发明的领域

这项发明涉及免疫学和医学两个领域。主要指一类新的杂交瘤细胞 株，这类细胞株所分泌的单克隆抗体能特异性地结合临床上所谓的结肠癌 相关抗原。这种单克隆抗体对体内免疫检测和免疫治疗是有用的。同时还 可以用来检测和纯化结肠癌相关抗原。

技术背景

在癌的发生过程中，在细胞上出现许多细胞表面分子或标记。这种肿 瘤相关标记包括：癌胚蛋白，新糖蛋白，鞘脂以及原来表面蛋白质的修饰。 而这些新产生的和结构改变了的分子经常从肿瘤细胞表面脱落下来，并出 现在血清或其它体液中。对这些物质或“肿瘤标志”的检测可为诊断或监 测癌性病变的发生发展提供依据。

早期的动物实验发现，在这些肿瘤标志中，有一类细胞膜蛋白或糖蛋 白抗原具有免疫原性。进一步的实验发现，当癌症病人的原发灶被手术切 除后，这种抗原能够有效地阻止新的癌组织的生长。

Hollinshead和Stewart用肺癌患者的癌组织制成比较纯的制剂试图将 比较相似的肿瘤相关抗原用于临床治疗(Stewart，T.H.M.et al.，Ann. N.Y.Acad.Sci.277：436(1976)).以后这一研究工作又进一步开展到黑色素瘤 和结肠癌患者，而不同种类的同种异型较纯制剂是和弗氏佐剂同时使用 的。(Hollinshed，A.C.et al.Cancer 49：1387(1982)；Hollinshead，A.C.et al.， Cancer 56：480(1985)).

同时使用弗氏佐剂的原因是由于科学家发现，这种佐剂与正常组织抗 原的共同使用，可以引起动物受体强烈的自身免疫反应。相反，若没有同 时使用这一佐剂，则没有副作用的发生。因此，科学家认为佐剂可以促进 宿主巨噬细胞的抗原加工，并延长抗原在作用部位的反应时间(请查阅Roitt， I.，Essential Immunology，6th Ed.，Blackwell Scinetific Publication， 0xford(1988)).

正是由于以上的这些实验结果，科学家开始尝试着在临床上用特异的 人类肿瘤细胞膜的蛋白和糖蛋白作为肿瘤疫苗。接着，各种各样已被分离 的肿瘤相关抗原能够延长患者的存活期，甚至在一些实验中抑制了转移灶 肿瘤的生长。

随着单克隆抗体技术的产生与完善，科学家便能得到纯化了的抗体， 并以此来纯化和定义不同的肿瘤标志性分子和肿瘤相关抗原，最后用这些 抗体进行免疫诊断和免疫治疗。许多单抗对肿瘤抗原表现出不同程度的选 择性，其中有些抗原可以同时出现在多种不同类型的肿瘤上，而另一些则 表现出很强的肿瘤特异性，以下就介绍一些：

Herlyn及其同伴(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：1438(1979))通过用人类 直肠结肠癌(CRC)细胞来免疫小鼠后得到两种单抗，这两种单抗都能选择 性地与人类CRC细胞相互作用。现在已经证明其中一个单抗，1083-17 (17-1A的前体)，是与41KD的糖蛋白反应的。

Herlyn等(J.Clin.Immunol.2：135(1982))得到了一个抗SW116细胞株膜 抗原的单抗，用这个单抗可以检测体循环中的CRC相关抗原。单抗19- 9和52a能识别单唾液酸神经节苷脂抗原(Magnani，J.L.等，science 212：55(1981)，在临床上则能与12种细胞株中的8种、一种胃癌细胞、一 种胰腺癌细胞反应。单抗C414能与4/6的培养CRC细胞、胃癌细胞反应。 并且，单抗19-9和52a与肿瘤细胞的结合会被CRC患者的血清所抑制。 然而，胃癌患者的血清和胰腺癌患者的血清比CRC患者的血清更易于抑制 单抗与肿瘤细胞的结合。

1986年，Girardet及其同伴(J.Im munol.136：1497-1503(1986)) 发现了抗人类结肠癌的单抗.L-D1单抗能与一种41KD的糖蛋白反应， 这种糖蛋白可能就是单抗1083-17-1A所识别的抗原(Herlyn et al，1979，参见前述)。单抗L-C5则能沉淀分子量分别为43，45，47和53 KD的LoVo结肠癌细胞来源的蛋白。L-D1同时也能与子宫颈癌株反 应，L-C5乳腺癌细胞株反应，但它们与胰腺癌瘤细胞反应如何还不知 道。

1987年，Greiner及其同伴(Science 235：895-898(1987))发现了单 抗06.2，它能与一种90 KD的糖蛋白反应。而在75-80％的乳腺癌患 者和90％以上的结肠癌患者体内发现了这种糖蛋白的存在。

Sakamoto及其同伴则发现了一系列通过其他途径能够诊断并治疗人 类结肠癌的单抗(美国专利4,579,827(4/1/86))。而所有这些单抗中没有一 种能与分子量分别为61或72 KD的人类结肠癌相关抗原蛋白反应的性 能，正是这一性质使其有别于我们发明的抗体。而且，Sakamoto的单抗 与我们发明的单抗在特异性上没有任何相同之处。

1986年，Delaloye及其同事(J.Clin.Invest.77：301(1986))用CEA特 异性的单抗在体内检测结肠直肠癌，具体是借助与123I标记片段和计算机 模拟其释放出的同位素的拓扑结构。然而，这种单抗与我们所发明的单抗 没有任何关系。

1986年，Douillard及其同事(Hybridoma 5，Suppl.1：S139(1986))发 现了单抗17-1A，以及它在体外对胃-小肠腺癌细胞的毒性，而在某 种程度上，单抗17-1A在免疫治疗试验中是成功的。单抗17-1A能 够识别38-41 KD的蛋白并有广泛的反应性，但它对结肠癌肿瘤并无特 异性，这就表明了它与我们所发明的抗体的明显的差别。

Scannon等美国专利4,590,071(5/20/86)公开的单抗就结合了诸如 ricinA链的毒蛋白，这些结合成份有治疗黑色素瘤的功能，而这一单抗能 特异性识别黑色素瘤抗原。然而，还没有发现针对结肠癌抗原和抗体的单 抗，以及这类单抗的使用。

Hollinshead等在1972年(Science 177：887-889(1972))已经报道了抗原 的相对较纯的制备物，这些抗原制备物含有免疫原性的结肠癌细胞膜抗 原，也正是我们的抗体所识别并结合的部位。

在临床上如何评价上述抗原制备物的价值，也已经由Hollinshead等(参 见前述1985)报道了，主要包括该抗原制备物的免疫原性，以及通过增强 特异性主动免疫以延长患者的存活期。

在Intl.Symp.Biotech.in Clin.Med.，Rome，Italy，April 13-15，1987上， Tsang等在“抗人类结肠癌相关抗原的单抗″一文中简述了本发明的工作。 这篇参考文献的公开发表离本专利申请的基本原始申请专利(美国专利申 请序号为07/176,337)的时间还不足一年。

发明的概要

本发明的发明者已经制成了能针对结肠癌相关抗原的鼠源单抗和鼠- 人嵌合抗体，而结肠癌相关抗原被认为对人类具有免疫原性。这些在发明 者实验室内分离得到的抗原是不同于前面所讲的结肠癌抗原的，理由如 下：1.单抗所识别的表位并不是肿瘤相关糖蛋白的糖部分，而是蛋白部 分；2.这一抗原在正常的组织中并不表达；3.这些抗原具有肿瘤特异性， 存在于结肠癌，乳房癌和卵巢癌的肿瘤组织内；4.这些抗原能同时通过细 胞反应和体液反应来增强宿主的抗肿瘤的免疫能力，因此它们对于人类是 有免疫活性的；5.抗原的免疫原性对于人类是具有特异性的，因为只有结 肠癌，乳腺癌和卵巢癌的患者才表现出对这些抗原的免疫学特异性，而对 其它的肿瘤则没有特异性，这已经通过体内体外的免疫学实验证实了。

本发明的单抗和嵌合抗体能应用于结肠癌，乳腺癌和卵巢癌的诊断与 治疗。例如：描绘肿瘤的转移；传递细胞毒性成份至肿瘤部位；激活诸如 抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或者补体依赖性细胞毒性(CDC)的宿主效应 机制来直接杀死肿瘤细胞。

本发明是一种针对结肠癌相关抗原蛋白的单克隆抗体，而这种结肠癌 相关抗原对人类具有特异的免疫原性，在正常的人体组织或其它的肿瘤(除 了结肠癌，乳腺癌和卵巢癌以外)内并不能发现这些抗原。另外本发明还包 括抗原结合片段或抗体的衍生物。

本发明的另一部分是特异性针对一种人类结肠癌相关蛋白抗原的嵌合 抗体，而在正常的人体组织或其它的肿瘤(除了结肠癌以外)内并不能发现 这种抗原。

在一实施例中，该抗体对一分子量约为61KD的CCAA蛋白特异。在 另一实施例中，该抗体对一分子量为72KD的CCAA蛋白特异。在一最佳 实施例中该抗体是小鼠单克隆抗体33.8或31.1，或者是与33。28、31.1 一样能特异地结合在相同的结肠癌相关抗原的抗体。在另一最佳实施例 中，抗体是一种小鼠/人嵌合抗体Chi#1，它如同31.1那样能特异性地与相 同的结肠癌相关表位结合。

本发明中的抗体是能在固定在固相物上。

本发明包括上述的经标记后能检测的抗体，如同位素标记的抗体。

在附加的实施例中，上述的抗体还能与具有细胞毒性的放射性核素、 药物、蛋白结合。

又在另一个实施例中，本发明还包括能抗上述抗体的单抗，即第二次 产生的单抗。

在一更深一层的实施例中，本发明还包括第三次产生的单抗，即对抗 上述二抗的单克隆抗体。

本发明所针对的结肠癌相关抗原也是唯一的，理由如下：1.单抗所识 别的表位并不是肿瘤相关糖蛋白的糖部分，而是蛋白部分；2.这一抗原在 正常的组织中并不表达；3.这些抗原具有肿瘤特异性，存在于结肠癌，乳 房癌和卵巢癌的肿瘤组织内；4.这些抗原能同时通过细胞反应和体液反应 来增强宿主的抗肿瘤的免疫能力，因此它们对于人类是有免疫活性的；5. 抗原的免疫原性对于人类是具有特异性的，因为只有结肠癌，乳腺癌和卵 巢癌的患者才表现出对这些抗原的免疫学特异性，而对其它的肿瘤则没有 特异性，这已经通过体内体外的免疫学实验证实了。

