本发明的领域

本发明涉及疫苗领域。

背景技术的描述

人类，家畜和宠物常被接种疫苗以防止疾病或降低疾病的严重 性。接种导致产生抗体，抗体是能与疫苗中所用的抗原物质特异性结 合的血清蛋白质。这种体液应答涉及选择特异性B淋巴细胞系，以及 增殖和分化所选的细胞以产生产抗体血浆细胞的克隆。

免疫接种后几周内抗体生产达到峰值，然后逐渐下降。由于血清 蛋白质的恒量周转，该抗体生产的下降伴随着抗体循环水平的相应下 降。然而，如果患者再次受到相同抗原的攻击，将会启动比第一次更 迅速和更强烈的新应答曲线。这称为二级，加强或回忆应答，且在健 康的患者中产生比第一次接触抗原，或初次接种更高水平的亲和力更 大的抗体。这种抗体合成速率的增加是产抗体的血浆细胞数增加的结 果。这些细胞在含有大多数小淋巴细胞的未接种患者的淋巴结中是稀 少的。然而，在健康的患者中，初次接种后血浆细胞占到总淋巴结细 胞的3％，二次接种后多达淋巴结细胞的30％。

据说二级应答是由于免疫记忆所致。即，健康机体能“记住”其 以前与该抗原的接触，并在其第二次接触时能更迅速和有效地应答， 即使此时血清中特异性抗体的量下降到极低的水平。

某些情况，例如衰老，营养不良，药物成瘾，醇中毒，和某些疾 病状态，例如糖尿病和艾滋病，引起免疫缺陷，其中许多免疫应答受 抑制和接种效力下降。因此在本领域中需要改进接种技术，特别是针 对老年或其它免疫缺陷群体。

本发明概述

根据本发明，一种接种方法使用了药用组合物以增强疫苗效力。 该药用组合物包含一种能在免疫缺陷动物中刺激抗对该动物为异源 的致病因子的抗体生产的免疫应答触发疫苗。该药用组合物进一步包 括疫苗增效量的神经生长因子(NGF)，它可增强在该动物对该疫苗 应答中的所述抗体的产生和亲和性。疫苗和NGF可单独和一起施用。 在优选的方法中，接种方法包括给免疫缺陷动物施用第一剂能在所述 动物中刺激抗对该动物为异源的致病因子的抗体生产的免疫应答触 发疫苗；然后，在施用所述第一剂大约1周至大约2月的时间期间内 给所述的动物施用：1)疫苗增效量的神经生长因子(NGF)，它在所 述的动物中对所述的疫苗的应答中增强所述抗体的生产，或者2)加强 剂量的所述疫苗以及疫苗增效量的所述神经生长因子(NGF)，以便 增强所述疫苗在所述动物中的效力。

附图的简要描述：

图1是显示与对照相比，根据本发明处理的成年小鼠中抗体生产 的图示。

图2是显示与对照相比，利用本发明在老年小鼠中增强抗体生产 的图示。

图3是显示在幼年和老年小鼠中抗体生产的图示。

图4是显示与对照相比，免疫接种3个月后，根据本发明在老年 小鼠中增强抗体生产的图示。

优选实施方案的详细描述：

本发明意外地发现了神经生长因子不仅在神经系统发育中起作 用，而且在免疫系统生理学中具有重要作用。记忆B细胞是保留机体 遇到给定化学结构(抗原)之痕迹(记忆)的淋巴细胞，它产生并分 泌NGF，通过细胞表面受体与之结合，并与其生物学信息反应(由相 同细胞产生并反应的自分泌环路)，该细胞可存活许多年，或者甚至 在机体的整个生命历程中存活，它与具有较短寿命的其它淋巴细胞存 在差异。

尽管还没有任何特定的理论来解释，但据信除了NGF在维持记 忆B细胞存活中的活性外，NGF可能也影响其产生，对其前体起正 调作用。记忆细胞可能由祖先细胞随机获得产NGF的能力而产生， 否则，祖先细胞将经过细胞程序死亡(自杀)而走向死亡，这种产 NGF的能力将产生自分泌环维持的分化直至成熟记忆细胞阶段，然 后，成熟的记忆细胞得以存活。因此，给动物施用外源性NGF产生 更高数目的记忆细胞。更大的记忆细胞库给个体提供了针对抗原的更 强和更持久的保护。这种改进在免疫缺陷情况，例如，衰老，其中许 多免疫应答受到抑制的情况下更明显。经过增加记忆B细胞的数目， NGF提高了免疫系统识别极低浓度的抗原的能力，因为表面抗体在记 忆B细胞上具有更高的亲和力。

本发明适用于能在免疫应答中形成抗体的动物，例如，包括人类 的哺乳动物，，家畜和宠物，以及鸟类，如家禽。

随着人的衰老，其免疫应答也下降，免疫接种效力由于普遍的低 亲和力抗体反应而减小。因此，本发明特别适用于45岁以上，特别 是50岁和以上的人使用。

本发明也适用于由于施用诸如环孢菌素的抗排斥药品而具有免 疫缺陷的移植病人。

据信本发明也适用于任何已知的疫苗，其例子包括流感疫苗，流 感嗜血杆菌疫苗，甲肝病毒疫苗，乙肝病毒疫苗，丙肝病毒疫苗，结 核疫苗，带状泡疹病毒疫苗，巨细胞病毒疫苗，肺炎球菌性肺炎疫苗， 脑膜炎球菌性脑膜炎疫苗，白喉疫苗，破伤风疫苗，狂犬病疫苗，幽 门螺杆菌疫苗，脊髓灰质炎疫苗和天花疫苗。

还相信本发明可适用于任何未来的疫苗，例如可开发用于接种抗 艾滋病病毒的疫苗。

一般来说，以在大约1×10-9g到大约1×10-3g的范围内，更典型的 是在大约1×10-8g到大约1×10-4g的范围内的量施用疫苗。

疫苗增效量的NGF一般以在大约0.001-100mg/kg受试者体重的 范围内的量，优选以大约0.1-10mg/kg的量，更优选大约0.3-3mg/kg 的量施用。

根据本发明的一个方面，NGF可在施用疫苗之前和/或同时施 用。

当与第二次(加强)接种剂量相联施用时，本发明特别有效。第 二次或加强接种剂量一般在施用第一次(初次)疫苗剂量后大约1周 至大约2月的时间期限内施用，优选在第一次疫苗剂量大约10-45 天内施用，更优选在施用第一次疫苗剂量大约10-30天内施用，根 据一些实施方案在施用第一次疫苗剂量大约10-20天内施用。

根据一个实施方案，在施用第二次(加强)疫苗剂量前几天给受 试者施用一剂NGF，更优选的是在施用第二次(加强)疫苗剂量前3 -4天施用。在特别优选的实施方案中，NGF也可与施用第二次(加 强)疫苗剂量时同时施用。

