贝伐单抗组合疗法用于治疗胰腺癌的血浆生物标志物
阅读：1030发布：2020-08-09
专利汇可以提供贝伐单抗组合疗法用于治疗胰腺癌的血浆生物标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供通过将贝伐单抗（bevacizumab）添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者的化疗方案的 治疗 效果的方法，其通过相对于诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者的对照 水 平，测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，特别是 血浆 表达水平来进行。特别是，本发明提供改进治疗效果的方法，其中治疗效果为患者的总体存活和/或无进展存活。本发明进一步提供用于评估患者对与化疗方案组合的贝伐单抗的敏感性或响应性的方法，其通过相对于诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者中的对照水平，测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，特别是血浆表达水平来进行。，下面是贝伐单抗组合疗法用于治疗胰腺癌的血浆生物标志物专利的具体信息内容。
1.特异性探针在制备供一种通过将贝伐单抗(bevacizumab)添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的所述化疗方案的治疗效果的方法使用的试剂盒中的用途，所述方法包括：
(a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
其中所述探针能够检测VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项，
其中该胰腺癌为转移性胰腺癌，
其中所述化疗方案包含吉西他滨(gemcitabine)和厄洛替尼(erlotinib)。
2.特异性探针在制备供一种用于鉴定对将贝伐单抗治疗添加至化疗方案响应或敏感的患者的体外方法使用的试剂盒中的用途，所述方法包括测定来自怀疑患有或倾向于患上胰腺癌的患者的样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平，由此VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于患有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高指示患者对将贝伐单抗添加至所述化疗方案的敏感性，其中所述探针能够检测VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项，其中该胰腺癌为转移性胰腺癌，其中所述化疗方案包含吉西他滨(gemcitabine)和厄洛替尼(erlotinib)。
3.贝伐单抗在制备用于改进患有胰腺癌的患者的化疗方案治疗效果的药物中的用途，所述改进包括下述步骤：
(a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
其中该胰腺癌为转移性胰腺癌，
其中所述化疗方案包含吉西他滨(gemcitabine)和厄洛替尼(erlotinib)。
4.特异性探针在制备供一种预测怀疑患有、患有或倾向于患上胰腺癌的患者对将贝伐单抗添加至化疗方案的响应或敏感性的体外方法使用的试剂盒中的用途，所述方法包括测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平，其中所述探针能够检测VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项，其中该胰腺癌为转移性胰腺癌，其中所述化疗方案包含吉西他滨(gemcitabine)和厄洛替尼(erlotinib)。
5.权利要求1、2和4任一项的用途，其中该探针为抗体。
6.权利要求1至3任一项的用途，其中该治疗效果为无进展存活。
7.权利要求1至3任一项的用途，其中该治疗效果为总体存活。
8.权利要求4至6任一项的用途，其中测定的蛋白质表达水平为VEGFA或PLGF的。
9.权利要求4、5和7任一项的用途，其中测定的蛋白质表达水平为VEGFA或VEGFR2的。
10.权利要求1至7任一项的用途，其中测定的蛋白质表达水平为VEGFA和VEGFR2的组合表达水平。
11.权利要求1至7任一项的用途，其中测定的蛋白质表达水平为VEGFA和PLGF的组合表达水平。
12.权利要求1至7任一项的用途，其中测定的蛋白质表达水平为VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平。
13.权利要求1至12任一项的用途，其中所述表达水平通过免疫测定法方法来检测。
14.权利要求13的用途，其中所述免疫测定法方法为ELISA。
15.权利要求1至14任一项的用途，其中所述患者样品为血液样品。
16.权利要求1至15任一项的用途，其中所述患者样品为血浆样品。
17.权利要求1至16任一项的用途，其中所述样品是在新辅助药物或辅助疗法之前获得的。
18.权利要求1至16任一项的用途，其中所述样品是在新辅助药物或辅助疗法之后获得的。
19.多肽在制备用于在权利要求1至18任一项中测定VEGFA、VEGFR2和/或PLGF中一项或多项的表达水平的试剂盒中的用途。
贝伐单抗组合疗法用于治疗胰腺癌的血浆生物标志物
[0001] 本发明提供通过将贝伐单抗（bevacizumab） 添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，其通过相对于诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者的对照水平，测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，特别是血浆表达水平来进行。特别是，本发明提供改进治疗效果的方法，其中治疗效果为患者的总体存活和/或无进展存活。本发明进一步提供用于评估患者对与化疗方案组合的贝伐单抗 的敏感性或响应性的方法，其通过相对于诊断
有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者中的对照水平，测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，特别是血浆表达水平来进行。
有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者中的对照水平，测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，特别是血浆表达水平来进行。
[0002] 因而，本发明涉及鉴定和选择胰腺癌，特别是转移性胰腺癌中与对与化疗方案，诸如吉西他滨（gemcitabine）-厄洛替尼（erlotinib）（GE）疗法组合的血管发生抑制剂，例如贝伐单抗 的敏感性或响应性有关的生物标志物。在这方面，本发明涉及相对于诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者中建立的对照，VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的血浆特异性表达概况用于鉴定对将血管发生抑制剂，例如贝伐单抗
添加至标准化疗敏感或响应的患者的用途。本发明进一步涉及通过将血管发生抑制剂，例如贝伐单抗 添加至标准化疗，例如吉西他滨-厄洛替尼（GE）疗法，用于改进
患有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者的治疗效果，特别是总体存活和/或无进展存活的方法，其通过相对于诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者中的对照，测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的血浆特异性表达水平来进行。本发明进一步提供用于鉴定依照本发明的方法确定和定义的对血管发生抑制剂，特别是贝伐单抗 敏感或
响应的患者的试剂盒和组合物。
添加至标准化疗敏感或响应的患者的用途。本发明进一步涉及通过将血管发生抑制剂，例如贝伐单抗 添加至标准化疗，例如吉西他滨-厄洛替尼（GE）疗法，用于改进
患有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者的治疗效果，特别是总体存活和/或无进展存活的方法，其通过相对于诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者中的对照，测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的血浆特异性表达水平来进行。本发明进一步提供用于鉴定依照本发明的方法确定和定义的对血管发生抑制剂，特别是贝伐单抗 敏感或
响应的患者的试剂盒和组合物。
[0003] 血管发生是癌症形成所必需的，不仅调节原发性肿瘤尺寸和生长，而且影响侵入性和转移性潜力。因而，作为定向抗癌疗法的潜在靶，已经调查了介导血管发生过程的机制。在血管发生调控剂研究的早期，发现血管内皮生长因子（VEGF）信号传导途径优先调节多种癌症类型中的血管发生活性。这种因子经由VEGF受体2（VEGFR-2），即介导血管发生的主要VEGF信号传导受体发信号。已经开发了多种治疗剂在多个点调控这种途径。这些疗法包括例如贝伐单抗、舒尼替尼（sunitinib）、索拉非尼（sorafenib）和瓦他拉尼（vatalanib）。虽然血管发生抑制剂在临床中的使用已经显示出成功，但是并非所有患者都响应或未能完全响应血管发生抑制剂疗法。不知道此类不完全响应背后的机制。因此，越来越需要鉴定对抗血管发生癌症疗法敏感或响应的患者亚组。
[0004] 虽然知道多种血管发生抑制剂，但是最突出的血管发生抑制剂是贝伐单抗。贝伐单抗是一种特异性结合并阻断VEGF（血管内皮生长因子）的生物学效应的重组人源化单克隆IgG1抗体。VEGF是肿瘤血管发生（肿瘤生长和转移（即肿瘤扩散至身体其它部分）所需要的一个必要过程）的一种关键驱动物。 在欧洲批准用于治疗晚期阶段的四类常见癌症：结肠直肠癌，乳腺癌，非小细胞肺癌（NSCLC）和肾癌，它们每年总共引起超过250万例死亡。在美国， 是第一种得到FDA批准的抗血管发生疗
法，而且它现在批准用于治疗五类肿瘤：结肠直肠癌，非小细胞肺癌，乳腺癌，脑（成胶质细胞瘤）和肾（肾细胞癌）。至今已经用Avastin治疗超过50万患者，而且有超过450项临床试验的一个综合临床程序项目正在调查Avastin在不同情况（例如晚期或早期疾病）中治疗多种癌症类型（包括结肠直肠、乳腺、非小细胞肺、脑、胃、卵巢和前列腺）中的更多用途。
重要的是， 已经显示出作为共同治疗剂有希望，在与广泛的化疗和其它抗癌疗法组合时展现功效。已经发表了III期研究，证明将贝伐单抗与标准化疗方案组合的有益效果（参见例如Saltz等，2008，J.Clin.Oncol.，26：2013-2019；Yang等，2008，Clin.Cancer Res.，14：5893-5899；Hurwitz等，2004，N.Engl.J.Med.，350：2335-2342）。然而，正如在血管发生抑制剂的先前研究中，这些III期研究中的一些已经显示了一部分患者对将贝伐单抗 添加至他们的化疗方案经历不完全响应。
法，而且它现在批准用于治疗五类肿瘤：结肠直肠癌，非小细胞肺癌，乳腺癌，脑（成胶质细胞瘤）和肾（肾细胞癌）。至今已经用Avastin治疗超过50万患者，而且有超过450项临床试验的一个综合临床程序项目正在调查Avastin在不同情况（例如晚期或早期疾病）中治疗多种癌症类型（包括结肠直肠、乳腺、非小细胞肺、脑、胃、卵巢和前列腺）中的更多用途。
重要的是， 已经显示出作为共同治疗剂有希望，在与广泛的化疗和其它抗癌疗法组合时展现功效。已经发表了III期研究，证明将贝伐单抗与标准化疗方案组合的有益效果（参见例如Saltz等，2008，J.Clin.Oncol.，26：2013-2019；Yang等，2008，Clin.Cancer Res.，14：5893-5899；Hurwitz等，2004，N.Engl.J.Med.，350：2335-2342）。然而，正如在血管发生抑制剂的先前研究中，这些III期研究中的一些已经显示了一部分患者对将贝伐单抗 添加至他们的化疗方案经历不完全响应。
[0005] 因而，需要确定那些对包括血管发生抑制剂，特别是贝伐单抗 的组合疗法响应或有可能响应的患者的方法。如此，本发明下面的技术问题是提供用于鉴定患有或倾向于患上胰腺癌，特别是转移性胰腺癌，可能受益于将血管发生抑制剂，特别是贝伐单抗 添加至化疗疗法，例如吉西他滨-厄洛替尼（GE）疗法的患者的方法和手
段。
段。
[0007] 因此，本发明提供一种通过将贝伐单抗添加至所述化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，所述方法包括：
[0008] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并[0009] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0010] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，所述方法包括：
[0011] (a)自所述患者获得样品；
[0012] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并
[0013] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0014] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0015] (a)患者样品中测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并[0016] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0017] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0018] (a)自所述患者获得样品；
[0019] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并
[0020] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0021] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0022] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并[0023] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0024] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0025] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0026] (a)自所述患者获得样品；
[0027] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并
[0028] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0029] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0030] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0031] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并[0032] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0033] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0034] (a)自所述患者获得样品；
[0035] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并
[0036] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0037] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0038] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并[0039] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0040] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0041] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0042] (a)自所述患者获得样品；
[0043] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并
[0044] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0045] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0046] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0047] (a)测定患者样品中VEGFA或VEGFR2的蛋白质表达水平；并
[0048] (b)对VEGFA或VEGFR2的表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0049] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0050] (a)自所述患者获得样品；
[0051] (b)测定VEGFA或VEGFR2的蛋白质表达水平；并
[0052] (c)对VEGFA或VEGFR2的表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0053] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0054] (a)测定患者样品中VEGFA或VEGFR2的蛋白质表达水平；并
[0055] (b)对VEGFA或VEGFR2的表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0056] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0057] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0058] (a)自所述患者获得样品；