到目前为止，所有其它纯化的并已经使用的抗原都不能引发细胞性或 体液性免疫反应。

本发明还为结肠癌、乳腺癌和卵巢癌提供了有效的药物组份，该组份 是包含有与具有细胞毒性的放射性核素，具有细胞毒性的药物或具有细胞 毒性的蛋白结合的在一合适的赋形剂中如上述的抗体、片段或衍生物。

本发明还包括一种免疫检测方法，可以检测样品中能够与鼠单抗 33.28、31.1或Chi#1结合的结肠癌相关抗原的存在。这包括：

(a)用上述抗体接触样品；以及

(b)通过检测所结合的抗体来检测抗原的多少。

在另一个最佳实施例中，本发明还提供了用成象的方法来检测宿主中 结肠癌相关抗原的存在，这包括：

(a)将标记好的抗体接触宿主；以及

(b)检测抗原。

本发明包括一个杀死携带有结肠癌相关抗原的细胞的方法，这包括：

(a)将上述抗体及一种具有细胞毒性的效应剂传递给细胞；以及

(b)杀死细胞。

执行杀死细胞的任务的成份可以是补体，或是在ADCC中被激活的效 应细胞。也可以是有直接发挥杀死作用的已经结合了细胞毒性成份(放射性 核素、药物、蛋白)的标记的抗体。

本发明还提供一种治疗方法来治疗被怀疑已经患上了结肠癌、乳腺 癌、卵巢癌的人，这些人往往携带了能与33。28、31。1单克隆抗体、 Chi#1结合的抗原，这一治疗可以用如上所述的药物组份的有效剂量。

另外还提供了一个用于临床免疫治疗结肠癌、乳腺癌、卵巢癌的生产 具有免疫原性的组份的方法，这包括：

(a)制备一个含有能与33.28单抗或31.1单抗或Chi#1抗体结合的抗 原的肿瘤或细胞系的细胞膜提取物；以及

(b)运用上述抗体用亲和纯化的方法分离抗原。 这样就能生产具有免疫原性的组份。

在另一实施例中，本发明还包括应用上述的抗原来制成疫苗。

本发明也包括一个检测和诊断结肠癌、乳腺癌、卵巢癌的方法，具体 通过标记结合在人类结肠癌相关抗原上生物单抗或嵌合抗体。

在另一实施例中，本发明也包括可以选择性地鉴定结肠癌、乳腺癌、 卵巢癌的试剂盒。

图表的简要描述

图1是一个Hollinshead“疫苗“的HPLC洗脱液特征图象的记录图形， 所谓的“疫苗“是指一个部分纯化的结肠癌细胞膜的提取物。

图2是一个结肠癌相关抗原的HPLC洗脱液的记录图形，这个抗原是 通过对图1中峰4内的物质进行亲和纯化所得到的。

图3的图象描述单抗31.1在异体移植了人类肿瘤LS-174T后的裸 鼠体内的生物分布。

图4则是单抗33.28在异体移植了人类肿瘤LS-174T后的裸鼠体内 的生物分布图象。

最佳实施例的说明

本发明提供了抗体，包括单抗和嵌合抗体，这些抗体特异性地能结合 具有免疫原性的人类结肠癌相关抗原(CCAA)，这些抗原是天然的蛋白。 这些抗体用于诊断和治疗已经患有或正在生成结肠癌、乳腺癌、卵巢癌的 病人。

此项发明不仅仅提供了鼠单抗，而且还有由同一个单抗的V区所组成 的嵌合抗体，它同样能够识别CCAA区段。

这里的“区段“是指能被抗体识别并结合的那部分分子。通常，区段 由具有化学活性的界面分子簇所构成，比如氨基酸、糖链，这些分子有着 特殊的三维结构和特殊的电荷特性。本发明所关注的区段由氨基酸构成。

这里的“抗原“是指能够被一个抗体结合的分子或部分分子，它们还 能诱导动物产生能结合到其自身区段上去的抗体。一个抗原可以含有一个 或一个以上区段。上述的反应是高度选择性的，抗原只能与相关的抗体反 应。

这里的“抗体“是包括完整的免疫球蛋白分子、及它的片段和衍生物， 例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv，它们都能与抗原结合。这些抗体片段缺 少完整抗体的Fc片段，在血液中清除较快，而且比其他完整抗体少了非特 异性组织结合(Wahl et al.，J.Nucl.Med.24：316-325(1983))。这些片段都是 应用很成熟的方法从完整的抗体上剪切下来的，比如应用木瓜蛋白酶和胃 蛋白酶就能分别得到Fab和F(ab′)2片段。

一个抗体的″衍生物″包含非蛋白结构的化学组分。蛋白的共价修饰 包含于这发明中。通过使抗体的靶氨基酸残基与能和选择的侧链或末端残 基作用的有机衍生物发生反应，此类修饰即可引入分子内。例如，双功能 药物的衍生对抗体或片段与非水溶性支持物或其它大分子载体的连接非常 有用。

″疫苗″是指一类用于刺激生物的免疫系统来提供对抗未来感染药物 侵害的免疫防护的药物，本发明预期的疫苗对病人的给药可以采用任何已 知或标准技术。这些包括口服，肠插管或支气管-鼻喷雾。其他投药方法， 如使微生物达到人或动物血流的静脉注射，在微生物载体不能复制时是可 接受的。

本发明的抗体是新颖的。它们是第一个已知的单克隆抗体(mAb)，并且 是针对人体内肿瘤抗原致免疫性的CCAA特异性的嵌合抗体。现有发明的 抗体识别的抗原可诱发结肠癌、乳腺癌和卵巢癌病人的免疫反应，但对其 它类型的癌症病人无反应。这些抗原的免疫原性主要表现为细胞介导的免 疫性，并可通过以下方法检测：体内延迟皮肤过敏分析(″皮肤测试″)或对 体外各种特异性淋巴细胞反应的分析，如淋巴细胞增殖或转移抑制分析。 关于免疫原性的普通原则和各种特异性免疫反应的分析参见下列查考文 献：Roitt，I.，Essential Immunology，6th Ed.，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1988)；Roitt，I.et al.，Immunology，C.V.Mosby Co.， St.Louis，MO91985)；Klain，J.，Immunology，Blackwell Scientific Publications，Inc.，Cambridge，MA(1990)；Klain，J.，Immunology；The Science of Self-Nonself Discrimination，John Wiley & Sons，New York，NY(1982)； Paterson，P.Y.，Textbook of Immunopathology，Grune and Stratton，New York，(1986).

在一最佳实施例中，本发明抗体是鼠源单克隆抗体指定为33.28。在 另一最佳实施例中，抗体是鼠源单克隆抗体指定为31.1。在再一个最佳实 施例中，抗体是识别由33.28确认的表位的嵌合抗体。在另再一实施例中， 抗体是识别由31.1确认的表位的嵌合抗体。

本发明的嵌合抗体包含不同免疫球蛋白(Ig)的重链(H)和轻链(L)。 嵌合H链包含一个来自特异性对由33.28或31.1识别的表位的非人体抗体 的H链的抗原结合区，它至少与人体H链C区一部分连接(CH)。

一个最佳的嵌合L链包含一个来自33.28或31.1的单克隆抗体的L 链的抗原结合区，它至少与人体L链C区的一部分连接(CL)。

或者，一个最佳的嵌合H链包含一个来自33.28或31.1的单克隆抗 体的L链的抗原结合区，它至少与人体L链C区的一部分连接(CL)。

文中的术语″抗原结合区″是指抗体分子中与抗原作用，并提供抗体 特异性和抗原亲和性的氨基酸残基部分。抗体区域包括对维持抗原结合残 基的适当构型而必需的″框架″氨基酸残基。

文中的术语″嵌合抗体″包括单价、二价或多价免疫球蛋白。一个单 价嵌合抗体是由通过二硫键连接的嵌合H和L链组成的二聚体。一个二 价嵌合抗体是由两个至少通过一个二硫键连接的HL二聚体构成的四聚 体。同样也可获得多价嵌合抗体，例如，通过H链C区的聚合(如，IgM H或μ链)。

本发明也提供mAb或嵌合抗体的衍生物。它包括由为产生功能类似 于Ig片段的分子类型而截短或修饰的基因所编码的蛋白。这种修饰包括 加入编码细胞毒蛋白如植物和细菌毒素的基因序列，但不局限于此。这些 片断和衍生物可来源于原核和真核宿主，类似本文中描述的重组方式。它 们可来源于化学过程，如完整Ig分子的蛋白切割，或文献中讲述的其它化 学修饰或衍生方式。此类衍生组分可提高溶解性、吸收率、生物半衰期和 其它有益特性，同样也可选择地消除或减弱抗体蛋白的任何有害副作用。 能够产生此类作用的组分已有报道。(见文献Remington′s Pharmaceutical Sciences，16 th ed.，Hack Publishing Co.，Easton，PA(1980))。

具有相同或不同V区结合特异性的嵌合H和L链的抗体、片段或衍 生物可通过不同多肽链的连接来制备(见文献Sear等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 72：353-357(1975))。通过这种方法，表达嵌合H链(或其衍生物) 的宿主与表达嵌合L链(或其衍生物)的宿主进行分别培养，在培养基质 中链自发连接，然后恢复装配的Ig、片段或衍生物。

产生对CCAA特异的mAb的小鼠杂交瘤细胞，如本发明的33.28和 31.1的mAb，是通过小鼠融合配偶体细胞，如SP2/0细胞，与CCAA免 疫化小鼠的脾脏细胞融合而成。

小鼠可通过含有目的抗原的粗或半纯制备物免疫化，如Hollinsheed″ 疫苗″是半纯化的结肠癌细胞膜制备物。为使小鼠免疫化，可采用多种传 统方法。例如小鼠可接受抗原制备物的基本和激发(boosting)免疫法。