NGF和疫苗的施用可经过任何合适的方式进行，例如，注射，输 注或口服。在特别优选的实施方案中，经注射用药。

根据一个实施方案，可经过给受试者导入包括携带编码NGF之 基因的载体的成肌细胞。根据该实施方案，受试者中的成肌细胞产生 NGF以增强免疫系统效力。

当疫苗和NGF同时施用时，它们可作为包括疫苗和NGF的单个 组合物提供。

包括疫苗和/或NGF的组合物也可包括一种或多种药用上可接受 的载体和任选其它的治疗成分。适用于注射或输注的配制品包括含水 或不含水的无菌注射溶液，它可任选含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂 和导致配制品与目的受试者血液等渗的溶质，以及可包括悬浮剂和增 稠剂的含水和无水无菌悬液。该配制品可存在于单位剂量或多剂量的 容器内，例如，密封的安培和小瓶，且可以冷冻干燥(冻干)状态贮 存，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如注射水。

优选使用的NGF与受试者匹配，例如，人NGF优选用于人受试 者。本发明适用于天然的(即，天然存在的)NGF，以及相应于天然 NGF，具有天然NGF的氨基酸序列的合成NGF和重组NGF，基本上 与其相似的生物学活性氨基酸序列，或其缩短的序列形式，和具有取 代，缺失，延长，置换或其它修饰的序列且具有基本上相似于NGF 的生物活性的其生物学活性类似物。

本发明以实施例1作进一步的说明，它并不用于限制本发明。

实施例  1

给两组10只老年(＞5月龄)C57/BL6雌性小鼠经每只小鼠腹膜 内注射悬浮于0.1ml完全Freund氏佐剂中的在0.1ml磷酸盐缓冲溶液 (PBS)中的0.1mg(4-羟基-5-碘-3-硝基-酚)乙酰-牛血清白蛋白 (NIP-BSA)(Reth等，1978)进行免疫。21天后，在一组动物中给 每只动物注射50μg按上述从下颌下唾液腺纯化的小鼠神经生长因子 (NGF)，而另一组动物用相同量的预先加热(72℃20分钟)灭活的 纯化NGF处理。再过4天后，两组动物接受上述相同的NGF处理， 并用在不完全Freund氏佐剂中的0.1mgNIP-BSA加强注射所有小鼠。 4天后，经眼眶后神经丛吸血从每只动物获取大约0.4ml血液，并经 过向血清样品中加入BSA中和抗-BAS抗体。然后在ELISA中测定 NIP-特异性IgG滴度。在用含1％BSA的PBS饱和并用含0.05％(v/v) Tween-20的PBS漂洗后用NIP-BSA(35μg/ml溶于PBS中)覆盖平 板，将覆盖的孔与系列稀释的小鼠血清37℃温育1小时；免疫前小鼠 血清的合并液用作阴性对照。经过加入碱性磷酸酶偶连的羊抗小鼠 IgG检测结合的Ig。经过与NPP(Sigma)底物溶液温育观察最终反 应，记录405nm下的吸光值。结果在下面表A和图1和2中显示。

表A  小鼠血清中的NIP-特异性IgG的滴度(Abs405任意单位) 血清稀释   NGF-处理 对照 显著性水平(p) 老年1∶20  179.1±29.3 82.6±18.3 ＜0.05 正常1∶20  159.9±15.8 116.7±17.0 n.s.s. 老年1∶50  146.3±3.0 18.6±6.3 ＜0.001 正常1∶50  153.7±19.2 133.8±11.9 n.s.s. 老年1∶100  97.3±17.5 ＜10 ＜0.0001 正常1∶100  123.8±34.7 148.4±28.6 n.s.s. 老年1∶500  75.5±2.6 ＜10 ＜0.0001 正常1∶500  87.3±7.53 98.2±14.2 n.s.s. 老年1∶1000  80.1±11.2 ＜10 ＜0.0001 正常1∶1000  84.2±12.3 78.4±6.3 n.s.s.

图1和2显示了在老年小鼠中NGF处理显著增加血清NIP-特异 性IgG的滴度，而不影响在幼年小鼠中的反应。

经过使用偶连到葡聚糖上的NIP-BSA作为传感器芯片在 BIAcore机器上分析NGF处理的和对照小鼠产生的特异性IgG对抗原 决定簇(NIP-BSA)的亲和性。这些实验的结果表明IgG对该抗原 的亲和力在老年小鼠中比在幼年小鼠中低得多，显示在记忆细胞成熟 中有缺损。然而在老年小鼠中用NGF处理可恢复高亲和性IgG的生 产，因此，不仅改良了体液免疫应答的数量，而且改进了其质量(未 显示数据)。

为了确定这种简单的NGF施用方案是否能在免疫后长期维持特 异性IgG的高滴度，我们从用NIP-BSA加强注射3个月后的同组老 年免疫的小鼠中获得血液样品。经ELISA测量NIP—特异性IgG的血 清滴度。图4显示了NGF处理的动物组甚至在加强免疫后长期维持 明显的NIP—特异性IgG滴度。

总之，这些结果表明即使在初次反应的末期，当已知记忆B细胞 出现了成熟时，单次施用NGF也可校正老年小鼠中体液免疫应答的 质量和数量。此时NGF处理增加了在老年小鼠中不能由自身产生细 胞因子的记忆B细胞的存活。相反，在正常幼年小鼠中NGF处理无 效，其记忆淋巴细胞能产生足够量的NGF，因此得以存活。而且数据 表明施用NGF可能有助于几乎所有的初级或次级其特征为体液免疫 应答受损的免疫缺陷状态(癌症，艾滋病，慢性炎症等。)

本发明进一步受如下实施例2支持。

实施例2 小结

在人类T和B淋巴细胞和巨噬细胞培养物中测定了神经生长因子 (NGF)的生产。NGF仅由B细胞在组成上生产，该细胞也表达表 面p140trk-A和p75NGFR分子，且因此有效结合和内吞细胞因子。内源性 NGF的中和引起bcl-2蛋白质消失和携带表面IgG或IgA的静息淋巴 细胞(包括记忆细胞的群体)程序性死亡，而表面IgM/IgD“处女(未 接触抗原的)”B淋巴细胞不受影响。体外施用中和抗-NGF抗体引 起用破伤风类毒素，硝基酚或砷酸盐免疫的小鼠中特异性IgG滴度急 剧减少和表面IgG或IgA B淋巴细胞的数目减少。因此，NGF是记忆 B淋巴细胞的自分泌存活因子。 引言

几乎在30年前(Levi-Montalcini，1987；Cohen，1960)作为第一个 介导细胞间通讯的可溶性信号被描述和鉴定的神经生长因子(NGF) 是称为神经营养蛋白的蛋白质家族的一个成员，它对于调节发育和神 经元细胞的存活(Barde，1990)是关键的。其在维持神经元在交感神 经节和感觉神经节中的存活的作用已确定了数十年(Levi-Montalcini 和Angeletti，1966，1968)。在最近几年，这些开始的观察已扩展到中 央神经系统神经元的其它群体，包括前脑基底胆碱能细胞(Johnson 等，1986；Shelton和Reichardt，1986)。据信与其它神经营养蛋白 一样，NGF由佐细胞，例如，神经胶质细胞和少突胶质细胞在神经系 统中产生(Ernfors等，1990，Hofer等，1990)，因此，主要通过形 成旁分泌环路调节神经元的分化过程。

