用于基于亚单位的痘病毒疫苗的包含痘病毒衍生肽和针对抗原呈递细胞的抗体的免疫偶联物
阅读：260发布：2020-05-16
专利汇可以提供用于基于亚单位的痘病毒疫苗的包含痘病毒衍生肽和针对抗原呈递细胞的抗体的免疫偶联物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及诱导针对诸如 天花 的痘 病毒感染 的免疫 力 的基于亚单位的 疫苗 的方法和组合物。优选实施方案涉及包含一种或多种与靶向 抗原 产生细胞(APC)的 抗体 或其 片段 连接的亚单位抗原肽的免疫偶联物。更优选地，所述抗体与HLA-DR结合并且所述抗原肽来自免疫调节因子，如病毒IL-18结合蛋白(vIL18BP)。然而，也可使用来自不同病毒蛋白的抗原肽的混合物。所述疫苗能够诱导针对痘病毒的免疫力，而没有在免疫功能低下宿主中发生播散性感染或传染给易感染的 接触 者的 风 险。，下面是用于基于亚单位的痘病毒疫苗的包含痘病毒衍生肽和针对抗原呈递细胞的抗体的免疫偶联物专利的具体信息内容。
1.一种免疫偶联物，其包含：
a)至少一种来自痘病毒蛋白的抗原肽；和
b)结合抗原呈递细胞(APC)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段与所述抗原肽偶联；
其中将所述免疫偶联物施用给受试者诱导针对所述痘病毒的免疫反应。
2.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述痘病毒蛋白是病毒免疫调节因子。
3.根据权利要求2所述的免疫偶联物，其中所述痘病毒蛋白是病毒IL-18结合蛋白(vIL18BP)。
4.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述痘病毒蛋白是包膜蛋白。
5.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述痘病毒蛋白选自由L1R、A27L和D8L组成的组。
6.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述免疫偶联物包含至少一种来自病毒免疫调节因子的抗原肽和至少一种来自病毒包膜蛋白的抗原肽。
7.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述痘病毒是天花。
8.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述抗体或其片段结合选自由以下组成的组的APC抗原：HLA-DR、CD74、CD209(DC-SIGN)、CD34、CD74、CD205、TLR2(toll样受体2)、TLR4、TLR7、TLR9、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4。
9.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述APC抗原是HLA-DR或CD74。
10.根据权利要求9所述的免疫偶联物，其中所述抗体或其片段是抗-HLA-DR抗体，其包含重链互补决定区(CDR)序列CDR1NYGMN(SEQ ID NO：1)、CDR2 WINTYTREPTYADDFKG(SEQ ID NO：2)和CDR3 DITAVVPTGFDY(SEQ ID NO：3)以及轻链CDR序列CDR1 RASENIYSNLA(SEQ ID NO：4)、CDR2 AASNLAD(SEQ ID NO：5)和CDR3OHFWTTPWA(SEQ ID NO：6)。
11.根据权利要求9所述的免疫偶联物，其中所述抗体或其片段是抗-CD74抗体，其包含轻链CDR 序列CDR1RSSQSLVHRNGNTYLH(SEQ ID NO：7)、CDR2 TVSNRFS(SEQ ID NO：
8)和CDR3 SQSSHVPPT(SEQ ID NO：9)以及重链CDR序列CDR1NYGVN(SEQ ID NO：10)、CDR2 WINPNTGEPTFDDDFKG(SEQ ID NO：11)和CDR3 SRGKNEAWFAY(SEQ ID NO：12)。
12.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述抗原肽具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：
33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40。
13.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述免疫偶联物是包含所述抗原肽和所述抗体或抗体片段的融合蛋白。
14.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述抗原肽与所述抗体或抗体片段共价连接。
15.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述抗原肽是第一融合蛋白的一部分，所述抗体或其片段是第二融合蛋白的一部分，并且所述第一和第二融合蛋白彼此结合。
16.根据权利要求15所述的免疫偶联物，其中第一融合蛋白包含来自人蛋白激酶A(PKA)RIα、RIIα、RIβ或RIIβ的二聚化和对接域(DDD)部分，并且所述第二融合蛋白包含来自AKAP蛋白的锚定域。
17.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的免疫偶联物和药学上可接受的载体。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物是亚单位疫苗。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中将所述疫苗施用给受试者提供针对痘病毒感染的免疫力。
20.根据权利要求18所述的药物组合物，其中将所述疫苗施用给受试者诱导针对天花感染的免疫力。
21.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种佐剂。
22.一种诱导针对痘病毒感染的免疫力的方法，其包括向受试者施用根据权利要求18所述的亚单位疫苗。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述痘病毒是天花。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述组合物皮下或鼻腔施用。
25.根据权利要求24所述的方法，其中脂质体亚单位疫苗经鼻腔施用。
26.根据权利要求17所述的方法，其中所述免疫偶联物以编码融合蛋白的表达载体形式施用，所述融合蛋白包含至少一种来自痘病毒蛋白的抗原肽和结合APC的抗体或其抗原结合片段。
用于基于亚单位的痘病毒疫苗的包含痘病毒衍生肽和针对
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2010年4月5日提交的第12/754,140号美国专利申请、2010年4月6日提交的第12/754,740号美国专利申请，和2009年11月5日提交的第61/258,369号美国临时专利申请、2009年11月6日提交的第61/258,729号美国临时专利申请和2010年8月30日提交的第61/378,059号美国临时专利申请的优先权。每个优先权申请的文本全部内容以引用方式并入本文。
[0003] 背景发明领域
[0004] 本发明涉及用于治疗和/或预防痘病毒感染(包括但不限于天花)的基于亚单位的疫苗的设计、产生和应用。在优选实施方案中，疫苗包含来自一种或多种病毒蛋白的亚单位抗原肽的免疫偶联物。在更优选实施方案中，病毒蛋白是免疫调节因子，如病毒IL-18结合蛋白(vIL18BP)，但是可使用替代病毒蛋白，如病毒包膜蛋白。在其它替代实施方案中，基于亚单位的疫苗可能包含来自一种以上病毒蛋白(如免疫调节因子和包膜蛋白)的抗原肽的组合。病毒抗原肽连接到抗体或其抗原结合片段，从而将所述亚单位靶向输送到抗原产生细胞(APC)。在最优选的实施方案中，基于亚单位的疫苗并有针对HLA-DR抗原的抗体或抗体片段，如L243抗体；但是本领域技术人员会意识到其它APC靶向抗体是已知的，并且可以使用。免疫偶联物的使用提供大幅增加的免疫原性和对病毒抗原的改进的免疫系统反应，同时避免接触活病毒疫苗的免疫力低下的个体感染的可能性。优选地，基于亚单位的疫苗在体内有效地诱导对天花和/或其它痘病毒的免疫性，并且防止受其感染。
[0005] 相关技术
[0006] 具有交叉反应抗原的一组复合病毒即正痘病毒包括牛痘病毒(VV)、猴痘病毒和引起天花(痘疮，VAR)的病毒。天花已不再是一种自然发生的传染病，它已被持续到1978年为止的一个大规模的免疫规划所消灭，从那时起世界人口的例行性疫苗接种停止(Minor，2002，British Med J 62：213-224)。当时，剩余的病毒原液存放于美国和前苏联。最近出现的生物恐怖主义的威胁、最近爆发的猴痘(CDC MMWR2003)，和尤其在全世界据估计只有不到一半的人口进行接种的情况下天花病的致命性质，重新激起了对于研制针对VAR或此病毒家族的其它危险成员的疫苗保护的关注。
[0007] 采用活性VV的天花疫苗目前代表针对天花进行免疫的最有效的手段(Rosenthal等，2001，Emerg.Infect.Dis.7：920-926)。这种疫苗产生短暂的病毒血症，它在大多数个体中得以消退，并留下长久的免疫力。然而，这种疫苗也由于包括全身性病毒血症和死亡的严重不良反应而引起安全问题(He等，2007，JID 196：1026-1032；Rosenthal等，2001)。因此，如果客观形势要求进行人口免疫，就必须开发替代接种策略。
[0008] 替代疫苗的几种方法已经尝试过，或正在开发中。具有缺失或突变基因的减毒痘病毒形式，如Akhara改良牛痘(MVA)(Grandpre等，Vaccine 27：1549-56，2009)，可赋予针对痘病毒的强毒株的部分免疫力。用灭活病毒进行的免疫已得到研究，但它并没有赋予与3 4
活病毒相同程度的保护；无论使用哪一种灭活方法，都需要多10-10 个单位的灭活病毒来保护小鼠免受激发影响(Turner等1970，J Hyg.Camb68：197-210)。这一事实意味着，用活性病毒进行免疫所获得的保护包括非活性病毒不能够产生或在非活性病毒中不存在的因子。痘病毒产生一系列分泌性宿主免疫反应修饰因子，其会中和掉宿主细胞因子和先天防御机制。通过削弱宿主的第一道防线，病毒可能能够建立感染(如在粘膜中)，并在宿主细胞内开始第一阶段的感染性复制。
活病毒相同程度的保护；无论使用哪一种灭活方法，都需要多10-10 个单位的灭活病毒来保护小鼠免受激发影响(Turner等1970，J Hyg.Camb68：197-210)。这一事实意味着，用活性病毒进行免疫所获得的保护包括非活性病毒不能够产生或在非活性病毒中不存在的因子。痘病毒产生一系列分泌性宿主免疫反应修饰因子，其会中和掉宿主细胞因子和先天防御机制。通过削弱宿主的第一道防线，病毒可能能够建立感染(如在粘膜中)，并在宿主细胞内开始第一阶段的感染性复制。
[0009] 存在对于针对痘病毒(如天花)的疫苗的需要，所述疫苗比灭活病毒更有效，但可避免活病毒疫苗所出现的安全性问题。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明公开了针对痘病毒(如天花)的亚单位疫苗的改进的组合物和其使用方法。在优选实施方案中，该疫苗包含一个或多个亚单位抗原肽与结合抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞(DC)的抗体或抗体片段偶联以形成免疫偶联物。向受试者施用疫苗可诱导对痘病毒的免疫力，并且有效地预防或治疗痘病毒感染。任选地，该疫苗可能并有一种或多种佐剂，如氢氧化铝、CpG DNA、磷酸钙或基于细菌的佐剂(例如，德氏保加利亚乳杆菌(L.delbroeckii/bulgaricus))。
[0012] VV和VAR都产生的一种宿主免疫调节因子是病毒白细胞介素18结合蛋白(vIL18BP，牛痘病毒C12L基因)。和其它病毒宿主防御调节因子一样，该基因在感染的早期阶段表达，它通过中和掉关键促炎性细胞因子IL-18来削弱宿主免疫力，所述促炎性细胞因子刺激NK、CD8和Th1CD4细胞产生干扰素-γ(IFN)，它进而活化抗原呈递细胞(APC)和其它细胞，并且引导对Th1类型的免疫反应(Born等，2000，J.Immunol.164：3246-3254；Scott，1991，J Immunol147：3149-3155；Pien等，2002，.Immunol.169：5827-5837；Xiang和Moss，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：11537-11542)。在优选实施方案中，选择亚单位抗原肽以模拟vIL18BP的表位。其它示例性宿主免疫调节因子及其locus_tag标识符在表
1中提供。
1中提供。
[0013] 在其它优选实施方案中，亚单位抗原肽源于病毒免疫调节蛋白。本领域技术人员将认识到各种病毒免疫调节蛋白是已知的并且可以使用。非限制性实例包括干扰素-γ(IFN-γ)受体同源物(B8R基因)、补体调节蛋白同源物(B5R基因)和丝氨酸蛋白酶抑制剂(B13R、B14R、B22R基因)。多种痘病毒免疫调节蛋白已得以报道，但其对病毒免疫原性的影响一直没有得到很好地表征。(参见例如Jackson等J Virol79：6554-59，2005；B12R基因(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)；B15R基因(IL-1和IL-6受体)；B16R基因(IL-1受体)、B18R基因(IFN-α受体)、B19R基因(IL-1和IL-6受体、IFN抑制因子)。
[0014] 表1.痘病毒免疫调节蛋白
[0015]
[0016]
[0017] 在替代实施方案中，亚单位抗原肽可能源于病毒包膜蛋白或其它病毒蛋白。非限制性实例包括D8L、A27L、L1R和A33R基因的蛋白产物。本领域技术人员将认识到所述各种痘病毒基因和蛋白质的DNA和氨基酸序列是本领域熟知的并且可公开获得(关于牛痘病毒WR的完整基因组序列以及所编码的蛋白质序列，参见例如GenBank登录号AY243312)。
[0018] 免疫偶联物的抗体组分将复合物引导至APC，其中抗原肽组分经加工以引起对痘病毒和/或表达靶抗原的受感染细胞的免疫反应。各种APC靶向抗体是本领域已知的，如结合选自由以下组成的组的抗原的抗体：HLA-DR、CD74、CD209(DC-SIGN)、CD34、CD74、CD205、TLR2(toll样受体2)、TLR4、TLR7、TLR、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4。在更优选实施方案中，抗体结合选自HLA-DR和CD74的抗原。在最优选实施方案中，抗体结合HLA-DR。