细胞融合可通过免疫领域熟知的标准程序完成(见文献Kohler and Milstain，Nature 256：495-497(1975)and美国专利No.4,376,110；Hartlow，E. et al，supra；Campbell，A.，″Monoclonal Antibody Techology″In：Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Volume 13(Burdon，R.， et al，eds.)，Elsevier，Amsterdam(1984)；Kennett et al.，Monoclonal Antibodies (Kennett et al.，eds.pp.365-367，Plenum Press，NY，1980)；da St.Groth，S.F.. et al.，J.Immunol.Meth.35；1-21(1980)；Galfre，G.，et al.，Methods Enzymol. 73：3-46(1981)；Goding，J.W.1987，Monoclonal Antibodies；Principles and Practice，2nd ed.Academic Press，London，1987)。

融合配偶体细胞系和融合、选择杂交瘤细胞以及筛选mAb的方法已 很成熟。(见文献Hartlow，E.et al.，Supra；Kawamoto，T.etal，Meth.Enzymol. 121：266-277(1986)；Keamey，J.F.et al.，J.Immunol.123：1548-1550(1979)； Kilmartin，J.V.et al，J.Cell Biol.93：576-582(1982)；Kohler，G.et al.，Eur.J. Immunol.6：292-295(1976)；Lane，D.P.et al.，J.Immunol.Meth.47：303- 307(1981)；Mueller，U.W.et al.，J.Immunol.Meth.87：193-196(1986)； Pontacorvo，G.，Somatic Cell Genet.1：397-400(1975)；Sharo.J.，et al.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 76：1420-1424(1979)；SHulman，M.et al，Nature 276：269-270(1978)；Springer，T.A.(ed)，Hybridoma Techology in the Biosciences and Medicine，Plenum Press，New York，1985；and Taggart，R.T. et al.，Science 219：1228-1230(1982)).

本发明的mAb可通过以下方法大量制备：向小鼠腹腔注射分泌抗体 的杂交瘤细胞，适当时间之后，收集含有高效价mAb的腹水，并分离 mAb。或者，可通过体外培养杂交瘤细胞并从细胞培养基质中分离mAb。

编码本发明嵌合抗体的C区的人体基因来源于表达、产生人体Ig的 细胞。人体H链C区可来源于任何已知种类或同型的人体H链，包括γ， μ，α，δ或θ。由于H链类型负责抗体的多种效应功能，选择H链C 区应受目的效应功能的指导，如补体固定或抗体依赖性细胞毒性。理想的 H链C区来源于γ1(IgG1)，γ3(IgG3)，γ4(IgG4)和μ(IgM)。

人体L链C区可来源于人体同型L链，卡巴或λ。

编码人体IgC区的基因可通过标准克隆技术从人体细胞中获得 (Sambrook.J.et al，Molecular cloning；A Laboratory Manual，2 nd Edition， Cold Spring Harbor，Press，Cold Spring Haxbor，NY(1989))。人体C区基因存 在于知表达两类L链和五类H链的基因克隆中。嵌合抗体片段，如F(ab′)2 和Fab，可通过设计经适当截短的嵌合H链基因而获得，例如，编码F(ab′)2 片段H部分的嵌合基因包括编码CH1区和H绞链区的DNA序列，尾随 一个翻译终止密码子以产生截短的分子。

通常，现有发明的嵌合抗体是通过克隆编码CCAA特异性抗体的H 和L链抗原结合区的DNA片段而制备，优先是非人体基因，最佳的是 33.28或31.1中的基因，然后把这些片段同编码人体H链C区和L链C 区的DNA片段相连，以制备编码嵌合Ig的基因。

因此，在一最佳实施例中，创造的融合基因至少编码一个非人体起源 的Ag结合区，如带有连接片段(J)的功能重排的V区，并且至少与一个 编码部分人体C区的第二DNA片段相连。这种融合可应用PCR完成如 由Temando等所报道的(见文献Miami Symp.Short Reports 3：88，1993)。

编码抗体结合区的DNA可以是基因组DNA或cDNA。选取染色体 基因片段作为编码小鼠V区抗原结合片段的DNA源的一种方便选择就 是应用cDNA构建嵌合Ig基因(见文献Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84：3439(1987)和J.Immunology 139：3521(1987))。cDNA的应用要求 适合于宿主细胞的基因表达元素应与基因结合，以获得目的蛋白的合成。 应用cDNA序列比基因组序列(含内含子)更有利，因为cDNA序列可在 缺少适当RNA剪接系统的细菌或其它宿主中表达。

因此，在应用编码抗体V区的cDNA方式中，制备嵌合抗体的方法 可概括为如下几步：

1.从产生mAb的细胞系中分离mRNA，克隆和cDNA产物来源于 此。

2.以纯化mRNA制备全长cDNA文库，从中适当的L和H链的V 区基因片段可以：(I)以适当探针鉴定；(II)测序；(III)与C区基因片段匹配。

3.由cDNA制备物和克隆制备C区基因片段。

4.如上所述，通过连接克隆的特异V区基因和克隆的人体C区基因， 可构建编码完整的H或L链的序列。

5.在选择的宿主中，包括原核和真核细胞，表达和制备嵌合L和H 链。

所有IgH和L基因及它们编码的mRNA的一个共同特征就是J 区。H和L链的J区有不同的序列，但序列同源性较高(＞80％)，尤其在C 区附近。此同源性在这种方法中得到了应用，并且H和L链的J区的相同 序列可用来设计寡核苷酸引物，用于在J区中引入有用的限制位点，以便 以后V区片段与人体C区片段的连接。

从人体细胞中制备的C区cDNA载体可经定位诱变在人体序列的相 似位置加入限制位点。例如，人们可克隆完整的人体卡巴链C区和完整的 人体γ-1C区。在这种情况下，以基因组C区克隆作为C区载体源的其 它方法，不能使这些基因在缺乏清除插入序列的必需酶的细菌系统中表 达。克隆的V区片段被剪出并连接于L或H链的C区载体。或者，人 体γ-1C区可如此修饰：引入终止密码子，进而产生编码Fab分子的H 链部分的基因序列。这样，带有V和C区的编码序列可转移入适当的表 达载体中，用来在适当的宿主如原核和真核细胞中进行表达。

如果连接导致一个连续地可翻译序列，而没有改变或中断三联子阅读 框架，两个DNA编码序列可称为是″可操作地连接″。如果此连接导致 基因表达元素的正常功能，从而使DNA编码序列表达，那么此DNA编 码序列就被可操作地连接于该基因表达元素了。

表达载体包括质粒或其它载体。其中较佳的是携带含恰当嵌入限制位 点的功能完整的人体H或L链C区序列的载体，以便任何带有适当粘性 末端的H或L链V区序列可轻易地插入。这样，含人体H或L链C 区序列的载体就作为在任何适当宿主中表达任何目的完整H或L链的中 间物。

典型地，小鼠-人体抗体可从构建物中天然的小鼠H和L链V区的 染色体基因启动子驱动的基因来合成；剪接通常出现于小鼠J区的剪接供 点和人体C区前剪接受点之间；也可出现于人体H链C区内剪接区域之 间；聚腺苷酸化和转录终止发生于人体天然染色体编码区位点的下游。

对cDNA基因表达有用的基因表达元件包括：(a)病毒转录启动子和它 们的增强子元件，如SV40早期启动子((见文献OkayamaH.et al，Mol.Cell Biol.3：280(1983))，鲁氏肉瘤病毒LTR(见文献Gorman.C，等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 79：6777(1982))和Moloney小鼠白血病病毒LTR(见文献 Grosschedd，R.et al，Cell 41：885(1985))。(b)衍生于SV40晚期区域的剪接 区域和聚腺苷酸化位点(见文献Okayama等，参见前述)。(c)聚腺苷酸 化位点，如SV40内(见文献Okayama等，参见前述)。

Ig cDNA基因可如此表达(见文献Liu等，参见前述，及Weidle等， Gene 51：21(1987)))：以SV40早期启动子及其增强子，小鼠IgH链 启动子的增强子，SV40晚期区域mRNA剪接，兔β-珠蛋白插入序列，Ig 和兔β-珠蛋白聚腺苷酸化位点和SV40聚腺苷酸化位点作为表达元件。对 于由部分cDNA，部分基因组DNA组成的Ig基因(见文献Whittle 等，Protein Engineering 1：499(1987))，转录启动子可以是人体″CMV″，衍 生于CMV和小鼠/人Ig启动子的增强子，或衍生于天然染色体Ig序列的 mRNA剪接和聚腺苷酸化区。

在一实施例中，为了在啮齿类细胞内表达cDNA，转录启动子是病毒 LTR序列，转录启动子的增强子或是小鼠IgH链增强子，或是病毒LTR 增强子，剪接区是包含大于31bp的内含子，并且聚腺苷酸化和转录终止 区来自对应于合成Ig链的天然染色体序列。在其它方式中，编码其它蛋 白的cDNA序列结合于上述表达元件，以获得哺乳细胞中蛋白的表达。

每个融合基因装配或插入于一个表达载体，然后用一个编码嵌合H或 L链的基因进行单独转染能够表达嵌合Ig链基因产物的受体细胞；或者用 一个编码嵌合H和L链的基因共同转染。在允许掺入基因表达的条件下 培养转染的受体细胞，并从培养物中恢复表达的Ig链、完整抗体或片段。 在实施例中，编码嵌和H和L链的融合基因或其部分，装配于不同的表 达载体，再用来共同转染受体细胞。

每个载体可包含两个选择基因，一个用于细菌系统的选择，另一个用 于真核系统的选择，因此每个载体具有不同对基因。这个策略产生了细菌 系统内融合基因的指导生产、允许扩增的载体。进而，此类在细菌宿主中 制备和扩增的基因可用于共同转染真核细胞，并允许携带目的转染基因的 共转染细胞的选择。

在细菌系统中可以选择使用的基因有抗氨苄青霉素基因和抗氯霉素基 因。在真核转染中选择的基因以黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt) 和Tn5磷酸转移酶基因(neo)为好。选择表达gpt的细胞的依据是这一基因 所编码的酶以黄嘌呤作为底物来合成嘌呤核苷酸，而同类的内源性的酶则 不然。在含有霉酚酸的培养基上，单磷酸次黄嘌呤无法转化为单磷酸黄嘌 呤和黄嘌呤，只有表达了gpt的细胞方可存活。neo的产物阻止了G418和新 霉素类抗生素对蛋白质合成的抑制作用。

