在历史上，已知牛痘病毒被成功用于免疫对抗天花，根据WHO在 1980年将其灭绝。从那时起，已经暂停牛痘接种。目前，认为该病毒 的复活是潜在的威胁，对于未受保护的人群是毁灭性的。问题是在USA 仅有1.5亿剂量天花疫苗可获得，FDA已经作出方针并签定合同来生 产大量对抗天花的疫苗单元药剂。更多信息在 http：//www.bt.cdc.gov/Agent/Smallpox/SmallpoxConsensus.pdf.可获得。
然而，加快生产需要新的生产方法和合适的细胞系。本发明中，我 们描述了来自鸟物种的新细胞系(附着或非附着的)，可以用作医药公 司生产疫苗的基质。这些新的细胞源自鸟胚胎，并可以替换目前所用 的蛋或原代胚胎成纤维细胞。
传统上，通过使用减弱或灭活形式的传染剂，疫苗诱导对疾病的免 疫性。目前减毒的痘病毒特征如在人细胞中不存在复制和免疫响应的 良好诱导，使得使用例如MVA(修饰的病毒安卡拉)作为载体的新疫 苗策略得到发展。MVA是牛痘病毒(VV)的高度减毒株，最初在该 疾病灭绝之前作为天花的安全疫苗来开发。MVA源自Ankara株，通 过原代鸡胚胎成纤维细胞(CEF)超过570连续传代，且作为该适应的 结果，和亲本株相比较，含有几个大的基因组缺失。MVA在大多数哺 乳动物细胞系中不再复制且在动物中是非致病性的。更重要地，当MVA 作为天花疫苗对多于100,000人包括免疫降低的个体给药时，没有报道 过严重并发症。通过分子生物学的传统技术，可以获得含有编码所关 心治疗的特定肽或蛋白质的外源DNA的重组MVA。这些重组病毒注 射后，在体内能够刺激免疫系统来对抗特定抗原如肿瘤抗原。目前， 发展了这些疫苗载体的新世代，或可以发展来对抗人或动物的传染病 和对抗各种肿瘤类型(黑素瘤、前列腺癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、肝 癌……)。
Drexler I等(1998J.Gen Virol.79：347-352)已经观察到高度减毒的 修饰的牛痘病毒安卡拉(MVA)在幼仓鼠肾细胞(病毒繁殖的潜在宿 主)中复制，但在各种人转化的和原代细胞中没有复制；因此，MVA 的宿主范围受到限制。此外，该高度减毒的痘病毒株没有产生生产性 的感染(Moss B，Dev Biol Stand 1994：55-63)。例如，Blanchard TJ等 (1998 J.Gen.Virol.79：1159-1167)已经报道了修饰的牛痘病毒安卡拉在 人细胞中进行有限的复制并缺少几个免疫调节蛋白。此外，产量必须 与天花疫苗大规模生产的经济能力相适应。
MVA强有力的安全记录以及在接种个体中引起的有效细胞和体液 免疫反应在MVA用作重组载体来免疫对抗人和动物传染病中已经产 生了相当大的科学和工业兴趣，尤其是对抗HIV和癌症。假设MVA 适应CEF，则可以在在这样的细胞中生长成高滴定度，且目前的临床 批量重组MVA疫苗候选者是在原代CEF上生产的。然而，CEF的建 立需要制备原代组织培养物的经验并依赖保持于特定无病原体条件下 的鸡的鸡蛋。此外，生产方法是工作量巨大的且难以标准化，由于原 代细胞仅存活有限的代数一些传代并因此连续从胚胎化的蛋制得。虽 然疫苗生产者可以解决生产用于I期和II期临床试验的批量MVA原料 这样的局限性，按比例扩大用于III期临床试验的基于CEF的生产方法 和最终用于后期产品商业化仍然存在严重的障碍。
本发明解决的问题是提供用于复制牛痘病毒的细胞系，其避免了上 述问题且其可以满足管理机构的需要。这就是本发明的目的。
理想地，这样的细胞系是完全管理顺从的；全部用已知的历史来表 征细胞。此外，细胞系是非致瘤的，遗传未改变的，且在长期培养中 是稳定的。细胞系能够复制病毒并适于在无血清培养基中稳定附着和 悬浮生长。在这点上，发明者研究了用于复制病毒用途的鸟细胞。本 发明报道了建立的新的鸟源自胚胎的干细胞，其详述于我们的共同未 决申请PCT/FR03/00735(WO03/076601)中，对于复制痘病毒特别稳 定，尤其是正痘病毒如牛痘病毒。
因为疫苗大规模生产的过程需要无限的细胞增殖，发明者选定检测 鸟源自胚胎的干细胞复制病毒的能力。然而，为了将鸟源自胚胎的干 细胞在体外维持长的时间段，需要观察特定培养和维持条件，如Pain 等(1996，Development 122：2339-2348)；US 6,114,168和EP 787180 中所述的，且这些培养条件是高成本的。问题是能够在经济培养基中 维持鸟源自胚胎的干细胞的培养而避免障碍如细胞分化和衰老。本发 明的内容中，已经发现生长因子、血清和/或滋养层的撤除导致鸟源自 胚胎的干细胞群的分离，该细胞可以在基础培养基中无限生长。
此外，除了大部分是非附着细胞的造血干细胞，根据现有技术获得 的细胞呈现表型。然而，对于病毒疫苗的工业生产，非附着细胞是优 选的。该表型是有利的，因为其既容易处理，避免了使用用于分离的 蛋白水解酶，又因为通过非粘着细胞的体外培养而获得高细胞密度。 本发明描述了鸟源自胚胎的干细胞的生产，其变成自发地非附着的或 通过撤出滋养层而获得非附着性。由于悬浮生长，这些细胞系完全适 于生物反应器中疫苗的工业生产。
除了它们在基础培养基上生长的特征，已经发现这些细胞系可以复 制特定病毒，产量等于或甚至高于现有方法获得的产量，其使得这些 细胞系尤其适于疫苗的大规模生产。

因此，第一方面，本发明涉及在鸟源自胚胎的干细胞中复制病毒的 方法，更具体地为牛痘病毒，如天然或重组牛痘病毒。本发明的方法 包括步骤：将病毒颗粒接种到所述鸟源自胚胎的干细胞，在无生长因 子、滋养细胞和/或动物血清的培养基中培养所述细胞直至发生细胞裂 解，新产生的病毒颗粒释放于所述培养基中。本发明鸟干细胞的接种 用0.001至0.5的m.o.i.(多次感染)来进行，优选实施方案中为0.01 至0.5，最优选实施方案中为0.01至0.1。该方法用于生产疫苗，尤其 是对抗痘病毒科的疫苗，特别是抗天花的疫苗。
所述鸟源自胚胎的干细胞系是通过以下方法可获得的，该方法包 括：
a)在含有使其生长的所有因子和滋养层，优选灭活的，以及补体 失活的血清的完全培养基中培养鸟细胞，优选鸟胚胎的；
b)通过改变培养基来传代，以致获得所述因子、血清和/或滋养层 渐进性的或完全的清除，
c)建立能够在不存在外源生长因子，和/或灭活滋养层和/或低含量 血清或无血清的基础培养基中繁殖的附着或非附着的鸟细胞系；
结果，步骤c)的基础培养基仍然含有低含量血清(即，约2％或更 少)，所述方法可以任选的包括另外的步骤d)：用选自以下的培养基改 变不再含有外源生长因子、不再含有灭活滋养层和低含量血清的基础 培养基，
-补充血清的基础培养基(i)并用无血清培养基稀释，然后培养在 基础培养基(i)中连续传代的所述鸟细胞，其中无血清培养基的比例 逐渐提高直到所述不含有外源生长因子、不含有灭活滋养层和低含量 血清的基础培养基完全消失；
-补充血清的无血清培养基(SFM)(ii)，然后培养在所述培养基 (ii)中的连续传代过程中的所述鸟细胞，其中血清的比例逐渐降低至 获得无血清培养基；
-无血清培养基(SFM)(iii)，然后在培养基(iii)中培养所述鸟细 胞；然后在将适应培养基改变的所述鸟细胞维持于无血清培养基中。
如在此所用的术语《鸟》指的是生物分类学《ava》分类的任何种、 亚种或属，如但不限于，这样的生物如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、 鹦鹉、雀类、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡。术语包括原鸡(gallus gallus)的各种株，或鸡(例如白来杭鸡(White Leghorn)、米奴加鸡 (Brown Leghorn)、Barred Rock、Sussex、New Hampshire、Rhode Island、 Ausstralorp、Minorca、Amrox、California Cray、Italian Partidge-colored)， 以及火鸡、雉、鹌鹑、鸭、鸵鸟和其它常规喂养家禽的株。优选实施 方案中，本发明的鸟细胞是鸡细胞。
