由血浆环状RNA组成的肝癌诊断标志物及诊断试剂盒
阅读：1028发布：2020-08-17
专利汇可以提供由血浆环状RNA组成的肝癌诊断标志物及诊断试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 医学诊断技术领域，具体是一种由 血浆 环状RNA组成的 肝细胞 肝癌诊断标志物组合，以及含有该组合的 试剂 盒 。所述肝癌诊断标记物包括如下环状RNAs：hsa_circ_0000976、hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897。本发明可用于区分肝癌患者与健康人、慢性乙型 肝炎 患者或乙肝肝硬化患者。，下面是由血浆环状RNA组成的肝癌诊断标志物及诊断试剂盒专利的具体信息内容。
1.hsa_circ_0000976、hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897在制备肝癌诊断试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的hsa_circ_0000976、hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897在制备肝癌诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒通过检测以下环状RNA分子在血浆中水平诊断肝癌：hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897。
3.根据权利要求1所述的hsa_circ_0000976、hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897在制备肝癌诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂为检测以下环状RNA分子在血浆中水平的试剂的组合：hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_
0139897。
4.根据权利要求1所述的hsa_circ_0000976、hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897在制备肝癌诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂为实时荧光定量PCR相关试剂。
5.一种诊断肝癌的hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897联合检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒通过检测以下环状RNA分子在血浆中水平诊断肝癌：
hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897。
6.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含用于检测以下环状RNA分子在血浆中水平的试剂：hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_
0139897。
7.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括血浆RNA提取系统和反转录系统。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括3对可用于检测以下环状RNA水平的LNA修饰引物：hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测hsa_circ_0000976的引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，所述的检测hsa_circ_0007750的引物序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，所述的检测hsa_circ_0139897的引物序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。
10.一种利用如权利要求5-9任一所述的诊断肝癌的hsa_circ_0000976，hsa_circ_
0007750和hsa_circ_0139897联合检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
A)实时荧光定量PCR检测血浆中hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_
0139897的浓度含量；
B)将血浆中hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897的浓度含量统计换算之后放入得出的公式计算，计算出待测者罹患肝癌的可能性；
所述的公式为：
P＝1/[1+EXP(3.502-1.920*hsa_circ_0000976-2.800*hsa_circ_0007750-3.154*hsa_circ_0139897)]
在此公式中，当环状RNA的表达量大于或等于最佳截断值时，相应的环状RNA符号代表
1；当环状RNA的表达量小于最佳截断值时，相应的环状RNA符号代表0；血浆中hsa_circ_
0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897用于区别肝癌和非肝癌的最佳截断点分别为1067,4324以及1108copies/ml plasma；
当P大于0.5时，诊断为肝癌；当P小于或等于0.5时，诊断为非肝癌。
由血浆环状RNA组成的肝癌诊断标志物及诊断试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医学诊断技术领域，具体地说，是一个由血浆环状RNA组成的肝癌诊断组合，所述的血浆环状RNA包括hsa_circ_0000976、hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897，以及其用于原发性肝细胞肝癌预警以及早期诊断试剂盒的应用。
背景技术
[0002] 早期肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称为肝癌)往往没有明显症状或仅表现为乏力、纳差、腹胀等非典型症状，当出现肝区疼痛、肝肿大等明显症状时，常常意味着已经到达中晚期，发生了肝内外转移，失去了根治性手术的机会。因此，对于慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝病以及非酒精性脂肪性肝病等肝癌高危患者，需定期(一般为3至6个月)监测肝癌的发生。目前常用的肝癌诊断方法有B超，CT(computed tomography)和磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)等影像学检查以及甲胎蛋白(a-fetoprotein,AFP)，异常凝血酶原(又称PIVKA-II，protein induced by vitamin K absence or antagonists-II,维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白)等实验室检查。但影像学检查对于小肝癌的诊断仍不够准确。而甲胎蛋白和异常凝血酶原对肝癌诊断的敏感性和特异性也不够理想。既往文献表明，甲胎蛋白对肝癌诊断的敏感性为39-64％，特异性为76-91％，异常凝血酶原对肝癌诊断的敏感性为41-77％，特异性为72-98％。因此，有必要寻找新的肝癌诊断标志物。
[0003] 环状RNA(Circular RNAs，简称为circRNAs)是一种闭合环状的单链RNA，既往被认为是一种罕见的RNA，并且仅仅是RNA剪切过程中产生的“废物”，没有任何功能。近年来，高通量测序发现包括人类在内的真核生物细胞中存在大量的环状RNA。重要的是，已有多篇文献报道环状RNA可以作为肿瘤诊断标志物。Li Yan等(LI Y,ZHENG Q,BAO C,et al.Circular RNA is enriched and stable in exosomes:a promising biomarker for cancer diagnosis[J].Cell research,2015,25(8):981-4)在健康人血清外泌体中检测出了1215个环状RNA，这些RNA丰度较高，并且将血清在常温放置24小时后，环状RNA几乎没有发生降解。结肠癌患者血清外泌体中circ-KLDHC10的表达水平高于健康对照。这些结果表明环状RNA可作为肿瘤诊断标志物。Yang Fan等(YANG F,LIU D Y,GUO J T,et al.Circular RNA circ-LDLRAD3as a biomarker in diagnosis of pancreatic cancer[J].World journal of gastroenterology:WJG,2017,23(47):8345-54)发现环状RNA circ-LDLRAD3在胰腺癌组织中的表达量高于癌旁(P<0.01)，在胰腺癌患者外周血血浆中的表达量高于正常人(P<0.01)，其对胰腺癌诊断的ROC曲线(receiver operating characteristic curve，受试者工作特征曲线，简称ROC曲线)的AUC(Area Under Curve，曲线下面积)为0.67，敏感性为57.38％，特异性为70.49％；联合CA19-9后AUC为0.87，敏感性为70.49％，特异性为93.55％。Sun Handong等(SUN H,TANG W,RONG D,et al.Hsa_circ_0000520,a potential new circular RNA biomarker,is involved in gastric carcinoma[J].Cancer biomarkers:section A of Disease markers,2018,21(2):299-