[0059] (b)测定VEGFA或VEGFR2的蛋白质表达水平；并
[0060] (c)对VEGFA或VEGFR2的表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗,
[0061] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0062] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0063] (a)测定患者样品中VEGFA或PLGF的蛋白质表达水平；并
[0064] (b)对VEGFA或PLGF的表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0065] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0066] (a)自所述患者获得样品；
[0067] (b)测定VEGFA或PLGF的蛋白质表达水平；并
[0068] (c)对VEGFA或PLGF的表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0069] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0070] (a)测定患者样品中VEGFA或PLGF的蛋白质表达水平；并
[0071] (b)对VEGFA或PLGF的表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0072] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0073] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0074] (a)自所述患者获得样品；
[0075] (b)测定VEGFA或PLGF的蛋白质表达水平；并
[0076] (c)对VEGFA或PLGF的表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0077] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0078] 本发明提供一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0079] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0080] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0081] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。
[0082] 因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0083] (a)自所述患者获得样品；
[0084] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0085] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0086] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。
[0087] 因此，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0088] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0089] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0090] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0091] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0092] (a)自所述患者获得样品；
[0093] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0094] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0095] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0096] 本发明提供一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0097] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0098] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0099] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。
[0100] 因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0101] (a)自所述患者获得样品；
[0102] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0103] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0104] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。
[0105] 本发明，因此，涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0106] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0107] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0108] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0109] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0110] (a)自所述患者获得样品；
[0111] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0112] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0113] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0114] 本发明提供一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0115] (a)测定患者样品中VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平；并
[0116] (b)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0117] 因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0118] (a)自所述患者获得样品；
[0119] (b)测定VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平；并
[0120] (c)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0121] 因此，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0122] (a)测定患者样品中VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平；并
[0123] (b)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0124] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0125] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0126] (a)自所述患者获得样品；
[0127] (b)测定VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平；并
[0128] (c)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0129] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0130] 本发明提供一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0131] (a)测定患者样品中VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平；并
[0132] (b)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0133] 因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0134] (a)自所述患者获得样品；
[0135] (b)测定VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平；并
[0136] (c)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0137] 因此，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0138] (a)测定患者样品中VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平；并
[0139] (b)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0140] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0141] 本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0142] (a)自所述患者获得样品；
[0143] (b)测定VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平；并
[0144] (c)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0145] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0146] 本发明提供一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0147] (a)测定患者样品中VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0148] (b)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的组合对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0149] 因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0150] (a)自所述患者获得样品；
[0151] (b)测定VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0152] (c)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0153] 因此，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0154] (a)测定患者样品中VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0155] (b)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的组合对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0156] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0157] 因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的方法，所述方法包括：
[0158] (a)自所述患者获得样品；
[0159] (b)测定VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0160] (c)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0161] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0162] 本发明提供一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0163] (a)测定患者样品中VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0164] (b)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的组合对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0165] 因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0166] (a)自所述患者获得样品；
[0167] (b)测定VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0168] (c)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0169] 因此，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0170] (a)测定患者样品中VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0171] (b)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的组合对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0172] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0173] 因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括：
[0174] (a)自所述患者获得样品；
[0175] (b)测定VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平；并
[0176] (c)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0177] 其中该化疗方案包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0178] 本发明提供一种用于鉴定对将贝伐单抗治疗添加至化疗方案响应或敏感的患者的体外方法，所述方法包括测定来自患者患有、怀疑患有或倾向于患上胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平，由此VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于患有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平，特别是转移性胰腺癌升高指示患者对将贝伐单抗添加至所述化疗方案的敏感性。该化疗方案可以包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0179] 因而，本发明涉及一种用于鉴定对将贝伐单抗治疗添加至化疗方案响应或敏感的患者的体外方法，所述方法包括：
[0180] (a)自患有、怀疑患有或倾向于患上胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者获得样品；并
[0181] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；
[0182] 由此VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于患有胰腺癌的患者中测定的对照表达水平，特别是转移性胰腺癌升高指示患者对将贝伐单抗添加至所述化疗方案的敏感性。该化疗方案可以包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0183] 本发明提供一种用于鉴定对将贝伐单抗治疗添加至化疗方案响应或敏感的患者的体外方法，所述方法包括测定来自患有、怀疑患有或倾向于患上转移性胰腺癌的患者的样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平，由此VEGFA和VEGFR2或VEGFA和PLGF或VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在患有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高指示患者对将贝伐单抗添加至所述化疗方案的敏感性。该化疗方案可以包含吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0184] 因而，本发明解决所鉴别的技术问题，其在于令人惊讶地显示了相对于在诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者中测定的对照水平，给定患者中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的血浆特异性表达水平与那些施用与化疗方案组合的血管发生抑制剂的患者中的治疗效果有关的。具体而言，令人惊讶地将VEGFA、VEGFR2和/或PLGF的蛋白质表达水平中的变化鉴定为转移性胰腺癌患者响应将贝伐单抗 添加至吉西他滨-厄洛替尼化疗方案的总体存活和/或无进展存活改善的标志物/预测物。对将贝伐单抗 添加至化疗方案展现响应或敏感性的患者鉴定为VEGFA、VEGFR2和PLGF中