如在此所用的术语“使其生长的因子”意思是鸟细胞在培养物中存 活和生长必需的生长因子。根据本发明，生长因子包括营养因子和细 胞因子。营养因子主要是SCF、IGF-1和bFGF。细胞因子主要是通过 与gp130蛋白质相关的受体而作用的细胞因子，如LIF、白细胞介素 11、白细胞介素6、白细胞介素6受体、CNTF、制瘤素和促心激素 (cardiotrophin)。
步骤a)的鸟细胞选自鸟胚胎细胞，更优选选自鸟胚胎干细胞和鸟 原代细胞。优选实施方案中，细胞是从分离的X期胎盘细胞的悬浮群 分离的全能性或多能性鸟胚胎干细胞，胎盘细胞是从鸟胚胎获得的， 更优选为鸡胚胎(参见EYAL-GILADI’s classification：EYAL-GILADI 和KOCHAN，1976，《From cleavage to primitive streack formation：a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick》.“General Morphology”Dev.Biol.49： 321-337)。鸟胚胎干细胞的特征是在39℃培养时包括48至72小时的 慢的倍增时间来表征这些。
为了获得渐进性的或完全的生长因子、血清和/或滋养层的清除， 可以同时、连续或分开进行本发明方法步骤b)中的培养基改变。培养 基清除的次序可以选自：
-滋养层/血清/生长因子；
-滋养层/生长因子/血清；
-血清/生长因子/滋养层；
-血清/滋养层/生长因子；
-生长因子/血清/滋养层；
-生长因子/滋养层/血清；
优选实施方案中，清除的次序是生长因子/滋养层/血清。
特定实施方案中，本发明涉及如上所述的方法，其中建立的细胞系 是附着干细胞，其在不存在灭活滋养层下增殖。在这点上，上述方法 中，步骤b)包括培养基成分的清除(生长因子单独或血清单独或生长 因子然后血清或血清然后生长因子)。
另一实施方案中，本发明涉及如上所述的方法，其中建立的细胞系 是非附着干细胞，其在无外源生长因子的培养基中悬浮增殖。在这点 上，上述方法中，步骤b)包括滋养层渐进性的或全部的清除和然后任 选的培养基其它成分(生长因子和血清)的清除。
另一实施方案中，本发明涉及上述的方法，其中建立的细胞系是非 附着干细胞，其在没有血清的培养基(无血清培养基)中悬浮增殖。
另一实施方案中，本发明涉及如上所述的方法，其中建立的细胞系 是非附着干细胞，其在无外源生长因子和血清的培养基中悬浮增殖。
另一可替换的方案中，步骤b)包括生长因子渐进性的或完全的清 除之后，任选的为血清渐进性的清除。
另一可替换的方案中，步骤b)包括生长因子和/或血清渐进性的或 完全的清除之后，任选的为滋养层的清除。
此外，建立的细胞系是在血清耗尽的培养基中尤其在无血清培养基 中增殖的细胞。表述血清耗尽理解为意思是血清浓度随着时间逐渐降 低。该方法使得可以选择克隆，该克隆适于这些新的，愈加剧烈的条 件直至获得稳定细胞系，其能够在血清耗尽的培养基中或完全无血清 的培养基中生长。
更准确地，方法的步骤a)包括在完全培养基中的约7×104/cm2至 8×104/cm2鸟细胞接种于培养瓶中。优选，用约7.3×104/cm2(4×106 细胞/55cm2或4×106细胞/100mm培养皿)来接种。
“完全培养基”，意思是补充生长因子和动物血清的基础培养基。 完全培养基的实例描述于Pain等(1996，Development 122：2339-2348)， EP 787,180和US6,114,168、US5,340,740、US6,656,479和US5,830,510 中。根据本发明，“基础培养基”意思是有传统培养基配方的培养基， 其自身至少使细胞存活，甚至更好，使细胞生长。基础培养基的实例 是BME(基础Eagle培养基)、MEM(最小Eagle培养基)、培养基199、 DMEM(Dulbecco’s改良Eagle培养基)、GMEM(Glasgow改良Eagle 培养基)、DMEM-HamF12、Ham-F12和Ham-F10、Iscove’s改良 Dulbecco’s培养基、MacCoy’s 5A培养基、RPMI 1640。基础培养基包 括无机盐(例如，CaCl2、KCl、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4、MgSO4，……)、 氨基酸、维生素(硫胺素、核黄素、叶酸、D-泛酸钙，……)和其它 成分如葡萄糖、β-巯基乙醇、丙酮酸钠。
可以示意地区分两类生长因子：细胞因子和营养因子。细胞因子主 要是通过与gp130蛋白相关的受体而作用的细胞因子。因此，LIF、白 细胞介素11、白细胞介素6、白细胞介素6受体、CNTF、制瘤素和促 心激素具有相似的作用模式，在特定链受体的水平募集，后者与单体 或有时杂二聚形式的gp130蛋白结合。营养因子主要是SCF、IGF-1和 bFGF。更优选，完全培养基含有基础培养基、胰岛素生长因子(IGF-1)、 睫状神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受 体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)， 任选的白细胞介素11(IL-11)和动物血清。步骤a)的鸟细胞，优选 鸟胚胎细胞在完全培养基中的几次传代过程中培养。培养基补充至少 一种选自LIF、IGF-1、CNTF、IL-6、IL6R、SCF、bFGF、IL-11、制 瘤素或促心激素的生长因子。
根据优选的实施方案，完全培养基是补充IGF-1、CNTF、IL-6、IL6R、 SCF、bFGF、任选的IL-11的基础培养基。基础培养基中含有的生长因 子IGF-1、CNTF、IL-6、IL6R、SCF、bFGF、任选的IL-11的浓度约 为0.01至10ng/ml，优选0.1至5ng/ml，更优选约为1ng/ml。
约传代3至10次后，清除完全培养基中的生长因子(步骤b)。优 选，对于每种生长因子，从一个传代至另一个传代，在一个步骤中直 接进行清除。或者，逐渐进行生长因子的清除，通过渐进性降低完全 培养基中生长因子的浓度。更优选的实施方案中，同时进行至少两种 生长因子的生长因子清除。优选的实施方案中，生长因子的清除是以 两轮清除进行的：首先，直接从完全培养基中除去SCF、IL6、IL6R， 任选的IL11；然后在含有IGF1和CNTF，任选的IL-11并补充动物血 清的完全培养基中维持鸟细胞培养至少一个传代。其次，从培养基中 直接除去IGF1和CNTF，任选的IL11，其最终含有仅补充血清的基础 培养基。通常，在约传代20至30次时全部清除生长因子。
优选实施方案中，在生长因子去除后进行滋养细胞的去除。滋养细 胞的去除是渐进性的并进行数个传代。现在以低于步骤a)的浓度将鸟 细胞接种于烧瓶中，约4×104细胞/cm2至5×104细胞/cm2。以约4.2 ×104细胞/cm2将滋养细胞接种于瓶中。瓶中滋养细胞的浓度逐渐降低。 实际上，相同浓度的滋养细胞用于2至4次传代，然后较低浓度的滋 养细胞用于另外的2至4次传代，同样继续。然后，瓶接种约4.2×104 滋养细胞/cm2，然后约2.2×104滋养细胞/cm2，然后约1.8×104滋养细 胞/cm2，然后约1.4×104滋养细胞/cm2，然后约1.1×104滋养细胞/cm2， 然后约0.9×104滋养细胞/cm2，然后约0.5×104滋养细胞/cm2。然后烧 瓶接种6.5×104鸟细胞/cm2至7.5×104鸟细胞/cm2且无滋养细胞。假 定中，鸟细胞随着烧瓶中滋养细胞浓度的降低没有良好的形状，然后 在继续滋养细胞清除之前用相同的滋养细胞浓度培养鸟细胞额外的代 数。