[0019] 在一些优选实施方案中，痘病毒疫苗包含人源化、人或嵌合抗-HLA-DR抗体，如L243抗体。L243抗体已被描述(例如美国专利第7,612,180号，其实施例部分以引用方式并入本文)并且特征在于具有重链互补决定区(CDR)序列CDR1(NYGMN，SEQ ID NO：1)，CDR2(WINTYTREPTYADDFKG ，SEQ ID NO：2)，和CDR3(DITAVVPTGFDY，SEQ ID NO：3)和轻链CDR序列CDR1(RASENIYSNLA，SEQ ID NO：4)，CDR2(AASNLAD，SEQ ID NO：5)，和CDR3(OHFWTTPWA，SEQ ID NO：6)。然而，可使用本领域中已知的其它抗-HLA-DR抗体(参见例如美国专利第6,416,958、6,894,149、7,262,278号，其实施例部分分别以引用方式并入本文)。
[0020] 在其它优选实施方案中，痘病毒疫苗包含人源化、人或嵌合抗-CD74抗体，如LL1抗体。LL1抗体已被描述(例如美国专利第7,312,318号，其实施例部分以引用方式并入本文)并且特征在于具有轻链CDR序列CDR1(RSSQSLVHRNGNTYLH，SEQ ID NO：7)，CDR2(TVSNRFS，SEQ ID NO：8)，和CDR3(SQSSHVPPT，SEQ ID NO：9)和重 链CDR 序列 CDR1(NYGVN，SEQ ID NO：10)，CDR2(WINPNTGEPTFDDDFKG ，SEQ ID NO：11)， 和CDR3(SRGKNEAWFAY，SEQ ID NO：12)。或者，可利用其它抗CD74抗体或针对其它APC或DC相关抗原的抗体(参见例如LifeSpan Biosciences Inc.，Seattle，WA；BioLegend，San Diego，CA；Abcam，Cambridge，MA)。
[0021] 在各种实施方案中，抗体或其抗原结合片段可能是嵌合、人源化或人抗体或其抗原结合片段。使用嵌合抗体优于亲本鼠源抗体，因为它们具备人抗体恒定区序列，因此不会引起和鼠源抗体一样强的人抗小鼠抗体(HAMA)反应。为了进一步降低诱发HAMA反应的可能性，使用人源化抗体是更优选的。正如下面所讨论，通过将鼠源框架和恒定区序列用相应人抗体框架和恒定区序列替换来使鼠源抗体人源化的技术是本领域熟知的，并已应用于众多的鼠源抗癌抗体。抗体人源化还可能涉及将一个或多个人框架氨基酸残基用来自亲本鼠源框架区序列的相应残基取代。也如下面所讨论，产生人抗体的技术也是熟知的，而且此类抗体可并入主题痘病毒疫苗构建体中。
[0022] 其它实施方案涉及编码融合蛋白(如抗体-亚单位抗原肽融合蛋白)的DNA序列，含有所述DNA序列的载体和宿主细胞，以及制造用于产生痘病毒疫苗的融合蛋白的方法。在一些实施方案中，使用DNL(对接-和-锁定)技术制造亚单位疫苗的情况下，融合蛋白可包含DDD(二聚化和对接域)部分或AD(锚定域)部分。在替代实施方案中，可通过例如抗体或抗体片段与抗原肽的化学交联来形成免疫偶联物。发明详述
[0023] 定义
[0024] 本文使用的术语“一”和“所述(该)”可能是指单数或复数，除非上下文另外明确指出仅表示单数。
[0025] 本文使用的术语“约”是指数值加上或减去百分之十(10％)。例如，“约100”是指90和110之间的任何数字。
[0026] 抗体是指全长(即自然发生或通过正常的免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(如IgG抗体)，或免疫球蛋白分子的免疫活性、抗原结合部分，如抗体片段。
[0027] 抗体片段是抗体的一部分，如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv等。无论结构为何，抗体片段结合由完整抗体识别的相同抗原。因此，该术语与“抗原结合抗体片段”同义地使用。术语“抗体片段”还包括由可变区组成的分离片段，如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段以及轻链和重链可变区通过连接肽连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。本文使用的术语“抗体片段”不包括无抗原结合活性的抗体部分，如Fc片段或单个氨基酸残基。其它抗体片段，例如单域抗体片段是本领域已知的，并且可用于所主张的构建体中。(参见例如Muyldermans等，TIBS 26：230-235，2001；Yau等，J Immunol Methods281：161-75，2003；Maass等，J Immunol Methods 324：13-25，2007)。
[0028] 术语抗体融合蛋白可指具有相同或不同特异性的一个或多个相同或不同单链抗体或抗体片段相连的重组产生的抗原结合分子。融合蛋白的价态指示融合蛋白相对于单个抗原或表位所具有的结合臂或位点的数量，即一价、二价、三价或多价。抗体融合蛋白的多价性是指它可以在结合抗原时利用多重相互作用，从而提高与抗原结合的亲合力(avidity)。特异性指示抗体融合蛋白能够结合的抗原或表位的数量，即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义，例如IgG的天然抗体是二价的，因为它有两个结合臂，但是它是单特异性的，因为它结合一个表位。单特异性、多价融合蛋白对于表位有一个以上结合位点，但只结合一个表位。融合蛋白可能包含单一抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合，或同一抗体组分的多个拷贝。此外，融合蛋白可包含抗体或抗体片段和亚单位肽抗原。然而，该术语不是限制性的，并且多种蛋白或肽效应物可并入融合蛋白中。在另一个非限制性实例中，融合蛋白可包含用于产生如下讨论的DNL构建体的AD或DDD序列。
[0029] 嵌合抗体是含有来源于一个物种的抗体(优选啮齿动物抗体)的可变域(包括互补决定区(CDR))，而抗体分子的恒定域来源于人抗体的恒定域的重组蛋白。对于兽医应用，嵌合抗体的恒定域可能源于其它物种，如猫或狗。
[0030] 人源化抗体是来自一个物种的抗体(例如啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的重链和轻链可变链转移至人重链和轻链可变域(例如框架区序列)的重组蛋白。抗体分子的恒定域源自人抗体。在某些实施方案中，来自亲本(啮齿动物)抗体的有限数量的框架区氨基酸残基可取代入人抗体框架区序列。
[0031] 人抗体是例如由经“工程化”以响应于抗原激发而产生特异性人抗体的转基因小鼠获得的抗体。在这种技术中，人重链和轻链基因座的元件被引入到源自胚胎干细胞系的包含内源性鼠源重链和轻链基因座的靶向断裂的小鼠品系中。转基因小鼠可以合成具有针对特定抗原的特异性的人抗体，并且所述小鼠可以用来产生分泌人抗体的杂交瘤细胞。从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg等，Nature368：856(1994)，和Taylor等，Int.Immun.6：579(1994)描述。完全人抗体也可以通过基因或染色体转染方法，以及噬菌体展示技术来构建，所述方法和技术都是本领域已知的。
关于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变域基因谱体外产生人抗体和其片段，参见例如McCafferty等，Nature 348：552-553(1990)。在此技术中，将抗体可变域基因同框克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并且以功能性抗体片段形式展示于噬菌体颗粒的表面上。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致编码展现这些性质的抗体的基因的选择。这样，噬菌体模拟B细胞的某些性质。
噬菌体展示可以多种方式执行，关于评论，参见例如Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3：5564-571(1993)。人抗体也可通过在体外活化的B细胞产生。
参见美国专利第5567610号和第5229275号，其实施例部分以引用方式并入本文。
关于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变域基因谱体外产生人抗体和其片段，参见例如McCafferty等，Nature 348：552-553(1990)。在此技术中，将抗体可变域基因同框克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并且以功能性抗体片段形式展示于噬菌体颗粒的表面上。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致编码展现这些性质的抗体的基因的选择。这样，噬菌体模拟B细胞的某些性质。
噬菌体展示可以多种方式执行，关于评论，参见例如Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3：5564-571(1993)。人抗体也可通过在体外活化的B细胞产生。
参见美国专利第5567610号和第5229275号，其实施例部分以引用方式并入本文。
[0033] 图1.源自vIL18BP序列(SEQ ID NO：23)的肽的结合和吸收。(A)vIL18BP110(SEQ ID NO：16)与T2细胞结合。所示的肽(TT830，SEQ ID NO：19；vA4L229，SEQ ID NO：18；vIL18BP008，SEQ IDNO：13；vIL18BP105，SEQ ID NO：15；vIL18BP110，SEQ ID NO：16；
vIL18BP117，SEQ ID NO：17)与T2细胞一起孵育24h。显示HLA-A02在T2细胞中的相对丰度。从左到右的条形图分别代表从0到40μg/mL以10-μg/mL增量递增的肽的浓度。(B)vIL18BP105(SEQ IDNO：15)展现最高的供体PBMC吸收。在与所示的经生物素化肽孵育24h之后，评价平行双份样品。NJ01、NJ04、NJ07和NJ08。在添加抗生物素蛋白-FITC偶联物之后，通过流式细胞术分析结果。每个肽的荧光值等于同一实验中的肽处理细胞的荧光值减去未处理细胞的荧光值。肽浓度为20微克/毫升。
vIL18BP117，SEQ ID NO：17)与T2细胞一起孵育24h。显示HLA-A02在T2细胞中的相对丰度。从左到右的条形图分别代表从0到40μg/mL以10-μg/mL增量递增的肽的浓度。(B)vIL18BP105(SEQ IDNO：15)展现最高的供体PBMC吸收。在与所示的经生物素化肽孵育24h之后，评价平行双份样品。NJ01、NJ04、NJ07和NJ08。在添加抗生物素蛋白-FITC偶联物之后，通过流式细胞术分析结果。每个肽的荧光值等于同一实验中的肽处理细胞的荧光值减去未处理细胞的荧光值。肽浓度为20微克/毫升。
[0034] 图2.来自接种供体的PBMC在与病毒肽一起孵育时增殖。将来自接种(A)和未接种(B)人供体的负载CFSE的PBMC与10μg/mL指定肽(vA27L003，SEQ ID NO：20；vD8L118，SEQ ID NO：22；vIL18BP105，SEQ ID NO：15或对照)一起孵育5天。收获细胞，并利用流式细胞术分析(平均值±SD)。条形图按以下顺序显示：未填实条形图，培养基对照；实心黑色条形图，2.5mg/mL肽(或SEA)；水平-阴影线浅灰色条形图，5.0mg/mL肽；垂直-阴影线深灰色条形图，10.0mg/mL肽。(C)来自独立实验的结果，其中来自指定样品的细胞与vD8L118(SEQ ID NO：22)一起孵育以测定细胞内细胞因子和活化标志物的表达。结果显示于所嵌入表(C)中(D8L，vD8L118肽，SEQ ID NO：22)。*相比于培养基对照，组平均值P＜0.05(t-检验)。
[0035] 图3.应答CD8+IFN-γ+细胞具有TEM或CD45RA-终末分化细胞的表型。针对CD45RA和CCR7表达，对来自接种供体的CD8+PBMC进行了评估。数目代表细胞总数的百分比。对于TEM群体，vD8L118相比于培养基对照的P＜0.019(ANOVA)(左下象限)。
[0036] 图4.CD8+细胞的CD107a表达。相比于脱粒潜在标志物CD107a，评估CD8+细胞群体的IFN-γ、IL-2。数目和条形图值代表针对以下细胞的门中细胞百分比：(A)CD8+IFN-γ+细胞、(B)CD8+IFN-γ-细胞，和(C)CD8+IL-2+细胞。*相比于培养基对照，组平均值P＜0.04(t-检验)。
[0037] 图5.肽抗体存在于接种供体的血清中。将来自未接种或接种供体的血清1∶200稀释并且在针对以下肽的改良ELISA中与固定于96-孔板上的肽一起孵育：(A)肽vA27L003(SEQ ID NO：20)、(B)肽vD8L110(SEQ ID NO：21)，和(C)肽vIL18BP102(SEQ ID NO：14)。圆点代表每个供体的A450。*相比于未接种者，P＜0.03(ANOVA)。未接种供体：213、704、220；接种供体：05、12A、12B、19、26、720、308、416和920。肽vD8L110和vIL18BP105是包括vD8L118和vIL18BP105全序列的25-聚体。
[0038] 图6.相对于vIL18BP105的HLA-DR04tg脾细胞增殖。以vIL18BP105-L243偶联物(偶联物)或游离vIL18BP105(游离)接种的HLA-DR04tg小鼠，原初 HLA-DR04tg小鼠(HLA-DR04tg原初)和野生型C57BL/6J(WT原初)(n＝3小鼠/组)。用与不同浓度的肽一起孵育的经CFSE标记的脾细胞进行三次重复试验。结果是3次独立实验的代表值(n＝3，平均值±SD)。
[0039] 图7.第一次加强免疫之后7和14天，用CIL18BP105(偶联物)和IL18BP105(游离)免疫的HLA-DR04tg小鼠中的肽特异性血清抗体产生。原初HLA-DR04tg小鼠血清用作对照(原初)。实验用汇集的血清三次重复执行(n＝3，平均值±SD)。
[0040] 图8.来自免疫小鼠的血清抗体与完整vIL18BP蛋白的结合。针对识别完整vIL18BP蛋白的抗体，对用单独L243抗体、vIL18BP105肽(SEQ ID NO：15)、与L243抗体偶联的病毒IL18BP105肽(CIL18BP105)、单独培养基免疫的小鼠或原初小鼠的血清进行测试。
[0041] 图9.亚单位疫苗的基于脂质体的免疫偶联物。(A)脂质体展示的肽-L243抗体偶联物。(B)脂质体展示的没有抗体的裸肽。
[0042] 痘病毒疫苗
[0043] 亚单位抗原肽