306)发现环状RNA hsa_circ_0000520在胃癌患者血浆中的表达量低于正常人。Yin Wei-Bing等(YIN W B,YAN M G,FANG X,et al.Circulating circular RNA hsa_circ_
0001785acts as a diagnostic biomarker for breast cancer detection[J].Clinica chimica acta；international journal of clinical chemistry,2017,12(3):25-30)发现环状RNA hsa_circ_0001785在乳腺癌患者血浆中的表达量高于正常人，其诊断乳腺癌的AUC为0.784，而在同一队列中，CEA诊断乳腺癌的AUC为0.562，CA15-3诊断乳腺癌的AUC为
0.629，其在乳腺癌手术前(0.283±0.043)血浆中的表达量高于手术后(0.109±0.037，P<
0.01)。Zhao Q等(ZHAO Q,CHEN S,LI T,et al.Clinical values of circular RNA
0000181in the screening of gastric cancer[J].Journal of clinical laboratory analysis,2017,10(9):87-92)发现hsa_circ_0000181在胃癌患者外周血血浆中的表达量低于正常人(P<0.001)，其低表达与分化(P＝0.038)及癌胚抗原(P＝0.037)有关，其AUC为
0.756，其敏感性为99.0％，特异性为85.2％。
306)发现环状RNA hsa_circ_0000520在胃癌患者血浆中的表达量低于正常人。Yin Wei-Bing等(YIN W B,YAN M G,FANG X,et al.Circulating circular RNA hsa_circ_
0001785acts as a diagnostic biomarker for breast cancer detection[J].Clinica chimica acta；international journal of clinical chemistry,2017,12(3):25-30)发现环状RNA hsa_circ_0001785在乳腺癌患者血浆中的表达量高于正常人，其诊断乳腺癌的AUC为0.784，而在同一队列中，CEA诊断乳腺癌的AUC为0.562，CA15-3诊断乳腺癌的AUC为
0.629，其在乳腺癌手术前(0.283±0.043)血浆中的表达量高于手术后(0.109±0.037，P<
0.01)。Zhao Q等(ZHAO Q,CHEN S,LI T,et al.Clinical values of circular RNA
0000181in the screening of gastric cancer[J].Journal of clinical laboratory analysis,2017,10(9):87-92)发现hsa_circ_0000181在胃癌患者外周血血浆中的表达量低于正常人(P<0.001)，其低表达与分化(P＝0.038)及癌胚抗原(P＝0.037)有关，其AUC为
0.756，其敏感性为99.0％，特异性为85.2％。
[0004] 但是关于由血浆环状RNA组成的肝癌诊断标志物及诊断试剂盒目前还未见报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种由血浆环状RNA组成的肝癌诊断标志物及诊断试剂盒。
[0006] 本发明的第一方面，提供一种肝癌诊断标志物，其由以下环状RNA的核酸分子组成：hsa_circ_0000976、hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897。
[0007] 进一步的，所述的环状RNA在肝癌患者血浆中的水平高于健康人、慢性乙型肝炎患者或乙肝肝硬化患者。
[0008] 进一步的，所述的肝癌为原发性肝细胞肝癌。
[0009] 本发明的第二方面，提供hsa_circ_0000976、hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897在制备肝癌诊断试剂或试剂盒中的应用。
[0010] 进一步的，所述的诊断试剂或试剂盒通过检测以下环状RNA分子在血浆中水平诊断肝癌：hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897。
[0011] 进一步的，所述的诊断试剂为检测以下环状RNA分子在血浆中水平的试剂的组合：hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897。
[0012] 进一步的，所述的诊断试剂为实时荧光定量PCR相关试剂。
[0013] 进一步的，所述的诊断试剂盒包含检测以下环状RNA分子在血浆中水平的试剂：hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897。
[0014] 本发明的第三方面，提供一种诊断肝癌的hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897联合检测试剂盒，所述的试剂盒通过检测以下环状RNA分子在血浆中水平诊断肝癌：hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897。
[0015] 所述的诊断试剂盒应用于肝癌预警。优选地，所述的肝癌预警的群体为慢性肝炎、肝硬化患者等肝癌高危人群。
[0016] 进一步的，所述的试剂盒包含用于检测以下环状RNA分子在血浆中水平的试剂：hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897。
[0017] 进一步的，所述的试剂盒还包括血浆RNA提取系统和反转录系统。
[0018] 进一步的，所述试剂盒包括3对可用于检测以下环状RNA水平的LNA修饰引物：hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897。
[0019] 在本发明的一个优选的实施方案中，所述的检测hsa_circ_0000976的引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，所述的检测hsa_circ_0007750的引物序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，所述的检测hsa_circ_0139897的引物序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。
[0020] 本发明的第四方面，提供一种利用上述诊断肝癌的hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897联合检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
[0021] A)实时荧光定量PCR检测血浆中hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897的浓度含量；
[0022] B)将血浆中hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897的浓度含量统计换算之后放入公式计算，计算出待测者罹患肝癌的可能性；
[0023] 所述的公式为：
[0024] Logit(P＝HCC)＝
[0025] -3.502+1.920*hsa_circ_0000976+2.800*hsa_circ_0007750+3.154*hsa_circ_0139897，即
[0026] P＝1/[1+EXP(3.502-1.920*hsa_circ_0000976-2.800*hsa_circ_0007750-3.154*hsa_circ_0139897)]
[0027] 在此公式中，当环状RNA的表达量大于或等于最佳截断(cut off)值时，相应的环状RNA符号代表1；当环状RNA的表达量小于最佳截断值时，相应的环状RNA符号代表0；血浆中hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897用于区别肝癌和非肝癌的最佳截断点分别为1067,4324以及1108copies/ml plasma；
[0028] 当P大于0.5时，诊断为肝癌；当P小于或等于0.5时，诊断为非肝癌。
[0029] 其中hsa_circ_0000976、hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897为相应血浆环状RNA检测水平离散化后的数值。
[0030] 本发明通过以下步骤得到了上述由3个血浆环状RNAs组成的肝癌诊断组合：