另一优选实施方案中，在生长因子和滋养细胞清除后进行血清清 除。通过选自以下的培养基来改变基础培养基：
-补充血清的基础培养基(i)并用新的无血清培养基(ii)稀释。 然后鸟细胞培养基(i)中通过连续传代来培养，其中无血清培养基的 比例逐渐提高至补充血清的基础培养基完全消失(渐进性稀释)。
-补充血清的新的无血清培养基(ii)。然后在培养基(ii)中通过 连续传代来培养鸟细胞，其中血清比例逐渐降低至获得无血清培养基 (渐进性隔绝排除)。
-没有补充血清的新的无血清培养基(ii)。然后将鸟细胞直接在无 血清培养基(ii)中培养(直接排除)。
在一优选实施方案中，通过渐进性排除除去血清。
第一个实施方案中，血清清除的方法(the method of serum deprivation proce)
根据本发明，“无血清培养基”(SEM)意思是立即使用的细胞培养 基，即不需要添加血清使细胞存活和细胞生长。该培养基没有必需的 化学限定，可以含有各种来源的水解物，例如来自植物。优选，所述 SFM是“非动物来源”限定的，即不含有动物或人来源的成分(FAO 状态：“无动物来源”)。SFM中，由重组蛋白替代天然血清蛋白。或者， 根据本发明的SFM培养基不含有蛋白质(PF培养基：“无蛋白质培养 基”)和/或化学限定的(CDM培养基：“化学限定培养基”)。SFM培 养基存在数个优势：(i)首先，这样的培养基是管理顺应性的(实际上， 没有偶发物质如BSE、病毒污染的风险)；(ii)纯化过程的最佳化；(iii) 由于更好限定的培养基，过程中更好的再现性。可购得的SFM培养基 实例是：VP SFM(In Vitrogen参考11681-020，2003目录)，Opti Pro ((In Vitrogen参考12309-019，2003目录)，Episerf(In Vitrogen参考 10732-022，2003目录)，Pro 293 S-CDM(Cambrex参考12765Q，2003 目录)，LC17(Cambrex参考BESP302Q)，Pro CHO 5-CDM(Cambrex 参考12-766Q，2003目录)，HyQ SFM4CHO(Hyclone参考 SH30515-02)，HyQ SFM4CHO-Utility(Hyclone参考SH30516.02)， HyQ PF293(Hyclone参考SH30356.02)，HyQ PF Vero(Hyclone参 考SH30352.02)，Ex细胞293培养基(JRH Biosciences参考 14570-1000M)，Ex cell 325 PF CHO无蛋白培养基(JRH Biosciences参 考14335-1000M)，Ex细胞VPRO培养基(JRH Biosciences参考 14560-1000M)，Ex细胞302无血清培养基(JRH Biosciences参考 14312-1000M)。
本发明还涉及获得鸟细胞系的方法，优选非转化细胞系，能够在无 血清培养基中生长；那些细胞系在任选的含有滋养细胞的完全培养基 中培养。所述方法包括步骤：
-在完全培养基和任选的用滋养层培养鸟细胞，优选非转化的。鸟 细胞可以是上述步骤a)中的鸟细胞，本发明方法建立的鸟细胞系，如 EB1、EB14或S86N45(也称为EB45)，或其它鸟源自胚胎的细胞系如 DF1(US5,672,485和US6,207,415)；
-通过改变或变化培养基至少培养一个传代，为了获得血清的完全 清除，通过渐进性的或直接清除血清。
-建立能够在无血清培养基中生长的附着或非附着鸟细胞系。
本发明依赖于这样的发现：通过从基础培养基中简单除去血清不能 进行从补充动物血清的基础细胞培养基到无血清培养基的传代，而是 需要改变培养基的类型，应该是无血清培养基(SFM)。此外，当鸟细 胞系生长需要生长因子或滋养细胞时，优选在清除生长因子和/或滋养 细胞后清除血清。
滋养细胞是动物细胞，其优选通过照射或用丝裂霉素化学处理而灭 活的。可以在遗传上修饰滋养细胞以表达生长因子如SCF。优选，滋 养细胞是小鼠成纤维细胞系如STO(美国典型培养物保藏中心ATCC N °CRL-1503)。
上述方法可以另外包括步骤，其中步骤c)中获得的细胞接受大规 模生产培养基的选择或适应，以致获得适于确定用于人类或动物治疗 的疫苗生产的克隆。
该方法导致新的鸟源自胚胎的细胞系的建立，其维持体外培养相当 长的时间。有利地，源自步骤c)中所获得细胞系的细胞能够增殖至少 50天、100天、150天、300天或优选至少600天。600天不构成时间 限制，因为更长时间段后获得的细胞系仍然是活的。因此，认为这些 细胞系能够在无外源生长因子、血清和/或灭活滋养层的基础培养基中 无限生长。表述“细胞系”理解为意思是能够在体外培养中无限增殖 而保持或多或少相同程度形态学和表型特征的任何细胞群。当然，上 述方法可以获得源自建立细胞系所获得细胞的细胞克隆。这些克隆在 遗传上与通过分裂衍生的细胞是相同的。
建立的细胞系和源自其(步骤c或d)的细胞优选是源自胚胎的鸟 干细胞系，更确切地那些细胞是多能性的鸟源自胚胎的干细胞。通过 本发明方法可获得的鸟源自胚胎的干细胞是小的、圆的、单个的细胞， 在39℃具有约24小时或更短的倍增时间。通过本发明方法可获得的细 胞至少是传代p60的、至少p70、至少p80、至少p90、至少p100、至 少p110、至少p120或至少p1300或更后的。根据本发明的鸟源自胚胎 的干细胞具有至少一个以下特征：
-高的核-细胞质比例，
-内源碱性磷酸酶活性，
-内源端粒酶活性，
-与选自抗体SSEA-1(TEC01)、SSEA-3或EMA-1的特异性抗体 的反应性。
-短于本发明方法步骤a)鸟细胞倍增时间(39℃48至72h)的倍 增时间，相同培养条件下约24小时或更短。
-这些细胞系和源自其的细胞能够在基础培养基中增殖至少50天、 100天、150天、300天，或优选至少600天，尤其是在补充各种本领 域技术人员常用添加剂的培养基中如DMEM、GMEM、HamF12或 McCoy。添加剂中，包括非必需氨基酸、维生素和丙酮酸钠。然而， 细胞能够在无谷氨酰胺的基础培养基中增殖。
-这些细胞系和源自其的细胞具有作为附着细胞或作为悬浮细胞 生长的特征。
优选，本发明的细胞系具有全部上述特征。
本发明建立的鸟细胞系和源自其的细胞用于生物制剂如重组肽和 蛋白质(即，抗体、激素、细胞因子，……)、病毒、病毒载体、病毒 颗粒和病毒疫苗的生产。
更确切地，本发明建立的鸟细胞系和源自其的细胞用于病毒和/或相 关载体和颗粒的复制，用于生产活的或减毒的、重组的或未重组的、 对抗疾病如癌症和传染病的疫苗。病毒、相关的病毒载体、病毒颗粒 和病毒疫苗优选选自腺病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、正粘病毒、 乳多泡病毒、副粘病毒、细小核糖核酸病毒、痘病毒、呼肠孤病毒和 逆转录酶病毒。优选实施方案中，病毒、相关的病毒载体、病毒颗粒 和病毒疫苗属于痘病毒科，更优选属于脊索痘病毒科 (chordopoxviridae)。更优选，病毒或相关的病毒载体、病毒颗粒和病 毒疫苗是禽痘病毒，选自鸡痘病毒、金丝雀痘病毒(即ALVAC)、灯 芯草雀痘病毒、八哥痘病毒(mynahpox virus)、鸽子痘病毒、鹦鹉痘 病毒(psittacinepox virus)、鹌鹑痘病毒、麻雀痘病毒、燕八哥痘病毒、 火鸡痘病毒。根据另一优选实施方案，病毒是牛痘病毒。
