一种血浆中利可君浓度的检测方法
阅读：2发布：2020-05-30
专利汇可以提供一种血浆中利可君浓度的检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 血浆 中利可君浓度的检测方法。该方法将血浆中利可君与替硝唑经高氯酸沉淀蛋白后采用LC-MS法进行分离测定。本发明的方法经方法学验证准确可靠，可用于血浆中利可君的浓度测定。，下面是一种血浆中利可君浓度的检测方法专利的具体信息内容。
1.一种血浆中利可君浓度的检测方法，其特征在于包含以下步骤：
(a)对血浆样品进行前处理：取待测样品，加入内标和高氯酸进行蛋白沉淀，并取上清液，所述的内标为替硝唑，其用量为使样品中含替硝唑浓度为100ng-1mg/ml，所述的高氯酸溶液的用量为每1ml样品中加入高氯酸重量为10-100mg。
2. (b)采用LC-MS联用仪测定上述上清液中利可君的浓度，其中，LC-MS联用的色谱条件是：色谱柱是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；内标法，以替硝唑作为内标；流动相为乙腈-水-冰乙酸的混合液，其比例范围为20±1:80±5:0.3±0.03）；LC-MS联用的质谱条件是：离子源为ESI离子源，正离子检测。
3.根据权利要求1所述的的检测方法，其特征在于，步骤(a)中高氯酸可预先配置成水溶液，浓度为1-10%，优选为3-7%，最优选为4%。
4.根据权利要求1所述的的检测方法，其特征在于，步骤(a)中替硝唑可预先配置成水溶液，浓度为1.0-1.5μg/ml。
5.根据权利要求1所述的分析血浆中利可君含量的方的检测方法，其特征在于，所述的色谱条件流动相由乙腈-水-冰乙酸组成，其体积比为乙腈-水-冰乙酸=20:80:0.3。
6.根据权利要求1所述的的检测方法，其特征在于， LC-MS联用质谱条件中，扫描方式为选择性离子检测。
一种血浆中利可君浓度的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种血浆中利可君浓度的检测方法，特别涉及一种采用液相色谱-质谱联用技术分析利可君浓度的方法。
背景技术
[0004] 另外，利可君存在3个手性中心，有多个手性中心，因此，提供一种可靠的可检测所有这些异构体的方法就成为积极困难的事情。
发明内容
[0006] 本发明提供了一种血浆中利可君浓度的检测方法，包含以下步骤：(a)对血浆样品进行前处理：取待测样品，加入内标和高氯酸进行蛋白沉淀，并取上清液，所述的内标为替硝唑，其用量为使样品中含替硝唑浓度为100ng-1mg/ml，所述的高氯酸溶液的用量为每1ml样品中加入高氯酸重量为10-100mg。
[0007] (b)采用液相色谱-质谱（LC-MS）联用仪测定上述上清液中利可君的浓度，其中，LC-MS联用的色谱条件是：色谱柱是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；内标法，以替硝唑作为内标；流动相为乙腈-水-冰乙酸的混合液，其体积比例范围为20±1:80±5:0.3±0.03）；LC-MS联用的质谱条件是：离子源为ESI离子源，正离子检测。
[0008] 所述步骤(a)中高氯酸可预先配置成水溶液，浓度为1-10%，优选为3-7%，最优选为4%。
[0009] 所述步骤(a)中替硝唑可预先配置成水溶液，浓度为1.0-1.5μg/ml。
[0010] 所述的分析血浆中利可君含量的方的检测方法，色谱条件流动相由乙腈-水-冰乙酸组成，其配比为乙腈-水-冰乙酸=20:80:0.3。
[0011] 所述的的检测方法，其特征在于，步骤LC-MS联用质谱条件中，扫描方式为选择性离子检测。
[0012] 上述色谱条件为典型条件，实际应用中根据所使用仪器的不同特点，可以对各参数做出适当调整，以期获得最佳的效果。本发明建立了简单、灵敏、快速的LC-MS法测定血浆中利可君的浓度，其高灵敏度、较小的样品需求量以及相对较短的分析时间使得本发明方法适用于利可君的临床前和临床药代代动力学研究，利用该方法，可以很好的分离检测利可君及其非对映异构体。附图说明
