用于经皮肤输送流感疫苗的装置和方法
阅读：446发布：2020-05-24
专利汇可以提供用于经皮肤输送流感疫苗的装置和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且用于经 皮肤 输送免疫活性 试剂 的装置和方法，包括具有微凸出部件(或系统)的输送系统，其包括大量适合于刺穿 角 质层而进入下面的表皮层、或者表皮和真皮层的微凸出(或其阵列)，该微凸出部件具有设置在其上的包括免疫活性试剂的 生物 相容性 涂层。优选地，生物相容性涂层是由 疫苗 涂层制剂形成的。，下面是用于经皮肤输送流感疫苗的装置和方法专利的具体信息内容。
1.用于经皮肤输送免疫活性试剂的系统，包括具有多个刺穿角质 层的微凸出的微凸出部件，在所述微凸出上设置有生物相容的涂层， 其中所述涂层含有所述的免疫活性试剂。
2.权利要求1的系统，其中所述生物相容的涂层是由所述免疫活 性试剂的制剂形成的。
3.权利要求1的系统，其中所述免疫活性试剂包括流感疫苗。
4.权利要求1的系统，其中所述免疫活性试剂选自病毒、细菌、 蛋白质为基础的疫苗、多糖为基础的疫苗以及核酸为基础的疫苗。
5.权利要求1的系统，其中所述免疫活性试剂选自病毒、减毒的 病毒、杀死的病毒、细菌、减毒的细菌、杀死的细菌、蛋白质为基础 的疫苗、多糖为基础的疫苗、核酸为基础的疫苗、蛋白质、多糖缀合 物、寡糖、脂蛋白、百日咳博德特氏菌(重组PT疫苗-非细胞的)、破伤 风梭菌(纯化的、重组的)、白喉棒状杆菌(纯化的、重组的)、巨细胞病 毒(糖蛋白亚基)、A族链球菌(糖蛋白亚基、与破伤风类毒素的复合糖A 族多糖、与毒素亚基载体连接的M蛋白/肽、M蛋白、多价的型特异性 表位、半胱氨酸蛋白酶、C5a肽酶)、乙型肝炎病毒(重组的PreS 1、 Pre-S2、S、重组的核心蛋白)、丙型肝炎病毒(重组表达的表面蛋白和 表位)、人乳头瘤病毒(衣壳蛋白、TA-GN重组蛋白L2和E7[来自 HPV-6]、来自HPV-11的MEDI-501重组VLP L1、四价的重组BLP Ll [来自HPV-6]、HPV-11、HPV-16和HPV-18、LAMP-E7[来自HPV- 16])、肺炎军团菌(纯化的细菌表面蛋白)、脑膜炎奈瑟氏球菌(与破伤风 类毒素的复合糖)、绿脓杆菌(合成肽)、风疹病毒(合成肽)、肺炎链球菌 (缀合到脑膜炎球菌B OMP的复合糖[1，4，5，6B，9N，14，18C，19V， 23F]、缀合到CRM197的复合糖[4，6B，9V，14，18C，19F，23F]、缀合到 CRM1970的复合糖[1，4，5，6B，9V，14，18C，19F，23F]、梅毒密螺旋体(表 面脂蛋白)、水痘带状疱疹病毒(亚基、糖蛋白)、霍乱弧菌(缀合的脂多 糖)、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、风 疹病毒、水痘带状疱疹病毒、百日咳博德特氏菌、破伤风梭菌、白喉 棒状杆菌、A族链球菌、肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、绿脓杆菌、 肺炎链球菌、梅毒密螺旋体、霍乱弧菌、流感疫苗、莱姆病疫苗、狂 犬病疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、水痘疫苗、天花疫苗、肝炎疫苗、 百日咳疫苗、白喉疫苗、核酸、单链核酸、双链核酸、超螺旋质粒DNA、 线性质粒DNA、粘粒、细菌人工染色体(BACs)、酵母人工染色体 (YACs)、哺乳动物人工染色体、RNA分子以及mRNA。
6.权利要求1的系统，其中所述制剂进一步包括免疫应答增强佐 剂，选自磷酸铝凝胶，氢氧化铝，α-葡聚糖，β-葡聚糖，霍乱毒素B 亚基，CRL1005，具有平均值x＝8和y＝205的ABA嵌段共聚物，γ菊 粉，线性的(无支链的)β-D(2-＞1)多聚呋喃果糖氧基-α-D-葡萄糖， Gerbu佐剂，N-乙酰葡糖胺-(β 1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰 胺(GMDP)，二甲基双十八烷基氯化铵(DDA)，L-脯氨酸锌盐复 合物(Zn-Pro-8)，咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4- 胺，ImmTherTM，N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L- Ala-甘油二棕榈酸酯，MTP-PE脂质体，C59H108N6O19PNa-3H2O (MTP)，Murametide，Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3，Pleuran，QS-21； S-28463，4-氨基-a，a-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇，scalvo肽， VQGEESNDK·HCl(IL-1β163-171肽)，苏氨酰- MDP(TermurtideTM)，N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺，白介素 18(IL-18)、IL-2 IL-12，IL-15，IL-4，IL10，DNA寡核苷酸，含有 CpG的寡核苷酸，γ-干扰素以及NFκB调节信号蛋白质。
7.权利要求1的系统，其中所述微凸出部件具有至少大约100个 微凸出/cm2的微凸出密度。
8.权利要求7的系统，其中所述微凸出部件具有大约200-3000个 微凸出/cm2范围的微凸出密度。
9.权利要求1的系统，其中每个所述微凸出具有大约50-145微米 范围的长度。
10.权利要求9的系统，其中每个所述微凸出具有大约70-140微 米范围的长度。
11.权利要求1的系统，其中所述生物相容涂层具有大约2-50微 米范围的厚度。
12.权利要求2的系统，其中所述制剂包括水性制剂。
13.权利要求2的系统，其中所述涂层制剂包括表面活性剂。
14.权利要求13的系统，其中所述表面活性剂选自sodium lauroamphoacetate，十二烷基硫酸钠(SDS)，氯化十六烷基吡啶 (CPC)，十二烷基三甲基氯化铵(TMAC)，烷基苄基二甲基氯化 铵，聚山梨酸酯，山梨聚糖衍生物，山梨醇月桂酸酯，烷氧基化醇， 以及月桂基聚氧乙烯(4)醚。
15.权利要求2的系统，其中所述涂层制剂包括两亲性的聚合物。
16.权利要求15的系统，其中所述两亲性的聚合物选自纤维素衍 生物，羟乙基纤维素(HEC)，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙 基纤维素(HPC)，甲基纤维素(MC)，羟乙基甲基纤维素(HEMC)， 乙基羟基乙基纤维素(EHEC)，以及pluronics。
17.权利要求2的系统，其中所述涂层制剂包括亲水性的聚合物。
18.权利要求17的系统，其中所述亲水性的聚合物选自聚(乙烯 醇)，聚(环氧乙烷)，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)，聚(n-乙烯吡 咯烷酮)，聚乙二醇以及它们的混合物。
19.权利要求2的系统，其中所述涂层制剂包括生物相容载体。
20.权利要求19的系统，其中所述生物相容聚合物选自人白蛋 白、生物工程化的人白蛋白、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚组氨酸、戊 聚糖多硫酸酯、聚氨基酸、蔗糖、海藻糖、松三糖、棉子糖和水苏糖。
21.权利要求2的系统，其中所述涂层制剂包括稳定剂，该稳定剂 选自非还原糖、多糖、还原糖或者DNA酶抑制剂。
22.权利要求2的系统，其中所述涂层制剂包括血管收缩剂。
23.权利要求22的系统，其中所述血管收缩剂选自肾上腺素、萘 唑啉、四氢唑啉、茚唑啉、美替唑啉、曲马唑啉、泰马唑啉、羟甲唑 啉、丁苄唑啉、阿米福林、咖啡氨醇、环喷他明、脱氧肾上腺素、肾 上腺素、苯赖加压素、茚唑啉、美替唑啉、米多君、萘唑啉、盐酸可 巴君、二甲己胺、鸟氨加压素、羟甲唑啉、苯肾上腺素、苯基乙醇胺、 苯基丙醇胺、六氢脱氧麻黄碱、伪麻黄碱、四氢唑啉、曲马唑啉、异 庚胺、泰马唑啉、血管加压素以及丁苄唑啉。
24.权利要求22的系统，其中所述涂层制剂包括通道开放调节 剂。
25.权利要求24的系统，其中所述通道开放调节剂选自渗透压调 节剂、氯化钠、两性离子化合物、氨基酸、抗炎试剂、倍他米松21- 磷酸二钠盐、去炎舒松21-磷酸二钠、盐酸氢可松氨酯、氢化可的松21- 磷酸二钠盐、甲基强的松龙21-磷酸二钠盐、甲基强的松龙21-琥珀酸 钠盐、帕拉米松磷酸二钠盐、强的松龙21-琥珀酸钠盐、抗凝血剂、柠 檬酸、柠檬酸盐、柠檬酸钠、糊精硫酸钠以及EDTA。
26.权利要求2的系统，其中所述涂层制剂具有小于大约5泊以及 大于大约0.3-2.0泊的粘度。
27.经皮肤输送免疫活性试剂给受试者的方法，该方法包括步骤：
提供具有多个微凸出的微凸出部件；
提供粗疫苗；
将所述粗疫苗进行切向流过滤来提供疫苗溶液；
加入至少一种赋形剂到所述疫苗溶液中；
冷冻干燥所述疫苗溶液以形成疫苗产品；
用第一溶液将所述疫苗产品重构以形成疫苗涂层制剂；
用所述疫苗涂层制剂涂覆所述微凸出部件；以及
将所述涂覆的微凸出部件应用到所述受试者的皮肤上。
28.权利要求27的方法，其中加入至少一种赋形剂到所述疫苗溶 液中的步骤包括加入选自蔗糖、海藻糖和甘露糖醇的赋形剂。
29.权利要求27的方法，其中提供粗疫苗的步骤包括提供流感疫 苗。
30.权利要求29的方法，其中所述流感疫苗包括血凝素。
31.权利要求30的方法，进一步包括输送大约45μg血凝素的步 骤
32.权利要求31的方法，其中输送血凝素的步骤包括将至少大约 70％的所述血凝素输送到受试者表皮的富含APC的层。
33.配制疫苗溶液的方法，包括步骤：
提供粗疫苗；
将所述粗疫苗进行切向流过滤来提供疫苗溶液；
加入至少一种赋形剂到所述疫苗溶液中；以及
冷冻干燥所述疫苗溶液以形成疫苗产品。
34.权利要求33的方法，其中所述疫苗产品显示出比所述粗疫苗 至少浓大约500倍的浓度。
35.权利要求33的方法，其中所述疫苗产品保持室温稳定性至少 大约六个月。
36.权利要求33的方法，其中提供粗疫苗的步骤包括提供流感疫 苗。
37.权利要求36的方法，其中所述流感疫苗包括血凝素。
本发明的领域
本发明一般地涉及经皮肤的试剂输送系统和方法。更特别地，发 明涉及用于经皮肤输送流感疫苗的装置、方法和制剂。
发明背景
活性试剂(或者药物)最常规地是通过口服或者注射而施用的。 不幸地，许多活性试剂在口服施用的时候完全无效或者具有根本上降 低了的功效，因为它们要么不被吸收要么在进入血流之前受到不利影 响，因而不会具有期望的活性。另一方面，在施用过程中在确保不改 变试剂的同时，直接注射试剂到血流中是困难的、不便的、痛苦的和 不舒服的过程，这有时候会导致受试者的不配合。
因此，原则上来说，经皮肤的输送提供了施用活性试剂的方法， 否则就将需要通过皮下注射或静脉注射来输送。如这里使用的单词“经 皮肤”是一般术语，是指通过皮肤将活性试剂(例如诸如药物的治疗 剂或者诸如疫苗的免疫活性试剂)输送到局部组织或全身循环系统， 它基本上不会切割或穿透皮肤，诸如用外科手术刀切割或者用皮下注 射针刺穿皮肤。经皮肤的试剂输送包括通过被动扩散的输送以及基于 外部能源，诸如电(例如离子电渗疗法)和超声波(例如超声透入疗 法)的输送。
如本领域所公知的，皮肤不仅是保护身体免受外部危害的物理屏 障，也是免疫系统的组成部分。皮肤的免疫功能源自用先天性和获得 性免疫功能的存活表皮和真皮的固有细胞和体液组分的集合，总称为 皮肤免疫系统。
皮肤免疫系统的一种最重要的组分是朗氏细胞(LC)，它是在存 活表皮中发现的特化的抗原呈递细胞。LC细胞由于它们在周围细胞之 间的树突的广泛分枝而形成了半连续的网络。LC细胞的正常功能是检 测、捕获并呈递抗原以引起对侵入病原体的免疫应答。LC细胞执行它 的功能是通过内化上表皮抗原、输送到区域性皮肤引流淋巴结并将加 工过的抗原呈递给T细胞。
皮肤免疫系统的有效性对已经靶向到皮肤的接种策略的成功和安 全性负责。用活的减毒天花疫苗经划破皮肤接种，已经成功地导致了 致死性天花疾病在全球的灭绝。使用1/5到1/10的标准IM剂量的不同 疫苗的皮内注射已经用许多疫苗有效地诱导了免疫应答，而低剂量的 狂犬病疫苗已经得到商业许可用于皮内应用。
作为备选，经皮肤输送提供了施用生物活性试剂特别是疫苗的方 法，否则就将需要通过皮下注射、静脉内注射或口服输送。经皮肤的 疫苗输送在这两个方面都提供了改进。当与口服输送比较，经皮肤输 送避免了消化道的苛刻环境，绕过了胃肠道的药物代谢，减少了首过 效应，并且避免了由于消化和肝脏酶而可能导致的失活。相反，疫苗 在经皮肤施用过程中不须经过消化道。
更为普通的被动性经皮肤的试剂输送典型地包括含有高浓度活性 试剂的药物储存器。该药物储存器适合于接触皮肤，它使得试剂能够 扩散通过皮肤并进入受试者的身体组织或血流。
增加被动性经皮肤扩散的试剂流量的一种普通方法涉及用皮肤渗 透增强剂预处理皮肤或者与试剂共输送。当应用到试剂输送所通过的 身体表面上时，渗透增强剂增强了试剂通过的流量。然而，由于蛋白 质的大小，这些方法中在增强经皮肤的蛋白质流量方面的效力已经被 限制了，至少对于较大的蛋白质来说是这样的。
为了增强经皮肤输送的试剂的量，也已经有许多技术和系统被开 发来机械地穿透或破坏最外面的皮肤层，从而形成了进入皮肤的通 道。被称为划痕器的早期接种设备一般包括许多尖头或针，它们被应 用到皮肤上并在应用区域划破或制造小的切口。将疫苗应用到局部皮 肤上，诸如美国专利No.5,487,726中披露的，或者作为湿液体应用到 划痕器的尖头上，诸如美国专利No.4,453,926、4,109,655和3,136,314 中披露的。
划痕器已经被建议用于皮肤内的疫苗输送，部分地是因为只需要 少量疫苗输送到皮肤中来有效免疫受试者。进一步地，所输送疫苗的 量并不是特别关键的，因为过量也会达到令人满意的免疫。
然而，在使用划痕器输送活性试剂诸如疫苗中的严重缺点就是确 定经皮肤的试剂流量和最后得到的输送剂量的困难。而同样，由于皮 肤偏转并对抗穿刺的弹性、变形和反弹性质，微小穿刺元件经常不会 均匀地穿透皮肤皮肤和/或皮肤刚刺穿就擦去了试剂的液体涂层。
此外，由于皮肤的自修复过程，在皮肤中形成的刺孔或狭缝在从 角质层去除穿刺元件后易于愈合。这样，皮肤的弹性性质就起作用， 去除在这些微小元件穿透到皮肤中时就已经应用到微小穿刺元件上的 活性试剂液体涂层。而且，由穿刺元件形成的微小狭缝在去除设备后 会迅速愈合，这样就限制了液体试剂溶液通过穿刺元件所形成的通 道，而限制了这些设备的经皮肤的流量。
采用微小皮肤穿刺元件来增强经皮肤的试剂输送的其它系统和装 置披露于美国专利No.5,879,326、3,814,097、5,250,023、3,964,482、重 授权专利No.25,637以及PCT公开No.WO 96/37155、WO 96/37256、 WO 96/17648、WO 97/03718、WO 98/11937、WO 98/00193、WO 97/48440、WO 97/48441、WO 97/48442、WO 98/00193、WO 99/64580、 WO 98/28037、WO 98/29298和WO 98/29365；所有这些都以它们的整 体引入这里作为参考。
所披露的系统和装置采用各种形状和大小的穿刺元件来刺穿皮肤 的最外层(即角质层)。这些参考文献中披露的穿刺元件通常从薄的、 扁平的部件诸如垫板或薄板上垂直延伸。这些设备中的一些穿刺元件 非常小，一些元件具有仅仅大约25-400微米的微凸出长度以及大约5- 50微米的微凸出厚度。这些微小穿刺/切割元件在角质层中产生了相对 小的微小狭缝/微小切口来增强经皮肤的试剂输送。
所披露的系统典型地进一步包括容纳试剂的储存器，还有将试剂 从储存器转移通过角质层的输送系统，诸如通过设备自身的中空尖 头。这种设备的一个例子披露于WO 93/17754，其具有液体试剂储存 器。然而，必须将储存器加压以迫使液体试剂通过微小的管状元件并 进入皮肤中。这种设备的缺点包括增加可压缩液体储存器而增加的复 杂性和费用，以及由于压力驱动的输送系统的存在而带来的复杂性。
如美国专利申请No.10/045,842中所披露的，将要输送的活性试剂 涂覆在微凸出上而不是包含在物理储存器中也是可能的，该申请在这 里整体引入作为参考。这就消除了分开的物理储存器以及开发储存器 特异性的试剂制剂或组合物的必要性。
然而，涂覆的微凸出系统的缺点是，所输送的活性试剂特别是免 疫活性试剂的最大量是有限的，因为当涂覆厚度增加时微凸出(及其 阵列)穿透角质层的能力降低了。进一步地，为了用其上设置的厚的 涂覆微凸出来有效穿透角质层，必须增加敷贴器的冲击能量，这会引 起冲击时无法忍受的感觉。
因此，能够通过涂覆的微凸出容易地以免疫学(或生物学)有效 量施用而提供高浓度的免疫活性试剂特别是液体流感疫苗将是需要 的。
因此，本发明的一个目的是提供用于经皮肤输送免疫活性试剂的 装置和方法，其基本上降低或消除了与现有技术的免疫活性试剂输送 方法和系统相关的缺点和不足。
本发明的另一个目的是提供用于经皮肤输送流感疫苗的装置和方 法，其包括用生物相容涂层涂覆的微凸出，该涂层上设置有流感疫苗。
本发明的另一个目的是提供用于经皮肤输送流感疫苗的装置和方 法，其包括具有多个微凸出的微凸出部件，其中微凸出是用流感疫苗 涂层制剂涂覆的。
本发明还有另一个目的是提供流感疫苗，它可以通过涂覆的微凸 出系统容易地以免疫学有效量施用。
本发明的另一个目的是提供基本上没有防腐剂的流感疫苗。
本发明还有另一个目的是提供具有增加的保存期的流感疫苗。
发明概述
根据上面的以及在下面将要提及的和将变得显而易见的那些目 的，根据本发明的用于经皮肤输送免疫活性试剂的装置和方法，通常 包括具有微凸出部件(或系统)的输送系统，该微凸出部件包括多个 适合于刺穿角质层进入到下面的表皮层或者表皮和真皮层的微凸出 (或其阵列)，该微凸出部件具有设置在其上的包括免疫活性试剂的 生物相容的涂层。在本发明的优选实施方案中，生物相容的涂层是由 免疫活性试剂涂层制剂形成的。
在本发明的优选实施方案中，免疫活性试剂包括流感疫苗。
在备选实施方案中，免疫活性试剂包括抗原性试剂或疫苗，选自 病毒和细菌、蛋白质为基础的疫苗、多糖为基础的疫苗以及核酸为基 础的疫苗。
合适的抗原性试剂包括但不限于蛋白质形式的抗原、多糖缀合 物、寡糖以及脂蛋白。这些亚基疫苗包括百日咳博德特氏菌(重组PT 疫苗-非细胞的)、破伤风梭菌(纯化的、重组的)、白喉棒状杆菌(纯化 的、重组的)、巨细胞病毒(糖蛋白亚基)、A族链球菌(糖蛋白亚基、与 破伤风类毒素的复合糖A族多糖、与毒素亚基载体连接的M蛋白/肽、 M蛋白、多价的型特异性表位、半胱氨酸蛋白酶、C5a肽酶)、乙型肝 炎病毒(重组的PreS1、Pre-S2、S、重组的核心蛋白)、丙型肝炎病毒(重 组表达的表面蛋白和表位)、人乳头瘤病毒(衣壳蛋白、TA-GN重组蛋 白L2和E7[来自HPV-6]、来自HPV-11的MEDI-501重组VLP L1、 四价的重组BLP Ll[来自HPV-6]、HPV-11、HPV-16和HPV-18、 LAMP-E7[来自HPV-16])、肺炎军团菌(纯化的细菌表面蛋白)、脑膜 炎奈瑟氏球菌(与破伤风类毒素的复合糖)、绿脓杆菌(合成肽)、风疹病 毒(合成肽)、肺炎链球菌(缀合到脑膜炎球菌B OMP的复合糖[1，4，5，6B， 9N，14，18C，19V，23F]、缀合到CRM197的复合糖[4，6B，9V，14，18C， 19F，23F]、缀合到CRM1970的复合糖[1，4，5，6B，9V，14，18C，19F， 23F]、梅毒密螺旋体(表面脂蛋白)、水痘带状疱疹病毒(亚基、糖蛋白) 以及霍乱弧菌(缀合的脂多糖)。
完整的病毒或细菌包括但不限于减毒的或杀死的病毒，诸如细胞 巨化病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、风疹病毒 和水痘带状疱疹，减毒的或杀死的细菌，诸如百日咳博德特氏菌、破 伤风梭菌、白喉棒状杆菌、A族链球菌、肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟氏 球菌、绿脓杆菌、肺炎链球菌、梅毒密螺旋体和霍乱弧菌，以及它们 的混合物。
另外的商业上可获得的含有抗原性试剂的疫苗包括但不限于流感 疫苗、莱姆病疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、水痘疫苗、 天花疫苗、肝炎疫苗、百日咳疫苗以及白喉疫苗。
包含核酸的疫苗包括但不限于单链和双链核酸，诸如超螺旋质粒 DNA；线性质粒DNA；粘粒；细菌人工染色体(BACs)；酵母人工染色 体(YACs)；哺乳动物人工染色体；以及RNA分子，诸如mRNA。核酸 也可以与蛋白质试剂偶联或者可以包括一种或多种化学修饰，诸如硫 代磷酸酯部分。
与疫苗抗原一起构成疫苗的合适的免疫应答增强佐剂包括磷酸铝 凝胶；氢氧化铝；α葡聚糖：β-葡聚糖；霍乱毒素B亚基；CRL1005； 具有平均值x＝8和y＝205的ABA嵌段共聚物；γ菊粉：线性的(无支 链的)β-D(2-＞1)多聚呋喃果糖氧基-α-D-葡萄糖；Gerbu佐剂：N-乙 酰葡糖胺-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)，二 甲基双十八烷基氯化铵(DDA)，L-脯氨酸锌盐复合物(Zn-Pro-8)； 咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；ImmTherTM：N- 乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-甘油二棕榈酸酯； MTP-PE脂质体：C59H108N6O19PNa-3H2O(MTP)；Murametide：Nac- Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3；Pleuran：β-葡聚糖；QS-21；S-28463：4- 氨基-a，a-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇；salvo肽： VQGEESNDK·HCl(IL-1β 163-171肽)；苏氨酰-MDP(TermurtideTM)： N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺，以及白介素18、IL-2 IL-12、IL- 15，佐剂也包括DNA寡核苷酸，诸如含有CpG的寡核苷酸。此外，也 可以使用编码免疫调节淋巴因子诸如IL-18、IL-2 IL-12、IL-15、IL-4、 IL10、γ-干扰素和NFκB调节信号蛋白质的核酸序列。