另一实施方案中，病毒、相关的病毒载体、病毒颗粒和疫苗属于正 粘病毒科，尤其是流行性感冒病毒，和属于副粘病毒族，尤其是麻疹 病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒。
本发明还涉及在本发明建立的鸟细胞系中表达和/或产生的生物制 剂，尤其是蛋白质和疫苗。
优选实施方案中，本发明涉及本发明建立的附着或非附着鸟干细胞 系的用途，该细胞系是遗传、生物或化学未修饰的，能够在培养物中 无限增殖，并具有上述特征，用于复制活的或减毒的正痘病毒科的病 毒，更特别的是的或减毒的牛痘病毒或重组牛痘病毒。
本发明的目的在于用如上所限定的附着或非附着细胞来生产活的 或减毒疫苗的用途，包括培养根据上述方法在步骤c)或d)中建立的 附着或非附着细胞系，将病毒颗粒接种所述细胞，并在上述的基础培 养基中培养所述细胞直至发生细胞裂解，收集释放于所述培养基中的 新产生的病毒颗粒。本发明对于生产属于正痘病毒科的减毒病毒尤其 有用，尤其是牛痘病毒，Lister-Elstree牛痘病毒株，修饰的牛痘病毒如 可以从ATCC(ATCC编号VR-1508)获得的修饰牛痘病毒安卡拉 (MVA)，NYVAC(Tartaglia等，1992 Virology 188：217-232)，LC16m8 (Sugimoto et Yamanouchi 1994 Vaccine 12：675-681)，CV178(Kempe 等，1968 Pediatrics 42：980-985)和其它重组病毒。有利地，感染源自 建立的细胞系的细胞，以生产活的牛痘病毒或减毒病毒，其是修饰的 牛痘病毒和/或重组牛痘。可以通过本领域技术人员可获得的任何技术 感染所述细胞。
或者，转染或修饰源自建立细胞系的细胞，以生产活的牛痘病毒或 减毒病毒，其是修饰的牛痘病毒和/或重组牛痘。通过本领域技术人员 可获得的任何技术来修饰所述细胞，尤其是通过非同源的或同源的， 直接和/或条件重组(Cre-Lox或FLP-FRT系统)，通过任何载体、质粒、 病毒或重组病毒尤其是通过逆转录病毒或重组逆转录病毒帮助的来转 化。
一特定实施方案中，本发明涉及生产活的或减毒疫苗的方法如抗天 花的疫苗，包括培养根据上述方法的步骤c)或d)中建立的附着或非 附着细胞系，将病毒颗粒接种所述细胞，并在上述基础培养基中培养 所述细胞直至发生细胞裂解，收集释放于所述培养基中的新产生的病 毒颗粒。本发明对于生产属于痘病毒科的减毒病毒特别有用，尤其是 牛痘病毒，Lister-Elstree牛痘病毒株，修饰的牛痘病毒如可以从ATCC (ATCC编号VR-1508)获得的修饰牛痘病毒安卡拉(MVA)，NYVAC (Tartaglia等，1992 Virology 188：217-232)，LC16m8(Sugimoto et Yamanouchi 1994 Vaccine 12：675-681)，CV178(Kempe等，1968 Pediatrics 42：980-985)和其它重组牛痘病毒。例如，可以使用MVA如 抗天花的疫苗。
第二个特定实施方案中，本发明涉及生产活的或减毒疫苗的方法， 如抗疾病的疫苗，更优选后天的或传染病，所述方法包括培养根据上 述方法的步骤c)或d)中建立的附着或非附着细胞系，将病毒重组颗 粒接种所述细胞，并在上述基础培养基中培养所述细胞直至发生细胞 裂解，收集释放于所述培养基中的新产生的病毒重组颗粒。例如，可 以使用重组MVA来表达对抗以下疾病的抗原：
-后天性疾病，如但无限制，前列腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺 癌、乳癌、黑素瘤；
-传染病，如但无限制，AIDS(HIV病毒)、甲肝、乙肝、丙肝、 疟疾、狂犬病、黄热病、日本脑炎、腮腺炎、麻疹、风疹。
通过上述方法生产的疫苗是本发明的一部分。
对于说明书的剩余部分，将参考以下的图例。
附图说明
图1：本发明一细胞系的生长曲线，显示细胞的长期复制。
图2：S86N45(EB45)(附着)和EB14(悬浮)细胞的群倍增时 间。
图3：温度对S86N45(EB45)细胞生长动力学的影响。
图4：本发明一细胞系的生长曲线，显示细胞随着血清清除(达2％ 血清)的长期复制。
图5：S86N45(EB45)和EB14细胞在无血清培养基(SFM)中生 长的适应。
图6：EB14悬浮细胞在2L生物反应器中无血清培养基中的培养。
图7：本发明一细胞系的生长曲线(S86N16)，显示细胞随着滋养 层撤除的长期复制。
图8：显示鸟干细胞形态特征的照片。
N：核，n：核仁，C：细胞质
(分离的S86N99，40倍放大，用Sony Cyber-shot数码相机拍摄)
图9：显示附着或悬浮鸟干细胞的碱性磷酸酶活性的照片。
固定后(0.1％甲醛/0.5％戊二醛，4℃30分钟)，将细胞在1×PBS 中漂洗两次，并在NBT/BCIP溶液中(硝基蓝四唑氯0.375mg/ml，5- 溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐0.188mg/ml，0.1M Tris pH9.5，0.05M MgCl2，0.1M NaCl)37℃孵育10至30分钟。通过两次1×PBS洗涤来停止反应， 并拍摄照片。
A-说明了在无滋养层或因子的条件下培养的附着细胞系S86N45 p87获得的内源碱性磷酸酶的特征性紫罗兰染色，(40倍放大，Sony Cyber-shot数码相机)。
B-说明了从8次传代维持悬浮的EB14细胞系获得的内源碱性磷酸 酶的特征性紫罗兰染色，该细胞系源自S86N45细胞，在无滋养层或因 子的条件下悬浮培养(20倍放大，Sony Cyber-shot数码相机)。
C-S86N45(EB45)细胞特异性标记。
图10：CEF和附着S86N45(EB45)细胞的病毒敏感性(感染后 72小时-MOI0.1)。
图11：CEF和附着S86N45(EB45)细胞在各种多次感染(MOI) 的病毒敏感性(感染后48小时)
图12：附着S86N45(EB45)细胞上MVA-GFP的增殖动力学。
图13：悬浮EB14细胞上MVA-GFP的增殖动力学。
图14：DMEM-F12培养基上生长的S86N45(EB45)细胞上 MVA-GFP复制。
图15：DMEM-F12培养基上生长的S86N45(EB45)细胞上野生型 MVA病毒的复制(MOI：0.1)
图16：含有血清培养上悬浮EB14细胞上的MVA复制(MOI：0.2)
图17：无血清培养基中悬浮EB14细胞上的MVA复制(MOI：0.01)
图18：无血清培养基中悬浮EB14细胞上的MVA产量(MOI：0.01)

实施例1：附着细胞的产生和建立
打开蛋，在打开过程中从蛋白中分离出蛋黄。直接或借助Pasteur 移液管，或借助小的吸附滤纸(Whatmann 3M纸)从蛋黄中取出胚胎， 纸片预先用打孔机裁出穿孔环的形式。孔的直径约为5mm。将这些小 环在烤炉中使用干热灭菌约30分钟。将这小纸环放置于蛋黄表面，并 居中于胚胎上，因此使纸环围绕胚胎。然后用小剪刀剪裁后者，并整 个取出放置于装满PBS或生理盐水的培养皿中。因此清洗掉环带出胚 胎的介质中过多的蛋黄和胎盘，因此用Pasteur移液管收集无过量的卵 黄磷蛋白。