神经营养蛋白，包括NGF，脑产生的神经营养因子(BDNF)， 神经营养蛋白-3(NT-3)和NT4/5通过特异性表面受体在细胞靶 上发挥其效力，其中该受体通过结合和内吞配体触发代表适应性应答 的级联生化事件(参见Barde，1990)。根据对配体的低(Kd1nM)和 高(Kd20pM)亲和力，在靶细胞上可鉴定两类神经营养蛋白结合位 点。最近已鉴定了这些受体的分子特性(Meakin和Shooter，1992)。 称为p75NGFR的75kDa糖蛋白介导与任何神经营养蛋白具有相似亲和 力的低亲和性结合(Chao，1994)。与神经营养蛋白以高特异性方式 相互作用的，属于trk酪氨酸激酶受体家族的蛋白质负责高亲和力结 合。p140trk-A与NGF结合，p140trk-B与BDNF，p140trk-C与NT-3和NT-4/5 结合(Barbacid，1994)。很可能各种类型的受体给靶细胞传递不同的 信号，因为p75NGFR和p140trk-A似乎不形成NGF-结合杂二聚体(Jing 等，1992)。令人感兴趣的是，p75NGFR表现出与肿瘤坏死因子受体I 和II，淋巴细胞表面抗原CD30，CD40，OX40和Fas/Apo-1表面抗原， 涉及防止或介导细胞程序死亡的分子的结构同源性(参见Raffioni 等，1993)。

由于首次描述从小鼠小颚腺细胞纯化NGF，很明显该因子也可由 一些非神经细胞类型产生(Levi-Montalcini，1987)，包括角质细胞(Di Marco等，1993)和平滑肌细胞(Ueyama等，1993)。同样，已报 道了由免疫细胞表达trk原癌基因，例如单核细胞(Ehrard等，1993a) 或T淋巴细胞(Ehrard等，1993b)。因此，相信神经营养蛋白，特 别是NGF可在神经系统外发挥重要作用。

这两方面的证据，加上p75NGFR与一系列表面受体，包括细胞因 子的那些表面受体具有结构同源性，以及在一些自体免疫疾病患者中 观察到的NGF血浆水平升高(Dicou等，1993；Bracci-Laudiero等， 1993；L.B.-L，L.A.，E.G.，和G.Rasi，未公开观察结果)引起对NGF和/ 或其受体是否由免疫系统细胞表达进行研究。本文显示了NGF在基 础条件下由正常人B淋巴细胞合成和释放，该细胞也在组成上表达 p75NGFR和p140trk-A受体链。另外，内源性NGF以自分泌方式发挥功 能以维持具有记忆B细胞表面表型的细胞活性，且其体内中和消除了 次级体液免疫应答。 结果 由正常人免疫活性细胞产生NGF

在测定NGF在各种病理学状态下的血浆水平的研究过程中，我 们注意到在慢性肝脏疾病和其它自体免疫条件的患者中存在特别高 含量的细胞因子。为了测定在免疫活性细胞中哪一种细胞类型负责 NGF生产，将正常外周血或扁桃体单核细胞(MNC)分离成T细胞， B细胞和单核细胞。然后在存在或不存在相关刺激的条件下培养这些 细胞，随后检测NGF合成和分泌的生化证据。只有B淋巴细胞在组 成上产生NGF且其NGF生产受金黄色葡萄糖球菌I Cowan菌株 (SAC)的刺激而增强(a)。免疫印迹表明在含抗-NGF抗体的B 淋巴细胞条件培养基中有一条主要带，但无免疫IgG时没有(数据未 显示)。经代谢标记的B细胞上清的免疫沉淀也显示出一条单一的主 带，该主带在还原条件下具有Mr13kDa，或在非还原条件下具有 M，26kDa，其存在被包含过多未标记的NGF阻断。对B细胞溶胞产 物和上清的动力学研究显示无NGF贮存库(数据未显示)。与B细 胞的这些结果相反，用T淋巴细胞或单核细胞即使在刺激后也未观察 到NGF生产。尽管最近报道了一些T细胞克隆可产生NGF(Ehrard 等，1993b)，但似乎这类细胞很少在正常外周血或扁桃体样品中存 在(根据对来自至少20个不同的供体的细胞群体的分析)，因而把 注意力集中在B细胞生产上。

在密度梯度上分离B淋巴细胞，高-和低-密度馏份分别作为静息 和体内激活的细胞的代表进行研究。两种B细胞群体产生并有效释放 NGF(后者比前者多大约60％，数据未显示)。接着用抗人免疫球蛋 白链恒定区加白细胞介素-4的抗体(抗-μ+IL-4)或用SAC刺激静 息B细胞，两种刺激对B细胞具有活性，前者仅激活表面IgM+细胞， 后者基本上激活所有的B淋巴细胞(Romagnani等，1982)。很明显 抗-μ+IL-4刺激是无效的，而SAC极大地增强NGF的合成和分泌。 经ELISA分析相似培养物的上清证实抗-μ+IL-4刺激的细胞和未刺激 的细胞逐渐降低了NGF生产，而SAC-刺激细胞强烈增加NGF生 产。相对照，两种刺激均有效，其诱导的增殖刺激指数分别为＞10和 ＞20。这些发现表明SAC，而不是抗-μ+IL-4触发导致NGF生产的代 谢途径。另一种可能的解释是正常情况下与抗-μ+IL-4应答的淋巴细 胞，即，大多数未接触抗原的sμ+δ+细胞在sIg交联后不改变NGF生 产(或可能不能生产NGF)，而与SAC应答的淋巴细胞，即也包括 具有sγ+或sα+(sγ+/α+)表型的细胞的群体却改变，这表明在对后一 种细胞类型特异性的功能过程中涉及细胞因子。 由正常人免疫活性细胞表达NGF受体分子

NGF由B淋巴细胞产生的观察结果导致确定是否也存在NGF受 体，使得自分泌反馈环成为可能。为达到该目的，对扁桃体或外周血 T细胞，B细胞和单核细胞表达两种神经系统细胞表现的NGF结合分 子，p140trk-A(trk)和p75NGFR进行了研究。使用特异性抗体进行的细 胞溶胞产物的Western印迹分析表明所研究的每种细胞类型均表达trk 分子；令人感兴趣的是，p75NGFR仅由B细胞生产。而且，经过FACS， 随后用抗p75NGFR链的抗体和用Tmg13.1(最近描述的针对trk分子细 胞外细胞因子结合区的单克隆抗体(Eager，1991))染色研究了相同 的细胞。与免疫化学研究一致，仅在B细胞上观察到两种染色，而T 细胞和单核细胞仅被Tmg13.1染色(数据未显示)。

由B淋巴细胞受刺激表达两种受体链，即神经细胞的典型方式， 表明这些细胞用于应答由细胞因子传递的所有各种信号。因而检查了 B细胞以便获得与NGF在淋巴细胞中的功能相关的数据。