[0031] 1.通过环状RNA芯片筛选在肝癌患者血浆高于慢性乙型肝炎患者血的浆环状RNAs，并与在肝癌组织中检测到的环状RNAs取交集，得到10个候选分子；
[0032] 2.实时荧光定量PCR成功验证了其中的3个候选血浆环状RNAs；
[0033] 3.在由健康人、肝炎、肝硬化、肝癌患者组成的训练集中确立可区分肝癌与非癌对照(包括健康人、肝炎及肝硬化患者)的血浆环状RNA组合；
[0034] 4.在独立验证集验证步骤3确立的血浆环状RNA组合诊断肝癌的效果；
[0035] 5.分析步骤3确立的血浆环状RNA组合在小肝癌以及AFP阴性的肝癌患者中的诊断效果。
[0036] 对实验结果进行分析及相关统计显示：上述步骤1中，发明人通过高通量环状RNA芯片(发现集)筛选确定了10个候选环状RNAs，并在步骤2中验证了3个候选环状RNAs在肝癌患者血浆中的水平均升高。进一步检测了候选环状RNAs在训练集(样本量为313份)中的水平，并确立了区分肝癌与非癌对照的最优血浆环状RNA组合。进而在独立的验证集(样本量为306份)中验证了该血浆环状RNA组合可以区分肝癌与非癌对照。与此同时，发明人发现相较传统的肝癌筛查手段，如AFP，血浆环状RNA组合在小肝癌以及AFP阴性的肝癌患者中具有更好的诊断效果。
[0037] 血浆中RNA分子的定量没有公认的内参。因此，我们采用绝对定量的方法对血浆中的环状RNA进行定量。我们将本研究中需要绝对定量的3个环状RNA分子(hsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897)的PCR产物克隆到pUC57质粒上，得到3种重组质粒(pUC57-hsa_circ_0000976,pUC57-hsa_circ_0007750和pUC57-hsa_circ_
0139897)。在对血浆中的环状RNA分子进行实时定量PCR时，加上相应的稀释不同倍数(5×
7 6 5 4 3
10copies/μl,5×10copies/μl,5×10copies/μl,5×10copies/μl,5×10 copies/μl,5×102copies/μl,5×101copies/μl以及5copies/μl)的重组质粒，得到8个不同拷贝数对应的Ct值。接着，我们用SPSS 23.0软件(SPSS,Inc.,Chicago,IL)进行线性回归分析，得到hsa_circ_0000976,hsa_circ_0003506,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897的标准曲线公式分别为Y＝-3.381*X+34.724，Y＝-3.377*X+35.305，Y＝-3.322*X+36.460和Y＝-
3.384*X+37.686。根据标准曲线公式以及实时定量PCR的Ct值，我们得到血浆环状RNA的绝对量。在训练集中，我们通过Cutoff Finder(http://molpath.charite.de/cutoff/)网站的ROC曲线(Euclidean distance)分析法确定了血浆中hsa_circ_0000976，hsa_circ_
0007750和hsa_circ_0139897用于区别肝癌和非肝癌的最佳截断(cut off)点分别为1067,
4324以及1108copies/ml plasma，大于或等于这些cut off值的记为1，诊断为肝癌，而小于这些cut off值的记为0，诊断为非肝癌。
0139897)。在对血浆中的环状RNA分子进行实时定量PCR时，加上相应的稀释不同倍数(5×
7 6 5 4 3
10copies/μl,5×10copies/μl,5×10copies/μl,5×10copies/μl,5×10 copies/μl,5×102copies/μl,5×101copies/μl以及5copies/μl)的重组质粒，得到8个不同拷贝数对应的Ct值。接着，我们用SPSS 23.0软件(SPSS,Inc.,Chicago,IL)进行线性回归分析，得到hsa_circ_0000976,hsa_circ_0003506,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897的标准曲线公式分别为Y＝-3.381*X+34.724，Y＝-3.377*X+35.305，Y＝-3.322*X+36.460和Y＝-
3.384*X+37.686。根据标准曲线公式以及实时定量PCR的Ct值，我们得到血浆环状RNA的绝对量。在训练集中，我们通过Cutoff Finder(http://molpath.charite.de/cutoff/)网站的ROC曲线(Euclidean distance)分析法确定了血浆中hsa_circ_0000976，hsa_circ_
0007750和hsa_circ_0139897用于区别肝癌和非肝癌的最佳截断(cut off)点分别为1067,
4324以及1108copies/ml plasma，大于或等于这些cut off值的记为1，诊断为肝癌，而小于这些cut off值的记为0，诊断为非肝癌。
[0038] 为了提高诊断效果，我们将这三个环状分子的组合(Panel of circRNAs,简称CircPanel)用于诊断肝癌。我们采用的逻辑回归(logistic regression)方法，得到CircPanel的计算公式为Logit(P＝HCC)＝-3.502+1.920*hsa_circ_0000976+2.800*hsa_circ_0007750+3.154*hsa_circ_0139897，即P＝1/[1+EXP(3.502-1.920*hsa_circ_0000976-2.800*hsa_circ_0007750-3.154*hsa_circ_0139897)]。在此公式中，当环状RNA的表达量大于或等于cut off值时，相应的环状RNA符号代表1；当环状RNA的表达量小于cut off值时，相应的环状RNA符号代表0。当P大于0.5时，诊断为肝癌；当P小于或等于0.5时，诊断为非肝癌。
[0039] 本发明的血浆环状RNA组合用于肝癌检测及早期诊断的优越性在于：
[0040] 1、标本易于获得，临床可操性强且创伤性小，而且血浆环状RNA稳定性好，检测便利；
[0041] 2、实验方法非常成熟，检测过程简便、易于重复，由普通的技术员均可以完成；
[0042] 3、本发明采用高通量筛选以及多中心验证，对血浆环状RNA组合的效果以及诊断试剂盒进行了全面评估，以上方法和策略的应用保证了本发明在肝癌临床诊断中的潜在应用价值，并为其他疾病生物标志物的研制提供可借鉴的方法策略；
[0044] 图1.本发明的总体设计。
[0045] 图2.绝对定量实验所用的标准曲线(A)hsa_circ_0000976的标准曲线.(B)hsa_circ_0003506的标准曲线.(C)hsa_circ_0007750的标准曲线.(D)hsa_circ_0139897的标准曲线.斜线由8对数据的线性回归分析产生。
[0046] 图3.芯片及PCR法检测肝癌及慢乙肝患者血浆中的环状RNA分子.(A)5例肝癌患者血浆与5例慢乙肝患者血浆差异环状RNA分子的聚类分析.(B)琼脂糖凝胶电泳显示单一条带.(C)Sanger测序测到反向剪切位点.(D)实时定量PCR显示单峰.(E)实时定量PCR表明在室温放置24小时后，4种候选环状RNA分子仍稳定存在。
[0047] 图4.4种候选环状RNA分子在肝组织中的验证.(A)琼脂糖凝胶电泳显示单一条带.(B)Sanger测序测到反向剪切位点.(C)实时定量PCR显示单峰.(D)实时定量PCR表明这四种候选分子不能被RNase R消化，beta-actin为阳性对照。
[0048] 图5.4种候选环状RNA分子在肝组织及血浆中的检测(训练集).(A)实时定量PCR检测了hsa_circ_0000976，hsa_circ_0003506,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897在40对肝癌及癌旁组织的表达量.β-actin为内参，检验方法为Wilcoxon符号秩检验.(B)实时定量PCR检测了hsa_circ_0000976,hsa_circ_0003506，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897在40对肝癌患者手术前血浆及手术后血浆的表达量.采用绝对定量，检验方法为Wilcoxon符号秩检验.(C)实时定量PCR检测了hsa_circ_0000976，hsa_circ_0003506，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897在158例肝癌患者，53例健康对照，52例慢乙肝患者以及
50例乙肝肝硬化患者血浆中的表达量.采用绝对定量，检验方法为Kruskal-Wallis H检验.(D)4种环状RNA分子在肝癌组织及血浆中表达量的相关性.检验方法为Spearman相关性分析。
50例乙肝肝硬化患者血浆中的表达量.采用绝对定量，检验方法为Kruskal-Wallis H检验.(D)4种环状RNA分子在肝癌组织及血浆中表达量的相关性.检验方法为Spearman相关性分析。
[0049] 图6.三个环状RNA分子及其组合对肝癌诊断效果的评价(训练集)。
[0050] 图7.CircPanel，AFP及其组合对肝癌诊断效果的评价(训练集)。
[0051] 图8.CircPanel对AFP阴性肝癌诊断效果的评价(训练集)。
[0052] 图9.三个环状RNA分子及其组合对肝癌诊断效果的评价(验证集)。
[0053] 图10.CircPanel，AFP及其组合对肝癌诊断效果的评价(验证集)。
[0054] 图11.CircPanel对AFP阴性肝癌诊断效果的评价(验证集)。