两种情况中，将胚胎放置于含有生理介质(1×PBS，Tris葡萄糖、 培养基等等)的管中。然后将胚胎机械分离并接种于“滋养”放入限 定的培养基中。用于培养的优选条件中，优选将包括MacCoy或DF12 的培养基作为基础培养基，补充初始浓度12至8％的胎牛血清，1％的 非必需氨基酸，1％商业来源的维生素混合物，终浓度1mM的丙酮酸 钠，终浓度0.2mM的β-巯基乙醇，终浓度2.9mM的谷氨酰胺，抗生 素的初始混合物，含有10ng/ml终浓度的庆大霉素，100U/ml终浓度的 青霉素和100μg/ml终浓度的链霉素。细胞头几次传代后不久，不再将 抗生素混合物加入培养基中。表述不久理解为意思是通常开始3至5 次传代后。还可以加入核苷混合物，该混合物如上制得(Pain等，1996)。 在这些相同条件下测试的基础培养基中，给予了相似结果的是 HamF12、Glasgow MEM和DMEM培养基，后者补充终浓度8mg/l的 生物素。通过比较，生物素浓度为MacCoy培养基中0.2mg/ml，HamF12 中0.0073mg/l，商业DMEM和GMEM培养基中为0。
加入培养基中的生长因子和细胞因子优选是重组的因子和细胞因 子，包括终浓度1ng/ml的小鼠SCF，终浓度1至5ng/ml的IGF-1，终 浓度1ng/ml的CNTF，终浓度1ng/ml的IL-6，和终浓度0.5ng/ml至 1ng/ml的可溶IL-6受体。一些实验中，可以在头几次传代过程中加入 一些其它因子。例如达3或10次传代，可以将终浓度1ng/ml的bFGF 和终浓度1ng/ml的IL-11加入培养基中。
进行该培养基中灭活“滋养层”上的接种，滋养层由建立的小鼠成 纤维细胞系构成，如STO细胞。一些情况中，用简单表达载体转染这 些细胞，载体可以在STO细胞中组成型表达如鸟SCF的生长因子。因 此，该“滋养层”产生了在细胞膜中可溶和/或附着形式的因子。
将细胞初次直接接种于该培养基后，根据观察到的原代细胞的附着 速率，可以加入新鲜培养基或第二天部分改变培养基，然后在随后的 日子中部分或全部改变。根据情况约4至7后，分离初始培养物并转 入新培养皿中灭活滋养层上的相同初始培养基中。三至五次传代后， 在灭活STO细胞滋养层上培养细胞，STO细胞是非转染的或用编码抗 生素抗性如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素抗性基因等等表达载体转染的。 约二十次传代后，将细胞渐进性清除生长因子和细胞因子。表述“逐 渐清除”理解为意思是从培养基中生长因子接着生长因子去除，或生 长因子组接着生长因子组去除。第一个实施方案中，在一个传代，首 先除去全部SCF，然后在两个或三个传代后，例如除去另一种生长因 子如IGF-1。如果细胞没有呈现形态改变或平均增殖速率的改变，然后 除去其它因子，如CNTF和IL-6。第二个优选实施方案中，以生长因 子组接着生长因子组来进行生长因子的清除。除去包括SCF、IL6、IL6R 和IL11的第一组生长因子，然后除去包括IGF1和CNTF的第二组。 第三个实施方案中，该清除还可以是剧烈的。在这种情况中一次除去 所有的因子。然后观察细胞，如果仅传代数天后其增殖速率改变了。 较后面的溶液通常是被实践过的。
因此获得各种分离物并维持非常长的时间段。表述非常长的时间段 理解为意思是大约数周次的时间段，最小为50天，优选长于200至400 天的时间段，在时间上无限制。观察到长于600天的时间段。
与所用的支持物无关，用蛋白水解分离酶分离所有附着细胞，如链 霉蛋白酶、胶原酶、分散酶、胰蛋白酶等等。优选，为了避免任何可 能的动物来源的污染，使用细菌来源的蛋白水解酶。这些细胞具有所 示特定形态的胚胎干细胞的特征，例如，通过图8的照片，即大小小、 大的核-细胞质比例，具有至少一个清楚可见核仁的核，和非常小的细 胞质。通过以或多或少紧密实体形式物质生长来表征这些细胞。附着 和非附着细胞呈现与许多抗体的交叉反应性，如上Pain等(1996)以 及专利US 6,114,168和EP787,180中所述的。还存在内源端粒酶活性 成份，且是这些细胞“干”性能中的重要因素。
获得不同的细胞分离物，并维持长时间段。表1说明了这些分离物 的一些特征。
表1   名称   物种   开始   停止   天数   传代   世代   S86N16   鸡S86N   26-01-2000   05-08-2001   559   207   692   WL3   鸡WL   28-06-2000   09-08-2001   403   153   333   Valo4   鸡Valo   26-09-2000   07-02-2002   401   135   317   S86N45   鸡S86N   29-01-2001   12-11-2001   287   118   329
注意到术语“停止”不对应于细胞增殖的结束，而是实验者故意停 止细胞培养物的。世代数n通过公式X＝2n获得或X是理论的细胞累积 数目。该数字是可获得的，因为每次传代和每次接种中进行细胞计数。 培养的完整记载因此是可获得的。
S86N45细胞也称为EB45。
实施例2：细胞的传代
干细胞尤其是体干细胞和胚胎干细胞的特征之一是它们在体外增 殖相当长时间段的能力。为了繁殖和传代细胞，在传代数小时之前用 新鲜培养基来改变和替换培养基。图1中所示的曲线说明了细胞生长 和建立的特征。
实施例3：倍增时间和平均分化时间
3.1用培养中建立的细胞和之前实施例中所示的细胞开始，计算平 均分裂时间。对于获得的所有独立分离物，在连续传代过程中增殖速 率略有提高，因此导致在细胞建立过程中的平均分裂时间改变。附着 阶段中，最初将细胞接种于灭活滋养层上并以1至2×106细胞每 100mm培养皿(55cmm2培养皿)的恒定起始接种密度有规律地传代。 表2说明了3个建立的细胞类型倍增时间(d)和平均分裂时间(以小 时计的MDT)为培养时间的函数。观察到在建立过程中平均倍增时间 缩短。
表2：   细胞/天数   50   100   150   200   250   300   350   400   450   500   550   S86N16(d)   0.30   0.63   1.00   0.86   1.13   1.15   1.47   1.70   1.94   1.50   1.9   S86N16(MDT)   80   38   24   27.9   21.2   20.9   16.3   14.1   12.4   16   12.6   S86N45(d)   0.49   0.89   0.89   1.45   2.15   X   X   X   X   X   X   S86N45(MDT)   49   26.8   27   16.5   11.1   X   X   X   X   X   X   Valo4(d)   0.03   0.61   1.00   1.17   1.26   1.03*   1.08*   1.25*   X   X   X   Valo4(MDT)   ＞48   39.3   24   20.5   19   23.3   22.2   19.2   X   X   X
用以下公式：d＝(1/Log2×(LogX2/X1))×1(T2-T1)建立以天 数表示时间段的平均倍增时间d，其中X2和X1是时间T2和T1的细 胞总数。该公式是实施例1中所示公式X＝2n计算世代数N的直接结果。 然后通过将d除以24小时获得以小时计的平均分裂时间(MDT)。
*在该建立过程中Valo细胞在不存在滋养层的塑料支持物上传代。 当细胞对该新环境重新适应时，倍增时间缩短，然后再增加。
3.2-鸡具有39℃的体温。因此S86N45(EB45)和EB14细胞生长 动力学的分析开始在39℃进行。在这些条件下，细胞表征为非常短的 世代时间，通常15至20小时(图2)。
实施例4：细胞培养温度