[0044] 痘病毒产生一系列分泌性宿主免疫反应修饰因子，其会中和掉宿主细胞因子和先天防御机制。削弱宿主的第一道防线会使病毒建立感染(如在粘膜中)，并接着开始第一阶段的感染性复制。VV和其它痘病毒产生的一种因子是病毒白细胞介素18结合蛋白(vIL18BP，牛痘病毒C12L基因)，其在感染的早期阶段表达(Born等J Immunol164：3246-54，2000)。它通过中和掉关键促炎性细胞因子IL-18来起作用，所述促炎性细胞因子刺激NK、CD8和Th1CD4细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)，它引导对Th1类型的获得性免疫(Livingston等，J Immunol168：5499-5506，2002；Pien等，J Immunol 160：5827-37，2002；
Scott，JImmunol 147：3149-55，1991；Turner等，J Hyg Camb 68：197-210，1970；Xiang和Moss，PNAS USA 96：11537-542，1999)。
Scott，JImmunol 147：3149-55，1991；Turner等，J Hyg Camb 68：197-210，1970；Xiang和Moss，PNAS USA 96：11537-542，1999)。
[0045] 在下面的实施例中所描述的研究解决对vIL18BP的宿主反应是否牵涉到对于痘病毒感染的抗性的问题。如果是这样，替代疫苗策略应包括这一因子和/或类似的抗原。最近报道另一种正痘病毒宿主防御调节因子即I型IFN-结合蛋白对于致病力是必不可少的(Xu等，JExp Med 205：981-92，2008)并且可为包含于亚单位痘病毒疫苗中的候选物。正如下面所讨论的，其它已知的病毒蛋白也可作为基于亚单位的痘病毒疫苗的亚单位抗原肽的候选物而包含在内。
[0046] 如以下实施例中所描述，通过研究vIL18BP抗原肽是否能够引起经接种人受试者的外周血单核细胞(PBMC)和血清的回忆反应来测试人免疫力的基于亚单位肽的疫苗方法。细胞介导的免疫性在对痘病毒的抗性中的重要性仍在研究中，但是免疫性需要抗体反应得到了一定公认(Chaudhri等，J Virol 80：6339-44，2006；Combadiere等，J Exp Med199，1585-89，2004；Kim等，Clin Vaccine Immunol 13：1172-74，2006)。
[0047] 除了vIL18BP-衍生肽以外，来源于其它VV基因的肽即D8L和A27L也得以测试。D8L蛋白对于病毒吸附和进入细胞是重要的，并且已显示可在痘病毒感染的小鼠模型中引起强烈的保护性免疫(Kan-Mitchell等，J Immunol 172：5249-61，2010；Berhanu等，J Virol82：3517-29，2008)。A27L蛋白对于病毒吸附和组装也是重要的，并且针对它的抗体提供保护性免疫(Berhanu等，J Virol 82：3517-29，2008；Chun g等，J Virol 72：1577-85，1998；Scott，J Immunol 147：3149-55，1991)。
[0048] 本发明的总体目标是选择和开发供包含于多表位疫苗规格中的T-细胞(HLA-结合)和B-细胞抗原肽。肽具有相对易于合成、修饰和组合成多抗原复合物的优势。为了提高其免疫原性，将肽与靶向APC的抗体如针对HLA-DR抗原的抗体连接。
[0049] 靶向APC的抗体
[0050] 作为专门的抗原呈递细胞，树突状细胞(DC)在发动先天免疫和适应性免疫中发挥着举足轻重的作用，并已被用于产生有效的疫苗(Vulink等，Adv Cancer Res.2008，99：363-407；O′Neill等，Mol Biotechnol.2007，36：131-41)。在体内将抗原靶向输送到APC和DC代表一种有前途的接种方法，因为它可以避开费力而昂贵的离体抗原负载和培养，并且有助于免疫疗法的大规模应用(Tacken等，Nat Rev Immunol.2007，7：790-802)。更重要的是，体内APC和/或DC靶向接种可更高效地引发抗肿瘤免疫反应，并且可更有效地控制动物模型中的肿瘤生长(Kretz-Rommel等，J Immunother 2007，30：715-726)。
[0051] 除了DC以外，B细胞是另一类型强效的抗原呈递细胞，它能够预激Th1/Th2细 胞 (Morris 等，J Immunol.1994，152：3777-3785；Constant，J Immunol.1999，162：5695-5703)和经由交叉呈递来活化CD8T细胞(Heit等，J Immunol.2004，172：1501-1507；
Yan等，Int Immunol.2005，17：869-773)。最近据报道，在体内将抗原靶向输送至B细胞打破MUC1的免疫耐受(Ding等，Blood 2008，112：2817-25)。
Yan等，Int Immunol.2005，17：869-773)。最近据报道，在体内将抗原靶向输送至B细胞打破MUC1的免疫耐受(Ding等，Blood 2008，112：2817-25)。
[0052] 在本发明的各种实施方案中，可将针对一般由APC并且特别由DC表达的抗原的抗体并入免疫偶联物疫苗中以便将亚单位抗原肽靶向输送至免疫系统细胞。两个示例性APC抗原是HLA-DR和CD74。HLA-DR是主要组织相容性复合物种类II细胞表面受体，它在抗原呈递中起作用以引起T-细胞免疫反应。HLA-DR发现于多种抗原呈递细胞上，如巨噬细胞、B-细胞和树突状细胞。如上所述，针对HLA-DR的抗体(包括L243抗体)是本领域已知的。此类抗体可与亚单位抗原肽偶联以便递送至APC。
[0053] 另一种APC表达的抗原是CD74，它是适当MHC II折叠和将MHC II-CD74复合物靶向输送至内涵体所必需的II型膜内在蛋白(Stein等，Clin Cancer Res.2007，13：5556s-5563s；Matza等，Trends Immunol.2003，24(5)：264-8)。CD74表达不限于DC，而是发现于几乎所有抗原呈递细胞中(Freudenthal等，Proc Natl Acad Sci U S A.1990，
87：7698-702；Clark等，J Immunol.1992，148(11)：3327-35)。CD74在APC中的广泛表达可提供超过只是表达于髓性DC中的一些优势，因为已报道将抗原靶向输送至其它APC(如B细胞)可打破免疫耐受(Ding等，Blood 2008，112：2817-25)，并且靶向输送至类浆细胞DC可将抗原交叉呈递至原初CD 8T细胞。更重要的是，CD74也表达于滤泡DC中(Clark等，J Immunol.1992，148(11)：3327-35)，所述滤泡DC是对于抗原呈递至B细胞起关键作用的DC亚群(Tew等，Immunol Rev.1997，156：39-52)。这一表达谱使CD74成为用于体内靶向接种的优秀候选物。各种抗CD74抗体是本领域已知的，如LL1抗体(Leung等，Mol Immunol.1995，32：1416-1427；Losman 等，Cancer 1997，80：2660-2666；Stein 等，Blood
2004，104：3705-11)。
87：7698-702；Clark等，J Immunol.1992，148(11)：3327-35)。CD74在APC中的广泛表达可提供超过只是表达于髓性DC中的一些优势，因为已报道将抗原靶向输送至其它APC(如B细胞)可打破免疫耐受(Ding等，Blood 2008，112：2817-25)，并且靶向输送至类浆细胞DC可将抗原交叉呈递至原初CD 8T细胞。更重要的是，CD74也表达于滤泡DC中(Clark等，J Immunol.1992，148(11)：3327-35)，所述滤泡DC是对于抗原呈递至B细胞起关键作用的DC亚群(Tew等，Immunol Rev.1997，156：39-52)。这一表达谱使CD74成为用于体内靶向接种的优秀候选物。各种抗CD74抗体是本领域已知的，如LL1抗体(Leung等，Mol Immunol.1995，32：1416-1427；Losman 等，Cancer 1997，80：2660-2666；Stein 等，Blood
2004，104：3705-11)。
[0054] 抗体和抗体片段
[0055] 在各种实施方案中，抗体或抗体的抗原结合片段可并入痘病毒疫苗中。抗原结合抗体片段是本领域熟知的，如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv等，并且可使用任何此类已知片段。如本文所使用的抗原结合抗体片段是指与完整或亲本抗体识别的相同抗原结合的抗体的任何片段。制备几乎任何目标抗体或片段的偶联物的技术是已知的(例如美国专利第7,527,787号)。
[0056] 制备针对几乎任何靶抗原(如HLA-DR或CD74)的单克隆抗体的技术是本领域熟知的。参见例如Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)，和Coligan等(编著)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第1卷，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)。简单地说，单克隆抗体可通过以下步骤获得：将包含抗原的组合物注入小鼠，取出脾脏以获得B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞，克隆杂交瘤细胞，选择产生所述抗原的抗体的阳性克隆，培养产生所述抗原的抗体的克隆，和从杂交瘤细胞培养物中分离抗体。
[0057] 单克隆抗体(MAb)可通过多种行之有效的技术从杂交瘤细胞培养物中分离和纯化。此类分离技术包括利用蛋白质 的亲和色谱、体积排阻色谱和离子交换色谱。参见例如Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。还参见Baines等METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第79-104页中的“Purification of Immunoglobulin G(IgG)”(The Humana Press，Inc.1992)。
[0058] 在最初培殖针对免疫原的抗体之后，可对抗体测序并且随后通过重组技术来制备。鼠源抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员熟知的。使用来源于人源化、嵌合或人抗体的抗体组分避免了与鼠源恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
[0059] 嵌合抗体
[0060] 嵌合抗体是人抗体的可变区被例如小鼠抗体的可变区(包括小鼠抗体的互补决定区(CDR))替换的重组蛋白。嵌合抗体在施用给受试者时呈现降低的免疫原性和增加的稳定性。克隆鼠源免疫球蛋白可变域的一般技术公开于例如Orlandi等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：3833(1989)。构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员熟知的。举例来说，Leung等，Hybridoma 13：469(1994)中通过将编码鼠源LL2(一种抗-CD22单克隆抗体)的Vκ和VH域的DNA序列与相应人κ和IgG1恒定区结构域组合来产生LL2嵌合体。
[0061] 人源化抗体
[0062] 产生人源化MAb的技术是本领域熟知的(参见例如Jones等，Nature 321：522(1986)，Riechmann 等，Nature 332：323(1988)，Verhoeyen 等，Science 239：
1534(1988)，Carter等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)，和Singer等，J.Immun.150：2844(1993))。嵌合或鼠源单克隆抗体可通过将来自小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变链的小鼠CDR转移到人抗体的相应可变域中来人源化。嵌合单克隆抗体的小鼠框架区(FR)也替换为人FR序列。因为简单地将小鼠CDR转移到人FR中常常导致抗体亲和力降低或甚至丧失，所以可能需要额外修饰以便恢复鼠源抗体的原有亲和力。这可以通过将FR区域中的一个或多个人残基替换为其鼠源对应物以获得具有针对其表位的良好结合亲和力的抗体来实现。参见例如Tempest等，Biotechnology 9：266(1991)和Verhoeyen等，Science 239：1534(1988)。一般来说，不同于其鼠源对应物并且接近或毗邻一个或多个CDR氨基酸残基的那些人FR氨基酸残基将是替换的候选物。人源化形式的L243和LL1抗体是已知的(参见例如美国专利第7612180号和第7312318号)。
1534(1988)，Carter等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)，和Singer等，J.Immun.150：2844(1993))。嵌合或鼠源单克隆抗体可通过将来自小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变链的小鼠CDR转移到人抗体的相应可变域中来人源化。嵌合单克隆抗体的小鼠框架区(FR)也替换为人FR序列。因为简单地将小鼠CDR转移到人FR中常常导致抗体亲和力降低或甚至丧失，所以可能需要额外修饰以便恢复鼠源抗体的原有亲和力。这可以通过将FR区域中的一个或多个人残基替换为其鼠源对应物以获得具有针对其表位的良好结合亲和力的抗体来实现。参见例如Tempest等，Biotechnology 9：266(1991)和Verhoeyen等，Science 239：1534(1988)。一般来说，不同于其鼠源对应物并且接近或毗邻一个或多个CDR氨基酸残基的那些人FR氨基酸残基将是替换的候选物。人源化形式的L243和LL1抗体是已知的(参见例如美国专利第7612180号和第7312318号)。
[0063] 人抗体
[0064] 使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生完全人抗体的方法是本领域已知的(例如Mancini等，2004，New Microbiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.High Throughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Phamacol.3：544-50)。完全人抗体也可以通过基因或染色体转染方法，以及噬菌体展示技术来构建，所述方法和技术都是本领域已知的。参见例如McCafferty等，Nature 348：552-553(1990)。与嵌合或人源化抗体相比，预计此类完全人抗体表现出更少的副作用并且在体内基本上如内源性人抗体一样发挥作用。在一些实施方案中，所主张的方法和程序可利用由此类技术产生的人抗体。