为了证实细胞因子的结合并分析其功能效应，将扁桃体B淋巴细 胞分离成小的和大的细胞，并使用平衡结合试验研究其结合和内吞 NGF的能力。静息和体内激活的B细胞均能有效内吞125I-NGF(数 据未显示)。观察结果是用大型和静息B细胞获得的125I-NGF的饱 和曲线及其Scatchard转化。大型细胞按预期表达两类结合位点，证 实分别为Kd30pM(30000位点/细胞)和Kd1nM(106结合位点/细胞)， 与在神经细胞上报道的数据一致。令人惊奇的是，当在小型静息B细 胞上进行相同分析时，观察不到饱和结合，即使用极高的125I-NGF 浓度培养(数据未显示)，尽管两种受体链明显表达且细胞因子有效 内吞。这一显著的差异表明内源性配体实际上占据受体位点的可能 性，它是当自分泌环路发挥作用时经常遇到的情况(Cozzolino等， 1989；Cozzolino等，1990)。因此，纯化的小型B淋巴细胞用在pH3.0 缓冲的细胞培养基简单处理(4℃60秒)，然后在结合试验前用正规 培养基洗涤。在这些条件下，可检测分别具有90000和106结合位点/ 细胞的高-和低-亲和性(分别为Kd170pM和1nM)受体。为了进一步 证实由于存在自分泌环路这些位点确实被NGF占据的假说，在SDS -PAGE中电泳酸性pH洗脱物(和作为对照的中性pH洗脱物)，印 迹并用特异性抗NGF抗体染色。仅在酸性洗脱物中检测到细胞因子。 总之，这些结果证实了B淋巴细胞表达两类完整功能的NGF受体。 B淋巴细胞中内源性NGF中和的影响

上面表明B细胞产生NGF并表达高-和低-亲和力受体的数据支持 了自分泌环路的假说。为了了解由该环路发挥的作用，中和内源性 NGF并测定其对B淋巴细胞特性的影响。为达到该目的，采用中和 抗NGF抗体或在选择实验中采用NGF反义寡核苷酸。首先使用以抗 -μ+IL-4或SAC刺激的静息外周血或扁桃体B淋巴细胞在常规3H-胸 苷掺入试验中试验抗-NGF抗体。在对照免疫前抗体存在下两种刺激 均诱导强烈应答；在抗-NGF抗体存在下，不影响对抗-μ+IL-4的应答， 而对于SAC减少20-30％(表1)，初步表明NGF涉及对SAC的增 殖应答。然而，加入外源性重组NGF不能增加3H-胸苷掺入(表1)， 即使存在最适度以下剂量的刺激(数据未显示)，进一步表明细胞因 子不能充当生长因子。同样，抗-NGF抗体不能调节体内激活前B细 胞低密度的自发增殖(数据未显示)。这些用抗-μ+IL-4或SAC的刺 激实验又表明不同的细胞群体与促细胞分裂原应答，且它们除了NGF 生产外，可根据NGF利用在功能上进行划分。为了支持这一概念， 经过淘选成sμ+δ+细胞和sγ+及sα+细胞(sγ+/α+)分离静息扁桃体B淋 巴细胞，然后用SAC或抗-μ+IL-4刺激。表1显示了sμ+δ+细胞与SAC 应答的增殖不受中和抗-NGF抗体的影响。与预期一样，sγ+/α+细胞针 对抗-μ+IL-4的增殖极弱(数据未显示)，而这些细胞针对SAC应答 极强；当在抗-NGF抗体存在下进行刺激时，3H-胸苷掺入降低＞80％ (p＜0.0001)。这些发现，结合对NGF生产的实验结果表明细胞因子 对sγ+/α+细胞是关键的且对sμ+δ+细胞明显是非必需的。

这些数据导致进一步研究NGF对静息sμ+δ+细胞和sγ+/α+细胞的 效力。考虑到不能增加B细胞的体外生长(表1)且已知NGF维持 神经元细胞存活的特性(其缺乏时细胞走向程序死亡)，需考虑的是 NGF是否可增强静息sμ+δ+细胞或sγ+/α+细胞的存活。因此，在抗NGF 抗体或NGF反义寡核苷酸存在下培养从扁桃体纯化的上述群体不同 的时间间隔，记录片断化的/完整的DNA的比率，作为走向细胞程序 死亡的细胞百分比的测量值。当分析sμ+δ+细胞时，用抗-NGF试剂 和用对照免疫前IgG(或有义寡核苷酸)处理的细胞均具有相等比率 的细胞走向细胞程序死亡。作为对比，用抗-NGF抗体或寡核苷酸处 理的sγ+/α+细胞培养物在60小时时含有＞60％的细胞程序死亡的细 胞，而对照培养物具有＜20％的细胞程序死亡的细胞(p＜0.0001)；令 人感兴趣的是，细胞程序死亡的动力学比sμ+δ+细胞慢得多，这表明 后一种细胞和sγ+/α+细胞之间在体外生命潜力方面有重要差异。

总之，这组实验证实了内源性NGF是sγ+/α+细胞的自分泌存活因 子，因为其中和触发这些细胞的细胞程序死亡，但对于sγ+/α+细胞并 非如此，表明只有前一种细胞可合成细胞因子。为了试验这一概念， 经ELISA分析纯化群体的NGF生产。很明显sγ+/α+细胞产生比sμ+δ+ 细胞至少多8倍的NGF(409 19PG/107个细胞对51 4pg/107个细胞； n＝9)。

因此，为了确定亚群之间的功能差异是否是由于NGF的利用， 而不是由于其生产，研究了导致细胞程序死亡途径的一个重要决定 子，bcl-2蛋白更新(Korsmeyer，1992)。用抗-NGF或对照抗体培 养纯化的静息sγ+/α+和sμ+δ+群体18小时，然后裂解以分析其细胞内 bcl-2蛋白的含量。内源性NGF的中和引起来自sγ+/α+细胞的bcl-2 蛋白完全消失，但不影响sμ+δ+细胞中的bcl-2蛋白含量，揭示了该亚 群在NGF利用方面的主要差异。 抗-NGF抗体耗尽体内记忆B细胞