一项或多项的蛋白质表达水平相对于自诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者获得的样品中建立的对照表达水平升高。术语“标志物”和“预测物”可互换使用，而且指VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，如本文中描述的。本发明还涵盖“标志物”和“预测物”的用途，术语“标志物”和“预测物”指VEGFA、VEGFR2和PLGF的血浆表达水平，即本发明还涵盖VEGFA、VEGFR2和PLGF的血浆表达水平中任何两项或更多项的组合的用途。
一项或多项的蛋白质表达水平相对于自诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者获得的样品中建立的对照表达水平升高。术语“标志物”和“预测物”可互换使用，而且指VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，如本文中描述的。本发明还涵盖“标志物”和“预测物”的用途，术语“标志物”和“预测物”指VEGFA、VEGFR2和PLGF的血浆表达水平，即本发明还涵盖VEGFA、VEGFR2和PLGF的血浆表达水平中任何两项或更多项的组合的用途。
[0185] 在本发明的语境中，“VEGFA”指血管内皮生长因子蛋白A，以SEQ ID NO：1例示，在图8中显示（Swiss Prot登录号P15692，Gene ID（NCBI）：7422）。术语“VEGFA”涵盖具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白质及其同源物和同等型。术语“VEGFA”还涵盖VEGFA的已知的同等型，例如剪接同等型，例如VEGF111、VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206，及其变体、同源物和同等型，包括纤溶酶切割VEGF165生成的110个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如记载于Ferrara，Mol.Biol.Cell21：687（2010）；Leung等，Science246：1306（1989）；及Houck等Mol.Endocrin.5：1806（1991）。在本发明的一个具体实施方案中，“VEGFA”指VEGF121和/或VEGF110。在本发明的一个具体实施方案中，“VEGFA”指VEGF111。在本发明的语境中，术语“VEGFA”还涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO：1，或与其变体和/或同源物的氨基酸序列，以及该序列的片段具有至少85%、至少90%或至少95%同源性的蛋白质，前提是变体蛋白质（包括同等型）、同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种VEGFA特异性抗体识别，诸如抗体克隆3C5和26503，它们分别可得自Bender RELIATech和R&D Systems，和A4.6.1，如记载于Kim等，Growth Factors7（1）：53-64（1992）。在本发明的语境中，VEGF或VEGF-A的术语“同等型”（isoform）指剪接同等型和通过酶促切割（例如纤溶酶）生成的形式二者。
[0186] 在一个实施方案中，“VEGFA”指未修饰的VEGF。在本发明的语境中，“未修饰”VEGF涉及VEGF、它的同等型和它的切割产物的未修饰氨基酸序列。例如，未修饰的VEGF可以合成生成，或优选在原核表达系统，例如大肠杆菌中重组生成。例如，未修饰的VEGF不携带翻译后修饰，像糖基化。在本发明的语境中，术语“未修饰VEGF-A”还涵盖其变体和/或同源物，以及VEGF-A的片段，前提是变体蛋白质（包括同等型）、同源物蛋白质和/或片段受到未修饰VEGF-A特异性抗体识别，诸如抗体克隆3C5，它可得自RELIATech GmbH，Wolfenbüttel，Germany。
[0187] 在本发明的语境中，“VEGFR2”指血管内皮生长因子受体2，以SEQ ID NO：2例示，在图9中显示（Swiss Prot登录号P35968，Gene ID（NCBI）：3791）。术语“VEGFR2”涵盖具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质及其同源物和同等型。在本发明的语境中，术语“VEGFR2”还涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO：2，或与其变体和/或同源物的氨基酸序列，以及该序列的片段具有至少85%、至少90%或至少95%同源性的蛋白质，前提是变体蛋白质（包括同等型）、同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种VEGFR2特异性抗体识别，诸如抗体克隆89115和89109，它们可得自R&D Systems。
[0188] 在本发明的语境中，“PLGF”指胎盘生长因子，以SEQ ID NO：3例示，在图10中显示（Swiss Prot登录号P49763，Gene ID（NCBI）：5228）。术语“PLGF”涵盖具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的蛋白质及其同源物和同等型。在本发明的语境中，术语“PLGF”还涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO：3，或与其变体和/或同源物的氨基酸序列，以及该序列的片段具有至少85%、至少90%或至少95%同源性的蛋白质，前提是变体蛋白质（包括同等型）、同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种PLGF特异性抗体识别，诸如抗体克隆2D6D5和6A11D2，它们可得自Roche Diagnostics GmbH。
[0189] 因而，本发明涵盖测定蛋白质，包括但不限于如本文中描述的氨基酸序列的表达水平。在此语境中，本发明涵盖检测VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的同源物、变体和同等型；所述同等型或变体可例如包含等位变体或剪接变体。还涵盖检测与如本文中描述的VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项或其片段同源，例如与氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或其片段具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的蛋白质。或者/另外，本发明涵盖检测由与编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或其片段、变体或同等型的核酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列或其片段编码的蛋白质的表达水平。在此语境中，术语“变体”表示VEGFA、VEGFR2和/或PLGF氨基酸序列或编码所述氨基酸序列的核酸序列因突变，例如删除、添加、替代、插入等而不同于由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3鉴别的和/或在上文所述Swiss Prot登录号下可得的独特序列。另外，术语“同源物”指与一种或多种SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示多肽或其片段具有至少60%、更优选至少80%和最优选至少90%序列同一性的分子。
[0190] 为了测定一种氨基酸或核酸序列与如本文中描述的氨基酸或核酸序列是否具有某种程度的同一性，技术人员可使用本领域公知的手段和方法，例如比对，或是手工或是通过使用本领域已知的或本文中描述的计算机程序。
[0191] 依照本发明，术语“相同”或“百分比同一性”在两种或更多种氨基酸或核酸序列的语境中指如使用本领域已知的序列比较算法或通过手工比对和目视检查测量的，在比较窗口上或在指定区域上为最大对应进行比较和比对时，两种或更多种序列或亚序列相同，或规定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同（例如与例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3氨基酸序列具有60%或65%同一性、优选70-95%同一性、更优选至少95%同一性）。认为具有例如60%至95%或更大序列同一性的序列是基本相同的。此类定义也适用于测试序列的互补物。优选地，所描述的同一性在长度为至少约15至25个氨基酸或核苷酸的区域上、更优选在长度为约50至100个氨基酸或核苷酸的区域上存在。本领域技术人员会知道如何测定序列之间的百分比同一性，例如使用诸如那些基于CLUSTALW计算机程序（Thompson，Nucl.Acids Res.2（1994），4673-4680）或FASTDB（Brutlag，Comp.App.Biosci.6（1990），237-245）的算法，如本领域已知的。
[0192] 虽然FASTDB算法通常不考虑序列中的内部不匹配删除或添加，即缺口，但是在它的计算中，这可以手工修正以避免过高估算%同一性。然而，CLUSTALW在它的同一性计算中确实考虑序列缺口。本领域技术人员还可得到BLAST（基本局部算法搜索工具）和BLAST2.0算 法（Altschul，1997，Nucl.Acids Res.25：3389-3402；Altschul，1993J.Mol.Evol.36：290-300；Altschul，1990，J.Mol.Biol.215：403-410）。作为缺省，用于核酸序列的BLASTN程序使用词长（W）11、预期（E）10、M=5、N=4和双链比较。对于氨基酸序列，作为缺省，BLASTP程序使用词长（W）3和预期（E）10。BLOSUM62评分矩阵（Henikoff（1989）PNAS89：10915）使用比对（b）50、预期（E）10、M=5、N=4和双链比较。
[0193] 如上文讨论的，BLAST算法生成氨基酸和核苷酸序列二者的比对以测定序列相似性。由于比对的局部性质，BLAST在测定精确匹配中或在鉴定相似序列中尤其有用。BLAST算法输出的基础单元是高评分区段对（HSP）。HSP由任意但相等长度的两个序列片段组成，它们的比对是局部最大的且它们的比对得分达到或超出由使用者设置的阈或截留得分。BLAST办法寻找查询序列和数据库序列之间的HSP以评估找到的任何匹配的统计学显著性，而且只报告那些满足使用者选择的显著性阈的匹配。参数E为报告数据库序列匹配建立统计学显著的阈。E解读为HSP（或一组HSP）在整个数据库搜索的范围内的机会发生的期望频率的上界。在程序输出中报告其匹配满足E的任何数据库序列。
[0194] 可以用使用BLAST的类似计算机技术来搜索蛋白质或核酸数据库诸如GenBank或EMBL中的相同或相关分子。这种分析比多种基于膜的杂交快得多。另外，可以修改计算机搜索的灵敏度来确定任何特定匹配是否归类为精确或相似。搜索的基础是一个乘积得分，其定义如下：
[0195]
[0196] 且考虑两种序列之间的相似性程度和序列匹配的长度二者。例如，对于乘积得分40，匹配在1-2%误差内会是精确的；而对于70，匹配会是精确的。相似分子通常通过选择那些显示乘积得分介于15和40之间的来鉴定，尽管更低的得分可鉴定相关分子。能够生成序列比对的程序的另一个例子是CLUSTALW计算机程序（Thompson，1994，Nucl.Acids Res.2：
4673-4680）或FASTDB（Brutlag，1990，Comp.App.Biosci.6：237-245），如本领域已知的。
4673-4680）或FASTDB（Brutlag，1990，Comp.App.Biosci.6：237-245），如本领域已知的。
[0197] 在本文所述发明的语境中，VEGFA、VEGFR2和/或PLGF的表达水平，特别是蛋白质表达水平可作为单独的标志物分开考虑，或者作为表达概况或标志物组以两项或更多项的组考虑。在本文所述发明的语境中，表达概况或标志物组（其中两种或更多种标志物的表达概况可以一起考虑）也可以称作组合表达水平。例如，两种或更多种标志物的表达水平可以添加到一起及与相似测定的对照组合表达水平比较。因此，本发明的方法涵盖基于一种或多种标志物的表达水平测定表达概况，包括组合表达水平。
[0198] 在本文所述发明的语境中及依照所附示例性实施例，对于分开考虑VEGFA、VEGFR2或PLGF，使用下述值作为标志物的相应高或低表达值：高VEGFA（≥152.9pg/ml），低VEGFA（<152.9pg/ml），高VEGFR2（≥9.9ng/ml），低VEGFR2（<9.9ng/ml）。这些水平是按照预先确定的统计分析计划由可得样品的中值确定的。另外，构成特定标志物的高和低表达之间截留值的经过优化的水平可以通过改变截留直至高于和低于截留的患者子集满足有关统计学最优性标准来确定。例如，可以选择最佳割点，使得高于和低于的子集之间的治疗危害比差异最大化，或使得一个子集中的治疗效果最大化，或任何其它有关统计学标准。依照本文所述发明及依照所附示例性实施例，分开考虑PLGF的经过优化的表达值为高PLGF（≥36.5pg/ml）和低PLGF（<36.5pg/ml）。这种水平是作为可得数据的第42百分位而确定的。确定这种水平是为了提高高和低水平之间治疗效果的统计学差异。然而，技术人员会理解特定标志物的表达水平和因此构成高或低表达水平的表达水平可以随患者和随患者群体而变化。因而，技术人员会理解在使用所附示例性实施例中所述以外的检测方法及研究所附示例性实施例中所述以外的患者和患者群体时，技术人员考虑的特定生物标志物的高和/或低表达水平可以不同于本文中描述的值。鉴于本文中描述的方法，技术人员能确定什么构成特定生物标志物的高和/或低表达水平。
[0199] 正如技术人员会领会的，有多种方式使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。在一种相当简单但常常有效的办法中，如果样品对于至少一种调查标志物呈阳性，那么假定为阳性结果。
[0200] 然而，也可以评估标志物组合。可以数学组合为标志物组的标志物，例如对VEGFA和VEGFR2、或VEGFA和PLGF、或VEGFA、VEGFR2和PLGF测量的值（或组合表达水平），并将组合值与潜在的诊断问题关联起来。标志物值可以通过任何适宜现有技术数学方法来组合。用于将标志物组合与疾病或与治疗效果关联起来的公知数学方法采用像判别分析（DA）（即线性、二次、规则DA）、Kernel方法（即SVM）、非参数方法（即k-最近邻居分类器）、PLS（部分最小二乘）、基于树的方法（即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法）、广义线性模型（即对数回归）、基于主分量的方法（即SIMCA）、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法的方法。技术人员选择适宜方法来评估本发明的标志物组合不会有问题。将依照本文中公开的本发明的标志物组合与例如改善的总体存活、无进展存活、对将贝伐单抗添加至化疗剂/化疗方案的响应性或敏感性和/或预测对（添加至一种或多种化疗剂/化疗方案的）贝伐单抗的响应或敏感性关联起来中使用的方法选自DA（即线性、二次、规则判别分析）、Kernel方法（即SVM）、非参数方法（即k-最近邻居分类器）、PLS（部分最小二乘）、基于树的方法（即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法）、或广义线性模型（即对数回归）。涉及这些统计方法的详情见下述参考文献：Ruczinski，I.等，J.of Computational and Graphical Statistics，12（2003）475-511；Friedman，J.H.，J.of the American Statistical Association84（1989）165-175；Hastie，Trevor，Tibshirani，Robert，Friedman，Jerome，The Elements of Statistical Learning，Springer Series in Statistics，2001；Breiman，L.，Friedman，J.H.，Olshen，R.A.，Stone，C.J.（1984）Classification and regression trees，California：Wadsworth；Breiman，L.，Random Forests，Machine Learning，45（2001）5-32；Pepe，M.S.，The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction，Oxford Statistical Science Series，28（2003）；及Duda，R.O.，Hart，P.E.，Stork，D.G.，Pattern Classification，Wiley Interscience，2nd Edition（2001）。
[0201] 因而，本文中公开的本发明涉及经过优化的多变量截留用于生物学标志物的潜在组合及区分状态A与状态B，例如对将贝伐单抗添加至化疗方案响应或敏感的患者与作为将贝伐单抗疗法添加至化疗方案的较差响应者的患者的用途。在这类分析中，标志物不再是独立的，而是形成标志物组或组合表达水平。
[0202] 因此，本发明涉及通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，其通过测定VEGFA、PLGF和VEGFR2中两项或更多项的表达水平，通过叠加这些表达水平使得每一个表达水平乘以权函数（或加权因子）来进行。令人惊讶地，结果（“值”，数学运算的结果，或组合表达水平）与施用与化疗方案组合的贝伐单抗的患者中的治疗效果有关，使得高于预先规定的（多变量）截留的值指示患者的治疗效果较好，而低于此截留的值指示治疗效果较差。
[0203] 因而，本发明涉及通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有癌症，特别是转移性胰腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，其通过测定VEGFA和VEGFR2的表达水平，及通过叠加这些表达水平使得每一个表达水平乘以权函数（或加权因子）来进行。令人惊讶地，结果（“值”，数学运算的结果，或组合表达水平）与施用与化疗方案组合的贝伐单抗的患者中的治疗效果有关，使得高于预先规定的（多变量）截留的值指示患者的治疗效果较好，而低于此截留的值指示治疗效果较差。
[0204] 本发明还涉及通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有癌症，特别是转移性胰腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，其通过测定VEGFA和PLGF的表达水平，及通过叠加这些表达水平使得每一个表达水平乘以权函数（或加权因子）来进行。令人惊讶地，结果（“值”，数学运算的结果，或组合表达水平）与施用与化疗方案组合的贝伐单抗的患者中的治疗效果有关，使得高于预先规定的（多变量）截留的值指示患者的治疗效果较好，而低于此截留的值指示治疗效果较差。