具体实施方式
[0055] 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0056] 实施例1
[0057] 一、材料和方法
[0058] (一)患者临床资料与肝组织、血浆收集
[0059] 在本发明中，经过海军军医大学附属东方肝胆外科医院以及长海医院伦理委员会审批以及每一位患者的书面同意，本发明从海军军医大学附属东方肝胆外科医院收集了163例肝癌(HCC)患者血浆，40例肝癌手术后(HCC after hepatectomy)血浆，53例健康人(healthy)血浆，57例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者血浆，50例肝硬化(liver cirrhosis)患者血浆以及40对肝癌及癌旁(adjacent noncancerous liver，ANL，距离肿瘤边缘2厘米以上)组织，其中5例肝癌患者及5例慢性乙型肝炎患者血浆收集于2016年7月至8月，用于发现集(discovery set)的环状RNA芯片，其他的收集于2016年10月至
2017年6月，用于训练集(training set)的实时定量PCR。我们于2016年9月至2017年7月从长海医院收集了152例肝癌患者血浆，50例健康人血浆，54例慢性乙型肝炎患者血浆以及50例肝硬化患者血浆，这些均用于验证集(validation set)的实时定量PCR。(图1)纳入标准见表1。临床资料见表2。
2017年6月，用于训练集(training set)的实时定量PCR。我们于2016年9月至2017年7月从长海医院收集了152例肝癌患者血浆，50例健康人血浆，54例慢性乙型肝炎患者血浆以及50例肝硬化患者血浆，这些均用于验证集(validation set)的实时定量PCR。(图1)纳入标准见表1。临床资料见表2。
[0060] 肝癌及癌旁组织来源于肝癌切除术，肝癌组织经病理诊断为肝细胞癌，所有患者在手术前都没有经过局部消融、介入、放射、化学药物或靶向药物等治疗。组织切下后立即置于负80度冰箱保存。发现集中的5例肝癌组织环状RNA测序可参考论文(Yu J,Xu QG,Wang ZG,Yang Y,Zhang L,Ma JZ,Sun SH,et al.Circular RNA cSMARCA5inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma.J Hepatol[J].2018,9(6):15-20)。(图1)[0061] 对符合纳入标准(表1)的患者，在其空腹时用EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)抗凝管抽取外周静脉血4ml。在1小时内完成以下操作：以1900g/min,4摄氏度离心10分钟；小心吸取血浆(避免吸到血细胞)到新的离心管(无RNA酶)中；以16000g/min,4摄氏度离心10分钟；小心吸取血浆(避免碰到管底的细胞碎片)到新的离心管(无RNA酶)中；置于负80度冰箱保存备用。
[0062] 表1.病例选择的纳入和排除标准
[0063]
[0064]
[0065] 注：CHB,chronic hepatitis B；HCC,hepatocellular carcinoma. 参照2010年美国肝病研究学会(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)的实践指南。
[0066] 表2.本发明参与者的临床资料
[0067]
[0068] 注：ALT,谷丙转氨酶；AFP,甲胎蛋白；BCLC,巴萨罗纳临床肝癌分期；IQR,四分位数间距。
[0069] (二)总RNA抽提
[0070] 本发明用TAKARA公司的RNAiso Plus(Code No.9109)抽提肝癌及癌旁组织中的总RNA。所用离心管，枪头等均无RNA酶。其大致步骤为：适量的组织或细胞，加入适量(一般为1ml)的RNAiso Plus后匀浆；室温静置5分钟后，以12000g/min,4摄氏度离心5分钟；上清液移至新的1.5ml EP管中，丢弃沉淀；加入0.2倍RNAiso Plus体积量(一般为0.2ml)的三氯甲烷，振荡混匀，室温静置5分钟；以12000g/min,4摄氏度离心15分钟，将上清液移至新的
1.5ml离心管中(避免吸到中间白色层)，加入等体积的异丙醇，室温静置10分钟；以12000g/min,4摄氏度离心10分钟(在管底可见白色沉淀)；弃液体，留沉淀，加入RNAiso Plus等体积量(一般为1ml)的75％乙醇，以7500g/min,4摄氏度离心5分钟；弃液体，留沉淀，干燥；加适量DEPC水溶解；测浓度，置于负80摄氏度冰箱备用。
1.5ml离心管中(避免吸到中间白色层)，加入等体积的异丙醇，室温静置10分钟；以12000g/min,4摄氏度离心10分钟(在管底可见白色沉淀)；弃液体，留沉淀，加入RNAiso Plus等体积量(一般为1ml)的75％乙醇，以7500g/min,4摄氏度离心5分钟；弃液体，留沉淀，干燥；加适量DEPC水溶解；测浓度，置于负80摄氏度冰箱备用。
[0071] 本发明用ThermoFisher公司的TRIzolTMLS Reagent(货号：10296010)抽提血浆中的总RNA。所用离心管，枪头等均无RNA酶。其大致步骤为：取0.25ml血浆，加入0.75ml的TRIzolTMLS Reagent，充分震荡混匀，室温静置5分钟；加入0.2ml的三氯甲烷，剧烈震荡15秒，室温静置2至15分钟；以12000g/min,4摄氏度离心15分钟，将上清液移至新的1.5ml离心管中(避免吸到中间白色层)，加入等体积的异丙醇，室温静置10分钟；以12000g/min,4摄氏度离心10分钟(在管底可见白色沉淀)；弃液体，留沉淀，加入RNAiso Plus等体积量(一般为1ml)的75％乙醇，以7500g/min,4摄氏度离心5分钟；弃液体，留沉淀，干燥；加适量DEPC水溶解；测浓度，置于负80摄氏度冰箱备用。
[0072] (三)环状RNA芯片检测
[0073] 本发明中用于环状RNA芯片检测的5名乙肝相关肝癌患者和5名慢性乙型肝炎患者均为男性，年龄均在40至50岁之间，肝癌患者肿瘤直径均为2至4厘米。本发明的环状RNA芯片检测是在博奥晶典(上海)生物技术有限公司的协助下完成的，所用的芯片为博奥晶典人类环状RNA芯片v2(CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2，4x180K)。用Cluster3.0软件进行Cluster分析和图形化展示。根据分组信息，进行差异比较，得到差异基因。当两组样本中circRNA表达差异倍数≥2，且P值<0.05时，定义为差异基因。
[0074] (四)RNA反转录
[0075] 我们使用ThermoFisher公司的M-MLV Reverse Transcriptase(目录号28025-013,28025-021)试剂盒进行RNA反转录。操作步骤按照其说明书进行。
[0076] (五)实时定量PCR(Real-time PCR)
[0077] 本发明中的实时定量PCR所用试剂为TAKARA公司的 Premix ExTaqTMII(Tli RNaseH Plus),ROX plus(Code NO.RR82LR)。操作步骤按照其说明书进行。我们使用TM的仪器是StepOnePlus Real-Time PCR系统(ThermoFisher公司)。针对每一个目的基因，我们均利用Primer Premier 5(加拿大)软件设计了2至3对引物。引物由上海杰李生物技术有限公司合成并用PAGE(Polyacrylamide Gel Electrophoresis)进行纯化。首次实时定量PCR使用多位患者肝癌及癌旁组织的混合cDNA作为模板。首次实时定量PCR后，如果某一引物对能够同时满足如下3个条件，则选择它作为正确的引物继续使用：(1)溶解曲线为单峰；
(2)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后呈现单一条带；(3)琼脂糖凝胶电泳单一条带进行切胶，胶回收并进行Sanger测序，测序结果符合预期。我们设置了无模板对照以及参考样本。正确引物序列见表3。
(2)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后呈现单一条带；(3)琼脂糖凝胶电泳单一条带进行切胶，胶回收并进行Sanger测序，测序结果符合预期。我们设置了无模板对照以及参考样本。正确引物序列见表3。
[0078] 当对肝癌、癌旁组织以及细胞中环状RNA以及信使RNA进行定量时，我们使用ACTB作为内参。计算公式为2-△△ct法。
[0079] 血浆中RNA分子的定量没有公认的内参。因此，在本发明中，我们根据以往文献对血浆或血清中信使RNA的定量方法，采用绝对定量的方法对血浆中的环状RNA进行定量。我们将本发明中需要绝对定量的4个环状RNA分子(hsa_circ_0000976,hsa_circ_0003506,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897)的PCR产物克隆到pUC57质粒上，得到4种重组质粒(pUC57-hsa_circ_0000976,pUC57-hsa_circ_0003506,pUC57-hsa_circ_0007750和pUC57-hsa_circ_0139897)。在对血浆中的环状RNA分子进行实时定量PCR时，加上相应的稀释不同倍数(5×107copies/μl,5×106copies/μl,5×105copies/μl,5×104copies/μl,5×3 2 1