由于sμ+δ+表型鉴定为未接触抗原的B细胞，而具有sγ+/α+表型的 细胞包含已进行Ig恒定区类型转换过程的那些淋巴细胞，包括记忆B 淋巴细胞(Kishimoto和Hirano，1989；Sprent，1994)，假定自分泌 NGF用作记忆B细胞的存活因子，决定使用体内研究分析完全确定 的半抗原特异性系统硝基酚-BSA(NP)或Arsonate-KLH(Ars)，或 复合(嵌合)抗原系统破伤风类毒素(TT)来检验这一观点。首先， 证实了在人和鼠B细胞之间，NGF合成(鼠sγ+/α+和sμ+δ+细胞分别 在组成上产生234±21和28±3pg/107个细胞)，NGF受体表达[鼠未裂 解的sIg+细胞每细胞表达≈4800高亲和力(Kd≈135pM)和≈106低亲和 力(Kd≈1.1nM)的结合位点]，和细胞因子对体外细胞存活的功能意 义(sγ+/α+细胞接触中和抗-NGF抗体时产生≈70％的DNA片断)是基 本上相同的。因此，用相关抗原免疫接种20个BALB/c或C57BL/6 小鼠组，40天后一组10个动物接受单一剂量的中和抗-NGF IgG，而 用非免疫IgG作为对照注射其它10只小鼠。再过48小时后，所有动 物接受回忆剂量的各自抗原，4天后处死所有小鼠，经过ELISA测定 抗原特异性IgM和IgG的血浆浓度。接受抗-NGF抗体的动物显著低 于对照的针对免疫原的特异性IgG水平(p＜0.001)。相对比，在抗 原特异性IgM浓度中未观察到区别，表明新形成的未接触抗原的B 淋巴细胞遇到免疫原产生的抗体应答，即次级的(初级)应答不受影 响。为了进一步支持后一结论，用抗-NGF IgG或对照IgG首先处理 另外两组小鼠，然后(48小时后)用TT免疫，一周后处死动物以测 定其TT-特异性IgM血浆水平，在两组群体中无统计学差异(在处理 的动物中0.275±0.032Abs405任意单位而对照为0.284±0.041)(数据 未显示)。

上述发现表明，与体外数据一致，抗-NGF抗体能诱导大多数同 种型转换记忆B细胞的细胞死亡，从而抑制次级体液应答。为了获得 支持该观点的直接证据，用抗-NGF IgG或对照IgG处理两组正常成 年小鼠，三天后分离脾细胞，经细胞荧光光度术测定B细胞亚群体的 比例。与对照相比，处理的小鼠脾脏中sγ+/α+细胞的百分比显著下降， 而sμ+δ+细胞百分比在两组之间观察不到明显的差异。总之，这组实 验表明NGF在体内维持记忆B细胞中发挥作用。 NGF不是B淋巴细胞的转换因子

上述体内NGF中和实验的结果与细胞因子是记忆B淋巴细胞的 自分泌存活因子的假说一致。然而，如果NGF涉及控制IgMIgG类型 转换以及CD40配体的机制(Aruffo等，1993)可观察到相同结果。 然而，如果这样，无论何时在抗-NGF抗体存在下体外诱导淋巴细胞 多克隆群体分化应观察到更高比例的产IgM细胞，以及产IgG-或IgA 细胞的量减少。因此，用商陆促分裂原培养正常人外周血单核细胞10 天以刺激多克隆分化(Kishimoto和Hirano，1989)，且用抗-NGF IgG 或非免疫IgG作为阴性对照，或用可溶性CD40五聚体，即一种遗传 改造的防止CD40-gp39相互作用的分子(Fanslow等，1992)作为阳 性对照。经ELISA进行的Ig测量显示在商陆促分裂原刺激的培养物 中抗-NGF抗体诱导IgG和IgA水平有限下降，但IgM水平比对照培 养物低20％(表2)。相对比，可溶性CD40五聚体与对照相比引起 IgG和IgA分泌的抑制，且IgM分泌率增加(表2)。

这些实验表明在可能负责观察到的改变的机制中存在明显的差 异。事实上，可溶性CD40五聚体引起Ig类型转换表现的抑制，诱导 细胞在转换前(即，s+)区域的“聚集”；相反，抗-NGF抗体仅引起 产IgG-和产IgA细胞急剧减少，它是抗-NGF抗体诱导的各自前体消 失(死亡)的证据。这些数据与上述体内实验的结果一致，其中s+或 s+细胞的减少并不伴随着s+细胞的增加。总之，这些发现有力的表明 NGF不充当正常人或鼠B淋巴细胞的“转换因子”。 讨论

精确辨别大量化学结构并保留这些遭遇的痕迹的能力(特异性和 记忆)是免疫系统的标记。而特异性的分子基础主要通过对T和B淋 巴细胞表达的抗原受体的生化和遗传进行广泛鉴定来限定，对免疫记 忆的了解仍然主要是表象的。特别是仍需要限定象大多数淋巴细胞一 样的单个记忆细胞在静止条件下是具有有限的和受限制的寿命，还是 其为持续多年，可能一生的长生细胞。已提出了一些假说，流行的一 个是抗原在淋巴器官中的长期存留导致维持免疫记忆的免疫细胞连 续，缓慢增殖(Gray，1993)。然而，难以想象抗原如何能保留多年 不被修饰，特别是如果其为蛋白质时(Sprent，1994)。事实上，已 提供了免疫学记忆可被非周期性细胞相当长期保持的证据(Schittek 和Raiewsky，1990)，尽管使其存活的分子机制尚不清楚。本发明的 证据表明记忆B淋巴细胞产生时可遵循Bizzozzero“长期”细胞(其 原型是神经元)的相同命运，因为它们具有产生自分泌存活因子，NGF 的能力。

主要的论据表明细胞因子充当存活因子而不是生长因子，这是基 于这样的观察结果，即经过中和抗-NGF抗体防止NGF受体触发纯化 的sγ+/α+静息B细胞引起经过细胞程序死亡而产生大量细胞死亡。另 外，当用诱导强烈增殖反应的抗-μ抗体+IL-4刺激静息未分离的B细 胞时，不增加其NGF产率，且外源性重组NGF不增加其增殖，也不 受抗-NGF抗体的影响。而且，当SAC用于刺激相同细胞时，分泌的 NGF量增加，但进一步加入外源性细胞因子不能加强3H-胸苷掺入， 即使使用适度以下剂量的刺激。同样，低密度的体内激活前的B细胞 表达更多NGF，但饱和剂量的抗-NGF抗体不能消除B细胞增殖，正 如细胞因子是生长因子时可预期的。总之，这些因素更加表明NGF 是一种存活因子。

这些结论似乎与过去几年显示的淋巴细胞上的NGF具有内在刺 激生长活性的报道相抵触(Otten等，1989；Brodie和Gelfand，1992)。 然而，考虑到根据这些发现，加入外源性NGF可降低某些体外自发 死亡的细胞数[特别是来自IgA-和IgG4-分泌细胞的那些细胞(Kimata 等，1991)]是因为低密度培养条件，最终导致培养物中更高的基础增 殖，可重新解释这些报道。而且，正如IL-3和干细胞因子支持液体 培养物中休眠的非周期淋巴造血祖先细胞长期存活(Katayama等， 1993)的观察结果所显示的，生长和存活因子之间的区别可能纯粹是 命名上的。

B细胞自发产生NGF的发现对NGF“致炎”作用的证据(Aloe 等，1994)提供了进一步的支持，它可能以旁分泌方式有助于炎症细 胞，例如巨噬细胞的功能，该细胞带有与细胞因子反应所必需的受体 机制(Ehrhard等，1993a)，但不能产生该细胞因子(Santambrogio 等，1994)。相似情况适用于T淋巴细胞。在本研究中，没有尝试从 表型或功能观点更精确地鉴定表达NGF受体因而可能与之反应的T 细胞群体或亚群体。然而，B细胞产生的NGF可能在将B细胞抗原 提供给T淋巴细胞的复合事件中发挥重要作用，特别是当需要发生次 级免疫应答时。事实上，sIgG+记忆B细胞表达对抗原具有高亲和力 的受体(Siekevitz等，1987；MacLennan和Gray，1986)，因而当抗 原量有限时在发生的竞争结合中优先。其释放NGF的能力可能对于 适当激活记忆或原初T细胞是必需的。

