一种与胆石症相关的血浆代谢小分子标志物及其应用
阅读：1039发布：2020-08-15
专利汇可以提供一种与胆石症相关的血浆代谢小分子标志物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种与胆石症相关的 血浆 代谢小分子标志物及其应用，该标志物为 氧 化三甲胺和三甲胺。本 发明 通过采用UPLC‑Q exactive MS比较正常对照和胆石症患者血浆中的代谢小分子，发现了血浆中存在可用于评估患者是否胆石症，具有诊断价值的血浆代谢小分子标志物组合，以及该血浆代谢小分子标志物检测的UPLC‑Q exactive MS的应用，研制出可便于临床应用的胆石症诊断、监测 试剂 盒 。，下面是一种与胆石症相关的血浆代谢小分子标志物及其应用专利的具体信息内容。
1.一种与胆石症相关的血浆代谢小分子标志物组合在制备胆石症诊断或监测试剂盒中的应用；所述的与胆石症相关的血浆代谢小分子标志物组合由氧化三甲胺和三甲胺组成。
2.胆石症诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有氧化三甲胺和三甲胺标准品。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于包括氚3H标记的氧化三甲胺稳定同位素内标物；氚3H标记的三甲胺稳定同位素内标物；试剂A：流动相用，含0.1wt.％的甲酸的水试剂B：流动相用，含0.1wt.％的甲酸的乙腈；试剂C：沉淀蛋白用，含100wt.％甲醇；试剂D复溶用，超纯水。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还含有C18色谱柱，规格为100mm×2.1mm，粒径1.9μm。
一种与胆石症相关的血浆代谢小分子标志物及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及一种用于胆石症辅助早期诊断及高危人群筛选标志物及其应用，特点是检测与胆石症发生相关的代谢小分子标志物及其应用。
背景技术
[0002] 胆石症(cholelithiasis)是世界范围的常见病。近20余年来，随着影像学(B型超声、CT及MRI等)检查的普及，很多无症状的胆石症也会在体检中被发现。在我国，随着经济发展和生活水平提高，其发病率逐年升高，并随年龄增长而增高，尤其是胆囊结石。最近的流行病学调查显示，在自然人群中，胆囊结石的发病率已接近15%。胆囊结石主要见于成人，女性多于男性，40岁后发病率随年龄增长而明显增高。结石为胆固醇结石或以胆固醇为主的混合性结石和黑色胆色素结石，而目前80%以上的胆囊结石都属于胆固醇性结石。胆囊结石与饮食、脂质代谢、遗传等多种因素有关。任何影响胆固醇与胆汁酸浓度比例改变，导致胆汁中胆固醇过饱和进而沉积的因素都能导致胆固醇结晶形成，并逐渐发展最终成结石。个别地区和种族的居民、女性激素、肥胖、妊娠、高脂肪饮食、长期肠外营养、糖尿病、高脂血症、胃切除或胃肠吻合手术后、回肠末段疾病和回肠切除术后、肝硬化、溶血性贫血等因素都可引起胆囊结石。在我国西北地区的胆囊结石发病率相对较高，可能与饮食习惯有关。胆石症可能引起急性胆囊炎、化脓性胆管炎、胆源性胰腺炎，长期的胆结石甚至导致胆囊癌。
[0003] 胆石症的临床表现有多种，其自然病程无法预测。约60%～80%胆囊结石患者可在结石形成之后的一段时间内无症状，称无症状性胆石，通常是在体检时候偶然发现。目前临床上胆石症的诊断有多种方法，主要是腹部超声，进一步检查包括腹部CT、MRCP，必要时内镜超声(EUS)、内镜下逆行胰胆管造影术（Endoscopic Retrograde Cholangiopancreatography，ERCP）或术中胆管造影(Intraoperativecholangiography，IOC)。在肝功能检查中，血清胆红素和碱性磷酸酶可以提示胆道梗阻，但对胆管结石的诊断缺乏敏感性和特异性。腹部超声检查是最常用的一种无创检查手段，检查的敏感性为90%～