这二种方法可同时选用亦可顺序进行以使免疫球蛋白链基因由二种不 同的DNA载体介导进入真核细胞表达。但真核细胞不需要不同的选择标 记。一条H链载体和一条L链载体各有一个同样的选择标记，可以同时转 染。筛选出未转染的细胞后，克隆的大部分将包含完整的含H和L链载体的 拷贝。

或者，编码嵌合性H和L链的融合基因可能装配在同一表达载体上。

对于表达载体的转染和嵌合性抗体的产生，受转染的细胞系以骨髓瘤 细胞优先。骨髓瘤细胞可以合成、聚集和分泌有转染的免疫球蛋白基因编 码的免疫球蛋白并具备使免疫球蛋白糖基化的机制。而特别优先的受转染 的细胞系是Ig-non-producing骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC #CRL 8287)。SP 2/0 只产生转染的基因编码的免疫球蛋白。骨髓瘤细胞可培养获得，或接种于 小鼠的腹腔中生长，分泌的免疫球蛋白可以从腹水中获得。其它合适的受 转染细胞包括淋巴细胞比如人或非人类来源的B淋巴细胞，人类或非人类 来源的杂交瘤细胞，或种间的异种杂交瘤细胞。

本发明的携带嵌合抗体的表达载体可用不同的方法导入合适的宿主细 胞。这些方法包括生物化学方法，如转化、转染、连接，原生质融合、钙 磷酸沉淀法，多价阳离子试剂法，如二乙胺乙基葡聚糖(DEAE)，及其它的 物理机械法，如电穿孔法、直接微量注射法和微投射物轰击法(Johnston et al，Scence 240：1538(1988)).将DNA导入淋巴细胞的较好的方法是电穿孔法 (Dotter et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7161(1984)；Yoshikawa，K et al，Jan.J.Cancer Res.77：1122-1133)。在这过程中，DNA在电脉冲下掺入受 转染细胞。一般在转染后，细胞要在完全培养基中恢复24小时，然后接种 于96孔培养板的选择性培养基中。G418筛选的浓度为0.4-0.8mg/ml。霉酚 酸筛选使用6ug/ml的浓度加0.25mg/ml黄嘌呤。电穿孔技术可使SP2/0细 胞的转染频率达10-5至10-4.在原生质融合方法中，溶菌酶被用来剥离含 有嵌合抗体基因的重组质粒的有粘膜炎的细胞壁。在聚乙二醇作用下，原 生质球体与骨髓瘤细胞融合。

本发明的嵌合性免疫球蛋白基因也可在哺乳动物非淋巴细胞或其它真 核细胞中表达，如酵母菌，或在原核细胞、在特定的细菌中表达。

酵母菌对免疫球蛋白H和L链的产生具有重要的优越性。它可进行翻译 后肽修饰反应，包括糖基化。许多重组DNA的方法的出现即利用增强启动 子序列和高拷贝数质粒，这样可用在酵母菌中获得所需的蛋白质。酵母菌 可识别克隆的哺乳动物基因产物的前导序列并分泌含有前导序列的肽 (如：前肽〕(Hitziman，et al，11th International Conference on Yeast，Genetics and Molecular Biology，Montpeller，France，Setember 13-17，1982)

通常酵母菌的基因表达系统的好坏可从产物的水平、分泌的情况、嵌 合H和L链蛋白和嵌合抗体的稳定水平来判断。任何一种结合了启动基因和 终止因子的酵母基因表达系统都可使用。这些启动基因和终止因子是从在 富含葡萄糖的培养基中大量培养的酵母菌产生的活跃表达的编码糖酵解酶 的基因中得来的。已知的糖酵解基因也可提供有效的转译控制信号，例 如，可使用磷酸甘油激酶(CPK)的基因的启动基因和终止因子。许多手 段可用来判断选择在酵母中克隆的免疫球蛋白cDNA的最佳表达质粒。(参 见Glover，D.M.ed.，DNA Cloning，Vol II pp.45-66，IRL Press，1985)

细菌菌株可用来作为生产本发明所描述的抗体分子或抗体片段的宿 主。E.Coli K12菌株如E.Coli W3110(ATCC 27325)和其它的肠杆菌株如 Selmonella typhimurium或Serratia Marcascery和各种假单胞杆菌属都可 利用。

含有来自与宿主细胞种类相配的复制子和控制序列的质粒载体用来与 这些细菌宿主连接。载体带有复制位点和能提供表型选择能力的特定基 因。细菌中由克隆的免疫球蛋白cDNA编码的嵌合抗体或抗体链的产生的 表达质粒的评价可由多种方法完成。(参见Glover，D.M.ed.；DNA Cloning，Vol I，IRL Press，1985)。

其它优先使用的宿主是可以在体内、体外生长的哺乳动物细胞。哺乳 动物细胞提供对免疫球蛋白分子的翻译后的修饰，其中包括：先导肽的除 去、折叠以及H链和L链r-糖基化抗体分子的装配，功能性抗体蛋白的分 泌。

除了以上提及的淋巴来源的细胞外，能用来作为宿主生产抗体蛋白的 哺乳类细胞包括一些成纤维细胞来源的细胞，如Vero.(ATCC CRL 81) CHO-Ki(ATCC CRL 61).

在哺乳类细胞内表达已克隆的H链、L链的载体系统有许多。(参见 Glover，D.M.ed.，DNA Cloning.Vol.II pp.143-238，IRL Press，1985)不同的途 径都能得到完整的H2L2抗体。正如前面所述，完全可以在同一个细胞内共 同表达H链、L链，并使之在细胞内结合从而得到完整的四聚体的H2L2抗 体。在同一宿主细胞内，无论使用相同或不同的质粒都能得到共同表达。 编码H链、L链的基因可以放在一个质粒中，然后在转染到细胞内，最后表 达。另外一种方法是：编码一条链的质粒，如L链，首先转染到细胞内， 然后带有第二个特殊标志并编码H链的质粒再转染到这些细胞内。无论用 那一种途径，都能得到H2L2分子。另外，在质粒上再增加编码一些因子的 话，得到的H2L2分子还将具有诸如高产量、稳定性好等特点。

除了单抗与嵌合抗体之外，本发明还能生产专门针对单抗与嵌合抗体 的可变区(V)的抗Id抗体。一个抗Id抗体是专门识别与另一个抗体的抗原 结合区有关的专一性决定簇的抗体，如代号为33.28的抗CCAA的抗体就称 为独特型或Id抗体。通过用Id抗体或抗原结合物免疫与其具有相同种属和 基因型的动物，就能得到抗Id抗体。也可进一步用抗Id抗体作为免疫原去 免疫另一个动物，从而得到抗-抗Id抗体的动物。其实这种抗-抗Id抗体 相同于原来诱导产生的抗Id抗体的抗体。这样，通过使用针对单抗独特位 的抗体，就可能区分表达相同特异性的抗体的其它克隆。

因此，本发明的单抗和嵌合抗体可以用来在适合的动物中诱导抗Id抗 体，如BALB/C小鼠。这些免疫了的小鼠的脾细胞可以用来产生抗Id杂交瘤 进而分泌抗Id单抗。接着将抗Id单抗整合在一个载体(如KIH)上，并用来 免疫另外的BALB/c小鼠；最后，这种小鼠的血清中就含有抗-抗Id抗体， 这种抗体能特异性结合到最初的单抗的CCAA段。

本发明的抗体以及它们的抗原结合片段及衍生物可以具有多种诊断、 监测和治疗癌症的功能，包括结肠癌、乳癌和卵巢癌。这些用途都由 Schlom，J.总结于Cancer Res.46：3225-3238(1986)。

当它们被用来作为诊断时，本发明抗体可以在免疫诊断中检查体液诸 如血清、尿液、脑脊液、痰、渗出液中有无CCAA的存在。如果用适当的 免疫标记物标记后，这些抗体也可以用来扫描或免疫成象以确定原发癌和 转移癌的位置，甚至于可以用来确定有癌细胞转移的淋巴结。

本发明的抗体也适用于免疫病理分析。比如肿瘤分化的诊断，以及依 据CCAA表达的肿瘤的亚型的分析，这种判断对于预测肿瘤的转移可能 性、治疗结果及预后都是非常重要的。

特别值得一提的是，由于本发明的单抗和嵌合抗体的特异性便能够确 定出正在生长的异源性肿瘤中细胞的不同类型。通过流式细胞仪的方法可 以应用这些抗体来确定组成肿瘤的肿瘤细胞的种类和交叉配对。这在手术 和治疗前进行。运用本发明的抗体以及其它的单抗来确定肿瘤细胞的亚型 是指：A哪一种抗原制剂最适合得到特异性活度高的免疫治疗。B哪一种 单抗或嵌合性抗体对ADCC是有效验的。C哪种抗体或单抗的组合最适用 于预测治疗后的病人是否会有复发和转移的出现。

除了诊断应用外，通过监测体液中CCAA的存在，肿瘤的放射成象， 或者通过检测淋巴结和骨髓活检、体液细胞、转移的呼出细胞，本发明的 抗体也适用于监测病程的发展。

综合本发明抗体的治疗途径，包括1.直接的细胞毒性途径，这包括通 过补体CDC或者效应细胞ADCC的两种途径；2.与抗肿瘤药物、毒素、放射 性核素连接。在体外实验中，这些抗体能够除去血液循环和骨髓中的肿瘤 细胞。

所有这些方法将在以下的章节中详细描述。学习并掌握这里所提供的 方法介绍，具有一般实践水平的人也将能够知道，在诊断、监测和实际的 治疗实践中，如何使用本发明的抗体。

本发明最适用的动物是哺乳动物，这里指的是哺乳纲的生物体。尤其 适用于人类。

这里所谓的“治疗”是指当治疗对象用了我们的抗体片段或衍生物， 用于预防、缓解和治愈结肠癌、乳癌和卵巢癌。

本发明的抗体的所有药物成份都是有助于达到一定的医疗目的的。具 备常规的治疗结肠癌、乳癌和卵巢癌以及有关疾病的临床技能，就可以掌 握这些抗体片段、衍生物的剂量和治疗方案。例如，可以通过非肠道途径、 皮下、静脉、肌肉、腹腔、经皮和颊部给药。除此以外，可以单独或同时 进行口服，而给药剂量则取决于患者的年龄、健康状况、体重、有无合并 用药、治疗频率、期望的疗效等因素。

