瓶通常被视为一个障碍。从生产的角度讲，它们代表高于完成疫苗的成 本的50％。在这种情况下，必须向小瓶注射稀释剂，并且如果需要，提 取并稀释得到的溶液备用。这是不方便的，不总是适合现场情况，例如 在养鸡场中。对于在该过程中偶尔自行注射的这些情况中的操作也是不 常见的。还有，这样的疫苗包装和制剂的另一个缺点是一些浓缩溶液会 留在小瓶中，结果，通常接受的是过量的内含物有必须补偿不均匀性和 制备损失，以及贮存期间带来的损失。还必须安全处置玻璃瓶使不可能 导致健康和环境公害。
作为结果，常规冷冻干燥疫苗配方的应用涉及复杂的制备技术，其 成本高并且在野外难以实施。结果，这样的常规疫苗配方不很适合在发 展中国家接种，因为发展中国家经济上和实地条件都不允许耗费大的事 情，或者需要大量接种的情况，例如防御生物战，或者其它潜在的突发 事件或流行病。
因此，所期望的是这样一种疫苗配方，其避免使用用于给药的玻璃 瓶，提供较低费用和大体积包装替代物。还期望的是这样一种疫苗配方 及其使用方法，其提供更高剂量精确性并且容易使用，同时保持稳定性， 无菌性，溶解性和均匀性，对于单和多疫苗配方都是如此。有利于更精 确，可重复生产和有效给药的疫苗配方和改进的免疫方法能够提供更好 的实地效率，提高的安全性，成本效率，较少浪费，和改进的环境要求。
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供一种疫苗组合物和免疫方法，包括 简单地将固体、压实、稳定形式的冻干疫苗溶解于稀释剂中，从而省却 玻璃小瓶的需要，同时也使得剂量精确性大大提高，并且容易使用。
本发明的另一个目的是提供冻干的活的或灭活疫苗，其是压实的、 压紧的或压片的密实、稳定固体，其在制备期间以及在商售疫苗足够的 保存期要求的期间内将保持其潜在的免疫能力。
本发明的另一个目的是提供冻干的活的或灭活疫苗，其是压实的、 压紧的或压片的密实稳定固体，其有利于卵内(in-ovo)疫苗制剂的配制及 其使用。
本发明的另一个目的是提供冻干的活的或灭活疫苗，其是压实的、 压紧的的或压片的密实稳定固体，其有利于非小瓶容器中疫苗的包装及 其使用。
本发明的另一个目的是提供可以配制的更适合接种的疫苗组合物和 免疫方法及其使用。
本发明的另一个目的是提供一种疫苗组合物和免疫方法，其减少了 为抵消根据已知方法制备的包装疫苗的效价中固有的不精确所需要的过 量疫苗材料的需要。
本发明的另一个目的是提供使可以施用的疫苗配方类型更灵活的疫 苗组合物和免疫方法。
本发明的另一个目的是提供有利于多剂量疫苗溶液的配制及其使用 的疫苗组合物和免疫方法。
本发明的另一个目的是提供有利于人群免疫的疫苗组合物和免疫方 法。
本发明的另一个目的是提供一种疫苗组合物和免疫方法，其适合用 于低成本的不发达国家免疫接种，这些国家成本和场地条件不允许复杂 制备和昂贵的使用。
本发明的另一个目的是提供用于必须群体免疫接种的生物战防御的 疫苗组合物和免疫方法。
本发明可以实现这些和其它目的，其涉及含有至少一种预先滴定过 的冻干的抗原成分和助溶剂的稳定疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是 硬片剂形式。另外，本发明还提供使受试者免疫抵抗某种疾病的方法， 其包括以下步骤：用稀释剂溶解疫苗组合物形成溶液，其中所述疫苗组 合物含有至少一种冻干的抗原成分和助溶剂，其中所述疫苗组合物是硬 片剂形式，其中所述疫苗组合物提供抵抗这种疾病的保护；给受试者施 用使其获得免疫抵抗该疾病的有效量的得到的溶液。
参照下面的实施例根据下面的详细描述，本发明其特别特征将变得 更明显。下面的描述将继续讨论本发明提出的问题和解决方案，它们涉 及兽医应用。但是，下面的描述不能理解为限制于此或者对人免疫接种 不能用。
本发明的详细描述
本发明提供含有至少一种冻干的抗原成分和一种助溶剂的稳定压紧 的疫苗组合物。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述疫苗组合物是硬片剂形 式。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述组合物在水中完全而快 速地溶解。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述组合物是无菌的。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述助溶剂是泡腾剂或者一对 泡腾剂试剂(pair of agents)，崩解剂，表面活性剂或增溶剂。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述泡腾剂对包括一种盐和 一种酸。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述泡腾剂对中酸是柠檬 酸，所述盐是碳酸氢盐。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述疫苗组合物含有粘合剂 和润滑剂。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述组合物在水中完全而快 速地崩解。
在本发明的另一个实施方案中，所述活性材料是在使用之前在低于 冷冻温度的干燥氮气之下保存的预先滴定过的冻干物。
在本发明的另一个实施方案中，所述冻干成分至多占该组合物重量 的80％。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述疫苗组合物特征在于与 稀释剂接触后在不到80秒之内完全溶解。