95%，不但能发现结石，还能提示胆管结石的间接征象如胆管扩张等，但其高度依赖检查者的经验和水平。腹部CT在诊断胆石症中也起到一定作用，既可确定结石的存在，CT值的测定据报道有助于胆石性质的确定。MRCP作为一种准确和无创的诊断方法，能清晰地显示胆管的解剖特征，使其诊断敏感性达到81%～100%，特异性达到92%～100%，和ERCP及IOC的准确性相当。但MRCP可能漏掉直径<5mm的小结石，同时也较昂贵，尚未普遍应用。EUS也是一种有用的侵入性的术前诊断胆管结石的方法，其敏感性和特异性分别可以达到88%～97%和96%～100%，且可避免ERCP的并发症如胰腺炎等。但是上述影响学检查仅能发现已经形成的明确结石，不能更早的诊断如胆固醇结晶性结石或者对于具有成石高危人群的筛选和鉴别。
95%，不但能发现结石，还能提示胆管结石的间接征象如胆管扩张等，但其高度依赖检查者的经验和水平。腹部CT在诊断胆石症中也起到一定作用，既可确定结石的存在，CT值的测定据报道有助于胆石性质的确定。MRCP作为一种准确和无创的诊断方法，能清晰地显示胆管的解剖特征，使其诊断敏感性达到81%～100%，特异性达到92%～100%，和ERCP及IOC的准确性相当。但MRCP可能漏掉直径<5mm的小结石，同时也较昂贵，尚未普遍应用。EUS也是一种有用的侵入性的术前诊断胆管结石的方法，其敏感性和特异性分别可以达到88%～97%和96%～100%，且可避免ERCP的并发症如胰腺炎等。但是上述影响学检查仅能发现已经形成的明确结石，不能更早的诊断如胆固醇结晶性结石或者对于具有成石高危人群的筛选和鉴别。
[0004] 代谢组学(Metabolomics/Metabonomics)是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科，它是通过考察生物体系在遗传改变或受刺激或扰动后，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。所谓代谢组(Metabolome)是基因组的下游产物也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子质量小于1000的内源性小分子，这些内源性代谢小分子涉及糖代谢、能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢、核酸代谢、辅酶代谢等。
[0005] 正常状态下的生物体是一个完整的系统，生物体液、细胞和组织中的代谢过程维持一定的稳态，而代谢产物则处于动态平衡状态。机体由于遗传或者后天原因发生了病理变化，打破这种平衡，从而改变了代谢过程及其相应的代谢产物。通过代谢组学分析掌握代谢过程中的多种小分子在疾病过程中的变化，有助于人们寻找相关的生物标志物(biomarker)并用于辅助疾病诊断，也可帮助人们通过小分子物质本身涉及的代谢通路了解疾病的发病机制并以其靶点，涉及特异性的药物用于防治。近年来，代谢组学在人类各类疾病的研究中在疾病的早期诊断中取得了诸多具有重大意义的研究成果，如心血管疾病、肝胆疾病、糖尿病和癌症，相关论文发表在《Nature》、《Nature Medicine》、《Cell》、《Hepatology》和《Cancer Research》等学术期刊上，展现了代谢小分子在人类疾病诊断中巨大的潜力与价值。然而采用代谢组学分析与代谢异常相关所导致的胆石病的早期诊断和监测中的应用还未得到相应的关注。
[0006] 目前代谢组学研究常用技术包括液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气象色谱-质谱联用(GC-MS)及核磁共振技术(NMR)。核磁共振技术特点是对待测组分无破坏，样本前处理简单，但灵敏度较低；气相色谱-质谱联用具有较好的灵敏度和重现性，但一般要采用衍生化方法对样本进行前处理，使得实验步骤变得复杂。而LC-MS具有样本处理简单，灵敏度高，临床实用性强的特点，故而采用LC-MS进行代谢小分子的代谢组学分析，若能发现稳定的与胆石症发病相关的特异血浆代谢小分子作为生物标志物，并研发相应疾病的代谢小分子标志的LC-MS检测方法，对于更早发现胆石病，筛选胆石症高危人群，以及对于保留胆囊取石手术后患者再次复发的早期监控及指导预防具有重要价值。不仅在该领域处于国际领先地位，可创造令人瞩目的经济效益，对我国胆石症的防治也将是一次强有力的推动。
