一种25羟维生素D3定量免疫层析检测试剂卡
阅读：83发布：2023-02-27
专利汇可以提供一种25羟维生素D3定量免疫层析检测试剂卡专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本实用新型公开了一种25羟-维生素D3定量 免疫层析 检测 试剂 卡，属于维生素免疫化学试验装置。本实用新型包括有稀释液孔、加样孔和观察窗的盒盖，盒体的卡架一端有端护栏，另一端有侧护栏，盒盖的插突起与盒体的插孔柱插接结合；以及沿卡架长度方向铺设的检测 试纸 条，检测试纸条的 基板 两端分别设置的样品垫和吸样垫，而在样品垫和吸样垫之间依次设置有含有胶体金标记的25羟-维生素D3 抗体 的胶体金垫，分别包被有25羟-维生素D3-偶联蛋白的T线和抗鼠IgG的C线的NC膜。使用时结合带有25羟-维生素D3内置标准曲线的免疫层析结果判读记录仪进行测定。适合对血清、 血浆 、 全血 样本中25羟-维生素D3浓度进行定量判定，检测简便、快速，适合现场检测，经济实用。，下面是一种25羟维生素D3定量免疫层析检测试剂卡专利的具体信息内容。
1.一种25羟-维生素D3定量免疫层析检测试剂卡，包括依次形成有稀释液孔（1）、加样孔（2）和观察窗（3）的盒盖（4），盒体（5）内底部形成的检测试纸条架（6）一端形成有端护栏（7），另一端形成有侧护栏（8），盒盖（4）底面形成的插突起（9）与盒体（5）的插孔柱（10）插接结合；以及沿卡架（6）长度方向平铺的检测试纸条（11），检测试纸条（11）的塑料基板（12）两端分别设置的样品垫（13）和吸样垫（14），其特征在于：样品垫（13）和吸样垫（14）之间依次设置有胶体金标记的25羟-维生素D3抗体的胶体金垫（15），分别包被有25羟-维生素D3-偶联蛋白的T线（16）和抗鼠IgG的C线（17）的NC膜（18）。
2.根据权利要求1所述25羟-维生素D3定量免疫层析检测试剂卡，其特征在于：检测试纸条（11）长度为7～9.5cm，宽3～5mm；塑料基板（12）上的样品垫（13）长2.5～3.5cm；
胶体金垫（15）长为0.6～1cm；NC膜（18）的长2～2.5cm，吸样垫（14）长2～2.5cm，样品垫（13）、胶体金垫（15）、NC膜（18）和吸样垫（14）间的接口相互叠压1～2mm。
一种25羟维生素D3定量免疫层析检测试剂卡
技术领域
[0001] 本实用新型涉及维生素免疫化学试验装置，具体是一种25羟-维生素D3定量免疫层析检测试剂卡。
背景技术
[0002] 维生素D是环戊烷多氢菲类化合物，可由维生素D原经紫外线270～300nm激活形成。动物皮下7-脱氢胆固醇，酵母细胞中的麦角固醇都是维生素D原，经紫外线激活分别转化为维生素D3及维生素D2。维生素D的最大吸收峰为265nm，从食物中得来的维生素D，与脂肪一起吸收，吸收部位主要在空肠与回肠。胆汁帮助其吸收。脂肪吸收受干扰时，如慢性胰腺炎、脂肪痢及胆道阻塞都会影响吸收。吸收的维生素D与乳糜微粒相结合，由淋巴系统运输。当维生素D运到肝脏中，在微粒体中经单氧酶系统作用，将其25位羟基化形成25（OH）维生素D3，肝外的其他组织也可吸取维生素D及25（OH）D3，因此组织中维生素D及25（OH）d3及其总量比维生素D血浆中多，如果靶组织需要，可将其释放出来，他们在脂肪组织中最多，释放速度最慢，当体重减轻，脂肪减少时，他们也可释放出来。25羟-维生素D3在肾线粒体单氧酶作用下（酶系统包括细胞色素p450、铁硫蛋白及黄素蛋白），经羧基化，转变为1，25（OH）-D3，这是维生素D的生物作用形式，现将其作为激素看待，其作用方式与其他固醇类激素相似。
[0003] 维生素D缺乏会导致少儿佝偻病和成年人的软骨病。症状包括骨头和关节疼痛，肌肉萎缩，失眠，紧张以及痢疾腹泻。维生素D主要用于组成和维持骨骼的强壮。它被用来防治儿童的佝偻病和成人的软骨症，关节痛等等。患有骨质疏松症的人通过添加合适的维生素D和镁可以有效的提高钙离子的吸收度。除此以外，维生素D还被用于降低结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的机率，对免疫系统也有增强作用。
[0004] 测定血液中25羟-维生素D3能反应机体的维生素D状况，以为利于后续的干预治疗。由于维生素D是小分子物质，采用免疫学方法检测最佳的方法为竞争抑制法。目前，市场上虽有采用化学发光等方法检测25羟-维生素D3的试剂卡出现，然而运用胶体金免疫层析技术定量检测25羟-维生素D3的试剂尚为空白。实用新型内容