在本发明的另一个优选的实施方案中，在每200毫克组合物0.5毫升 稀释剂和每400毫克组合物100毫升稀释剂之间的稀释剂与组合物比例 下发生所述疫苗组合物的完全溶解。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述疫苗组合物的稳定性特 征在于在37℃下5天之后效价的减小不大于109.7EID50/毫升和109.2EID50/ 毫升之间的差异。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述疫苗组合物的稳定性特 征在于在4℃下9个月之后效价的减小不大于109.7EID50/毫升和109.3 EID50/毫升之间的差异。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述疫苗组合物的抗原成分 是全病毒，全细菌或全微生物。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述疫苗组合物的抗原成分 是活细菌或活病毒。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述疫苗组合物含有存在抗原 成分的指示剂。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述指示剂是一种染料。
本发明进一步提供了含有至少一种冻干的抗原成分和一种助溶剂的 稳定疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是硬片剂形式并且所述抗原成分 包括脂多糖或蛋白质，不管它是天然存在的，重组的或修饰的。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述抗原成分是选自下面的 活病毒：新城疫病毒或细菌，新城疫病毒VH株，传染性滑液囊疾病病毒， Gumboro病病毒，禽痘病毒，喉气管炎病毒，传染性支气管炎家禽病毒， Gumboro Winterfield病毒，传染性支气管炎(IB-H120)，绵羊天花病毒， 牛瘟病毒，炭疽孢子，沙门氏菌属，大肠埃希氏杆菌，或者上述一种或 多种的混合物，不管它是天然存在的，重组的或修饰的。
在本发明的另一个实施方案中，所述抗原成分是选自炭疽孢子、沙 门氏菌属、大肠埃希氏杆菌，或者上述一种或多种的混合物，不管它是 天然存在的或重组的或修饰的。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述抗原成分是活病毒，并 且该组合物进一步含有抗该病毒的中和抗体。
本发明进一步提供使受试者免疫抵抗某种疾病的方法，包括以下步 骤：用稀释剂溶解疫苗组合物形成一种溶液，其中所述疫苗组合物含有至 少一种冻干的抗原成分和助溶剂，其中所述疫苗组合物是硬片剂形式， 并且其中疫苗组合物提供抵抗该疾病的保护；和将得到的溶液以使受试者 免疫抵抗该疾病的有效量施用给受试者。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述免疫方法的溶解步骤进一 步特征在于疫苗组合物的完全溶解。
在本发明的另一个优选的实施方案中，在每200毫克组合物0.5毫升 稀释剂和每400毫克组合物100毫升稀释剂之间的稀释剂与组合物比例 下发生所述免疫方法的溶解步骤期间的完全溶解。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述免疫方法的溶解步骤进 一步特征在于与稀释剂接触时在不到80秒之内完全溶解。
在本发明的另一个实施方案中，所述施用步骤包括用溶液对受试者 注射。
在本发明的另一个实施方案中，所述施用步骤包括用所述溶液形成 的气溶胶对受试者喷雾。
在本发明的另一个实施方案中，所述施用步骤包括以滴眼液形式将 所述溶液施用给受试者。
在本发明的另一个实施方案中，所述施用步骤包括通过口服摄入施 用所述溶液。
在本发明的一个优选的实施方案中，对鸟类动物受试者施用所述免 疫方法，并且所述疾病选自新城疫，传染性滑液囊病，禽痘，喉气管炎， 家禽传染性支气管炎。
在本发明的另一个优选的实施方案中，给药步骤包括在卵内对受试 者施用溶液。
本发明还提供了一种包装(package)，其包含含有至少一种冻干的抗 原成分和助溶剂的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是硬片剂形式或者 进一步含有指示抗原成分存在的指示剂。
在本发明的优选的实施方案中，所述包装是泡罩包装(blister pack)。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述包装是无菌注射器。
本发明还提供了含有密实疫苗组合物的无菌注射器，其中所述疫苗 组合物含有至少一种冻干抗原成分和助溶剂。
在本发明的一个实施方案中，所述无菌注射器的压实疫苗组合物是 压紧组合物。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述无菌注射器的压紧疫苗组 合物是硬片剂形式。
本发明进一步提供了使受试者免疫抵抗一种疾病的方法，其包括向 含有压实疫苗组合物的无菌注射器加入稀释剂，其中所述疫苗组合物含 有至少一种冻干的抗原成分和助溶剂，或者其中无菌注射器的压实疫苗 组合物进一步的特征是压紧组合物，或者其中无菌注射器的压紧疫苗组 合物是片剂形式，使得在注射器中形成溶液，并且将得到的溶液施用给 受试者。