[0013] 图1为利可君的结构式。
[0014] 图2A为利可君的质谱全扫描图。
[0015] 图2B为替硝唑的质谱全扫描图。
[0016] 图3A-3C为实施例一中利可君和替硝唑的总离子流色谱图，Ⅰ代表替硝唑的色谱峰，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别代表利可君的四种非对映异构体；其中：图3A代表空白血浆；图3B代表空白血浆中加入利可君和内标替硝唑；图3C代表血浆样品。
[0017] 图4A-4C为另一实施例中利可君和替硝唑的总离子流色谱图，Ⅰ代表替硝唑的色谱峰，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别代表利可君的四种非对映异构体；其中：图4A代表空白血浆；图4B代表空白血浆中加入利可君和内标替硝唑；图4C代表血浆样品。
具体实施方式
[0018] 实施例一1 仪器、材料与试剂
1.1 仪器 LC-MS联用仪（岛津LC-MS2020）
1.2 样品与试剂 利可君（纯度为＞99.5%）；替硝唑（纯度＞99.8%），购自中国药品生物制品检定所；其他化学试剂均为分析纯。
1.1 仪器 LC-MS联用仪（岛津LC-MS2020）
1.2 样品与试剂 利可君（纯度为＞99.5%）；替硝唑（纯度＞99.8%），购自中国药品生物制品检定所；其他化学试剂均为分析纯。
[0019] 2 实验部分2.1 血浆样品前处理 取静脉注射给药后采集的大鼠血浆样品100μL置于1.5mL塑料Ep管中，加入30μL内标溶液(1140ng/mL)，涡旋混合30s，再加入100μL4%高氯酸溶液，涡旋混合3min，4℃条件下20000rpm离心10min两次，取上清液10μL进行LC-MS分析。
[0020] 2.2 LC-MS分析条件2.2.1 色 谱 条 件 色 谱 柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (2.1*150mm,
5-Micro)；流动相：乙腈:水:冰乙酸=20;80;0.3；柱温：30℃；流速：0-4min为0.3mL/min，4-5min由0.3mL/min线性升至0.6mL/min，维持0.6mL/min至分析时间结束；进样量：
10μL。
5-Micro)；流动相：乙腈:水:冰乙酸=20;80;0.3；柱温：30℃；流速：0-4min为0.3mL/min，4-5min由0.3mL/min线性升至0.6mL/min，维持0.6mL/min至分析时间结束；进样量：
10μL。
[0021] 2.2.2 质谱条件 ESI离子源，正离子检测；扫描方式：选择性离子检测；定量分析的离子分别为：m/z 296.2（利可君）和m/z 248.1（替硝唑，内标）。
[0022] 2.3 LC-MS分析结果对样品利可君和内标替硝唑的质谱扫描图参见图2A和图2B。
[0023] 3 方法确证3.1 专属性 本方法中待测物与内标的专属性以标准曲线中一个浓度点与同法操作的空白血浆进行对比来进行评价。
[0024] 空白血浆、空白血浆中加入利可君和内标替硝唑、血浆样品的色谱图分别见图3A、3B和3C，从图中可以看出，空白血浆中的内源性物质不干扰利可君和内标的测定，内标替硝唑的保留时间为3.2min，利可君四个非对映异构体的保留时间分别为9.5min、10.6min、
11.9min和13.2min。
11.9min和13.2min。
[0025] 3.2 线性与灵敏度 利可君的标准系列工作液由乙腈配制。取空白血浆100μL，加入内标溶液30μL，再依次加入利可君标准系列工作液指定体积，配制成相当于血浆浓度为50、100、200、400、1000、2000、5000和10000ng/mL的血浆样品，按2.1项下操作，进行LC-MS分析，求得直线回归方程，即为工作曲线。其测定和分析结果见表1。