10copies/μl,5×10copies/μl,5×10copies/μl以及5copies/μl)的重组质粒，得到8个不同拷贝数对应的Ct值。接着，我们用SPSS23.0软件(SPSS,Inc.,Chicago,IL)进行线性回归分析，得到hsa_circ_0000976,hsa_circ_0003506,hsa_circ_0007750和hsa_circ_
0139897的标准曲线公式分别为Y＝-3.381*X+34.724，Y＝-3.377*X+35.305，Y＝-3.322*X+
36.460和Y＝-3.384*X+37.686。根据标准曲线公式以及实时定量PCR的Ct值，我们得到血浆环状RNA的绝对量。
10copies/μl,5×10copies/μl,5×10copies/μl以及5copies/μl)的重组质粒，得到8个不同拷贝数对应的Ct值。接着，我们用SPSS23.0软件(SPSS,Inc.,Chicago,IL)进行线性回归分析，得到hsa_circ_0000976,hsa_circ_0003506,hsa_circ_0007750和hsa_circ_
0139897的标准曲线公式分别为Y＝-3.381*X+34.724，Y＝-3.377*X+35.305，Y＝-3.322*X+
36.460和Y＝-3.384*X+37.686。根据标准曲线公式以及实时定量PCR的Ct值，我们得到血浆环状RNA的绝对量。
[0080] 表3本发明中使用的引物序列
[0081]
[0082] (六)统计分析
[0083] 本发明的统计计算由SPSS 23.0软件(SPSS,Inc.,Chicago,IL)完成。两两比较时，根据不同情况选择卡方检验(chi-squared test),t检验(Student’s t-test),Wilcoxon符号秩检验(Wilcoxon signed-rank test)或Mann-Whitney U检验。多组比较(在血浆中的绝对定量不符合正态分布)采用多个独立样本Kruskal-Wallis H检验。绝对定量标准曲线公式由线性回归(linear regression)分析方法产生。分析相关性采用Spearman相关性分析(本发明用于相关性分析的数据均为非正态分布)。在本发明中，我们认为P值小于0.05代表差异具有统计学意义，*表示P值小于0.05，**表示P值小于0.01，***表示P值小于0.001。
[0084] 三个环状RNA分子联合诊断肝癌的公式由逻辑回归(logistic regression)分析方法产生，可参考既往文献[36]。我们用ROC曲线(receiver operating characteristic curve，受试者工作特征曲线，简称ROC曲线)的AUC(Area Under Curve，曲线下面积)来评价诊断价值。AUC的比较利用了R软件的pROC语言包(版本3.0.1)。我们认为P值小于0.05代表差异具有统计学意义。我们还计算了灵敏度(Sensitivity)以及特异度(Specificity)。灵敏度又称真阳性率，是指实际患病且被试验诊断为患者的概率，即患者被诊断为阳性的概率。特异度又称真阴性率，是实际未患病而被试验诊断为非患者的概率，即非患者被诊断为阴性的概率。
[0085] 二、实验结果
[0086] (一)乙肝相关肝癌及慢性乙型肝炎患者血浆环状RNA芯片检测及鉴定(发现集)[0087] 本发明中用于环状RNA芯片检测的5名乙肝相关肝癌患者和5名慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者年龄及性别匹配。按照表达差异倍数≥2，且P值<0.05的标准，我们发现了371个差异表达的环状RNA分子，其中326个环状RNA分子在肝癌患者血浆中的表达量高于慢性乙型肝炎患者血浆，45个环状RNA分子在肝癌患者血浆中的表达量低于慢性乙型肝炎患者血浆。(图3A，附表2)我们将326个在肝癌患者血浆上调的环状RNA分子与本发明第一部分在5例肝癌组织中测到(平均RPM≥0.05)的环状RNA分子取交集，获得10个目标分子。(图1)我们在血浆(来自5名乙肝相关肝癌患者和5名慢性乙型肝炎患者血浆的混合)以及肝组织(来自5例肝癌组织的混合)的cDNA中用PCR后琼脂糖凝胶电泳，胶回收及Sanger测序以及实时定量PCR的方法对这10个分子进行了鉴定。我们发现其中4个分子的引物符合如下条件，可以作为正确的引物继续使用：(1)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后呈现单一条带(图3B，图4A)；
(2)琼脂糖凝胶电泳单一条带进行切胶，胶回收并进行Sanger测序，测序结果符合预期(图
3C，图4B)；(3)实时定量PCR溶解曲线为单峰(图3D，图4C)。另外，我们将血浆在常温下分别放置4，8，12及24小时后用实时定量PCR检测这4个分子的表达，发现这4个分子较为稳定。
(图3E)接着，我们将肝组织的RNA用RNase R消化(RNase R是一种5’→3’核酸外切酶,能特异性地消化线性RNA而保留环状RNA。RNase R的使用参照以往文献，简而言之，就是取约3μg的总RNA在37℃孵育3小时后纯化)后用实时定量PCR进行检测，发现这4个分子均能够抵抗RNase R的消化，(图4D)这证明了这4个分子是环状的。
(2)琼脂糖凝胶电泳单一条带进行切胶，胶回收并进行Sanger测序，测序结果符合预期(图
3C，图4B)；(3)实时定量PCR溶解曲线为单峰(图3D，图4C)。另外，我们将血浆在常温下分别放置4，8，12及24小时后用实时定量PCR检测这4个分子的表达，发现这4个分子较为稳定。
(图3E)接着，我们将肝组织的RNA用RNase R消化(RNase R是一种5’→3’核酸外切酶,能特异性地消化线性RNA而保留环状RNA。RNase R的使用参照以往文献，简而言之，就是取约3μg的总RNA在37℃孵育3小时后纯化)后用实时定量PCR进行检测，发现这4个分子均能够抵抗RNase R的消化，(图4D)这证明了这4个分子是环状的。
[0088] (二)四个候选分子在肝癌，非肝癌血浆以及肝癌，癌旁组织的检测(训练集)[0089] 我们接着从海军军医大学附属东方肝胆外科医院收集了158例肝癌(HCC)患者血浆，40例肝癌手术后(HCC after hepatectomy)血浆，53例健康人(healthy)血浆，52例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者血浆，50例肝硬化(liver cirrhosis)患者血浆以及40对肝癌及癌旁(adjacent noncancerous liver,ANL，距离肿瘤边缘2厘米以上)组织用于训练集(training set)的实时定量PCR。结果显示，hsa_circ_0000976与hsa_circ_0007750在肝癌组织的表达量高于癌旁组织，hsa_circ_0139897在肝癌及癌旁组织的表达未见显著差异，而hsa_circ_0003506在肝癌组织的表达量低于癌旁组织。(图5A)hsa_circ_
0000976，hsa_circ_0007750及hsa_circ_0139897在肝癌切除手术前血浆中的表达量高于切除手术后，而hsa_circ_0003506在肝癌切除手术前后血浆中的表达量未见明显差异。(图
5B)hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750及hsa_circ_0139897在肝癌患者血浆中的表达量高于健康人，慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者，而健康人，慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者三者之间的表达量没有显著差异。(图5C)hsa_circ_0003506在肝癌患者，健康人，慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者之间的表达量没有显著差异。(图5C)hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750及hsa_circ_0139897在肝癌患者血浆中的表达量与肝癌组织中的表达量呈正相关关系，而hsa_circ_0003506在肝癌患者血浆中的表达量与肝癌组织中的表达量未见显著相关。(图5D)
0000976，hsa_circ_0007750及hsa_circ_0139897在肝癌切除手术前血浆中的表达量高于切除手术后，而hsa_circ_0003506在肝癌切除手术前后血浆中的表达量未见明显差异。(图
5B)hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750及hsa_circ_0139897在肝癌患者血浆中的表达量高于健康人，慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者，而健康人，慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者三者之间的表达量没有显著差异。(图5C)hsa_circ_0003506在肝癌患者，健康人，慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者之间的表达量没有显著差异。(图5C)hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750及hsa_circ_0139897在肝癌患者血浆中的表达量与肝癌组织中的表达量呈正相关关系，而hsa_circ_0003506在肝癌患者血浆中的表达量与肝癌组织中的表达量未见显著相关。(图5D)