[0065] 在一个替代方案中，噬菌体展示技术可用于产生人抗体(例如Dantas-Barbosa等，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40)。可从正常人或表现出特定疾病状态(如癌症)的人产生人抗体(Dantas-Barbosa等，2005)。从患病个体构建人抗体的优点是可使循环抗体谱偏向针对疾病相关抗原的抗体。
[0066] 在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)从骨肉瘤患者构建人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般来说，从循环血液淋巴细胞中获得总RNA(同上)。重组Fab从μ、γ和κ链抗体谱克隆并且插入噬菌体展示文库中(同上)。将RNA转变为cDNA并且用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物来产生FabcDNA文库(Marks等，1991，J.Mol.Biol.222：581-97)。根据Andris-Widhopf等执行文库构建(2000，Phage Display Laboratory Manual，Barbas等(编著)，第1版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY第9.1到9.22页)。最终Fab片段用限制性内切酶消化并且插入噬菌体基因组中以产生噬菌体展示文库。如本领域中已知，此类文库可通过标准噬菌体展示方法进行筛选(参见例如Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature
380：364-366；Pasqualini，1999，The Quart.J.Nucl.Med.43：159-162)。
380：364-366；Pasqualini，1999，The Quart.J.Nucl.Med.43：159-162)。
[0067] 噬菌体展示可以多种方式执行，关于其评论，参见例如Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3：5564-571(1993)。人抗体也可通过在体外活化的B细胞产生。参见美国专利第5567610号和第5229275号，其全部内容以引用方式并入本文。本领域技术人员将认识到这些技术是示例性的并且可利用制造和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。
[0068] 在另一替代方案中，经基因工程化以产生人抗体的转基因动物可用于使用标准免疫方案来产生针对基本上任何免疫原靶标的抗体。从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg等，Nature 368：856(1994)，和Taylor等，Int.Immun.6：579(1994)公开。此种系统的非限制性实例是来自Abgenix(Fremont，CA)的(例如Green等，1999，J.Immunol.Methods231：11-23)。在和类似动物中，小鼠抗体基因经灭活并且替换为功能性人抗体基因，而小鼠免疫系统的其余部分仍然完好。
[0069] 将 用包含人IgH和Igκ基因座的部分(包括大部分可变区序列)以及附加基因和调控序列的生殖细胞系配置YAC(酵母人工染色体)来转化。人可变区谱可用来产生抗体产生B-细胞，所述B-细胞可通过已知技术加工成杂交瘤细胞。用靶抗原免疫的 通过正常免疫反应产生人抗体，其可通过以上讨论的标准技术来收
获和/或产生。可利用多种 品系，其各自能够产生不同种类的抗体。转基因
方式产生的人抗体已被证明具有治疗潜力，同时保持正常人抗体的药代动力学性质(Green等，1999)。本领域技术人员将认识到所主张的组合物和方法不限于使用 系
统，而是可利用经基因工程化以产生人抗体的任何转基因动物。
获和/或产生。可利用多种 品系，其各自能够产生不同种类的抗体。转基因
方式产生的人抗体已被证明具有治疗潜力，同时保持正常人抗体的药代动力学性质(Green等，1999)。本领域技术人员将认识到所主张的组合物和方法不限于使用 系
统，而是可利用经基因工程化以产生人抗体的任何转基因动物。
[0070] 抗体片段
[0071] 识别特定表位的抗体片段可以通过已知的技术产生。抗体片段是抗体的抗原结合部分，如F(ab′)2、Fab′、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。F(ab’)2片段可通过胃蛋白酶消化抗体分子来产生，而Fab′片段可通过还原F(ab’)2片段的二硫桥键来产生。另外，可构建Fab′表达文库(Huse等，1989，Science，246：1274-1281)以允许快速简便地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab′片段。F(ab)2片段可通过木瓜蛋白酶消化抗体来产生，而Fab片段可通过二硫键还原来获得。
[0072] 单链Fv分子(scFv)包含VL域和VH域。VL和VH域联合形成靶结合位点。这两个域进一步通过连接肽(L)共价连接。制造scFv分子和设计合适连接肽的方法描述于美国专利第4,704,692号、美国专利第4,946,778号、R.Raag和M.Whitlow，“Single Chain Fvs.”FASEB第9卷：73-80(1995)以及R.E.Bird和B.W.Walker，“Single Chain Antibody Variable Regions，”TIBTECH，第9卷：132-137(1991)。
[0073] 产生单域抗体的技术也是本领域已知的，例如Cossins等(2006，Prot Express Purif 51：253-259)中所公开。单域抗体(VHH)可通过标准免疫技术例如从骆驼、羊驼或美洲驼获得。(参见例如Muyldermans等，TIBS 26：230-235，2001；Yau等，J Immunol Methods 281：161-75，2003；Maass等，J Immunol Methods 324：13-25，2007)。VHH可具有强效的抗原结合能力并且可与常规VH-VL对难以接近的新的表位相互作用。(Muyldermans等，2001)。羊驼血清IgG含有约50％的仅骆驼科重链IgG抗体(HCAb)(Maass等，2007)。羊驼可用已知抗原如TNF-α免疫，并且可分离结合靶抗原并中和靶抗原的VHH(Maass等，
2007)。扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物已得到鉴定并且可用于构建羊驼VHH噬菌体展示文库，其可用于通过本领域熟知的标准生物淘选技术来分离抗体片段(Maass等，
2007)。
2007)。扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物已得到鉴定并且可用于构建羊驼VHH噬菌体展示文库，其可用于通过本领域熟知的标准生物淘选技术来分离抗体片段(Maass等，
2007)。
[0074] 抗体片段可通过全长抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或编码该片段的DNA的另一宿主中表达来制备。抗体片段可用常规方法对全长抗体进行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得。这些方法描述于例如Goldenberg的美国专利第4,036,945号和第4,331,647号和其中所含的参考文献。还参见Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)，Edelman等，METHODS IN ENZYMOLOGY第1卷，第422页(Academic Press 1967)，和Coligan第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
[0075] 已知的抗体
[0076] 虽然针对HLA-DR或CD74的抗体是优选的，但是痘病毒疫苗可替代地使用与靶细胞表面上的另一抗原结合或与其反应的抗体来产生。优选的额外MAb可包括可与CD209(DC-SIGN)、CD34、CD205、TLR2(toll样受体2)、TLR4、TLR7、TLR9、BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4反应的人源化、嵌合或人MAb。
[0077] 此类抗体可从如美国菌种保藏中心的公共来源或商业抗体供应商获得。例如，针对CD209(DC-SIGN)、CD34、BDCA-2、TLR2、TLR4、TLR7和TLR9的抗体可从Santa Cruz Biotechnology公司(Santa Cruz，CA)购买。针对CD205和BDCA-3的抗体可从Miltenyi Biotec公司(Auburn，CA)购买。众多的其它抗体商业来源是本领域技术人员已知的。
[0078] 这些抗体只是示例性的并且多种其它抗体和其杂交瘤细胞是本领域已知的。本领域技术人员将认识到针对几乎任何APC-相关抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤细胞可通过针对选定的相关靶抗原的抗体来简单搜索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库而获得。克隆抗体的抗原结合域可使用本领域熟知的标准技术来扩增、切除、连接到表达载体上，转染至改造的(adapted)宿主细胞中并用于蛋白质产生。
[0079] 免疫偶联物
[0080] 在各种实施方案中，痘病毒疫苗可以免疫偶联物形式施用。制造具有抗体或融合蛋白的共价或非共价偶联物的许多方法是本领域已知的并且可利用任何此类已知方法。
[0081] 例如，抗原肽可经由二硫键形成而连接于经还原抗体组分的铰链区。另外，此类药剂可使用异双功能交联剂，如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)来连接。Yu等，Int.J.Cancer 56：244(1994)。此类偶联的一般技术是本领域熟知的。参见例如Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press1991)；MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch 等 ( 编著)，第187-230页 中 的Upeslacis等，“Modification of Antibodies by Chemical Methods”(Wiley-Liss，Inc.1995)；MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等(编著)，第60-84页中的Price，“Production and Characterization of Syntheticn Peptide-Derived Antibodies”(Cambridge University Press 1995)。
[0082] 对接和锁定(DNL)方法
[0083] 在替代实施方案中，包含免疫偶联物的基于亚单位的疫苗可通过其它技术产生。一种几乎将任何蛋白或肽与任何其它蛋白或肽偶联的技术称为对接和锁定(DNL)技术。
DNL方法利用在cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的调控(R)亚单位和A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定域(AD)之间发生的特异性蛋白/蛋白相互作用(Baillie等，FEBS Letters.2005；
579：3264。Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。
DNL方法利用在cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的调控(R)亚单位和A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定域(AD)之间发生的特异性蛋白/蛋白相互作用(Baillie等，FEBS Letters.2005；
579：3264。Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。
[0084] PKA在一种由第二信使cAMP与R亚单位的结合所触发的研究最彻底的信号转导途径中发挥核心作用，它于1968年首次从兔骨骼肌中分离(Walsh等，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。全酶的结构由通过R亚单位来保持非活性形式的两个催化亚单位所组成(Taylor，J.Biol.Chem.1989；264：8443)。PKA的同工酶被发现具有两种类型的R亚单位(RI和RII)，并且每种类型具有α和β同种型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。
R亚单位仅以稳定二聚体形式得以分离并且二聚化域已被证明由前44个氨基末端残基组成(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。cAMP与R亚单位的结合导致释放活性催化亚单位以产生广泛范围的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，其通过PKA对接于AKAP而发生区室化来定向于选定底物(Scott等，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
R亚单位仅以稳定二聚体形式得以分离并且二聚化域已被证明由前44个氨基末端残基组成(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。cAMP与R亚单位的结合导致释放活性催化亚单位以产生广泛范围的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，其通过PKA对接于AKAP而发生区室化来定向于选定底物(Scott等，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