本发明的范围的组成是由所有这些抗体片段、衍生物所组合的方式所 决定的，而这取决于所要达到的治疗目的。当个别病人调整药物组成时， 可以在技术允许范围内决定各有效成份量的最适范围。有效剂量是特定的 嵌合性或单克隆抗体所结合的其它治疗成份的存在和性质、病人的临床状 况综合的结果。这一有效剂量可以在10ng/kg-100mg/Kg体重范围内变 动。最好是在0.1-10mg/Kg体重范围内。

除了有药理活性的成份外，新的药物化学组成可以包括适当的药物化 学载体，这其中包括赋形剂、佐剂。因为这些赋形剂和佐剂能加速活性成 份制剂化过程。制剂中有效成份和赋形剂的含量在0.01％-99％范围内，最 好是20％-75％。

本发明适用于肠道给药的抗体、抗体片段、衍生物制剂，无论是一种 可检测的标记形式、结合形式或非结合形式，均可包括无菌的水性溶液、 非水性溶液、悬浊液和乳剂。水溶液有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄 油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯，水性载体包括水、乙醇/水溶液、乳 剂或悬浊液，这些载体中都含有盐、缓冲介质，非肠道途径载体则包括NaCl溶液、右旋糖林格氏液、右旋糖和氯化钠、乳酸盐林格氏液或固定油类， 静脉内注射剂的载体主要有液体和营养补充剂组成，它们往往是在右旋糖 林格氏液的基础上制成的，当然防腐剂和其它的添加剂也是必不可少的， 比如抗微生物成份、抗氧化剂、螯合成份、惰性气体等，具体请看 Remington′s Pharmaceutical Science，16th ed.，Mack Publishing Co.， Easton.PA.1980.

本发明的抗体、抗体片段及其衍生物也有助于治疗已经存在或正在发 展中的结肠癌、乳癌和卵巢癌，这种治疗是通过非肠道途径给予单剂量或 多剂量的抗体、抗体片段或衍生物或者是缀合物。

本发明的抗体之所以能发挥治疗效用，是由于它们能够对抗那些有 CCAA在其表面的细胞，具体作用是通过介导ADCC和/或CDC来完成的。 不管是内源性的还是外源性的效应细胞，(对ADCC)或补体成份(对CDC) 都可以成为抗体发挥效应的手段。

本发明的抗体、抗体片段、衍生物也可以作为免疫偶合物发挥治疗效 用。(参见Dillman，R.O.，Ann.Int Med.111：592-603(1989))。它们可以 与细胞毒性蛋白，包括(但不限于这些)Ricin-A，假单胞杆菌毒素，白喉毒 素和肿瘤坏死因子偶合。将毒素偶合到抗体或其它配体上的技术是可行的 (见Olsnes，S.et al.，Immunol.Today 10：291-295(1989))。植物和细菌的 毒素最能够破坏蛋白的合成，从而达到杀死细胞的目的。

本发明的抗体还能缀合到其它类型的有治疗作用的物质中。这些物质 包括(但不限于这些)诊断用的放射性同位素、细胞毒性成份(如细胞毒 性放射性核素、药物和蛋白)。能够偶联于抗体上的并能运输到体内作用 部位的放射性核素例如有212Bi、131I、186Re、90Y(这些还没有详尽的 列出)。放射性核素能够在局部通过放射性照射细胞以达到其细胞毒性作 用。这也就是一般的放射性治疗的机理。

上面所说的能够结合到抗体上的具有治疗作用的细胞毒性药物包括道 诺红菌素，doxombicin，氨甲蝶呤和丝裂霉素C，但不限于这些。细胞毒性药 物会影响许多重要的活动，如DNA、RNA和蛋白质的合成，详细可见 Goodman，A.C.，et al，Goodman and Gilman′s THE PHARMACOLOGY BASIS OF THERAPEUTICS，7th Ed.，Macmillan Publishing Co.，1985。

本发明抗体还有一个优势，它可以和其它的单克隆抗体、嵌合抗体、 淋巴因子、促红细胞生成生长因子等联合使用，这物质都能增加效应细胞 的活力与数目。

本发明的抗体、片段及衍生物附着在一个固体支持物上，能够从体液 组织和细胞提取物中除去可溶性结肠癌相关抗原。在一最佳实施例中，它 们被用于除去血液和血浆中的可溶性肿瘤抗原。在另一最佳实施例中，抗 体被用于体外的免疫吸附装置中(见Seminars in Hematology，Vol.26(2 Suppl.1)(1989))。病人的血液与其它体液经过吸附的抗体后，可部分 或完全除去循环中的CCAA(游离的或是免疫复合物)、包含携带CCAA 的细胞，接着将这些体液输回体内。这一免疫吸附的方法可以持续流动的 状态中完成，可插入或不插入细胞离心这一步骤。参见实例Terman.D.S.et al.，J.Immunol.117：1971-1975(1976)。

本发明也提供了上述抗体，片段或是衍生物，都作了检测性的标记， 如下文所述。

本发明的抗体可用于免疫分析，对样品中CCAA或细胞中CCAA进行 检测或定量。这样的免疫分析法一般如下，将生物样品与本发明的抗体一 起温育，这抗体具有可检测的标记，能识别肿瘤抗原；检出与样品结合在 一起的标记了的抗体。

因此，从这方面考虑本发明，生物样品可用硝化纤维素或其它能固定 细胞、细胞碎片或可溶性蛋白、糖蛋白的固体支持物或载体进行处理，再 以适当的缓冲液冲洗，然后加入本发明中标记过的抗体；再次用缓冲液洗 固定相支持物，使未结合的抗体除去。与固定相支持物结合的抗体的量可 用传统的方法测出。

固定相支持物或载体是指任何能与抗原或抗体结合的物质。常用的有 玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然或人工 纤维素、聚乙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿(magnetite)。载体的性质可以在 某种程度上可溶或不溶性的。只要连接的分子能与CCAA或CCAA特异性 抗体结合，支持物的材料可以是任何可能的结构形状。因此，它可以是如 圆珠子般球形的、如同试管的内面般圆柱形的、如杆状物的外表面、纸或 试纸般平面的等等。比较适合的支持物有聚苯乙烯珠。熟练的技术人员还 知道其它结合抗体或抗原的适合的载体，或能用常规实验来确定哪种载体 是适用的。

同一批抗体的结合活性可用一些常用方法来确定。熟练的技术人员可 通过常规实验判断每一项指标的操作方法和最佳分析条件。

比较本发明的抗体的方法之一是将抗体与一种酶连结，用酶分析法 (EIA)或酶联免疫吸附分析法(ELISA)来检测，当这种酶与底物接触时， 会发生反应产生一种可检测的化学物质，例如用分光光度计法、荧光测定 法或可见光法测定。在一个补充的实施例中是将这种酶去标记一种本发明 的抗体的配体。这种配体可以是本发明的抗体的恒定区与可变区，诸如异 源性抗小鼠免疫球蛋白抗体。另外，结合配体可以是一个能与本发明的抗 体结合的非抗体蛋白，如葡萄球菌蛋白A或链球菌蛋白G。

可用以标记本发明的抗体的CCAA特异性抗体，或这些抗体的结合配 体的酶可包括以下列出的，但不仅限于这些：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核 酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母菌酒精脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、 磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧 化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶、糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。

如果对本发明的抗体或结合配体进行放射性标记，就可以用放射免疫 分析法检测CCAA(参见Work，T.S.et al，Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，North Holland Publishing Company，N.Y. (1978)).放射性同位素可用γ-计数器或闪烁计数器或放射自显影的方 法来检测。而应用于本发明的抗体的同位素即是人们所经常使用的那些。

荧光复合物也可用来标记抗体或结合配体。当用荧光标记过的抗体暴 露于一定波长的光时，它的存在可因荧光而测出。最常用的荧光标记复合 物有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、异藻青蛋白、邻苯 二醛和荧光胺。

抗体也可用发射荧光的金属来标记，如152Eu，或其它的镧系。这些金 属可用金属螯合剂如DTPA或EDTA连结到抗体上。

本发明的抗体也可用结合化学发光复合物标记。标记了的抗体在化学 反应过程中发出光，从而被检测到。特别常用的一些化学发光标记物有鲁 米诺、鲁米诺异构体、咪唑、丫啶盐和草酸酯。

同样，生物发光物质也可用来标记本发明的抗体，无论是片段还是衍 生物。生物发光物质是从生物系统中发现的一种化学发光物质，在这一系 统中有一种催化蛋白能提高化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在由 它所发出的光来确定。用于标记的重要的生物发光复合物有荧光素、荧光 素酶和sequorin。

如果标记物是放射性γ射线发射体，抗体的片段或衍生物的检测可通 过闪烁计数法完成；如果标记物是一种荧光物质，可通过荧光测定法；在 酶标法中，用比色法来完成检测，这方法需要一种酶的底物，或者通过与 预先准备的标准品与底物的酶反应程度的比较来检测。

原位检测需要从病人取得组织学标本，并准备好标本的标记了的抗 体，或未标记的抗体加上标记了的结合配体。通过这样一个过程，不仅能 检测抗原的存在，并且还可了解它在检测组织中的分布情况。用本发明， 具有一般技术的人很容易发现许多组织学方法(如染色法)经过改良后可 用作原位检测。这些方法包括例如免疫组织化学染色法。在一最佳实施例 中，亲和素-生物素免疫过氧化物酶染色法能被使用，这种试剂盒在筹划 之中。

用本发明的单克隆抗体或嵌合抗体制成的试剂盒可用以评估结肠癌、 乳癌和卵巢癌的免疫组织特性。组织学研究的结果是用来评价表达单抗 31.1和33.28的抗原的肿瘤细胞亚群。

结肠癌检测试剂盒包含免疫组织化学分析所需的试剂如下：

A、单克隆抗体31.1，33.28或鼠/人嵌合性抗体Chi#1，和癌胚抗原的单抗 (CEA)，后者是结肠组织免疫组化的标准单克隆。

B、免疫过氧化物酶试剂，(封阻试剂)例如羊血清；二抗，如羊抗鼠 抗体。

C、免疫过氧化物酶和。

D、棕色显色试剂。

类似的试剂盒可用于乳癌和卵巢癌的免疫组化分析。免疫过氧化物酶 技术是采用Sternberger的。一抗(单抗或嵌合抗体)作为抗原可与多个二 抗相结合。二抗形成了一抗与辣根过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物连接 的“桥梁”。