通过任何合适的方法可以施用溶解本发明的疫苗组合物得到的溶 液。根据本发明的使受试者免疫抵抗某种疾病的方法可以利用施用疫苗 组合物形成的液体溶液的多种方法。施用的例示的方法是肌内注射，皮 下注射，静脉内注射，腹膜内注射，滴眼液，通过饮用水，气雾剂或鼻 喷雾剂。当要处理的动物是鸟类时，所述鸟类动物可以是新孵化的(即大 约孵化后一天)，青春期的或成年期的鸟类。本发明的疫苗可以用于卵内 对鸟类施用，如Sharma的美国专利No.4458630所述。
本发明的冷冻干燥(冻干的)预先滴定过的疫苗组合物理解为是由至少 一种冷冻干燥的抗原预先滴定过的疫苗成分，赋形剂和任选的各种添加 剂组成的制剂，其已经压实或压紧成密实形式。
如这里使用的，“密实(dense)”指具有大于1.0g/cc密度的疫苗组合 物。通常，疫苗组合物的密度将大于1.5g/cc。典型地，疫苗组合物的密 度范围是大约1.5g/cc至2.5g/cc。
疫苗组合物可以是压实，压紧或硬片剂形式的。
如这里使用的，“压实的(compacted)”指具有大于1.0g/cc密度的疫 苗组合物，但是以Strong-Cobb单位(SCU)测定并且在ERWEKA片剂硬 度测试仪TBH20型上测定硬度时没有可测的硬度。
如这里使用的，“压紧的(compressed)”指具有至少2.0SCU硬度的疫 苗组合物，并且“硬片剂(hard tablet)”指片剂形式或者具有至少3.0SCU 硬度的其它密实形式的疫苗组合物。
可以在安装的MANESTY F3冲压机12mm平面倾斜或6mm标准凹 面冲压机上制备压实的，压紧的和硬片剂疫苗组合物。
以最大4吨的压力制备硬片剂形式的疫苗组合物。如上所述在 ERWEKA片剂硬度测试仪TBH20型上测定片剂硬度，发现硬度都大于 3.0SCU。
通常与治疗物质相关的经典片剂被理解为是这样的“片剂”。但是， 可以理解其是指任何压实的或压紧的密实形式，包括药学领域不经常使 用的那些。例如，大“团块(briquette)”也是适合的，最终应用要求大体 积材料。
要明白在稀释剂中“完全”并且“快速”崩解或溶解的制剂是在纯 水中能够这样做的制剂，即使预期的应用不限于纯水而是用一种溶液例 如盐水，或者在无水赋形剂的情况下。
“完全溶解”理解为没有不溶成分不溶解。“快速崩解或溶解”理解 为当大体积水用于小体积压紧的冻干的疫苗组合物例如100毫升水用于 400毫克泡腾片剂时在大约几分钟之内或更短时间内完全崩解或溶解。 稀释剂体积相比减小情况下时间延长。因此，相同的片剂，10毫升体积 水可能需要70秒，2毫升体积水可能需要80秒。
上面指出的崩解或溶解时间是室温不搅拌下置于测定量水中时溶解 或崩解片剂所需时间。
“稳定的”理解为本发明的组合物在其制备或商售疫苗货架期所需 时间将保持它们(潜在的)免疫能力。
通过参照下面的实施例将证明，正如这里所描述的，本发明的疫苗 组合物和免疫方法具有很多优点。
如下通过对含有1000剂量疫苗成分的疫苗组合物制剂的说明来一般 性举例说明本发明的方法。在盘中冻干疫苗成分的溶液。将干燥的材料 磨碎。测定冷冻干燥之后均匀混合样品的效价，同时将冻干物保存在氮 气下-20℃密封结实的容器中。如果测得冻干材料的效价是每100毫克625 剂量，则每个压紧的疫苗制剂中160毫克重量的该材料足以精确达到要 求的效价。然后将该材料与任选的和/或功能性添加剂混合，并且将该制 剂压紧或压片。然后可以通过本领域技术人员公知的任何方法和/或这里 描述的方法包装压紧的冷冻干燥的疫苗制剂。
术语赋形剂是配制疫苗组合物中使用的稀释剂或载体的总称。赋形 剂可以包括：稀释剂或填料，粘合剂或粘结剂，助溶剂，润滑剂，隔离剂， glidant或流动性促进剂，染料，矫味剂，甜味剂和吸附剂。
具体地说，片剂填料是兼衡大团片剂并且主要作为载体起作用的物 质。典型的片剂填料包括但不限于硫酸钙，磷酸钙，碳酸钙，淀粉，修 饰的淀粉(羧甲基淀粉等)，微晶纤维素，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露糖醇 和山梨糖醇。
片剂填料含量占片剂重量的大约0％至90％。
粘合剂作为使粉末保持为颗粒形式的“胶水”作用。粘合剂包括但 不限于天然聚合物，例如淀粉或阿拉伯胶，黄耆胶和明胶或合成的聚合 物例如PVP和甲基-，乙基-和羟丙基纤维素。
粘合剂含量占组合物重量的大约0％至20％。
助溶剂促进疫苗组合物的溶解。典型的例子包括但不限于泡腾剂， 崩解剂，表面活性剂和增溶剂。
崩解剂引起压紧的片剂崩解。典型的例子包括但不限于淀粉，微晶 纤维素，纯羊毛淀粉，藻酸，淀粉甘醇酸钠，瓜耳胶，交联聚乙烯吡咯 烷酮(PVP)，离子交换树脂和纤维素例如甲基-纤维素，croscarmellose钠， 羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素。
助溶剂含量占组合物重量的大约1％至95％。
润滑剂减小压紧和注入期间要压紧的材料与模壁之间的摩擦。大多 数润滑剂是水不溶性的并且包括硬脂酸盐(镁盐，钙盐和钠盐)，硬脂酸， 滑石和蜡。水溶性润滑剂包括PEG，苯甲酸钠，油酸钠，乙酸钠，月桂 基硫酸钠和月桂基硫酸镁。
润滑剂含量占组合物重量的大约0％至5％。
加入着色剂有助于鉴定疫苗配方的类型，例如审美和功能目的的片 剂形式，例如但是不限于本发明，以色列专利No.46189实施例A至D 公开的染料。
着色剂含量占配方的大约＜1％。
本发明的疫苗组合物可以根据本领域技术人员公知的方法制成片 剂，例如用H.A.Lieberman，L.Lachman，J.B.Schwartz编著的“药物剂量 形式，片剂”(Pharmaceutical Dosage Forms，Tablets)，第二版，vol.1，2， 3中描述的方法。