[0205] 本发明涉及通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有癌症，特别是转移性胰腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，其通过测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的表达水平，及通过叠加这些表达水平使得每一个表达水平乘以权函数（或加权因子）来进行。令人惊讶地，结果（“值”，数学运算的结果，或组合表达水平）与施用与化疗方案组合的贝伐单抗的患者中的治疗效果有关，使得高于预先规定的（多变量）截留的值指示患者的治疗效果较好，而低于此截留的值指示治疗效果较差。
[0206] 例如，正如所附示例性实施例中显示的，当治疗效果为患有转移性胰腺癌的患者中的总体存活时，下述方程式可用于评估VEGFA和VEGFR2或VEGFA和PLGF的组合表达水平。
[0207] 公式1：norm（VEGFA）+1.3*norm（VEGFR2）。割点= 中值或0
[0208] 等效公式：VEGFA+3.3*VEGFR2。割点= 中值或0
[0209] 和
[0210] 公式2：0.25*norm（VEGFA）+0.21*norm（PLGF），割点= 中值或0
[0211] 等效公式：0.19*VEGFA+0.67*PLGF，割点= 中值或4.8
[0212] 其中我们使用log2变换和
[0213]
[0214] 因而，在本文所述发明的语境中及依照所附示例性实施例，关于总体存活，VEGFA和VEGFR2的高组合表达水平为（公式1≥-0.1）而VEGFA和VEGFR2的低组合表达为（公式1<-0.1）。在本文所述发明的语境中及依照所附示例性实施例，关于总体存活，VEGFA和PLGF的高组合表达水平为（公式2≥-0.042）而VEGFA和PLGF的低组合表达为（公式2<-0.042）。然而，技术人员会理解，可以数学组合为标志物组的标志物，例如对VEGFA和VEGFR2或VEGFA和PLGF测量的表达水平（或组合表达水平），而且可以以超过一种方式将组合表达水平与潜在的诊断问题关联起来。因而，标志物水平可以通过任何适宜现有技术数学方法来组合。
[0215] 正如所附示例性实施例中亦显示的，当治疗效果为患有转移性胰腺癌的患者中的无进展存活时，下述方程式可用于评估VEGFA和VEGFR2或VEGFA和PLGF的组合表达水平。
[0216] 公式1：norm（VEGFA）+1.3*norm（VEGFR2）。割点= 中值或0
[0217] 等效公式：VEGFA+3.3*VEGFR2。割点= 中值或0
[0218] 和
[0219] 公式2：0.25*norm（VEGFA）+0.21*norm（PLGF），割点= 中值或0
[0220] 等效公式：0.19*VEGFA+0.67*PLGF，割点= 中值或4.8
[0221] 其中我们使用log2变换和
[0222]
[0223] 因而，在本文所述发明的语境中及依照所附示例性实施例，关于无进展存活，VEGFA和VEGFR2的高组合表达水平（公式1≥-0.1）而VEGFA和VEGFR2的低组合表达为（公式1<-0.1）。在本文所述发明的语境中及依照所附示例性实施例，关于无进展存活，VEGFA和PLGF的高组合表达水平为（公式2≥-0.042）而VEGFA和PLGF的低组合表达为（公式2<-0.042）。然而，技术人员会理解，可以数学组合为标志物组的标志物，例如对VEGFA和VEGFR2或VEGFA和PLGF测量的表达水平（或组合表达水平），而且可以以超过一种方式将组合表达水平与潜在的诊断问题关联起来。因而，标志物水平可以通过任何适宜现有技术数学方法来组合。
[0224] 例如，正如所附示例性实施例中显示的，当治疗效果为患有转移性胰腺癌的患者中的总体存活或无进展存活时，下述方程式可用于评估VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平。
[0225] 公式3：0.0127*ln（PLGF+1）+0.144*ln（VEGFR2+1）+0.0949*ln（VEGFA+1）[0226] 其中ln= 以e为底的log
[0227] 因而，在本文所述发明的语境中及依照所附示例性实施例，关于总体存活，VEGFA、VEGFR2和PLGF的高组合表达水平为（公式3≥0.837）而VEGFA、VEGFR2和PLGF的低组合表达为（公式3<0.837）。在本文所述发明的语境中及依照所附示例性实施例，关于无进展存活，VEGFA、VEGFR2和PLGF的高组合表达水平为（公式3≥0.837）而VEGFA、VEGFR2和PLGF的低组合表达为（公式3<0.837）。然而，技术人员会理解，可以数学组合为标志物组的标志物，例如对VEGFA、VEGFR2和PLGF测量的表达水平（或组合表达水平），而且可以以超过一种方式将组合表达水平与潜在的诊断问题关联起来。因而，标志物水平可以通过任何适宜现有技术数学方法来组合。
[0228] 标志物VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平可通过本领域已知的适合于测定患者样品中特定蛋白质水平的任何方法来评估，而且优选通过采用对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项特异性的抗体的免疫测定法方法，诸如ELISA来测定。此类方法是本领域公知的且常规执行的，而且相应商业性抗体和/或试剂盒易于获得。例如，用于VEGFA、VEGFR2和PLGF的商业性抗体/测试试剂盒可分别得自Bender RELIATech和R&D Systems，如克隆3C5和26503，得自R&D systems，如克隆89115和89109及得自Roche Diagnostics GmbH，如克隆2D6D5和6A11D2。优选地，本发明的标志物/指示物蛋白质的表达水平使用抗体或试剂盒制造商的试剂和/或方案推荐来评估。技术人员也会知道用于通过免疫测定法方法测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平的别的手段。因此，本发明的一种或多种标志物/指示物的表达水平可以由本领域技术人员常规且可再现地测定，没有过度负担。然而，为了确保精确且可再现的结果，本发明还涵盖在能确保确立测试规程的专业化实验室中测试患者样品。
[0229] VEGF121和VEGF110蛋白质可使用本领域已知的任何方法来检测。例如，可以使用Western、ELISA、等对来自哺乳动物的组织或细胞样品方便地测定例如蛋白质。可得到多份参考文献来提供应用上述技术的指导（Kohler等，Hybridoma Techniques（Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1980）；Tijssen，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays（Elsevier，Amsterdam，1985）；Campbell，Monoclonal Antibody Technology（Elsevier，Amsterdam，1984）；Hurrell，Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications（CRC Press，Boca Raton，FL，1982）；及Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158（CRC Press，Inc.，1987））。
[0230] 如果提及VEGF121和VEGF110的检测或水平的话，这表示测量这两种分子的和，例如使用检测VEGF121和VEGF110二者的测定法。检测VEGF121和VEGF110这两种分子的测定法包括例如对相应其它形式（即在VEGF110得到更好识别的情况中对VEGF121，或在VEGF121得到更好识别的情况中对VEGF110）具有至少25%灵敏度的测定法。在某些实施方案中，测定法对相应其它形式具有至少50%、75%、80%、85%、90%或以上的灵敏度。在一个实施方案中，以本质上相同的灵敏度测量VEGF121和VEGF110二者。
[0231] 至于VEGF121和VEGF110蛋白质的检测，可得到多种测定法。例如，可以将样品与同更长天然存在VEGF-A同等型VEGF165和VEGF189相比优先或特异性结合短VEGF-A同等型VEGF121和VEGF110的抗体或抗体组合（例如在夹心式测定法中）接触。优选地，以与更长同等型相比要高至少3倍的灵敏度检测短同等型。如果使用短同等型（根据SDS-PAGE和通过OD280nm测定的浓度，纯度至少90%）建立标准曲线且对于长同等型，在预先确定的浓度（根据SDS-PAGE和通过OD280nm测定的浓度，纯度至少90%）使用相同的试剂和相同的标准曲线，标准曲线的值读数只有预期浓度的三分之一或更小，那么承认灵敏度要高至少3倍。还优选对短同等型的灵敏度与长同等型相比，尤其是与VEGF165相比要高至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍。
[0232] 在一个实施方案中，特异性检测短同等型VEGF121和VEGF110二者。此类特异性检测是可能的，例如，如果使用和采用分别结合通过连接VEGF121中外显子4和8生成的序列或VEGF110的游离C端的抗体，尤其是单克隆抗体的话。此类VEGF110抗C端抗体不结合包含氨基酸110作为更长多肽链一部分的任何VEGF-A同等型或例如在氨基酸109处结束的更短VEGF-A片段。结合通过连接VEGF121中外显子4和8生成的序列的单克隆抗体不会结合更长VEGF同等型165和189中包含的氨基酸序列，因为其中因连接外显子4和外显子7及外显子4和外显子5而存在其它氨基酸序列（参见Ferrara，N.，Mol.Biol.of the Cell21（2010）687-690）。如果所使用的抗体对更短片段展现小于10%的交叉反应性及对那些不具有游离C端氨基酸110的VEGF-A同等型（在抗VEGF110抗体的情况中）或那些不包含通过连接外显子4和8生成的序列的同等型（在抗VEGF121抗体的情况中）展现小于10%的交叉反应性，那么承认上述意义的特异性结合。还优选对于更短片段和不具有游离C端氨基酸110的或不具有通过连接外显子4和8生成的序列的VEGF同等型二者，交叉反应性会小于
5%、4%、3%、2%和1%。
5%、4%、3%、2%和1%。
[0233] 只结合短VEGF同等型VEGF121或VEGF110的适宜特异性抗体可依照标准规程来获得。通常，会合成呈现或包含VEGF110最C端至少4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸的肽或呈现或包含VEGF121氨基酸115C端和N端至少5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸的肽，任选与载体偶联，并用于免疫接种。特异性多克隆抗体可通过适宜免疫吸附步骤来获得。可以容易地对单克隆抗体筛选与VEGF121或VEGF110的反应性及适宜的低交叉反应性。在VEGF110特异性抗体方面的低交叉反应性可以对VEGF110的更短片段（例如缺失VEGF110的C端氨基酸）和不具有VEGF110游离C端氨基酸的VEGF-A同等型二者来评估。在VEGF121特异性抗体方面的低交叉反应性可以使用含有连接外显子4和外显子7及连接外显子4和外显子5时形成的氨基酸序列的VEGF-同等型来评估。
[0234] VEGF111蛋白质或核酸可使用本领域已知的任何方法来检测。例如，可以对来自哺乳动物的组织或细胞样品方便地测定例如蛋白质（使用Western、ELISA）、来自感兴趣遗传生物标志物的mRNA或DNA（使用Northern、点印迹、或聚合酶链式反应（PCR）分析、阵列杂交、RNA酶保护测定法、或使用DNA SNP芯片微阵列，它们是商品化的，包括DNA微阵列快照）。例如，实时PCR（RT-PCR）测定法诸如定量PCR测定法是本领域公知的。在本发明的一个示例性实施方案中，一种用于检测生物学样品中来自感兴趣遗传生物标志物的mRNA的方法包括使用至少一种引物通过逆转录自样品生成cDNA；扩增如此生成的cDNA；并检测扩增cDNA的存在。另外，此类方法可包括一个或多个容许测定生物学样品中mRNA水平的步骤（例如通过同时检查“持家”基因诸如肌动蛋白家族成员的比较性对照mRNA序列的水平）。任选地，可测定扩增cDNA的序列。
[0235] 可得到多份参考文献来提供应用上述技术的指导（Kohler等，Hybridoma Techniques（Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1980）；Tijssen，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays（Elsevier，Amsterdam，1985）；Campbell，Monoclonal Antibody Technology（Elsevier，Amsterdam，1984）；Hurrell，Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications（CRC Press，Boca Raton，FL，1982）；及Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158（CRC Press，Inc.，1987）。
[0236] 至于VEGF111蛋白质的检测，可得到多种测定法。例如，可以将样品与同更长天然存在VEGF-A同等型VEGF165和VEGF189相比优先或特异性结合VEGF111的抗体或抗体组合（例如在夹心式测定法中）接触。优选地，以与更长同等型相比要高至少3倍的灵敏度检测短同等型VEGF111。如果使用短同等型（根据SDS-PAGE和通过OD280nm测定的浓度，纯度至少90%）建立标准曲线且对于长同等型，在预先确定的浓度（根据SDS-PAGE和通过OD280nm测定的浓度，纯度至少90%）使用相同的试剂和相同的标准曲线，标准曲线的值读数只有预期浓度的三分之一或更小，那么承认灵敏度要高至少3倍。还优选对短同等型的灵敏度与长同等型相比要高至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍。
[0237] 在一个实施方案中，特异性检测同等型VEGF111。此类特异性检测是可能的，例如，如果使用和采用结合VEGF111独特的外显子连接的抗体，尤其是单克隆抗体的话。此类抗体不结合不包含这种特定外显子连接的其它VEGF-A同等型或其切割产物。如果所使用的抗体对不具有这种独特外显子连接的其它VEGF-A同等型，像VEGF121或VEGF165展现小于10%的交叉反应性，那么承认上述意义的特异性结合。还优选对于例如VEGF121，交叉反应性会小于5%、4%、3%、2%和1%。
[0238] 在一个实施方案中，对VEGF111的特异性通过使用相同试剂比较VEGF111（根据SDS-PAGE和通过OD280nm测定的浓度，纯度至少90%）和VEGF121（根据SDS-PAGE和通过OD280nm测定的浓度，纯度至少90%）来评估。如果在这项比较中对VEGF121材料获得的信号只有用VEGF111材料获得的信号的十分之一或更小，那么针对VEGF121的交叉反应性小于10%。正如技术人员会领会的，优选在产生VEGF111最大信号约50%的浓度处读取VEGF121信号。
[0239] 只结合短VEGF同等型VEGF111的适宜特异性抗体可依照标准规程来获得。通常，会合成呈现或包含VEGF111氨基酸105C端和N端氨基酸的肽，任选与载体偶联，并用于免疫接种。优选地，此类肽会是长至少六个氨基酸且至少包含VEGF111氨基酸105和106。还优选它会至少包含VEGF111氨基酸104、105、106和107。正如技术人员会领会的，包含例如VEGF111氨基酸105和106之间外显子连接N和C端3或更多个氨基酸的更长肽也可用于获得特异性结合VEGF111的抗体。
[0240] 未修饰VEGF蛋白质可使用本领域已知的任何适宜方法来检测。优选地，会使用至少具有与经修饰VEGF相比，对未修饰VEGF的优先结合特性的抗体，如MAB3C5，它可购自RELIATech GmbH，Wolfenbüttel，Germany。例如，可以使用Western、ELISA、等对来自哺乳动物的组织或细胞样品方便地测定未修饰VEGF蛋白质。可得到多份参考文献来提供应用上述技术的指导（Kohler等，Hybridoma Techniques（Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1980）；Tijssen，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays（Elsevier，Amsterdam，1985）；Campbell，Monoclonal Antibody Technology（Elsevier，Amsterdam，1984）；Hurrell，Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications（CRC Press，Boca Raton，FL，1982）；及Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158（CRC Press，Inc.，1987））。
[0241] 如果提及未修饰VEGF的检测或水平，这表示测量未修饰VEGF分子（同等型或切割产物），如例如MAB3C5结合的。
[0242] 至于未修饰VEGF蛋白质的检测，可得到多种测定法。例如，可以将样品与同经修饰VEGF（例如如患者的样品中天然存在的）相比优先或特异性结合未修饰VEGF的抗体或抗体组合（例如在夹心式测定法中）接触。优选地，使用特异性结合未修饰VEGF的抗体，即用对未修饰VEGF165的灵敏度与经修饰VEGF165相比要高至少3倍抗体来检测未修饰VEGF。此类对未修饰VEGF高至少3倍的灵敏度通过使用相同试剂比较在大肠杆菌中重组生成的VEGF165（根据SDS-PAGE和通过OD280nm测定的浓度，纯度至少90%）和在HEK细胞中重组生成的VEGF165（根据SDS-PAGE和通过OD280nm测定的浓度，纯度至少90%）来评估。如果在这项比较中对HEK生成的材料获得信号只有用大肠杆菌衍生的材料获得的信号的十分之一或更小，那么以高至少3倍的灵敏度检测未修饰VEGF。正如技术人员会领会的，优选在最大信号约50%处读取信号。优选地，在这项评估中，使用实施例5的测定法。还优选特异性结合未修饰VEGF（来自大肠杆菌的VEGF165）的抗体是与经修饰VEGF材料（来自HEK细胞的VEGF165）相比以高至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的灵敏度检测未修饰VEGF的抗体。