这里所提的试剂盒可用来研究结肠、癌变、息肉的变化以确定恶变的 程度，研究良性息肉转化部位是否被忽略，研究肠炎以检查任何未觉察的 变化。类似的试剂盒可用于研究乳癌和卵巢癌。

计划中的另一种类似上述试剂盒的试剂盒采用结肠癌的五种单克隆抗 体，对所有肿瘤亚群进行损伤分型和交叉配血。

本发明的抗体，片段或是衍生物，都能适用于免疫测定分析中，也称 为“双层”分析法或“三明治”分析法。在一般的免疫测定分析中，一定 数量的未标记抗体(或抗体的片段)与固体支持物连结，这一支持物不溶 于待测液体，加入标记了的可溶性抗体，这样通过对固相抗体、抗原和标 记抗体三种物质形成的复合物的检测，可测定或定量测定待测物。

典型和最好的免疫测定分析包括“正向”分析。与固相结合的抗体首 先与待测样品混合，样品中的肿瘤抗原先与抗体形成固相抗体-CCAA复 合物；经过一段时间的稳定后，清洗固相支持物除去剩余的样品，还包括 未结合的抗原；然后再加入包含未知数量的标记抗体(作为报道分子)的 溶液；再经过稳定，标记抗体与CCAA结合的固相支持物通过未标记抗体 结合在一起，再次清洗固相支持物，去除未反应的标记抗体。这种方法可 以只是简单的测定出CCAA是否存在，或者也可以对它进行定量，这可与 已知抗原数量的标准样品比较标记抗体的测量来进行。这种“二层”分析 法和“三明治”分析法可参见Wide的描述(Radioimmune Assay Method，Kirkham，ed.，E.&S.Livingstone，Edinburgh，1970，pp.199-206)。

另一种可用于测定CCAA的“三明治”分析法被称为“同步”和“反 向”分析法。同步法中包含了一个温育的过程，就是将抗体结合于固体支 持物上而标记了的抗体也同时加入待测样品中。当温育完成后，清洗固体 支持物以除去剩余的液体样品和未结合的标记抗体。与上述“正向”法中 同样，测定与固体支持物联接的标记抗体。

在反向法中，首先加入液体样品的标记抗体，然后加入未标记的抗体， 经过一段时间后与固相支持物结合。经过第二次温育，冲洗固定相，清除 剩余待测样品和未结合的标记抗体，用“同步”和“正向”分析法测定结 合的标记抗体，在一个实例中，联合使用本发明的抗体的特殊的分离表位 可构建一个更灵敏的三位的免疫放射测定分析法。

用本发明的抗体体内检测结肠癌、乳癌和卵巢癌，一般的技术人员可 用不同的标记物和不同的标记方法。本发明抗体可用的标记物类型，例如 有放射性同位素、顺磁性同位素和可用PET(正电子发射断层显象)成象 的复合物。一般的技术人员还知道其它的标记方法或者通过常规实验来确 定某一种方法。另外，技术人员可通过标准的技术来进行结合标记。

若是为体内诊断的目的，选择放射性核素取决于所具备的检测仪器。 所选择的放射性核素的衰变必须是所具备的仪器能检测到的。一般来说， 任何使诊断图象显象的传统方法都可用于本发明。

选择体内成象系统的诊断用放射性核素的另一重要因素是放射性核素 的半衰期要足够长，这样当靶组织达最大摄取时仍可被测出；半衰期又要 短，使对人体造成的放射性危害达到最小。在具体实验中，用于体内成象 的放射性核素不放出粒子，但产生大量的140-200Kev范围的光子，光子 易于用γ-照相机检测。

为了体内诊断的目的，放射性核素可用一个中介的功能团作为媒介直 接或间接的被连结到抗体上，常用于结合以金属离子形式存在的放射性同 位素的中介功能团是螯合剂，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四 乙酸(EDTA)。可结合到本发明的抗体的金属离子例如有 99mTc，123I，111In，131I，97Ru，67Cu，67Ga，125I，68Ga，72As，89Zr和201Tl。

单抗33.28和31.1，以及嵌合抗体Chi#1可用来加速其它单抗的产生，这 些单抗可与同一抗原或免疫交叉反应性结肠癌相关性抗原相结合。首先， 这些抗体可与层析柱连结，并用来免疫纯化结肠癌相关抗原。这些纯化的 抗原反过来又刺激了某些动物的免疫反应。其次，反应的动物的脾细胞可 与无限增殖化细胞融合，产生的杂交瘤细胞可根据分泌的抗体来筛选，它 们是与纯化的抗原结合的抗体，和/或与结肠癌相关抗原结合的抗体，它们 被33.28或31.1抗体或嵌合抗体Chi#1竞争性抑制了。

以上是对我们的发明的一个大致描述，通过一些具体实例可进一步了 解我们的发明，这些例示只为了举例说明的目的，并不限止本发明的范围。

                     实施例I

             结肠癌相关抗原的制备和特征

按照Hollinshead的描述(Cancer，56；480(1985))，抗原制剂是从混合 的结肠癌膜中获得的。这种抗原性物质要进行纯化，使膜中不再含有HL- A抗原，并除去了大部分的非免疫原性糖蛋白。这种抗原制剂的最终状态 应显示出仅诱发活跃的结肠癌、乳癌和卵巢癌的病人的迟发性过敏反应。

将新鲜取出的标本的肿瘤细胞制成盐悬液。按传统方法得到单细胞悬 液，以400xg速度离心10分钟，保留上清液，将细胞沉淀再次悬浮，离心。 以电子显微镜确定仅有膜物质而不是完整的细胞存在，内含的蛋白以 Lowry法测定。

然后用低频率超声处理膜物质，使它成为膜蛋白悬浊液。用 Sephadex-6200凝胶过滤分离溶液。2ml收集一管，记录220到280um的吸收 率。收集单个峰蛋白的部分混合在一起，用Diafle超滤法浓缩。用 Sephadex-G200分离IB和IIA，这是由Hollinshead等定义的(参见前述)； 再进一步以梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化。于结肠癌病人作皮 试，试验上面制备的蛋白片段是否能诱发阳性的迟发性超敏反应。这些具 有免疫原性的片段含有结肠癌相关抗原(CCAA)，并被作为免疫原和制 备单抗的筛选物。

经过梯度PAGE，确定了与癌胚抗原(Gold，P.et al.，J.Exp.Med. 122：467-481(1965)；Hollinshead，A.et al.，Cancer 56：480(1985))不同的 双带抗原并得到了分离，组成这种抗原带的示踪染色显示长为6.3和 6.6cm。抗原的生物化学分析证明它是糖蛋白。根据分子量为76.5KDa的转 铁蛋白的电泳迁移率(6.4-6.5cm)，可以估计抗原的分子量。

                        实施例II

                  单克隆抗体的制备和筛选

如上所述的用CCAA免疫BALB/C鼠，剖取脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0-Ag14融合杂交，从它们的克隆和产物中可获得抗人结肠癌相关抗原 (CCAA)的单克隆抗体。

建立五个杂交克隆，如下所述，称为31.2，31.1，77，33.23和33.28。经 ELISA分析五种单抗均与CCAA和两个结肠癌细胞系(SW480和SW620) 强烈反应，其中对31.1和33.28作了详细研究。

A、免疫和细胞融合

按照Hollonshead的临床试验的描述(Hollinshead.et al，)，取BALB/C 小鼠，腹腔注射50μgCCAA在完全佐剂中乳化，十天后对这些小鼠加强免 疫，静脉注射同剂量的CCAA盐溶液。三天后处死，取脾细胞。将5×107 小鼠脾细胞和107SP2/)Ag14骨髓瘤细胞置于40％聚乙二醇(MW-1500) 中温育，使细胞融合。

B、杂交克隆的筛选

检测产生CCAA特异性抗体的杂交瘤克隆，可用Tsang的酶联免疫吸 附分析法(Tsang et al，JNCI 77：1175(1986))。将CCAA固定于聚苯乙烯 微孔板上(100ng/孔)。上清液中的抗体与固定的抗原结合，加上与过氧 化物酶连接的小鼠免疫球蛋白特异性的第二抗体，以检测连结了的鼠单 抗。接着加入过氧化物酶的显色底物D-苯二胺。孔中显色反应的吸收率≥ 0.500个单位的视为阳性。吸收率在0.01到0.09范围内则为阴性。

经ELISA确定为阳性的杂交瘤再用间接免疫荧光法筛选。用下表1列出 的已经鉴定过的不同的肿瘤细胞和正常细胞。所有的肿瘤细胞系从ATCC 获得。将细胞与培养的杂交瘤细胞上清液用磷酸缓冲液以1∶2的比例稀释 后于4℃共同温育1小时。冲洗细胞，与荧光标记的羊抗鼠免疫球蛋白抗体 一起温育。用PBS冲洗细胞三次，用荧光显微术观察。结果列于表1。 表1抗结肠癌相关抗原单克隆抗体和人培养细胞的间接免疫荧光反应性   细    胞           单抗的反应性

         31.2   77    31.1 33.28  33.23 肿瘤细胞系   SW948(COL)    -      +      -    -     - HCT116(COL)   -      -      -    +     - WIDR(COL)     +      +      +    +     + COLO320(COL)  +      +      +    -     - HS619(COL)    -      -      -    -     - HS853(COL)    -      -      -    -     - CACO-2(COL)   +      +      -    -     - SK-CO-1(COL)  +      +      -    +     + HT-29(COL)    +      +      -    +     + SW1116(COL)          +    -    -    +    + SW480(COL)           +    +    +    +    + SW620(COL)           +    +    +    +    + 231(BR)              -    -    -    -    - CAMA-1(BR)           -    -    -    -    - PAN-1(PAN)           -    -    +    -    - MIA(PAN)             -    -    +    -    - HS766T(PAN)          -    -    -    -    - M-14(MEL)            -    -    -    -    - HT1080(FIB)          -    -    -    -    - LM(OS)               -    -    -    -    - TE-85(OS)            -    -    -    -    -