在优选的实施方案中，本发明的组合物是含有泡腾剂作为助溶剂制 备的硬片剂，正如本领域技术人员明白的，泡腾剂必须含有一种碱性成 分和一种酸性成分，例如泡腾剂对(effervescent pair)，这样当溶解时发生 合适的反应产生二氧化碳和碳酸。合适的泡腾成分包括碱性化合物的碳 酸盐族和无机或有机酸性化合物。
碱性化合物的碳酸盐族中，在本发明的组合物中使用的优选的泡腾 剂是碳酸钠，碳酸氢钠，甘氨酸碳酸盐，碳酸钾，碳酸氢钾，柠檬酸二 氢钾，和碳酸钙。最优选的碱性物质是碳酸氢钠。
本发明的组合物中使用的优选的酸性成分是柠檬酸，己二酸，酒石 酸，马来酸，硼酸，苯甲酸，羟基苯甲酸，甲氧基苯甲酸，扁桃酸，丙 二酸，乳酸，丙酮酸，戊二酸，天冬氨酸，盐酸，草酸，水杨酸，琥珀 酸和乙酸。最优选的酸性泡腾成分是柠檬酸。
除了上述碱性和酸性泡腾片剂成分外，本发明的片剂组合物还可以 含有其它常规使用的赋形剂。
使用本领域公知的片剂制备方法获得本发明的片剂组合物。总的来 说，本发明使用的片剂制备方法可以总结如下：筛选各成分，混合，并 且在MANESTY F3片剂压制机上直接压制成要求的重量、大小和硬度的 片剂。
本发明的泡腾片剂组合物可以溶解于普通的水或简单的盐溶液中。
抗原疫苗成分是特异性触发抗从中衍生疫苗成分的一种或多种抗原 的免疫应答的那些成分。这样的成分可以源自一种病毒或微生物，包括 重组体，例如抗原性脂多糖和抗原性蛋白质，或者例如两种不同的抗原 性蛋白质。它们也可以包括所述蛋白质或多糖的抗原部分。这些成分一 般称之为亚基成分。在某些情况下，疫苗成分包括全病毒或微生物包括 重组体。所述疫苗成分例如可以是菌苗，或者活的减毒细菌或病毒，灭 活细菌或病毒，死细菌或病毒包括重组体和另外修饰体。优选地，疫苗 成分是活的(修饰的非毒性或部分毒性包括重组体)细菌或病毒。例子 包括但不限于沙门氏菌，新城疫疾病病毒，传染性滑液囊疾病 (GUMBORO)病毒，传染性支气管炎病毒，假狂犬病病毒或炭疽孢子 疫苗。
组合疫苗是含有多种疫苗成分的疫苗。组合疫苗还可以含有从两种 或多种不同的病毒或微生物衍生的抗原性成分。
更复杂的组合也是可能的。因此，上述一种类型的疫苗，以及其混 合物称之为组合疫苗。这些组合疫苗还可以含有任何已知的佐剂。
“包装”理解为用于贮存稳定压紧的疫苗制剂的任何包装。
所述包装可以是例如但不限于通常用于包装和贮存片剂的玻璃或塑 料(例如高密度聚乙烯)容器。向稀释剂加入稳定压紧的冷冻干燥疫苗 制剂以使制剂均匀溶解足以使疫苗备好代用。包装本发明压紧的冷冻干 燥疫苗制剂的另一种形式是泡罩包装。泡罩包装的一个例子是带有一行 行凹部的塑料板(盘)，其含有制剂并且优选在干燥氮气下加盖铝箔热密 封。用于敏感产物的另一种泡罩包装称之为铝/铝泡罩，这两种盘都是以 铝或层压各种塑料的铝为基础。这将避免使用费用大并且占空间的玻璃 瓶，一般用于最终使用者一般不使用的疫苗的包装和贮存。
本发明使向例如一桶水中直接加入一泡罩包装的一种或多种压紧的 冷冻干燥疫苗组合物，以在饮用水或气溶胶喷雾系统中使用以保证成功 免疫称为可能。这通常在固定场所例如鸡棚中完成。兽医免疫接种也可 以通过喷雾，肛门刷，穿刺，全身喷洒或作为滴眼液。用类似方法获得 的疫苗溶液或者可以用于胚胎的卵内免疫接种，如美国专利5397569和 5871748所述。
很清楚在本发明中可以使用能被用来盛压紧的固体的任何装置。稀 释剂可以只是水，或者另一方面其可以是缓冲液和佐剂的复杂混合物。 这主要决定于在冻干之前向溶液中或者在压紧之前向制剂中加入什么添 加剂。
已知的冷冻干燥方法在小瓶中得到含有一种或多种疫苗成分的压 块。正如所指出的该方法占空间费时间。如果在盛有溶液的盘中冷冻干 燥抗原性疫苗成分，则在该过程中使用冷冻干燥机中冷却平板的整个表 面。另外，如果发生塌陷或其它情况，如果在冷冻干燥过程中出现任何 其它问题，能够容易回收材料。这不是如果在冻干之前将材料预先添入 玻璃瓶的情况。另外，因为在该方法的该部分不涉及占高度的小瓶，所 以能够将冷却平板以高密度堆积。作为结果，干燥器的容量大大增加， 只有冷凝器容量限制实际应用。作为必然结果，本发明使用小得多的冷 冻干燥器以实现和当在大得多干燥器中使用小瓶时一样的产出。
因此，在一个实施方案中，将已经在盘中干燥然后粉碎成粉末、并 且与无菌添加剂混合以助于成片剂、且最终溶解的无菌冻干抗原材料压 紧成疫苗组合物。然后在干燥氮气下在高湿度和气体屏障下用无菌泡罩 条袋包装来包装无菌疫苗组合物。
在一个优选的实施方案中，冻干材料是活减毒病毒。
在另一个优选的实施方案中，将含有预先干燥的病毒成分的组合的 混合物与有助于溶解的添加剂和任选的期望用于接种的那些佐剂一起压 制成单一制剂。
如果要求组合疫苗，则本发明提供的优点更显著。在压制得到具有 高精确剂量每一种成分的组合疫苗之前仅仅向制剂中加入各类型的抗原 疫苗成分的足量的预先滴定过的冻干物就足够了。
同时，本发明提供贮存例如三种或四种成分疫苗的所有可能的变体 需要的大贮存能力的问题的解决方法。
代替组合疫苗冷冻干燥要求的冷冻干燥之前混合各种成分的是分别 冷冻干燥各成分。这样可以分别贮存各成分。当需要时，通过如本文所 述将合适量的各期望的成分的冻干材料混合成一个制剂，然后如上所述 将混合物压紧并且包装，容易获得各种期望的组合物。
这使得例如在四种成分复合疫苗的情况下，只储存四个容器，每一 个容器只盛有组成要求的任何单一或组合疫苗制剂的一种特定类型疫苗 的冻干材料。先前的方法会要求15个不同的容器，每一个盛有预先组合 的成分或混合物。