[0026] 表1 利可君的标准曲线浓度(ng/mL) 50 100 200 400 1000 2000 5000 10000
相应值(A样/A内) 0.2413 0.2696 0.7651 0.9645 1.6370 4.9575 16.8421 35.3485本方法的线性范围为50~10000ng/mL，标准曲线的方程为：y = 0.003556x - 0.70697
2
(r=0.994999),y表示待测物与内标的峰面积之比，x表示待测物的浓度。本方法最低检测限及最低定量限分别为10ng/mL(S/N=3)和50ng/mL(S/N=10)。
相应值(A样/A内) 0.2413 0.2696 0.7651 0.9645 1.6370 4.9575 16.8421 35.3485本方法的线性范围为50~10000ng/mL，标准曲线的方程为：y = 0.003556x - 0.70697
2
(r=0.994999),y表示待测物与内标的峰面积之比，x表示待测物的浓度。本方法最低检测限及最低定量限分别为10ng/mL(S/N=3)和50ng/mL(S/N=10)。
[0027] 3.3 提取回收率 取空白血浆100μL，按3.2项下操作，制备低、中、高三个浓度的样品进行分析，记录色谱峰。同时，另取纯水代替空白血浆，按3.2项下操作，制备低、中、高三个浓度的样品进行分析，获得相应峰面积，以二者色谱图的峰面积之比，考察样品的提取回收率。测定和分析结果见表2。
[0028] 表2 利可君的提取回收率如表所示，三个浓度利可君的提取回收率分别为77.38±6.14%、81.45±5.35%、
97.44±3.78%。
97.44±3.78%。
[0029] 3.4 精密度与准确度 按3.2项下操作，制备利可君低、中、高三个浓度的质量控制样品，每个浓度进行6样本分析，连续测定三天，方法精密度由求得的日内、日间RSD（%）来评价，准确度由实际测得值与理论值得偏差来评价，分析结果如表3所示。
[0030] 表3 血浆样品中利可君LC-MS测定方法的准确度与精密度如表3所示，日内、日间精密度分别在5.69%及7.71%以内，准确度范围为
86.4~112.5%，表明本方法具有良好的精密度与准确度。
86.4~112.5%，表明本方法具有良好的精密度与准确度。
[0031] 3.5 稳定性 以-20℃冷冻10天及冷冻-溶化三次来考察利可君的稳定性，如果实测值与理论值的偏差在±15%以内，则表明样品稳定，本实验方法的稳定性结果见表4。
[0032] 表4 稳定性结果如表4所示，利可君浓度的实测值与理论值的偏差在±15%以内，表明本方法具有良好的稳定性。
[0033] 实施例二1 仪器、材料与试剂
1.1 仪器LC-MS联用仪
1.2 样品与试剂 利可君（纯度为＞99.5%）；替硝唑（纯度＞99.8%），购自中国药品生物制品检定所；其他化学试剂均为分析纯。
1.1 仪器LC-MS联用仪
1.2 样品与试剂 利可君（纯度为＞99.5%）；替硝唑（纯度＞99.8%），购自中国药品生物制品检定所；其他化学试剂均为分析纯。
[0034] 2 实验部分2.1 血浆样品前处理 取灌胃给药后采集的大鼠血浆样品100μL置于1.5mL塑料Ep管中，加入30μL内标溶液(1100ng/mL)，涡旋混合30s，再加入100μL6.2%高氯酸溶液，涡旋混合5min，4℃条件下20000rpm离心150min两次，取上清液10μL进行LC-MS分析。
[0035] 2.2 LC-MS分析条件2.2.1 色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈:水:冰乙酸=21;85;0.33；柱温：30℃；流速：0-4min为0.35mL/min，4-5min由0.35mL/min线性升至
0.7mL/min，维持0.7mL/min至分析时间结束；进样量：10μL。
0.7mL/min，维持0.7mL/min至分析时间结束；进样量：10μL。