正常皮肤纤维细胞   -    -    -    -    -

骨髓细胞         -    -    -    -    - 正常人外周血单核细胞 -    -    -    -    -

A.培养细胞悬液用PBS按1∶2稀释

B.根据对照所得的膜荧光强度确定阳性(+)或阴性(-)。

C.COL：结肠癌；BR：乳癌；PAN：胰腺癌；FIB：纤维肉瘤

实施例III

单克隆抗体及其反应性的分析

上面所述的抗CCAA单抗的生产和检测也要用新鲜人体组织检测其反 应性。表2列出的组织类型置于低温恒温器中，均用3.5％的甲醛磷酸缓冲 液固定，再用PBS冲洗三次。在间接的免疫荧光研究中，将组织与单抗一 起温育，然后用荧光标记的二抗染色。

如表2所示，单抗31.1和33.28对结肠癌细胞具有高度的特异性。这表 明所用的抗原(CCAA)对结肠癌高度特异性，而且，是结肠癌病人的免 疫原(DH反应阳性)，对小鼠藻红蛋白兴奋性试验也是良好的免疫原。用正向 对抗90°光散射检测的细胞来建立引发区。如表4所示，31.1和33.28的单 抗都能与结肠癌细胞连接。二者与PBMC细胞的连结则不明显。 表2用新鲜人体组织间接免疫荧光检测抗CCAA单抗反应性

           单抗的  反应性

组织       33.28    31.1

肿瘤

结肠癌     3/3      3/3

胰腺癌     0/2      0/2

黑色素瘤   0/2      0/1

乳癌       0/2      0/1

正常组织

胎盘       0/1      0/1

肝脏       0/1      0/1

结肠       0/3      0/3

脾脏       0/1      0/1

胸腺       0/1      0/1

肌肉       0/1      0/1

a.腹水用PBS按1∶50稀释。低温切片(4-6μM厚)用3.5％福尔马 林磷酸缓冲液固定10分钟，然后用PBS洗三次。若不立即使用，将切片置 于-70℃保存。

结果按试验结果阳性数量/阴性数量表示。

表3列出的是单抗的免疫吸附分析结果。三种结肠癌细胞系(HT-29， WIDR和SW620)和一种骨肉瘤细胞系(LM)用来吸附与异硫氰酸荧光素 连接的单抗31.1和33.28。取接种了杂交瘤的小鼠腹水，以1∶50稀释，加 入吸附细胞中。混合液4℃温育1小时，用2×107细胞(表3中A)或104 细胞(表3中B)吸附抗体(表3)。骨肉瘤细胞系无吸附31.1或33.28的 活性，而结肠癌细胞则有。

表3  单抗的免疫吸附分析

           吸      附     细     胞 单抗     HT-29      WIDR      SW620      LM

     A    B    A    B    A    B    A    B 33.28    -    +    -    +    -    +    +    + 31.1     -    +    -    +    -    +    +    +

抗体31.1、33.28和对照单抗与肿瘤细胞HT29、WIDR和SW480及外周 血单核细胞(PBMCs)的结合情况可用细胞荧光测定分析法获得。采用Ortho 光谱III细胞荧光自显影图，带有一个氩激光器可激活荧光素和藻红蛋白。 用正向对抗90°光散射检测的细胞来建立引发区。如表4所示，31.1和33.28 的抗体均能与结肠癌细胞相连，而单抗则不能与PBMC结合。

表4细胞荧光分析测定结果

单抗细胞染色百分数   细胞33.28    31.1    对照

HT29       51.0    53.9    9.2

WIDR       21.0    ND      8.1  SW48037.0     32.0    3.8

PBMC       2.1     2.1     ND

单克隆抗体的重链和轻链的类型可用免疫扩散法测定。31.1单抗是带 有Kappa轻链的IgG1，33.28单抗则是有Kappa轻链的IgG2a(表5)。这与过 去的19.9单抗完全不同(Herlyn，M.et al，J.Biol.Chem.257：14365-14369 (1982))，它是属于IgG1类的(Herlyn D.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：4761-4765(1982))。重要的是，IgG2a型的抗体对免疫治疗更为有效。 (Cilcher，D.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78：3199-3203(1981)).19.9单 抗对结肠肿瘤也有反应性，但它是以胰腺癌作为抗原免疫而来的，对结肠 具有交叉反应性。这与B72.3单抗(【citation】)有些类似，它是以乳癌组 织为免疫原获得的抗体，也对结肠有反应活性。

表5单克隆抗体的同种型 培养悬液  IgG1  IgG2a  IgG2b  IgM      轻链

                                 卡巴   λ

31.2    -    +      -     -       +     -

31.1    +    -      -     -       +     -

77      -    -      +     -       +     -

33.23   -    +      -     -       +     -

33.28   -    +      -     -       +     -

                      实施例IV

                 结肠癌相关抗原的特性

用蛋白质印迹(western blot)分析法测定取自SW480和SW620结肠癌细 胞系的可溶性蛋白可确定上述单克隆抗体结合的抗原的分子量。结果发现 这两个细胞系中分子量为61.1KDa和72KDa的抗原能与33.28和31.1单抗起 反应。在Western blot分析中，这些单抗不能与人外周血单核细胞或其它组 织类型的肿瘤细胞系反应。

为了更好的确定本发明的单克隆抗体对CCAA免疫反应的特异性，并 确立单抗是否会与已用于临床治疗的细胞膜制剂中的免疫原成份发生反应 (Hollinshead et al，supra)，上述的致免疫制剂将用高效液相色谱仪 (HPLC)分析处理。

分析显示4个较显著的峰，于结肠癌病人作皮试，观察每个峰的免疫反 应性(用DH诱发)。在10个受试病人中，仅第4个峰的蛋白的皮试为阳性。 峰4的抗原与33.28单抗能起反应，而31.1单抗与峰3的抗原反应，峰3是第 二个最显著的峰。

上文引用的参考文献与这里的结果是一致的。

                    实施例V

            结肠癌相关抗原的亲和纯化

用33.28单抗将从HT-29细胞系中提取的抗原用亲和层析法分离出 来。经纯化的33.28IgG5mg连接到CNBr激活的琼脂糖凝胶电泳4B上。柱 子用PH 11.5的0.05M二乙胺预洗脱，然后用0.14M NaCl/0.01M Tris(PH 8.0)平衡。将CCAA制剂注入柱子中，再用PH 11.5 0.05M的二乙胺洗脱。 洗脱下的部分加入PH8.0的IM Tris-HCl中和。

连接在33.28亲和基质上并被洗脱下来的物质再用HPLC处理。洗脱的 CCAA制剂用启动缓冲液(0.01M磷酸钾缓冲液，PH7.0)调节，加入 Synchropak Wax Weak阴离子交换HPLC柱(250×4.6mm)中，并用以0.01M 磷酸钾缓冲液配制的0-1MNaCl溶液梯度洗脱，洗脱速度为1ml/分。阴离 子交换层析采用惠普(Hewlett-Packard)HPLC(HP1090，HP，Arondals，PA)

结果列于图2，用33.28单抗从HT-29细胞分离的抗原性物质产生的峰 与第4个峰吻合，并且对人的免疫反应性也相似，表明可利用33.28单抗来 分离致人免疫的结肠癌制剂。

                   实施例VI

         单克隆抗体33.28和31.1的ADCC活性

为了具有治疗作用，一种免疫原性肿瘤抗原特异性单克隆抗体应具备 以下特征：(A)对肿瘤组织的高度特异性；(B)对正常人体组织无交叉 反应性；(C)与破坏肿瘤相关的生物学活性，如依赖抗体的细胞毒性作 用。

单抗33.28和31.1的ADCC活性可用结肠癌细胞系WIDR作为靶细胞来 检测。黑色素瘤细胞系M-14则作为特异性对照。分析ADCC采用传统的 51Cr 4小时释放分析法，以人PBMC作为效应细胞，结果用同位素释放百 分数(分解％)(表6)来表示。分解的底数为8.3％，当效应细胞和靶细 胞的比例为100∶1时，33.28单抗导致肿瘤细胞分解率达40.3％，而31.1单抗 为51.8％。

表6单抗33.28和31.1的ADCC活性

靶细胞释放百分数(E∶T比值)

               WIDR                    M-14 抗体或对照  25      50      100     25      50    100

33.28   23.1    40.3    45.3    6.9     8.4   9.0

31.1    14.3    26.7    51.8    7.5     6.4   8.7

OSA1    10.0    9.2     12.2    11.4    14.8  10.9

NMS     12.2    11.7    13.1    14.2    15.0  11.1

PBS     8.2     5.1     7.6     11.0    14.2  10.5 ADCC用51Cr 4小时释放分析法分析。51Cr释放的底数是8.3％。E∶T比 值表示效应细胞与靶细胞的比值。单抗或血清以1∶100稀释后检测；OSA1 --骨肉瘤相关抗原的单抗；NMS-正常小鼠血清；WIDR-结肠癌 细胞系；M14--黑色素瘤细胞系。

                    实施例VII

       循环血液中带有单抗33.28和31.1的CCAA的检测

检测79例未知的血清样品中的循环CCAA(表7)可以用来检测本发明 的单抗。这一分析是建立在ELISA分析法中血清抑制单抗与CCAA的结合 的原理的基础上的。50例正常血清无一出现假阳性，10例活跃的结肠癌病 人的血清9例为阳性，结肠癌治愈一年后的病例未出现阳性。

表7  循环结肠癌相关抗原的检测

(血清抑制单抗与CCAA的结合的数量)

                        33.28      .       31.1       .