[0090] 综上所述，hsa_circ_0000976和hsa_circ_0007750这两个环状RNA分子不仅在肝癌患者血浆中的表达量高于健康人、慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者，在肝癌手术前血浆中的表达量高于手术后，而且在肝癌患者血浆中的表达量与肝癌组织中的表达量呈正相关关系，在肝癌组织中的表达量高于癌旁组织。hsa_circ_0139897虽然在肝癌及癌旁组织的表达量未见显著差异，但是其在肝癌患者血浆中的表达量高于健康人、慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者，在肝癌手术前血浆中的表达量高于手术后，而且在肝癌患者血浆中的表达量与肝癌组织中的表达量呈正相关关系。我们推测这可能是因为肝癌组织中的hsa_circ_0139897比癌旁或健康组织中的hsa_circ_0139897更容易分泌到血浆中。因此，我们选择hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897这3个环状分子作为肝癌诊断标志物进一步研究。
[0091] (三)三个环状RNA分子及其组合(CircPanel)对肝癌诊断效果的评价(训练集)[0092] 在训练集中，我们通过Cut off Finder(http://molpath.charite.de/cutoff/)网站的ROC曲线(Euclidean distance)分析法确定了血浆中hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897用于区别肝癌和非肝癌的最佳截断(cut off)点分别为1067,
4324以及1108copies/ml plasma，大于或等于这些cut off值的记为1，诊断为肝癌，而小于这些cut off值的记为0，诊断为非肝癌。
4324以及1108copies/ml plasma，大于或等于这些cut off值的记为1，诊断为肝癌，而小于这些cut off值的记为0，诊断为非肝癌。
[0093] 我们用ROC曲线(receiver operating characteristic curve，受试者工作特征曲线，简称ROC曲线)的AUC(Area Under Curve，曲线下面积)来评价诊断价值，并计算了灵敏度(Sensitivity)以及特异度(Specificity)。灵敏度又称真阳性率，是指实际患病且被试验诊断为患者的概率，即患者被诊断为阳性的概率。特异度又称真阴性率，是实际未患病而被试验诊断为非患者的概率，即非患者被诊断为阴性的概率。
[0094] 基于此，在训练集中，血浆中hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897对肝癌的诊断效果如图6A-C和表4所示。为了提高诊断效果，我们将这三个环状分子的组合(Panel of circRNAs,简称CircPanel)用于诊断肝癌。我们参照既往文献所采用的逻辑回归(logistic regression)方法，得到CircPanel的计算公式为Logit(P＝HCC)＝[0095] -3.502+1.920*hsa_circ_0000976+2.800*hsa_circ_0007750+3.154*hsa_circ_
0139897，即
0139897，即
[0096] P＝1/[1+EXP(3.502-1.920*hsa_circ_0000976-2.800*hsa_circ_0007750-3.154*hsa_circ_0139897)]。在此公式中，当环状RNA的表达量大于或等于cut off值时，相应的环状RNA符号代表1；当环状RNA的表达量小于cut off值时，相应的环状RNA符号代表0。
当P大于0.5时，诊断为肝癌；当P小于或等于0.5时，诊断为非肝癌。按照这个CircPanel公式，我们对每一名参与者进行了计算，得出诊断结果，并进行了评价。(图6D，表4)我们发现CircPanel在区别肝癌组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.863(95％CI
0.819–0.907)、81.6％和91.0％，其诊断价值高于hsa_circ_0000976(AUC 0.863[0.819–
0.907]vs 0.702[0.644–0.761]，P<0.001)，hsa_circ_0007750(AUC 0.863[0.819–0.907]vs 0.776[0.723–0.830]，P＝0.012)以及hsa_circ_0139897(AUC 0.863[0.819–0.907]vs
0.749[0.693–0.804]，P＝0.001)。(图6，表4)
当P大于0.5时，诊断为肝癌；当P小于或等于0.5时，诊断为非肝癌。按照这个CircPanel公式，我们对每一名参与者进行了计算，得出诊断结果，并进行了评价。(图6D，表4)我们发现CircPanel在区别肝癌组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.863(95％CI
0.819–0.907)、81.6％和91.0％，其诊断价值高于hsa_circ_0000976(AUC 0.863[0.819–
0.907]vs 0.702[0.644–0.761]，P<0.001)，hsa_circ_0007750(AUC 0.863[0.819–0.907]vs 0.776[0.723–0.830]，P＝0.012)以及hsa_circ_0139897(AUC 0.863[0.819–0.907]vs
0.749[0.693–0.804]，P＝0.001)。(图6，表4)
[0097] 我们同时分析了甲胎蛋白(AFP)(cut off值为20μg/L)的诊断效果。(图7，表5)接着，我们再次采用逻辑回归(logistic regression)方法，将CircPanel和AFP进行组合(CircPanel+AFP)，其计算公式为Logit(P＝HCC)＝-2.152+3.321*CircPanel+2.241*AFP，即P＝1/[1+EXP(2.152-3.321*CircPanel-2.241*AFP)]。在此公式中，当CircPanel大于cut off值(0.5)时，其符号代表1，小于或等于cut off值(0.5)时，其符号代表0；当AFP大于cut off值(20ng/ml)时，其符号代表1，当AFP小于等于cut off值(20ng/ml)时，其符号代表0。当P大于0.5时，诊断为肝癌；当P小于或等于0.5时，诊断为非肝癌。按照这个CircPanel+AFP公式，我们也对每一名参与者进行了计算，得出诊断结果，并进行了评价。
[0098] CircPanel在区别肝癌组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.863(0.819–0.907)、81.6％和91.0％，其诊断价值高于AFP(AUC 0.863[0.819–0.907]vs 0.790[0.738–0.842]，P＝0.036)。CircPanel与AFP联合的诊断价值与CircPanel单独诊断相当(AUC 0.878[0.836–0.920]vs AUC 0.863[0.819–0.907]，P＝0.622)，但明显高于AFP(AUC 0.878[0.836–0.920]vs 0.790[0.738–0.842]，P＝0.010)。接着，我们将非肝癌组区分为健康组、慢乙肝组与乙肝肝硬化组后分别与肝癌组进行比较。结果表明，CircPanel在区别肝癌组与健康组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.861(0.803–0.919)、81.6％和90.6％，其诊断价值与AFP的诊断价值相当(AUC 0.861[0.803–0.919]vs 0.842[0.791–0.893]，P＝
0.632)。CircPanel在区别肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.870(0.814–0.925)、81.6％和92.3％，其诊断价值高于AFP(AUC0.870[0.814–0.925]vs 0.765[0.693–0.837]，P＝0.024)。CircPanel在区别肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.858(0.798–0.918)、81.6％和90.0％，其诊断价值高于AFP(AUC 0.858[0.798–0.918]vs 0.762[0.688–0.835]，P＝0.047)。(图7，表5)
0.632)。CircPanel在区别肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.870(0.814–0.925)、81.6％和92.3％，其诊断价值高于AFP(AUC0.870[0.814–0.925]vs 0.765[0.693–0.837]，P＝0.024)。CircPanel在区别肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.858(0.798–0.918)、81.6％和90.0％，其诊断价值高于AFP(AUC 0.858[0.798–0.918]vs 0.762[0.688–0.835]，P＝0.047)。(图7，表5)