S86N45(EB45)和EB14细胞在39℃非常快的周期对于有效的MVA 病毒生产是次优的。因此还分析了37℃和35℃的细胞生长(图3)。如 所期望的，细胞周期在37℃降低。这样的条件原则上更适于病毒增殖 并因此在以下所述的MVA实验中选用。相关地注意到S86N45(EB45) 细胞和EB14细胞还可以在35℃生长，虽然具有更短的动力学。S86N45 和EB14细胞对低温(35℃甚至33℃)的适应对于活的减毒的热敏感 性病毒疫苗的生产尤其有用。
实施例5：细胞系增殖血清含量的控制
5.1-低血清浓度的培养基
获得这些细胞系的过程中，所用的培养基是常规培养基，含有补充 各种添加剂如非必需氨基酸、维生素和丙酮酸钠的基础培养基 (DMEM、GMEM、HamF12、McCoy等等)。该复合培养基包括胎牛 血清，其仍然是培养基的关键成分，尽管可以逐渐使用不同来源的成 分，包括植物成分。提出了控制并使细胞习惯相对低比例胎牛血清的 方法。因此可以用低百分比的血清维持细胞的高增殖(分裂时间＞1) (例如S86N16细胞的情况中为2％)。
图4所示的曲线说明了所给细胞类型S86N16细胞的血清相对减少。 还计算了倍增时间和平均分裂时间，并列于表3中。注意到平均分裂 时间随着血清相对减少的函数而提高。尽管在上述条件下培养一段时 间后观察到恢复期。尽管该时间保持低于24h(d＞1)，其已经代表了就 工业化而言非常有利的增殖，甚至在2％血清浓度，其已经是相对低的 了。为了提高该时间和再进一步最佳化培养条件，可以观察关于使用 不同代谢物的改进。
表3：S86N16细胞的倍增时间和平均分裂时间   条件   10％   7.5％   3.75％   2％   d   2.02   1.51   1.47   1.08   MDT   11.9   15.8   16.3   22.2
对于10％的条件取传代p204和p179之间的样本，对于7.5％的取 p198至p176之间的，对于3.75％的取p224至p201之间的，对于2％ 的取p216和p199之间的。
5.2-对无血清培养基的适应&在生物反应器中生长
通过S86N45(EB45)和EB14细胞对无血清培养基的适应获得了 主要的进一步提高。测试了几种配方并鉴定了使S86N45(EB45)和 EB14细胞有效生长的一对无血清培养基配方(图5)。
此外，可以进一步扩大EB14细胞在含有血清的和无血清培养基中 的培养，因为在2L生物反应器中重复证明了有效生长(图6)。此外， EB14细胞还可以在3L搅拌罐生物反应器中有效生长并达到超过2百 万细胞/ml的密度。
实施例6：滋养层细胞的清除
为了获得如上所述的胚胎干细胞，在初始培养条件下，灭活细胞层 是必需的。在多次传代后，不再有该滋养层是必需的。只有“培养处 理的”塑料是重要的。实际上，一些真核干细胞的特征之一是以附着 形式增殖。为了有助于细胞的附着，所用的各种塑料材料是“培养” 处理的。在其制造过程中它们经受了处理，在塑料表面添加了电荷， 该电荷促进了细胞胞外基质的附着。相反，细胞培养未处理的塑料， 通常称为细菌学性质的塑料，没有通过添加特定滋养层来处理表面。 细胞附着于此是非常困难的，甚至不可能，或然后诱导形态学改变， 和通常剧烈的行为。根据其中进行的接种两种塑料性质之间的区别使 其可以获得具有不同行为的细胞。灭活“滋养层”的逐渐清除使其可 以在一些传代后获得直接接种于“培养处理的”塑料上的干细胞同源 培养物。
S86N16细胞维持于存在和不存在灭活“滋养层”的细胞的比较生 长曲线列于图7中。细胞的这种适应是渐进性的，以致没有失去初始 维持于“滋养层”上细胞的干细胞特征。因此完成渐进性清除。获得 在塑料上增殖的细胞是清除方法的完成。表4中，分裂时间显示细胞 对其环境的敏感性。如在血清渐进性清除的情况中，在限定条件下的 一些传代后获得适应，伴随对细胞的恢复效果。
表4：   条件   1.2   0.5   0.3   塑料   d   1.95   1.84   1.39   1.42   MDT   12.3   13   17.3   16.9
对于1.2×106、0.5×106和0.3×106滋养细胞的3个条件，取传代 p154和p131之间的样本，对于单独在塑料上的条件，取p161和p139 之间的样本。
实施例7：细胞生长因子的清除
在初始培养条件下，生长因子的存在是必需的。可以示意地区分两 类因子：细胞因子和营养因子。
细胞因子主要是通过与gp130蛋白相关的受体作用的细胞因子。因 此，LIF、白细胞介素11、白细胞介素6、CNTF、制瘤素和促心激素 具有相似的作用模式，在特定链受体的水平募集，后者与单体或有时 杂二聚形式中的gp130蛋白结合。一些情况中，可溶形式受体的组合， 所述形式中特别是白细胞介素6和CNTF的受体，可以提高所观察到 的增殖效果。之前已经显示加入这些细胞因子中的至少一种对于获得 胚胎干细胞是必需的。
营养因子主要是SCF、IGF-1和bFGF，如上所述，其也用于培养的 开始。它们的存在对于获得和扩增细胞也是必需的。
通过渐进性减少这些生长因子，一些传代后在没有添加外源生长因 子而可以获得使胚胎或体干细胞增殖的培养条件。用于表征这些细胞 的不同标记通常对于没有因子维持的细胞是阳性的。
实施例8：所用培养基的比较
接种于不同培养基，没有获得相同频率的细胞。培养基组成的比较 使一种成分的鉴定尤其困难。更可能的是整个组合物使得细胞的生理 学得到提高。优选培养基中，注意到Ham F12培养基、MacCoy培养 基、DMEM培养基、DMEM-F12培养基和富含生物素的DMEM培养 基。用这样的分离物开始，在这些不同的培养基中进行适应试验。
实施例9：非附着细胞的建立
在干细胞连续传代的过程中，直接接种于细菌学培养皿的高密度接 种可以在一些传代后获得胚胎细胞，其从其基质上脱离并以小的规则 聚合体的形式悬浮增殖。在几次传代中通过更多稀释，机械分离且没 有使用蛋白水解酶来促进该增殖。通常进行培养物的搅拌，但并不表 示是获得非附着细胞的特征因素。和附着细胞一样，这些细胞具有干 细胞的特征性形态，即，大小小，大的核-细胞质比例，具有至少一个 清楚可见核仁的核和小的细胞质。这些细胞通过或多或少紧密的小聚 合体生长来表征(图8)。这些非附着细胞呈现与多种抗体的交叉反应 性，如上Pain等(1996)中所述的。这些细胞对于内源端粒酶活性也 是阳性的(如实施例10中所列的，对于EB1、EB4和EB5细胞)。非 附着阶段中，细胞在不同培养基中呈现高度增殖。初始接种密度和新 鲜培养基非常规律的供给提供了高密度，约高于1×106细胞每ml。表 5总结了一些分离物的主要特征(亲本细胞、形成悬浮的初始传代、悬 浮培养维持的天数、维持自动停止之前获得的传代数和世代)。因此可 以注意到一种分离物与另一种分离物之间形成悬浮的传代(参见分离 物EB1和EB14)以及增殖速率(参见分离物EB3和EB14)可以不同。
表5：   名称     亲本细   胞   初始传   代   开始     天数     传代     世代     EB1   S86N16   p111   20-01-2001   184   41   120   EB3   S86N16   p118   23-01-2001   381   17   40   EB4   S86N45   p100   25-09-2001   44   17   40   EB5   S86N45   p100   25-09-2001   44   17   40   EB14   S86N45   p81   05-09-2002   70   24   65
注意到术语“开始”对应于非附着下放置的细胞。