[0005] 本实用新型是为了解决应用免疫层析胶体金检测人血液中25羟-维生素D3的技术问题，而提供一种25羟-维生素D3定量免疫层析检测试剂卡。
[0006] 本实用新型是按照以下技术方案实现的。
[0007] 一种25羟-维生素D3定量免疫层析检测试剂卡，包括依次形成有稀释液孔、加样孔和观察窗的盒盖，盒体内底部形成的卡架一端形成有端护栏，另一端形成有侧护栏，盒盖底面形成的插突起与盒体的插孔柱插接结合；以及沿卡架长度方向平铺的检测试纸条，检测试纸条的塑料基板两端分别设置的样品垫和吸样垫，而在样品垫和吸样垫之间依次设置有胶体金标记的25羟-维生素D3抗体的胶体金垫，分别包被有25羟-维生素D3-偶联蛋白的T线和抗鼠IgG的C线的NC膜。
[0008] 这样设计的本实用新型，测试后，结合带有25羟-维生素D3内置标准曲线的免疫层析结果判读记录仪，实现25羟-维生素D3快速定量检测，检测范围宽，适合血清、血浆、全血样本，并适合临床上单人份检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。附图说明
[0009] 图1是本实用新型盒盖顶面立体结构示意图；
[0010] 图2是本实用新型盒盖底面立体结构示意图；
[0011] 图3是本实用新型盒体的立体结构示意图；
[0012] 图4是本实用新型检测试纸条的立体结构示意图。
[0013] 图中：1.稀释液孔 2.加样孔
[0014] 3.观察窗 4.盒盖
[0015] 5.盒体 6. 检测试纸条架
[0016] 7.端护栏 8.侧护栏
[0017] 9.插突起 10.插孔柱
[0018] 11.检测试纸条 12.基板
[0019] 13.样本垫 14.吸样垫
[0020] 15.胶体金垫 16.T线
[0021] 17.C线 18.NC膜
[0022] 19.十字架。
具体实施方式
[0023] 下面结合附图及实施例对本实用新型进行详细的说明。
[0024] 一种25羟-维生素D3定量免疫层析检测试剂卡，包括依次形成有稀释液孔1、加样孔2和观察窗3的长方形盒盖4，长方形盒体5内底部形成的检测试纸条架6一端形成有“[”形端护栏7，另一端形成有相向的板状侧护栏8，盒盖4底面形成的插突起9与盒体5的插孔柱10，插接结合；以及沿检测试纸条架6长度方向平铺的检测试纸条11，检测试纸条11的基板12两端分别设置的样品垫13和吸样垫14，而在样品垫13和吸样垫14之间依次设置有胶体金标记的25羟-维生素D3抗体的胶体金垫15，分别包被有25羟-维生素D3-偶联蛋白的T线16和抗鼠IgG的C线17的NC膜18。检测试纸条架6是与盒体5内底面延长度中心线一体形成的棱条，并分段形成十字架19形状，避免平放其上的检测试纸条11倾倒。
[0025] 盒盖4底面形成的插突起9与盒体5的插孔柱10分别以对应的位置和数量形成。
[0026] 所述25羟-维生素D3定量免疫层析检测试剂卡，其检测试纸条11长度为7～9.5cm，宽3～5mm；塑料基板12上的样品垫13长2.5～3.5cm；胶体金垫15长为0.6～
1cm；NC膜18的长2～2.5cm，吸样垫14长2～2.5cm，样品垫13、胶体金垫15、NC膜18和吸样垫14间的接口相互叠压1～2mm。
1cm；NC膜18的长2～2.5cm，吸样垫14长2～2.5cm，样品垫13、胶体金垫15、NC膜18和吸样垫14间的接口相互叠压1～2mm。
[0027] 因此，试剂卡的盒盖4顶面形成对应T线16和C线17位置的观察窗3，对应样品垫13位置形成有长圆形稀释液孔1和圆形加样孔2。
[0028] 下面简述本实用新型的制备方法，在所述样品垫13和吸样垫14之间依次设置有含有胶体金标记25羟-维生素D3抗体的胶体金垫15，分别包被有25羟-维生素D3-偶联蛋白的T线16和抗鼠IgG的C线17的NC膜18，其中：
[0029] a.含有胶体金标记的25羟-维生素D3抗体的胶体金垫15的制备过程为：金颗粒为直径30～50nm的胶体金溶液10ml，于烧杯内用0.2M K2CO3调至pH7.5～8.5，加入25～50μg25羟-维生素D3抗体，室温搅拌30min，加入终浓度为0.5%牛血清白蛋白，5% PEG 20000 封闭20min，12000g离心20分钟，弃上清，用胶体金溶液复溶至80ml，按1ml溶