在另一个优选的实施方案中，所述疫苗容器包括盛有固体形式例如 无菌片剂的无菌泡罩条，所述无菌片剂从在泡腾剂对(例如碳酸氢钠和 柠檬酸)，无菌粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)和无菌润滑剂(例如硬脂 酰基富马酸钠，硬脂酸镁)中与无菌助溶剂混合的一种或多种疫苗成分 的冻干材料压制而成的。然后可以利用这些单一成分或多成分制剂就地 容易制备已知效价的精确疫苗溶液。上述是助溶剂，粘合剂和润滑剂的 例子，而不是要作为本发明的疫苗组合物的限制。
在另一个实施方案中，免疫的疫苗组合物和方法包括含有从两种或 多种抗原成分衍生的成分的疫苗组合物。以来自多种抗原成分的成分为 基础的疫苗的优点在于一次施用这样一种疫苗足以诱导抵抗多种疾病的 保护作用。要理解对于每一种病毒或微生物，可以包括任何几种不同的 抗原疫苗成分。
在另一个实施方案中，以形成卵内免疫例如活Marek疾病，NDV和 Gumboro疫苗要求的复合物所需要的精确比例可以混合各种疫苗的抗原 成分。因此多成分卵内疫苗制剂也是可能的。通过将用于各种疾病的冷 冻干燥的抗原成分和要求的抗体与片剂助剂的混合物压紧，本发明能够 实现这样的混合物的剂量形式。然后就在卵内接种之前在规定条件下通 过就地将该制剂溶解于要求的赋形剂中可以使用这样一种制剂来实现期 望的病毒免疫因子复合物。
通常，疫苗容器能够含有1至10000剂量或更多的疫苗。对于个体 接种，对于人和兽医使用两种情况，单一剂量容器是常见的。
人脊髓灰质炎病毒疫苗，人活的冷冻干燥的伤寒疫苗或犬细小病毒 疫苗一般配制成单一剂量疫苗。应该理解，对于单一剂量疫苗，与多剂 量疫苗所述的相同配制方法完全适用。
对于新孵化小鸡的大棚接种，实际上通常使用10000剂量疫苗容器 用于大量接种抵抗传染性支气管炎病毒或NDV。对于大农场动物例如牛 免疫接种抵抗例如传染性牛喉气管炎或副流感病毒，一般使用具有10剂 量的疫苗容器。
根据本发明制备的疫苗组合物的一个优点在于在冷冻干燥之后可以 加入在冷冻干燥溶液中不互溶的助溶剂。这加速了施用过程。出人意料 地发现使用预计对活减毒病毒制剂有害的柠檬酸作为崩解剂部分，对效 价没有显著的不利影响。
容器的湿度屏障的完整对配制该类型配方有显著影响，并且应该采 取确保在包装中形成有效湿度屏障的步骤，这一点也是明显的。特别是 当使用泡罩条包装和选择的添加剂当湿润时有不稳定潜力的情况下，如 使用柠檬酸的情况。
本发明还提供使受试者免疫抵抗某种疾病的方法，包括以下步骤： 用稀释剂溶解疫苗组合物形成溶液，其中所述疫苗组合物含有至少一种 冻干的抗原成分和助溶剂，其中所述疫苗组合物是硬片剂形式，并且其 中所述疫苗组合物提供抵抗该疾病的保护作用；以使受试者免疫抵抗该 疾病的有效量将该得到的溶液施用给受试者。
或者，所述冻干物可以含有来自两种或多种病毒或微生物的抗原疫 苗成分。
另外，本发明提供一种疫苗组合物，其中疫苗组合物和稀释剂一起 包含在包装中。这样的实施方案提供了一种免疫方法，其中可以在场所 就地实施形成用于给药的液体疫苗的溶解步骤。
应该明白，含有压紧的冷冻干燥的稳定疫苗组合物的疫苗包装或包 (pack)可以是任何有用的疫苗包装。在一个简单形式中，疫苗包包括含有 疫苗成分的疫苗容器，其与说明书一起包装在盒子中。在更复杂的疫苗 包形式中，疫苗容器可以另外包括稀释剂和注射器。在另一个实施方案 中，在无菌条件下将压紧的冻干的疫苗装入密封注射器中，其中在该无 菌注射器中发生疫苗的溶解。以这种方法，预先装入的注射器的批量规 格不取决于冻干器中注射器占据的空间。
下面的实施例详细说明本发明的疫苗组合物的制备和当用来使受试 者免疫抵抗各种传染病时的效力。也给出了对压紧冷冻干燥的片剂形式 的各种疫苗配方的效价分析的稳定性评价。
给出实施例进一步详细说明和解释本发明但是不应该认作是限制。 除非另有说明，实施例以及说明书和权利要求书中所有的份数和百分比 是重量比。温度是摄氏度。
实施例1
1.1含有活减毒新城疫病毒VH株(下文称之为NDV-VH)的片剂的 制备
用NDV接种能育的无特异性病原体(SPF)鸡蛋，并且根据在鸡蛋中 繁殖NDV病毒的公知方法孵育。
收集尿囊羊膜液(AAF)并且通过在4000g下离心20分钟纯化。
完全根据已知的标准方法实施在小瓶中的冻干。
以下面方式制备片剂：
向13.2克粉碎的冻干物加入：
60克碳酸氢钠
42克无水柠檬酸
4.2克聚乙烯吡咯烷酮K-30
0.3克硬脂酸镁
然后将这些成分混合并且压紧出每片400毫克重量的片剂。
这样制备的每一片得到的片剂含有44毫克冻干物。
1.2片剂分析
评价随机取样的片剂的SPF鸡蛋中的效价，并且与小瓶中的冻干物 的调节量相比较。
  NDV-VH/片剂   109.7EID50 *   NDV-VH/小瓶   109.6EID50
*鸡蛋感染剂量50单位
当将一片加入100毫升水中，在不到一分钟之内完全溶解，即肉眼 观察不到固体痕迹。
当将一片加入10毫升水中，在70秒内完全溶解。
当将一片加入2毫升水中，在80秒之后完全溶解。
在1毫升水中，尽管实现了完全溶解，但是没有发现完全溶解中涉 及该片剂的泡腾性质，这用了大约4分钟。
1.3包装和稳定性
将片剂包装在聚氯乙烯(PVC)泡罩条中并且在37℃下测定稳定性，发 现5，7和9天期间内相对稳定。
  37℃下的天数   0   5   7   9   NDV-VH片剂   109.7   109.2   109.3   109.4
4℃下贮存9个月之后片剂的效价和颜色没有产生可感知的变化。
  4℃下贮存的月数   0   3   9   NDV-VH片剂   109.7   1010.1   109.3   NDV-VH小瓶   109.6   109.6   109.3
对计算相同量的活性材料的每片或小瓶以EID50单位给出效价。
1.4片剂NDV-VH对鸡的效能测定