[0036] 2.2.2 质谱条件 ESI离子源，正离子检测；扫描方式：选择性离子检测；定量分析的离子分别为：m/z 296.2（利可君）和m/z 248.1（替硝唑，内标）。
[0037] 2.3 LC-MS分析结果对样品利可君和内标替硝唑的质谱扫描图参见图2A和图2B。
[0038] 3 方法确证3.1 专属性 本方法中待测物与内标的专属性以标准曲线中一个浓度点与同法操作的空白血浆进行对比来进行评价。
[0039] 空白血浆、空白血浆中加入利可君和内标替硝唑、血浆样品的色谱图分别见图3A、3B和3C，从图中可以看出，空白血浆中的内源性物质不干扰利可君和内标的测定，内标替硝唑的保留时间为3.2min，利可君四个非对映异构体的保留时间分别为9.5min、10.6min、
11.9min和13.2min。
11.9min和13.2min。
[0040] 3.2 线性与灵敏度 利可君的标准系列工作液由乙腈配制。取空白血浆100μL，加入内标溶液30μL，再依次加入利可君标准系列工作液指定体积，配制成相当于血浆浓度为50、100、200、400、1000、2000、5000和10000ng/mL的血浆样品，按2.1项下操作，进行LC-MS分析，求得直线回归方程，即为工作曲线。其测定和分析结果见表5。
[0041] 表5 利可君的标准曲线浓度（ng/mL） 50 100 200 400 1000 2000 5000 10000
相应值（A样/A内） 0.0399 0.0849 0.1895 0.3161 1.4369 2.8029 9.1374 20.3577本方法的线性范围为50~10000ng/mL，标准曲线的方程为：y = 0.002039x - 0.48431
2
(r=0.995685),y表示待测物与内标的峰面积之比，x表示待测物的浓度。本方法最低检出限及最低检测限分别为10ng/mL (S/N=3)和50ng/mL(S/N=10)。
相应值（A样/A内） 0.0399 0.0849 0.1895 0.3161 1.4369 2.8029 9.1374 20.3577本方法的线性范围为50~10000ng/mL，标准曲线的方程为：y = 0.002039x - 0.48431
2
(r=0.995685),y表示待测物与内标的峰面积之比，x表示待测物的浓度。本方法最低检出限及最低检测限分别为10ng/mL (S/N=3)和50ng/mL(S/N=10)。
[0042] 3.3 提取回收率 取空白血浆100μL，按3.2项下操作，制备低、中、高三个浓度的样品进行分析，记录色谱峰。同时，另取纯水代替空白血浆，按3.2项下操作，制备低、中、高三个浓度的样品进行分析，获得相应峰面积，以二者色谱图的峰面积之比，考察样品的提取回收率。测定和分析结果见表6。
[0043] 表6 利可君的提取回收率如表所示，三个浓度利可君的提取回收率分别为77.38±6.14%、81.45±5.35%、
97.44±3.78%。
97.44±3.78%。
[0044] 3.4 精密度与准确度 按3.2项下操作，制备利可君低、中、高三个浓度的质量控制样品，每个浓度进行6样本分析，连续测定三天，方法精密度由求得的日内、日间RSD（%）来评价，准确度由实际测得值与理论值得偏差来评价，分析结果如表7所示。
[0045] 表7 血浆样品中利可君LC-MS测定方法的准确度与精密度如表3所示，日内、日间精密度分别在6.43%及7.82%以内，准确度范围为
85.9~114.1%，表明本方法具有良好的精密度与准确度。
85.9~114.1%，表明本方法具有良好的精密度与准确度。
[0046] 3.5 稳定性 以-20℃冷冻10天及冷冻-溶化三次来考察利可君的稳定性，如果实测值与理论值的偏差在±15%以内，则表明样品稳定，本实验方法的稳定性结果见表4。
[0047] 表8 稳定性结果如表8所示，利可君浓度的实测值与理论值的偏差在±15%以内，表明本方法具有良好的稳定性。
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