在本发明的一个实施方案中，微凸出部件具有至少大约10个微凸 出/cm2的微凸出密度，优选超过大约100个微凸出/cm2，更优选在大约 200-3000个微凸出/cm2的范围。进一步地，每个微凸出优选具有大约 50-145微米范围的长度，更优选在大约70-140微米的范围。
在一个实施方案中，微凸出部件由不锈钢、钛、镍钛合金或者类 似的生物相容材料诸如聚合材料构成。
在备选实施方案中，微凸出部件由不导电材料诸如聚合物构成。 备选地，微凸出部件可用诸如Parylene的不导电材料涂覆。
在本发明的一个实施方案中，生物相容涂层具有小于100微米的 厚度。在优选实施方案中，生物相容涂层具有大约2-50微米范围内的 厚度。
应用到微凸出部件上形成固体生物相容涂层的涂层制剂可包括含 有免疫活性试剂的水性或非水性制剂。在优选实施方案中，涂层制剂 包括水性制剂。
在本发明的一个实施方案中，涂层制剂包括至少一种表面活性 剂，可以是两性离子的、两性的、阳离子的、阴离子的或非离子的， 合适的表面活性剂包括但不限于sodium lauroamphoacetate，十二烷基 硫酸钠(SDS)，氯化十六烷基吡啶(CPC)，十二烷基三甲基氯化 铵(TMAC)，烷基苄基二甲基氯化铵，聚山梨酸酯诸如吐温20和吐 温80，其它山梨聚糖衍生物诸如山梨醇月桂酸酯，以及烷氧基化醇诸 如月桂基聚氧乙烯(4)醚。
在本发明进一步的实施方案中，涂层制剂包括至少一种具有两亲 性质的聚合材料或聚合物，可包括但不限于葡聚糖，羟乙基淀粉 (HES)，纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基甲基纤 维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素(MC)、羟乙 基甲基纤维素(HEMC)、或乙基羟基-乙基纤维素(EHEC)，以及 pluronics。
在本发明的一种实施方案中，在涂层制剂中呈现两亲性质的聚合 物的浓度优选在大约0.001-70wt.％的范围，更优选在大约0.01-50wt.％ 的范围，甚至更优选在涂层制剂大约0.03-30wt.％的范围。
在本发明的一个实施方案中，在固体生物相容涂层中呈现两亲性 质的聚合物的浓度优选在大约0.002-999wt.％的范围，更优选在固体生 物相容涂层大约0.1-60wt.％的范围。
在另一个实施方案中，涂层制剂包括亲水性的聚合物，选自下面 的组：聚(乙烯醇)、聚(环氧乙烷)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、 聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇以及它们的混合物和类似的聚合物。
在优选实施方案中，亲水性聚合物在涂层制剂中的浓度优选在大 约0.001-90wt.％的范围，更优选在大约0.01-20wt.％的范围，甚至更 优选在涂层制剂大约0.03-10wt.％的范围。
在优选实施方案中，亲水性聚合物在固体生物相容涂层中的浓度 在大约.002-99.9wt.％的范围，更优选在涂层制剂大约0.1-20wt.％的范 围。
在本发明的另一实施方案中，涂层制剂包括生物相容载体，其可 包括但不限于人白蛋白、生物工程化的人白蛋白、聚谷氨酸、聚天冬 氨酸、聚组氨酸、戊聚糖多硫酸酯、聚氨基酸、蔗糖、海藻糖、松三 糖、棉子糖和水苏糖。
优选地，生物相容载体在涂层制剂中的浓度优选在大约0.001-90 wt.％的范围，更优选在大约2-70wt.％的范围，甚至更优选在涂层制剂 大约5-50wt.％的范围。
优选地，生物相容载体在固体生物相容涂层中的浓度在大约 0.002-99.9wt.％的范围，更优选在固体生物相容制剂大约0.1-95wt.％ 的范围。
在进一步的实施方案中，涂层制剂包括稳定剂，其可包括但不限 于非还原糖、多糖、还原糖或者DNA酶抑制剂。
在另一个实施方案中，涂层制剂包括血管收缩剂，可包括但不限 于阿米福林、咖啡氨醇、环喷他明(cyclopentamine)、脱氧肾上腺素、 肾上腺素、苯赖加压素(felypressin)、茚唑啉(indanazoline)、美 替唑啉(metizoline)、米多君(midodrine)、萘唑啉(naphazoline)、 盐酸可巴君、二甲己胺(octodrine)、鸟氨加压素(ornipressin)、羟 甲唑啉、苯肾上腺素、苯基乙醇胺、苯基丙醇胺、六氢脱氧麻黄碱 (propylhexedrine)、伪麻黄碱、四氢唑啉、曲马唑啉(tramazoline)、 异庚胺(tuaminoheptane)、泰马唑啉(tymazoline)、血管加压素、 丁苄唑啉(xylometazoline)以及它们的混合物。最优选的血管收缩剂 包括肾上腺素、萘唑啉、四氢唑啉、茚唑啉、美替唑啉、曲马唑啉、 泰马唑啉、羟甲唑啉和丁苄唑啉。
如果采用，血管收缩剂的浓度优选在涂层大约0.1wt.％到10wt.％ 的范围。
在本发明的另一个实施方案中，涂层制剂包括至少一种“通道开 放调节剂”，可包括但不限于渗透压调节剂(例如氯化钠)，两性离 子化合物(例如氨基酸)，以及抗炎试剂诸如倍他米松21-磷酸二钠盐、 去炎舒松21-磷酸二钠、盐酸氢可松氨酯、氢化可的松21-磷酸二钠盐、 甲基强的松龙21-磷酸二钠盐、甲基强的松龙21-琥珀酸钠盐、帕拉米 松磷酸二钠盐、强的松龙21-琥珀酸钠盐，以及抗凝血剂诸如柠檬酸、 柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)、糊精硫酸钠、阿司匹林和EDTA。
优选地，本发明的涂层制剂具有小于大约5泊的粘度，更优选在 大约0.3-2.0泊的范围。
根据本发明的一个实施方案，输送免疫活性试剂的方法包括下面 的步骤：(i)提供具有多个微凸出的微凸出部件，(ii)提供粗疫苗，(iii) 将粗疫苗进行切向流过滤来提供疫苗溶液，(iv)加入至少一种赋形剂 (例如蔗糖、海藻糖或甘露糖)到疫苗溶液中，(v)冷冻干燥疫苗溶液 以形成疫苗产品，(vi)用第一溶液(例如水)将疫苗产品重构以形成 疫苗涂层制剂，(vii)用疫苗涂层制剂涂覆微凸出部件，以及(viii)将涂 覆的微凸出部件应用到受试者的皮肤上。
在一个实施方案中，疫苗包括流感疫苗。优选地，该方法包括输 送大约45μg血凝素的步骤。更优选地，输送疫苗的步骤包括将至少大 约70％的疫苗输送到富含APC的表皮层。
在另一个实施方案中，本发明配制疫苗溶液的方法包括下面的步 骤：(i)提供粗疫苗，(ii)将粗疫苗进行切向流过滤来提供疫苗溶液， (iii)加入至少一种赋形剂到疫苗溶液中，(v)冷冻干燥疫苗溶液以形成 疫苗产品。在一个实施方案中，疫苗产品显示出比粗疫苗至少浓500 倍的浓度。优选地，疫苗产品保持室温稳定性至少大约六个月。
附图简述
从下文以及对本发明优选实施方案更详细的描述来看，进一步的 特征和优点将是显而易见的，如附图中所图解阐明的，其中同样的参 考符号通常在整个图中都指同一部分或元件，其中：
图1是流感病毒粒子的图解；
图2是根据本发明的微凸出部件的一个实施方案的部分透视图；
图3是图2中所显示的根据本发明在微凸出上沉积有生物相容涂 层的微凸出部件的透视图；
图4是根据本发明的具有粘性衬垫的微凸出部件的截面侧视图；
图5是根据本发明的微凸出部件的另一个实施方案的部分透视 图；
图6是根据本发明的止动器的截面侧视图，止动器上设置有微凸 出部件；
图7是图6中所显示的止动器的透视图；
图8是敷贴器和图6中所显示的止动器的透视图；
图9是根据本发明的预配过程的流程图；
图10是根据本发明的吸光度相对于pH的图解说明，图解阐明了 pH对降低溶液浊度的效果；
图11是疫苗Fluzone和VaxigripTM的粘度相对于rpm的图解说 明；
图12是A/New Caledonia菌株的粘度相对于温度的图解说明，该 菌株在22.5mg/mL时具有15％的HA纯度；
图13A和13B是汇总了根据本发明的各种微凸出阵列设计的疫苗 输送的图解说明；
图14A是各种剂量的HA(A/Panama菌株)的平均抗-HA滴度相 对于时间的图解说明；
图14B是总的A/Panama特异性IgG滴度相对于HI活性的图解说 明；
图15A和15B是HA(A/Panama菌株)的几种制剂的免疫原性的条 形图，图解阐明了抗-A/Panama特异性的IgG抗体和HI活性；
图16A和16B是干燥涂覆在微凸出上的HA(A/Panama菌株)的几 种制剂的免疫原性的条形图，图解阐明了第28天和第49天时的抗-HA IgG抗体活性和HI活性；
图17是干燥涂覆在微凸出上的三价HA(A/Panama、A/New Caledonia和B/Shangdong菌株)的几种制剂的免疫原性的一系列条形 图，图解阐明了HI活性；
图18是HA的量相对于时间的图解说明，图解阐明了根据本发明 的几种涂层制剂在40℃存储达八周的稳定性曲线图；
图19和20是两种三价制剂的条形图，图解阐明了根据本发明的 制剂在40℃存储达三个月以及5℃和40℃达六个月的稳定性曲线图； 以及
图21是SRID/BCA相对于时间的图解说明，显示了根据本发明用 蔗糖配制的并在40℃存储达八周的A/New Caledonia菌株的稳定性曲 线图。
发明详述
在详细描述本发明之前，要理解的是本发明并不限于特定的例证 性材料、制剂、方法或结构等等，当然可以改变。这样，尽管与这里 描述的那些相类似或相当的许多材料和方法都可用于实施本发明，但 是这里描述了优选材料和方法。
也要理解的是这里使用的术语仅仅是为了描述发明的特定实施方 案，并不打算是限制性的。
除非另外定义，这里使用的所有技术和科学术语的意义是与本发 明所属技术领域普通技术人员所通常理解的意义相同的。
进一步地，这里引用的所有出版物、专利和专利申请都被整体引 入这里作为参考，无论是在前文中或是在后文中。
最后，如在该说明书和所附的权利要求中所使用的，单数形式“一 个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非内容中另外清楚地规定 了。这样，例如提及“一种免疫活性试剂”就包括两种或多种这样的 试剂；提及“一种微凸出”就包括两种或多种这样的微凸出等等。
定义
如这里使用的术语“经皮肤的”意指输送试剂进入和/或通过皮肤 用于局部或全身治疗。
如这里使用的术语“经皮肤的流量”意指经皮肤输送的速度。
如这里使用的术语“共输送”意指辅助试剂的经皮肤施用在试剂 输送之前，或在试剂的经皮肤流动之前和期间，或在试剂的经皮肤流 动期间，或在试剂的经皮肤流动期间和之后，和/或试剂的经皮肤流动 之后。此外，两种或多种免疫活性试剂可以被配制到本发明的生物相 容涂层中，形成不同免疫活性试剂的共输送。
如这里使用的术语“生物学活性试剂”是指含有活性试剂或药物 的物质组合物或混合物，当以治疗有效量施用时是药学有效的。这种 活性试剂的例子包括但不限于小分子量化合物、多肽、蛋白质、寡核 苷酸、核酸以及多糖。
如这里使用的术语“免疫活性试剂”是指含有任意和所有来源的 抗原性试剂和/或“疫苗”的物质组合物或混合物，当以免疫学有效量 施用时能够触发有利的免疫应答。免疫活性试剂的特殊例子是流感疫 苗。
免疫活性试剂的更多例子包括但不限于病毒和细菌、蛋白质为基 础的疫苗、多糖为基础的疫苗以及核酸为基础的疫苗。
合适的免疫活性试剂包括但不限于蛋白质形式的抗原、多糖缀合 物、寡糖以及脂蛋白。这些亚基疫苗包括百日咳博德特氏菌(重组PT 疫苗-非细胞的)、破伤风梭菌(纯化的、重组的)、白喉棒状杆菌(纯化的、 重组的)、巨细胞病毒(糖蛋白亚基)、A族链球菌(糖蛋白亚基、与破伤 风类毒素的复合糖A族多糖、与毒素亚基载体连接的M蛋白/肽、M 蛋白、多价的型特异性表位、半胱氨酸蛋白酶、C5a肽酶)、乙型肝炎 病毒(重组的PreS 1、Pre-S2、S、重组的核心蛋白)、丙型肝炎病毒(重 组表达的表面蛋白和表位)、人乳头瘤病毒(衣壳蛋白、TA-GN重组蛋 白L2和E7[来自HPV-6]、来自HPV-11的MEDI-501重组VLP L1、 四价的重组BLP Ll[来自HPV-6]、HPV-11、HPV-16和HPV-18、 LAMP-E7[来自HPV-16])、肺炎军团菌(纯化的细菌表面蛋白)、脑膜 炎奈瑟氏球菌(与破伤风类毒素的复合糖)、绿脓杆菌(合成肽)、风疹病 毒(合成肽)、肺炎链球菌(缀合到脑膜炎链球菌B OMP的复合糖[1，4，5， 6B，9N，14，18C，19V，23F]、缀合到CRM197的复合糖[4，6B，9V，14， 18C，19F，23F]、缀合到CRM1970的复合糖[1，4，5，6B，9V，14，18C，19F， 23F]、梅毒密螺旋体(表面脂蛋白)、水痘带状疱疹病毒(亚基、糖蛋白) 以及霍乱弧菌(缀合的脂多糖)。
完整的病毒或细菌包括但不限于减毒的或杀死的病毒，诸如细胞 巨化病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、风疹病毒 和水痘带状疱疹，减毒的或杀死的细菌，诸如百日咳博德特氏菌、破 伤风梭菌、白喉棒状杆菌、A族链球菌、肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟氏 球菌、绿脓杆菌、肺炎链球菌、梅毒密螺旋体和霍乱弧菌，以及它们 的混合物。
许多商业上可获得的含有对本发明有用的抗原性试剂的疫苗包括 但不限于流感疫苗、莱姆病疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫 苗、水痘疫苗、天花疫苗、肝炎疫苗、百日咳疫苗以及白喉疫苗。
也可根据本发明的方法输送的包含核酸的疫苗包括但不限于单链 和双链核酸，诸如超螺旋质粒DNA；线性质粒DNA；粘粒；细菌人工 染色体(BACs)；酵母人工染色体(YACs)；哺乳动物人工染色体；以及 RNA分子，诸如mRNA。
核酸的大小可达数千个千碱基。核酸也可以与蛋白质试剂结合或 者可以包括一种或多种化学修饰，诸如硫代磷酸酯部分。
与疫苗抗原一起构成疫苗的合适的免疫应答增强佐剂包括但不限 于磷酸铝凝胶；氢氧化铝；α葡聚糖：β-葡聚糖；霍乱毒素B亚基； CRL1005；具有平均值x＝8和y＝205的ABA嵌段共聚物；γ菊粉：线 性的(无支链的)β-D(2-＞1)多聚呋喃果糖氧基-α-D-葡萄糖；Gerbu 佐剂：N-乙酰葡糖胺-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺 (GMDP)，二甲基双十八烷基氯化铵(DDA)，L-脯氨酸锌盐复合 物(Zn-Pro-8)；咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺； ImmTherTM：N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L-Ala- 甘油二棕榈酸酯；MTP-PE脂质体：C59H108N6O19PNa-3H2O(MTP)； Murametide：Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3；Pleuran：β-葡聚糖； QS-21；S-28463：4-氨基-a，a-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇；salvo 肽：VQGEESNDK·HCl(IL-1β163-171肽)；苏氨酰-MDP (TermurtideTM)：N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺，以及白介素 18、IL-2 IL-12、IL-15，佐剂也包括DNA寡核苷酸，诸如含有CpG的 寡核苷酸。此外，也可以使用编码免疫调节淋巴因子诸如IL-18、IL-2 IL-12、IL-15、IL-4、IL10、γ-干扰素和NF κB调节信号蛋白质的核 酸序列。
如这里使用的术语“生物学有效量”或“生物学有效速度”是指 刺激或启动期望的免疫学的并且经常是有利的结果所需要的免疫活性 试剂的量或速度。本发明的涂层中所采用的免疫活性试剂的量将是这 样的量，这个量对于输送为获得期望的免疫学结果所需要的免疫活性 试剂的量来说是必需的。实际上，这将是变化很大的，取决于所输送 的特定免疫活性试剂、输送的部位以及用来输送免疫活性试剂到皮肤 组织中的溶解和释放动力学。
如同本领域普通技术人员将能理解的是，被输送的免疫活性试剂 的剂量也可以通过改变微凸出阵列(或药贴)的大小、密度等等而被 改变或操纵。
如这里使用的术语“涂层制剂”意指并包括自由流动的组合物或 混合物，采用它来涂覆微凸出和/或其阵列。
如这里使用的术语“生物相容涂层”和“固体涂层”意指并包括 基本上呈固体状态的“涂层制剂”。
如这里使用的术语“微凸出”是指适合于刺穿或切穿活体动物特 别是哺乳动物更特别是人的皮肤的角质层进入下面的表皮层或者表皮 和真皮层的穿刺元件。
如这里使用的术语“微凸出部件”通常意指包括多个排列成阵列 来刺穿角质层的微凸出的微凸出阵列。微凸出部件的形成可通过从薄 板上蚀刻或冲孔多个微凸出、并将微凸出从薄板上折叠或弯曲形成诸 如图2所显示的设置。微凸出部件也可用其它已知的方式形成，诸如 通过沿每个条带的边缘形成一个或多个具有微凸出的条带，其披露于 美国专利No.6,050,988，将其整体引入这里作为参考。
在一个实施方案中，微凸出部件具有微凸出密度为至少大约10个 微凸出/cm2的阵列，优选至少大约100个微凸出/cm2，更优选在大约 200-3000个微凸出/cm2的范围。
如上所述，本发明包括用于经皮肤输送免疫活性试剂的包括具有 微凸出部件(或系统)的装置和方法，该微凸出部件包括多个适合于 刺穿角质层进入到下面的表皮层或者表皮和真皮层的微凸出(或其阵 列)，该微凸出部件具有设置在其上的包括免疫活性试剂的生物相容 的涂层。
在发明的优选实施方案中，免疫活性试剂包括流感疫苗，更优选 包括三价流感疫苗。根据本发明，在刺穿皮肤的角质层时，生物相容 涂层就被体液(胞内流体和胞外流体诸如组织液)溶解，流感疫苗就 被释放到皮肤中(即推注输送)用于全身治疗。
根据本发明，涂层溶解和释放的动力学将取决于许多因素，包括 免疫活性试剂的性质、涂覆过程、涂层厚度以及涂层组成(例如涂层 制剂添加剂的存在)。依据释放动力学曲线图，以延长的时间周期保 持涂覆的微凸出与皮肤的穿刺联系可能是必需的。这可以通过使用粘 合剂将微凸出部件锚定在皮肤上来实现或者通过使用锚定的微凸出来 实现，诸如图5中所显示的以及WO 97/48440中所描述的，将其整体 引入这里作为参考。
如现有技术中所公知的，流感病毒粒子由许多蛋白质成分构成， 以血凝素(HA)作为负责诱导人体中的保护性抗-HA抗体的基本表面 抗原。流感粒子的图解显示于图1中。
在免疫学上，根据两种表面抗原HA和神经氨酸酶(NA)将流感 A病毒分为亚型。对这些抗原特别是血凝素的免疫性降低了感染的感 染可能性并减轻了感染发生时的疾病严重程度。
流传菌株的抗原特性提供了选择每年的疫苗中所包括的病毒菌株 的基础。每年，流感疫苗包含三种病毒菌株(通常是两种A型和一种 B型)，代表了在即将到来的冬季可能全世界传播的流感病毒。流感A 和B可通过它们核蛋白和基底蛋白的不同来区分。类型A是最普通的 菌株，是造成主要的人间传染的原因。三价疫苗中每种菌株的HA含 量典型地调整为单一的人剂量中15μg，即45μg总HA。
如这里所详细探讨的，由于独特的预配过程，完全的流感疫苗人 体剂量，即45μg血凝素，可通过涂覆的微凸出阵列经皮肤输送到富含 APC的表皮层，这是皮肤最具有免疫活性的成分，其中至少70％的流 感疫苗被输送到所述的表皮层。更重要的是，抗原保留了在皮肤中的 免疫原性来引起强的抗体和血清保护性免疫应答。此外，干燥涂覆的 疫苗制剂基本上不含防腐剂，可以维持至少六个月的室温稳定性。
现在参看图2，显示了用于本发明的微凸出部件30的一个实施方 案。如图2所示，微凸出部件30包括具有多个微凸出34的微凸出阵 列32。微凸出34优选以基本上90°角从薄板36上延伸出来，在所述 的实施方案中包括开口38。
根据本发明，薄板36可以被插入输送药贴中，包括用于薄板36 的衬垫40，还可以额外包括将药贴粘附到皮肤上(见图4)的粘合条 (未显示)。在这个实施方案中，微凸出34是通过在金属薄板36上 蚀刻或冲孔多个微凸出34并将微凸出34从薄板36的平面上弯曲出来 而形成的。
在本发明的一个实施方案中，微凸出部件30具有至少大约1 0个 微凸出/cm2的微凸出密度，更优选在至少大约200-3000个微凸出/cm2 的范围。优选地，试剂所通过的每单位面积开口数是至少大约10个开 口/cm2并少于大约3000个开口/cm2。
如所述，微凸出34优选具有小于1000微米的凸出物长度。在一 个实施方案中，微凸出34具有小于500微米的凸出物长度，更优选小 于250微米。
在进一步的适合于最小程度出血和刺激的实施方案中，微凸出优 选具有小于145微米的凸出物长度，更优选在大约50-145微米的范围， 甚至更优选在大约70-140微米的范围。