[0099] CircPanel在区别小肝癌(单发，直径≤3cm)组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.862(0.796–0.928)、81.5％和91.0％，其诊断价值高于AFP(AUC 0.862[0.796–0.928]vs 0.680[0.589–0.770]，P＝0.001)。CircPanel与AFP联合的诊断价值与CircPanel单独诊断相当(AUC 0.873[0.817–0.929]vsAUC 0.862[0.796–0.928]，P＝0.809)，但明显高于AFP(AUC 0.873[0.817–0.929]vs 0.680[0.589–0.770]，P<0.001)。接着，我们将非肝癌组区分为健康组、慢乙肝组与乙肝肝硬化组后分别与小肝癌组进行比较。结果表明，CircPanel在区别小肝癌组与健康组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.860(0.784–
0.936)、81.5％和90.6％，其诊断价值高于AFP(AUC 0.860[0.784–0.936]vs 0.731[0.634–
0.829]，P＝0.041)。CircPanel在区别小肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.869(0.795–0.943)、81.5％和92.3％，其诊断价值高于AFP(AUC 0.869[0.795–0.943]vs 0.655[0.550–0.759]，P＝0.001)。CircPanel在区别小肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.857(0.780–0.935)、81.5％和90.0％，其诊断价值高于AFP(AUC
0.857[0.780–0.935]vs 0.651[0.546–0.757]，P＝0.002)。(图7，表5)[0100] CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为
0.838(0.761–0.914)、74.0％和93.5％。CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与健康组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.823(0.737–0.909)、74.0％和90.6％。CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.859(0.779–0.939)、74.0％和
97.7％。CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为
0.834(0.747–0.921)、74.0％和92.9％。CircPanel在区别AFP阴性小肝癌组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.881(0.797–0.965)、82.8％和93.5％。CircPanel在区别AFP阴性小肝癌组与健康组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.867(0.774–0.959)、82.8％和90.6％。CircPanel在区别AFP阴性小肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为
0.902(0.816–0.989)、82.8％和97.7％。CircPanel在区别AFP阴性小肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.878(0.785–0.971)、82.8％和92.9％。(图8，表6)[0101] 训练集的结果表明，外周血血浆CircPanel用于诊断肝癌的价值高于AFP，并且能用于小肝癌以及AFP阴性肝癌的诊断。
0.936)、81.5％和90.6％，其诊断价值高于AFP(AUC 0.860[0.784–0.936]vs 0.731[0.634–
0.829]，P＝0.041)。CircPanel在区别小肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.869(0.795–0.943)、81.5％和92.3％，其诊断价值高于AFP(AUC 0.869[0.795–0.943]vs 0.655[0.550–0.759]，P＝0.001)。CircPanel在区别小肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.857(0.780–0.935)、81.5％和90.0％，其诊断价值高于AFP(AUC
0.857[0.780–0.935]vs 0.651[0.546–0.757]，P＝0.002)。(图7，表5)[0100] CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为
0.838(0.761–0.914)、74.0％和93.5％。CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与健康组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.823(0.737–0.909)、74.0％和90.6％。CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.859(0.779–0.939)、74.0％和
97.7％。CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为
0.834(0.747–0.921)、74.0％和92.9％。CircPanel在区别AFP阴性小肝癌组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.881(0.797–0.965)、82.8％和93.5％。CircPanel在区别AFP阴性小肝癌组与健康组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.867(0.774–0.959)、82.8％和90.6％。CircPanel在区别AFP阴性小肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为
0.902(0.816–0.989)、82.8％和97.7％。CircPanel在区别AFP阴性小肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.878(0.785–0.971)、82.8％和92.9％。(图8，表6)[0101] 训练集的结果表明，外周血血浆CircPanel用于诊断肝癌的价值高于AFP，并且能用于小肝癌以及AFP阴性肝癌的诊断。
[0102] 表4.三个环状RNA分子及其组合对肝癌诊断效果的评价(训练集)
[0103]
[0104] 注：#,P值代表各环状RNA分子的AUC与CircPanel的AUC比较的差异显著性。
[0105] 表5.CircPanel,AFP及其组合对肝癌诊断效果的评价(训练集)
[0106]
[0107]
[0108] 表6.CircPanel对AFP阴性肝癌诊断效果的评价(训练集)
[0109]
[0110]
[0111] (四)三个环状RNA分子及其组合(CircPanel)对肝癌诊断效果的评价(验证集)[0112] 为了验证上述三个环状RNA分子(hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897)及其组合(CircPanel)对肝癌的诊断效果，我们从海军军医大学附属东方肝胆外科医院收集了152例肝癌患者血浆，50例健康人血浆，54例慢性乙型肝炎患者血浆以及50例肝硬化患者血浆作为验证集。入组标准见表1，临床资料见表2。我们通过实时定量PCR以及绝对定量的方法检测了血浆中这三种环状分子的表达。
[0113] 按照训练集所确定的环状RNA表达量的cut off值，我们发现hsa_circ_0000976，hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897在验证集中也能够较为准确地区别肝癌与非肝癌。(图9A-C，表7)按照训练集所确定的CircPanel的计算公式，我们发现，在验证集中，三者的组合CircPanel在区别肝癌组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.843(0.796–
0.890)、87.5％和81.2％，其诊断价值也均高于hsa_circ_0000976(AUC 0.843[0.796–
0.890]vs0.684[0.623–0.744]]，P<0.001)，hsa_circ_0007750(AUC 0.843[0.796–0.890]vs 0.758[0.703–0.814]，P＝0.021)以及hsa_circ_0139897(AUC 0.843[0.796–0.890]vs
0.764[0.709–0.819]，P＝0.032)。(图9，表7)
0.890)、87.5％和81.2％，其诊断价值也均高于hsa_circ_0000976(AUC 0.843[0.796–
0.890]vs0.684[0.623–0.744]]，P<0.001)，hsa_circ_0007750(AUC 0.843[0.796–0.890]vs 0.758[0.703–0.814]，P＝0.021)以及hsa_circ_0139897(AUC 0.843[0.796–0.890]vs