[0243] 在一个实施方案中，使用至少具有与经修饰VEGF相比，对未修饰VEGF的相同结合偏好的抗体，如商品化MAB3C5来特异性检测未修饰的VEGF。在一个实施方案中，在夹心式免疫测定法中评估抗体对未修饰VEGF的相对灵敏度或优先结合，其中使用针对未修饰VEGF的抗体作为捕捉抗体并使用结合在所有主要VEGF-同等型或切割产物上存在的表位的检测抗体。在一个实施方案中，检测抗体会结合在MAB3C5的表位以外的表位，即它不会结合跨越VEGF氨基酸33至43的合成肽中包含的表位。优选地，检测抗体会结合范围1至32、44至105的氨基酸中包含的表位、成熟VEGF165的最后六个氨基酸、或与MAB3C5结合的表位不交叠的构象表位。在一个实施方案中，与经修饰VEGF相比特异性结合未修饰VEGF165的抗体具有结合跨越VEGF氨基酸33至43的合成肽中包含的表位的特性。
[0244] 特异性结合未修饰VEGF的适宜特异性抗体可依照标准规程来获得。通常，会使用在大肠杆菌中重组生成的或合成（例如通过固相多肽合成）获得的VEGF同等型或呈现或包含在大肠杆菌中重组生成的或合成（例如通过固相多肽合成）获得的VEGF的表位的肽作为免疫原。单克隆抗体可依照标准规程容易地生成，并筛选与未修饰VEGF的反应性及与经修饰VEGF的适宜低交叉反应性。一种方便且优选的筛选方法基于使用在大肠杆菌中重组生成的VEGF165（根据SDS-PAGE和通过OD280nm测定的浓度，纯度至少90%）和在HEK细胞中重组生成的VEGF165（根据SDS-PAGE和通过OD280nm测定的浓度，纯度至少90%）。
[0245] 可以评估作为生物学样品的患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平。患者样品可以是血液样品、血清样品或血浆样品。在一个实施方案中，样品是EDTA-血浆。在一个实施方案中，样品是柠檬酸盐-血浆。获得血液样品、血清样品和血浆样品的方法是本领域公知的。患者样品可以在新辅助疗法之前或之后或在辅助疗法之前或之后得自患者。
[0246] 在本发明的语境中，贝伐单抗要添加至作为本领域已知的标准化疗方案的一部分施用的一种或多种化疗剂或与作为本领域已知的标准化疗方案的一部分施用的一种或多种化疗剂一起作为共同疗法或共同治疗施用。此类标准化疗方案中包括的药剂的例子包括5-氟尿嘧啶、亚叶酸、伊利替康（irinotecan）、吉西他滨、厄洛替尼、卡培他滨（capecitabine）、紫杉烷（taxane）诸如多西他赛（docetaxel）和帕利他赛（paclitaxel）、干扰素阿尔法、长春瑞滨（vinorelbine）、和基于铂的化疗剂诸如卡铂（carboplatin）、顺铂（cisplatin）和奥沙利铂（oxaliplatin）。如所附示例性实施例中证明的，将贝伐单抗添加至吉西他滨-厄洛替尼疗法实现了依照VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平定义和选择的患者和/或患者群体中总体存活和/或无进展存活的延长。如此，贝伐单抗可以与化疗方案，诸如吉西他滨-厄洛替尼疗法组合，如所附示例性实施例中证明的。
[0247] 常用施用模式包括胃肠外施用如推注或如设定时间段里的输注，例如在10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟、120分钟、3小时、4小时、5小时或6小时里施用总的日剂量。例如，可以根据所治疗的癌症的类型每周、每2周或每3周施用2.5mg/kg体重至15mg/kg体重贝伐单抗 。剂量的例子包括每
周、每2周或每3周给予2.5mg/kg体重、5mg/kg体重、7.5mg/kg体重、10mg/kg体重和15mg/kg体重。剂量的其它例子是5mg/kg体重每2周、每2周10mg/kg体重、每3周7.5mg/kg体重和每3周15mg/kg体重。对于治疗胰腺癌，特别是转移性胰腺癌，剂量包括每2周5mg/kg体重、每2周10mg/kg、每3周7.5mg/kg体重和每3周15mg/kg体重。技术人员会认识到，本发明涵盖由具体患者和化疗方案确定的贝伐单抗的其它施用模式，而且具体施用模式和治疗剂量由主治医师依照本领域已知的方法最佳确定的。
周、每2周或每3周给予2.5mg/kg体重、5mg/kg体重、7.5mg/kg体重、10mg/kg体重和15mg/kg体重。剂量的其它例子是5mg/kg体重每2周、每2周10mg/kg体重、每3周7.5mg/kg体重和每3周15mg/kg体重。对于治疗胰腺癌，特别是转移性胰腺癌，剂量包括每2周5mg/kg体重、每2周10mg/kg、每3周7.5mg/kg体重和每3周15mg/kg体重。技术人员会认识到，本发明涵盖由具体患者和化疗方案确定的贝伐单抗的其它施用模式，而且具体施用模式和治疗剂量由主治医师依照本领域已知的方法最佳确定的。
[0248] 依照本发明的方法选择的患者用与化疗方案组合的贝伐单抗来治疗，而且可以进一步用一种或多种别的抗癌疗法来治疗。在某些方面，该一种或多种别的抗癌疗法为放射。
[0249] 本发明还涉及一种诊断组合物或试剂盒，其包含适合于测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平的寡核苷酸或多肽。如本文中详述的，寡核苷酸（诸如DNA、RNA或DNA和RNA的混合物）探针可用于检测标志物/指示物蛋白质的mRNA水平，而多肽可用于经特异性蛋白质-蛋白质相互作用间接检测标志物/指示物蛋白质的蛋白质水平。在本发明的优选方面，作为用于VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平的探针涵盖的且本文中描述的试剂盒或诊断组合物中包括的多肽是对这些蛋白质特异性的或对其同源物和/或截短物特异性的抗体。
[0250] 因而，在本发明的又一个实施方案中，提供一种对于进行本文中描述的方法有用的试剂盒，其包含能够测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平的寡核苷酸或多肽。寡核苷酸可包含对编码一种或多种本文中描述的标志物/指示物的mRNA特异性的引物和/或探针，而多肽包含能够与标志物/指示物蛋白质特异性相互作用的蛋白质，例如标志物/指示物特异性抗体或抗体片段。
[0251] 因而，本发明涉及供患有胰腺癌的患者的改良化疗方案中使用的贝伐单抗，其中测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，由此对VEGFA VEGFR2和PLGF中一项或多项的水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照水平升高的患者施用添加至化疗方案的贝伐单抗。
[0252] 加以必要的变更后可以应用下述类似用途。
[0253] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有胰腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的用途，包括下述步骤：
[0254] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平；并
[0255] (b)对VEGFA VEGFR2和PLGF中一项或多项的水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0256] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。该化疗方案可以是吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0257] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有胰腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的用途，包括下述步骤：
[0258] (a)自所述患者获得样品；
[0259] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平；并
[0260] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0261] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。该化疗方案可以是吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0262] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0263] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平；并
[0264] (b)对VEGFA VEGFR2和PLGF中一项或多项的水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0265] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。该化疗方案可以是吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0266] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0267] (a)自所述患者获得样品；
[0268] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平；并
[0269] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0270] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。该化疗方案可以是吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0271] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0272] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平；并
[0273] (b)对VEGFA VEGFR2和PLGF中一项或多项的水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0274] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。该化疗方案可以是吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0275] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0276] (a)自所述患者获得样品；
[0277] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平；并
[0278] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0279] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。该化疗方案可以是吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0280] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0281] (a)测定患者样品中VEGFA或VEGFR2的表达水平；并
[0282] (b)对VEGFA或VEGFR2的水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0283] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。该化疗方案可以是吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0284] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0285] (a)自所述患者获得样品；
[0286] (b)测定VEGFA或VEGFR2的表达水平；并
[0287] (c)对VEGFA或VEGFR2的水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0288] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。该化疗方案可以是吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0289] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0290] (a)测定患者样品中VEGFA或PLGF的表达水平；并
[0291] (b)对VEGFA或PLGF的水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0292] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。该化疗方案可以是吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0293] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0294] (a)自所述患者获得样品；
[0295] (b)测定VEGFA或PLGF的表达水平；并
[0296] (c)对VEGFA或PLGF的水平相对于在诊断有胰腺癌的患者中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0297] 该胰腺癌可以是转移性胰腺癌。该化疗方案可以是吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0298] 本发明提供贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0299] (a)测定患者样品中VEGFA和VEGFR2的表达水平；并
[0300] (b)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0301] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0302] (a)自所述患者获得样品；
[0303] (b)测定VEGFA和VEGFR2的表达水平；并
[0304] (c)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0305] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0306] (a)测定患者样品中VEGFA和VEGFR2的表达水平；并
[0307] (b)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0308] 其中该化疗方案为吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0309] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0310] (a)自所述患者获得样品；
[0311] (b)测定VEGFA和VEGFR2的表达水平；并
[0312] (c)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0313] 其中该化疗方案为吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0314] 本发明提供贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0315] (a)测定患者样品中VEGFA和VEGFR2的表达水平；并
[0316] (b)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0317] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0318] (a)自所述患者获得样品；
[0319] (b)测定VEGFA和VEGFR2的表达水平；并
[0320] (c)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0321] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0322] (a)测定患者样品中VEGFA和VEGFR2的表达水平；并
[0323] (b)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0324] 其中该化疗方案为吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0325] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0326] (a)自所述患者获得样品；
[0327] (b)测定VEGFA和VEGFR2的表达水平；并
[0328] (c)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0329] 其中该化疗方案为吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0330] 本发明提供贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0331] (a)测定患者样品中VEGFA和PLGF的表达水平；并
[0332] (b)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0333] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0334] (a)自所述患者获得样品；
[0335] (b)测定VEGFA和PLGF的表达水平；并
[0336] (c)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0337] 本发明提供贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0338] (a)测定患者样品中VEGFA和PLGF的表达水平；并
[0339] (b)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0340] 其中该化疗方案为吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0341] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0342] (a)自所述患者获得样品；
[0343] (b)测定VEGFA和PLGF的表达水平；并
[0344] (c)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0345] 其中该化疗方案为吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0346] 本发明提供贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0347] (a)测定患者样品中VEGFA和PLGF的表达水平；并