微凸出34也优选具有大约25-500微米的在图2中标为“W”的宽 度范围，以及大约10-100微米的厚度范围。
现在参看图5，显示了本发明的范围中可采用的微凸出部件50的 另一个实施方案。微凸出部件50同样包括具有多个微凸出54的微凸 出阵列52。微凸出54优选以基本上90°角从薄板51上延伸出来，同 样包括开口56。
如图5所示，几个微凸出54包括设置在前缘附近的固位部件或锚 58。如上所述，固位部件58有助于微凸出部件50粘附到受试者的皮 肤上。
微凸出部件(例如30、35)可由各种金属制造，诸如不锈钢、钛、 镍钛合金，或者类似的生物相容材料，诸如聚合材料。优选地，微凸 出部件是由钛制造的。
根据本发明，微凸出部件也可由不导电材料构成，诸如聚合物。 备选地，微凸出部件可以用不导电材料涂覆，诸如Parylene，或者是 疏水性材料，诸如Teflon、硅或者其它低能材料。所述的疏水性材料 和相关基底(诸如photoreist)层在美国申请No.60/484,142中阐述了， 将其引入这里作为参考。
可在本发明中采用的微凸出部件包括但不限于美国专利No. 6,083,196、6,050,988和6,091,975以及美国专利公开No.2002/0016562 中所披露的，将其整体引入这里作为参考。
可在本发明中采用的其它微凸出部件包括使用硅片蚀刻技术蚀刻 硅或者通过使用蚀刻微型铸模成型塑料而形成的部件，诸如美国专利 No.5,879,326中所披露的部件，将其整体引入这里作为参考。
现在参看图3，显示了具有多个微凸出34的微凸出部件30，微凸 出上涂覆了生物相容涂层35。根据本发明，涂层35可部分或全部覆盖 每个微凸出34。例如，涂层35可以干燥方式涂覆在微凸出34上。涂 层35也可在微凸出34形成之前或之后进行施加。
根据本发明，涂层35可通过各种已知方法施加到微凸出34上。 优选地，涂层仅仅施加到微凸出部件30或微凸出34刺穿皮肤的那些 部分(例如尖端39)。
一种这样的涂覆方法包括浸涂。浸涂可被描述为这样的方式，通 过部分或全部将微凸出34浸入涂覆溶液中来涂覆微凸出。通过使用部 分浸入技术，将涂层35仅仅限制在微凸出34的尖端39是可能的。
更多的涂覆方法包括辊涂，采用辊涂机制同样地将涂层35限制在 微凸出34的尖端39。辊涂方法披露于美国申请No.10/099,604(公开号 2002/0132054)，将其整体引入这里作为参考。如所述的申请中所详细 讨论的，披露的辊涂方法提供了平滑涂层，在皮肤穿刺期间不容易从 微凸出34上脱离。
根据本发明，微凸出34可进一步包括适合于接受和/或增加涂层35 体积的装置，诸如孔隙(未显示)、沟槽(未显示)、表面不平整(未 显示)或者类似的变形，其中该工具提供了增加的表面面积，更大量 的涂层可以被沉淀在其上。
在本发明的范围中可采用的更多涂覆方法包括喷涂。根据本发 明，喷涂可包括涂层组合物的喷雾悬液的形成。在一个实施方案中， 将具有大约10到200皮升液滴大小的喷雾悬液喷雾到微凸出10上，然 后干燥。
也可采用模式涂覆来涂覆微凸出34。模式涂覆可使用将沉淀液体 定位到微凸出表面的分配器来应用。沉淀液体的量优选在0.1到20纳 升/微凸出的范围。合适的精密计量液体分配器披露于美国专利No. 5,916,524；5,743,960；5,741,554和5,738,728中；将其整体引入这里作 为参考。
也可使用喷墨技术来施加微凸出涂层制剂，其使用已知的电磁阀 分配器、任选的流体运动装置以及定位装置，一般通过使用电场来控 制。也可使用印刷工业的其它液体分配技术或者现有技术中已知的类 似的液体分配技术来应用本发明的模式涂覆。
现在参看图6和7，为保存和应用，优选将微凸出部件30通过粘 性标签6悬在固定环40中，如同共同未决的美国申请No.09/976,762(公 开号2002/0091357)中所详细描述那样，将其整体引入这里作为参考。
将微凸出部件30安置在固定环40中以后，将微凸出部件30应用 到受试者的皮肤。优选地，使用冲击敷贴器45将微凸出部件30应用 到皮肤上，诸如涂8中所显示的以及共同未决的美国申请No. 09/976,798中所披露的，将其整体引入这里作为参考。
如所述，在本发明的优选实施方案中，施加到微凸出部件30上形 成固体涂层的涂层制剂包括水性制剂。在备选实施方案中，涂层制剂 包括非水性制剂。根据本发明，免疫活性试剂可溶解在生物相容载体 中或者悬浮在载体中。
如所述，在本发明的优选实施方案中，免疫活性试剂包括流感疫 苗。更优选地，包括三价流感疫苗。
在本发明的备选实施方案中，免疫活性试剂包括疫苗(或抗原性 试剂)，选自病毒和细菌、蛋白质为基础的疫苗、多糖为基础的疫苗 以及核酸为基础的疫苗。
合适的抗原性试剂包括但不限于蛋白质形式的抗原、多糖缀合 物、寡糖以及脂蛋白。这些亚基疫苗包括百日咳博德特氏菌(重组PT 疫苗-非细胞的)、破伤风梭菌(纯化的、重组的)、白喉棒状杆菌(纯化 的、重组的)、巨细胞病毒(糖蛋白亚基)、A族链球菌(糖蛋白亚基、与 破伤风类毒素的复合糖A族多糖、与毒素亚基载体连接的M蛋白/肽、 M蛋白、多价的型特异性表位、半胱氨酸蛋白酶、C5a肽酶)、乙型肝 炎病毒(重组的PreS1、Pre-S2、S、重组的核心蛋白)、丙型肝炎病毒(重 组表达的表面蛋白和表位)、人乳头瘤病毒(衣壳蛋白、TA-GN重组蛋 白L2和E7[来自HPV-6]、来自HPV-11的MEDI-501重组VLP L1、 四价的重组BLP Ll[来自HPV-6]、HPV-11、HPV-16和HPV-18、 LAMP-E7[来自HPV-16])、肺炎军团菌(纯化的细菌表面蛋白)、脑膜 炎奈瑟氏球菌(与破伤风类毒素的复合糖)、绿脓杆菌(合成肽)、风疹病 毒(合成肽)、肺炎链球菌(缀合到脑膜炎球菌B OMP的复合糖[1，4，5，6B， 9N，14，18C，19V，23F]、缀合到CRM197的复合糖[4，6B，9V，14，18C， 19F，23F]、缀合到CRM1970的复合糖[1，4，5，6B，9V，14，18C，19F， 23F]、梅毒密螺旋体(表面脂蛋白)、水痘带状疱疹病毒(亚基、糖蛋白) 以及霍乱弧菌(缀合的脂多糖)。
完整的病毒或细菌包括但不限于减毒的或杀死的病毒，诸如细胞 巨化病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、风疹病毒 和水痘带状疱疹，减毒的或杀死的细菌，诸如百日咳博德特氏菌、破 伤风梭菌、白喉棒状杆菌、A族链球菌、肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟氏 球菌、绿脓杆菌、肺炎链球菌、梅毒密螺旋体和霍乱弧菌，以及它们 的混合物。
另外的商业上可获得的含有抗原性试剂的疫苗包括但不限于流感 疫苗、莱姆病疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、水痘疫苗、 天花疫苗、肝炎疫苗、百日咳疫苗以及白喉疫苗。
包含核酸的疫苗包括但不限于单链和双链核酸，诸如超螺旋质粒 DNA；线性质粒DNA；粘粒；细菌人工染色体(BACs)；酵母人工染色 体(YACs)；哺乳动物人工染色体；以及RNA分子，诸如mRNA。核酸 的大小可达数千个千碱基。此外，在本发明的某些实施方案中，核酸 也可以与蛋白质试剂结合或者可以包括一种或多种化学修饰，诸如硫 代磷酸酯部分。核酸的编码序列包括免疫应答所期望针对的抗原的序 列。此外，在DNA的情况下，也将启动子和聚酰苷化序列插入到疫苗 构建体中。可被编码的抗原包括感染性疾病、病原体以及癌抗原的抗 原性成分。这样就发现了核酸在例如感染性疾病、癌症、过敏、自身 免疫以及炎症领域的应用。
与疫苗抗原结合的，可包括疫苗的合适的免疫应答增强佐剂包括 但不限于磷酸铝凝胶；氢氧化铝；α葡聚糖：β-葡聚糖；霍乱毒素B 亚基；CRL1005；具有平均值x＝8和y＝205的ABA嵌段共聚物；γ菊 粉：线性的(无支链的)β-D(2-＞1)多聚呋喃果糖氧基-α-D-葡萄糖； Gerbu佐剂：N-乙酰葡糖胺-(β 1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰 胺(GMDP)，二甲基双十八烷基氯化铵(DDA)，L-脯氨酸锌盐复 合物(Zn-Pro-8)；咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4- 胺；ImmTherTM：N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L- Ala-甘油二棕榈酸酯；MTP-PE脂质体：C59H108N6O19PNa-3H2O (MTP)；Murametide：Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3；Pleuran：β-葡聚 糖；QS-21；S-28463：4-氨基-a，a-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙 醇；salvo肽：VQGEESNDK·HCl(IL-1 β 163-171肽)；苏氨酰-MDP (TermurtideTM)：N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺，以及白介素 18、IL-2 IL-12、IL-15，佐剂也包括DNA寡核苷酸，诸如含有CpG的 寡核苷酸。此外，也可以使用编码免疫调节淋巴因子诸如IL-18、IL-2 IL-12、IL-15、IL-4、IL10、γ-干扰素和NF κB调节信号蛋白质的核 酸序列。
根据本发明，涂层制剂可包括至少一种润湿剂。合适的润湿剂包 括呈现两亲性质的表面活性剂和聚合物。
这样，在本发明的一个实施方案中，涂层制剂包括至少一种表面 活性剂。根据本发明，表面活性剂是两性离子的、两性的、阳离子的、 阴离子的或非离子的。合适的表面活性剂的例子包括sodium lauroamphoacetate，十二烷基硫酸钠(SDS)，氯化十六烷基吡啶 (CPC)，十二烷基三甲基氯化铵(TMAC)，苄烷铵，氯化物，聚 山梨酸酯诸如吐温20和吐温80，其它山梨聚糖衍生物诸如山梨醇月桂 酸酯，以及烷氧基醇诸如十二烷基醚-4。最优选的表面活性剂包括吐温 20、吐温80和SDS。
在发明进一步的实施方案中，涂层制剂包括至少一种具有两亲性 质的聚合材料或聚合物。所述的聚合物的例子包括但不限于纤维素衍 生物诸如羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟 丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素(MC)、羟乙基甲基纤维素(HEMC)、 或乙基羟基-乙基纤维素(EHEC)，以及pluronics。
在发明的一个实施方案中，呈现两亲性质的聚合物的浓度优选在 大约0.01-20wt.％的范围，更优选在涂层制剂大约0.03-10wt.％的范 围。甚至更优选润湿剂的浓度在涂层制剂大约0.1-5wt.％的范围。
如本领域普通技术人员将可理解的是，所述的润湿剂可单独或组 合使用。
根据本发明，涂层制剂可进一步包括亲水性聚合物。优选地，亲 水性聚合物选自下面的组：葡聚糖、羟乙基淀粉(HES)、聚(乙烯 醇)、聚(环氧乙烷)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(n-乙烯吡 咯烷酮)、聚乙二醇以及它们的混合物和类似的聚合物。如本领域所 公知的，所述的聚合物增加粘性。
涂层制剂中亲水性聚合物的浓度优选在大约0.01-50wt.％的范 围，更优选在涂层制剂大约0.03-30wt.％的范围。甚至更优选润湿剂的 浓度在涂层制剂大约0.1-20wt.％的范围。
根据本发明，涂层制剂可进一步包括生物相容载体，诸如共同未 决的美国申请No.10/127,108中所披露的那些，将其整体引入这里作为 参考。生物相容载体的例子包括人白蛋白、生物工程化的人白蛋白、 聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚组氨酸、戊聚糖多硫酸酯、聚氨基酸、蔗 糖、海藻糖、松三糖、棉子糖和水苏糖。
生物相容载体在涂层制剂中的浓度优选在大约2-70wt.％的范 围，更优选在涂层制剂大约5-50wt.％的范围。甚至更优选润湿剂的浓 度在涂层制剂大约10-40wt.％的范围。
涂层制剂可进一步包括血管收缩剂，诸如共同未决的美国申请No. 10/674,626中所披露的那些，将其整体引入这里作为参考。如所述的共 同未决申请中所述，血管收缩剂用于控制微凸出部件的应用期间和应 用之后的出血。优选的血管收缩剂包括但不限于阿米福林、咖啡氨醇、 环喷他明、脱氧肾上腺素、肾上腺素、苯赖加压素、茚唑啉、美替唑 啉、米多君、萘唑啉、盐酸可巴君、二甲己胺、鸟氨加压素、羟甲唑 啉、苯肾上腺素、苯基乙醇胺、苯基丙醇胺、六氢脱氧麻黄碱、伪麻 黄碱、四氢唑啉、曲马唑啉、异庚胺、泰马唑啉、血管加压素、丁苄 唑啉以及它们的混合物。最优选的血管收缩剂包括肾上腺素、萘唑啉、 四氢唑啉、茚唑啉、美替唑啉、曲马唑啉、泰马唑啉、羟甲唑啉和丁 苄唑啉。
如果采用，血管收缩剂的浓度优选在涂层大约0.1wt.％到10wt.％ 的范围。
在发明的另一个实施方案中，涂层制剂包括至少一种“通道开放 调节剂”，诸如共同未决的美国申请09/950,436中所披露的那些，将 其整体引入这里作为参考。如所述的共同未决申请中所述，通道开放 调节剂防止或减少了皮肤的自然愈合过程，从而防止了由微凸出部件 阵列在角质层中所形成的通道或微小狭缝的关闭。通道开放调节剂的 例子包括但不限于渗透压调节剂(例如氯化钠)以及两性离子化合物 (例如氨基酸)。
如共同未决的申请中所定义的，术语“通道开放调节剂”进一步 包括抗炎试剂诸如倍他米松21-磷酸二钠盐、去炎舒松21-磷酸二钠、 盐酸氢可松氨酯、氢化可的松21-磷酸二钠盐、甲基强的松龙21-磷酸 二钠盐、甲基强的松龙21-琥珀酸钠盐、帕拉米松磷酸二钠盐、强的松 龙21-琥珀酸钠盐，以及抗凝血剂诸如柠檬酸、柠檬酸盐(例如柠檬酸 钠)、糊精硫酸钠、阿司匹林和EDTA。
根据本发明，涂层制剂也可进一步包括非水性溶剂，诸如乙醇、 氯仿、乙醚、丙二醇、聚乙二醇等等，染料、色素、惰性填料、渗透 增强剂、赋形剂，以及本领域已知的药学产品或经皮肤设备的其它常 规成分。
也可将其它已知的制剂佐剂加入到涂层制剂中，只要它们不会不 利地影响涂层制剂所必需的可溶性和粘性特征以及干燥涂层的物理完 整性。
优选地，涂层制剂具有小于大约5的粘度，以便有效涂覆每个微 凸出10。更优选地，涂层制剂具有大约0.3-2.0泊的粘度范围。
根据本发明，涂层厚度优选在小于100微米，更优选小于50微米。 甚至更优选地，涂层厚度在大约2-30微米的范围。
期望的涂层厚度取决于几个因素，包括所需的剂量以及因此而需 要输送该剂量的涂层厚度，薄片每单位面积的微凸出密度，涂层制剂 的粘度和浓度以及所选择的涂覆方法。
在所有情况下，应用涂层之后，可通过各种方法干燥微凸出上的 涂层制剂。在本发明的一个实施方案中，将涂覆的微凸出部件(例如 30)在环境室温条件下空气干燥。在另一个实施方案中，将涂覆的微 凸出部件真空干燥。在另一个实施方案中，将微凸出部件空气干燥， 然后真空干燥。
也可以采用各种温度和湿度水平来干燥微凸出上的涂层制剂。这 样就可将涂覆的微凸出部件30经加热、冻干、冷冻干燥或者进行类似 技术以去除涂层上的水。
研究/实施例
下面的研究和实施例图解说明了本发明的装置、制剂方法和工 艺。实施例仅仅用于例证性目的，并不打算以任何方式限定发明的范 围。
首先参看表I，显示了在下面所述的研究中获得并采用的单价菌株 (即批)的汇总：
表I
菌株 批号 HA浓度 (g/mL) 总疫苗成分 的HA％ B/Yamanashi/Fluzone 5096PD 79 20 B/Victoria/Fluzone U2603 197 25 B/Victoria/Fluzone U02995 210 18 A/New Caledonia/Fluzone 5095PD 95 16 A/Panama/Fluzone 5094PD 112 40 A/Panama/Fluzone U02598 401 50 A/Panama/VaxigripTM FA106821 180 38 A/Panama/VaxigripTM FA107640 159(123) (33)* A/New Caledonia/VaxigripTM FA106076 131(127) (32)* B/Shangdong/VaxigripTM FA107994 191(260，234) (63)*
预配过程
所获得的最初粗疫苗是400μg HA/mL的A/Panama/2007/99菌株 (Fluzone)。在接收的时候溶液是浑浊的，表明存在不溶微粒，可能 是由于不溶于水的脂、脂蛋白复合物以及聚集的蛋白。单价疫苗的BCA 分析以及透析显示盐和其它低分子量物质占了固体成分的大多数。为 富集涂层的HA含量以满足剂量需求，必须去除这些低分子量成分。 因此就发展了渗滤/浓缩方法来处理这个问题。
现在参看图9，显示了所采用的预配过程的流程图。流程图中所述 的步骤在下面讨论。
切向流过滤(TFF)
如本领域所已知的，TFF允许渗滤和浓缩在同一时间进行。使用 渗滤来去除低分子量物质。建立并评估了配备Pellicon XL、重构纤维 素膜(Millipore，50cm2，30 kD MWCO)的TFF系统(Millipore，实验室 级)，用于疫苗原料的渗滤和浓缩。将疫苗溶液的体积减少到原始体积 的1/20-1/50，增加HA浓度到5-10mg HA/mL。加入缓冲溶液进行缓 冲交换和浓缩。
冻干
在切向流过滤之后，用防冻赋形剂诸如蔗糖或海藻糖配制浓缩疫 苗，填充到20mL的玻璃小瓶中，用液氮瞬间冷冻并置于多样式冷冻 干燥机(Virtis，25EL Freezemobile)上。使小瓶冷冻干燥2-5天，直到容 器室压达到稳态(约50m Torr)。
所述的预配过程提供了高度浓缩的固态血凝素(HA)制剂作为中 间产物。实际上，HA制剂的浓度是商业产品浓度的至少500倍。所述 的中间产物也是高效的且是免疫原性的。
如本领域普通技术人员将理解的是，所述的本发明的预配过程可 以修改并适应于预配各种疫苗来源材料及其形态。例如，工艺可适应 于使用以更高浓度接收的原料。在这种情况下，渗滤步骤将不是必需 的，高浓度原料将被直接冻干和重构来产生涂层制剂。
预配过程也可适应于使用作为固体被接收的原料，诸如但不限于 冻干的或喷雾干燥的粉末。在这种情况下，固体原料将被直接重构来 产生涂层溶液制剂。
预配过程也可修改来使用高纯原料，诸如但不限于源自细胞的流 感疫苗。在这种情况下，材料可以是足够纯的，冻干和重构步骤将不 再必需。
制剂研发
配制尝试贯注于开发具有合适涂层性质和稳定性的涂层制剂，确 定能可靠产生可再生涂层剂量的涂层系统，以及鉴定能够以良好输送 效率和可接受的皮肤耐受性输送疫苗的阵列设计。
涂覆工艺
在研究中使用两种类型的涂布机。第一种涂布机配备有Delrin制 造的0.38”直径的鼓。将鼓浸入具有0.25mL负荷体积的储存器中。该 储存器没有冷却能力，但是允许淡水的直接注入以补偿操作期间的蒸 发。固定在鼓上的膜的厚度是约200-250μm。
第二种涂布机配备有0.621”直径的不锈钢鼓和同心的储存器。用 于该涂布机的储存器具有0.3-0.7mL的负荷体积，取决于鼓的直径。 鼓直径也控制膜的厚度，对于0.621”鼓来说，膜厚是约80-90μm。该 涂布机的储存器配备有热电冷却(TEC)。通过将鼓温度控制在环境条件 的露点，可以最小程度减少涂层溶液浓度的变化。涂层高度通过微凸 出长度和阵列条带厚度的和来确定。
微凸出阵列设计
在制剂研制中采用了八个微凸出阵列。微凸出阵列设计的微凸出 长度、尖头角度、以及附加设计特征诸如固位倒钩和/或微凸出止动块 的存在是可变的。最初评估了两种微凸出阵列设计MF-1和MF-2。
赋形剂
为评估微凸出是否能够使用悬浮液即不清澈的涂层溶液来涂覆， 最初集中于通过加入表面活性剂来稳定不溶的颗粒。
现在参看表II，显示了表面活性剂在降低溶液浊度上的效果。所 述的数据表明加入表面活性剂能够帮助颗粒的解聚/溶液化，如通过溶 液浊度的降低所确定的。表面活性剂的强度顺序是SDS＞Triton X100＞ 吐温20，这与同样表面活性剂存在时的溶液澄清度是一致的(见表 III)。
表II
340nm的 浊度 粗品 粗品/0.1％ SDS 粗品/0.1％ Triton X100 粗品/0.1％ 吐温20 80μg/mL HA 0.279 0.022 0.053 0.185
表III
表面活 性剂 外观 膜/MWCO 终浓度 备注 SDS 澄清 Ultrfree/10 kD+ Centricon 30kD 30 mg/mL 超过100厘泊 的粘度 Triton X100 澄清 Ultrfree/10kD 15 mg/mL 成胶凝 吐温80 浑浊 Ultrfree/10kD 15 mg/mL 成胶凝
另一种有效的表面活性剂类型两性洗涤剂也能够破坏蛋白质/脂为 基础的聚集体。表IV列出了三种类型的两性洗涤剂，其溶解能力随两 性洗涤剂的疏水性增加而增加，即两性洗涤剂3-14是最强的。
表IV
两性洗涤剂 吸光度@340nm 起始疫苗材料 (0.2mg/mL HA) 0.3557 3-10 0.120 3-12 0.087 3-14 0.070
调节pH也显示出在高和低pH时降低了疫苗的浊度，如图10所 示。然而，pH的大量增加或减少可能损害了抗原在高浓度时的稳定 性。因此，为了消除溶液浊度就不要采用显著偏离7.2的pH。
由于预配过程使得疫苗能够被浓缩到涂覆所需的水平，结合制备 溶解的或悬浮的涂层溶液的策略，进一步研究了七种候选制剂。在表V 中所述的制剂含有至少一种或多种赋形剂。
表V