发明内容
[0007] 解决的技术问题：本发明的目的是提供一种与胆石症发生相关的血浆代谢小分子标志物。
[0009] 本发明再有一个目的是提供上述血浆代谢小分子标志物的色谱质谱检测用的诊断和监测试剂盒。
[0011] 上述标志物在制备胆石症诊断或监测试剂盒中的应用。
[0012] 胆石症诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有氧化三甲胺和三甲胺标准品。
[0013] 优选的，所述的试剂盒包括氚3H标记的氧化三甲胺稳定同位素内标物；氚3H标记的三甲胺稳定同位素内标物；试剂A：流动相用，含0.1wt.％的甲酸的水；试剂B：流动相用，含0.1wt.％的甲酸的乙腈；试剂C：沉淀蛋白用，含100wt.％甲醇；试剂D：复溶用，超纯水。
[0014] 该试剂盒还含有C18色谱柱，规格为100mm×2.1mm，粒径1.9μm。
[0015] 本发明通过UPLC-Q exactive MS的方法确定正常和胆石症患者血浆中具有较高丰度的代谢小分子。然后，在其中通过基于UPLC-Q exactive MS的代谢组学技术筛选与胆石症相关的代谢小分子，作为胆石症诊断以及诊断程度的指标。最后将筛选出的对应血浆代谢小分子的数量控制在2个，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。
[0016] 选用这2个代谢小分子的组合既能保证诊断的精确(灵敏度为68.13％,特异度为77.78％，ROC曲线下面积为0.7657)又能最大化减少检测成本，降低病人的经济负担，也利于临床推广使用。
[0017] 本发明详细描述如下：
[0019] 具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
[0020] 一、研究对象选择和分组依据
[0021] 第一阶段筛选阶段
[0022] 随机纳入正常共200人。
[0023] 1.年龄在25到70岁间；
[0024] 2.无脂肪肝、胃溃疡等消化道其他疾病；
[0025] 3.无吸烟、饮酒史；
[0026] 4.无手术史；
[0027] 5.无全身内分泌代谢、肿瘤等重大疾病；
[0028] 第二阶段验证阶段
[0029] 纳入病例和对照共200人。
[0030] A组：健康对照组(100人，健康无疾病正常人)：
[0031] 1.年龄在25到70岁间；
[0032] 2.无脂肪肝、胃溃疡等消化道其他疾病；
[0033] 3.无吸烟、饮酒史；
[0034] 4.无手术史；
[0035] 5.无全身内分泌代谢、肿瘤等重大疾病；
[0036] B组：胆石症病人组(100人，手术确诊为胆石症病人)：
[0037] 1.年龄在25到70岁间；
[0038] 2.无脂肪肝、胃溃疡等消化道其他疾病；
[0039] 3.无吸烟、饮酒史；
[0040] 4.无手术史；
[0041] 5.无全身内分泌代谢、肿瘤等重大疾病；
[0042] 二、UPLC-Q exactive MS代谢组学分析和胆石症诊断用代谢小分子筛选和验证[0043] 1.样本前处理
[0044] 1.1.新鲜血液于离心机3000rpm离心5min，取上清100μL分装至洁净1.5mL EP管中。
[0045] 1.2.50μL血浆用150μL甲醇(试剂C)沉淀蛋白。
[0046] 1.3.吸取上清，用氮气吹干再用真空干燥。
[0047] 1.4.用100μL水(试剂D)溶解干燥物。
[0048] 2.仪器检测
[0049] 2.1.分析仪器：UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色谱仪；QExactive高分辨质谱仪。
[0050] 2.2.液相条件：
[0051] 2.2.1液相色谱柱为C18色谱柱(100mm×2.1mm，粒径1.9μm)，柱温为40℃。