[0348] (b)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0349] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0350] (a)自所述患者获得样品；
[0351] (b)测定VEGFA和PLGF的表达水平；并
[0352] (c)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0353] 本发明提供贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0354] (a)测定患者样品中VEGFA和PLGF的表达水平；并
[0355] (b)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0356] 其中该化疗方案为吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0357] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0358] (a)自所述患者获得样品；
[0359] (b)测定VEGFA和PLGF的表达水平；并
[0360] (c)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0361] 其中该化疗方案为吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0362] 本发明提供贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0363] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的表达水平；并
[0364] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0365] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0366] (a)自所述患者获得样品；
[0367] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的表达水平；并
[0368] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0369] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0370] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的表达水平；并
[0371] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0372] 其中该化疗方案为吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0373] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的总体存活的用途，包括下述步骤：
[0374] (a)自所述患者获得样品；
[0375] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的表达水平；并
[0376] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0377] 其中该化疗方案为吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0378] 本发明提供贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0379] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的表达水平；并
[0380] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0381] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0382] (a)自所述患者获得样品；
[0383] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的表达水平；并
[0384] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0385] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0386] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的表达水平；并
[0387] (b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0388] 其中该化疗方案为吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0389] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有转移性胰腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述步骤：
[0390] (a)自所述患者获得样品；
[0391] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的表达水平；并
[0392] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有转移性胰腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，
[0393] 其中该化疗方案为吉西他滨-厄洛替尼疗法。
[0394] 如所附示例性实施例中证明的，本发明解决所鉴别的技术问题，其在于它能令人惊讶地显示相对于在诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者中测定的对照水平，给定患者中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平与施用与吉西他滨-厄洛替尼化疗方案组合的贝伐单抗的患者中的治疗效果有关。如所附示例性实施例中显示的，令人惊讶地发现升高的VEGFA或VEGFR2的蛋白质表达水平与用贝伐单抗和吉西他滨-厄洛替尼化疗方案治疗的患有转移性胰腺癌的患者中与用安慰剂和吉西他滨-厄洛替尼化疗方案治疗的患者相比改善的总体存活有关（图2和3）。令人惊讶地发现升高的蛋白质VEGFA或PLGF的表达水平与用贝伐单抗和吉西他滨-厄洛替尼化疗方案治疗的患有转移性胰腺癌的患者中与用安慰剂和吉西他滨-厄洛替尼化疗治疗的患者相比改善的无进展存活有关（图2和4）。进一步令人惊讶地发现升高的VEGFA和VEGFR2的组合表达水平与用贝伐单抗和吉西他滨-厄洛替尼化疗方案治疗的患有转移性胰腺癌的患者中与用安慰剂和吉西他滨-厄洛替尼化疗方案治疗的患者相比改善的总体存活和无进展存活有关（图5和6）。还令人惊讶地发现升高的VEGFA和PLGF的组合表达水平与用贝伐单抗和吉西他滨-厄洛替尼化疗方案的患有转移性胰腺癌的患者中与用安慰剂和吉西他滨-厄洛替尼化疗方案治疗的患者相比改善的总体存活和无进展存活有关（图5和6）。进一步令人惊讶地发现升高的VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平与用贝伐单抗和吉西他滨-厄洛替尼化疗方案治疗的患有转移性胰腺癌的患者中与用安慰剂和吉西他滨-厄洛替尼化疗方案治疗的患者相比改善的总体存活和无进展存活有关（图7）。这些结果是特别令人惊讶的，原因在于当在来自一项在患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者中比较多西他赛疗法加贝伐单抗或安慰剂的研究的患者血浆样品中分析时，单独的这些标志物和这些标志物的上文所述组合显示出与总体存活无关。
[0395] 因此，本发明涉及一种预测患有、怀疑患有或倾向于患上胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者对将贝伐单抗添加至化疗方案的响应或敏感性的体外方法，包括测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，包括组合表达水平。因而，在本文所述方法的语境中，本发明提供特异性探针（包括例如结合分子，像抗体和适体）用于制备诊断组合物的用途，该诊断组合物用于预测患有、怀疑患有或倾向于患上胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者对将贝伐单抗添加至化疗方案的响应或敏感性，包括测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，包括组合表达水平。
[0396] 因此，本发明提供一种预测患有、怀疑患有或倾向于患上转移性胰腺癌的患者对将贝伐单抗添加至化疗方案的响应或敏感性的体外方法，包括测定患者样品中VEGFA和VEGFR2的组合表达水平。因而，在本文所述方法的语境中，本发明提供特异性探针（包括例如结合分子，像抗体和适体）用于制备诊断组合物的用途，该诊断组合物用于预测患有、怀疑患有或倾向于患上转移性胰腺癌的患者对将贝伐单抗添加至化疗方案的响应或敏感性，包括测定患者样品中VEGFA和VEGFR2的组合表达水平。
[0397] 本发明提供一种预测患有、怀疑患有或倾向于患上转移性胰腺癌的患者对将贝伐单抗添加至化疗方案的响应或敏感性的体外方法，包括测定患者样品中VEGFA和PLGF的组合表达水平。因而，在本文所述方法的语境中，本发明提供特异性探针（包括例如结合分子，像抗体和适体）用于制备诊断组合物的用途，该诊断组合物用于预测患有、怀疑患有或倾向于患上转移性胰腺癌的患者对将贝伐单抗添加至化疗方案的响应或敏感性，包括测定患者样品中VEGFA和PLGF的组合表达水平。
[0398] 本发明提供一种预测患有、怀疑患有或倾向于患上转移性胰腺癌的患者对将贝伐单抗添加至化疗方案的响应或敏感性的体外方法，包括测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平。因而，在本文所述方法的语境中，本发明提供特异性探针（包括例如结合分子，像抗体和适体）用于制备诊断组合物的用途，该诊断组合物用于预测患有、怀疑患有或倾向于患上转移性胰腺癌的患者对将贝伐单抗添加至化疗方案的响应或敏感性，包括测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平。
[0399] 短语“响应”在本发明的语境中指示患有、怀疑患有或倾向于患上胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的受试者/患者显示对包含添加贝伐单抗的化疗方案的响应。技术人员会容易地能够确定依照本发明的方法用贝伐单抗的人是否显示响应。例如，响应可以反映为来自转移性胰腺癌的痛苦减轻，诸如肿瘤生长降低和/或停止、肿瘤的尺寸缩小和/或癌症的一种或多种症状改善。优选地，响应可以反映为胰腺癌的转移性转化的指数诸如降低或减少，诸如预防转移形成或降低转移数目或尺寸（参见例如Eisenhauser等，New response evaluation criteria in solid tumours：Revised RECIST guideline（version1.1）Eur.J.Cancer200945：228-247）。
[0400] 短语“敏感”在本发明的语境中指示患有、怀疑患有或倾向于患上胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的受试者/患者以某种方式对与化疗方案组合的贝伐单抗的治疗显示阳性反应。患者的反应在与如上文描述的“响应”的患者相比时可以是不太明显的。例如，患者可以经历较少的与疾病有关的痛苦，尽管可能没有测量到肿瘤生长或转移性指示物的降低，和/或患者对与化疗方案组合的贝伐单抗的反应可以仅仅是瞬时性质的，即肿瘤和/或转移的生长可以仅仅是暂时降低或停止的。
[0401] 依照本发明的短语“患有……的患者”指显示胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的临床体征的患者。短语“怀疑患有”、“对……易感”、“倾向于患上”或“倾向于”在转移性胰腺癌的语境中指基于例如，可能的遗传素因、预先或最终暴露于危险的和/或致癌的化合物、或暴露于致癌性物理危险诸如辐射，患者中的适应症疾病。
[0402] 短语“化疗方案的治疗效果”在本发明的语境中涵盖术语“总体存活”和“无进展存活”。
[0403] 短语“总体存活”在本发明的语境中指治疗期间和之后患者存活的时间的长度。如技术人员会领会的，如果患者属于具有与另一患者亚群相比统计学显著更长的均值存活时间的患者亚群的话，患者的总体存活得到改善或增强。
[0404] 短语“无进展存活”在本发明的语境中指治疗期间和之后依照主治医师或调查人员的评估，患者的疾病没有恶化，即没有进展的时间的长度。如技术人员会领会的，如果患者经历与类似处境的患者的对照组的平均或均值无进展存活时间相比更长的疾病没有进展的时间长度的话，患者的无进展存活得到改善或增强。
[0405] 如本文中使用的，术语“施用”表示通过本领域已知的适合于施用治疗性抗体的任何手段对需要此类治疗或医学干预的患者施用血管发生抑制剂，例如贝伐单抗，和/或包含血管发生抑制剂，例如贝伐单抗 的药物组合物/治疗方案。非限制性施用路径包括通过口服、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、表面、皮内、鼻内或支气管内施用（例如如通过吸入实现的）。在本发明的语境中特别优选的是胃肠外施用，例如静脉内施用。
[0406] 术语“抗体”在本文中以最广义使用，而且包括但不限于单克隆和多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、嵌合抗体、CDR嫁接抗体、人源化抗体、骆驼化（camelized）抗体、单链抗体和抗体片段和片段构建物，例如F(ab’)2片段、Fab片段、Fv片段、单链Fv片段（scFv）、双特异性scFv、双抗体、单域抗体（dAb）和微型抗体（minibody），它们展现期望的生物学活性，特别是对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项或对其同源物、变体、片段和/或同等型的特异性结合。
[0407] 术语“适体”在本文中以最广义使用，而且包括但不限于寡核苷酸，包括RNA、DNA和RNA/DNA分子，或肽分子，它们展现期望的生物学活性，特别是对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项或对其同源物、变体、片段和/或同等型的特异性结合。
[0408] 如本文中使用的，“化疗方案”或“化疗剂”包括能提供抗癌治疗效果的任何活性剂，而且可以是化学药剂或生物学药剂，特别是能够干扰癌或肿瘤细胞的化学药剂或生物学药剂。优选的活性剂是那些起抗瘤（化学毒性或化学抑制性）药剂的作用的，其抑制或阻止恶性细胞形成、成熟或增殖。化疗方案或化疗剂的非限制性例子包括烷化剂类(alkylating agents)诸如氮芥类(nitrogen mustards)（例如双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil)）、亚硝脲类(nitrosoureas)（例如，卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、和司莫司汀(semustine)（甲基-CCNU））、乙撑亚胺类(ethylenimines)/甲基蜜胺类(methylmelamines)（例如三乙撑蜜胺(thriethylenemelamine)(TEM)、三乙烯(triethylene)、硫代磷酰胺(thiophosphoramide)（塞替派(thiotepa)）、六甲基蜜胺(hexamethylmelamine)（HMM，六甲蜜胺(altretamine)））、磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)（例如，白消安(busulfan)）、和三嗪(triazines)（例如，达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)）；抗代谢物类(antimetabolites)诸如叶酸类似物（例如甲氨蝶呤(methotrexate)、三甲曲沙(trimetrexate)）、嘧啶类似物（例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、氟脱氧尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)（AraC，阿糖胞苷(cytarabine)）、5-氮胞苷(azacytidine)、2,2’-二氟脱氧胞苷）、和嘌呤类似物（例如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、2’-脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)（喷司他丁(pentostatin)）、红羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine,EHNA)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、和2-氯脱氧腺苷（克拉屈滨(cladribine)，2-CdA））；自天然产物开发的抗有丝分裂药物（例如，帕利他赛(paclitaxel)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)（例如，长春碱(vinblastine,VLB)、长春新碱(vincristine)、和长春瑞滨(vinorelbine)）、多西他赛(docetaxel)、雌莫司汀(estramustine)、和磷酸雌莫司汀）、表鬼臼毒素类(epipodophylotoxins)（例如依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)）、抗生素（例如放射菌素(actimomycin)D、道诺霉素(daunomycin)（柔红霉素(rubidomycin)）、daunorubicon、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)（光神霉素(mithramycin)）、丝裂霉素(mitomycin)C、放线菌素(actinomycin)）、酶（例如L-门冬酰胺酶）、和生物反应修饰剂(biological response modifier)（例如干扰素-α、IL-2、G-CSF、GM-CSF）；混杂的药剂，包括铂配位复合物（例如顺铂、卡铂、奥沙利铂(oxaliplatin)）、蒽二酮类(anthracenediones)（例如米托蒽醌(mitoxantrone)）、取代的脲（即，羟基脲(hydroxyurea)）、甲基肼(methylhydrazine)衍生物（例如N-甲基肼(MIH)、丙卡巴肼(procarbazine)）、肾上腺皮质抑制剂（例如米托坦(mitotane)(o,p’-DDD)、氨鲁米特(aminoglutethimide)）；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂（例如泼尼松(prednisone)和等同物、地塞米松(dexamethasone)、氨鲁米特(aminoglutethimide)）、妊娠素(progestin)（例如己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)）、雌激素（例如己烯雌酚(diethylstilbestrol)、乙炔基雌二醇(ethinyl estradiol)及其等同物）；抗雌激素（例如他莫昔芬(tamoxifen)）、雄激素（例如丙酸睾酮(testosterone propionate)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)及其等同物）、抗雄激素（例如氟他胺(flutamide)、促性腺素释放素类似物、亮丙瑞林(leuprolide)）和非类固醇抗雄激素（例如氟他胺(flutamide)）、表皮生长因子抑制剂（例如厄洛替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼(gefitinib)）抗体（例如曲妥单抗(trastuzumab)）、依立替康(irinotecan)及其其它药剂诸如亚叶酸(leucovorin)。对于治疗胰腺癌，特别是转移性胰腺癌，供与贝伐单抗一起施用的化疗剂或化疗方案包括吉西他滨和厄洛替尼及其组合（还可见本文中提供的所附示例性实施例）。