2
液铺20cm 的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间干燥3～5小时，制成胶体金垫15；
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液铺20cm 的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间干燥3～5小时，制成胶体金垫15；
[0030] b.所述NC膜抗体的包被过程为：以0.01M pH 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）将25羟-维生素D3-偶联蛋白配制成0.8～1.6mg/ml的溶液，在NC膜18上用喷膜仪以1～1.5μl/cm的参数包被C线17；另将抗鼠IgG配制成1～3mg/ml的溶液，用喷膜仪以上述相同参数包被T线16，划线后将NC膜18干燥3～5小时，制成包被25羟-维生素D3-偶联蛋白的T线16和包被抗鼠IgG的C线17的NC膜18；
[0031] c.在相对湿度小于30%的条件下，取基板12，将已包被的NC膜18粘贴在塑料基板12的中部，在NC膜18的T线16一侧粘贴胶体金垫15，在胶体金垫15另一侧粘贴样品垫13；在NC膜18的C线一侧粘贴吸样垫14；邻接接口相互叠压1～2mm，将粘贴好的大板切成3～5mm宽的检测试纸条11备用。
[0032] 1.主要材料
[0033] 1.1 25羟-维生素D3抗体、25羟-维生素D3-偶联蛋白，标准品：芬兰MEDIX有限公司产品；
[0034] 羊抗鼠IgG抗体：用小鼠IgG免疫山羊自制；氯金酸：Sigma公司产品；
[0037] 1.2 临床样本 由天津朗赛生物科技有限公司在相关医院获得，共150份，其中血清、血浆和全血样本各50份，25羟-维生素D3含量分布区间为4～100μg/L之间的定值样本。
[0038] 1.3免疫层析结果结判读记录仪：型号：NS5001，天津中新科炬生物制药有限公司产品。
[0039] 2.方法
[0040] 2.1 25羟-维生素D3抗体胶体金标记， 氯金酸－柠檬酸三钠还原法制备金颗粒直径为30～50nm的胶体金溶液，取三份胶体金溶液，分别用0.2M K2CO3将溶液调到pH7.0、pH7.5和pH8.0。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每10ml溶液分别加入25ug、50ug、75ug将标记用25羟-维生素D3抗体缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌30min，再加入到终浓度为0.5%的BSA和PEG 20000进行封闭20min，标记结束后以12000g离心，弃上清，沉淀按80%原体积复溶至3种不同配方的胶体金工作液中任意一种，配方1：
100mM TRIS.Cl，pH7.6，含1%BSA、5%蔗糖，1% Triton X100；或配方2：20mM TRIS.Cl，pH7.0，含0.5%BSA、5%蔗糖，0.5% Triton X100；或配方3：20mM TRIS.Cl，pH6.5，含0.2%BSA、5%蔗
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糖，0.2% Triton X100。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm 的比例加样于无纺布上，在温度20～25℃，相对湿度在＜30%的干燥间干燥3～5小时，制成胶体金垫15。
100mM TRIS.Cl，pH7.6，含1%BSA、5%蔗糖，1% Triton X100；或配方2：20mM TRIS.Cl，pH7.0，含0.5%BSA、5%蔗糖，0.5% Triton X100；或配方3：20mM TRIS.Cl，pH6.5，含0.2%BSA、5%蔗
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糖，0.2% Triton X100。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm 的比例加样于无纺布上，在温度20～25℃，相对湿度在＜30%的干燥间干燥3～5小时，制成胶体金垫15。