参考号 制剂(形式) 1 5％HA/1％海藻糖/10％SDS(溶解的) 2 5％HA/1％海藻糖/10％Triton X100(溶解的) 3 5％HA/1％海藻糖/5％两性洗涤剂3-14/pH10 (Na2CO3-NaHCO3)(溶解的) 4 5％HA/1％海藻糖/10％两性洗涤剂3-14(溶解的) 5 5％HA/5％蔗糖/2％吐温80(悬浮液) 6 5％HA/5％蔗糖(悬浮液) 7 5％HA/2.5海藻糖/2.5甘露糖/2％Pluronic F68 (悬浮液)
制剂1-4是溶解的溶液。制剂5-7是悬浮液/混浊溶液。所有制剂含 有至少稳定蛋白质的糖。制剂5含有弱的表面活性剂吐温80，据信它 可以提供疫苗增加的溶解性以及可能增加的免疫原性。仅含有蔗糖的 制剂6是所有评估的制剂中最简单的制剂。制剂7包括甘露糖和固体 表面活性剂Pluronic F68，据信它可以降低涂层的吸湿性并增加涂层完 整性/物理稳定性。
涂层溶液/悬浮液特征
如本领域所公知的，主要是两种物理参数控制涂覆可行性：涂层 溶液的粘度和润湿性。下面讨论每种所述的参数。
粘度
溶液粘度影响涂层溶液在微凸出涂覆期间的流动。如果涂层溶液 粘度太低，当所浸入的微凸出阵列从涂层溶液中离开时，就会有相当 部分的液体可能在有机会形成微凸出尖端周围的膜之前落回到储存器 中。这将导致低效率的过程而需要许多的更多循环的涂覆。
另一方面，如果涂层溶液粘度太高，微凸出阵列上的液体将很缓 慢地移动，可能导致奇怪的涂层形态。表VI汇总了固态的七种候选制 剂的组成。所有七种涂层溶液制剂都含有6mg/mL的2-苯氧基乙醇作 为防腐剂。涂层溶液中的HA含量在HA纯度50％的情况下为约30％。
表VI
制剂 1 2 3 4 5 6 7 HA 23.1 23.1 30.1 23.1 28.4 32.1 28.4 糖 4.6 4.6 6.1 4.6 28.4 32.1 28.4 非HA材料 23.1 23.1 30.1 23.1 28.4 32.1 28.4 表面活性剂 46.3 46.3 30.1 46.3 11.4 0 11.4 2-PE 2.9 2.9 3.6 2.9 3.4 3.7 3.4
现在参看图11，显示了两种不同批疫苗Fluzone和VaxigripTM 的比较图。 两种批都包括A/Panama菌株并配制到制剂5中(HA∶海 藻糖∶吐温80＝5∶5∶2重量比)。
涂层制剂通常是50mg/mL(5％)的HA。然而，在这个浓度下， VaxigripTM的溶液粘度高的多，即在200rpm时候约0.8泊。
如图11所示，制剂的粘度随稀释而降低。在35mg/mL HA(3.5％) 时，VaxigripTM制剂的溶液粘度达到了Fluzone制剂在50mg/mL HA (5％)时同样的水平，在200rpm测定为0.4泊。
除了HA纯度和HA浓度，涂层溶液的温度是另一个影响粘度的重 要因素。这样，通过将冷冻干燥的疫苗重构到22.5mg/mL HA中就制 备了包括具有15％HA纯度的A/New Caledonia菌株的高粘性涂层溶液 (具有2.25％HA/2.25蔗糖的改良制剂6)。该涂层溶液的粘度在低于 室温的几个温度下进行测定(见图12)。溶液是高度粘性的，即5℃ 时约1.70cp。
如本领域所公知的，温度是涂覆系统中的重要参数，因为为了最 小程度减少涂覆过程期间由于蒸发而损失的水，不锈钢溶液储存器和 鼓的温度都要控制在环境条件的露点。在正常环境条件下(22℃和 30-45％RH)的露点典型地在4-10℃的范围。
尽管溶液粘度可以显著变化，但是已经发现涂层溶液可以在很宽 的粘度范围中容易地且有效地涂覆在微凸出阵列上，优选大约0.3-2.0 泊的范围。
润湿性：接触角
如本领域所已知的，润湿性决定了液体附着、粘附并散布到要涂 覆的表面上的能力。液滴在基底表面上的接触角测定通常用来表征表 面润湿性。所测得的接触角是以纯水为参照的，纯水的接触角在同样 条件下是约70-80°。一般地，接触角越小，润湿性越好。
现在参看表VII，显示了表V中所鉴别的七种流感疫苗制剂在没有 被清洁的金属钛表面上的接触角。与纯水相比，所有制剂都显示出良 好的润湿性，接触角在26°到36°的范围。很不同的制剂的接触角的 狭窄范围表明疫苗对润湿性的贡献可能超出赋形剂的贡献。为验证这 个假设，测定了没有疫苗的同一制剂的接触角。结果表明疫苗中的成 分似乎有助于润湿金属表面。没有疫苗，这些赋形剂除了强力表面活 性剂之外都不能有效润湿金属表面。
表VII
制剂 接触角 (°) 没有疫苗时的 接触角(°) 水 72 72 (1)5％HA/10％SDS 32 ND (2)5％HA/10％Triton X100/pH10 36 ND (3)5％HA/5％两性洗涤剂 3-14/pH10 28 30 (4)5％HA/5％两性洗涤剂3-14 26 ND (5)5％HA/5％蔗糖/2％吐温80 31 40 (6)5％HA/5％蔗糖 34 60 (7)5％HA/2.5％海藻糖/2.5％甘露糖/ 2％Pluronic F68 32 59
总的说来，涂层溶液显示了增强的润湿性质，其最小程度地受涂 覆表面的影响，还显示了极好的涂覆性质，即使接触角在最佳接触角 范围的最低端。接触角被认为在大约30-60°的范围，这是由其它生物 药学制剂和安慰剂制剂所确定的。
免疫原性研究的候选物选择
用于免疫原性研究的最终制剂的选择是在抗原稳定性和输送性能 的基础上进行的。
三价制剂
往回参看表1，确定了每批的HA纯度。HA纯度在16％到50％的 范围。基于公认的经验关系曲线，如果HA纯度从期望的50％降到20 ％，那么涂层溶液的HA含量就会从约30％显著降到11％。尽管有这 样的HA纯度变化，这些材料都可以被成功处理，表明了预配过程的 稳定性。
评估了从三种单价菌株A/Panama/Fluzone、A/New Caledonia/ Fluzone和B/Victoria/Fluzone制备三价流感疫苗的两种方法。在第 一种方法中，分别处理三种单价起始材料A/Panama/Fluzone、A/New Caledonia/Fluzone和B/Victoria/Fluzone以提供三种冷冻干燥的单价 中间体。组合具有等量HA的来自三种中间体的每一种的冷冻干燥材 料，用水重构用于涂覆。
第二种方法是通过混合三种单价起始材料来进行的，它们具有等 量的HA，即具有不同的体积。然后将三价混合物渗滤、经TTF系统 浓缩以及冷冻干燥。第二种方法的涂层溶液具有与第一种方法相同的 涂覆性质。
三价制剂的涂覆(24mg/ml HA，即每种HA菌株约8mg/ml)显示了 在类似位置的尖端涂层形态，不论使用何种微凸出阵列设计。从微凸 出的尖端开始测定，所有设计的涂层向下延伸了约90μm，表明建立了 可良好控制的涂覆系统。
涂覆的微凸出阵列的表征
除了形态，需要表征涂层的几个物理和生化方面来理解配制过程 的进行。物理参数包括涂覆期间和之后的水蒸发和含水量以及涂层的 微生物考虑事项。
涂覆可行性/形态：溶液化制剂(No.1-4)
尽管存在不同涂层制剂可能导致各种涂层形态的事实，但是无论 制剂如何，都获得了类似的和可接受的涂层位置/形态，表明一些疫苗 成分的存在有利于涂覆过程，如接触角结果所反映的。用四种制剂证 明了涂覆可行性。
涂覆可行性/形态：悬浮液制剂(No.5-7)
尽管制剂No.5-7是高度混浊的粘性溶液，但是悬浮液是稳定的， 因为在冷藏储存一个月后没有观察到相分离。此外，在7000rpm离心 2分钟后没有清晰的颗粒沉降。涂覆期间在鼓上形成了均匀的薄膜，没 有观察到明显的颗粒——这是优良的稳定悬浮液的进一步证据。
含水量
如表VIII中所反映的，发现涂层含水量受到干燥和处理环境的影 响，特别是环境条件的相对湿度。在微凸出阵列或钛板基底上干燥的 制剂5(HA/蔗糖/吐温80)的涂层溶液产生了1.7％的含水量，只有在空 气干燥后进行真空干燥才是这样。不真空干燥，涂层的含水量显著更 高，为6.2％，这将随环境空气的湿度而变化。
表VIII
样品信息 干燥 水含量 (％) 涂覆的制剂5 (A/Panama/VaxigripTM) 的阵列 空气干燥，然后真空干燥 1.7 在钛板上干燥的制剂5 空气干燥过夜 6.2 在钛板上干燥的制剂5 空气干燥2小时，然后真空 干燥过夜 1.7
微生物学
在低生物负荷产生区域即“非无菌”区域进行了微生物学分析， 用于GLP生产批次和GMP生产批次的方式为仅有蔗糖的三价形成 物，没有任何防腐剂。该分析的结果示于表IX中。
表IX
批次 三价涂层溶液 三价涂覆阵列 内毒素* 微生物含量* 内毒素 微生物含量 GLP ＜0.05EU/mL ＜0.04CFU/mL ＜0.5EU/阵列 ＜1CFU/阵列 GMP ＜0.04EU/mL ＜0.05CFU/mL ＜0.5EU/阵列 ＜1CFU/阵列
*在单份人剂量浓度下等量。三价涂层溶液比现有市场销售的疫 苗溶液浓466倍。
如表IX所反映的，在缺乏任何防腐剂时，两个批次的涂层溶液都 含有极低水平的内毒素和微生物含量。这些结果从而表明，采用来得 到涂层溶液的过程以及涂覆过程本身都可以以不引入另外的生物负荷 到产品中的方式进行操作。
SDS-PAGE/Western印迹
通过Western印迹分析分析了涂覆在微凸出上的三种最终制剂 (制剂No.3、6和7)的HA抗原性。与起始材料相比(第2道)，所 有涂覆的并冷冻干燥的制剂都显示了相似的带模式。据信三条带与HA 的单体(约75kD)或三聚体(约2250kD)有关。因此，根据匹配带 和带强度(相对于起始疫苗)，可以断定的是，在制剂中已被冷冻干 燥并涂覆在微凸出阵列上的抗原HA保持了抗原性。
BCA与SRID
如本领域所公知的，SRID是确定HA体外效力的唯一被认可的分 析方法，它通常与免疫原性是一致的。然而，它很耗费时间(3天)。 为以及时的方式监测预配和涂覆过程期间的HA效力，进行了BCA蛋 白质分析，并与SRID分析的结果进行比较，这将使得能够评估短期 HA稳定性。
现在参看表X，显示了三种单价菌株在TFF浓缩、冷冻干燥、重 构为三价涂层液体以及涂覆之后的BCA/SRID结果的汇总。BCA结果 通常与SRID结果是一致的，除了A/New Caledonia中冷冻干燥材料具 有比BCA值低得多的SRID。然而，这两个值在重构的三价液体制剂 中更好地匹配了，表明较早的不一致性很可能是由于样品制备或分析 方法的偏差。
表X
材料 A/Panama B/Victoria A/New Caledonia BCA (μg/mL) SRID (μg/mL) BCA (μg/mL) SRID (μg/mL) BCA (μg/mL) SRID (μg/mL) 起始材料 130 110 150 140 100 100 TFF浓缩的 71 UD 49 55 62 74 冷冻干燥的 120 UD 84 92 148 68 三价重构的 1320 UD 640 720 1070 1260 三价涂覆的# UD (18.0) 18.3 (21.2) 25.3(30.5)
微凸出阵列输送和皮肤耐受性
进行了十六个单独的输送研究来评估输送效率和皮肤耐受性。每 个研究汇总在表XI中。
表XI
研究号 制剂 皮肤评估 1 FluzoneA/P(1，2，4) 无 2 FluzoneA/P(2，3，5) 无 3 FluzoneA/P(2，5，7) 无 4 FluzoneA/P(3，5，7) 无 5 VaxigripTM A/P(3，5，7) 无 6 VaxigripTM A/P(5) 无 7 VaxigripTM A/P(5) 无 8 三价(6) 无 9 三价(6) 无 10 三价(6) 无 11 FluzoneA/P(6) 有 12 FluzoneA/P(6) 有 13 FluzoneA/P(6) 有 14 FluzoneA/P(6) 有 15 FluzoneA/P(6) 无 16 FluzoneA/P(6) 有
输送研究No.1-7
输送研究No.1-7针对两个微凸出设计，以下叫做MF-1和MF-2。 结果表明，无论哪种制剂，由MF-1微凸出设计进行的输送是高效的， 将40-90％低得涂层输送进了皮肤。
输送研究No.8-15
输送研究No.8-15集中在可提供平衡的输送效率和皮肤耐受性的 微凸出设计。由于出血主要是由刺入太深而引起的，直接与微凸出长 度相关联，选择来用于进一步评估的六个设计(MF-3、MF-4和MF-5) 中，每个都具有225μm的微凸出长度和1316微凸出/2cm2阵列的密 度。
包括八个微凸出阵列设计的研究覆盖了七个输送研究来评估它们 的药物输送性能。通过测定增加药物加样时在无毛豚鼠皮肤体内存在 的荧光素-疫苗含量来测试阵列设计。
现在参看图13A，显示了八个微凸出阵列设计的输送结果汇总。 发现MF-3阵列设计保持了其高输送效率，达140μg的药物涂层，这 是用对照设计所能输送的最大量药物固体涂层。MF-1、MF-6和MF-7 阵列设计的输送效率开始降低接近100μg的药物涂层，使得用这些设 计输送的最大量药物比MF-3更低。
为证实MF-3的性能，制备了DS No.15的一系列MF-3阵列，具 有大范围的涂覆量；涂覆了50到170μg的总固体。图13B中显示的输 送结果表明，DS No.15的输送效率曲线几乎与MF-3阵列在DS No. 8-14中观察到的效率曲线重叠(见表XI)。输送的量最初遵循70等斜 线，直到140μg的拐点，此时输送量就稳定了，尽管涂覆量在增加。 在阵列应用之后的涂层残留物对于较少的涂覆量来说是少的，在140μg 涂覆量时陡然增加，这与所输送涂覆量的突然变化是一致的。
皮肤耐受性(微出血)和穿透相关特性诸如保持性对于评估系统 的安全性和稳固性是重要的。因此将微凸出药贴应用到活的(每个系 统双份)和安乐死的无毛豚鼠(HGP)上分别为3和15分钟。一旦去 除药贴，就评估动物的皮肤反应/微出血(仅活动物)、保持性功能以 及用亚甲基蓝染色的应用部位的穿透评分。
对于保持性，具有保持性特性的微凸出设计(即MF-3、MF-4、 MF-5和MF-7)都显示了在皮肤中可观察到的保持性，随涂覆量增加 而减少。在高涂覆量(MF-3涂覆160μg，MF-1涂覆138μg)的任何 例子中都没有观察到出血。
通过抗原纯度和输送剂量来确定涂覆量的范围。考虑到粗疫苗40 ％的HA纯度，包括赋形剂的总涂覆量将是约150μg每2cm2阵列(对 于45μg HA剂量)和50μg每2cm2阵列(对于15μgHA剂量)。
输送研究No.16
输送研究No.16被用在了几种涂覆低剂量HA的微凸出阵列设计 上，约15μg/阵列，即每个阵列约60-70μg总涂层。包括四个设计 (MF-3、MF-5、MF-6和MF-7)的该研究证明了高剂量是最有效的。
四个阵列设计涂覆了总涂覆量60-70μg，这是基于与DS No.13& 14中所使用的相同的A/Panama/蔗糖制剂。现在参看表XII，显示了 未涂覆的和涂覆的阵列在保持性评分和出血倾向方面的比较。保持性 性能是根据1-5评分系统来评定的。
表XII
阵列设计 保持性(1-5等级) 出血 未涂覆 涂覆 未涂覆 涂覆 MF-6/1 5 4 100％ 25％ 2 5 5 100％ 50％ 3 5 4 100％ 20％ MF-3/1 4 3 75％ 25％ 2 5 4 100％ 50％ 3 4 4 75％ 25％ MF-5/1 4 4 50％ 4-5点 2 3 4 25％ 0 3 3 3 100％ 2-3点 MF-7/1 1 3 2-3点 0 2 3 3 50％ 0 3 3 1 100％ 0
保持性结果表明，(i)未涂覆的阵列优于涂覆的阵列，(ii)性能评 分等级遵循顺序MF-6～MF-3＞MF-5＞MF-5。出血倾向方面观察到了 同样的趋势。总的说来，MF-5设计在保持性和穿透方面是较强的，似 乎在低剂量时提供了更好的皮肤耐受性。
免疫原性研究
在无毛豚鼠(HGP)中进行了四项免疫原性研究。第一项研究确 定了使用肌肉内(IM)注射1、5和50μgA/Panama(H3N2)剂量的抗 体应答动力学和抗原剂量响应。这项研究证明了用1到50μg增加的 HA剂量的初次免疫产生了增加的抗体滴度。在加强免疫时(在的4周 进行)，观察到了1到5μg HA的剂量响应。然而，在5和50μg剂量 之间没有观察到统计差异。在加强免疫后2-3周观察到了峰值抗体滴度 (见图14A)。在总的HA特异性IgG滴度(经ELISA测定)与血凝 素抑制(HI)活性之间建立了关联(见图14B)。根据该数据，此后 使用5μg的HA剂量来评估制剂的HA效力。
进行了第二项免疫研究来评估几种HA/Panama(H3N2)制剂的相 对免疫原性。评估了含有HA/Panama(H3N2)的四种制剂：
(1)40-52mg/mL HA，10％两性洗涤剂3-14
(2)40-52mg/mL HA，5％两性洗涤剂3-14，pH10
(3)40-52mg/mL HA，10％Triton X100，pH10
(4)40-52mg/mL HA，10％Triton X100 pH10
将每种浓缩物的一份转移到钛盘表面上，使其干燥(即“干燥涂 覆”)。在研究中测试了液体浓缩物和干燥涂覆盘两者。在第0天(初 次)和第28天(加强)经IM途径将每种稀释制剂0.1mL体积(5μg 剂量)注射到HGP中。包括对照组，其由等量的5μg剂量(起始材料) 构成。
研究证明所有制剂都能够诱导抗HA的抗体应答，如通过ELISA 和HI分析所测定的(见图15A和15B)。然而，在各种HA制剂之间 存在差别。含有10％Triton X-100(液体或干燥涂覆)或10％SDS (干燥涂覆)的制剂具有降低的免疫效力。所有其它的HA制剂在与 使用起始材料的等量注射剂量相比时似乎没有统计意义。
进行了第三项研究来证明干燥涂覆在微凸出阵列上的单价 A/Panama(H3N2)涂层制剂能够诱导初次和二次HA特异性抗体应 答。包括了使用起始HA材料的IM对照组。使用唯一的微凸出阵列设 计(MF-1)。在微凸出阵列上测试了两种作为目标的HA涂覆剂量(5 和15μg/阵列)的全部4种HA制剂：
HA，两性洗涤剂(10％)，海藻糖(2.5％)
HA，吐温-80(2％)，蔗糖(5％)
HA，Pluronic F68(2％)，海藻糖(2.5％)，甘露糖(2.5％)
HA，蔗糖(5％)
总起来说，该研究的结果(血清HAU滴度)证明初次(滴28天) 和二次抗体(第49天)应答可使用HA涂覆的Macroflux系统来产生 (见图16A和16B)。而且，用药贴免疫的动物中产生了HA特异性 血清中和抗体。加强免疫之后，在更高的目标HA涂覆剂量时可观察 到一些制剂差异。用使用两性洗涤剂3-14/海藻糖的HA制剂免疫的 HGP产生了最高的平均HAI滴度。这个组的血清中和抗体滴度水平与 IM处理对照的最相似。
第四项研究通过HGP中钛微凸出阵列上干燥涂覆的三价流感制剂 的免疫原性测试来评估。研究包括评估两种三价涂层制剂、三种 Macroflux微凸出阵列设计以及两种HA涂覆剂量。三价流感制剂包括 两种A菌株(A/Panama/2007/99[H3N2]和A/New Caledonia/20/99 [H1N1])和一种B菌株(B/Shangdong/7/97)。以1∶1∶1的比例配制HA菌 株。含有三价HA的两种涂层制剂用蔗糖(5％)或者2)吐温80(2％)和 蔗糖(5％)来配制。微凸出阵列设计是MF-1、MF-3和MF-5(直径2 cm2)。加在微凸出阵列设计上的两种HA涂覆剂量定义为“低”(21-23 μg)和“高”(33-45μg)。数据证明三价Macroflux药贴可诱导对每 种HA菌株的初次抗HA抗体应答(HI滴度)(见图18)。使用Macroflux 阵列的两种三价制剂(蔗糖和吐温-80/蔗糖)免疫的HGP所产生的抗体 滴度水平比得上它们各自的肌肉内注射对照。对于抗HA应答来说， 在各种微凸出阵列设计之间或者蔗糖与吐温80/蔗糖制剂之间都没有 发现显著差异。在一些情况下，取决于HA菌株和处理组，观察到了 剂量响应，但并不总是这样。
总的说来，这些免疫原性研究表明表V中所示的每种制剂都是免 疫原性的，尽管相对于起始疫苗具有显著的制剂变化。
短期稳定性
上述讨论的预配过程不仅使抗原经受了冷冻，也经受了一系列应 力事件，包括膜渗滤期间的剪切应力以及冰/水介面和脱水/再水化引起 的应力。在冷冻干燥疫苗重构之后，溶液将如此经受10个循环的冷冻 /解冻(经液氮冷冻，立即在室温解冻)以评估对抗原稳定性的影响， 如果有。如通过ELISA所确定的，10个循环的冷冻/解冻之前和之后 的HA效力没有变化，表明了海藻糖或蔗糖保持了抗原稳定性。
比冷冻干燥还更有应力的工艺步骤是经有效的表面活性剂的再增 溶，诸如高浓度的SDS或两性洗涤剂并剧烈振荡(涡旋)。已知这些 表面活性剂通过改变天然分子的物理构象来变性蛋白质。对于疫苗抗 原，显著构象变化的结果可能是抗原性和免疫原性的完全丧失。在下 面的研究中评估了强表面活性剂存在下的再增溶影响。
在一系列预配步骤包括不用表面活性剂和用SDS(10％)、Triton- X 100(10％)或两性洗涤剂3-14(5和10％)来重构冷冻干燥疫苗之后， 在A/Panama疫苗上进行了SDS-PAGE/Western印迹分析。在考马斯 蓝染色凝胶的非还原条件下(左侧的SDS-PAGE)，显然起始疫苗中 存在的所有条带也存在于重构样品中，表明所评估的任何制剂都没有 可检测的降解。
当凝胶被再次被转移到膜上进行Western印迹分析时，在不同制 剂和起始疫苗之间没有注意到差异。反映HA蛋白和抗HA抗体之间的 结合的一系列条带主要以高分子量存在。根据匹配的条带和条带密度 (相对于起始疫苗)，可以断定，已被冷冻干燥并暴露于高浓度强表 面活性剂的制剂中的HA保持了抗原性。
在还原条件下，所有制剂都显示了类似于起始疫苗在SDS-PAGE 凝胶上的条带。Western印迹上的条带模式在所有制剂之间也都很好地 匹配。结合ELISA分析，HA似乎是稳固的，即使在大量的配制操作 包括用强表面活性剂在强烈涡旋之下的渗滤、浓缩、冷冻、脱水以及 再水化之后也保持了抗原性。
长期稳定性
研究了两种类型的稳定性来筛选和鉴别最佳制剂：(i)涂层的物理 稳定性和(ii)抗原的生化稳定性，这两者都需要在储存期间保持以保持 可输送的目标剂量。
物理稳定性
涂层的物理稳定性包括在特定温度储存一定时间周期之后涂层位 置和形态的保持。为有助于研究，将四种涂层制剂(No.3、5、6和7) 暴露于高温(65℃)达四周。