0.764[0.709–0.819]，P＝0.032)。(图9，表7)
[0114] 按照训练集所介绍的方法，我们也对AFP和CircPanel+AFP的诊断效果进行了评价，并比较了CircPanel、AFP和CircPanel+AFP的诊断价值。
[0115] 验证集中，CircPanel在区别肝癌组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.843(0.796–0.890)、87.5％和81.2％，其诊断价值高于AFP(AUC0.843[0.796–0.890]vs
0.747[0.691–0.804]，P＝0.011)。CircPanel与AFP联合的诊断价值与CircPanel单独诊断相当(AUC 0.863[0.819–0.908]vs AUC 0.843[0.796–0.890]，P＝0.547)，但明显高于AFP(AUC 0.863[0.819–0.908]vs 0.747[0.691–0.804]，P＝0.002)。接着，我们将非肝癌组区分为健康组、慢乙肝组与乙肝肝硬化组后分别与肝癌组进行比较。结果表明，CircPanel在区别肝癌组与健康组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.858(0.791–0.924)、87.5％和
84.0％，其诊断价值与AFP的诊断价值相当(AUC 0.858[0.791–0.924]vs 0.793[0.731–
0.854]，P＝0.158)。CircPanel在区别肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为
0.817(0.744–0.891)、87.5％和75.9％，其诊断价值与AFP相当(0.817[0.744–0.891]vs
0.729[0.654–0.803]，P＝0.097)。CircPanel在区别肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.858(0.791–0.924)、87.5％和84.0％，其诊断价值高于AFP(0.858[0.791–0.924]vs 0.723[0.645–0.800]，P＝0.009)。(图10，表8)
0.747[0.691–0.804]，P＝0.011)。CircPanel与AFP联合的诊断价值与CircPanel单独诊断相当(AUC 0.863[0.819–0.908]vs AUC 0.843[0.796–0.890]，P＝0.547)，但明显高于AFP(AUC 0.863[0.819–0.908]vs 0.747[0.691–0.804]，P＝0.002)。接着，我们将非肝癌组区分为健康组、慢乙肝组与乙肝肝硬化组后分别与肝癌组进行比较。结果表明，CircPanel在区别肝癌组与健康组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.858(0.791–0.924)、87.5％和
84.0％，其诊断价值与AFP的诊断价值相当(AUC 0.858[0.791–0.924]vs 0.793[0.731–
0.854]，P＝0.158)。CircPanel在区别肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为
0.817(0.744–0.891)、87.5％和75.9％，其诊断价值与AFP相当(0.817[0.744–0.891]vs
0.729[0.654–0.803]，P＝0.097)。CircPanel在区别肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.858(0.791–0.924)、87.5％和84.0％，其诊断价值高于AFP(0.858[0.791–0.924]vs 0.723[0.645–0.800]，P＝0.009)。(图10，表8)
[0116] 验证集中，CircPanel在区别小肝癌组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.838(0.776–0.900)、86.4％和81.2％，其诊断价值高于AFP(0.838[0.776–0.900]vs 0.699[0.613–0.785]，P＝0.011)。CircPanel与AFP联合的诊断价值与CircPanel单独诊断相当(AUC 0.874[0.823–0.925]vs AUC 0.838[0.776–0.900]，P＝0.383)，但明显高于AFP(AUC 0.874[0.823–0.925]vs 0.699[0.613–0.785]，P＝0.001)。接着，我们将非肝癌组区分为健康组、慢乙肝组与乙肝肝硬化组后分别与小肝癌组进行比较。结果表明，CircPanel在区别小肝癌组与健康组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.852(0.774–0.930)、86.4％和
84.0％，其诊断价值与AFP相当(0.852[0.774–0.930]vs 0.744[0.651–0.837]，P＝0.080)。
CircPanel在区别小肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.812(0.728–
0.896)、86.4％和75.9％，其诊断价值高于AFP(0.812[0.728–0.896]vs 0.680[0.581–
0.779]，P＝0.048)。CircPanel在区别小肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.852(0.774–0.930)、86.4％和84.0％，其诊断价值高于AFP(AUC 0.852[0.774–
0.930]vs 0.674[0.573–0.776]，P＝0.007)。(图10，表8)
84.0％，其诊断价值与AFP相当(0.852[0.774–0.930]vs 0.744[0.651–0.837]，P＝0.080)。
CircPanel在区别小肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.812(0.728–
0.896)、86.4％和75.9％，其诊断价值高于AFP(0.812[0.728–0.896]vs 0.680[0.581–
0.779]，P＝0.048)。CircPanel在区别小肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.852(0.774–0.930)、86.4％和84.0％，其诊断价值高于AFP(AUC 0.852[0.774–
0.930]vs 0.674[0.573–0.776]，P＝0.007)。(图10，表8)
[0117] 验证集中，CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.857(0.793–0.921)、81.7％和89.8％。CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与健康组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.837(0.756–0.917)、81.7％和85.7％。CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.843(0.763–0.923)、81.7％和87.0％。CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.896(0.831–0.962)、81.7％和97.6％。CircPanel在区别AFP阴性小肝癌组与非肝癌组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.897(0.827–0.968)、89.7％和89.8％。CircPanel在区别AFP阴性小肝癌组与健康组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.877(0.791–0.963)、89.7％和85.7％。CircPanel在区别AFP阴性小肝癌组与慢乙肝组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.883(0.797–0.969)、89.7％和87.0％。CircPanel在区别AFP阴性小肝癌组与乙肝肝硬化组时的AUC、灵敏度和特异度分别为0.936(0.866–1.000)、89.7％和97.6％。(图11，表9)[0118] 验证集的结果进一步证明了外周血血浆CircPanel用于诊断肝癌的价值高于AFP，并且能用于小肝癌以及AFP阴性肝癌的诊断。
[0119] 表7.三个环状RNA分子及其组合对肝癌诊断效果的评价(验证集)
[0120]
[0121] 注：#,P值代表各环状RNA分子的AUC与CircPanel的AUC比较的差异显著性。
[0122] 表8.CircPanel,AFP及其组合对肝癌诊断效果的评价(验证集)
[0123]
[0124]
[0125]
[0126] 表9.CircPanel对AFP阴性肝癌诊断效果的评价(验证集)
[0127]
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