[0052] 2.2.2采用的流动相为流动相A含0.1wt.％甲酸的水(试剂A)和流动相B含0.1wt.％甲酸的乙腈(试剂B)，流速为400μL/min。
[0053] 2.2.3仪器梯度为：0-3min 1％试剂B(99％试剂C)，3-10min 1％到99％试剂B(99％到1％试剂C)，10-13min99％试剂B(1％试剂C)，13-13.1min 99％到1％试剂B(1％到99％试剂C)，13.1-17min 1％试剂B(99％试剂C)。
[0054] 2.2.4进样方式：体积10μL。
[0055] 2.3.质谱条件
[0056] 2.3.1加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析。
[0057] 2.3.2正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V。采用全扫模式，扫描范围：70到1050m/z；分辨率：70000；自动增益控制(ACG)：1×10-6charges；最大注射时间：30ms。
[0058] 3.物质定性和定量
[0059] 代谢小分子定性采用与氧化三甲胺和三甲胺标准品比对色谱信息(保留时间)和质谱信息(精确分子量、同位素分布和MS/MS碎片信息)，并实时比对样本中同位素内标标准品(氚3H标记的氧化三甲胺稳定同位素内标物和氚3H标记的三甲胺稳定同位素内标物)的色谱信息(保留时间)；定量采用氧化三甲胺和三甲胺标准品和同位素内标标准品(氚3H标记的氧化三甲胺稳定同位素内标物和氚3H标记的三甲胺稳定同位素内标物)的内标标准曲线法。
[0060] 4.数据分析
[0061] 生物标志物筛选采用多元线性回归筛选稳健的与胆石症有关的代谢物，再采用多元Logistic回归确认关键代谢物。
[0062] 5.健康对照组、胆石症组血浆样本中代谢小分子的差异和诊断意义
[0063] 经过校正纳入个体的年龄、性别、体质指数，多元线性回归分析发现血浆氧化三甲胺和三甲胺的含量与胆石症的发生呈正相关。经过校正年龄、体质指数、性别，多元Logistic回归分析发现血浆氧化三甲胺和三甲胺的含量增加显著提高了胆石症的风险。浓度分层—OR（表1）。采用独立人群应用上述代谢小分子组合诊断胆石症，灵敏度为68.13％，特异度为77.78％，ROC曲线下面积为0.7657，具有较高的诊断价值。
[0064] 表1
[0065]
[0066] 三、诊断试剂盒制备方法
[0067] 根据上述一系列实验结果，本发明还提供了一种能用于胆石症高危人群筛选及监测的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者血浆中稳定存在且可检测的氧化三甲胺和三甲胺的稳定同位素内标及氧化三甲胺和三甲胺的标准品。诊断试剂盒还包括一套血浆代谢小分子提取及色谱分离用试剂及器材。
[0068] 有益效果：本发明通过采用UPLC-Q exactive MS比较正常对照和胆石症患者血浆中的代谢小分子，发现了血浆中存在可用于评估患者是否胆石症，具有诊断价值的血浆代谢小分子标志物组合，以及该血浆代谢小分子标志物检测的UPLC-Q exactive MS的应用，研制出可便于临床应用的胆石症诊断、监测试剂盒。
[0069] 本发明采用血浆代谢小分子作为胆石症评价的标志物的优越性在于：
[0070] (1)血浆代谢小分子是一种新型生物标志物，其与疾病结局关联强，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高胆石症诊断的敏感性和特异性，该类小分子生物标志物的成功开发将为疾病生物标志物的研制提供借鉴。
[0071] (2)本发明提供的血浆代谢小分子标志物可用于胆石症的诊断标志物，更可在早期通过微创方式进行早期诊断、高危人群的筛选，特别是对行保留胆囊取石手术后病人再次复发前的检测和早期诊断，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。