本研究发现的重点是B淋巴细胞受刺激表达已知结合NGF的两 条链(trk分子和p75NGFR分子)，而这是神经元细胞的典型特征。尽 管NGF是第一个鉴定的细胞因子，但关于其与哪一种受体链相互作 用触发特异性代谢途径仍然所知甚少，在结合单一配体分子中两条链 是否协同作用也不清楚，因为关于这一主题已报道的结果相矛盾(Jing 等，1992；Benedetti等，1993；Huber和Chao，1995)。然而，已显 示当蛋白质未结合时p75NGFR的表达诱导组成上的神经细胞死亡，而 其被NGF或单克隆抗体结合抑制细胞死亡(Rabizadeh等，1993)， 这表明它本身能传递生物学信号，这与p75NGFR和一系列受体链，包 括TNFRI，TNFRII，Fas/Apo-1和CD40之间的结构同源性一致，这 些受体链均涉及诱导或防止靶细胞的细胞程序死亡(参见Raffioni 等，1993)。这些后来的数据完全符合中和自分泌NGF，但未用抗- p75NGFR处理测定B细胞死亡的发现(准备中的原稿)，表明这些受 体链作为作用于存活/死亡分配的信号介导。令人感兴趣的是，尽管 p75NGFR和CD40之间具有结构同源性，但很明显NGF不参与Ig类型 转换过程。

在有些细胞类型中，如角质细胞和黑色素细胞中(Yaar等，1994； Di Marco等，1993)，trk介导有效刺激细胞增殖的信号，与神经元 细胞中出现的情况相反，其中NGF很可能经过磷脂酰肌醇-3激酶激 活防止trk结合后的细胞程序死亡(Yao和Cooper，1995)。这一差 异可这样解释，对于大多数细胞因子受体，通常可能存在可参与与trk 和/或p75NGFR形成多链受体复合物的其它链。后一种假说也可解释在 大型和静息B细胞群体表现的NGF结合亲和力中观察到的有限但明 显的差异(分别为≈30pM与≈170pM)。

根据表面Ig同种型表达分离正常静息B淋巴细胞鉴定了两种功 能上不同的亚群体，即，sμ+δ+未接触抗原的细胞和sγ+/α+记忆细胞 (Kishimoto和Hirano，1989)。我们使用该研究认识到NGF自分泌 环路的作用并观察到一些特征，这些特征导致形成这样一种观点，即 在人类和小鼠中，细胞因子是记忆细胞的内源性存活因子。首先，尽 管未接触抗原的细胞和记忆细胞均基本上表达相同水平的NGF受 体，但后者产生至少比前者多8倍的NGF蛋白质。其次，用中和抗- NGF抗体处理诱导sγ+/α+细胞中的bcl-2蛋白质和同样的大量DNA片 断消失，而对于sμ+δ+细胞则无足轻重。第三，体内施用抗-NGF抗体 抑制了第二抗原特异性免疫应答，但不能影响初级IgM应答。最后， 给正常动物单次注射抗-NGF抗体引起同种型转换的B淋巴细胞百 分数显著降低，该淋巴细胞包括记忆细胞。另一方面，这些发现得出 了至少两个重要结果，即发生NGF基因表达的成熟阶段和NGF与 bcl-2之间的关系。

由sμ+δ+细胞产生较低但可检测的NGF表明在B细胞个体发生期 间相当早期开始，其功能意义需进一步解释。然而，根据对不同B细 胞亚群体数量的定量结果，表明sμ+细胞也包括记忆淋巴细胞，能产 生分泌Ig而不是IgM的细胞(Gray，1993)。如果这样，我们观察 到的sμ+细胞产生的NGF可由后一种细胞产生，在这种情况下，NGF 基因表达可能与操纵Ig类型转换的相同分子机制相联系，且很可能受 其调节。

目前对于NGF受体链与bcl-2相联系的分子途径所知甚少，其 中，bcl-2是在神经元和淋巴细胞，特别是记忆B细胞中调节存活的 关键蛋白质(Batistatoua等，1993；Hawkins和Vaux，1994；Nunez 等，1991)，事实上，该蛋白质从用中和抗-NGF抗体处理的静息 sIgG+或sIgA+细胞中消失。最近，已提供的证据表明可能涉及活性氧 种类，更普遍的是细胞氧化还原潜力的改变(Greenlund等，1995)。 在这一点上，已表明在EBV感染的组成上表达氧化氮合成酶的B淋 巴细胞中低速率的氧化氮产生防止了细胞程序死亡(Mannick等， 1994)，很可能在多种水平上作用于巯基敏感性途径，该途径也调节 bcl-2的代谢，而bcl-2对细胞内氧化还原潜力敏感并参与其维持 (Hockenbery等，1993)。令人感兴趣的是，Mosialos等(1995)最 近显示在转导TNF/Fas/NGF受体家族信号的蛋白质之间存在功能关 系；因为TNF诱导细胞氧化还原平衡的改变(Ishii等，1992)，这 些分子也可参与NGF诱导的适应性应答。我们目前考察了NGF中和 后记忆B细胞中的后一种假说。

一个值得考虑的显著的证据是这样一种观察结果，在淋巴细胞 中，至少细胞程序死亡和细胞存活通过自分泌环路调节，前者涉及 Fas/Apo-1及其配体(Brunner等，1995；Dhein等，1995；Ju等，1995)， 后者涉及NGF(根据我们的数据)。这一安排确保了及时满足指定细 胞进入任一途径所需的分子要求，并帮助了解淋巴器官如何定位，其 中在该位置以有序方式发生复合物的功能改变。自分泌环路是开放式 的(涉及配体的分泌和与细胞外受体的结合，不是隔绝或内部分泌) 的证据有力地表明两个系统的功能受受体拮抗剂或可溶性受体的调 节，产生“社会性”的复杂网络控制单个淋巴细胞的命运。令人感兴 趣的是，后一种复杂性可产生一些使用药物学方法干扰该动力学的机 会。 实验程序 细胞分离和培养

从外周血单核细胞或扁桃体细胞经过E-花结试验分离人T淋巴 细胞。经过附着在塑料平皿上分离单核细胞。使用CD19-覆盖的磁珠 从无-T群体进一步纯化B淋巴细胞。使用抗-CD3ε单克隆抗体 (Boheringer Mannheim，Milano，Italy)经两轮阴性选择从脾脏分离 按上述方法除掉单核细胞的鼠B淋巴细胞。经流式细胞计量术测定群 体的纯度超过95％。用Percoll密度梯度将人和鼠B细胞进一步分成 静息(高密度)和活化(低密度)细胞。按流式细胞计量术测定扁桃 体静息B细胞中dlsIgM+，sIgG+，和sIgA+细胞的比例一般分别是65 ％，25％和10％。