我们还发现数次传代后在任何时刻可以从用或不用滋养层增殖的 附着干细胞获得非附着细胞。
实施例10：所建立细胞的表征
用如上所述(Pain等，1996)的相同标准来表征维持长培养时间的 干细胞。因此可以有规律地检测内源碱性磷酸酶活性，通过图9a-9b 的照片来说明，内源端粒酶活性(图9c)以及与特定抗体如抗体SSEA-1 (TEC-01)和EMA-1的反应性。
细胞系建立过程中重要标准之一是端粒酶的存在。在细胞维持培养 的过程中，使用TRAP检测试剂盒(端粒酶PCR酶联免疫吸附测定， Roche)来进行各种测试，经过不同的培养传代后，细胞检测为阳性。 因此，对于S86N16细胞、S86N45(EB45)细胞，以及对于源自其的 非附着形式的EB1、EB4和EB5细胞，端粒酶活性是可检测的(参见 表6)。认为维持于原代培养中的CEFs(鸡胚胎成纤维细胞)是阴性的。 OD＜0.2的阈值是试剂盒推荐的作为阴性极限的阈值。所有分析都以相 等的2000个细胞来进行。
表6：不同传代中各种细胞端粒酶活性的测定   细胞   传代   端粒酶OD   S86N16   p12   p29   p185   p204   1.7   2.8   0.97   0.95   S86N16EB1   p134   1.1   S86N45(EB45)   p50   p58   p66   p94   0.87   1.1   0.96   1.2   EB4   p112   1.4   EB5   p112   0.94   CEF*   p4   0.07
*CEF：鸡胚胎成纤维细胞
特别重要，本发明的细胞保存一些实质性的“干细胞”特征。它们 表达已知在小鼠、鸡和人胚胎干细胞中存在的一系列干细胞特异性标 记(例如，碱性磷酸酶、SSEA-1、EMA-1、端粒酶)(图9)。如所 期望的，在加入视黄酸(RA)或DMSO诱导细胞分化的实验中失去这 些标记的表达(表7和图9c)。它们在体外无限复制(图1)；数个候 选细胞系培养已经超过一年而没有特定障碍，如分化。
表7：ES细胞特异性标记：
“在用视黄酸分化时，标记表达减少”   标记   无视黄酸   用视黄酸   碱性磷酸酶   ++++   -   SSEA-1   90   ＜10   EMA-1   90   10   端粒酶活性(OD)   ＞1.5   ＜0.2
以标记细胞的百分比来表示标记SSEA1和EMA1。
实施例11：细胞的转染和诱导
用各种表达质粒转染维持长时间生长的干细胞。已经显示鸟干细胞 是可以转染的(Pain等，1996)。尤其是，非附着细胞得到转染，各种 分选系统使其可以鉴定稳定转染的细胞(细胞分选、极限稀释等等)。 可以在干细胞未分化阶段进行这些遗传修饰。一旦获得该修饰，然后 诱导细胞自然分化或通过加入分化诱导剂。这种情况下，可以使用浓 度10-8M至10-6M的视黄酸，或终浓度1至2％的二甲亚砜或浓度为10-4 至10-8M的丁酸钠，或终浓度1至5μg/ml的佛波醇酯(TPA、PMA 等等)或脂多糖(LPS)。另一实施例中，在悬浮液中细胞可以形成胚 状体，在组成它们的细胞分离或非分离后，可以使该胚状体粘着塑料。 然后这些分化的细胞增殖，但对于长时间增殖具有更有限的能力。通 过针对影响细胞增殖的基因的遗传修饰，可以使这些分化的细胞能够 长时间增殖。
实施例12：用病毒感染非附着鸟细胞系(EB1)的实验方案 细胞的扩增：
以0.2×106细胞/ml的浓度将EB1或EB4细胞接种于培养基中，优 选MacCyo’s 5A、HAMF12或DMEM培养基，或任何所关心的培养基， 含有5％血清，通常50ml的初始体积。在39℃和7.5％CO2的条件下维 持培养，伴随搅拌。为了达到100至250ml终培养体积的1至3×106 细胞/ml的细胞浓度，每天加入新鲜培养基3至4天，使其扩增持续。
收集悬浮细胞并在约1000rpm离心10分钟。将沉淀重悬浮于20至 50ml的1×PBS(磷酸盐缓冲盐)中。然后将细胞计数、离心并将沉淀 的细胞以3至5×106细胞/ml的终浓度放入无血清培养基中。然后在这 些条件下制得几个管子，每管含有3至5×106细胞。
病毒的制备和感染
将具有已知滴定度的病毒储备在37℃快速解冻并以10×至1000× 最终感染所需浓度的滴定度稀释于无血清培养基中。根据病毒的类型 用所关心病毒以0.01至0.5的m.o.i.(感染复数)感染细胞，其包括将 0.1至10％体积/体积的病毒悬浮液加入细胞沉淀中。在通常为33℃至 37℃的病毒最佳温度孵育1小时后，将细胞再次离心并小心除去培养 基。为了限制初始病毒对随后过程的影响，发现该步骤通常是必需的。 一种可能性是用含有血清的培养基(5％血清)直接稀释细胞至终浓度 0.2至1×106细胞/ml而没有再次离心，并再次孵育。
上清液和细胞的收集
孵育2至4天后，根据特定病毒的病毒动力学和潜在的致细胞病变 作用，收集含有细胞或细胞碎片的培养基。根据病毒，只有沉淀或上 清液是所关心的并含有病毒颗粒。收集细胞并离心。将收集的上清液 在2500rpm再次离心5至10分钟，并在颗粒纯化之前保存于-80℃。 为了进行滴定，收集等份试样。将细胞沉淀放入5ml无血清培养基中， 超声处理并在2500rpm离心5至10分钟。将获得的上清液保存于-80 ℃直至等份试样的纯化和滴定。
比较各种所进行条件之间的病毒感染和生产效率。对于具有致细胞 病变作用的病毒，通常通过溶菌斑技术来进行滴定。
实施例13：用病毒感染附着鸟细胞系(S86N45)的实验方案
细胞的扩增：
在感染48小时之前将细胞以0.03至0.06×106细胞/cm2的浓度接种 于T150瓶中的培养基中，优选，MacCyo’s 5A、HAMF12或DMEM 培养基，或任何其他所关心的培养基，含有5％血清。将它们维持于39 ℃和7.5％CO2。
感染：
将具有已知滴定度的病毒储备在37℃快速解冻并以10×至1000× 最终感染所需浓度的滴定度稀释于无血清培养基中。根据病毒的类型， 用所关心的病毒以0.01至0.5的m.o.i.(感染复数)感染细胞，其包括 将0.1至10％体积/体积的病毒悬浮液加入细胞单层中。感染通常在含 有0％血清的最小培养基(对于75cm2瓶5至10ml)中进行。在通常为 33至37℃的病毒最佳温度孵育1小时后，将20ml 5％培养基加入瓶中。 特定情况中，用PBS洗涤细胞，以便除去可能粘着在细胞上的颗粒。 在致细胞病变病毒的情况中，为了监控表明感染良好进程的细胞裂解 的出现，感染后每天观察细胞。
上清液和细胞的收集
孵育2至4天后，根据特定病毒的病毒动力学和潜在的致细胞病变 作用，收集含有上清细胞或细胞碎片的培养基。根据病毒，只有沉淀 或上清液是所关心的并含有病毒颗粒。收集细胞并离心。将收集的上 清液在2500rpm再次离心5至10分钟，并在颗粒纯化之前保存于-80 ℃。为了进行滴定，收集等份试样。将细胞沉淀放入5ml无血清培养 基中，超声处理并在2500rpm离心5至10分钟。将获得的上清液保存 于-80℃直至纯化等份试样的和滴定。
比较各种所进行条件之间的病毒感染和生产效率。对于具有致细胞 病变作用的病毒，通常通过溶菌斑技术来进行滴定。
实施例14：修饰牛痘病毒安卡拉(MVA)在EB45细胞系和EB14细 胞系的附着和非附着鸟干细胞上的复制
在EB45(S86N45)和EB14细胞上进行一系列实验来测定它们各 自对MVA感染的敏感性、MVA增殖的动力学和病毒产量。用于这些 研究中的MVA是表达受体GFP蛋白(MVA-GFP)的重组MVA载体 或非重组MVA病毒。在所有实验中包括新鲜制得的鸡胚胎成纤维细胞 (CEF)作为对照细胞。
14.1-安全性考虑