[0072] (3)本发明采用胆石症和健康对照人群的血浆样本进行验证，证明了血浆中氧化三甲胺和三甲胺水平在预测胆石症中具有较高灵敏度和特异度，可作为筛选高危人群标志物使用。
[0074] 图1A胆石症B型超声检查图；
[0075] 图1B典型胆固醇结石图；
[0076] 图2胆石症手术所见图；
[0077] 图3代谢小分子波动水平曲线图；
[0078] 图4氧化三甲胺和胆汁胆固醇饱和度的相关性示意图；
[0079] 图5正常对照组和胆石症组之间的ROC曲线图（氧化三甲胺）；
[0080] 图6正常对照组和胆石症组之间的ROC曲线图（三甲胺）；
[0081] 图7正常对照组和胆石症组之间的ROC曲线图（氧化三甲胺和三甲胺联合指标）。
具体实施方式
[0082] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0083] 实施例1：
[0084] 研究对象选择和分组依据
[0085] 本发明于2011年7月到2012年6月间从同济大学附属上海东方医院胆石病中心采集符合要求的胆石症及正常非胆石症个体的血液（图1A和图1B：为胆囊结石超声和肉眼所见），通过对样品资料的整理，从中选择了符合要求的200例健康对照（平均年龄：45.1±6.3岁）、200例胆石症症患者（平均年龄：46.5±5.2天）作为胆石症代谢小分子生物标志物的筛选实验对象。具体的样品归类标准如下：具体的样品归
[0086] 类标准如下：
[0087] A组：健康对照组（n=100，75人筛选，25人独立人群验证）：
[0088] 1.年龄25-70岁；
[0089] 2.无消化系统疾病；
[0090] 3.无其他内分泌代谢、肿瘤等全身性重大疾病。
[0091] B组：胆石症症组（n=100，75人筛选，25人独立人群验证）：
[0092] 1.年龄25-70岁；
[0093] 2.经B超及手术验证为胆囊结石病(图2)；
[0094] 3.无其它消化系统疾病；
[0095] 4.无其他内分泌代谢、肿瘤等全身性重大疾病。
[0096] UPLC-MS代谢组学胆石症生物标志物筛选
[0097] 1.样本前处理
[0098] 1.1.新鲜血液(筛选阶段样本100例)于离心机3000rpm离心5min，取上清100μL分装至洁净1.5mL EP管中。
[0099] 1.2.50μL血浆用150μL甲醇(试剂C)沉淀蛋白。
[0100] 1.3.吸取上清，用氮气吹干再用真空干燥。
[0101] 1.4.用100μL水(试剂D)溶解干燥物。
[0102] 2.仪器检测
[0103] 2.1.分析仪器：UPLC Ultima te 3000sys tem(Dionex)高效液相色谱仪；QExactive高分辨质谱仪。
[0104] 2.2.液相条件：
[0105] 2.2.1液相色谱柱为C18色谱柱(100mm×2.1mm，粒径1.9μm)，柱温为40℃。优选液相色谱柱为Hypersil GOLD C18色谱柱(100mm×2.1mm，粒径1.9μm，Thermo Scientific，Germany)。
[0106] 2.2.2采用的流动相为(A)含0.1wt.％甲酸的水(试剂A)和(B)含0.1wt.％甲酸的乙腈(试剂B)，流速为400μL/min。
[0107] 2.2.3仪器梯度为：0-3min 1％试剂B(99％试剂C)，3-10min 1％到99％试剂B(99％到1％试剂C)，10-13min99％试剂B(1％试剂C)，13-13.1min 99％到1％试剂B(1％到99％试剂C)，13.1-17min 1％试剂B(99％试剂C)。
[0108] 2.2.4进样方式：体积10μL。
[0109] 2.3.质谱条件
[0110] 2.3.1加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析。
[0111] 2.3.2正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V。采用全扫模式，扫描范围：70到1050m/z；分辨率：70000；自动增益控制(ACG)：1×10-6charges；最大注射时间：30ms。