对于增殖试验，在含5％CO2的加湿空气中，在补充了10％v/v 胎牛血清(FCS，Hyclone，Logan，UT)的RPMI1640中以106/ml 的浓度在96-孔平板中培养B细胞72小时。使用1∶10000最终稀释 的加热灭活的金黄色葡萄球菌I Cowan菌株(SAC，Boheringer Mannheim)。使用100U/ml的人rIL-4(R&D，Minneapolis，MN)， 使用1g/ml兔抗人链，使用100ng/mlNGF(Boheringer Mannheim)， 以10μg/ml使用中和性羊抗NGF抗体[R&D，在IMR-32成神经细胞瘤 细胞增殖试验(Janet等，1995)中与100ng/mlNGF反应的 ND50＝10μg/ml]或免疫前的羊IgG。在培养的最后12小时中用0.5Ci 的3H-胸苷脉冲标记细胞并在β-闪烁计数器中计数。

对于免疫球蛋白的生产，在商陆促分裂原(GIBCO)，10g/ml， 抗-NGF抗体(10g/ml)，免疫前的羊IgG(10g/ml)，CD40-或CD4- 上清(1∶10最终稀释度)存在或不存在的条件下，培养人外周血单 核细胞12小时。收集上清并经ELISA试验IgG，IgA，IgM生产。

对于NGF生产的分析，在补充了10％(v/v)Nutridoma(Sigma) 的无血清RPMI-1640中，在SAC(1∶10000最终稀释度)，植物凝 集素(PHA-P，1g/ml，GIBCO)，脂多糖(LPS，10g/ml，Sigma) 存在或不存在的条件下以107/ml培养细胞(2×107)不同的时间，经 过ELISA测定上清。

使用按上述制备的用兔抗-人IgM和兔抗-人IgD(称为 sμ+δ+)，或兔抗人IgG加兔抗人IgA(称为s+/+)，或羊抗小鼠IgM 和IgD或IgG和IgA覆盖的塑料平皿(Wysocki等，1978)经过淘选 程序分离B细胞亚群体。经过使用特异性mAbs的流式细胞计数数测 定分离的群体纯度通常＞90％。为了排除sIg受体触发后激活过程的干 扰，使用互补非附着群体(例如，s-细胞，包含s+/+细胞的大多数细 胞)重复所有实验，经过3轮Ig-覆盖的平板贴壁后回收。 细胞活力测定和DNA的片断化

用10μg/ml抗-NGF IgG或免疫前的IgG，或者用20μM与NGF编 码区的核苷酸54-72互补的18-聚体反义或有意义寡核苷酸 (Primm，Milano，Italy)以5×106/ml培养的人和鼠B细胞亚群体用 5mM Tris，20mM EDTA，和0.5％(v/v)Triton X-100，pH8.0以1∶1.5 稀释，使其在冰上裂解15分钟，之后以27000xg离心20分钟分离完 整的染色质(沉淀)与DNA片断(上清)。沉淀重悬于5ml含有10mM Tris和1mM EDTA pH8.0的缓冲液中，使用二苯胺试剂(1.5％二苯胺 溶于乙酸加10％乙醛)在30℃处理16小时(Burton，1956)测定沉淀 和上清样品中的DNA含量。测定各样品在600nm下的光密度。根据 McConkey等(1989)计算DNA片断化的百分数。经过苔盼蓝染料排 斥试验评价细胞活力。 放射性配体结合研究

为了分析表面NGF受体，用在pH3.0下缓冲的RPMI-1640在冰 上酸处理人静息扁桃体或鼠脾脏B淋巴细胞1分钟并用PBS洗涤。 然后在过量未标记的人rNGF存在或不存在的条件下用不同浓度的 125I-NGF(Amersham，Milano，比活为50Ci/g)以106/ml在4℃培养 酸处理的静息B淋巴细胞和体内活化的大型B淋巴细胞2小时。洗涤 细胞并在γ-计数器中计数结合的放射活性。计算各实验点的特异性结 合且经过科学程序分析数据(图P，Biosoft英国剑桥)。对于放射性 配体内吞，在过量未标记的NGF存在或不存在的条件下用 0.5nM125I-NGF按上述培养细胞，洗涤并在37℃培养2小时，然后用 甘氨酸缓冲液(pH2.8)处理并裂解。经过在γ-计数器中计数测定膜结 合的(酸洗脱物)和与细胞相关联的放射活性。TCA-浓缩来自108个 静息B细胞的中性pH洗涤液和酸性pH洗脱物，印迹到硝酸纤维素 膜上，并用抗-NGF IgG或用免疫前IgG免疫染色以检测受体结合的 内源性配体。 免疫化学分析

对于Western印迹分析，TCA-沉淀2×107个细胞的上清或NP-40 (0.25％溶于PBS)溶胞产物，用乙醇洗涤并在2-巯基乙醇Laemmli 缓冲液中以1∶1稀释。在SDS-PAGE中电泳样品，对硝基纤维素滤膜 印迹并用合适的抗体[羊抗-NGF，兔抗-trk(Genzyme，Boston，MA)， 小鼠抗-p75NGFR(Boheringer Mannheim)，小鼠抗-bcl-2(Santa Cruz Technology，Milano)]或用免疫前Ig免疫染色。使用合适的第二抗体 和ECL检测系统，按厂商(Amersham)的建议观察抗原-抗体复合 物。对于内源性标记和免疫沉淀研究，用无半胱氨酸RPMI-1640 (GIBCO)洗涤细胞3次并在补充了5％透析FCS和200Ci35S-半胱氨 酸(Amersham，比活800Ci/mM)的相同培养基中在5％CO2中37℃ 以107/ml培养4小时。弃去上清，在冷PBS中洗涤细胞并在 0.25％NP-40加1mM PMSF中裂解。在100μg/ml人rNGF存在或不存 在的条件下按所述方法(Cozzolino等，1990)免疫沉淀上清和细胞 溶胞产物。洗涤免疫沉淀，在含有或不含2-巯基乙醇的SDS Laemmli 缓冲液中洗脱，并在用Amplify(Amersham)处理的15％SDS-PAGE 板上电泳，干燥并在-70℃对Hyper膜MP(Amersham)曝光。 小鼠免疫和处理

以40mg半抗原对1g蛋白质的比率(Nisonoff，1967)经过重氮 化对-氨基苯胂酸并偶连到匙孔血蓝蛋白(KLH，Calbiochem)上制备 Ars-KLH。按照Reth等，1978将(4-羟基-5-碘-3-硝基-苯)乙酰(NIP， D.Schilovich，HSR，Milano博士惠赠)偶连到牛血清白蛋白(NIP- BSA)上。两组20只6周龄的雌性Balb/c小鼠用0.1ml TT溶液[15μg/ml (Anatetal，Biocine-Sclavo，Siena，Italy)]在颈部s.c.注射或用Ars- KLH(0.1mg)经i.p.注射，用0.1mg NIP-BSA经i.p.免疫一组20只 C57BL/6小鼠。引发40天后，用羊抗-NGF IgG(500g/小鼠)处理各 组10只小鼠，其它用免疫前羊IgG(500g/小鼠)处理，48小时后用 相同剂量的相关抗原加强注射所有小鼠。第二次免疫4天后，从眼眶 后神经丛抽血。用TT，NIP-BSA或Ars-KLH免疫的其它组的10只 小鼠用于在加强注射前立即测定抗原特异性IgG。