  组   NDV-VH   EID50/剂量   接种后3星期时的HI   攻击后的致死率   A   片剂1   106.6   9.3   2/18   B   片剂2   106.3   9.2   1/20   C   小瓶   106.6   9.2   2/19   D   没有接种   --   1.2   10/10
HI＝血凝抑制单位。
A：将一片NDV-VH溶解于20毫升无菌蒸馏水中并且使用0.02毫升通过滴入眼 内对18只鸡的每一只接种。
B：类似地，用溶解于40毫升无菌蒸馏水的片剂VH疫苗对另一组鸡接种。
C：将一小瓶NDV-VH溶解于无菌蒸馏水中给出和A一样的相同病毒浓度。
D：没有接种的对照。
接种后3星期对鸡取血，通过血凝抑制(HI)测试测定抗体效价，并且 在Kimron Veterinary Institute(The Istaeli Veterinary Services)通过肌内注射 105.3EID50/鸡用亲内脏强NDV攻击所有的组。
试验结果表明所有的试验疫苗制剂都对鸡提供了好的保护作用。
实施例2
2.1含有NDV-VH的片剂的制备
用NDV接种能育的SPF鸡蛋并且根据在鸡蛋中繁殖NDV病毒的公 知方法孵育。
收集AAF并且通过在4000g下离心20分钟纯化。完全根据公知的 标准方法进行冻干。
在盘中冻干NDV-VH。在低湿度下将干燥的粉末封装在无菌双层聚 丙烯袋中并且保存在-20℃下。制备含有渐增含量的干燥粉末的泡腾片 剂。根据实施例1描述的方法制备片剂。
  成分   重量(克)   重量(克)   重量(克)   重量(克)   干燥盘中   冻干的VH   1.25   (2.7％)   2.5   (5.3％)   5.0   (10.1％)   10.0   (20.3％)   碳酸氢钠   25.0   25.0   25.0   22.0   无水柠檬酸   17.5   17.5   17.5   15.4   聚乙烯吡咯   烷酮K-30   1.75   1.75   1.75   1.75   硬脂酸镁   0.12   0.12   0.12   0.12   片剂重量   0.5   0.45   0.38   0.36
2.2片剂分析
通过对SPF鸡蛋的滴定作用获得片剂的NDV-VH效价(EID50)。
  冻干物/片剂   百分比   2.7   5.3   10.5   20.3   NDV-VH片剂   108.00   108.25   108.75   109.00
获得了活性材料浓度和病毒效价之间令人满意的线性关系。
当将一片加入100毫升水时，在不到一分钟内完全溶解，即肉眼观 察不到固体痕迹。
2.3包装和稳定性
将片剂装在注射器中并且包装在铝箔小药囊中。通过将稀释液吸注 到注射器中制备可注射溶液，接着片剂完全溶解。得到的可注射溶液直 接用于个体接种，或者在一个更大容器中进一步稀释之后多次接种。然 后使用自动注射器。
实施例3
3.1用于卵内接种的含有包含抗新城疫病毒(NDA)抗体的NDV-VH 的片剂的制备
用NDV接种能育的SPF鸡蛋并且根据在鸡蛋中繁殖NDV病毒的公 知方法孵育。
收集AAF并且在4000g下离心20分钟。
完全根据已知的标准方法实施冻干，并且滴定冻干材料。测定NDV 和NDA的期望的量。
以下面方式制备片剂：
向7.0克粉碎的冻干物加入：
0.36克冻干的对NDV(NDA)超免疫鸡血清
13克碳酸氢钠
9.1克无水柠檬酸
0.9克聚乙烯吡咯烷酮K-30
0.07克硬脂酸镁
然后将这些成分混合并且压紧出每片500毫克重量的片剂。这样制 备的每一片片剂含有115毫克冻干的病毒制剂。
3.2片剂分析
当将一片加入100毫升水时，在2.5分钟内完全溶解，即肉眼观察不 到固体痕迹。
3.3包装
将片剂包装在PVC泡罩条中。
3.4含有NDA的片剂NDV-VH卵内效能测定
用NDV-VH+NDA对购得的适合烤制的小鸡卵内接种。孵出之后2 和4星期对卵内接种的鸡进行攻击。在孵育的第18天用卵内注射器 (Embrex U.S.A.)在一个商用农场对胚胎注射。将一片溶解于200毫升 Marek疫苗稀释液中并且对每一个鸡蛋注射0.05毫升。接种的和没有接 种的鸡圈在隔离笼中以避免NDV病毒非特异性污染。
  第二周时HI   攻击第二周时   死亡率％   第四周时HI   攻击第四周时   死亡率％   接种的   5.7   40   4.4   10   没有接种的   3.4   53   2.5   80
在第2和4周对鸡取血通过HI测定检测抗体，在Kimron Veterinary Institute(The Istaeli Veterinary Services)通过肌内注射105.3EID50/鸡用亲内 脏强NDV攻击两组。结果表明在孵化之后第4周对鸡提供好的保护作用。
实施例4
4.1含有活减毒Gumboro Disease病毒(下文称之为“MB”)的片剂 的制备
用Gumboro Disease病毒(MB)接种SPF鸡蛋，并且根据在鸡蛋中繁 殖病毒的公知方法孵育。
收集胚胎和尿囊绒膜并且通过匀浆作用提取病毒。
完全根据已知的标准方法进行冻干。
以下面方式制备片剂：
向10.0克粉碎的冻干物加入：
22.4克碳酸氢钠
15.7克无水柠檬酸
1.7克聚乙烯吡咯烷酮K-30
0.1克硬脂酸镁
然后将这些成分混合并且压紧出每片350毫克重量的片剂。
这样制备的每一片含有70毫克冻干物。
4.2片剂的分析
对随机取样的片剂的效价评价为105.6EID50/片。
(102.5EID50被认为是接种剂量)。
当将一片加入100毫升水时，在不到1分钟之内完全溶解，即肉眼 观察不到固体痕迹。
泡腾片剂和小瓶中的病毒效价
  MB/片剂   105.6EID50   MB/小瓶*   105.5EID50