制剂5&6在65℃储存之前和之后的SEM形态表明，储存四周没 有发生变化。制剂3&7观察到了同样的结果，表明所有四种涂覆的制 剂即使在这样的高温下也是物理稳固的。
生化稳定性
参看表XIII，采用了相似的参数来研究抗原生化稳定性。该研究 涉及四项研究，以加速研究开始来使用单价菌株筛选制剂No.3、5、6 和7。在赋形剂稀释研究中测试了最稳定的制剂，其使用一系列赋形剂 组分中的其它两种菌株。然后将赋形剂稀释研究中确定的优选组合物 在三价制剂中测试，将制剂涂覆在包装于箔袋中的微凸出阵列上，作 为日常稳定性研究的一部分。进行了该最终包装稳定性研究来研究涂 层中的含水量对抗原稳定性的影响。
表XIII
研究类型 制剂 条件 指示稳定性的 分析方法 加速的 A/Panama 3，5，6， 7(表5) 40℃，室温 ELISA 稀释 A/New Caledonia和 B/Victoria 40℃，室温 SRID 包装 三价 2-8，25和40℃ SRID 水份影响 三价 40℃ SRID
加速的稳定性研究
将四种A/Panama制剂(制剂No.3、5、6和7)涂覆在微凸出阵 列上。将每个涂覆的阵列放置在20mL的带有螺旋顶盖的闪烁管中。 将每个管子在阵列操作之后真空干燥以去除吸收的水分，然后密封。 将所有样品在40℃烘箱中保温1、2、4和8周。在每个时间点取出三 个样品(三份)并经ELISA分析HA效力。
现在参看图18，显示了四种制剂的稳定性曲线。两性洗涤剂制剂 (制剂No.3)存在明显的趋势，它的HA效力看起来随保温时间而降 低。也很显然的是，吐温/蔗糖制剂在最终时间点(第8周)时似乎丧 失了大多数HA效力。
在保持效力方面，仅有蔗糖的制剂的稳定性是第三好的制剂， Pluronic/海藻糖/甘露糖制剂是最好的。
然后将以两种不同剂量涂覆的三种上述制剂在室温(真空下)储 存达25周。通过ELISA监测HA效力。参看表IV，海藻糖/甘露糖/ Pluronic制剂(制剂No.7)显示了降低的效力的趋势。其它两种制剂 在比较0时间时的效力时似乎保持了抗原效力。对于制剂No.5和7， 在40℃和室温储存的样品之间的稳定性趋势好象是不同的。
将包括单独的蔗糖以及蔗糖-吐温的两种三价制剂涂覆在阵列上并 储存在密封的、氮气净化的箔袋中40℃达3个月以及5℃和25℃达6 个月。经SRID分析法分析了三种菌株A/Panama(A/P)、A/New Caledonia(A/NC)和B/Shangdong(B/SD)每一种的效力。单独的蔗糖以 及蔗糖-吐温制剂稳定性研究的结果分别示于图19和20。如图19和20 所反映的，两种制剂中所有三种菌株的涂覆阵列在5℃和25℃储存达6 个月都显示了非常好的稳定性。
赋形剂稀释研究
为确定蔗糖制剂的最佳赋形剂成分，将B/Victoria菌株(18％的 HA纯度)与蔗糖按照HA∶蔗糖＝1∶1、1∶2和1∶4的重量比配制。将涂覆 的阵列在40℃保温达8周。将样品储存在-80℃，直到分析之时将所有 样品与1mL水重构，通过SRID在单独凝胶上分析以及通过BCA在 单独的96孔板上分析以消除分析方法之间的差异。稳定性曲线示于图 21中。
在头两周的储存期间观察到的初始降低之后，HA∶蔗糖＝1∶2&1∶4 的制剂似乎在即使40℃的八周始终都是稳定的。然而，对于HA∶蔗糖 ＝1∶1的制剂来说，延续了降低趋势。据信这个现象是由于蛋白酶的存 在而引起的，在纯化时没有完全去除蛋白酶，可能在我们的工艺中被 激活了。
随着蔗糖量相对于HA的增加，似乎存在稳定化效应。用于该研 究的B/Victoria批具有极低的HA纯度，相对于存在的总蛋白质为约 15％，并不被预期具有未来的粗起始材料(≥HA纯度)的特征。然而， 增加蔗糖重量百分比而产生的稳定化效应可能并不能观察到与更高 HA纯度的起始材料相等的相对程度。例如，100mg的15％HA纯度 的起始材料在以1∶1、1∶2和1∶4的HA∶蔗糖比配制时，需要15、30和 45mg的蔗糖。这产生了分别为13、23和37％蔗糖的干重比。然而， 100mg的40％HA纯度的起始材料在以同样的三种比例配制时，将需 要40、80和160mg蔗糖，产生了29、44和54％的蔗糖干重比。结果， 高纯度的1∶1制剂已经接近了1∶4低纯度制剂的干重蔗糖含量。在这些 水平，蔗糖的稳定化效应已经最大可能地达到了稳定水平，任何进一 步的增加蔗糖含量可能将对产物的稳定性影响很小或者没有影响。由 于这个缘故以及为了进一步简化粗加工，将预冻干溶液的蔗糖固定比 例设定为1.0％。由于冻干粉末典型地被重构到1/5的原始预冻干体 积，这将产生5％蔗糖的涂层溶液浓度。
总结
如本领域普通技术人员将可以理解的是，依靠独特的预配过程， 可以将完全的人剂量流感疫苗即45μg的血凝素通过涂覆的微凸出阵 列而经皮肤输送，其中至少70％的流感疫苗被输送到了皮肤中。抗原 也保持了在皮肤中引发强烈的抗体和血清保护性免疫应答的免疫性。 进一步地，干燥的涂覆疫苗制剂基本上不含防腐剂，能够保持至少六 个月的室温稳定性。
不背离本发明的精神和范围，普通技术人员可对发明进行各种改 变和修正，以使其适用于各种应用和情况。因此，这些改变和修正将 适当地、合理地并打算包括在下面权利要求的完全等效的范围中。
相关申请的交叉引用
本申请要求2004年4月1日提交的美国临时申请No.60/559,153 的权益。
因此，原则上来说，经皮肤的输送提供了施用活性试剂的方法， 否则就将需要通过皮下注射或静脉注射来输送。如这里使用的单词“经 皮肤”是一般术语，是指通过皮肤将活性试剂(例如诸如药物的治疗 剂或者诸如疫苗的免疫活性试剂)输送到局部组织或全身循环系统， 它基本上不会切割或穿透皮肤，诸如用外科手术刀切割或者用皮下注 射针刺穿皮肤。经皮肤的试剂输送包括通过被动扩散的输送以及基于 外部能源，诸如电(例如离子电渗疗法)和超声波(例如超声透入疗 法)的输送。
如本领域所公知的，皮肤不仅是保护身体免受外部危害的物理屏 障，也是免疫系统的组成部分。皮肤的免疫功能源自用先天性和获得 性免疫功能的存活表皮和真皮的固有细胞和体液组分的集合，总称为 皮肤免疫系统。
皮肤免疫系统的一种最重要的组分是朗氏细胞(LC)，它是在存 活表皮中发现的特化的抗原呈递细胞。LC细胞由于它们在周围细胞之 间的树突的广泛分枝而形成了半连续的网络。LC细胞的正常功能是检 测、捕获并呈递抗原以引起对侵入病原体的免疫应答。LC细胞执行它 的功能是通过内化上表皮抗原、输送到区域性皮肤引流淋巴结并将加 工过的抗原呈递给T细胞。
皮肤免疫系统的有效性对已经靶向到皮肤的接种策略的成功和安 全性负责。用活的减毒天花疫苗经划破皮肤接种，已经成功地导致了 致死性天花疾病在全球的灭绝。使用1/5到1/10的标准IM剂量的不同 疫苗的皮内注射已经用许多疫苗有效地诱导了免疫应答，而低剂量的 狂犬病疫苗已经得到商业许可用于皮内应用。
作为备选，经皮肤输送提供了施用生物活性试剂特别是疫苗的方 法，否则就将需要通过皮下注射、静脉内注射或口服输送。经皮肤的 疫苗输送在这两个方面都提供了改进。当与口服输送比较，经皮肤输 送避免了消化道的苛刻环境，绕过了胃肠道的药物代谢，减少了首过 效应，并且避免了由于消化和肝脏酶而可能导致的失活。相反，疫苗 在经皮肤施用过程中不须经过消化道。
更为普通的被动性经皮肤的试剂输送典型地包括含有高浓度活性 试剂的药物储存器。该药物储存器适合于接触皮肤，它使得试剂能够 扩散通过皮肤并进入受试者的身体组织或血流。
增加被动性经皮肤扩散的试剂流量的一种普通方法涉及用皮肤渗 透增强剂预处理皮肤或者与试剂共输送。当应用到试剂输送所通过的 身体表面上时，渗透增强剂增强了试剂通过的流量。然而，由于蛋白 质的大小，这些方法中在增强经皮肤的蛋白质流量方面的效力已经被 限制了，至少对于较大的蛋白质来说是这样的。
为了增强经皮肤输送的试剂的量，也已经有许多技术和系统被开 发来机械地穿透或破坏最外面的皮肤层，从而形成了进入皮肤的通 道。被称为划痕器的早期接种设备一般包括许多尖头或针，它们被应 用到皮肤上并在应用区域划破或制造小的切口。将疫苗应用到局部皮 肤上，诸如美国专利No.5,487,726中披露的，或者作为湿液体应用到 划痕器的尖头上，诸如美国专利No.4,453,926、4,109,655和3,136,314 中披露的。
划痕器已经被建议用于皮肤内的疫苗输送，部分地是因为只需要 少量疫苗输送到皮肤中来有效免疫受试者。进一步地，所输送疫苗的 量并不是特别关键的，因为过量也会达到令人满意的免疫。
然而，在使用划痕器输送活性试剂诸如疫苗中的严重缺点就是确 定经皮肤的试剂流量和最后得到的输送剂量的困难。而同样，由于皮 肤偏转并对抗穿刺的弹性、变形和反弹性质，微小穿刺元件经常不会 均匀地穿透皮肤皮肤和/或皮肤刚刺穿就擦去了试剂的液体涂层。
此外，由于皮肤的自修复过程，在皮肤中形成的刺孔或狭缝在从 角质层去除穿刺元件后易于愈合。这样，皮肤的弹性性质就起作用， 去除在这些微小元件穿透到皮肤中时就已经应用到微小穿刺元件上的 活性试剂液体涂层。而且，由穿刺元件形成的微小狭缝在去除设备后 会迅速愈合，这样就限制了液体试剂溶液通过穿刺元件所形成的通 道，而限制了这些设备的经皮肤的流量。
采用微小皮肤穿刺元件来增强经皮肤的试剂输送的其它系统和装 置披露于美国专利No.5,879,326、3,814,097、5,250,023、3,964,482、重 授权专利No.25,637以及PCT公开No.WO 96/37155、WO 96/37256、 WO 96/17648、WO 97/03718、WO 98/11937、WO 98/00193、WO 97/48440、WO 97/48441、WO 97/48442、WO 98/00193、WO 99/64580、 WO 98/28037、WO 98/29298和WO 98/29365；所有这些都以它们的整 体引入这里作为参考。
所披露的系统和装置采用各种形状和大小的穿刺元件来刺穿皮肤 的最外层(即角质层)。这些参考文献中披露的穿刺元件通常从薄的、 扁平的部件诸如垫板或薄板上垂直延伸。这些设备中的一些穿刺元件 非常小，一些元件具有仅仅大约25-400微米的微凸出长度以及大约5- 50微米的微凸出厚度。这些微小穿刺/切割元件在角质层中产生了相对 小的微小狭缝/微小切口来增强经皮肤的试剂输送。
所披露的系统典型地进一步包括容纳试剂的储存器，还有将试剂 从储存器转移通过角质层的输送系统，诸如通过设备自身的中空尖 头。这种设备的一个例子披露于WO 93/17754，其具有液体试剂储存 器。然而，必须将储存器加压以迫使液体试剂通过微小的管状元件并 进入皮肤中。这种设备的缺点包括增加可压缩液体储存器而增加的复 杂性和费用，以及由于压力驱动的输送系统的存在而带来的复杂性。
如美国专利申请No.10/045,842中所披露的，将要输送的活性试剂 涂覆在微凸出上而不是包含在物理储存器中也是可能的，该申请在这 里整体引入作为参考。这就消除了分开的物理储存器以及开发储存器 特异性的试剂制剂或组合物的必要性。
然而，涂覆的微凸出系统的缺点是，所输送的活性试剂特别是免 疫活性试剂的最大量是有限的，因为当涂覆厚度增加时微凸出(及其 阵列)穿透角质层的能力降低了。进一步地，为了用其上设置的厚的 涂覆微凸出来有效穿透角质层，必须增加敷贴器的冲击能量，这会引 起冲击时无法忍受的感觉。
因此，能够通过涂覆的微凸出容易地以免疫学(或生物学)有效 量施用而提供高浓度的免疫活性试剂特别是液体流感疫苗将是需要 的。
因此，本发明的一个目的是提供用于经皮肤输送免疫活性试剂的 装置和方法，其基本上降低或消除了与现有技术的免疫活性试剂输送 方法和系统相关的缺点和不足。
本发明的另一个目的是提供用于经皮肤输送流感疫苗的装置和方 法，其包括用生物相容涂层涂覆的微凸出，该涂层上设置有流感疫苗。
本发明的另一个目的是提供用于经皮肤输送流感疫苗的装置和方 法，其包括具有多个微凸出的微凸出部件，其中微凸出是用流感疫苗 涂层制剂涂覆的。
本发明还有另一个目的是提供流感疫苗，它可以通过涂覆的微凸 出系统容易地以免疫学有效量施用。
本发明的另一个目的是提供基本上没有防腐剂的流感疫苗。
本发明还有另一个目的是提供具有增加的保存期的流感疫苗。
发明概述
根据上面的以及在下面将要提及的和将变得显而易见的那些目 的，根据本发明的用于经皮肤输送免疫活性试剂的装置和方法，通常 包括具有微凸出部件(或系统)的输送系统，该微凸出部件包括多个 适合于刺穿角质层进入到下面的表皮层或者表皮和真皮层的微凸出 (或其阵列)，该微凸出部件具有设置在其上的包括免疫活性试剂的 生物相容的涂层。在本发明的优选实施方案中，生物相容的涂层是由 免疫活性试剂涂层制剂形成的。
在本发明的优选实施方案中，免疫活性试剂包括流感疫苗。
在备选实施方案中，免疫活性试剂包括抗原性试剂或疫苗，选自 病毒和细菌、蛋白质为基础的疫苗、多糖为基础的疫苗以及核酸为基 础的疫苗。
合适的抗原性试剂包括但不限于蛋白质形式的抗原、多糖缀合 物、寡糖以及脂蛋白。这些亚基疫苗包括百日咳博德特氏菌(重组PT 疫苗-非细胞的)、破伤风梭菌(纯化的、重组的)、白喉棒状杆菌(纯化 的、重组的)、巨细胞病毒(糖蛋白亚基)、A族链球菌(糖蛋白亚基、与 破伤风类毒素的复合糖A族多糖、与毒素亚基载体连接的M蛋白/肽、 M蛋白、多价的型特异性表位、半胱氨酸蛋白酶、C5a肽酶)、乙型肝 炎病毒(重组的PreS1、Pre-S2、S、重组的核心蛋白)、丙型肝炎病毒(重 组表达的表面蛋白和表位)、人乳头瘤病毒(衣壳蛋白、TA-GN重组蛋 白L2和E7[来自HPV-6]、来自HPV-11的MEDI-501重组VLP L1、 四价的重组BLP Ll[来自HPV-6]、HPV-11、HPV-16和HPV-18、 LAMP-E7[来自HPV-16])、肺炎军团菌(纯化的细菌表面蛋白)、脑膜 炎奈瑟氏球菌(与破伤风类毒素的复合糖)、绿脓杆菌(合成肽)、风疹病 毒(合成肽)、肺炎链球菌(缀合到脑膜炎球菌B OMP的复合糖[1，4，5，6B， 9N，14，18C，19V，23F]、缀合到CRM197的复合糖[4，6B，9V，14，18C， 19F，23F]、缀合到CRM1970的复合糖[1，4，5，6B，9V，14，18C，19F， 23F]、梅毒密螺旋体(表面脂蛋白)、水痘带状疱疹病毒(亚基、糖蛋白) 以及霍乱弧菌(缀合的脂多糖)。
完整的病毒或细菌包括但不限于减毒的或杀死的病毒，诸如细胞 巨化病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、风疹病毒 和水痘带状疱疹，减毒的或杀死的细菌，诸如百日咳博德特氏菌、破 伤风梭菌、白喉棒状杆菌、A族链球菌、肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟氏 球菌、绿脓杆菌、肺炎链球菌、梅毒密螺旋体和霍乱弧菌，以及它们 的混合物。
另外的商业上可获得的含有抗原性试剂的疫苗包括但不限于流感 疫苗、莱姆病疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、水痘疫苗、 天花疫苗、肝炎疫苗、百日咳疫苗以及白喉疫苗。
包含核酸的疫苗包括但不限于单链和双链核酸，诸如超螺旋质粒 DNA；线性质粒DNA；粘粒；细菌人工染色体(BACs)；酵母人工染色 体(YACs)；哺乳动物人工染色体；以及RNA分子，诸如mRNA。核酸 也可以与蛋白质试剂偶联或者可以包括一种或多种化学修饰，诸如硫 代磷酸酯部分。
与疫苗抗原一起构成疫苗的合适的免疫应答增强佐剂包括磷酸铝 凝胶；氢氧化铝；α葡聚糖：β-葡聚糖；霍乱毒素B亚基；CRL1005； 具有平均值x＝8和y＝205的ABA嵌段共聚物；γ菊粉：线性的(无支 链的)β-D(2-＞1)多聚呋喃果糖氧基-α-D-葡萄糖；Gerbu佐剂：N-乙 酰葡糖胺-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)，二 甲基双十八烷基氯化铵(DDA)，L-脯氨酸锌盐复合物(Zn-Pro-8)； 咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；ImmTherTM：N- 乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-甘油二棕榈酸酯； MTP-PE脂质体：C59H108N6O19PNa-3H2O(MTP)；Murametide：Nac- Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3；Pleuran：β-葡聚糖；QS-21；S-28463：4- 氨基-a，a-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇；salvo肽： VQGEESNDK·HCl(IL-1β 163-171肽)；苏氨酰-MDP(TermurtideTM)： N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺，以及白介素18、IL-2 IL-12、IL- 15，佐剂也包括DNA寡核苷酸，诸如含有CpG的寡核苷酸。此外，也 可以使用编码免疫调节淋巴因子诸如IL-18、IL-2 IL-12、IL-15、IL-4、 IL10、γ-干扰素和NFκB调节信号蛋白质的核酸序列。
在本发明的一个实施方案中，微凸出部件具有至少大约10个微凸 出/cm2的微凸出密度，优选超过大约100个微凸出/cm2，更优选在大约 200-3000个微凸出/cm2的范围。进一步地，每个微凸出优选具有大约 50-145微米范围的长度，更优选在大约70-140微米的范围。
在一个实施方案中，微凸出部件由不锈钢、钛、镍钛合金或者类 似的生物相容材料诸如聚合材料构成。
在备选实施方案中，微凸出部件由不导电材料诸如聚合物构成。 备选地，微凸出部件可用诸如Parylene的不导电材料涂覆。
在本发明的一个实施方案中，生物相容涂层具有小于100微米的 厚度。在优选实施方案中，生物相容涂层具有大约2-50微米范围内的 厚度。
应用到微凸出部件上形成固体生物相容涂层的涂层制剂可包括含 有免疫活性试剂的水性或非水性制剂。在优选实施方案中，涂层制剂 包括水性制剂。
在本发明的一个实施方案中，涂层制剂包括至少一种表面活性 剂，可以是两性离子的、两性的、阳离子的、阴离子的或非离子的， 合适的表面活性剂包括但不限于sodium lauroamphoacetate，十二烷基 硫酸钠(SDS)，氯化十六烷基吡啶(CPC)，十二烷基三甲基氯化 铵(TMAC)，烷基苄基二甲基氯化铵，聚山梨酸酯诸如吐温20和吐 温80，其它山梨聚糖衍生物诸如山梨醇月桂酸酯，以及烷氧基化醇诸 如月桂基聚氧乙烯(4)醚。
在本发明进一步的实施方案中，涂层制剂包括至少一种具有两亲 性质的聚合材料或聚合物，可包括但不限于葡聚糖，羟乙基淀粉 (HES)，纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基甲基纤 维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素(MC)、羟乙 基甲基纤维素(HEMC)、或乙基羟基-乙基纤维素(EHEC)，以及 pluronics。
在本发明的一种实施方案中，在涂层制剂中呈现两亲性质的聚合 物的浓度优选在大约0.001-70wt.％的范围，更优选在大约0.01-50wt.％ 的范围，甚至更优选在涂层制剂大约0.03-30wt.％的范围。
在本发明的一个实施方案中，在固体生物相容涂层中呈现两亲性 质的聚合物的浓度优选在大约0.002-999wt.％的范围，更优选在固体生 物相容涂层大约0.1-60wt.％的范围。
在另一个实施方案中，涂层制剂包括亲水性的聚合物，选自下面 的组：聚(乙烯醇)、聚(环氧乙烷)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、 聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇以及它们的混合物和类似的聚合物。
在优选实施方案中，亲水性聚合物在涂层制剂中的浓度优选在大 约0.001-90wt.％的范围，更优选在大约0.01-20wt.％的范围，甚至更 优选在涂层制剂大约0.03-10wt.％的范围。
在优选实施方案中，亲水性聚合物在固体生物相容涂层中的浓度 在大约.002-99.9wt.％的范围，更优选在涂层制剂大约0.1-20wt.％的范 围。
在本发明的另一实施方案中，涂层制剂包括生物相容载体，其可 包括但不限于人白蛋白、生物工程化的人白蛋白、聚谷氨酸、聚天冬 氨酸、聚组氨酸、戊聚糖多硫酸酯、聚氨基酸、蔗糖、海藻糖、松三 糖、棉子糖和水苏糖。
优选地，生物相容载体在涂层制剂中的浓度优选在大约0.001-90 wt.％的范围，更优选在大约2-70wt.％的范围，甚至更优选在涂层制剂 大约5-50wt.％的范围。
优选地，生物相容载体在固体生物相容涂层中的浓度在大约 0.002-99.9wt.％的范围，更优选在固体生物相容制剂大约0.1-95wt.％ 的范围。
在进一步的实施方案中，涂层制剂包括稳定剂，其可包括但不限 于非还原糖、多糖、还原糖或者DNA酶抑制剂。
在另一个实施方案中，涂层制剂包括血管收缩剂，可包括但不限 于阿米福林、咖啡氨醇、环喷他明(cyclopentamine)、脱氧肾上腺素、 肾上腺素、苯赖加压素(felypressin)、茚唑啉(indanazoline)、美 替唑啉(metizoline)、米多君(midodrine)、萘唑啉(naphazoline)、 盐酸可巴君、二甲己胺(octodrine)、鸟氨加压素(ornipressin)、羟 甲唑啉、苯肾上腺素、苯基乙醇胺、苯基丙醇胺、六氢脱氧麻黄碱 (propylhexedrine)、伪麻黄碱、四氢唑啉、曲马唑啉(tramazoline)、 异庚胺(tuaminoheptane)、泰马唑啉(tymazoline)、血管加压素、 丁苄唑啉(xylometazoline)以及它们的混合物。最优选的血管收缩剂 包括肾上腺素、萘唑啉、四氢唑啉、茚唑啉、美替唑啉、曲马唑啉、 泰马唑啉、羟甲唑啉和丁苄唑啉。