供体物    样品数  ＜15％    ＞15％    ＜15％    ＞15％

                   (阴性)   (阳性)    (阴性)    (阳性)   结肠癌      10         3         7        2         8 结肠癌(切除)  4          4         0        4         0

乳癌      9          9         0        9         0   黑色素瘤    5          5         0        5         0   前列腺癌    1          1         0        1         0   正常血清    50         50        0        50        0

结肠癌相关抗原用ELISA法检测。每次分析取100μl血清。

实施例VIII

其它对结肠癌有反应性的单抗的特异性比较

用ELISA方法进一步研究肿瘤特异性(表8)。将单抗31.1与CC49比 较，CC49是从B-72.3提纯的结肠直肠癌特异性单克隆抗体，对照用小鼠 骨髓瘤蛋白。31.1单抗与结肠直肠癌反应的范围比CC49小，但它具有更高 的特异性，与胃肿瘤或正常结肠组织的交叉反应性则较低或没有。 表8使用单抗31.1、CC49和MOPC-21的正常与肿瘤组织的ELISA结果

组    织    31.1    CC49    MOPC-21

结肠直肠癌

1.COCA2A      -       +++     -

2.COCA2       -       +++     -

3.COCA3       +       ++      -

4.COCA4       +++     +++     -

5.G820        ±          ++         -

6.G853        +++     ++      -

7.G817        +++     +++     -

8.G781        -       -       -

其它癌

1.乳腺癌1     -       -       -

2.乳腺癌2     -       -       -

3.肺癌1       -       -       -

4.肺癌2       -       -       -

5.卵巢癌D106  -       -       -

6.卵巢癌5     -       -       -

7.卵巢癌V5    -       -       -

8.卵巢癌V45   -       -       -

9.卵巢癌V43   -       -       -

10.胃癌14A    ++      +++     -

11.胃癌12A    -       +++     -

12.胃癌15A    -       -       -

其它正常组织

1.子宫内膜E21 -       -       - 2.子宫内膜EC19    -    -    - 3.子宫内膜EC17    -    +    - 4.子宫内膜EC18    -    -    -

(RBC)

5.红细胞1     -    -    -

6.红细胞2     -    -    -

7.红细胞3     -    -    -

8.红细胞4     -    -    -

9.红细胞5     -    -    -

10.红细胞6    -    -    -

11.红细胞7    -    -    -

12.红细胞8    -    -    -

13.红细胞9    -    -    -

14.红细胞10   -    -    -

15.红细胞11   -    -    -

16.粒细胞     -    -    -

17.385        -    -    -

18.386        -    -    -

19.正常脾3    -    -    - 20.392(正常脾)    -    -    - 21.395(正常肝脏)  -    -    - 22.387(正常肾脏)  -    -    - 23.398(正常脾)    -    -    - 24.390(正常肝脏)  -    -    -

25.正常脾#1   -    -    -

26.正常脾#2   -    -    - 27.800(正常结肠)  -    ++   - 28.正常结肠(GW)   -    ++   - 29.正常结肠(Meloy)-    -    -

30.正常结肠   -    -    -

31.G1155B(正常结肠)    -    -    -

32.G1164B(正常结肠)    -    -    -

33.正常结肠           ±       -      -

34.正常胃A             -    -    -

35.正常胃B             -    -    -

36.正常胃C             -    -    -

37.正常肺              -    -    -

38.正常肝脏            -    -    -

CC49-NCI结肠直肠的单克隆抗体

MOPC-21-骨髓瘤蛋白阴性对照

所有单抗为40ng/孔，POGAM稀释度为1∶3000

实施例IX

单抗33.28和31.1在体内肿瘤部位的分布

本发明的单抗在体内的分布行为，是研究了125I标记的单抗和异体移植 了结肠癌LS-174T的无胸腺裸鼠内的药代动力学后得到的。而种植了黑色 素A375的小鼠作为对照。放射部位指数(放射标记物在肿瘤部位的浓度/放 谢标记物在周围组织的浓度)即表示单抗在肿瘤内相对于周围组织(肝脏和 脾脏)的相对单克隆抗体的浓度。表-9是125I标记的单抗31.1和33.28的生物 分布。结果发现，单抗显著地集中在肿瘤部位，远高于正常组织(肝脏和脾 脏)内的分布，在96小时为正常组织的6倍，而在168小时时为12倍。图3和 图4是单抗在肿瘤组织和血液、肝脏内的放射分布指数。 表9 125I标记的单抗在带瘤的无胸腺裸鼠内的生物分布

组织    96小时        168小时

       LS174T   A375  LS1745T  A375  A.mAb 31.1

血液    7.30    NA    4.67    4.42

肿瘤    21.92   NA    25.43   2.91

肝脏    3.74    NA    2.16    1.24

脾脏    3.68    NA    2.41    1.32 B.mAb 33.28

血液    7.80    NA    5.58    3.95

肿瘤    13.12   NA    15.50   2.24

肝脏    2.55    NA    1.74    1.68

脾脏    2.31    NA    1.70    1.92 结果用注射剂量/组织重量(克)表示 LS174T-结肠癌；A375-黑色素瘤

                     实施例X

             免疫组织化学的研究

应用特异性单抗的选择性地定义肿瘤种群的能力，就可以通过免疫组 织化学的方法在血清中发现肿瘤标记物，从而描绘新生物的产生过程和新 生物的细胞种群的特征。    

运用免疫过氧化物酶染色法，用50种以上的结肠癌对单抗31.1和33.28 进行试验。实验发现，这两种单抗对于结肠新生物有很高的反应性，而对 于邻近的正常组织则反应性很低。当检查单抗对息肉有无反应性时发现， 良性部位，如：绒毛-管状腺瘤与单元毫无反应。只有在已经恶变的腺瘤 部位出现与单抗的反应。当用普通的碳水化合物-抗原所诱导的单抗来检 查类似的组织，发现无论是正常组织还是新生组织，都能与这种单抗反应。 在单抗3.11和33.28的实验中发现，两个单抗分别与肿瘤组织中不同种群的 细胞反应。这提示不同的癌基因产生不同的细胞表面抗原。

                     实施例XI

选择性地结合石蜡包埋的良性和恶性的乳房组织的上皮细亚群

应用亲和素-生物素染色法来研究单抗3.11和33.28在41个经福尔马林 固定后，石蜡包埋的良性和恶性乳房标本。在未经酶处理之前，在细胞表 面和胞浆内这两种抗体的染色都是阳性。单抗31.1对33％的导管致癌剂为 阳性，对25％的良性乳房疾病的标本为阳性；单抗33.28对48％的导管癌 的为阳性，对35％的良性乳房疾病的标本为阳性。10-75％的细中群染色 阳性。这些结果说明，单抗3.11和33.28所定义的抗原选择性地在一部分患 有乳房疾病的妇女体内有表达，这一结果将有助于这一疾病的诊断。

                     实施例XII

选择性地结合上新鲜冰冻的良性和恶性卵巢肿瘤的上皮细胞的亚群

应用亲和素-生物素间接免疫过氧化物酶检测的方法，研究单抗31.1 和33.28在来自21个卵巢肿瘤新鲜冰冻的活检组织。结果，4/7和乳头状粘 液腺瘤，1/1的粘蛋白刺激性腺瘤，1/2的子宫内膜样腺瘤的组织出现局部 染色阳性。且没有发现非上皮性卵巢肿瘤单抗染色阳性。这些结果说明， 单抗31.1和33.28所定义的抗原选择性地在一部分患有卵巢癌的妇女体内表 达，这一结果同样将有助于这一疾病的诊断。

                 实施例XIII

人类结肠癌组织及细胞株对单抗31.1和33.28的免疫反应性

用单抗31.1和33.28来考察细胞株的免疫反应性，这些细胞株包括结肠 腺癌，淋巴瘤，白血病和成神经细胞瘤。

应用亲和素-生物素免疫过氧化物酶染色法，发现单抗31.1和33.28能 很强地结合上结肠腺癌细胞株，WIDR和HT-29，而在细胞株KGI-a、HL -60、Molt-3和JUKRAT上则没有反应。两个抗体对淋巴瘤细胞株JY的 反应都弱。单抗33.28还与白血病细胞株K562和成神经细胞瘤细胞株 U87，MG有较弱的反应。这些结果与前面所述的流式细胞术和免疫荧光反 应的结果一致。单抗只能与结肠腺癌的细胞株反应，而与其他的肿瘤细胞 株则没有反应，但与SKBR-3乳癌细胞则没有反应。

两个单抗都表现了只能与结肠腺癌组织反应的特性(单抗33.28与84％ 的细胞反应，单抗31.1与64％的细胞反应)，而与正常组织或淋巴瘤，白血 病和成神经细胞瘤则没有反应。这些结果说明这些抗体能够作为考察肿瘤 标记和细胞生物学研究的工具。

                 实施例XIV

抗人类结肠直肠癌相关抗原的嵌合抗体的表达和特征

嵌合小鼠/人重链基因是这样得到的，用PCR的方法，将抗体31.1的重 链的可变区的外显子剪接到人类gammal链的恒定区上去。随后，将31.1的 嵌合抗体基因克隆到一个反转录病毒表达载体plgpCXII并转染到细胞株 PA317。转染细胞PA317H与另一个细胞PA317一起培养，后者含有一个表 达在反转录病毒表达载体plneoCXII中和SP2/00-Ag14细胞中的不相关的 小鼠/嵌合轻链基因。经传导的SP2/-A14细胞能够产生完整的嵌合抗体 CH#1，它能与辣根过氧化物酶结合的羊抗人1gGFc片段在酶联反应中反 应，这说明了Ch#1的恒定区是人种属的。细胞荧光测量分析表明， Ch#1能够染色人类结肠直肠癌细胞株HT-29和LS174T，但是与人类肺癌 细胞株则没有反应。抗体依赖的细胞介导的细胞毒性实验(ADCC)显示 Ch#1能够溶解Ls174T细胞。这些结果说明Ch#1具有对小鼠31.1单抗特异 性抗原结合的能力，这也进一步说明这种嵌合抗体能够在结肠癌的预后请 价中发挥作用。

以上我们详细的描述了本发明，在已经实验证实的相同的参数、浓度 和条件允许的范围内可以使用这一技术。

当本发明在描述中被限制在一些特殊的实施例时，也应该理解它也是 可以进行修饰的。本发明申请中提到的重要特征、和下面所提的权利要求 范围，意图覆盖所欲改变本发明的变化、用途和适用范围的行为。

这一申请是美国专利申请序号为No.08/159,836(1993年11月 30日申请)的部分继续申请。而No.08/159,836是美国专利申请序号为 N08/117,430(1993年9月7日申请)，的部分继续申请，而No.08/117,430 又是美国专利申请序号为No.07/670,816(1991年3月18日申请)的部分 继续申请，而No.07/670,816又是美国专利申请序号为No.07/176,337 (1988年3月31日申请)的部分继续申请，后三项专利目前都已经放弃。

发明的背景