*调节到相同量的免疫材料。
4.3包装和稳定性
将片剂包装在PVC泡罩条中并且在37℃下测定稳定性。
  37℃下的天数   0   5   MB   105.6EID50   104.9EID50
实施例5
5.1含有禽痘活疫苗病毒的泡腾片剂的制备
用禽痘病毒接种SPF鸡蛋，并且根据在鸡蛋中繁殖病毒的公知方法 孵育。
收集胚胎和尿囊绒膜并且通过匀浆作用提取病毒。
完全根据公知方法进行冻干。
基本上根据实施例1所述制备700毫克片剂。
每片含有140毫克冻干物。
5.2片剂分析
评价每一片在SPF鸡蛋中的效价，并且发现为106.25EID50/片。当将 一片加入100毫升水时，在2分钟之内完全溶解，即肉眼观察不到固体 痕迹。
实施例6
6.1含有喉气管炎(家禽)活病毒的泡腾片剂的制备
用喉气管炎疫苗病毒接种SPF鸡蛋，并且根据在鸡蛋中繁殖病毒的 公知方法孵育。收集胚胎和尿囊绒膜并且通过匀浆作用提取病毒。
完全根据公知方法进行冻干。基本上根据实施例1所述制备700毫 克片剂。
每片含有140毫克冻干物。评价每一片在SPF鸡蛋中的效价，并且 发现为105.53EID50/片。
实施例7
7.1含有传染性支气管炎家禽活病毒的泡腾片剂的制备
用传染性支气管炎家禽病毒接种SPF鸡蛋，并且根据在鸡蛋中繁殖 病毒的公知方法孵育。收集胚胎和尿囊绒膜，并且通过匀浆作用提取病 毒。
完全根据公知方法进行冻干。
基本上根据实施例1所述制备700毫克片剂。
每片含有140毫克冻干物。
7.2片剂分析
评价每一片在SPF鸡蛋中的效价，并且发现为106.15EID50/片。
实施例8
8.1含有Gumboro Winterfield(家禽)活病毒的泡腾片剂的制备
用Gumboro Winterfield(家禽)病病毒接种SPF鸡蛋，并且根据在鸡蛋 中繁殖病毒的公知方法孵育。
收集胚胎和尿囊绒膜并且通过匀浆作用提取病毒。
完全根据公知方法进行冻干。
基本上根据实施例1所述制备700毫克片剂。
每片含有140毫克冻干物。
8.2片剂分析
评价每一片在SPF鸡蛋中的效价，并且发现为106.28EID50/片。
实施例9
9.1含有传染性支气管炎(IB-HI20)+NDV-VH(家禽)活病毒的泡腾片 剂的制备
用IB-HI20或用NDV-VH疾病病毒接种SPF鸡蛋，并且根据在鸡蛋 中繁殖病毒的公知方法孵育。
收集AAF并且以4000克离心20分钟。完全根据公知方法进行冻干。
基本上根据实施例1所述制备700毫克片剂。
每片含有140毫克冻干物。
9.2片剂分析
当将一片加入100毫升水时，在2分钟之内完全溶解，即肉眼观察 不到固体痕迹。
评价每一片在SPF鸡蛋中的效价，并且发现对于IB-HI20和NDV- VH(家禽)的效价分别为105.80和109.60EID50/片。
实施例10
10.1含有绵羊天花活病毒的泡腾片剂的制备
在塑料转管中培养的非洲绿猴肾细胞株系中进行病毒繁殖。
完全根据公知方法进行冻干。
基本上根据实施例1所述制备700毫克片剂。
每片含有140毫克冻干物。
10.2片剂分析
评价每一片的效价为105.85TCID50/片。滴定非洲绿猴肾细胞中的绵羊 天花疫苗病毒。
实施例11
11.1含有牛瘟活疫苗病毒(家畜)的泡腾片剂的制备
在塑料转管中培养的非洲绿猴肾细胞株系中进行病毒繁殖。
完全根据公知方法进行冻干。
基本上根据实施例1所述制备700毫克片剂。
每片含有140毫克冻干物。
11.2片剂分析
评价每一片的效价为104.1TCID50/片。滴定非洲绿猴肾细胞中的牛瘟 疫苗病毒。
11.3疫苗组合物的颜色代码
以色列专利No.46189公开了用不同染料染色的家禽颜色代码标识病 毒疫苗，其在活组织中是安全的并且对病毒的生存能力没有有害影响。 利用截然不同染料对不同的疫苗分别标识颜色代码。合适的染料是例如 苋菜红染料，酒石黄，靛蓝胭脂红蓝或者产生不同色彩的任何这些染料 的混合物。
对各种不同类型疫苗染色或者对不同的相反颜色的疫苗标识颜色代 码的方法对克服农场主犯的这样的错误是有用的，所述错误是农场主想 用不只一种的不同类型疫苗对他们的家禽家畜接种，从而使得他们没有 想保护的禽畜群也抵抗他们实际上要免疫的疾病。这样的错误通常太晚 才发现，并且在各种情况下除了严重的经济损失和对农场主的损失之外， 还对疫苗提出投诉。尽管它们本身可能是安全的，但是当与一种病毒疫 苗组合时，化学染料具有一些问题和危险性。
家禽的免疫接种涉及使用活病毒疫苗，其中或病毒的培养物包含在 终产品中，并且因为活病毒非常弱，可能容易变质，涉及很多技术问题。 不同的着色物质和染料已知是有化学活性的，即它们可能化学氧化或还 原。活病毒对环境变化例如pH条件，温度，放射性，不同的金属离子非 常敏感，另外可能受它们接触的化学物质影响。这样的染料物质例如亚 甲蓝或品红或苯胺染料对病毒可能是毒性的，并且它们注入鸡或火鸡可 能会有问题。因此需要选择这样的染料，使其对活组织使用安全并且对 它们接触的病毒的生存能力无害。已经选择出四种颜色色光来鉴定当今 家禽业使用的最常见而且重要的四种疫苗，即红色鉴定轻型毒株或者在 以色列也称之为Komarov“小鸡”株的新城疫疫苗；黄色鉴定Komarov-Haifa 或“小母鸡”株的新城疫疫苗；蓝色鉴定喉气管炎疫苗；绿色鉴定禽痘疫苗。
如在以色列专利N0.46189中公开的，尝试了这些染料的不同浓度， 并且在将其分散于最后的容器之前和在其被干燥(冻干)之前直接与湿疫苗 混合。进行几轮试验来确定这些染料对疫苗无害。