[0085] 自从第一种AKAP即微管相关蛋白-2于1984年得到表征(Lohmann等，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81：6723)以来，集中于各种亚细胞位点(包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、核、线粒体，和内质网)的50多种AKAP已被鉴定出在从酵母到人范围内的物种中具有不同结构(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。AKAP针对PKA的AD是14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等，J.Biol.Chem.1991；266：14188)。AD的氨基酸序列在个别AKAP之间具有很大差异，其中针对RII二聚体的结合亲和力据报道在2到90nM范围内(Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100：4445)。引起关注的是，AKAP只与二聚体R亚单位结合。对于人RIIα，AD与由23个氨基末端残基形成的疏水表面结合(Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因此，人RIIα的二聚化域和AKAP结合域都位于相同N-末端44氨基酸序列内(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon等，EMBO J.2001；20：1651)，它在本文中称为DDD。
[0086] 人RIIα的DDD和AKAP的AD作为连接物模块
[0087] 我们已开发一种将人RIIα的DDD和AKAP的AD用作优秀连接物模块对以便将以下称为A和B的任何两个实体对接成非共价复合物的平台技术，所述非共价复合物可通过将半胱氨酸残基引入DDD和AD的战略位置以促进形成二硫键而进一步锁定为稳定栓系的结构。“对接-和-锁定”途径的一般方法如下。实体A通过将DDD序列连接至A的前体，产生以下被称为a的第一组分来构建。因为DDD序列将实现二聚体的自发形成，所以A将由a2组成。实体B通过将AD序列连接至B的前体，产生以下被称为b的第二组分来构建。a2中所包含的DDD的二聚基元产生与b中所包含的AD序列结合的对接位点，由此促进a2和b的即刻缔合，以便形成由a2b组成的二元、三聚体复合物。此结合事件由于将两个实体经由二硫桥键来共价固定的后续反应而变得不可逆，因为最初结合相互作用使置于DDD和AD上的反应性硫醇基团处于接近位置中以便于位点特异性地连接，所以此后续反应非常高效地基于有效局部浓度的原理而发生(Chmura等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480)。
[0088] 在一些替代实施方案中，痘病毒疫苗免疫偶联物基于a2b结构的变化形式，其中抗-HLA-DR或抗-CD74抗体或F(ab′)2或F(ab)2抗体片段的每个重链在其C-末端连接至AD部分的一个拷贝。因为每个抗体或片段有两个重链，所以每个抗体或片段有两个AD部分。亚单位抗原肽被连接到互补DDD部分。在DDD部分二聚化之后，每个DDD二聚体与连接至IgG抗体或F(ab′)2或F(ab)2片段的其中一个AD部分结合，产生每个IgG或F(ab′)2或F(ab)2单位四个抗原肽的化学计量关系。然而，本领域技术人员将认识到可利用替代复合物，如抗原肽与AD序列连接和将抗-HLA-DR或抗-CD74MAb或片段与DDD部分连接，产生效应因子部分的不同化学计量关系。例如，通过将DDD序列与IgG抗体或F(ab′)2片段的每个重链的C-末端连接，和将AD序列与抗原肽连接，可构建包含一个抗原肽和一个抗体或片段的DNL复合物。
[0089] 通过将DDD和AD远离两个前体的功能性基团连接，预计此类位点特异性连接可保存两个前体的初始活性。此方法在性质上是模块化的并且潜在地可用于位点特异性地和共价地连接广泛范围的物质。
[0090] 在优选实施方案中，DDD或AD部分与抗体或抗原肽共价连接以形成融合蛋白或肽。制造融合蛋白的多种方法是已知的，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。此类双链核酸可通过标准分子生物学技术插入表达载体中以产生融合蛋白(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。在此类优选实施方案中，AD和/或DDD部分可与蛋白质或肽的N-末端或C-末端连接。然而，本领域技术人员认识到AD或DDD部分的连接位点可变化。例如，虽然可在保持抗原结合活性的同时将AD或DDD部分连接至抗体或抗体片段的N-或C-末端，但是与C-末端的连接使AD或DDD部分处于远离抗原结合位点的位置并且似乎产生更强的结合相互作用(例如Chang等，Clin Cancer Res 2007，13：5586s-91s)。多种效应因子部分的位点特异性连接还可使用本领域已知的技术来执行，如使用二价交联试剂和/或其它化学偶联技术。
[0091] 治疗性处理的方法
[0092] 制剂
[0093] 痘病毒疫苗可根据已知方法配制以制备药学适用组合物，其中痘病毒疫苗以混合物形式与药学合适赋形剂组合。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学合适赋形剂的一个实例。其它合适赋形剂是本领域技术人员熟知的。参见例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea&Febiger 1990)，和Gennaro(编著)，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)和其修订版。
[0094] 痘病毒疫苗优选皮下或鼻腔施用。更优选地，痘病毒疫苗以单个或多个推注剂形式经由皮下注射施用。施用制剂可以单位剂型提供，例如提供于安瓿或多剂量容器中，其中添加防腐剂。组合物可采用如油性或水性载体中的混悬液、溶液或乳状液这样的形式，并且可含有配方剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。另外，活性成分可呈在使用之前用合适载体(例如无菌无热原水)复水的粉末形式。
[0095] 可使用其它制药方法来控制痘病毒疫苗的作用持续时间。可通过使用络合或吸附痘病毒疫苗的聚合物来制备缓释制剂。例如，生物相容聚合物包括乙烯-醋酸乙烯共聚物基质和硬脂酸二聚体与癸二酸的酸酐共聚物基质。Sherwood等，Bio/Technology 10：1446(1992)。从此种基质中释放的速率取决于痘病毒疫苗的分子量、基质内的痘病毒疫苗的量和分散颗粒的大小。Saltzman等，Biophys.J.55：163(1989)；Sherwood等，上述。其它固体剂型描述于Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第
5版(Lea&Febiger 1990)，和Gennaro(编著)，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)和其修订版。
5版(Lea&Febiger 1990)，和Gennaro(编著)，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)和其修订版。
[0096] 一般来说，人施用痘病毒疫苗的剂量取决于如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和既往病史等因素而有所不同。在单次施用中向接受者提供约1mg/kg到25mg/kg范围内的痘病毒疫苗剂量可能是可取的，但是如情况需要也可施用更低或更高剂量。举例2
来说，1-20mg/kg剂量对于70kg患者为70-1,400mg，或对于1.7-m患者为41-824mg/m。如需要可重复给药以诱导免疫反应。
来说，1-20mg/kg剂量对于70kg患者为70-1,400mg，或对于1.7-m患者为41-824mg/m。如需要可重复给药以诱导免疫反应。
[0097] 在替代实施方案中，治疗肽可通过吸入途径施用(例如Sievers等，2001，Pure Appl.Chem.73：1299-1303)。超临界二氧化碳雾化已用于从包括蛋白质和肽的各种药剂中产生纳米或微米尺度的颗粒(同上)。将超临界二氧化碳与蛋白质或肽水溶液混合所形成的微泡可在与形成药物粉末的替代方法相比较低的温度(25至65℃)下干燥，从而保留治疗肽的结构和活性(同上)。在某些情况下，可将稳定剂如海藻糖、蔗糖、其它糖、缓冲剂或表面活性剂添加到溶液中，以进一步保存功能活性。产生的颗粒小到足以通过吸入施用。在其它替代方案中，可利用水溶液的鼻腔施用。
[0098] 试剂盒
[0099] 各种实施方案可涉及含有适合于治疗或诊断患者的患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可含有至少一种或多种如本文所述的痘病毒疫苗免疫偶联物。如果包含施用组分的组合物不是经配制以便通过鼻腔施用或吸入来递送，能够通过皮下注射来递送试剂盒组分的装置可被包括在内。一种类型的装置是用于将组合物注入受试者的身体内的注射器。在一些实施方案中，治疗剂可以含有无菌、液体制剂或冻干制剂的预充式注射器或自动注射笔形式提供。
[0100] 试剂盒组分可以包装在一起或分隔至两个或更多个容器中。在一些实施方案中，容器可为含有适合于复水的组合物的无菌、冻干制剂的小瓶。试剂盒还可能包含一种或多种适合于复水和/或稀释其它试剂的缓冲剂。可使用的其它容器包括但不限于小袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可以被包装于容器内并保持无菌。可以包含在内的另一个组成部分是向使用者提供试剂盒的使用方法的说明书。
[0101] 表达载体
[0102] 其它实施方案可能涉及包含编码痘病毒疫苗免疫偶联物或其组成蛋白的核酸的DNA序列。融合蛋白可包含与亚单位抗原肽连接的抗-HLA-DR抗体。另外，所编码融合蛋白可包含与抗体或抗原肽连接的DDD或AD部分。
[0103] 各种实施方案涉及包含编码DNA序列的表达载体。载体可含有可与嵌合、人源化或人可变区序列连接的编码人免疫球蛋白的轻和重链恒定区和铰链区的序列。此外，载体可能含有在选定的宿主细胞中表达所编码的蛋白质的启动子、增强子和信号或前导序列。特别有用的载体是pdHL2或GS。更优选地，轻链和重链恒定区和铰链区可来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任选地同种异型(allotype)位置中的至少一个氨基酸更换为不同IgG1同种异型中的氨基酸，并且其中任选地基于EU编号系统的EU重链的氨基酸253可替换为丙氨酸。参见Edelman等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 63：78-85(1969)。在其它实施方案中，IgG1序列可转换为IgG4序列。
[0104] 本领域技术人员将认识到对表达构建体进行基因工程化并将其插入宿主细胞中以表达工程化蛋白质的方法是本领域熟知的，并且属于例行实验。宿主细胞及表达克隆抗体或片段的方法已描述于例如美国专利第7531327、7537930和7608425号，其实施例部分以引用方式并入本文。实施例
[0106] 实施例1.针对痘病毒亚单位抗原肽的免疫反应
[0107] 材料和方法
[0108] 肽设计.具有针对HLA I类和/或HLA II类分子的多个潜在结合位点的9-聚体或15-聚体肽序列通过目测筛查HLA锚定残基是否处于正确间距，或使用基于万维网的方法(例如BIMAS或SYFPEITHI[Parker等，J Immunol 152：163-75，1994；Rammensee等，Immunogenetics 50：213-19，1999])而从痘病毒开放阅读框架获得，其中选择是基于特异性HLA-结合的较高潜力(表2)。vIL18BP(C12L)、A4L(Boulanger等，J Virol 72：170-79，1998)、A27L(Chung等，J Virol72：1577-85，1998)或D8L(Hsaio等，J Virol 73：8750-61)VV抗原的核苷酸和氨基酸序列从NIH GenBank入藏登记号：AY243312来检索。这些肽通过其基因来源和编号(例如vIL18BP105或vD8L118)来定名。
[0109] 表2.痘病毒vIL18BP-衍生肽、A4L229和TT830的氨基酸数目和HLA限制。
[0110]#
[0111] *TT830，破伤风类毒素T细胞辅助肽；A4L229，来自牛痘A4LORF的表位；vIL18BP，@痘病毒IL-18结合蛋白衍生肽(牛痘C12L)。没有圆括号的结合潜力≥15(www.SYNPEITHI.de)；在圆括号内，结合概率为10-14。除了HLA II类表位以外，15-聚体还可含有一个以上潜在HLAI类结合表位。只显示有限数量的HLA类型。
[0112] 肽氨基酸序列如下所示。针对与人基因组的相似性、使用NIHBlast服务程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)来筛选肽。具有与人蛋白质组同源性的肽被丢弃。所有新设计的肽以95％纯度来商业合成(Sigma-Genosys，Woodlands，TX USA，New England Peptide，Gardner，MA)。
[0113] vIL18BP118
[0114] CVLTTLNGV(SEQ ID NO：13)
[0115] vIL18BP102
[0116] KFAHYRFTCVLTTLNGVSKKNIVVLK(SEQ ID NO：14)
[0117] vIL18BP105
[0118] HYRFTCVLTTLNGVS(SEQ ID NO：15)
[0119] vIL18BP110
[0120] CVLTTLNGV(SEQ ID NO：16)
[0121] vIL18BP117
[0122] GVSKKNIWL(SEQ ID NO：17)
[0123] vA4L229(天花病毒)
[0124] ALKDLMSSV(SEQ ID NO：18)
[0125] TT830(破伤风杆菌)
[0126] QYIKANAKFIGITEL(SEQ ID NO：19)
[0127] vA27L003-027
[0128] GTLFPGDDDLAIPAT(SEQ ID NO：20)
[0129] vA27L003-012
[0130] GTLFPGDDDLAIPATEFFSTKAAKK(SEQ ID NO：28)
[0131] vA27L004-012
[0132] TLFPGDDDL(SEQ ID NO：29)
[0133] vD8L110-134
[0134] HDDGLIIISIFLQVLDHKNVYFQKI(SEQ ID NO：21)
[0135] vD8L118-132
[0136] SIFLQVLDHKNVYFQ(SEQ ID NO：22)
[0137] vD8L116-124
[0138] IISIFLQVL(SEQ ID NO：33)
[0139] vB5R001-025
[0140] MKTISVVTLLCVLPAVVYSTCTVPT(SEQ ID NO：30)
[0141] vB5R004-018
[0142] ISVVTLLCVLPAVVY(SEQ ID NO：31)
[0143] vB5R008-016