在冰冻条件下接受MVA病毒(滴定度为0.5ml指管中2.5× 107TCID50/ml)。出于安全性原因，在控制条件下(-80℃冰箱中)保存 MVA病毒和感染的细胞，将污染的塑料材料放入次氯酸溶液中超过1 小时，然后放入袋子中用于全部和完全的高压锅灭活。
14.2-病毒生产
14.2.1-附着S86N45(EB45)细胞
在感染前一天将1×106附着细胞接种于100mm培养皿中，20mL 培养基。24小时后，丢弃培养基，在37℃用接种物与细胞孵育(2mL 无血清培养基，0.01或0.1TCID/细胞的感染复数)。1小时后，丢弃接 种物，将20mL预先温热的培养基加入细胞中，在37℃5％CO2中保持 孵育。为了病毒制备，用刮刀收集感染的细胞，转移进50mL FalconTM 管中并在室温1200RPM下旋转。收集上清液(胞外病毒，EV)，并将 细胞沉淀物(胞内病毒，IV)稀释于1或2mL培养基中。将EV和IV 两个样品接受三次融-冻循环，然后将它们超声处理。在室温2500rpm 离心10分钟后，将EV和IV样品等分并保存于-80℃直至滴定。
14.2.2-悬浮EB14细胞
在加入以培养基中0.01或0.1TCID/细胞的moi病毒接种物前一天， 将0.4×106/mL EB14细胞接种于125mL旋转瓶中的40mL培养基中(16 ×106细胞)，。病毒孵育一小时后，加入80mL预热的培养基。在期望 的旋转条件下在37℃和5％CO2保持孵育。然后在感染后各个时间收集 感染细胞，转入50mL FalconTM管中并在室温1200RPM下旋转。收集 上清液(胞外病毒，EV)，并将细胞沉淀物(胞内病毒，IV)稀释于5 或10mL培养基中。将EV和IV两个样品接受三次融-冻循环，然后将 它们超声处理。在室温2500rpm离心10分钟后，将EV和IV样品等 分并保存于-80℃直至滴定。
14.3-病毒滴定
14.3.1-通过TCID50终点稀释方法滴定MVA
通过TCID50终点稀释方法在CEF或DF-1细胞上进行MVA病毒的 滴定。试验测定了样品含有足够剂量的传染病毒来产生感染。TCID50 测定为细胞培养物累积数的一半产生了致细胞病变作用(CPE)。一个 病毒样品滴定需要一个平底P96。简短地，每孔接种15000CEF细胞 /100μL。接种十一孔的八排。八排表示病毒样品的高度系列10倍的稀 释度(即，10-2至10-9)。对于每个系列稀释度，在无血清培养基中形 成1mL混合物，将100μL混合物分配于10个相应的稀释孔中，第十 一排是对照的非感染孔。将P96板在37℃，5％CO2孵育。5至10天后， 通过Reed-Muench方法通过记录阳性CPE孔来计算病毒滴定度。
14.4-对MVA感染的易感性和滴定度的结果
14.4.1-首先使用重组MVA-GFP载体研究了EB45(S86N45)和EB14 细胞对MVA感染的固有易感性。选择该特异性载体用于这些研究来简 化感染细胞的监控和定量。因此用不同感染复数(moi)处理EBx和 CEF细胞，且在感染后数天通过荧光显微镜和荧光计数法 (fluorocytometry)来分析细胞。
如图10和11所示，所有在感染后48小时仍然是活着的附着EB45 细胞强烈表达了受体GFP蛋白，甚至当使用低至0.1 TCID50/细胞的moi 时。重要的，图10还说明了当和CEF细胞相比较时，EB45和EB14 细胞更小的大小。
总而言之，这些结果清楚地证明了附着EB45和EB14细胞对MVA 感染的高度敏感性。
14.4.2-以下的表8列出了所进行的各种MVA-GFP感染实验中获得的结 果。所有样品均滴定2次。
表8：滴定度的结果   实验条件     感染复数   (MOI)   感染后时间   (PI)(小时)   滴定   (TCID50/ml)   DMEM-F12培养基   中的S86N45(EB45)     细胞(100mm直径培     养皿)   0.01   96   9.57   96   8.57   0.1     72     7.5     72     7.63     DMEM-F12培养基   中的EB14细胞   (120ml旋转瓶)   0.2   48   7.5   72     7.63     HAM-F12培养基中   的CEF细胞(100mm   直径培养皿)   0.01   96   7.5   96   7.71   0.1   72   7.39   72   7.91
14.3-EB14和EB45细胞上的MVA增殖
通过MVA-GFP复制的动力学定量分析来测定悬浮EB14和附着 EB45细胞上的MVA增殖。EB45细胞在培养皿中的DMEM-F12培养 基中生长，并用0.1的moi感染，而EB14细胞在用0.2的moi感染之 前，在120ml旋转瓶中的DMEM-F12培养基中培养24小时。然后在 感染后的各个时间通过FACS分析定量感染细胞的百分比。如图12和 13中所示的，在感染后48小时(EB45)或72小时(EB14)，所有仍 然存活的细胞表达GFP。
14.4-生长于含有血清培养基中的附着EB45细胞上的病毒产量
14.4.1-使用生长于DMEM-F12中的细胞来分析附着EB45细胞的病毒 生产力。发现MVA在DMEM-F12中的EB45中非常有效地复制来获 得高于对照CEF细胞所获得的产量(图14)。
14.4.2-更多系列的实验中，非重组MVA病毒(来自ATCC)用于CEF 细胞和EB45细胞上的比较复制：证实之前使用MVA-GFP载体的结 果，用该MVA病毒再次获得较高的产量(图15)。
总而言之，这些结果证明附着EB45细胞对MVA感染的高度敏感 性和有效的病毒生产，其高于鸡胚胎成纤维细胞。此外，所有这些实 验在标准条件下进行。因此有理由表明在最佳化的实验条件下可以获 得更高的病毒产量，尤其是通过使用最佳细胞培养基。
14.5-含有血清培养基中悬浮EB14细胞上的病毒产量
使用生长于DMEM-F12培养基中的细胞测定了旋转瓶中EB14细胞 的病毒生产力。使用0.1感染复数的第一系列实验结果显示于图16中。 这些数据支持之前用附着细胞获得的结果并证实了悬浮EB14细胞有 效生产重组MVA病毒的能力，产量接近于100 TCID50/细胞，高于鸡 胚胎成纤维细胞所获得的两倍。
14.6-生长于无血清培养基的悬浮EB14细胞上的病毒产量
理想地，在生物反应器中的无血清培养基中的悬浮细胞上进行病毒 疫苗生产。为了研究MVA在无血清培养基中的生产，开始了一系列实 验，其中EB14悬浮细胞已经用旋转瓶中无血清培养基中两种不同感染 复数(0.01&0.1)的MVA-GFP载体感染。细胞的FACS分析证实了 EB14细胞在两种实验条件下的有效感染(图17)。此外，并如所期望 的，这些实验显示了当使用0.1的moi时感染更快，而0.01的moi的 细胞存活更长并能够在较长的时间段生产病毒后代(数据未显示)。
病毒产量的分析证实了通过无血清和无蛋白质培养基中悬浮生长 的悬浮EB14细胞获得了有效的MVA生产(图18)。高于罕有的用CEF 细胞获得的病毒产量是常规获得的。此外，感染颗粒分布的分析表明 大多数病毒粒子保留于细胞中，仅有部分分泌于上清液中(图18)。
EB14和S86N45细胞很好地表征为在无血清培养基中可以悬浮或 作为附着细胞有效生长的非遗传修饰鸟胚胎干细胞。发明者证明细胞 对感染是高度敏感的以及重组和非重组修饰牛痘病毒安卡拉的增殖， 且结果表明病毒生产至少高于对照CEF细胞两到三倍。总而言之，这 些特征构成了本发明的细胞，主要是EB14和EB45，为替代现有的用 于基于MVA载体的生产基于蛋的或基于CEF的生产系统的非常有前 景的细胞。
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