[0409] 在本发明的语境中，提及氨基酸序列的“同源性”理解为指在本文中提供的SEQ ID NO限定的序列的全长上至少80%的序列同一性，特别是至少85%、至少90%或至少95%的同一性。在本发明的语境中，技术人员会理解同源性涵盖不同群体和民族中标志物/指示物蛋白质的别的等位变异。
[0410] 如本文中使用的，术语“多肽”涉及肽、蛋白质、寡肽或多肽，其涵盖给定长度的氨基酸链，其中氨基酸残基通过共价肽键而连接。然而，本发明还涵盖此类蛋白质/多肽的肽模拟物，其中氨基酸和/或肽键以功能性类似物，例如20种由基因编码的氨基酸之一以外的氨基酸残基，例如硒代半胱氨酸替换。肽、寡肽和蛋白质可以称作多肽。术语多肽和蛋白质在本文中可互换使用。术语多肽还指且不排除多肽的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。此类修饰在基础教科书中有充分描述，而且在专著中以及在多卷研究文献中有更为详细地描述。如本文中使用的，术语多肽还指且涵盖术语“抗体”。
[0411] 如本文中使用的，术语“治疗”和“处理”指疾病或其任何参数或症状的纠正、改善、严重性减轻、或时间过程的缩短。优选地，所述患者为人患者，而且要治疗的疾病为胰腺癌，特别是转移性胰腺癌。
[0412] 术语“评估”此类患者涉及测定一种或多种本文所述标志物/指示物蛋白质，包括VEGFA、VEGFR2和PLGF的表达水平，和/或相对于在诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者中建立的对照水平，基于此类标志物/指示物蛋白质的表达水平选择此类患者的方法。
[0413] 如本文中使用的，术语“表达水平”也可以指样品中本发明的标志物/指示物蛋白质的浓度或量。
[0414] 在上文所述方法之外，本发明还涵盖用于评估或测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平别的免疫测定方法，诸如通过Western印迹和基于ELISA的检测。如本领域理解的，本发明的标志物/指示物蛋白质的表达水平也可以在mRNA水平评估，通过本领域已知的任何合适方法，诸如Northern印迹、实时PCR和RT-PCR。基于免疫测定法和mRNA的检测方法和系统是本领域公知的，而且可以自标准教科书，诸如Lottspeich（Bioanalytik，Spektrum Akademisher Verlag，1998）或Sambrook和Russell（Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，U.S.A.，2001）推导。所述方法具体用于相对于在诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的群体中建立的对照水平，测定患者或患者组中VEGFA、VEGFR2和PLGF的表达水平。
[0415] VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平也可以利用免疫凝集、免疫沉淀（例如免疫扩散、免疫电泳、免疫固定）、Western印迹技术（例如（原位）免疫细胞化学、亲和层析、酶免疫测定法）、等等在蛋白质水平上测定。溶液中纯化的多肽的量也可以通过物理方法，例如光度法来测定。量化混合物中特定多肽的方法通常依赖于特异性结合，例如抗体的。利用抗体特异性的特异性检测和量化方法包括例如免疫测定法方法。例如，患者样品中本发明标志物/指示物蛋白质的浓度/量可以通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）来测定。或者，可实施Western印迹分析或免疫染色。Western印迹组合通过电泳分开蛋白质混合物和使用抗体特异性检测。电泳可以是多维的，诸如2D电泳。通常，将多肽在2D电泳中根据它们的表观分子量沿一维分开并根据它们的等电点延另一维分开。
[0416] 如上所述，依照本发明的标志物/指示物蛋白质的表达水平也可以反映为编码VEGFA、VEGFR2和/或PLGF的相应基因的表达升高。因此，可以对翻译（例如剪接、未剪接或部分剪接的mRNA）之前的基因产物实施定量评估以评估相应基因的表达。本领域技术人员知道要在此语境中使用的标准方法，或者可以自标准教科书（例如Sambrook，2001，见上文）推导这些方法。例如，关于编码VEGFA、VEGFR2和/或PLGF中一项或多项的mRNA的相应浓度/量的定量数据可以通过Northern印迹、实时PCR等等来获得。
[0417] 在本发明的又一个方面，可以有利地使用本发明的试剂盒来进行本发明的方法，而且可以在多种应用中，例如在诊断领域或作为研究工具等采用。本发明的试剂盒的各部分可以个别地在管形瓶中或组合地在容器或多容器单元中包装。优选地，试剂盒的制造遵循本领域技术人员知道的标准规程。试剂盒或诊断组合物可用于依照本文所述本发明方法采用例如本文中描述的免疫组织化学技术检测VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平。
[0418] 虽然以使用贝伐单抗例示，但是本发明涵盖使用本领域已知的其它血管发生抑制剂供与标准化疗方案组合使用。如本文中使用的，术语“血管发生抑制剂”指改变血管发生（例如形成血管的过程）的所有药剂，而且包括阻断血管形成和/或停止或减缓血管生长的药剂。在贝伐单抗之外，血管发生抑制剂的非限制性例子包括哌加他尼（pegaptanib）、舒尼替尼、索拉非尼和瓦他拉尼。优选地，供依照本发明的方法使用的血管发生抑制剂是贝伐单抗。如本文中使用的，术语“贝伐单抗”涵盖满足在选自美国、欧洲和日本的国家或地区中获得相同或生物相似产品的销售许可必需的要求的所有相应抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段。
[0419] 为了在本文所述检测方法中使用，技术人员有能力标记本发明涵盖的多肽（例如抗体）或寡核苷酸。如本领域常规实践的，可以依照本领域已知的标准方法标记并显现供检测mRNA水平使用的杂交探针和/或供免疫测定法方法中使用的抗体或抗体片段，常用系统的非限制性例子包括使用放射性标记物、酶标记物、荧光标签、生物素-亲合素复合物、化学发光、诸如此类。
[0420] 本领域技术人员，例如主治医师，能够容易地对如本文中选择或定义的患者/患者组施用与化疗方案组合的贝伐单抗。在某些背景中，主治医师可以依照他/她的职业经验变更、改变或修改贝伐单抗和化疗方案的施用方案。因此，在本发明的某些方面，提供一种用与化疗方案组合的贝伐单抗，治疗患有或怀疑患有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者或改善其总体存活和/或无进展存活的方法，其中所述患者/患者组特征在于来自患者的生物学样品（特别是血浆样品）的评估，所述样品展现出VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者中建立的对照水平升高。本发明还提供贝伐单抗在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于治疗患有或怀疑患有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者，其中患者是根据本文中公开的蛋白质标志物/指示物状态选择或表征的（即VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有胰腺癌，特别是转移性胰腺癌的患者中建立的对照水平升高）。
[0422] 图1：正在为转移性胰腺癌接受治疗的患者中贝伐单抗加吉西他滨-厄洛替尼疗法较之对照安慰剂加吉西他滨-厄洛替尼疗法的总体存活（图1A）和无进展存活（图1B）的Kaplan Meier曲线。在图中，实线代表贝伐单抗/吉西他滨-厄洛替尼治疗和虚线代表安慰剂/吉西他滨-厄洛替尼治疗。
[0423] 图2：正在为转移性胰腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗加吉西他滨-厄洛替尼疗法较之对照安慰剂加吉西他滨-厄洛替尼疗法，标志物VEGFA的高（≥152.9pg/ml）和低（<152.9pg/ml）表达水平二者与总体存活方面治疗效果的关联（图2A）和与无进展存活方面治疗效果的关联（图2B）的Kaplan Meier曲线。在图中，实线代表贝伐单抗/吉西他滨-厄洛替尼治疗而虚线代表安慰剂/吉西他滨-厄洛替尼治疗。
[0424] 图3：正在为转移性胰腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗加吉西他滨-厄洛替尼疗法较之对照安慰剂加吉西他滨-厄洛替尼疗法，标志物VEGFR2的高（≥9.9ng/ml）和低（<9.9ng/ml）表达水平二者与总体存活方面治疗效果的关联的Kaplan Meier曲线。在图中，实线代表贝伐单抗/吉西他滨-厄洛替尼治疗而虚线代表安慰剂/吉西他滨-厄洛替尼治疗。
[0425] 图4：正在为转移性胰腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗加吉西他滨-厄洛替尼疗法较之对照安慰剂加吉西他滨-厄洛替尼疗法，标志物PLGF的经过优化的高（≥36.5pg/ml）和低（<36.5pg/ml）表达水平二者与无进展存活方面治疗效果的关联的Kaplan Meier曲线。在图中，实线代表贝伐单抗/吉西他滨-厄洛替尼治疗而虚线代表安慰剂/吉西他滨-厄洛替尼治疗。
[0426] 图5：正在为转移性胰腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗加吉西他滨-厄洛替尼疗法较之对照安慰剂加吉西他滨-厄洛替尼疗法，标志物VEGFA和VEGFR2（图5A）作为组合表达水平的高（公式1≥-0.1）和低（公式1<-0.1）表达水平二者及VEGFA和PLGF（图5B）作为组合表达水平的高（公式2≥-0.042）和低（公式2<-0.042）表达水平二者与总体存活方面治疗效果的关联的Kaplan Meier曲线。在图中，实线代表贝伐单抗/吉西他滨-厄洛替尼治疗而虚线代表安慰剂/吉西他滨-厄洛替尼治疗。
[0427] 图6：正在为转移性胰腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗加吉西他滨-厄洛替尼疗法较之对照安慰剂加吉西他滨-厄洛替尼疗法，标志物VEGFA和VEGFR2（图6A）作为组合表达水平的高（公式1≥0.1）和低（公式1<0.1）表达水平二者及VEGFA和PLGF（图6B）作为组合表达水平的高（公式2≥0.042）和低（公式2<0.042）表达水平二者与无进展存活方面治疗效果的关联的Kaplan Meier曲线。在图中，实线代表贝伐单抗/吉西他滨-厄洛替尼治疗而虚线代表安慰剂/吉西他滨-厄洛替尼治疗。
[0428] 图7：正在为转移性胰腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗加吉西他滨-厄洛替尼疗法较之对照安慰剂加吉西他滨-厄洛替尼疗法，标志物VEGFA、VEGFR2和PLGF（图7A）作为组合表达水平的高（公式3≥0.837）和低（公式3<0.837）表达水平二者与总体存活方面治疗效果的关联及标志物VEGFA、VEGFR2和PLGF（图7B）作为组合表达水平的高（公式3≥0.837）和低（公式3<0.837）表达水平二者与无进展存活方面治疗效果的关联的Kaplan Meier曲线。在图中，实线代表贝伐单抗/吉西他滨-厄洛替尼治疗而虚线代表安慰剂/吉西他滨-厄洛替尼治疗。
[0429] 图8：SEQ ID NO：1，VEGFA的示例性氨基酸序列。
[0430] 图9：SEQ ID NO：2，VEGFR2的示例性氨基酸序列。
[0431] 图10：SEQ ID NO：3，PLGF的示例性氨基酸序列。
[0432] 图11：提高VEGF111、VEGF121、VEGF165和VEGF189浓度的测量，如在IMPACT芯片上测量的。
[0433] 图12：提高VEGF110、VEGF121和VEGF165浓度的测量，如在自动化 分析仪上使用 测定法测量的。
[0434] 图13：来自相同患者的EDTA和柠檬酸盐样品、用IMPACT测定法测量两次的数据。EDTA血浆的VEGFA浓度比柠檬酸盐要高约40%，其中EDTA-柠檬酸盐方法比较的Spearman相关性为约0.8。
[0435] 图14：显示在自动化 分析仪上测量，在提高分别在大肠杆菌中或在HEK细胞中生成的VEGF165的浓度时测量的计数（ECL信号）。
[0436] 以下述非限制性例示性实施例进一步例示本发明。
[0437] 实施例1
[0438] 将具有转移性胰腺癌的患者随机分至吉西他滨-厄洛替尼加贝伐单抗（n=306）或安慰剂（n=301）。
[0439] 自参与一项随机化III期研究的患者收集血浆样品，该研究比较将贝伐单抗添加至吉西他滨-厄洛替尼疗法来治疗转移性胰腺癌的结果（BO17706研究，见图1，还可参见Van Cutsem，J.Clin.Oncol.200927：2231-2237）。将具有转移性胰腺癌的患者随机分至吉西他滨-厄洛替尼加贝伐单抗（n=306）或安慰剂（n=301）。给具有转移性胰腺癌的患者随2
机指派接受吉西他滨（1,000mg/m/周）、厄洛替尼（100mg/天）和贝伐单抗（5mg/kg每2周）或吉西他滨、厄洛替尼和安慰剂。
机指派接受吉西他滨（1,000mg/m/周）、厄洛替尼（100mg/天）和贝伐单抗（5mg/kg每2周）或吉西他滨、厄洛替尼和安慰剂。
[0440] 一项关于与血管发生和肿瘤发生有关的生物标志物的状态的调查揭示了相对于在整个生物标志物患者群体中测定的对照水平，三种生物标志物的表达水平与改善的治疗参数有关。特别地，相对于在整个生物标志物患者群体中测定的对照水平，展现更高VEGFA表达水平的患者响应将贝伐单抗添加至吉西他滨-厄洛替尼疗法而表现出延长的总体存活和延长的无进展存活。相对于在整个生物标志物患者群体中测定的对照水平，展现更高VEGFR2表达水平的患者响应将贝伐单抗添加至吉西他滨-厄洛替尼疗法而表现出延长的总体存活。相对于在整个生物标志物患者群体中测定的对照水平，展现更高PLGF表达水平的患者响应将贝伐单抗添加至吉西他滨-厄洛替尼疗法而表现出延长的无进展存活。还有，相对于在整个生物标志物患者群体中测定的对照水平，展现更高VEGFA和VEGFR2组合表达水平的患者响应将贝伐单抗添加至吉西他滨-厄洛替尼疗法而表现出延长的总体存活和延长的无进展存活。另外，相对于在整个患者群体中测定的对照水平，展现更高VEGFA和PLGF组合表达水平的患者响应将贝伐单抗添加至吉西他滨-厄洛替尼疗法而表现出延长的总体存活和延长的无进展存活。相对于在整个患者群体中测定的对照水平，展现更高VEGFA、VEGFR2和PLGF组合表达水平的患者响应将贝伐单抗添加至吉西他滨-厄洛替尼疗法而表现出延长的总体存活和延长的无进展存活。
[0441] 患者和免疫化学方法
[0442] 总共607名患者参与了BO17706研究，而且可得到来自224名参与者的血浆样品进行生物标志物分析。表1中提供生物标志物分析中的224名患者的基线特征。
[0443] 表1。基线特征：生物标志物群体（n=224）
[0444]
[0445]
[0446] VAS：疼痛直观模拟标度尺
[0447] KPS：Karnofsky性能得分
[0448] 血浆分析
[0449] 在随机化之后且对患者给予任何研究治疗之前收集了血浆样品，并使用来自Roche Diagnostics GmbH的多重ELISA测定法（Impact）测量了VEGFA、血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）、VEGFR2、PLGF和E-SELECTIN。
[0450] IMPACT多重测定法技术
[0451] Roche Professional Diagnostics（Roche Diagnostics GmbH）开发了一种多标志物平台，工作名称为IMPACT（Immunological MultiParameter Chip Technology）。该技术基于通过EP0939319和EP1610129中公开的规程制造的一种聚苯乙烯小芯片。芯片表面包被有链霉亲合素层，然后上面点生物素化抗体进行每一种测定法。对于每一种标志物，以垂直线将抗体的点加载到芯片上。在测定期间，用含有特定分析物的标本样品探查阵列。
[0452] 用于在一块芯片上测量所有标志物的标本每份需要的血浆体积为8μL，与32μL温育缓冲液（50mM HEPES pH7.2，150mM NaCl，0.1%Thesit，0.5%牛血清清蛋白和0.1%作为防腐剂的Oxypyrion）一起应用。在温育12分钟并使用清洗缓冲液（5mM Tris pH7.9，0.01%Thesit和0.001%Oxypyrion）之后，添加地高辛配基化单克隆抗体混合物（包括用地高辛配基标记的分析物特异性抗体混合物的40μL温育缓冲液）并再温育6分钟以结合到被捕获的分析物上。最终用包括与荧光胶乳偶联的抗地高辛配基抗体偶联物的40μL试剂缓冲液（62.5mM TAPS pH8.7，1.25M NaCl，0.5%牛血清清蛋白，0.063%Tween20和