[0144] TLLCVLPAV(SEQ ID NO：32)
[0145] 供体样品 血沉棕黄层从新泽西州血液中心(NJBB)(West Orange，NJ USA)获得。其它PBMC样品在新英格兰机构审查委员会(Wellesley，MA USA)批准使用人血液之后从当地供体，或从Cellular Technology Limited(CTL)(Shaker Hts，OH USA)获得。表3总结了供体HLA类型、年龄和疫苗状态。由于每个样品中的细胞数量有限，不是所有的样品都包括在每一个试验中。
[0146] 表3.供血者疫苗状态、年龄和HLA类型的汇总。
[0147]
[0148] 来自供体PBMC的DNA根据HLA-分型试剂盒(Biotest，Dreieich，Germany)说明书来扩增。为CTL，Inc.样品提供HLA类型。接种供体是声明其曾接受活的天花疫苗的人，或者根据年龄来推测接种状态，而未接种供体是声明其未接受过天花接种或在美国停止接种后出生的人。由于大多数样品中的细胞数量有限，不是所有的样品在所有试验中都进行测试。当供体的HLA类型未由供应商确定时，使用Biotest试剂盒(Biotest，Dreieich，Germany)通过SSP-PCR来测定PBMC的HLA类型。
[0149] 肽筛选与抗原加工蛋白-1和-2(TAP1和2)-缺陷型人B/T杂交瘤细胞系T2细胞(ATCC，Manassas，VA USA)相关的转运蛋白仅表达表面HLA-A02，并且在抗原呈递通道中由肽稳定时可增加其表达(Nijman等，Eur J Immunol 23：1215-19，1993)，将该转运蛋白与指示浓度下的β-2-微球蛋白和肽一起孵育。由于TAP缺陷，肽未经加工，因此必须具有允许与HLA-A02(9-聚体)结合的长度。使用FITC-标记的W6/32(BD Pharmingen，San Diego，CA USA)和FACSCALIBURTM流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA USA)来执行HLA6
分析。通过将1×10/mL的PBMC与生物素化肽一起孵育，接着将抗生物素蛋白-FITC偶联物添加至固定细胞并执行流式细胞术，来检测肽表位与从供体获得的人PBMC的结合。
分析。通过将1×10/mL的PBMC与生物素化肽一起孵育，接着将抗生物素蛋白-FITC偶联物添加至固定细胞并执行流式细胞术，来检测肽表位与从供体获得的人PBMC的结合。
[0150] T-细胞增殖和表型分析为了进行评价，使用基于羧基荧光素双醋酸酯琥珀酰亚胺酯(Invitrogen，Carlsbad，CA USA)的细胞增殖试验(Younes等，J Exp Med 198：1909-22，2003)，在体外针对来自接种天花和原初供体的PBMC进行肽筛选。为了便于比较，将来源于免疫显性痘病毒蛋白A4L(Boulanger等，J Virol 72：170-79，1998)的肽、另一个来自破伤风类毒素(TT830)(Demotz等，J Immunol 142：394-402，1989)的肽，或来自HIVgag蛋白(HIVgag)(Kan-Mitchell等，J Immunol172：5249-61，2010)的肽包含在内。简单地说，将
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10-50×10PBMC用CFSE(1.5μM)标记。2×10 细胞(200μL)与指示浓度的肽、金黄色葡萄球菌肠毒素(SEA)(10ng/mL)或植物血细胞凝集素(2.5μg/mL)(PHA，Sigma-Aldrich)一起孵育。细胞用针对CD8或CD3的抗体染色，并且在5天之后检查生存力(7-AAD)。将以活CD3+淋巴细胞设门的20,000个事件用流式细胞术收集，并且使用Flow-Jo软件(Mountain View，CAUSA)分析。基于CFSE荧光的减少来评价增殖。将在存在刺激肽(测试)时失去CFSE染料的细胞的数目除以不存在肽(对照)时增殖的细胞的数目来计算增殖细胞的荧光指数(FI)。
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10-50×10PBMC用CFSE(1.5μM)标记。2×10 细胞(200μL)与指示浓度的肽、金黄色葡萄球菌肠毒素(SEA)(10ng/mL)或植物血细胞凝集素(2.5μg/mL)(PHA，Sigma-Aldrich)一起孵育。细胞用针对CD8或CD3的抗体染色，并且在5天之后检查生存力(7-AAD)。将以活CD3+淋巴细胞设门的20,000个事件用流式细胞术收集，并且使用Flow-Jo软件(Mountain View，CAUSA)分析。基于CFSE荧光的减少来评价增殖。将在存在刺激肽(测试)时失去CFSE染料的细胞的数目除以不存在肽(对照)时增殖的细胞的数目来计算增殖细胞的荧光指数(FI)。
[0151] 对于表型分析，将GOLGIPLUGTM(布雷菲德菌素A，1μg/mL)中的PBMC与10μg/mL指示肽、培养基对照(其中添加与肽储备液相同体积的PBS)或者SEA或PHA一起孵育14h。然后将细胞(在透性化之后)以所指示荧光标记抗体(IFN-γ或IL-2)于表面或于细胞内染色。还将细胞针对CD8、用于确定以前是否接触抗原的CD45RA、CCR7(淋巴结归巢标志物)(38)或CD107a(细胞杀伤能力标志物)(1)染色。在肽刺激和对照试验中测定CD8+或CD8-效应记忆(TEM)或终末分化T细胞(CD45RA-CCR7-)、中央记忆T细胞(TCM)(CD45RA-CCR7+)和细胞因子驱动分化T细胞(TEMRA)(CD45RA+CCR7-)(12)的百分比。CD8-阴性T细胞被认为含有CD4+群体。
[0152] 抗体分析 使用基于ELISA的改良方法(Makabi-Panzu等，Vaccine16：1504-10，1998)来评估血清抗体。简单地说，将ELISA板孔涂上10μg/mL靶肽。在阻断和洗涤之后，添加在PBS中2倍连续稀释的测试血清。以与过氧化物酶偶联的抗人抗体来检测与抗体的结合。将板以邻苯二胺盐酸盐过氧化物酶底物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO USA)显影并且以酶标仪在490nm下测量孔的光密度。
[0153] 数据分析在实验条件下观察到的差异显著性按指示使用Statview+SE软件(Abacus Concepts，Berkeley，CA USA)或方差分析(ANOVA)(Excel，Microsoft Corp.，Redmond，WA USA)通过Student氏t检验并伴以多重比较的费歇尔校正来确定。P＜0.05被认为是显著的。
[0154] 结果
[0155] 痘病毒肽设计和筛选 根据SYFPEITHI或BIMAS分级系统、基于HLA-结合潜力的较高得分、将痘病毒vIL18BP(SEQ ID NO：23)分列为9-、15-或25-聚体肽，重点在于HLA-A02-和HLA-DR04-结合。测试vIL18BP-衍生肽与TAP-缺陷型T2杂交瘤细胞的结合，其在抗原呈递通道中由肽稳定时增加HLA-A02的表达。9-聚体肽、vIL18BP110(SEQ ID NO：16)、vIL18BP117(SEQ ID NO：17)和A4L(SEQ ID NO：18)都含有具有潜在HLA-A0201结合能力的序列(未经加工)。在这些肽中，vA4L(SEQ ID NO：18)和vIL18BP110(SEQ ID NO：16)以浓度依赖性的方式结合T2细胞上的HLA-A02(图1A)。vIL18BP117(SEQ ID NO：17)肽尽管具有结合HLA-A02的中度到高度概率，却未结合。并有T2细胞不能加工的vIL18BP110序列(SEQ ID NO：16)的15-聚体肽(vIL18BP008、SEQ ID NO：13和105、SEQ ID NO：15)也不结合。
[0156] vIL18BP序列
[0157] MRILFLIAFMYGCVHSYVNAVETKCPNLDIVTSSGEFYCSGCVEHMSKFSYMYWLAKDMKSDEYTKFIEHLGDGIKEDETIRTTDGGITTLRKVLHVTDTNKFAHYRFTCVLTTLNGVSKKNIWLK(SEQ ID NO：23)[0158] 还预测vIL18BP肽可结合若干其它HLA单倍型(表2)，其中大多数呈现于表3中概述的PBMC供体群体中。当测试肽与供体细胞的结合时，vIL18BP008(SEQ ID NO：13，15-聚体)和vIL18BP110(SEQ ID NO：16，9-聚体)展现与来自供体NJ04(A01/03，DR04)和NJ01(A11，DR15)的PBMC的强结合，以及与NJ07(A01，DR16)和NJ08(A01/02，DR16)的PBMC的相对弱结合(图1B)。考虑到供体HLA-类型、肽的预测HLA靶标和T2结果，可以得出结论：vIL18BP110(SEQ ID NO：16)9-聚体不结合HLA-A01，而是结合HLA-A02、A03和-A11，其全部由T2细胞或供体组来表示。
[0159] 15-聚体vIL18BP105(SEQ ID NO：15)据预测可结合HLA II类DR04和DR15(NJ01和NJ04)和由供体表示的除HLA-A01以外的所有I类HLA型。除了HLA-A01以外，供体NJ08也是HLA-A02-阳性的，因此HLA-A02可说明所测量的结合力。来自表达HLA-DR16和非结合HLA-A01的供体NJ07的强烈信号暗示了vIL18BP105(SEQ ID NO：15)与HLA-DR16结合的证据。虽然HLA-DR16的共有基元一直没有得到较好地表征(Onion等，J Gen Virol 88：2417-25，2007)，但是有至少一个报道暗示HLA-DR15和-DR16的结合基元共享相似性(Zeng等，J Virol 70：3108-17，1996)。
[0160] 作为T细胞抗原模拟物的肽的免疫反应性通过5天基于CFSE的增殖试验来评估，其中将来自接种或未接种供体的负载CFSE的PBMC与vIL18BP105(SEQ ID NO：15)和来自两种其它痘病毒基因vD8L118(SEQ ID NO：22)和vA27L003(SEQ ID NO：20)的肽一起孵育。所有vIL18BP105(SEQ ID NO：15)试验的结果总结于表4中。vIL18BP105(SEQ ID NO：15)、vD8L118(SEQ ID NO：22)和vA27L003(SEQ ID NO：20)的并行试验的结果显示于图2A(接种供体)和图2B(未接种供体)。
[0161] 总体上，vIL18BP105(SEQ ID NO：15)以10μg/mL的浓度诱导来自接种供体的PBMC的显著增殖(表4)。在与vD8L118(SEQ ID NO：22)(6/7)和vA27L003(SEQ ID NO：20)(4/7，图2A)一起孵育时，接种供体的细胞也增殖。这些结果表明vIL18BP105(SEQ ID NO：15)、vD8L118(SEQ ID NO：22)和vA27L003(SEQ ID NO：20)包含由来自天花接种供体的淋巴细胞识别的表位。来自未接种供体的细胞总体上对于痘病毒肽无反应(图2B)。当在独立实验(14-h试验)中检测来自接种供体(12A、416、417)和未接种供体(213、704、706)的样品是否存在活化标志物和产生细胞内细胞因子时，在CD4+和CD8+细胞中发现IFN-γ反应。CD8+细胞还表达细胞杀伤能力标志物CD107a(相比于培养基对照，P＜0.05，图2C)。
[0162] 表4.对于vIL18BP105的PBMC增殖反应的汇总表
[0163]
[0164] 使用10μg/mL vIL18BP105肽、2.5μg/mL PHA(P)或10ng/mLSEA(S)浓度。使用在材料和方法中描述的基于CFSE的细胞增殖试验，通过将在存在肽(或P或S)时增殖的细胞的数目除以不存在肽(或P或S)时增殖的细胞的数目来估算荧光指数(FI)。N＝个体供体的数目。所有样品检测三次(平均值±SD)。对于vIL18BP105，接种者相比于未接种者，P＜0.001(ANOVA)。
[0165] 增殖细胞的表型为了测定增殖细胞的CD4或CD8表型，探查与vA27L003(SEQ ID NO：20)或vIL18BP105(SEQ ID NO：15)一起孵育(5天)的来自接种和未接种对照的负载CFSE的PBMC是否表达CD4或CD8。在来自接种供体的样品中，CD4+(4/5)和CD8+(2/5)细胞均增殖，而在未接种供体的样品中，任一细胞亚群都几乎没有增殖(0/3，表5)。
[0166] 在14-小时细胞内细胞因子染色试验中执行应答细胞表型的进一步测定。在与vD8L118(SEQ ID NO：22)(2/5)或vIL18BP105(SEQ IDNO：15)(2/5)一起孵育的样品中发现CD8+T细胞群体中的IFN-γ产生的增加(表6，P＜0.05)。尽管在5天的基于CFSE的试验中刺激增殖，vA27L003(SEQ ID NO：20)未刺激IFN-γ或IL-2增加(未图示)。在CD4+T细胞中，IFN-γ产生未显著增加，但是分离样品作出反应。然而，在CD4+群体(vD8L118，SEQ ID NO：22)和CD8+细胞(vIL18BP105，SEQ ID NO：15)中，IL-2产生增加显著(表6；P＜0.04)。
[0167] 表5与vA27L003或vIL18BP105肽一起孵育的增殖T细胞的CD4+或CD8+表型(5天试验)。
[0168]
[0169] 将存放的人PBMC解冻，与CFSE一起孵育24h，接着按指示与PHA-P(2.5μg/mL)或20μg/mL肽一起孵育，之后染色以检测CD4或CD8表达。通过流式细胞术分析。栏标题：
待续：培养基对照；vA27L：vA27L003；vIL18BP：vIL18BP105。以黑体字呈现的值相比于对照≥1.5倍。
待续：培养基对照；vA27L：vA27L003；vIL18BP：vIL18BP105。以黑体字呈现的值相比于对照≥1.5倍。
[0170] 通过针对原初CD8细胞和效应因子CD8细胞亚群(TEMRA)的标志物CD45RA，和淋巴结归巢标志物CCR7进行染色来进一步分析来自相同接种供体的产生CD8+/IFN-γ的T细胞是否存在与记忆表型相关的标志物。此分析把TCM(CCR7+CD45RA-)、前体(CCR7+CD45RA+)、TEMRA(CCR7-CD45RA+)和TEM与终末分化(CCR7-CD45RA-)细胞群体区分开。显影的细胞类型是CCR7-CD45RA-(TEM或终末分化效应因子)(图3)。vD8L118(SEQ ID NO：
22)抗原肽在产生这些细胞类型中最活跃(相比于培养基对照，P＜0.019)。另外，每个试验中的2个供体也对vIL18BP105(SEQ ID NO：15)和vA27L003(SEQ ID NO：20)作出相似的反应。
22)抗原肽在产生这些细胞类型中最活跃(相比于培养基对照，P＜0.019)。另外，每个试验中的2个供体也对vIL18BP105(SEQ ID NO：15)和vA27L003(SEQ ID NO：20)作出相似的反应。