如果采用，血管收缩剂的浓度优选在涂层大约0.1wt.％到10wt.％ 的范围。
在本发明的另一个实施方案中，涂层制剂包括至少一种“通道开 放调节剂”，可包括但不限于渗透压调节剂(例如氯化钠)，两性离 子化合物(例如氨基酸)，以及抗炎试剂诸如倍他米松21-磷酸二钠盐、 去炎舒松21-磷酸二钠、盐酸氢可松氨酯、氢化可的松21-磷酸二钠盐、 甲基强的松龙21-磷酸二钠盐、甲基强的松龙21-琥珀酸钠盐、帕拉米 松磷酸二钠盐、强的松龙21-琥珀酸钠盐，以及抗凝血剂诸如柠檬酸、 柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)、糊精硫酸钠、阿司匹林和EDTA。
优选地，本发明的涂层制剂具有小于大约5泊的粘度，更优选在 大约0.3-2.0泊的范围。
根据本发明的一个实施方案，输送免疫活性试剂的方法包括下面 的步骤：(i)提供具有多个微凸出的微凸出部件，(ii)提供粗疫苗，(iii) 将粗疫苗进行切向流过滤来提供疫苗溶液，(iv)加入至少一种赋形剂 (例如蔗糖、海藻糖或甘露糖)到疫苗溶液中，(v)冷冻干燥疫苗溶液 以形成疫苗产品，(vi)用第一溶液(例如水)将疫苗产品重构以形成 疫苗涂层制剂，(vii)用疫苗涂层制剂涂覆微凸出部件，以及(viii)将涂 覆的微凸出部件应用到受试者的皮肤上。
在一个实施方案中，疫苗包括流感疫苗。优选地，该方法包括输 送大约45μg血凝素的步骤。更优选地，输送疫苗的步骤包括将至少大 约70％的疫苗输送到富含APC的表皮层。
在另一个实施方案中，本发明配制疫苗溶液的方法包括下面的步 骤：(i)提供粗疫苗，(ii)将粗疫苗进行切向流过滤来提供疫苗溶液， (iii)加入至少一种赋形剂到疫苗溶液中，(v)冷冻干燥疫苗溶液以形成 疫苗产品。在一个实施方案中，疫苗产品显示出比粗疫苗至少浓500 倍的浓度。优选地，疫苗产品保持室温稳定性至少大约六个月。
附图简述
从下文以及对本发明优选实施方案更详细的描述来看，进一步的 特征和优点将是显而易见的，如附图中所图解阐明的，其中同样的参 考符号通常在整个图中都指同一部分或元件，其中：
图1是流感病毒粒子的图解；
图2是根据本发明的微凸出部件的一个实施方案的部分透视图；
图3是图2中所显示的根据本发明在微凸出上沉积有生物相容涂 层的微凸出部件的透视图；
图4是根据本发明的具有粘性衬垫的微凸出部件的截面侧视图；
图5是根据本发明的微凸出部件的另一个实施方案的部分透视 图；
图6是根据本发明的止动器的截面侧视图，止动器上设置有微凸 出部件；
图7是图6中所显示的止动器的透视图；
图8是敷贴器和图6中所显示的止动器的透视图；
图9是根据本发明的预配过程的流程图；
图10是根据本发明的吸光度相对于pH的图解说明，图解阐明了 pH对降低溶液浊度的效果；
图11是疫苗Fluzone和VaxigripTM的粘度相对于rpm的图解说 明；
图12是A/New Caledonia菌株的粘度相对于温度的图解说明，该 菌株在22.5mg/mL时具有15％的HA纯度；
图13A和13B是汇总了根据本发明的各种微凸出阵列设计的疫苗 输送的图解说明；
图14A是各种剂量的HA(A/Panama菌株)的平均抗-HA滴度相 对于时间的图解说明；
图14B是总的A/Panama特异性IgG滴度相对于HI活性的图解说 明；
图15A和15B是HA(A/Panama菌株)的几种制剂的免疫原性的条 形图，图解阐明了抗-A/Panama特异性的IgG抗体和HI活性；
图16A和16B是干燥涂覆在微凸出上的HA(A/Panama菌株)的几 种制剂的免疫原性的条形图，图解阐明了第28天和第49天时的抗-HA IgG抗体活性和HI活性；
图17是干燥涂覆在微凸出上的三价HA(A/Panama、A/New Caledonia和B/Shangdong菌株)的几种制剂的免疫原性的一系列条形 图，图解阐明了HI活性；
图18是HA的量相对于时间的图解说明，图解阐明了根据本发明 的几种涂层制剂在40℃存储达八周的稳定性曲线图；
图19和20是两种三价制剂的条形图，图解阐明了根据本发明的 制剂在40℃存储达三个月以及5℃和40℃达六个月的稳定性曲线图； 以及
图21是SRID/BCA相对于时间的图解说明，显示了根据本发明用 蔗糖配制的并在40℃存储达八周的A/New Caledonia菌株的稳定性曲 线图。
发明详述
在详细描述本发明之前，要理解的是本发明并不限于特定的例证 性材料、制剂、方法或结构等等，当然可以改变。这样，尽管与这里 描述的那些相类似或相当的许多材料和方法都可用于实施本发明，但 是这里描述了优选材料和方法。
也要理解的是这里使用的术语仅仅是为了描述发明的特定实施方 案，并不打算是限制性的。
除非另外定义，这里使用的所有技术和科学术语的意义是与本发 明所属技术领域普通技术人员所通常理解的意义相同的。
进一步地，这里引用的所有出版物、专利和专利申请都被整体引 入这里作为参考，无论是在前文中或是在后文中。
最后，如在该说明书和所附的权利要求中所使用的，单数形式“一 个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非内容中另外清楚地规定 了。这样，例如提及“一种免疫活性试剂”就包括两种或多种这样的 试剂；提及“一种微凸出”就包括两种或多种这样的微凸出等等。
定义
如这里使用的术语“经皮肤的”意指输送试剂进入和/或通过皮肤 用于局部或全身治疗。
如这里使用的术语“经皮肤的流量”意指经皮肤输送的速度。
如这里使用的术语“共输送”意指辅助试剂的经皮肤施用在试剂 输送之前，或在试剂的经皮肤流动之前和期间，或在试剂的经皮肤流 动期间，或在试剂的经皮肤流动期间和之后，和/或试剂的经皮肤流动 之后。此外，两种或多种免疫活性试剂可以被配制到本发明的生物相 容涂层中，形成不同免疫活性试剂的共输送。
如这里使用的术语“生物学活性试剂”是指含有活性试剂或药物 的物质组合物或混合物，当以治疗有效量施用时是药学有效的。这种 活性试剂的例子包括但不限于小分子量化合物、多肽、蛋白质、寡核 苷酸、核酸以及多糖。
如这里使用的术语“免疫活性试剂”是指含有任意和所有来源的 抗原性试剂和/或“疫苗”的物质组合物或混合物，当以免疫学有效量 施用时能够触发有利的免疫应答。免疫活性试剂的特殊例子是流感疫 苗。
免疫活性试剂的更多例子包括但不限于病毒和细菌、蛋白质为基 础的疫苗、多糖为基础的疫苗以及核酸为基础的疫苗。
合适的免疫活性试剂包括但不限于蛋白质形式的抗原、多糖缀合 物、寡糖以及脂蛋白。这些亚基疫苗包括百日咳博德特氏菌(重组PT 疫苗-非细胞的)、破伤风梭菌(纯化的、重组的)、白喉棒状杆菌(纯化的、 重组的)、巨细胞病毒(糖蛋白亚基)、A族链球菌(糖蛋白亚基、与破伤 风类毒素的复合糖A族多糖、与毒素亚基载体连接的M蛋白/肽、M 蛋白、多价的型特异性表位、半胱氨酸蛋白酶、C5a肽酶)、乙型肝炎 病毒(重组的PreS 1、Pre-S2、S、重组的核心蛋白)、丙型肝炎病毒(重 组表达的表面蛋白和表位)、人乳头瘤病毒(衣壳蛋白、TA-GN重组蛋 白L2和E7[来自HPV-6]、来自HPV-11的MEDI-501重组VLP L1、 四价的重组BLP Ll[来自HPV-6]、HPV-11、HPV-16和HPV-18、 LAMP-E7[来自HPV-16])、肺炎军团菌(纯化的细菌表面蛋白)、脑膜 炎奈瑟氏球菌(与破伤风类毒素的复合糖)、绿脓杆菌(合成肽)、风疹病 毒(合成肽)、肺炎链球菌(缀合到脑膜炎链球菌B OMP的复合糖[1，4，5， 6B，9N，14，18C，19V，23F]、缀合到CRM197的复合糖[4，6B，9V，14， 18C，19F，23F]、缀合到CRM1970的复合糖[1，4，5，6B，9V，14，18C，19F， 23F]、梅毒密螺旋体(表面脂蛋白)、水痘带状疱疹病毒(亚基、糖蛋白) 以及霍乱弧菌(缀合的脂多糖)。
完整的病毒或细菌包括但不限于减毒的或杀死的病毒，诸如细胞 巨化病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、风疹病毒 和水痘带状疱疹，减毒的或杀死的细菌，诸如百日咳博德特氏菌、破 伤风梭菌、白喉棒状杆菌、A族链球菌、肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟氏 球菌、绿脓杆菌、肺炎链球菌、梅毒密螺旋体和霍乱弧菌，以及它们 的混合物。
许多商业上可获得的含有对本发明有用的抗原性试剂的疫苗包括 但不限于流感疫苗、莱姆病疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫 苗、水痘疫苗、天花疫苗、肝炎疫苗、百日咳疫苗以及白喉疫苗。
也可根据本发明的方法输送的包含核酸的疫苗包括但不限于单链 和双链核酸，诸如超螺旋质粒DNA；线性质粒DNA；粘粒；细菌人工 染色体(BACs)；酵母人工染色体(YACs)；哺乳动物人工染色体；以及 RNA分子，诸如mRNA。
核酸的大小可达数千个千碱基。核酸也可以与蛋白质试剂结合或 者可以包括一种或多种化学修饰，诸如硫代磷酸酯部分。
与疫苗抗原一起构成疫苗的合适的免疫应答增强佐剂包括但不限 于磷酸铝凝胶；氢氧化铝；α葡聚糖：β-葡聚糖；霍乱毒素B亚基； CRL1005；具有平均值x＝8和y＝205的ABA嵌段共聚物；γ菊粉：线 性的(无支链的)β-D(2-＞1)多聚呋喃果糖氧基-α-D-葡萄糖；Gerbu 佐剂：N-乙酰葡糖胺-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺 (GMDP)，二甲基双十八烷基氯化铵(DDA)，L-脯氨酸锌盐复合 物(Zn-Pro-8)；咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺； ImmTherTM：N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L-Ala- 甘油二棕榈酸酯；MTP-PE脂质体：C59H108N6O19PNa-3H2O(MTP)； Murametide：Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3；Pleuran：β-葡聚糖； QS-21；S-28463：4-氨基-a，a-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇；salvo 肽：VQGEESNDK·HCl(IL-1β163-171肽)；苏氨酰-MDP (TermurtideTM)：N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺，以及白介素 18、IL-2 IL-12、IL-15，佐剂也包括DNA寡核苷酸，诸如含有CpG的 寡核苷酸。此外，也可以使用编码免疫调节淋巴因子诸如IL-18、IL-2 IL-12、IL-15、IL-4、IL10、γ-干扰素和NF κB调节信号蛋白质的核 酸序列。
如这里使用的术语“生物学有效量”或“生物学有效速度”是指 刺激或启动期望的免疫学的并且经常是有利的结果所需要的免疫活性 试剂的量或速度。本发明的涂层中所采用的免疫活性试剂的量将是这 样的量，这个量对于输送为获得期望的免疫学结果所需要的免疫活性 试剂的量来说是必需的。实际上，这将是变化很大的，取决于所输送 的特定免疫活性试剂、输送的部位以及用来输送免疫活性试剂到皮肤 组织中的溶解和释放动力学。
如同本领域普通技术人员将能理解的是，被输送的免疫活性试剂 的剂量也可以通过改变微凸出阵列(或药贴)的大小、密度等等而被 改变或操纵。
如这里使用的术语“涂层制剂”意指并包括自由流动的组合物或 混合物，采用它来涂覆微凸出和/或其阵列。
如这里使用的术语“生物相容涂层”和“固体涂层”意指并包括 基本上呈固体状态的“涂层制剂”。
如这里使用的术语“微凸出”是指适合于刺穿或切穿活体动物特 别是哺乳动物更特别是人的皮肤的角质层进入下面的表皮层或者表皮 和真皮层的穿刺元件。
如这里使用的术语“微凸出部件”通常意指包括多个排列成阵列 来刺穿角质层的微凸出的微凸出阵列。微凸出部件的形成可通过从薄 板上蚀刻或冲孔多个微凸出、并将微凸出从薄板上折叠或弯曲形成诸 如图2所显示的设置。微凸出部件也可用其它已知的方式形成，诸如 通过沿每个条带的边缘形成一个或多个具有微凸出的条带，其披露于 美国专利No.6,050,988，将其整体引入这里作为参考。
在一个实施方案中，微凸出部件具有微凸出密度为至少大约10个 微凸出/cm2的阵列，优选至少大约100个微凸出/cm2，更优选在大约 200-3000个微凸出/cm2的范围。
如上所述，本发明包括用于经皮肤输送免疫活性试剂的包括具有 微凸出部件(或系统)的装置和方法，该微凸出部件包括多个适合于 刺穿角质层进入到下面的表皮层或者表皮和真皮层的微凸出(或其阵 列)，该微凸出部件具有设置在其上的包括免疫活性试剂的生物相容 的涂层。
在发明的优选实施方案中，免疫活性试剂包括流感疫苗，更优选 包括三价流感疫苗。根据本发明，在刺穿皮肤的角质层时，生物相容 涂层就被体液(胞内流体和胞外流体诸如组织液)溶解，流感疫苗就 被释放到皮肤中(即推注输送)用于全身治疗。
根据本发明，涂层溶解和释放的动力学将取决于许多因素，包括 免疫活性试剂的性质、涂覆过程、涂层厚度以及涂层组成(例如涂层 制剂添加剂的存在)。依据释放动力学曲线图，以延长的时间周期保 持涂覆的微凸出与皮肤的穿刺联系可能是必需的。这可以通过使用粘 合剂将微凸出部件锚定在皮肤上来实现或者通过使用锚定的微凸出来 实现，诸如图5中所显示的以及WO 97/48440中所描述的，将其整体 引入这里作为参考。
如现有技术中所公知的，流感病毒粒子由许多蛋白质成分构成， 以血凝素(HA)作为负责诱导人体中的保护性抗-HA抗体的基本表面 抗原。流感粒子的图解显示于图1中。
在免疫学上，根据两种表面抗原HA和神经氨酸酶(NA)将流感 A病毒分为亚型。对这些抗原特别是血凝素的免疫性降低了感染的感 染可能性并减轻了感染发生时的疾病严重程度。
流传菌株的抗原特性提供了选择每年的疫苗中所包括的病毒菌株 的基础。每年，流感疫苗包含三种病毒菌株(通常是两种A型和一种 B型)，代表了在即将到来的冬季可能全世界传播的流感病毒。流感A 和B可通过它们核蛋白和基底蛋白的不同来区分。类型A是最普通的 菌株，是造成主要的人间传染的原因。三价疫苗中每种菌株的HA含 量典型地调整为单一的人剂量中15μg，即45μg总HA。
如这里所详细探讨的，由于独特的预配过程，完全的流感疫苗人 体剂量，即45μg血凝素，可通过涂覆的微凸出阵列经皮肤输送到富含 APC的表皮层，这是皮肤最具有免疫活性的成分，其中至少70％的流 感疫苗被输送到所述的表皮层。更重要的是，抗原保留了在皮肤中的 免疫原性来引起强的抗体和血清保护性免疫应答。此外，干燥涂覆的 疫苗制剂基本上不含防腐剂，可以维持至少六个月的室温稳定性。
现在参看图2，显示了用于本发明的微凸出部件30的一个实施方 案。如图2所示，微凸出部件30包括具有多个微凸出34的微凸出阵 列32。微凸出34优选以基本上90°角从薄板36上延伸出来，在所述 的实施方案中包括开口38。
根据本发明，薄板36可以被插入输送药贴中，包括用于薄板36 的衬垫40，还可以额外包括将药贴粘附到皮肤上(见图4)的粘合条 (未显示)。在这个实施方案中，微凸出34是通过在金属薄板36上 蚀刻或冲孔多个微凸出34并将微凸出34从薄板36的平面上弯曲出来 而形成的。
在本发明的一个实施方案中，微凸出部件30具有至少大约1 0个 微凸出/cm2的微凸出密度，更优选在至少大约200-3000个微凸出/cm2 的范围。优选地，试剂所通过的每单位面积开口数是至少大约10个开 口/cm2并少于大约3000个开口/cm2。
如所述，微凸出34优选具有小于1000微米的凸出物长度。在一 个实施方案中，微凸出34具有小于500微米的凸出物长度，更优选小 于250微米。
在进一步的适合于最小程度出血和刺激的实施方案中，微凸出优 选具有小于145微米的凸出物长度，更优选在大约50-145微米的范围， 甚至更优选在大约70-140微米的范围。
微凸出34也优选具有大约25-500微米的在图2中标为“W”的宽 度范围，以及大约10-100微米的厚度范围。
现在参看图5，显示了本发明的范围中可采用的微凸出部件50的 另一个实施方案。微凸出部件50同样包括具有多个微凸出54的微凸 出阵列52。微凸出54优选以基本上90°角从薄板51上延伸出来，同 样包括开口56。
如图5所示，几个微凸出54包括设置在前缘附近的固位部件或锚 58。如上所述，固位部件58有助于微凸出部件50粘附到受试者的皮 肤上。
微凸出部件(例如30、35)可由各种金属制造，诸如不锈钢、钛、 镍钛合金，或者类似的生物相容材料，诸如聚合材料。优选地，微凸 出部件是由钛制造的。
根据本发明，微凸出部件也可由不导电材料构成，诸如聚合物。 备选地，微凸出部件可以用不导电材料涂覆，诸如Parylene，或者是 疏水性材料，诸如Teflon、硅或者其它低能材料。所述的疏水性材料 和相关基底(诸如photoreist)层在美国申请No.60/484,142中阐述了， 将其引入这里作为参考。
可在本发明中采用的微凸出部件包括但不限于美国专利No. 6,083,196、6,050,988和6,091,975以及美国专利公开No.2002/0016562 中所披露的，将其整体引入这里作为参考。
可在本发明中采用的其它微凸出部件包括使用硅片蚀刻技术蚀刻 硅或者通过使用蚀刻微型铸模成型塑料而形成的部件，诸如美国专利 No.5,879,326中所披露的部件，将其整体引入这里作为参考。
现在参看图3，显示了具有多个微凸出34的微凸出部件30，微凸 出上涂覆了生物相容涂层35。根据本发明，涂层35可部分或全部覆盖 每个微凸出34。例如，涂层35可以干燥方式涂覆在微凸出34上。涂 层35也可在微凸出34形成之前或之后进行施加。
根据本发明，涂层35可通过各种已知方法施加到微凸出34上。 优选地，涂层仅仅施加到微凸出部件30或微凸出34刺穿皮肤的那些 部分(例如尖端39)。
一种这样的涂覆方法包括浸涂。浸涂可被描述为这样的方式，通 过部分或全部将微凸出34浸入涂覆溶液中来涂覆微凸出。通过使用部 分浸入技术，将涂层35仅仅限制在微凸出34的尖端39是可能的。
更多的涂覆方法包括辊涂，采用辊涂机制同样地将涂层35限制在 微凸出34的尖端39。辊涂方法披露于美国申请No.10/099,604(公开号 2002/0132054)，将其整体引入这里作为参考。如所述的申请中所详细 讨论的，披露的辊涂方法提供了平滑涂层，在皮肤穿刺期间不容易从 微凸出34上脱离。
根据本发明，微凸出34可进一步包括适合于接受和/或增加涂层35 体积的装置，诸如孔隙(未显示)、沟槽(未显示)、表面不平整(未 显示)或者类似的变形，其中该工具提供了增加的表面面积，更大量 的涂层可以被沉淀在其上。
在本发明的范围中可采用的更多涂覆方法包括喷涂。根据本发 明，喷涂可包括涂层组合物的喷雾悬液的形成。在一个实施方案中， 将具有大约10到200皮升液滴大小的喷雾悬液喷雾到微凸出10上，然 后干燥。
也可采用模式涂覆来涂覆微凸出34。模式涂覆可使用将沉淀液体 定位到微凸出表面的分配器来应用。沉淀液体的量优选在0.1到20纳 升/微凸出的范围。合适的精密计量液体分配器披露于美国专利No. 5,916,524；5,743,960；5,741,554和5,738,728中；将其整体引入这里作 为参考。
也可使用喷墨技术来施加微凸出涂层制剂，其使用已知的电磁阀 分配器、任选的流体运动装置以及定位装置，一般通过使用电场来控 制。也可使用印刷工业的其它液体分配技术或者现有技术中已知的类 似的液体分配技术来应用本发明的模式涂覆。
现在参看图6和7，为保存和应用，优选将微凸出部件30通过粘 性标签6悬在固定环40中，如同共同未决的美国申请No.09/976,762(公 开号2002/0091357)中所详细描述那样，将其整体引入这里作为参考。
将微凸出部件30安置在固定环40中以后，将微凸出部件30应用 到受试者的皮肤。优选地，使用冲击敷贴器45将微凸出部件30应用 到皮肤上，诸如涂8中所显示的以及共同未决的美国申请No. 09/976,798中所披露的，将其整体引入这里作为参考。
如所述，在本发明的优选实施方案中，施加到微凸出部件30上形 成固体涂层的涂层制剂包括水性制剂。在备选实施方案中，涂层制剂 包括非水性制剂。根据本发明，免疫活性试剂可溶解在生物相容载体 中或者悬浮在载体中。
如所述，在本发明的优选实施方案中，免疫活性试剂包括流感疫 苗。更优选地，包括三价流感疫苗。
在本发明的备选实施方案中，免疫活性试剂包括疫苗(或抗原性 试剂)，选自病毒和细菌、蛋白质为基础的疫苗、多糖为基础的疫苗 以及核酸为基础的疫苗。
合适的抗原性试剂包括但不限于蛋白质形式的抗原、多糖缀合 物、寡糖以及脂蛋白。这些亚基疫苗包括百日咳博德特氏菌(重组PT 疫苗-非细胞的)、破伤风梭菌(纯化的、重组的)、白喉棒状杆菌(纯化 的、重组的)、巨细胞病毒(糖蛋白亚基)、A族链球菌(糖蛋白亚基、与 破伤风类毒素的复合糖A族多糖、与毒素亚基载体连接的M蛋白/肽、 M蛋白、多价的型特异性表位、半胱氨酸蛋白酶、C5a肽酶)、乙型肝 炎病毒(重组的PreS1、Pre-S2、S、重组的核心蛋白)、丙型肝炎病毒(重 组表达的表面蛋白和表位)、人乳头瘤病毒(衣壳蛋白、TA-GN重组蛋 白L2和E7[来自HPV-6]、来自HPV-11的MEDI-501重组VLP L1、 四价的重组BLP Ll[来自HPV-6]、HPV-11、HPV-16和HPV-18、 LAMP-E7[来自HPV-16])、肺炎军团菌(纯化的细菌表面蛋白)、脑膜 炎奈瑟氏球菌(与破伤风类毒素的复合糖)、绿脓杆菌(合成肽)、风疹病 毒(合成肽)、肺炎链球菌(缀合到脑膜炎球菌B OMP的复合糖[1，4，5，6B， 9N，14，18C，19V，23F]、缀合到CRM197的复合糖[4，6B，9V，14，18C， 19F，23F]、缀合到CRM1970的复合糖[1，4，5，6B，9V，14，18C，19F， 23F]、梅毒密螺旋体(表面脂蛋白)、水痘带状疱疹病毒(亚基、糖蛋白) 以及霍乱弧菌(缀合的脂多糖)。