[0041] 2.2 NC膜18的长度2～2.5cm，包被时用0.01M pH7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）将包被25羟-维生素D3-偶联蛋白稀释成0.8mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜18上按1.4ul/cm进行分别划线包被，包被完成后将NC膜18在温度20～25℃，相对湿度在＜30%的干燥间干燥3～5小时。
[0042] 2.3 试剂卡组装 在相对湿度小于30%的条件下，将已包被的NC膜18粘贴在塑料基板12的中部，在NC膜18的T线16一侧粘贴胶体金垫15，在胶体金垫15另一侧粘贴样品垫13；在NC膜18的C线17一侧粘贴吸样垫14；各粘贴部分接口相互叠压1～2mm，粘贴好的大板切成3～5mm宽的检测试纸条11。使用时，将检测试纸条11平放在盒体5内的卡架6上，一端由端护栏7限位，另一端有侧护栏8限位。然后盖上盒盖4，盒盖4底面的插突起9与盒体5内的插孔柱10插接结合，压紧，内设检测试纸条11的盒体5与盒盖4结为一体，完成装配。
[0043] 2.4检测试纸条工艺参数调试 将不同浓度标记、包被的组合进行配对，制备小样，利用25羟-维生素D3标准品对上述组合进行测试，寻找最佳组合。本发明中的样品垫13、胶体金垫15、NC膜18和吸样垫14从塑料基板12一端依次排列至另一端。
[0044] 检测试纸条11长度为7～9.5cm，样品垫13长度2.5～3.5cm；胶体金垫15长度为0.6～1cm；NC膜18为孔径8～12微米的多孔样结构膜，长度2～2.5cm，吸样垫14为吸水滤纸，长度为2～2.5cm；宽度均为3～5mm，吸样垫13为玻璃纤维膜或无纺布。
[0045] 2.5仪器曲线参数设置 确定好检测试纸条工艺参数后，分别用0、10、20、40、75、100ng/ml的25羟-维生素D3标准品对卡进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，将相应强度的色带数字化后，计算出标准曲线，输入免疫层析结果判读记录仪中，完成仪器曲线参数设置，用于对检测结果的定量判定，检测范围为10～100ng/ml。
[0046] 2.6 检测方法
[0047] 1）仪器设置，将25羟-维生素D3内置标准曲线导入到免疫层析结果判读记录仪内，设置好相关参数；
[0048] 2）将本试验制备的检测试剂卡及样本平衡至室温，将检测试剂卡平放；
[0049] 3）精确吸取20ul血清或血浆样本，样本为全血时吸取30ul样本，加入到对应试剂卡的加样孔2；
[0050] 4）再吸取100ul稀释液加入到试剂卡盖4的稀释液孔1中，计时，15～20分钟内用免疫层析结果判读记录仪定量判定结果。
[0051] 2.7 临床样本检测 试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。
[0052] 3 结果
[0053] 3.1卡参数确定，根据小样的检测结果，确定了卡的最佳标记pH值为7.5；25羟-维生素D3抗体最佳标记量为25ug/10ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为配方2：20mM TRIS.Cl，pH7.0，含0.5%BSA、5%蔗糖，0.5% Triton X100；最佳包被25羟-维生素D3-偶联蛋白浓度为1mg/mL。但以上参数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。
[0054] 3.2临床样本检测，对150份临床定值样本检测，20份低于10ng/ml的样本检测结果均报告低于10ng/ml，130份在线性范围内的样品检测值和样本原值的差异CV小于20%，2
大于25%的离群值只有5份，比例为4%。R>0.95。检测结果表明制备的检测试剂卡性能良好，适合用于临床检测，特别是满足了客户对快速现场检测的需要。
大于25%的离群值只有5份，比例为4%。R>0.95。检测结果表明制备的检测试剂卡性能良好，适合用于临床检测，特别是满足了客户对快速现场检测的需要。
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