[0171] 表6.与痘病毒肽一起孵育14h的CD4和CD8T细胞的IL-2或IFN-γ产生。
[0172]
[0173] 所示值是与指定肽一起孵育14h之后每个供体的关于每种细胞因子的阳性细胞的百分率。将细胞针对CD8染色，并且CD8-阴性淋巴细胞被认为是CD4+。CD8+细胞由10-30％的总淋巴细胞组成。所有供体接种天花疫苗。肽浓度：10μg/mL；PHA，2.5μg/mL。
以黑体字呈现的值超过培养基对照≥1.5倍。对于HIV肽和vA27L003的反应并非显著不同于仅有培养基的对照。*CD8/IFN-γ/vD8L118和vIL18BP105相比于培养基对照，P＜0.05；
CD4/IL-2/vD8l118相比于培养基对照，P＜0.04；CD4/IL-2/vIL18BP105相比于培养基对照，P＜0.013(t-检验)。
以黑体字呈现的值超过培养基对照≥1.5倍。对于HIV肽和vA27L003的反应并非显著不同于仅有培养基的对照。*CD8/IFN-γ/vD8L118和vIL18BP105相比于培养基对照，P＜0.05；
CD4/IL-2/vD8l118相比于培养基对照，P＜0.04；CD4/IL-2/vIL18BP105相比于培养基对照，P＜0.013(t-检验)。
[0174] 通过测定CD107a的表达来检测CD8+效应细胞群体脱粒的能力，即其执行效应功能的能力(Berhanu等，J Virol 82：3517-29，2008)(图4)。在CD8+IFN-γ+和CD8+IFN-γ-群体中，在与vD8L118(SEQ ID NO：22)一起孵育的5个PBMC样品中的3个PBMC样品中，CD107a表达增加到2-7倍(P＜0.04)。与vIL18BP105(SEQ ID NO：15)(P＜0.01)和vD8L118(SEQ ID NO：22)一起孵育时，也在CD8+IL-2+群体中测量到CD107a增加，但是后者未取得显著性。
[0175] 在相似的14-小时细胞内细胞因子染色试验中，来自未接种供体的CD8+IFN-γ+细胞对于肽无反应(未图示)。
[0176] 血清抗体滴度需要针对痘病毒的抗体以便在二次暴露时提供保护，并且在接种之后几十年，抗牛痘抗体的存在仍保持于90％的受接种者中(Hammarlund等，Nat Med 9：1131-37，2003)。因此，来自以前接种过的患者的血清抗体将指向免疫相关B细胞表位。为了测定抗原肽序列是否包含可识别的B细胞表位，将来自接种和未接种供体的1∶200稀释血清用肽vA27L003(SEQ ID NO：20)(15-聚体)、vIL18BP102和vD8L110(25-聚体)测试。结果(图5)表明针对vD8L110和vA27L003(SEQ ID NO：20)肽的血清抗体总体上较高，并且显著高于未接种个体(P＜0.05)。虽然3个供体产生识别vIL18BP102的抗体，但是总体结果未取得显著性。结果表明，实验肽含有一个或几个充当B细胞表位的序列。抗肽抗体的存在并没有因为供体年龄或接种后的时间而有所不同(未图示)。
[0177] 讨论
[0178] 将抗原肽包含在替代痘疫苗中要求它们是人体免疫力的相关靶标。上述结果决定源自痘病毒抗原的特定肽是否能够在接种供体的PBMC中引起记忆反应。表位来源于三种痘病毒抗原，包括在宿主免疫力方面未予以表征的抗原(vIL18BP)，以及针对宿主保护予以表征，但是其特定表位未予以表征的已知痘病毒包膜抗原A27L和D8L(Chung等，J Virol72：1577-85，1998；Hsaio等，J Virol 73：8750-61，1999)。由每种肽引起的反应类型是不同的。
[0179] 痘病毒IL18BP通过中和掉NK细胞IL-18，进而防止IFN-γ产生，来对宿主先天免疫进行调节。CD4+和CD8+细胞和来自接种供体的血清抗体对于一组肽vIL18BP、vIL18BP105(SEQ ID NO：15)和其衍生物的识别证实了以下假设：这种并且很可能其它瞬时表达的病毒宿主反应调节因子是宿主免疫力的靶标。vIL18BP的中和作用可有助于防止初次感染和由此导致的感染建立，此结论最近由痘病毒类型I IFN-结合蛋白所证明(Xu等，J Exp Med 205：981-92，2008)。
[0180] 基于抗原表位的疫苗策略的设计需要病毒组分与HLA相互作用以便T-细胞发育。在这项研究中，肽据预测可结合若干已定义的HLA单倍型。但是，尽管存在关于HLA结合的预测，如来自C12L序列(vIL18BP)的肽所证明，只有一些表位可结合。
[0181] 来自C12L(vIL18BP)以及抗原A27L和D8L的肽引起来自接种供体的CD4+和CD8+细胞的增殖，这表明APC吸收肽并且在HLA I类的情况下将其加工以呈递于CD8+，并且在II类的情况下将其加工以呈递于CD4+淋巴细胞。
[0182] 针对痘病毒的免疫力依赖于细胞免疫和体液免疫(Dunne等，Blood 100：933-40，2002；Ferrier-Rembert 等，Viral Immunol 20：214-20，2007；Meseda 等，Clin Vaccine Immunol 16：1261-71，2009；Xu等，J Immunol 172：6265-71，2004)，这两者需要T细胞辅助实现类别转换和亲和力成熟。在多肽内T和B表位的接近性由于其呈递的差异而可能影响抗体产生。然而，天然B细胞表位往往接近HLA-结合区域(Simitsek等，J Exp Med 181：
1957-63，1995)。许多因素可能影响抗体的形成，包括HLA类型(Quaratino等，J Immunol
174：557-63，2005)。
1957-63，1995)。许多因素可能影响抗体的形成，包括HLA类型(Quaratino等，J Immunol
174：557-63，2005)。
[0183] 在如上所述的研究中，我们证明1/3接种供体亚群中出现可测量的抗体。另外，肽包含线性序列，并且因此抗体识别线性表位，其可包含仅仅3个氨基酸(Tahtinen等，Virology 187：156-64，1992)。在vIL18BP105(SEQ ID NO：15)的情况下，存在相关B细胞表位的进一步证据由小鼠研究提供，在所述研究中针对vIL18BP105(SEQ IDNO：15)的血清抗体识别全长重组vIL18BP(C12L)蛋白质(未图示)。总的来说，这些结果表明，在这项研究中使用的抗原肽呈递人反应的T-和B-细胞靶标。
[0184] 细胞因子和标志物的产生显示了vIL18BP105(SEQ ID NO：15)和vD8L118(SEQ ID NO：22)引起IL-2的产生，它保存了T细胞的增殖能力，甚至在没有CD4辅助下也是如此(Zimmerli等，Proc Natl Acad Sci USA 102：7239-44，2005)。这支持了增殖数据，并进一步证明了vIL18BP肽对于基于亚单位的疫苗的效用。肽刺激的CD8+TEM细胞的IFN-γ产生具有多重效应，包括诱导抗病毒效应功能。因此，当vD8L118(SEQ ID NO：22)刺激具有效应和增殖潜力的CD8+T细胞时，结果类似于对于与病毒一起孵育的细胞所报道的结果(Laouar等，Plos One 3：e4089，2008)。IFN-γ产生也成为产生Th1反应的区别性特征，所述Th1反应对于出现针对牛痘的细胞毒性是必需的(Meseda等，Clin Vaccine Immunol16：1261-71，2009；Xu等，J Immunol 172：6265-71，2004)。另外，由CD4+细胞产生的IL-2和IFN-γ与辅助Th1导向的T-细胞参与紧密地联系在一起。A27L肽不刺激CD8+或CD4+细胞中的IFN-γ或IL-2增加，即使T细胞与此肽一起孵育时得以增殖也是如此。A27L样品中的活性缺乏可能归因于不同的反应动力学，或所刺激的替代细胞群体产生了我们没有检测的不同细胞因子或白细胞介素，如IL-4。
[0185] 我们的关于细胞杀伤能力标志物CD107a的结果类似于一项最近研究，其中来自再接种供体的CD4+细胞亚群在用牛痘病毒刺激后表达CD107a(Puissant-Lubrano等，J Clin Invest 120：1636-44，2010)。在我们的研究中，来自接种供体的CD8+细胞在用肽刺激后表现出此标志物的增强的表达。
[0186] 与Combadiere等(J Exp Med 199：1585-89，2004)的发现相反，当天花疫苗接种发生于超过45年以前时，我们未观察到响应于牛痘抗原而产生细胞因子的能力的丧失。
[0187] 总之，我们已经提出的证据表明，来自3种痘病毒抗原的亚单位抗原肽能够刺激接种供体的回忆反应，包括T细胞增殖、细胞因子的表达和血清抗体对于B细胞表位的识别。一个抗原表位来自由牛痘产生的一种迄今未予以表征的宿主防御调节因子IL18BP。这里提供的结果表明，使用选定肽表位来开发针对痘病毒的替代疫苗可以产生免疫力，而没有用活性病毒进行接种所带来的危害。相对于用致病基因通常缺失或突变的减毒形式的痘病毒进行免疫，此无病毒方法的优点在于任何痘病毒基因的免疫相关部分以及改变的基因可包含在内。
[0188] 实施例2.APC-靶向抗体与亚单位抗原肽偶联以用于痘病毒疫苗
[0189] 概述
[0190] 将vIL18BP105(SEQ ID NO：15)与抗-HLA-DR抗体L243偶联以便更好地呈递于免疫系统，并且使用其使表达HLA-DR04的转基因(tg)小鼠免疫。与游离vIL18BP105(SEQ ID NO：15)相比，偶联vIL18BP105(CIL18BP105)更容易被人和HLA-DR转基因小鼠细胞吸收。来自用CIL18BP105免疫的HLA-DR04转基因小鼠的脾细胞在体外用vIL18BP105(SEQ ID NO：15)刺激时增殖。CIL18BP105接种的小鼠脾细胞的增殖涉及CD3+CD4+CD45RA细胞。增殖伴有干扰素γ产生(定量夹心ELISA)。第一次加强免疫之后7天，接种CIL18BP105的小鼠还显示出4倍于注射vIL18BP105的对照的提前和快速上升的肽特异性抗体滴度。在稍后的时间，CIL18BP105和vIL18BP105(SEQID NO：15)诱导IgG2a和IgG1，这提示Th1和Th2免疫起始。来自CIL18BP105免疫小鼠的血清抗体识别完整重组C12L蛋白。这些结果表明，抗原肽与抗HLA-DR抗体的偶联加强了免疫原性，并且提升了表达HLA-DR的抗原呈递细胞的肽递送。
[0191] 方法
[0192] HLA-DR抗体-偶联物 使用含有H-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯和马来酰亚胺基团的异双功能交联剂，磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环已烷-1-羧酸(磺基-SMCC)“SMCC”，遵循制造商的方案(Pierce，Rockford，IL，USA)来使可刺激免疫供体PBMC增殖的肽与L243抗体偶联。SMCC通过其NHS酯基团与抗体的伯胺相互作用以形成酰胺键，并且马来酰亚胺基团与肽上的C-末端半胱氨酸的游离巯基形成硫酯键。简单地说，1ml的1mg/ml抗体于PBS中的溶液与20μL的1mg/ml新鲜制备的SMCC于PBS中的溶液在4℃下反应2小时。孵育之后，将多余的SMCC通过PBS预平衡脱盐柱去除。将活化抗体收集，然后在4℃下与肽(具有C-末端半胱氨酸)再孵育2小时(或过夜)。偶联物通过体积排除、使用P60细交联珠柱(BioRad，Hercules，CA，USA)来纯化以去除游离肽。通过SDS-PAGE使用5％-20％的梯度凝胶来评估肽偶联效率。在注入小鼠之前，偶联物制剂通过
0.22-μm PVDF过滤器(Millipore，Bedford，MA)过滤杀菌，并且在不完全弗氏佐剂(IFA)中乳化。
0.22-μm PVDF过滤器(Millipore，Bedford，MA)过滤杀菌，并且在不完全弗氏佐剂(IFA)中乳化。
[0193] 小鼠免疫从Taconic (Germantown，NY，USA)获得表达HLA-DR04(HLA-DR tg)的六到八周龄雌性C57BL/6J(B6)转基因(tg)小鼠。小鼠保持在我们设施的无病原体区域中。为了进行免疫，将每组3只小鼠的各组预激，然后通过皮下途径、用25μg以游离或抗体偶联形式在IFA中乳化的vIL18BP105(SEQ ID NO：15)肽以两周为间隔加强两次。注射IFA乳化PBS的小鼠充当原初对照。从预激到处死以一周为间隔收集血液，所述处死是在最后一次加强免疫之后7天。在处死时收集脾样品。用于通过ELISA来进行抗体检测和分型的血清在4℃下过夜凝血之后从血液中制备。在基于CFSE的T-细胞增殖试验和TCR谱分析中使用的脾细胞通过使脾经由不锈钢丝网机械破坏来分离。
[0194] 抗体产生分析和分型测定使用以前报道的基于ELISA的改良方法(MakabiPanzu等，1998)来评估抗体的产生和同型。简单地说，将ELISA板孔涂上PBS中的10μg/ml肽并且在4℃下孵育过夜。然后以脱脂乳/PBS在37℃下阻断30分钟并且以含有0.05％吐温20的PBS(PBST)洗涤。添加2倍连续稀释的测试血清以获得抗体滴度，或以1∶200稀释以用于同型测定。在室温下将板与血清孵育2h。将多余的血清通过用PBST洗涤三次来去除，并且在室温下添加1∶1000稀释的与过氧化物酶偶联的山羊抗-小鼠(或在分型的情况下与过氧化物酶偶联的绵羊抗-小鼠IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM)历时45min。
在此孵育之后，将孔洗涤，添加过氧化物酶底物，并且在显影之后，用酶标仪在490nm下测量孔的OD。
在此孵育之后，将孔洗涤，添加过氧化物酶底物，并且在显影之后，用酶标仪在490nm下测量孔的OD。
[0195] T-细胞增殖试验和TCRVβ谱分析供体PBMC或鼠源脾细胞的T-细胞增殖如以前所报道使用5天基于CFSE的细胞增殖试验来评估(Younes等，2003)。简单地说，6
10-50×10PBMC或脾细胞在1.5μM最终浓度下以CFSE标记。将细胞在PBS中洗涤两次，
5
并且以106细胞/毫升重新悬浮于完全RPMI培养基中。将2×10 细胞与所指示浓度的肽或PHA(2.5μg/ml)一起孵育以获得阳性对照孔。在体外在37℃、5％CO2气氛中孵育5天之后，将细胞用CD4-APC、CD8-PE和7-AAD或CD3-perCp染色。以活CD3+淋巴细胞设门的最低20,000个事件在FACScalibur流式细胞仪上得以收集，并且使用Flow Jo软件来分析。
基于生长细胞的CFSE荧光减少来评价T-细胞增殖。将综合细胞增殖Flow Jo程序用于分析。将在存在刺激肽(测试)时失去CFSE染料的细胞的数目除以不存在肽(对照)时增殖的细胞的数目来计算增殖细胞的荧光指数(FI)。
10-50×10PBMC或脾细胞在1.5μM最终浓度下以CFSE标记。将细胞在PBS中洗涤两次，
5