[0112] 3.物质定性和定量
[0113] 代谢小分子定性采用与氧化三甲胺和三甲胺标准品比对色谱信息(保留时间)和质谱信息(精确分子量、同位素分布和MS/MS碎片信息)，并实时比对样本中同位素内标标准品(氚3H标记的氧化三甲胺稳定同位素内标物，氚3H标记的三甲胺稳定同位素内标物)的色谱信息(保留时间)；定量采用氧化三甲胺和三甲胺标准品和同位素内标标准品(氚3H标记的氧化三甲胺稳定同位素内标物，氚3H标记的三甲胺稳定同位素内标物)的内标标准曲线法。
[0114] 4.数据分析
[0115] 生物标志物筛选采用多元线性回归筛选稳健的与胆石症有关的代谢物，再采用多元Logistic回归确认关键代谢物。
[0116] 5.健康对照组、胆石症组血浆样本中代谢小分子的差异和诊断意义
[0117] 经过校正年龄、体质指数、性别，多元线性回归分析发现血浆氧化三甲胺和三甲胺的含量与胆石症的发生呈正相关。经过校正年龄、体质指数、性别，多元Logistic回归分析发现血浆氧化三甲胺和三甲胺的含量增加显著提高了胆石症发生的风险(表1)。
[0118] 血浆代谢小分子的稳定性分析
[0119] 采用实施例1同样的采集方法采集10名胆石病人的血浆，采用实施例2的方法对血浆氧化三甲胺和三甲胺水平的稳定性进行评价(间隔时间为2周)。结果显示，血浆中氧化三甲胺和三甲胺测定水平稳定(图3)，具备作为诊断/监测标志物的特性。
[0120] 代谢小分子组合对胆石症的诊断
[0121] 根据上述UPLC-Q exactive MS代谢组学方法，本发明人通过对独立人群200病例和200对照(验证阶段样本250例)的血浆样品检测氧化三甲胺和三甲胺，以此绘制ROC曲线并评估预测的灵敏性和特异性，进而评估检测血浆中这2个代谢小分子水平对胆石症的评估能力。
[0122] 胆汁胆固醇饱和指数增加是结石形成的必要条件。检测显示：氧化三甲胺和胆石病人胆汁的胆固醇饱和度具有密切的正相关性（图4）。
[0123] 氧化三甲胺的灵敏度为53.85％，特异度为74.62％，ROC曲线下面积为0.6503(图5)；三甲胺灵敏度为45.26％，特异度为77.71％，ROC曲线下面积为0.6606(图6)。
[0124] 氧化三甲胺和三甲胺组合的灵敏度为68.13％，特异度为77.78％，ROC曲线下面积为0.7657(图7)。
[0125] 故而氧化三甲胺和三甲胺组合具有较好地诊断胆石症的能力。
[0126] 用于胆石症血浆代谢小分子检测和诊断试剂盒的制作
[0127] 此试剂盒包括一批血浆代谢小分子检测用试剂和耗材，其中代谢小分子的定性和定量采用氧化三甲胺和三甲胺的标准品，辅助定量和辅助定性采用氚3H标记的氧化三甲胺稳定同位素内标物，氚3H标记的三甲胺稳定同位素内标物。其它还有用于UPLC色谱分离的配套反向色谱柱(C18色谱柱，100mm×2.1mm，粒径1.9μm)、用于沉淀血浆蛋白的试剂(100％甲醇)，用于提取代谢小分子的试剂(100％超纯水)，用于流动相的试剂(含0.1wt.％的甲酸的水和含0.1wt.％的甲酸-乙腈)。此试剂盒的价值在于只需要100μL血浆，即可检测血浆代谢小分子标志物的含量，再通过含量评判胆石症发生可能性或诊断胆石症，并易于进行动态监测和观察治疗效果。
[0128] 具体试剂盒组成举例如下：
[0129] 氧化三甲胺标准品；
[0130] 三甲胺标准品；
[0131] 氚3H标记的氧化三甲胺稳定同位素内标物；
[0132] 氚3H标记的三甲胺稳定同位素内标物；
[0133] 试剂A(含0.1wt.％的甲酸的水)；
[0134] 试剂B(含0.1wt.％的甲酸的乙腈)；
[0135] 试剂C(含100wt.％甲醇)；
[0136] 试剂D(100wt.％超纯水)；
[0137] 该试剂盒还含有C18色谱柱：100mm×2.1mm，粒径1.9μm。
[0138] 以上实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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