完整的病毒或细菌包括但不限于减毒的或杀死的病毒，诸如细胞 巨化病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、风疹病毒 和水痘带状疱疹，减毒的或杀死的细菌，诸如百日咳博德特氏菌、破 伤风梭菌、白喉棒状杆菌、A族链球菌、肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟氏 球菌、绿脓杆菌、肺炎链球菌、梅毒密螺旋体和霍乱弧菌，以及它们 的混合物。
另外的商业上可获得的含有抗原性试剂的疫苗包括但不限于流感 疫苗、莱姆病疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、水痘疫苗、 天花疫苗、肝炎疫苗、百日咳疫苗以及白喉疫苗。
包含核酸的疫苗包括但不限于单链和双链核酸，诸如超螺旋质粒 DNA；线性质粒DNA；粘粒；细菌人工染色体(BACs)；酵母人工染色 体(YACs)；哺乳动物人工染色体；以及RNA分子，诸如mRNA。核酸 的大小可达数千个千碱基。此外，在本发明的某些实施方案中，核酸 也可以与蛋白质试剂结合或者可以包括一种或多种化学修饰，诸如硫 代磷酸酯部分。核酸的编码序列包括免疫应答所期望针对的抗原的序 列。此外，在DNA的情况下，也将启动子和聚酰苷化序列插入到疫苗 构建体中。可被编码的抗原包括感染性疾病、病原体以及癌抗原的抗 原性成分。这样就发现了核酸在例如感染性疾病、癌症、过敏、自身 免疫以及炎症领域的应用。
与疫苗抗原结合的，可包括疫苗的合适的免疫应答增强佐剂包括 但不限于磷酸铝凝胶；氢氧化铝；α葡聚糖：β-葡聚糖；霍乱毒素B 亚基；CRL1005；具有平均值x＝8和y＝205的ABA嵌段共聚物；γ菊 粉：线性的(无支链的)β-D(2-＞1)多聚呋喃果糖氧基-α-D-葡萄糖； Gerbu佐剂：N-乙酰葡糖胺-(β 1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰 胺(GMDP)，二甲基双十八烷基氯化铵(DDA)，L-脯氨酸锌盐复 合物(Zn-Pro-8)；咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4- 胺；ImmTherTM：N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L- Ala-甘油二棕榈酸酯；MTP-PE脂质体：C59H108N6O19PNa-3H2O (MTP)；Murametide：Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3；Pleuran：β-葡聚 糖；QS-21；S-28463：4-氨基-a，a-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙 醇；salvo肽：VQGEESNDK·HCl(IL-1 β 163-171肽)；苏氨酰-MDP (TermurtideTM)：N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺，以及白介素 18、IL-2 IL-12、IL-15，佐剂也包括DNA寡核苷酸，诸如含有CpG的 寡核苷酸。此外，也可以使用编码免疫调节淋巴因子诸如IL-18、IL-2 IL-12、IL-15、IL-4、IL10、γ-干扰素和NF κB调节信号蛋白质的核 酸序列。
根据本发明，涂层制剂可包括至少一种润湿剂。合适的润湿剂包 括呈现两亲性质的表面活性剂和聚合物。
这样，在本发明的一个实施方案中，涂层制剂包括至少一种表面 活性剂。根据本发明，表面活性剂是两性离子的、两性的、阳离子的、 阴离子的或非离子的。合适的表面活性剂的例子包括sodium lauroamphoacetate，十二烷基硫酸钠(SDS)，氯化十六烷基吡啶 (CPC)，十二烷基三甲基氯化铵(TMAC)，苄烷铵，氯化物，聚 山梨酸酯诸如吐温20和吐温80，其它山梨聚糖衍生物诸如山梨醇月桂 酸酯，以及烷氧基醇诸如十二烷基醚-4。最优选的表面活性剂包括吐温 20、吐温80和SDS。
在发明进一步的实施方案中，涂层制剂包括至少一种具有两亲性 质的聚合材料或聚合物。所述的聚合物的例子包括但不限于纤维素衍 生物诸如羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟 丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素(MC)、羟乙基甲基纤维素(HEMC)、 或乙基羟基-乙基纤维素(EHEC)，以及pluronics。
在发明的一个实施方案中，呈现两亲性质的聚合物的浓度优选在 大约0.01-20wt.％的范围，更优选在涂层制剂大约0.03-10wt.％的范 围。甚至更优选润湿剂的浓度在涂层制剂大约0.1-5wt.％的范围。
如本领域普通技术人员将可理解的是，所述的润湿剂可单独或组 合使用。
根据本发明，涂层制剂可进一步包括亲水性聚合物。优选地，亲 水性聚合物选自下面的组：葡聚糖、羟乙基淀粉(HES)、聚(乙烯 醇)、聚(环氧乙烷)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(n-乙烯吡 咯烷酮)、聚乙二醇以及它们的混合物和类似的聚合物。如本领域所 公知的，所述的聚合物增加粘性。
涂层制剂中亲水性聚合物的浓度优选在大约0.01-50wt.％的范 围，更优选在涂层制剂大约0.03-30wt.％的范围。甚至更优选润湿剂的 浓度在涂层制剂大约0.1-20wt.％的范围。
根据本发明，涂层制剂可进一步包括生物相容载体，诸如共同未 决的美国申请No.10/127,108中所披露的那些，将其整体引入这里作为 参考。生物相容载体的例子包括人白蛋白、生物工程化的人白蛋白、 聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚组氨酸、戊聚糖多硫酸酯、聚氨基酸、蔗 糖、海藻糖、松三糖、棉子糖和水苏糖。
生物相容载体在涂层制剂中的浓度优选在大约2-70wt.％的范 围，更优选在涂层制剂大约5-50wt.％的范围。甚至更优选润湿剂的浓 度在涂层制剂大约10-40wt.％的范围。
涂层制剂可进一步包括血管收缩剂，诸如共同未决的美国申请No. 10/674,626中所披露的那些，将其整体引入这里作为参考。如所述的共 同未决申请中所述，血管收缩剂用于控制微凸出部件的应用期间和应 用之后的出血。优选的血管收缩剂包括但不限于阿米福林、咖啡氨醇、 环喷他明、脱氧肾上腺素、肾上腺素、苯赖加压素、茚唑啉、美替唑 啉、米多君、萘唑啉、盐酸可巴君、二甲己胺、鸟氨加压素、羟甲唑 啉、苯肾上腺素、苯基乙醇胺、苯基丙醇胺、六氢脱氧麻黄碱、伪麻 黄碱、四氢唑啉、曲马唑啉、异庚胺、泰马唑啉、血管加压素、丁苄 唑啉以及它们的混合物。最优选的血管收缩剂包括肾上腺素、萘唑啉、 四氢唑啉、茚唑啉、美替唑啉、曲马唑啉、泰马唑啉、羟甲唑啉和丁 苄唑啉。
如果采用，血管收缩剂的浓度优选在涂层大约0.1wt.％到10wt.％ 的范围。
在发明的另一个实施方案中，涂层制剂包括至少一种“通道开放 调节剂”，诸如共同未决的美国申请09/950,436中所披露的那些，将 其整体引入这里作为参考。如所述的共同未决申请中所述，通道开放 调节剂防止或减少了皮肤的自然愈合过程，从而防止了由微凸出部件 阵列在角质层中所形成的通道或微小狭缝的关闭。通道开放调节剂的 例子包括但不限于渗透压调节剂(例如氯化钠)以及两性离子化合物 (例如氨基酸)。
如共同未决的申请中所定义的，术语“通道开放调节剂”进一步 包括抗炎试剂诸如倍他米松21-磷酸二钠盐、去炎舒松21-磷酸二钠、 盐酸氢可松氨酯、氢化可的松21-磷酸二钠盐、甲基强的松龙21-磷酸 二钠盐、甲基强的松龙21-琥珀酸钠盐、帕拉米松磷酸二钠盐、强的松 龙21-琥珀酸钠盐，以及抗凝血剂诸如柠檬酸、柠檬酸盐(例如柠檬酸 钠)、糊精硫酸钠、阿司匹林和EDTA。
根据本发明，涂层制剂也可进一步包括非水性溶剂，诸如乙醇、 氯仿、乙醚、丙二醇、聚乙二醇等等，染料、色素、惰性填料、渗透 增强剂、赋形剂，以及本领域已知的药学产品或经皮肤设备的其它常 规成分。
也可将其它已知的制剂佐剂加入到涂层制剂中，只要它们不会不 利地影响涂层制剂所必需的可溶性和粘性特征以及干燥涂层的物理完 整性。
优选地，涂层制剂具有小于大约5的粘度，以便有效涂覆每个微 凸出10。更优选地，涂层制剂具有大约0.3-2.0泊的粘度范围。
根据本发明，涂层厚度优选在小于100微米，更优选小于50微米。 甚至更优选地，涂层厚度在大约2-30微米的范围。
期望的涂层厚度取决于几个因素，包括所需的剂量以及因此而需 要输送该剂量的涂层厚度，薄片每单位面积的微凸出密度，涂层制剂 的粘度和浓度以及所选择的涂覆方法。
在所有情况下，应用涂层之后，可通过各种方法干燥微凸出上的 涂层制剂。在本发明的一个实施方案中，将涂覆的微凸出部件(例如 30)在环境室温条件下空气干燥。在另一个实施方案中，将涂覆的微 凸出部件真空干燥。在另一个实施方案中，将微凸出部件空气干燥， 然后真空干燥。
也可以采用各种温度和湿度水平来干燥微凸出上的涂层制剂。这 样就可将涂覆的微凸出部件30经加热、冻干、冷冻干燥或者进行类似 技术以去除涂层上的水。
研究/实施例
下面的研究和实施例图解说明了本发明的装置、制剂方法和工 艺。实施例仅仅用于例证性目的，并不打算以任何方式限定发明的范 围。
首先参看表I，显示了在下面所述的研究中获得并采用的单价菌株 (即批)的汇总：
表I
菌株 批号 HA浓度 (g/mL) 总疫苗成分 的HA％ B/Yamanashi/Fluzone 5096PD 79 20 B/Victoria/Fluzone U2603 197 25 B/Victoria/Fluzone U02995 210 18 A/New Caledonia/Fluzone 5095PD 95 16 A/Panama/Fluzone 5094PD 112 40 A/Panama/Fluzone U02598 401 50 A/Panama/VaxigripTM FA106821 180 38 A/Panama/VaxigripTM FA107640 159(123) (33)* A/New Caledonia/VaxigripTM FA106076 131(127) (32)* B/Shangdong/VaxigripTM FA107994 191(260，234) (63)*
预配过程
所获得的最初粗疫苗是400μg HA/mL的A/Panama/2007/99菌株 (Fluzone)。在接收的时候溶液是浑浊的，表明存在不溶微粒，可能 是由于不溶于水的脂、脂蛋白复合物以及聚集的蛋白。单价疫苗的BCA 分析以及透析显示盐和其它低分子量物质占了固体成分的大多数。为 富集涂层的HA含量以满足剂量需求，必须去除这些低分子量成分。 因此就发展了渗滤/浓缩方法来处理这个问题。
现在参看图9，显示了所采用的预配过程的流程图。流程图中所述 的步骤在下面讨论。
切向流过滤(TFF)
如本领域所已知的，TFF允许渗滤和浓缩在同一时间进行。使用 渗滤来去除低分子量物质。建立并评估了配备Pellicon XL、重构纤维 素膜(Millipore，50cm2，30 kD MWCO)的TFF系统(Millipore，实验室 级)，用于疫苗原料的渗滤和浓缩。将疫苗溶液的体积减少到原始体积 的1/20-1/50，增加HA浓度到5-10mg HA/mL。加入缓冲溶液进行缓 冲交换和浓缩。
冻干
在切向流过滤之后，用防冻赋形剂诸如蔗糖或海藻糖配制浓缩疫 苗，填充到20mL的玻璃小瓶中，用液氮瞬间冷冻并置于多样式冷冻 干燥机(Virtis，25EL Freezemobile)上。使小瓶冷冻干燥2-5天，直到容 器室压达到稳态(约50m Torr)。
所述的预配过程提供了高度浓缩的固态血凝素(HA)制剂作为中 间产物。实际上，HA制剂的浓度是商业产品浓度的至少500倍。所述 的中间产物也是高效的且是免疫原性的。
如本领域普通技术人员将理解的是，所述的本发明的预配过程可 以修改并适应于预配各种疫苗来源材料及其形态。例如，工艺可适应 于使用以更高浓度接收的原料。在这种情况下，渗滤步骤将不是必需 的，高浓度原料将被直接冻干和重构来产生涂层制剂。
预配过程也可适应于使用作为固体被接收的原料，诸如但不限于 冻干的或喷雾干燥的粉末。在这种情况下，固体原料将被直接重构来 产生涂层溶液制剂。
预配过程也可修改来使用高纯原料，诸如但不限于源自细胞的流 感疫苗。在这种情况下，材料可以是足够纯的，冻干和重构步骤将不 再必需。
制剂研发
配制尝试贯注于开发具有合适涂层性质和稳定性的涂层制剂，确 定能可靠产生可再生涂层剂量的涂层系统，以及鉴定能够以良好输送 效率和可接受的皮肤耐受性输送疫苗的阵列设计。
涂覆工艺
在研究中使用两种类型的涂布机。第一种涂布机配备有Delrin制 造的0.38”直径的鼓。将鼓浸入具有0.25mL负荷体积的储存器中。该 储存器没有冷却能力，但是允许淡水的直接注入以补偿操作期间的蒸 发。固定在鼓上的膜的厚度是约200-250μm。
第二种涂布机配备有0.621”直径的不锈钢鼓和同心的储存器。用 于该涂布机的储存器具有0.3-0.7mL的负荷体积，取决于鼓的直径。 鼓直径也控制膜的厚度，对于0.621”鼓来说，膜厚是约80-90μm。该 涂布机的储存器配备有热电冷却(TEC)。通过将鼓温度控制在环境条件 的露点，可以最小程度减少涂层溶液浓度的变化。涂层高度通过微凸 出长度和阵列条带厚度的和来确定。
微凸出阵列设计
在制剂研制中采用了八个微凸出阵列。微凸出阵列设计的微凸出 长度、尖头角度、以及附加设计特征诸如固位倒钩和/或微凸出止动块 的存在是可变的。最初评估了两种微凸出阵列设计MF-1和MF-2。
赋形剂
为评估微凸出是否能够使用悬浮液即不清澈的涂层溶液来涂覆， 最初集中于通过加入表面活性剂来稳定不溶的颗粒。
现在参看表II，显示了表面活性剂在降低溶液浊度上的效果。所 述的数据表明加入表面活性剂能够帮助颗粒的解聚/溶液化，如通过溶 液浊度的降低所确定的。表面活性剂的强度顺序是SDS＞Triton X100＞ 吐温20，这与同样表面活性剂存在时的溶液澄清度是一致的(见表 III)。
表II
340nm的 浊度 粗品 粗品/0.1％ SDS 粗品/0.1％ Triton X100 粗品/0.1％ 吐温20 80μg/mL HA 0.279 0.022 0.053 0.185
表III
表面活 性剂 外观 膜/MWCO 终浓度 备注 SDS 澄清 Ultrfree/10 kD+ Centricon 30kD 30 mg/mL 超过100厘泊 的粘度 Triton X100 澄清 Ultrfree/10kD 15 mg/mL 成胶凝 吐温80 浑浊 Ultrfree/10kD 15 mg/mL 成胶凝
另一种有效的表面活性剂类型两性洗涤剂也能够破坏蛋白质/脂为 基础的聚集体。表IV列出了三种类型的两性洗涤剂，其溶解能力随两 性洗涤剂的疏水性增加而增加，即两性洗涤剂3-14是最强的。
表IV
两性洗涤剂 吸光度@340nm 起始疫苗材料 (0.2mg/mL HA) 0.3557 3-10 0.120 3-12 0.087 3-14 0.070
调节pH也显示出在高和低pH时降低了疫苗的浊度，如图10所 示。然而，pH的大量增加或减少可能损害了抗原在高浓度时的稳定 性。因此，为了消除溶液浊度就不要采用显著偏离7.2的pH。
由于预配过程使得疫苗能够被浓缩到涂覆所需的水平，结合制备 溶解的或悬浮的涂层溶液的策略，进一步研究了七种候选制剂。在表V 中所述的制剂含有至少一种或多种赋形剂。
表V
参考号 制剂(形式) 1 5％HA/1％海藻糖/10％SDS(溶解的) 2 5％HA/1％海藻糖/10％Triton X100(溶解的) 3 5％HA/1％海藻糖/5％两性洗涤剂3-14/pH10 (Na2CO3-NaHCO3)(溶解的) 4 5％HA/1％海藻糖/10％两性洗涤剂3-14(溶解的) 5 5％HA/5％蔗糖/2％吐温80(悬浮液) 6 5％HA/5％蔗糖(悬浮液) 7 5％HA/2.5海藻糖/2.5甘露糖/2％Pluronic F68 (悬浮液)
制剂1-4是溶解的溶液。制剂5-7是悬浮液/混浊溶液。所有制剂含 有至少稳定蛋白质的糖。制剂5含有弱的表面活性剂吐温80，据信它 可以提供疫苗增加的溶解性以及可能增加的免疫原性。仅含有蔗糖的 制剂6是所有评估的制剂中最简单的制剂。制剂7包括甘露糖和固体 表面活性剂Pluronic F68，据信它可以降低涂层的吸湿性并增加涂层完 整性/物理稳定性。
涂层溶液/悬浮液特征
如本领域所公知的，主要是两种物理参数控制涂覆可行性：涂层 溶液的粘度和润湿性。下面讨论每种所述的参数。
粘度
溶液粘度影响涂层溶液在微凸出涂覆期间的流动。如果涂层溶液 粘度太低，当所浸入的微凸出阵列从涂层溶液中离开时，就会有相当 部分的液体可能在有机会形成微凸出尖端周围的膜之前落回到储存器 中。这将导致低效率的过程而需要许多的更多循环的涂覆。
另一方面，如果涂层溶液粘度太高，微凸出阵列上的液体将很缓 慢地移动，可能导致奇怪的涂层形态。表VI汇总了固态的七种候选制 剂的组成。所有七种涂层溶液制剂都含有6mg/mL的2-苯氧基乙醇作 为防腐剂。涂层溶液中的HA含量在HA纯度50％的情况下为约30％。
表VI
制剂 1 2 3 4 5 6 7 HA 23.1 23.1 30.1 23.1 28.4 32.1 28.4 糖 4.6 4.6 6.1 4.6 28.4 32.1 28.4 非HA材料 23.1 23.1 30.1 23.1 28.4 32.1 28.4 表面活性剂 46.3 46.3 30.1 46.3 11.4 0 11.4 2-PE 2.9 2.9 3.6 2.9 3.4 3.7 3.4
现在参看图11，显示了两种不同批疫苗Fluzone和VaxigripTM 的比较图。 两种批都包括A/Panama菌株并配制到制剂5中(HA∶海 藻糖∶吐温80＝5∶5∶2重量比)。
涂层制剂通常是50mg/mL(5％)的HA。然而，在这个浓度下， VaxigripTM的溶液粘度高的多，即在200rpm时候约0.8泊。
如图11所示，制剂的粘度随稀释而降低。在35mg/mL HA(3.5％) 时，VaxigripTM制剂的溶液粘度达到了Fluzone制剂在50mg/mL HA (5％)时同样的水平，在200rpm测定为0.4泊。
除了HA纯度和HA浓度，涂层溶液的温度是另一个影响粘度的重 要因素。这样，通过将冷冻干燥的疫苗重构到22.5mg/mL HA中就制 备了包括具有15％HA纯度的A/New Caledonia菌株的高粘性涂层溶液 (具有2.25％HA/2.25蔗糖的改良制剂6)。该涂层溶液的粘度在低于 室温的几个温度下进行测定(见图12)。溶液是高度粘性的，即5℃ 时约1.70cp。
如本领域所公知的，温度是涂覆系统中的重要参数，因为为了最 小程度减少涂覆过程期间由于蒸发而损失的水，不锈钢溶液储存器和 鼓的温度都要控制在环境条件的露点。在正常环境条件下(22℃和 30-45％RH)的露点典型地在4-10℃的范围。
尽管溶液粘度可以显著变化，但是已经发现涂层溶液可以在很宽 的粘度范围中容易地且有效地涂覆在微凸出阵列上，优选大约0.3-2.0 泊的范围。
润湿性：接触角
如本领域所已知的，润湿性决定了液体附着、粘附并散布到要涂 覆的表面上的能力。液滴在基底表面上的接触角测定通常用来表征表 面润湿性。所测得的接触角是以纯水为参照的，纯水的接触角在同样 条件下是约70-80°。一般地，接触角越小，润湿性越好。
现在参看表VII，显示了表V中所鉴别的七种流感疫苗制剂在没有 被清洁的金属钛表面上的接触角。与纯水相比，所有制剂都显示出良 好的润湿性，接触角在26°到36°的范围。很不同的制剂的接触角的 狭窄范围表明疫苗对润湿性的贡献可能超出赋形剂的贡献。为验证这 个假设，测定了没有疫苗的同一制剂的接触角。结果表明疫苗中的成 分似乎有助于润湿金属表面。没有疫苗，这些赋形剂除了强力表面活 性剂之外都不能有效润湿金属表面。
表VII
制剂 接触角 (°) 没有疫苗时的 接触角(°) 水 72 72 (1)5％HA/10％SDS 32 ND (2)5％HA/10％Triton X100/pH10 36 ND (3)5％HA/5％两性洗涤剂 3-14/pH10 28 30 (4)5％HA/5％两性洗涤剂3-14 26 ND (5)5％HA/5％蔗糖/2％吐温80 31 40 (6)5％HA/5％蔗糖 34 60 (7)5％HA/2.5％海藻糖/2.5％甘露糖/ 2％Pluronic F68 32 59
总的说来，涂层溶液显示了增强的润湿性质，其最小程度地受涂 覆表面的影响，还显示了极好的涂覆性质，即使接触角在最佳接触角 范围的最低端。接触角被认为在大约30-60°的范围，这是由其它生物 药学制剂和安慰剂制剂所确定的。
免疫原性研究的候选物选择
用于免疫原性研究的最终制剂的选择是在抗原稳定性和输送性能 的基础上进行的。
三价制剂
往回参看表1，确定了每批的HA纯度。HA纯度在16％到50％的 范围。基于公认的经验关系曲线，如果HA纯度从期望的50％降到20 ％，那么涂层溶液的HA含量就会从约30％显著降到11％。尽管有这 样的HA纯度变化，这些材料都可以被成功处理，表明了预配过程的 稳定性。