并且以106细胞/毫升重新悬浮于完全RPMI培养基中。将2×10 细胞与所指示浓度的肽或PHA(2.5μg/ml)一起孵育以获得阳性对照孔。在体外在37℃、5％CO2气氛中孵育5天之后，将细胞用CD4-APC、CD8-PE和7-AAD或CD3-perCp染色。以活CD3+淋巴细胞设门的最低20,000个事件在FACScalibur流式细胞仪上得以收集，并且使用Flow Jo软件来分析。
基于生长细胞的CFSE荧光减少来评价T-细胞增殖。将综合细胞增殖Flow Jo程序用于分析。将在存在刺激肽(测试)时失去CFSE染料的细胞的数目除以不存在肽(对照)时增殖的细胞的数目来计算增殖细胞的荧光指数(FI)。
[0196] 对于TCRVβ谱分析，将来自免疫或原初小鼠的经洗涤脾细胞再次用完全RPMI-1640培养基和染色缓冲液洗涤，然后如上所述针对T-细胞表面标志物在4℃下预染色20min，然后再次在4℃下与阻断2.4G2抗-FcRIII/I mAb一起孵育15min。然后细胞用适当荧光标记的抗-TCRVβ抗体染色，而不去除FcR-阻断mAb。在此最后孵育之后，将细胞用染色缓冲液洗涤并且用流式细胞术分析。
[0197] 数据分析在实验条件下观察到的差异显著性使用Statview+SE软件(Abacus Concepts，Berkeley，CA USA)、使用单向方差分析、视情况接着t检验并伴以多重比较的费歇尔校正来确定。P＜0.05被认为是显著的。
[0198] 结果
[0199] 在体外响应于vIL18BP105(SEQ ID NO：15)肽的T-细胞增殖为了测试是否亚单位抗原与APC靶向mAb的偶联将产生增强免疫反应，将肽vIL18BP105(SEQ ID NO：15)与mAb L243(CIL18BP105)化学偶联并且使用其使小鼠免疫。将结果与接受PBS/IFA(原初)和IFA中的游离vIL18BP105(SEQ ID NO：15)的小鼠相比较。使用5天基于CFSE的体外细胞增殖试验，来自CIL18BP105接种小鼠的脾细胞以浓度依赖性方式增殖。来自原初或游离肽免疫小鼠的细胞相对无反应(图6)。来自经任一形式的vIL18BP105(SEQ ID NO：15)免疫之后的HLA-DR04tg小鼠的CD4-阳性脾细胞的TCRVβ谱偏向TCRVβ8.3(未图示)。
[0200] 响应于vIL18BP105(SEQ ID NO：15)肽的抗体产生针对痘病毒的体液免疫对于防止感染是必不可少的。因此，在免疫HLA-DR04tg小鼠中研究了针对CIL18BP105相比于vIL18BP105(SEQ ID NO：15)的抗体反应。结果示于图7中。与注射vIL18BP105(SEQ ID NO：15)的小鼠相比，第一次加强免疫之后第7天(预激之后第21天)，注射CIL18BP105的小鼠展示较高肽特异性抗体产生。但是，在第一次加强免疫之后14天，抗体的数量是相似的。IgG1和IgG2a同型均可由CIL18BP105和vIL18BP105(SEQ ID NO：15)诱导，但是与其游离对应物相比，CIL18BP105引起更多的IgG1抗体产生(未图示)。IgG1和IgG2a的产生暗示了在T细胞辅助下的成熟抗体反应。该抗体反应也暗示了Th1和Th2辅助细胞参与。来自CIL18BP105免疫小鼠的血清抗体与整个vIL18BP蛋白(C12L)强烈反应(图8)，表明与抗-APC抗体偶联的亚单位抗原肽能够诱导针对完整病毒粒子的全身免疫反应。在促进在体外经vIL18BP105(SEQ ID NO：15)肽刺激的脾细胞产生干扰素-γ方面，用CIL18BP105免疫比用vIL18BP105(SEQ ID NO：15)免疫更有效(表7)。
[0201] 这些结果表明痘病毒亚单位肽，vIL18BP105(SEQ ID NO：15)，在与抗-HLA-DR抗体L243偶联时诱导HLA-DR04tg小鼠中的细胞和体液免疫反应。指示细胞介导免疫的T-细胞增殖反应尤其因抗原-L243偶联物而增强。在CIL18BP105免疫小鼠中，抗体产生更快地上升。肽-抗体偶联物比游离肽更早地诱导更高的抗体滴度。这些结果表明针对相对小肽抗原的T-细胞反应可通过与L243偶联来成功地引起。
[0202] 表7.免疫小鼠的干扰素γ产生
[0203]
[0204] 结论
[0205] 针对痘病毒的疫苗需要Th1和Th2免疫反应、细胞介导和体液免疫，以及合适的记忆CD4T细胞池(Belyakoc等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：9458-9463，2003)。所提供的结果表明与APC-靶向抗体偶联的亚单位抗原可增强和诱导Th1、Th2，和体液免疫反应。
[0206] 实施例3.亚单位疫苗的鼻腔施用
[0207] 将小鼠(HLA-DR04Tg)麻醉并且鼻内(i.n)施用疫苗(总共15-25μg肽)(10微升/鼻孔)。疫苗为游离肽，或肽-L243偶联物，在这些实验中，佐剂是由He等(Clin Diagnos Lab Immunol 9：1021-1024，2002)描述的磷酸钙佐剂(10μg/剂量抗原)。对照由未免疫(原初)小鼠、经完整病毒蛋白(i.n.)免疫的小鼠、全身免疫小鼠(肽，皮下(s.c))，和只经载体/佐剂(i.n)免疫的小鼠组成。在每种情况下施用等量的肽。在预激之后2周(d14)和4周(d28)，使用与预激时相同的途径将小鼠加强免疫两次。可使用免疫途径的组合(例如，预激时s.c，接着第14天i.n.免疫)。
[0208] 预激免疫之后第35天，将每个治疗组中的五只小鼠处死(25/75小鼠)。在预激免疫之前(d0)、第7天、第28天，和第56天，收获血清。另外，在处死时收获鼻腔灌洗(NL)液或支气管肺泡灌洗(BAL)液和脾细胞。
[0209] 呼吸道液体(在处死时通过NL或BAL收集)，和血清中的抗原特异性抗体通过连续稀释来滴定并且连同来自所有治疗组(包括原初小鼠)的固定完整重组抗原(或牛痘蛋白)、肽、非相关肽对照和连续稀释血清施用于ELISA。测定特异性抗体的同型。
[0210] 中和抗体存在于通过鼻腔或皮下施用来免疫的小鼠中。抗体与抗原肽和整个病毒蛋白反应。鼻腔施用可更有效地促进粘膜免疫反应，而皮下施用可更有效地促进对痘病毒的全身免疫反应。
[0211] 实施例4.通过对接-和-锁定(DNL)技术来制备免疫偶联物的替代方法[0212] DDD和AD融合蛋白
[0213] DNL技术可用于制造包含几乎任何抗体或其片段或其它蛋白质或肽部分的二聚体、三聚体、四聚体、六聚体等。对于一些优选实施方案，可产生呈含有二聚化和对接域(DDD)或锚定域(AD)序列的融合蛋白形式的IgG抗体、F(ab′)2抗体片段和亚单位抗原肽。虽然在优选实施方案中，产生呈融合蛋白形式的DDD和AD部分，本领域技术人员将认识到可利用在所主张方法和组合物范围内的其它偶联方法，如化学交联。
[0214] DNL构建体可通过将例如抗-HLA-DR或抗-CD74抗体的Fab-DDD融合蛋白与vIL18BP105-AD融合蛋白组合来形成。或者，可产生将IgG-AD融合蛋白与vIL18BP105-DDD融合蛋白组合的构建体。该技术是没有限制性的并且可产生呈AD或DDD融合蛋白形式的任何有用蛋白质或肽以便并入DNL构建体中。当利用化学交联时，AD和DDD偶联物不限于蛋白质或肽并且可包含可使用本领域已知的任何交联技术与AD或DDD序列交联的任何分子。
[0215] 可为每一种DDD或AD融合蛋白开发独立的转基因细胞系。一旦产生，模块可纯化(如果需要)，或维持于细胞培养上清液中。产生之后，任何DDD融合蛋白模块可与任何AD融合蛋白模块组合以产生DNL构建体。对于不同类型的构建体，可利用不同的AD或DDD序列。下面提供示例性DDD和AD序列。
[0216] DDD1：
[0217] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：24)[0218] DDD2：
[0219] CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：25)[0220] AD1：QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：26)
[0221] AD2：CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：27)
[0222] 表达载体
[0223] 质粒载体pdHL2已用于产生许多抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等，J Immunol Methods(1989)，125：191-202；Losman等，Cancer(Phila)(1997)，80：2660-6。双顺反子哺乳动物表达载体引导IgG的重链和轻链的合成。对于许多不同IgG-pdHL2构建体，载体序列大多是相同的，唯一的区别在于可变域(VH和VL)序列。使用本领域技术人员已知的分子生物学工具，这些IgG表达载体可转化为Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为了产生Fab-DDD表达载体，将铰链、重链的CH2和CH3域的编码序列替换为编码铰链的前4个残基、14残基Gly-Ser连接物和人RIIα(被称为DDD1)的前44个残基的序列。为了产生Fab-AD表达载体，将IgG的铰链、CH2和CH3域的序列替换为编码铰链的前4个残基、15残基Gly-Ser连接物和称为AKAP-IS的17残基合成AD(被称为AD1)的序列，其使用生物信息学和肽阵列技术产生并且表明以很高的亲和力(0.4nM)结合RIIα二聚体。参见Alto，等Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A(2003)，100：4445-50。
[0224] 两种穿梭载体经设计以促进将IgG-pdHL2载体转化为Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体。使用此技术，我们已产生用于多种已知抗体，如hLL1、hLL2、hPAM4、hR1、hRS7、hMN-14、hMN-15、hA19、hA20和许多其它抗体的Fab表达的AD和/或DDD融合蛋白和编码质粒。
[0225] 通过使包含例如IgG抗体或F(ab)抗体片段的DDD融合蛋白与包含例如亚单位抗原肽的AD融合蛋白以1.4∶1与2∶1之间摩尔比反应来获得三聚体DNL构建体。在含有1mM EDTA的PBS中，总蛋白浓度为1.5mg/ml。后续步骤可涉及TCEP还原、HIC色谱法、DMSO氧化，和亲和色谱以获得纯化DNL构建体。添加5mM TCEP快速地导致形成a2b复合物。结合试验表明，抗体部分和抗原肽部分分别保留其抗原结合和抗原性的功能性质。
[0226] 使用这种技术，可通过制备各自包含互补DDD和AD部分的适宜融合蛋白来将几乎任何抗体或抗体片段连接到任何亚单位抗原肽。
[0227] 将以下肽制成并有用于连接亚单位疫苗肽的连接序列的AD2模块。将AD2肽融合体与连接DDD2的IgG或Fab部分组合以提供并有APC靶向抗体或抗体片段的基于亚单位的疫苗。
[0228] ND8L
[0229] SIFLQVLDHKNVYFQGGGSCGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：34)
[0230] CD8L
[0231] CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGCGGGSSIFLQVLDHKNVYFQ(SEQ ID NO：35)
[0232] NIL18BP
[0233] HYRFTCVLTTLNGVSGGGSCGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：36)
[0234] CIL18BP
[0235] CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGCGGGSHYRFTCVLTTLNGVS(SEQ ID NO：37)
[0236] CSCRD8L
[0237] CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGCGGGSYHQFVIDQLKLSVNF(SEQ ID NO：38)
[0238] CSCRIL18BP105
[0239] CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGCGGGSGNCTFVTYLRHLSTV(SEQ ID NO：39)
[0240] 实施例5.用于鼻腔施用基于亚单位的疫苗的脂质体制剂
[0241] 通过标准技术来制备抗原肽与L243抗体偶联的脂质体制剂。鼻内肽经设计在C-末端和N-末端具有连接物。C-末端连接物用于偶联L243抗体。N-末端连接物用于经由棕榈酰化来促进与脂质体连接。肽偶联物如下所示。CD8L118肽不是脂蛋白并且包囊于脂质体中。
[0242] L1R183
[0243] GVQFYMIVIGVIILAALF(SEQ ID NO：40)
[0244] 偶联的L1R183
[0245] KKKKGVQFYMIVIGVIILAALFPSEC(SEQ ID NO：41)
[0246] 偶联的A27L3
[0247] KSGTLFPGDDDLAIPATEFFSTKAAKKPSEC(SEQ ID NO：42)
[0248] 偶联的IL18BP105
[0249] KSHYRFTCVLTTLNGVSPESC(SEQ ID NO：43)
[0250] CD8L118
[0251] HDDGLIIISIFLQVLDHKNVYFQKIGGGSC(SEQ ID NO：44)
[0252] 图9(A)显示鼻腔施用脂质体配制的亚单位疫苗的结果。如以上实施例1和2所描述来制备肽并与抗体偶联。图9中提供的结果显示在对小鼠鼻腔免疫之后响应于在体外与指定肽一起孵育的T细胞增殖。对于来源于L1R抗原的L1R183抗原肽(SEQ ID NO：39)观察到对T细胞增殖的最强效应(图9A)，所述L1R抗原是提供暴露后预防的免疫显性细胞内成熟病毒粒子(IMV)蛋白。用脂质体展示的单独裸肽对小鼠进行免疫(图9B)对T细胞增殖产生极少影响，不管测试肽为何。用不存在脂质体情况下的游离肽或空脂质体免疫也对T细胞增殖几乎无影响(数据未图示)。结果表明使用与APC靶向抗体的偶联来鼻腔施用基于亚单位的痘病毒疫苗可有效诱导免疫反应。
[0253] ***
[0254] 鉴于本公开，不用过多实验即可产生和使用本文所公开和主张的所有组合物和方法。虽然已根据优选实施方案描述这些组合物和方法，但是本领域技术人员显而易知组合物和方法和本文所述方法的步骤或步骤顺序可采用变化形式，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地说，某些化学和生理相关的药剂可取代本文所述的药剂，同时将获得相同或相似结果。本领域技术人员显而易知的所有此类相似取代和修改均被视为在如附加权利要求书所定义的本发明精神、范围和概念内。
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