将不同批的染色疫苗置于冷却贮存条件下，并且另外反复滴定来确 认病毒浓度。和染色疫苗的每一项试验平行进行没有加入染料死亡疫苗 的冷却对照试验。也直接对活禽测试了染色疫苗来看一看它们可能具有 什么作用。用这些实验中使用的所有四种类型的疫苗和四种染料反复试 验表明对病毒滴定结果没有有害的影响。对活禽的注射试验，以及通过 其它途径施用病毒疫苗，例如通过饮用水；通过透皮贴的方法(禽痘)；和通 过排脓口刷方法(对于喉气管炎疫苗)，证明了该染料对禽没有有害影响， 并且当肌内注射时，其被从组织再吸收并且在36小时之内完全消失。以 色列专利No.46189公开了对几种禽畜野外测试的疫苗，用这些染色的疫 苗对出生第一天和到市场出售年龄的禽畜接种。这些禽被成功出售，并 且没有无论何种染色问题的证据。
与从中截取的下面的实施例中的描述相关容易理解以色列专利 No.46189公开的本发明的进一步描述，选择这些实施例只是为了详细说 明的目的，只是为了使本领域技术人员使用疫苗的颜色代码配方，而不 是限制本发明。
实施例A
为了与Vineland新城疫“小鸡”疫苗组合，通过制备浓缩-染料-溶液， 制备苋菜红染料。该浓缩物含有145克溶解于4升蒸馏水的干燥粉末染 料。在制备后不久将浓缩的染料溶液在20帕斯卡下热压处20分钟并 且密封保存于玻璃瓶中，置于暗处。以1.33％向最终Vineland新城疫小 鸡疫苗加入染料-浓缩溶液。
与没有染色的对照物相比用染色疫苗滴定的结果发现如下：
冻干后2星期滴定：
没有染料    109.0EID50/ml
有染料      109.3EID50/ml
加速滴定：
没有染料    109.1EID50/ml
有染料      109.3EID50/ml
冻干后30天滴定：
没有染料    109.16EID50/ml
有染料      109.3EID50/ml
冻干后3个月滴定：
没有染料    108.86EID50/ml
有染料      109.3EID50/ml
冻干后6个月滴定：
只有有染料的样品    109.16EID50/ml
实施例B
为了与Vineland新城疫“小母鸡”毒株疫苗(中等毒力Haifa-Komarov 株)组合，通过制备浓缩-染料-溶液，制备酒石黄染料。该浓缩物含有200 克溶解于3升蒸馏水的干燥粉末染料。在制备后不久将浓缩的染料溶液 在20帕斯卡下热压处理20分钟，并且密封保存于玻璃瓶中，置于暗处。 以3％向最终Vineland新城疫小母鸡疫苗加入染料-浓缩溶液。
与没有染色的对照物相比，用染色疫苗滴定的结果发现如下：
规则疫苗滴定的结果：
每毫升109.4EID50
有染料的滴定样品的结果：108.8
37℃孵育7天后滴定：
没有染料    108.3EID50/ml
有染料      108.8EID50/ml
冻干后39天滴定：
没有染料    108.66EID50/ml
有染料      108.9EID50/ml
冻干后93天滴定：
没有染料    108.66EID50/ml
有染料      108.66EID50/ml
冻干后7个半月滴定：
没有染料    108.53EID50/ml
有染料      108.76EID50/ml
实施例C
为了与Vineland-注射喉气管炎疫苗组合，通过制备浓缩-染料-溶液， 制备靛蓝胭脂红蓝染料。
该浓缩物含有200克溶解于3升蒸馏水的干燥粉末染料。在制备后 不久将浓缩的染料溶液在20帕斯卡下热压处20分钟，并且密封保存 于玻璃瓶中，置于暗处。以3％向最终Vineland注射喉气管炎疫苗加入染 料-浓缩溶液。
与没有染色的对照物相比用染色疫苗滴定的结果发现如下：
冻干后3星期滴定：
没有染料    106.3EID50/ml
有染料      106.16EID50/ml
加速滴定：
没有染料    105.0EID50/ml
有染料      104.8EID50/ml
冻干后30天滴定：
没有染料    106.0EID50/ml
有染料      105.8EID50/ml
冻干后3个月滴定：
没有染料    105.66EID50/ml
有染料      105.5EID50/ml
冻干后7个月滴定：
没有染料    105.5EID50/ml
有染料      105.6EID50/ml
(染色和没有染色样品的滴度多少是不寻常的滴定，并且加速滴定这 批加速1log滴以上指示该批可能的高湿润内含物)。
实施例D
通过将靛蓝胭脂红与酒石黄混合获得绿色色光代码“P”(对于痘)并 且用于与Vineland禽痘疫苗组合。将100克粉末染料混合物溶解于3升 蒸馏水。
应用与实施例2和3相同的程序，并且以3％向最终禽痘疫苗加入该 溶液。
与没有染色的对照物相比，用染色疫苗滴定的结果发现如下：
冻干后7天滴定：
没有染色的对照物  105.5EID50/ml
有染料的疫苗      105.5EID50/ml
3个月后：
没有染色的对照物  105.4EID50/ml
有染料的疫苗      105.5EID50/ml
6个月后：
没有染色的对照物  105.35EID50/ml
有染料的疫苗      105.4EID50/ml
制备后9个月：
没有染色的对照物  103.1EID50/ml
有染料的疫苗      105.3EID50/ml
上面描述只是为了教导本领域技术人员怎样实施本发明，而不是要 详述所有的明显的其修饰和改变，对于技术人员来说通过阅读本说明书， 这些其修饰和改变变得显而易见。不管怎样，所有这些明显的修饰和改 变包括在下面权利要求书定义的本发明的范围内。
本申请是1999年8月24日申请的美国临时申请60/150514的继续 申请并且要求了该申请的优先权。上述确定申请的内容引入本申请作为 参考。
本申请自始至终，由作者和引用确定各种参考。这些公开物全文公 开内容在本申请中引作参考以更完整描述本发明所属领域背景。