0.1%Oxypyrion）检测二抗。使用这种标志物，在单个点中能检测到10例个别结合事件，产生下至fmol/L浓度的很高的灵敏度。将芯片传送入检测单元中，并且电荷耦合器件（CCD）相机产生图像，使用专用软件转换成信号强度。个别点自动定位于预先限定的位置并通过图像分析来量化。对每一种标志物，在芯片上加载多行，每行10-12个点，并且样品的浓度均值需要最少5个点。该技术的优点是以夹心式或竞争性形式多路复用上至10个参数的能力。一式两份测量校准物和患者样品。一次运行设计成含有总共100项测定，包括2份多重对照作为运行对照。由于一些选定分析物彼此反应（即VEGFA和PLGF与VEGFR1或VEGRF2或VEGFA与PLGF形成异二聚体），因此如下将5种分析物分到三块不同芯片上：
0.1%Oxypyrion）检测二抗。使用这种标志物，在单个点中能检测到10例个别结合事件，产生下至fmol/L浓度的很高的灵敏度。将芯片传送入检测单元中，并且电荷耦合器件（CCD）相机产生图像，使用专用软件转换成信号强度。个别点自动定位于预先限定的位置并通过图像分析来量化。对每一种标志物，在芯片上加载多行，每行10-12个点，并且样品的浓度均值需要最少5个点。该技术的优点是以夹心式或竞争性形式多路复用上至10个参数的能力。一式两份测量校准物和患者样品。一次运行设计成含有总共100项测定，包括2份多重对照作为运行对照。由于一些选定分析物彼此反应（即VEGFA和PLGF与VEGFR1或VEGRF2或VEGFA与PLGF形成异二聚体），因此如下将5种分析物分到三块不同芯片上：
[0453] 芯片1：VEGFA
[0454] 芯片2：VEGFR1，VEGFR2，E-选择蛋白
[0455] 芯片3：PLGF
[0456] 使用了下述抗体进行不同测定法：
[0457]
[0458]
[0459] 统计分析
[0460] 使用样品中值将生物标志物值二分为低（低于中值）或高（高于中值）。
[0461] 用比例危害cox回归分析评估了具有高或低生物标志物水平的患者亚组中治疗效果的危害比。
[0462] 另外，使用比例危害cox回归评估了生物标志物水平和治疗效果之间的关联。该模型包括下述共变量：试验治疗，生物标志物水平，治疗对生物标志物水平的交互项。使用用于交互项的Wald检验确定了生物标志物水平和治疗效果之间的关联。低于0.05的P值认为是显著的。
[0463] 结果
[0464] 血浆标志物
[0465] 表2中呈现生物标志物的基线描述统计。
[0466] 表2：生物标志物值的描述统计（基线）
[0467]
[0468]
[0469] 表3呈现选定生物标志物与总体存活方面治疗效果的关联的单变量分析。
[0470] 表3：与总体存活方面的治疗效果的关联（单变量分析）
[0471]HR（95%CI） 交互P值
VEGFA低 1.018（0.69，1.5） 0.0308
VEGFA高 0.558（0.37,0.83）
VEGFR2低 1.057（0.72,1.55） 0.0461
VEGFR2高 0.583（0.39,0.87）
PLGF低 1.048（0.67，1.63） 0.089
PLGF高 0.659（0.46，0.95）
VEGFA低 1.018（0.69，1.5） 0.0308
VEGFA高 0.558（0.37,0.83）
VEGFR2低 1.057（0.72,1.55） 0.0461
VEGFR2高 0.583（0.39,0.87）
PLGF低 1.048（0.67，1.63） 0.089
PLGF高 0.659（0.46，0.95）
[0472] 在此分析中，对VEGFA使用低VEGFA<152.9pg/ml和高VEGFA≥152.9pg/ml，对VEGFR2使用低VEGFR2<9.9ng/ml和高VEGFRA≥9.9ng/ml，而对PLGF使用低PLGF<36.5pg/ml和高PLGF≥36.5pg/ml。
[0473] 对VEGFA和VEGFR2，按照预先确定的分析计划，截留水平确定为样品数据中值，使得50%的患者具有高表达且50%的患者具有低表达。PLGF截留水平确定为数据的第42百分位。因而，58%的患者具有高PLGF表达且42%具有低表达。确定该截留是为了提高高和低水平亚组中治疗效果之间的统计差异。
[0474] 此结果表显示具有高VEGFA的患者子集的治疗效果的危害比与具有低VEGFA的患者相比显著更好。此结果表还显示具有高VEGFR2的患者子集的治疗效果的危害比与具有低VEGFR2的患者相比显著更好。因此，VEGFA和VEGFR2每一项是贝伐单抗总体存活方面治疗效果的独立预测生物标志物。
[0475] 表4呈现选定生物标志物与无进展存活方面治疗效果的关联的单变量分析。
[0476] 表4：与无进展存活方面治疗效果的关联（单变量分析）
[0477]HR（95%CI） 交互P值
VEGFA低 0.771（0.53,1.13） 0.0603
VEGFA高 0.522（0.35,0.78）
VEGFR2低 0.773（0.53,1.12） 0.4012
VEGFR2高 0.541（0.36,0.81）
PLGF低 0.957（0.63,1.46） 0.0136
PLGF高 0.505（0.35,0.73）
VEGFA低 0.771（0.53,1.13） 0.0603
VEGFA高 0.522（0.35,0.78）
VEGFR2低 0.773（0.53,1.12） 0.4012
VEGFR2高 0.541（0.36,0.81）
PLGF低 0.957（0.63,1.46） 0.0136
PLGF高 0.505（0.35,0.73）
[0478] 在此分析中，对VEGFA使用低VEGFA<152.9pg/ml和高VEGFA≥152.9pg/ml，对VEGFR2使用低VEGFR2<9.9ng/ml和高VEGFRA≥9.9ng/ml，而对PLGF使用低PLGF<36.5pg/ml和高PLGF≥36.5pg/ml。对VEGFA和VEGFR2，按照预先确定的分析计划，截留水平确定为样品数据中值，使得50%的患者具有高表达且50%的患者具有低表达。PLGF截留水平确定为数据的第42百分位。因而，58%的患者具有高PLGF表达且42%具有低表达。确定该截留是为了提高高和低水平亚组中治疗效果之间的统计差异。
[0479] 此结果表显示具有高VEGFA的患者子集的治疗效果的危害比与具有低VEGFA的患者相比显著更好。此结果表还显示具有高PLGF的患者子集的治疗效果的危害比与具有低PLGF的患者相比显著更好。因此，VEGFA和PLGF每一项是贝伐单抗无进展存活方面治疗效果的独立预测生物标志物。
[0480] 表5呈现生物标志物组合与总体存活方面治疗效果的关联的分析。
[0481] 对此分析，使用了下述方程式：
[0482] 公式1：norm（VEGFA）+1.3*norm（VEGFR2）。割点= 中值或0
[0483] 等效公式：VEGFA+3.3*VEGFR2。割点= 中值或0
[0484] 和
[0485] 公式2：0.25*norm（VEGFA）+0.21*norm（PLGF），割点= 中值或0
[0486] 等效公式：0.19*VEGFA+0.67*PLGF，割点= 中值或4.8
[0487] 其中我们使用log2变换和
[0488]
[0489] 表5：与总体存活方面治疗效果的关联（双标志物分析）
[0490]HR（95%CI） 交互P值
VEGFA和VEGFR2低 1.317（0.89,1.94） 0.0002
VEGFA和VEGFR2高 0.42（0.28,0.64）
VEGFA和PLGF低 1.101（0.74,1.64） 0.0096
VEGFA和PLGF高 0.546（0.37,0.81）
VEGFA和VEGFR2低 1.317（0.89,1.94） 0.0002
VEGFA和VEGFR2高 0.42（0.28,0.64）
VEGFA和PLGF低 1.101（0.74,1.64） 0.0096
VEGFA和PLGF高 0.546（0.37,0.81）
[0491] 在此分析中，VEGFA和VEGFR2的高组合表达水平为（公式1≥-0.10）而VEGFA和VEGFR2的低组合表达为（公式1<-0.10），而且VEGFA和PLGF的高组合表达水平为（公式2≥-0.042）而VEGFA和PLGF的低组合表达为（公式2<-0.042）。
[0492] 此结果表显示具有高VEGFA和VEGFR2组合的患者子集的治疗效果的危害比与具有低VEGFA和VEGFR2组合的患者相比显著更好。此结果表还显示具有高VEGA和PLGF组合的患者子集的治疗效果的危害比与具有低VEGFA和PLGF组合的患者相比显著更好。因此，VEGFA和VEGFR2组合和VEGFA和PLGF组合中每一组合是贝伐单抗总体存活方面治疗效果的独立预测生物标志物。
[0493] 表6呈现生物标志物组合与无进展存活方面治疗效果的关联的分析。
[0494] 对此分析，使用了下述方程式：
[0495] 公式1：norm（VEGFA）+1.3*norm（VEGFR2）。割点= 中值或0
[0496] 等效公式：VEGFA+3.3*VEGFR2。割点= 中值或0
[0497] 和
[0498] 公式2：0.25*norm（VEGFA）+0.21*norm（PLGF），割点= 中值或0
[0499] 等效公式：0.19*VEGFA+0.67*PLGF，割点= 中值或4.8
[0500] 其中我们使用log2变换和
[0501]
[0502] 表6：与无进展存活方面治疗效果的关联（双标志物分析）
[0503]HR（95%CI） 交互P值
VEGFA和VEGFR2低 0.984（0.68,1.43） 0.0040
VEGFA和VEGFR2高 0.411（0.26,0.64）
VEGFA和PLGF低 0.936（0.64,1.37） 0.0011
VEGFA和PLGF高 0.426（0.28,0.64）
VEGFA和VEGFR2低 0.984（0.68,1.43） 0.0040
VEGFA和VEGFR2高 0.411（0.26,0.64）
VEGFA和PLGF低 0.936（0.64,1.37） 0.0011
VEGFA和PLGF高 0.426（0.28,0.64）
[0504] 在此分析中，VEGFA和VEGFR2的高组合表达水平为（公式1≥-0.10）而VEGFA和VEGFR2的低组合表达为（公式1<-0.10），而且VEGFA和PLGF的高组合表达水平为（公式2≥-0.042）而VEGFA和PLGF的低组合表达为（公式2<-0.042）。
[0505] 此结果表显示具有高VEGFA和VEGFR2组合的患者子集的治疗效果的危害比与具有低VEGFA和VEGFR2组合的患者相比显著更好。此结果表还显示具有高VEGA和PLGF组合的患者子集的治疗效果的危害比与具有低VEGFA和PLGF组合的患者相比显著更好。因此，VEGFA和VEGFR2组合和VEGFA和PLGF组合中每一组合是贝伐单抗无进展存活方面治疗效果的独立预测生物标志物。
[0506] 表7和表8分别呈现生物标志物组合VEGFA、VEGFR2和PLGF与总体存活和无进展存活方面治疗效果的关联的分析。
[0507] 在此分析中，使用了下述方程式：
[0508] 公式3：0.0127*ln（PLGF+1）+0.144*ln（VEGFR2+1）+0.0949*ln（VEGFA+1）[0509] 其中ln= 以e为底的log
[0510] 表7：与总体存活方面的治疗效果的关联（三标志物分析）
[0511]总体存活 HR（95%CI） 交互P值
VEGFA和VEGFR2和PLGF低 1.051（0.71,1.55） 0.0033
VEGFA和VEGFR2和PLGF高 0.554（0.38，0.8）
VEGFA和VEGFR2和PLGF低 1.051（0.71,1.55） 0.0033
VEGFA和VEGFR2和PLGF高 0.554（0.38，0.8）
[0512] 表8：与无进展存活方面治疗效果的关联（三标志物分析）
[0513]无进展存活 HR（95%CI） 交互P值
VEGFA和VEGFR2和PLGF低 0.974（0.64,1.48） 0.0096
VEGFA和VEGFR2和PLGF高 0.488（0.34,0.71）
VEGFA和VEGFR2和PLGF低 0.974（0.64,1.48） 0.0096
VEGFA和VEGFR2和PLGF高 0.488（0.34,0.71）
[0514] 在此分析中，对总体存活，VEGFA、VEGFR2和PLGF的高组合表达水平为（公式3≥0.837）而VEGFA、VEGFR2和PLGF的低组合表达为（公式3<0.837），而对无进展存活，VEGFA、VEGFR2和PLGF的高组合表达水平为（公式3≥0.837）而VEGFA、VEGFR2和PLGF的低组合表达为（公式3<0.837）。
[0515] 此结果表显示具有高VEGFA和VEGFR2和PLGF组合的患者子集的治疗效果的危害比与具有低VEGFA和VEGFR2和PLGF组合的患者相比显著更好。因此，VEGFA和VEGFR2和PLGF组合是贝伐单抗无进展存活方面治疗效果的预测生物标志物。
[0516] 此结果表还显示对总体存活，具有高VEGFA和VEGFR2和PLGF组合的患者子集的治疗效果的危害比与具有低VEGFA和VEGFR2和PLGF组合的患者相比显著更好。因此，VEGFA和VEGFR2和PLGF组合是贝伐单抗总体存活治疗效果的预测生物标志物。
[0517] 实施例2：VEGF-A的更短同等型使用IMPACT测定法的检测
[0518] 基于用于在IMPACT平台上检测VEGF-A的抗体，此实施例证明VEGF-A的更短同等型与VEGF-A的更长同等型相比得到优先测量。
[0519] 使用“统计分析”部分前面的表中列举的抗体如上文涉及IMPACT技术的部分下面所述实施了测定法。
[0520] 四种不同VEGF-A形式，即VEGF111，VEGF121，VEGF165和VEGF189可得的且用于分析。VEGF111、VEGF121（二者衍生自大肠杆菌中的表达）和VEGF165（在昆虫细胞系中重组获得）购自R&D Systems，Minneapolis，USA而VEGF189得自RELIATech，Wolfenbüttel，Germany。后来发现VEGF189表现相当不稳定，而且用该材料获得的数据不可靠。如图11中所示，具有111或121个氨基酸的更短同等型（它们已经在大肠杆菌中生成且没有后来的修饰，例如没有糖基化）与具有165个氨基酸的更长同等型相比得到更好的检测。VEGF165已经在昆虫细胞系中获得且是至少部分糖基化的。在此时得不到生物学感兴趣的纤溶酶切割产物VEGF110来进行测试，但是预期这种同等型的检测会与对具有111个氨基酸的VEGF分子看到的相当。
[0521] 实施例3：短VEGF同等型使用 分析仪的检测
[0522] 此实施例描述证明使用 分析仪和相应测定法的测定法可用于检测人血浆中短VEGF同等型的实验。
[0523] 将VEGF-A测定法从IMPACT转移至自动化体外诊断系统 （RocheDiagnostics GmbH，Mannheim）。与IMPACT测定法使用相同的捕捉抗体，-m3C5（RELIATech，Wolfenbüttel），但是在IMPACT系统上使用的捕捉抗体-m25603（R&D Systems，Minneapolis）用-mA4.6.1（Genentech，South San Francisco）替换。
[0524] 在自动化 系统上运行的免疫测定法是使用电化学发光（ECLIA）作为信号产生技术的免疫测定法。在本夹心式测定法中，生物素化捕捉抗体结合经链霉亲合素包被的磁性微粒而钌化检测抗体容许产生信号。将反应缓冲液（50mM Tris（pH7.4），
2mM EDTA，0.1%thesit，0.2%牛IgG，1.0%牛血清清蛋白）中的75μl1.5μg/ml生物素化-m3C5和75μl2μg/ml钌化M-A.4.6.1二者与20μl样品一起温育9分钟。在第一个9分钟温育后添加30μl微粒悬浮液，然后将整个混合物再温育9分钟。在这些温育步骤期间，形成结合至微粒的抗体-分析物-抗体夹心物。最后，将微粒转移至Elecsys系统的检测室进行信号产生和读取。
2mM EDTA，0.1%thesit，0.2%牛IgG，1.0%牛血清清蛋白）中的75μl1.5μg/ml生物素化
[0525] 用纯化的重组蛋白：VEGF110（在Genentech，South San Francisco通过纤溶酶切割而生成），VEGF121和VEGF165（二者在昆虫细胞系中生成并由R&D Systems，Minneapolis供应）评估了 VEGF-A测定法的切割产物/同等型偏好。用 测定法看到的对短VEGF同等型的优先结合在Elecsys测定法中得到了确认。如图12中所示，在测定法中，同等型VEGF121和纤溶酶切割产物VEGF110二者以比VEGF165要高大
约5倍的灵敏度得到检测。
约5倍的灵敏度得到检测。
[0526] 实施例4：柠檬酸钠盐和EDTA中收集的血浆中短VEGF同等型的检测
[0527] 在EDTA Monovette（5mL）和柠檬酸盐Monovette收集管（5mL）二者中自具有HER2+局部复发性或转移性乳腺癌的患者收集配对血浆样品。在血液收集30分钟内，将血液管放置入离心机中并于室温以1500g离心10分钟，直至细胞和血浆分开。离心后立即将血浆小心地转移入丙烯转移管中，然后使用移液器等分入2个贮藏管中（每个一半体积，大约1.25mL）。使用上文所述IMPACT测定法测量样品中VEGF-A的水平。如图13中所示，在EDTA中收集和贮藏的血浆样品的VEGFA浓度与在柠檬酸盐中收集和贮藏的血浆样品相比要高约40%，其中在治疗之前收集的基线样品的EDTA-柠檬酸盐MC的Spearman相关性为约0.8。
[0528] 实施例5：未修饰和经修饰VEGF165在Elecsys分析仪上的比较性测量
[0529] 此实施例描述证明 分析仪和相应测定法可用于检测人血浆中未修饰VEGF的实验。
[0530] 将VEGF-A测定法从IMPACT转移至自动化体外诊断系统（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim）。与IMPACT测定法使用相同的捕捉抗体，-m3C5（RELIATech GmbH，Wolfenbüttel），但是在IMPACT系统上使用的检测抗体-m25603（R&D Systems，Minneapolis）用-mA4.6.1（Genentech，South San Francisco）替换。
[0531] 在自动化Elecsys系统上运行的免疫测定法是使用电化学发光（ECLIA）作为信号产生技术的免疫测定法。在本夹心式测定法中，生物素化捕捉抗体结合经链霉亲合素包被的磁性微粒而钌化检测抗体容许产生信号。将反应缓冲液（50mM Tris（pH7.4），2mM EDTA，0.1%thesit，0.2%牛IgG，1.0%牛血清清蛋白）中的75μl1.5μg/ml生物素化-m3C5和75μl2μg/ml钌化M-A.4.6.1二者与20μl样品一起温育9分钟。在第一个9分钟温育后添加30μl微粒悬浮液，然后将整个混合物再温育9分钟。在这些温育步骤期间，形成结合至微粒的抗体-分析物-抗体夹心物。最后，将微粒转移至Elecsys系统的检测室进行信号产生和读取。
[0532] 用纯化的重组蛋白：VEGF165（由Peprotech在大肠杆菌中重组生成）和VEGF165（在Roche Diagnostics，Germany在HEK细胞中重组生成）评估了Elecsys VEGF-A测定法的偏好。用IMPACT测定法看到的对未修饰VEGF165的优先结合在Elecsys测定法中得到了确认。如图14中所示，在Elecsys测定法中，未修饰VEGF165以比经修饰VEGF165要高大约5倍的灵敏度得到检测。
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