评估了从三种单价菌株A/Panama/Fluzone、A/New Caledonia/ Fluzone和B/Victoria/Fluzone制备三价流感疫苗的两种方法。在第 一种方法中，分别处理三种单价起始材料A/Panama/Fluzone、A/New Caledonia/Fluzone和B/Victoria/Fluzone以提供三种冷冻干燥的单价 中间体。组合具有等量HA的来自三种中间体的每一种的冷冻干燥材 料，用水重构用于涂覆。
第二种方法是通过混合三种单价起始材料来进行的，它们具有等 量的HA，即具有不同的体积。然后将三价混合物渗滤、经TTF系统 浓缩以及冷冻干燥。第二种方法的涂层溶液具有与第一种方法相同的 涂覆性质。
三价制剂的涂覆(24mg/ml HA，即每种HA菌株约8mg/ml)显示了 在类似位置的尖端涂层形态，不论使用何种微凸出阵列设计。从微凸 出的尖端开始测定，所有设计的涂层向下延伸了约90μm，表明建立了 可良好控制的涂覆系统。
涂覆的微凸出阵列的表征
除了形态，需要表征涂层的几个物理和生化方面来理解配制过程 的进行。物理参数包括涂覆期间和之后的水蒸发和含水量以及涂层的 微生物考虑事项。
涂覆可行性/形态：溶液化制剂(No.1-4)
尽管存在不同涂层制剂可能导致各种涂层形态的事实，但是无论 制剂如何，都获得了类似的和可接受的涂层位置/形态，表明一些疫苗 成分的存在有利于涂覆过程，如接触角结果所反映的。用四种制剂证 明了涂覆可行性。
涂覆可行性/形态：悬浮液制剂(No.5-7)
尽管制剂No.5-7是高度混浊的粘性溶液，但是悬浮液是稳定的， 因为在冷藏储存一个月后没有观察到相分离。此外，在7000rpm离心 2分钟后没有清晰的颗粒沉降。涂覆期间在鼓上形成了均匀的薄膜，没 有观察到明显的颗粒——这是优良的稳定悬浮液的进一步证据。
含水量
如表VIII中所反映的，发现涂层含水量受到干燥和处理环境的影 响，特别是环境条件的相对湿度。在微凸出阵列或钛板基底上干燥的 制剂5(HA/蔗糖/吐温80)的涂层溶液产生了1.7％的含水量，只有在空 气干燥后进行真空干燥才是这样。不真空干燥，涂层的含水量显著更 高，为6.2％，这将随环境空气的湿度而变化。
表VIII
样品信息 干燥 水含量 (％) 涂覆的制剂5 (A/Panama/VaxigripTM) 的阵列 空气干燥，然后真空干燥 1.7 在钛板上干燥的制剂5 空气干燥过夜 6.2 在钛板上干燥的制剂5 空气干燥2小时，然后真空 干燥过夜 1.7
微生物学
在低生物负荷产生区域即“非无菌”区域进行了微生物学分析， 用于GLP生产批次和GMP生产批次的方式为仅有蔗糖的三价形成 物，没有任何防腐剂。该分析的结果示于表IX中。
表IX
批次 三价涂层溶液 三价涂覆阵列 内毒素* 微生物含量* 内毒素 微生物含量 GLP ＜0.05EU/mL ＜0.04CFU/mL ＜0.5EU/阵列 ＜1CFU/阵列 GMP ＜0.04EU/mL ＜0.05CFU/mL ＜0.5EU/阵列 ＜1CFU/阵列
*在单份人剂量浓度下等量。三价涂层溶液比现有市场销售的疫 苗溶液浓466倍。
如表IX所反映的，在缺乏任何防腐剂时，两个批次的涂层溶液都 含有极低水平的内毒素和微生物含量。这些结果从而表明，采用来得 到涂层溶液的过程以及涂覆过程本身都可以以不引入另外的生物负荷 到产品中的方式进行操作。
SDS-PAGE/Western印迹
通过Western印迹分析分析了涂覆在微凸出上的三种最终制剂 (制剂No.3、6和7)的HA抗原性。与起始材料相比(第2道)，所 有涂覆的并冷冻干燥的制剂都显示了相似的带模式。据信三条带与HA 的单体(约75kD)或三聚体(约2250kD)有关。因此，根据匹配带 和带强度(相对于起始疫苗)，可以断定的是，在制剂中已被冷冻干 燥并涂覆在微凸出阵列上的抗原HA保持了抗原性。
BCA与SRID
如本领域所公知的，SRID是确定HA体外效力的唯一被认可的分 析方法，它通常与免疫原性是一致的。然而，它很耗费时间(3天)。 为以及时的方式监测预配和涂覆过程期间的HA效力，进行了BCA蛋 白质分析，并与SRID分析的结果进行比较，这将使得能够评估短期 HA稳定性。
现在参看表X，显示了三种单价菌株在TFF浓缩、冷冻干燥、重 构为三价涂层液体以及涂覆之后的BCA/SRID结果的汇总。BCA结果 通常与SRID结果是一致的，除了A/New Caledonia中冷冻干燥材料具 有比BCA值低得多的SRID。然而，这两个值在重构的三价液体制剂 中更好地匹配了，表明较早的不一致性很可能是由于样品制备或分析 方法的偏差。
表X
材料 A/Panama B/Victoria A/New Caledonia BCA (μg/mL) SRID (μg/mL) BCA (μg/mL) SRID (μg/mL) BCA (μg/mL) SRID (μg/mL) 起始材料 130 110 150 140 100 100 TFF浓缩的 71 UD 49 55 62 74 冷冻干燥的 120 UD 84 92 148 68 三价重构的 1320 UD 640 720 1070 1260 三价涂覆的# UD (18.0) 18.3 (21.2) 25.3(30.5)
微凸出阵列输送和皮肤耐受性
进行了十六个单独的输送研究来评估输送效率和皮肤耐受性。每 个研究汇总在表XI中。
表XI
研究号 制剂 皮肤评估 1 FluzoneA/P(1，2，4) 无 2 FluzoneA/P(2，3，5) 无 3 FluzoneA/P(2，5，7) 无 4 FluzoneA/P(3，5，7) 无 5 VaxigripTM A/P(3，5，7) 无 6 VaxigripTM A/P(5) 无 7 VaxigripTM A/P(5) 无 8 三价(6) 无 9 三价(6) 无 10 三价(6) 无 11 FluzoneA/P(6) 有 12 FluzoneA/P(6) 有 13 FluzoneA/P(6) 有 14 FluzoneA/P(6) 有 15 FluzoneA/P(6) 无 16 FluzoneA/P(6) 有
输送研究No.1-7
输送研究No.1-7针对两个微凸出设计，以下叫做MF-1和MF-2。 结果表明，无论哪种制剂，由MF-1微凸出设计进行的输送是高效的， 将40-90％低得涂层输送进了皮肤。
输送研究No.8-15
输送研究No.8-15集中在可提供平衡的输送效率和皮肤耐受性的 微凸出设计。由于出血主要是由刺入太深而引起的，直接与微凸出长 度相关联，选择来用于进一步评估的六个设计(MF-3、MF-4和MF-5) 中，每个都具有225μm的微凸出长度和1316微凸出/2cm2阵列的密 度。
包括八个微凸出阵列设计的研究覆盖了七个输送研究来评估它们 的药物输送性能。通过测定增加药物加样时在无毛豚鼠皮肤体内存在 的荧光素-疫苗含量来测试阵列设计。
现在参看图13A，显示了八个微凸出阵列设计的输送结果汇总。 发现MF-3阵列设计保持了其高输送效率，达140μg的药物涂层，这 是用对照设计所能输送的最大量药物固体涂层。MF-1、MF-6和MF-7 阵列设计的输送效率开始降低接近100μg的药物涂层，使得用这些设 计输送的最大量药物比MF-3更低。
为证实MF-3的性能，制备了DS No.15的一系列MF-3阵列，具 有大范围的涂覆量；涂覆了50到170μg的总固体。图13B中显示的输 送结果表明，DS No.15的输送效率曲线几乎与MF-3阵列在DS No. 8-14中观察到的效率曲线重叠(见表XI)。输送的量最初遵循70等斜 线，直到140μg的拐点，此时输送量就稳定了，尽管涂覆量在增加。 在阵列应用之后的涂层残留物对于较少的涂覆量来说是少的，在140μg 涂覆量时陡然增加，这与所输送涂覆量的突然变化是一致的。
皮肤耐受性(微出血)和穿透相关特性诸如保持性对于评估系统 的安全性和稳固性是重要的。因此将微凸出药贴应用到活的(每个系 统双份)和安乐死的无毛豚鼠(HGP)上分别为3和15分钟。一旦去 除药贴，就评估动物的皮肤反应/微出血(仅活动物)、保持性功能以 及用亚甲基蓝染色的应用部位的穿透评分。
对于保持性，具有保持性特性的微凸出设计(即MF-3、MF-4、 MF-5和MF-7)都显示了在皮肤中可观察到的保持性，随涂覆量增加 而减少。在高涂覆量(MF-3涂覆160μg，MF-1涂覆138μg)的任何 例子中都没有观察到出血。
通过抗原纯度和输送剂量来确定涂覆量的范围。考虑到粗疫苗40 ％的HA纯度，包括赋形剂的总涂覆量将是约150μg每2cm2阵列(对 于45μg HA剂量)和50μg每2cm2阵列(对于15μgHA剂量)。
输送研究No.16
输送研究No.16被用在了几种涂覆低剂量HA的微凸出阵列设计 上，约15μg/阵列，即每个阵列约60-70μg总涂层。包括四个设计 (MF-3、MF-5、MF-6和MF-7)的该研究证明了高剂量是最有效的。
四个阵列设计涂覆了总涂覆量60-70μg，这是基于与DS No.13& 14中所使用的相同的A/Panama/蔗糖制剂。现在参看表XII，显示了 未涂覆的和涂覆的阵列在保持性评分和出血倾向方面的比较。保持性 性能是根据1-5评分系统来评定的。
表XII
阵列设计 保持性(1-5等级) 出血 未涂覆 涂覆 未涂覆 涂覆 MF-6/1 5 4 100％ 25％ 2 5 5 100％ 50％ 3 5 4 100％ 20％ MF-3/1 4 3 75％ 25％ 2 5 4 100％ 50％ 3 4 4 75％ 25％ MF-5/1 4 4 50％ 4-5点 2 3 4 25％ 0 3 3 3 100％ 2-3点 MF-7/1 1 3 2-3点 0 2 3 3 50％ 0 3 3 1 100％ 0
保持性结果表明，(i)未涂覆的阵列优于涂覆的阵列，(ii)性能评 分等级遵循顺序MF-6～MF-3＞MF-5＞MF-5。出血倾向方面观察到了 同样的趋势。总的说来，MF-5设计在保持性和穿透方面是较强的，似 乎在低剂量时提供了更好的皮肤耐受性。
免疫原性研究
在无毛豚鼠(HGP)中进行了四项免疫原性研究。第一项研究确 定了使用肌肉内(IM)注射1、5和50μgA/Panama(H3N2)剂量的抗 体应答动力学和抗原剂量响应。这项研究证明了用1到50μg增加的 HA剂量的初次免疫产生了增加的抗体滴度。在加强免疫时(在的4周 进行)，观察到了1到5μg HA的剂量响应。然而，在5和50μg剂量 之间没有观察到统计差异。在加强免疫后2-3周观察到了峰值抗体滴度 (见图14A)。在总的HA特异性IgG滴度(经ELISA测定)与血凝 素抑制(HI)活性之间建立了关联(见图14B)。根据该数据，此后 使用5μg的HA剂量来评估制剂的HA效力。
进行了第二项免疫研究来评估几种HA/Panama(H3N2)制剂的相 对免疫原性。评估了含有HA/Panama(H3N2)的四种制剂：
(1)40-52mg/mL HA，10％两性洗涤剂3-14
(2)40-52mg/mL HA，5％两性洗涤剂3-14，pH10
(3)40-52mg/mL HA，10％Triton X100，pH10
(4)40-52mg/mL HA，10％Triton X100 pH10
将每种浓缩物的一份转移到钛盘表面上，使其干燥(即“干燥涂 覆”)。在研究中测试了液体浓缩物和干燥涂覆盘两者。在第0天(初 次)和第28天(加强)经IM途径将每种稀释制剂0.1mL体积(5μg 剂量)注射到HGP中。包括对照组，其由等量的5μg剂量(起始材料) 构成。
研究证明所有制剂都能够诱导抗HA的抗体应答，如通过ELISA 和HI分析所测定的(见图15A和15B)。然而，在各种HA制剂之间 存在差别。含有10％Triton X-100(液体或干燥涂覆)或10％SDS (干燥涂覆)的制剂具有降低的免疫效力。所有其它的HA制剂在与 使用起始材料的等量注射剂量相比时似乎没有统计意义。
进行了第三项研究来证明干燥涂覆在微凸出阵列上的单价 A/Panama(H3N2)涂层制剂能够诱导初次和二次HA特异性抗体应 答。包括了使用起始HA材料的IM对照组。使用唯一的微凸出阵列设 计(MF-1)。在微凸出阵列上测试了两种作为目标的HA涂覆剂量(5 和15μg/阵列)的全部4种HA制剂：
HA，两性洗涤剂(10％)，海藻糖(2.5％)
HA，吐温-80(2％)，蔗糖(5％)
HA，Pluronic F68(2％)，海藻糖(2.5％)，甘露糖(2.5％)
HA，蔗糖(5％)
总起来说，该研究的结果(血清HAU滴度)证明初次(滴28天) 和二次抗体(第49天)应答可使用HA涂覆的Macroflux系统来产生 (见图16A和16B)。而且，用药贴免疫的动物中产生了HA特异性 血清中和抗体。加强免疫之后，在更高的目标HA涂覆剂量时可观察 到一些制剂差异。用使用两性洗涤剂3-14/海藻糖的HA制剂免疫的 HGP产生了最高的平均HAI滴度。这个组的血清中和抗体滴度水平与 IM处理对照的最相似。
第四项研究通过HGP中钛微凸出阵列上干燥涂覆的三价流感制剂 的免疫原性测试来评估。研究包括评估两种三价涂层制剂、三种 Macroflux微凸出阵列设计以及两种HA涂覆剂量。三价流感制剂包括 两种A菌株(A/Panama/2007/99[H3N2]和A/New Caledonia/20/99 [H1N1])和一种B菌株(B/Shangdong/7/97)。以1∶1∶1的比例配制HA菌 株。含有三价HA的两种涂层制剂用蔗糖(5％)或者2)吐温80(2％)和 蔗糖(5％)来配制。微凸出阵列设计是MF-1、MF-3和MF-5(直径2 cm2)。加在微凸出阵列设计上的两种HA涂覆剂量定义为“低”(21-23 μg)和“高”(33-45μg)。数据证明三价Macroflux药贴可诱导对每 种HA菌株的初次抗HA抗体应答(HI滴度)(见图18)。使用Macroflux 阵列的两种三价制剂(蔗糖和吐温-80/蔗糖)免疫的HGP所产生的抗体 滴度水平比得上它们各自的肌肉内注射对照。对于抗HA应答来说， 在各种微凸出阵列设计之间或者蔗糖与吐温80/蔗糖制剂之间都没有 发现显著差异。在一些情况下，取决于HA菌株和处理组，观察到了 剂量响应，但并不总是这样。
总的说来，这些免疫原性研究表明表V中所示的每种制剂都是免 疫原性的，尽管相对于起始疫苗具有显著的制剂变化。
短期稳定性
上述讨论的预配过程不仅使抗原经受了冷冻，也经受了一系列应 力事件，包括膜渗滤期间的剪切应力以及冰/水介面和脱水/再水化引起 的应力。在冷冻干燥疫苗重构之后，溶液将如此经受10个循环的冷冻 /解冻(经液氮冷冻，立即在室温解冻)以评估对抗原稳定性的影响， 如果有。如通过ELISA所确定的，10个循环的冷冻/解冻之前和之后 的HA效力没有变化，表明了海藻糖或蔗糖保持了抗原稳定性。
比冷冻干燥还更有应力的工艺步骤是经有效的表面活性剂的再增 溶，诸如高浓度的SDS或两性洗涤剂并剧烈振荡(涡旋)。已知这些 表面活性剂通过改变天然分子的物理构象来变性蛋白质。对于疫苗抗 原，显著构象变化的结果可能是抗原性和免疫原性的完全丧失。在下 面的研究中评估了强表面活性剂存在下的再增溶影响。
在一系列预配步骤包括不用表面活性剂和用SDS(10％)、Triton- X 100(10％)或两性洗涤剂3-14(5和10％)来重构冷冻干燥疫苗之后， 在A/Panama疫苗上进行了SDS-PAGE/Western印迹分析。在考马斯 蓝染色凝胶的非还原条件下(左侧的SDS-PAGE)，显然起始疫苗中 存在的所有条带也存在于重构样品中，表明所评估的任何制剂都没有 可检测的降解。
当凝胶被再次被转移到膜上进行Western印迹分析时，在不同制 剂和起始疫苗之间没有注意到差异。反映HA蛋白和抗HA抗体之间的 结合的一系列条带主要以高分子量存在。根据匹配的条带和条带密度 (相对于起始疫苗)，可以断定，已被冷冻干燥并暴露于高浓度强表 面活性剂的制剂中的HA保持了抗原性。
在还原条件下，所有制剂都显示了类似于起始疫苗在SDS-PAGE 凝胶上的条带。Western印迹上的条带模式在所有制剂之间也都很好地 匹配。结合ELISA分析，HA似乎是稳固的，即使在大量的配制操作 包括用强表面活性剂在强烈涡旋之下的渗滤、浓缩、冷冻、脱水以及 再水化之后也保持了抗原性。
长期稳定性
研究了两种类型的稳定性来筛选和鉴别最佳制剂：(i)涂层的物理 稳定性和(ii)抗原的生化稳定性，这两者都需要在储存期间保持以保持 可输送的目标剂量。
物理稳定性
涂层的物理稳定性包括在特定温度储存一定时间周期之后涂层位 置和形态的保持。为有助于研究，将四种涂层制剂(No.3、5、6和7) 暴露于高温(65℃)达四周。
制剂5&6在65℃储存之前和之后的SEM形态表明，储存四周没 有发生变化。制剂3&7观察到了同样的结果，表明所有四种涂覆的制 剂即使在这样的高温下也是物理稳固的。
生化稳定性
参看表XIII，采用了相似的参数来研究抗原生化稳定性。该研究 涉及四项研究，以加速研究开始来使用单价菌株筛选制剂No.3、5、6 和7。在赋形剂稀释研究中测试了最稳定的制剂，其使用一系列赋形剂 组分中的其它两种菌株。然后将赋形剂稀释研究中确定的优选组合物 在三价制剂中测试，将制剂涂覆在包装于箔袋中的微凸出阵列上，作 为日常稳定性研究的一部分。进行了该最终包装稳定性研究来研究涂 层中的含水量对抗原稳定性的影响。
表XIII
研究类型 制剂 条件 指示稳定性的 分析方法 加速的 A/Panama 3，5，6， 7(表5) 40℃，室温 ELISA 稀释 A/New Caledonia和 B/Victoria 40℃，室温 SRID 包装 三价 2-8，25和40℃ SRID 水份影响 三价 40℃ SRID
加速的稳定性研究
将四种A/Panama制剂(制剂No.3、5、6和7)涂覆在微凸出阵 列上。将每个涂覆的阵列放置在20mL的带有螺旋顶盖的闪烁管中。 将每个管子在阵列操作之后真空干燥以去除吸收的水分，然后密封。 将所有样品在40℃烘箱中保温1、2、4和8周。在每个时间点取出三 个样品(三份)并经ELISA分析HA效力。
现在参看图18，显示了四种制剂的稳定性曲线。两性洗涤剂制剂 (制剂No.3)存在明显的趋势，它的HA效力看起来随保温时间而降 低。也很显然的是，吐温/蔗糖制剂在最终时间点(第8周)时似乎丧 失了大多数HA效力。
在保持效力方面，仅有蔗糖的制剂的稳定性是第三好的制剂， Pluronic/海藻糖/甘露糖制剂是最好的。
然后将以两种不同剂量涂覆的三种上述制剂在室温(真空下)储 存达25周。通过ELISA监测HA效力。参看表IV，海藻糖/甘露糖/ Pluronic制剂(制剂No.7)显示了降低的效力的趋势。其它两种制剂 在比较0时间时的效力时似乎保持了抗原效力。对于制剂No.5和7， 在40℃和室温储存的样品之间的稳定性趋势好象是不同的。
将包括单独的蔗糖以及蔗糖-吐温的两种三价制剂涂覆在阵列上并 储存在密封的、氮气净化的箔袋中40℃达3个月以及5℃和25℃达6 个月。经SRID分析法分析了三种菌株A/Panama(A/P)、A/New Caledonia(A/NC)和B/Shangdong(B/SD)每一种的效力。单独的蔗糖以 及蔗糖-吐温制剂稳定性研究的结果分别示于图19和20。如图19和20 所反映的，两种制剂中所有三种菌株的涂覆阵列在5℃和25℃储存达6 个月都显示了非常好的稳定性。
赋形剂稀释研究
为确定蔗糖制剂的最佳赋形剂成分，将B/Victoria菌株(18％的 HA纯度)与蔗糖按照HA∶蔗糖＝1∶1、1∶2和1∶4的重量比配制。将涂覆 的阵列在40℃保温达8周。将样品储存在-80℃，直到分析之时将所有 样品与1mL水重构，通过SRID在单独凝胶上分析以及通过BCA在 单独的96孔板上分析以消除分析方法之间的差异。稳定性曲线示于图 21中。
在头两周的储存期间观察到的初始降低之后，HA∶蔗糖＝1∶2&1∶4 的制剂似乎在即使40℃的八周始终都是稳定的。然而，对于HA∶蔗糖 ＝1∶1的制剂来说，延续了降低趋势。据信这个现象是由于蛋白酶的存 在而引起的，在纯化时没有完全去除蛋白酶，可能在我们的工艺中被 激活了。
随着蔗糖量相对于HA的增加，似乎存在稳定化效应。用于该研 究的B/Victoria批具有极低的HA纯度，相对于存在的总蛋白质为约 15％，并不被预期具有未来的粗起始材料(≥HA纯度)的特征。然而， 增加蔗糖重量百分比而产生的稳定化效应可能并不能观察到与更高 HA纯度的起始材料相等的相对程度。例如，100mg的15％HA纯度 的起始材料在以1∶1、1∶2和1∶4的HA∶蔗糖比配制时，需要15、30和 45mg的蔗糖。这产生了分别为13、23和37％蔗糖的干重比。然而， 100mg的40％HA纯度的起始材料在以同样的三种比例配制时，将需 要40、80和160mg蔗糖，产生了29、44和54％的蔗糖干重比。结果， 高纯度的1∶1制剂已经接近了1∶4低纯度制剂的干重蔗糖含量。在这些 水平，蔗糖的稳定化效应已经最大可能地达到了稳定水平，任何进一 步的增加蔗糖含量可能将对产物的稳定性影响很小或者没有影响。由 于这个缘故以及为了进一步简化粗加工，将预冻干溶液的蔗糖固定比 例设定为1.0％。由于冻干粉末典型地被重构到1/5的原始预冻干体 积，这将产生5％蔗糖的涂层溶液浓度。
总结
如本领域普通技术人员将可以理解的是，依靠独特的预配过程， 可以将完全的人剂量流感疫苗即45μg的血凝素通过涂覆的微凸出阵 列而经皮肤输送，其中至少70％的流感疫苗被输送到了皮肤中。抗原 也保持了在皮肤中引发强烈的抗体和血清保护性免疫应答的免疫性。 进一步地，干燥的涂覆疫苗制剂基本上不含防腐剂，能够保持至少六 个月的室温稳定性。
不背离本发明的精神和范围，普通技术人员可对发明进行各种改 变和修正，以使其适用于各种应用和情况。因此，这些改变和修正将 适当地、合理地并打算包括在下面权利要求的完全等效的范围中。
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本申请要求2004年4月1日提交的美国临时申请No.60/559,153 的权益。
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