为进行脾细胞的FACS分析，用抗-NGF抗体或羊IgG在72小时 内(0.5mg/小鼠)两次注射处理10只成年BALB/c小鼠组。再过72 小时后，处死小鼠，获得除去单核细胞的脾细胞。使用特异性抗体经 过细胞荧光光度术测定表面IgG+，IgA+，或IgM+脾细胞的百分数。 ELISA

按Soderstrom等(1990)所述进行NGF ELISA。为评价破伤风 类毒素(TT)-特异性IgG或IgM滴度，用501溶于0.1M硼酸盐缓冲 液，pH8.6中的TT(10g/ml)在4℃覆盖平板过夜。为评价NIP或Ars- 特异性IgG或IgM滴度，用NIP-KLH或Ars-BSA(35μg/ml溶于PBS 中)覆盖平板。经过用NIP-BSA或Ars-KLH覆盖平板还评价了针对 免疫复合物的特异性IgG和IgM滴度。用含1％BSA的PBS饱和并 用含0.05％(v/v)Tween20的PBS漂洗后，用系列稀释的小鼠血清在 37℃培养覆盖的孔1小时；免疫前的小鼠血清合并液用作阴性对照。 经过加入碱性磷酸酶连接的羊抗-小鼠IgG或IgM检测结合的Ig。经 过与NPP(Sigma)底物溶液温育观察最终反应并记录405nm处的吸 光度。 表1  抗-NGF抗体对促分裂原诱导的静息B淋巴细胞增殖的影响

                               3H-胸苷掺入(cpm)

                               实验1     实验2     实验3 UF B细胞                           251       240       306 UF B细胞+NGF                       305       312       403 UF B细胞+SAC                       13808     32010     17040 UF B细胞+SAC+抗-NGF                11488     25432     13050 UF B细胞+SAC+羊IgG                 13765     32456     17321 UF B细胞+SAC+NGF                   14056     34021     19028 UF B细胞+IL-4+抗-μ                                  12896     15675     11366 UF B细胞+IL-4+抗-μ+抗-NGF         12798     15254     10987 UF B细胞+IL-4+抗-μ+羊IgG          12913     16070     11654 UF B细胞+IL-4+抗-μ+NGF            13004     16876     12114 纯化的sμ+δ+细胞                384       426       368 纯化的sμ+δ+细胞+SAC+羊IgG      6863      7121      7256 纯化的sμ+δ+细胞+SAC+抗-NGF     6943      6889      7124 纯化的sγ+/α+细胞               279       344       368 纯化的sγ+/α+细胞+SAC+羊IgG     13935     14759     13157 纯化的sγ+/α+细胞+SAC+抗-NGF    2468      3137      2324

培养静息未分级分离的(UF)B淋巴细胞或所示的纯化群体48 小时并用3H-胸苷在最后12小时脉冲标记。数据表示为三份培养物的 平均3H-胸苷掺入。SD常低于10％。以1∶10000的最终稀释度使用 SAC。以10g/ml浓度使用羊抗-NGF抗体或免疫前羊IgG。以100ng/ml 浓度使用重组人NGF。以100U/ml浓度使用IL-4。以1g/ml的浓度使 用多克隆兔抗-抗体。

表2  抗-NGF抗体对PWM-刺激的PBMNC产生Ig的影响

                         Ig(ng/ml)

         IgM          IgG         IgA 仅含培养基   84           30          676 PWM          1028         966         10716 PWM+a-NGF    674          374         1350 PWM+羊IgG    987          995         9234 PWM+CD40μ        1530         554         4794 PWM+CD4μ          928          1024        9865

在PWM(10g/ml)，羊抗-NGF抗体或免疫前羊抗IgG(10g/ml)， CD40或CD4上清(1∶10最终稀释度)存在或不存在的条件下以3×106 个细胞/ml培养人PBMNC 12小时。在培养结束时，收集上清并使用 特异性抗体经过ELISA测量IgA，IgG，IgM。数据表示为三份孔的 平均Ig浓度；SD＜15％。

实施例3

体液免疫中与年龄相联系的变化对抗体应答的质量影响多于对 其数量的影响。抗体应答质量随年龄的改变包括抗体同种型从IgG转 换为IgM和抗体亲和力由高变低。老年人对大多数疫苗的反应受损以 及老年人对感染具有更大的易感性支持了这一观点，即免疫衰老导致 免疫缺陷状态。尽管这些变化大部分归根于T细胞帮助关于外周同种 型和亲和力成熟的B细胞成熟的能力受损，本实施例表明老年动物记 忆B细胞存活能力受损是由于NGF生产受损。在记忆B细胞成熟期 期间施用NGF恢复在用常用半抗原，NIP-BSA免疫的老年小鼠中特 异性，高亲和力的IgG生产。 结果和讨论 在用NIP免疫的老年小鼠中特异性IgG生产被极大地抑制

一组10只老年(＞5月龄)和一组10只幼年(≤8周龄)C57/BL6 雌性小鼠用每只小鼠0.1mg(4-羟基-5-碘-3-硝基-苯)乙酰-牛血清白 蛋白(NIP-BSA)(Reth等，1978)溶于0.1ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)， 重悬于0.1ml完全Freund’s佐剂经i.p.免疫接种。21天后，经眼眶 后神经丛吸血从每只动物获得0.4ml血液，经过向血清样品中加入 BSA中和抗-BSA抗体。然后在ELISA中测定NIP-特异性IgG和IgM 滴度。图3显示了对NIP的特异性IgG反应在老年小鼠中比幼年小鼠 明显受影响，而抗半抗原的特异性IgM反应在两组小鼠中相似。这些 结果表明NIP-特异性高亲和力免疫球蛋白生产中的机制(体细胞高 变，同种型转换)在老年小鼠中存在缺陷。

已报道NGF是记忆B淋巴细胞的自分泌存活因子(Torcia等， 1996)。为了研究老年小鼠有缺陷的免疫应答是否负责缺乏NGF生 产或NGF有效性诱导的记忆B细胞的大量死亡，我们经过淘选技术 从10只老年小鼠的脾脏分离了记忆B细胞(作为sIgD-淋巴细胞)且 来自10只幼年小鼠的细胞作为对照。细胞在37℃培养16小时，收获 上清，经过ELISA技术测定NGF。表3显示了从老年小鼠分离的记 忆B细胞不能产生NGF，而根据报道(Torcia等，1996)，从幼年小 鼠分离的相同群体产生高水平的细胞因子。

表3  老年或幼年小鼠sIgD-脾细胞的NGF生产

             未刺激的NGF生产(pg/ml) 老年小鼠                    ＜9 幼年小鼠                    535.3±43.1

由于NGF生产受损，老年小鼠记忆B细胞的存活曲线与从幼年 小鼠分离的相同群体相比一律更短。