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促生长素抑制素受体2拮抗剂

阅读：1030发布：2020-07-18

专利汇可以提供促生长素抑制素受体2拮抗剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了作为促生长素抑制素受体的受体拮抗剂的促生长素抑制素类似物，包括SSTR2-选择性拮抗剂。本发明还公开了相关的化合物、试剂盒和方法，包括与放射性核素络合或缀合的拮抗剂及其用途。本发明拮抗剂用于诊断和治疗赘生性和非赘生性哺乳动物疾病。，下面是促生长素抑制素受体2拮抗剂专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种与SSTR2结合的促生长素抑制素拮抗剂，选自由下述组成的组：
(i)DOTA-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(ii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(iii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(iv)H2N-Cpa-c[DCys-L-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(v)H2N-Cpa-c[DCys-D-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(vi)H2N-Cpa-c[DCys-Leu-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(vii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(viii)Cbm-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(ix)DOTA-βAla-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(x)DOTA-Peg-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-NH2；
(xii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Cha-NH2；
(xiii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Hor)-NH2；
(xiv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-NH2；
(xv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Cbm)-NH2；
(xvi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-GlyOH；
(xvii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OCH3)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xviii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OH)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xix)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xx)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-Trp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxi)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxiii)Ac-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(xxiv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxvi)DOTA-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(xxvii)DOTA-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；和(xxviii)DOTA-Cpa-[DCys-Pal-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]DTyr-NH2。
2.权利要求1所述的促生长素抑制素拮抗剂，其中所述拮抗剂不显著内化入表达SSTR2的细胞中，并且减少奥曲肽诱导的SSTR2内化。
3.权利要求1所述的促生长素抑制素拮抗剂，还包含螯合剂、络合剂、缀合剂或标记。
4.权利要求1所述的促生长素抑制素拮抗剂，其中所述拮抗剂相对于其他组织优先被肿瘤吸收。
5.权利要求1所述的促生长素抑制素拮抗剂，其中所述拮抗剂相对于其他组织优先被肿瘤吸收。
6.权利要求1所述的促生长素抑制素拮抗剂，其中在施用后4小时测量的肿瘤细胞中拮抗剂吸收与肾细胞中拮抗剂吸收的比值为至少约2.0。
7.一种放射成像癌症的方法，包括：
(a)施用包含促生长素抑制素拮抗剂和放射性核素的组合物；和
(b)检测所述放射性核素，
其中所述促生长素抑制素拮抗剂选自由下述组成的组：
(i)DOTA-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(ii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(iii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(iv)H2N-Cpa-c[DCys-L-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(v)H2N-Cpa-c[DCys-D-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(vi)H2N-Cpa-c[DCys-Leu-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(vii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(viii)Cbm-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(ix)DOTA-βAla-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(x)DOTA-Peg-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-NH2；
(xii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Cha-NH2；
(xiii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Hor)-NH2；
(xiv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-NH2；
(xv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Cbm)-NH2；
(xvi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-GlyOH；
(xvii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OCH3)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xviii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OH)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xix)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xx)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-Trp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxi)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxiii)Ac-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(xxiv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxvi)DOTA-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(xxvii)DOTA-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；和(xxviii)DOTA-Cpa-[DCys-Pal-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]DTyr-NH2。
8.权利要求7所述的方法，其中所述促生长素抑制素拮抗剂结合SSTR2。
9.权利要求8所述的方法，其中所述促生长素抑制素拮抗剂选择性结合SSTR2。
10.组合物制备用于治疗肿瘤的药剂的用途，其中所述组合物包含促生长素抑制素拮抗剂和放射性核素，其中所述促生长素抑制素拮抗剂选自由下述组成的组：
(i)DOTA-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(ii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(iii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(iv)H2N-Cpa-c[DCys-L-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(v)H2N-Cpa-c[DCys-D-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(vi)H2N-Cpa-c[DCys-Leu-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(vii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(viii)Cbm-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(ix)DOTA-βAla-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(x)DOTA-Peg-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-NH2；
(xii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Cha-NH2；
(xiii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Hor)-NH2；
(xiv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-NH2；
(xv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Cbm)-NH2；
(xvi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-GlyOH；
(xvii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OCH3)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xviii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OH)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xix)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xx)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-Trp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxi)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxiii)Ac-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(xxiv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxvi)DOTA-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(xxvii)DOTA-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；和(xxviii)DOTA-Cpa-[DCys-Pal-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]DTyr-NH2。
11.权利要求13所述的方法，其中所述促生长素抑制素拮抗剂选择性结合SSTR2。
12.一种用于诊断放射成像癌症的试剂盒，包含：
(a)适合容器中的促生长素抑制素拮抗剂，其中促生长素抑制素拮抗剂：
(i)用至少一种放射性核素标记；
(ii)未标记并与适合容器中至少一种用于标记的放射性核素一起提供；或(iii)未标记并能够随后用至少一种放射性核素标记；和
(b)使用说明书，
其中所述促生长素抑制素拮抗剂选自由下述组成的组：
(i)DOTA-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(ii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(iii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(iv)H2N-Cpa-c[DCys-L-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(v)H2N-Cpa-c[DCys-D-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(vi)H2N-Cpa-c[DCys-Leu-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(vii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(viii)Cbm-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(ix)DOTA-βAla-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(x)DOTA-Peg-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-NH2；
(xii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Cha-NH2；
(xiii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Hor)-NH2；
(xiv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-NH2；
(xv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Cbm)-NH2；
(xvi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-GlyOH；
(xvii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OCH3)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xviii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OH)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xix)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xx)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-Trp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxi)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxiii)Ac-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(xxiv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxvi)DOTA-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(xxvii)DOTA-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；和(xxviii)DOTA-Cpa-[DCys-Pal-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]DTyr-NH2。
13.权利要求12所述的试剂盒，其中所述促生长素抑制素拮抗剂选择性结合SSTR2。
14.一种用于治疗癌症的试剂盒，包含：
(a)适合容器中的促生长素抑制素拮抗剂，其中，在放射性核素标记所述促生长素抑制素拮抗剂后，所述拮抗剂以对于癌症治疗而言的治疗有效量存在，并且其中所述促生长素抑制素拮抗剂：
(i)用至少一种放射性核素标记，
(ii)未标记并与适合容器中至少一种用于标记的放射性核素一起提供，或(iii)未标记并能够随后用至少一种放射性核素标记；和
(b)使用说明书，
其中所述促生长素抑制素拮抗剂选自由下述组成的组：
(i)DOTA-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(ii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(iii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(iv)H2N-Cpa-c[DCys-L-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(v)H2N-Cpa-c[DCys-D-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(vi)H2N-Cpa-c[DCys-Leu-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(vii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(viii)Cbm-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(ix)DOTA-βAla-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(x)DOTA-Peg-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-NH2；
(xii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Cha-NH2；
(xiii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Hor)-NH2；
(xiv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-NH2；
(xv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Cbm)-NH2；
(xvi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-GlyOH；
(xvii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OCH3)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xviii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OH)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xix)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xx)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-Trp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxi)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr--Cys]-2Nal-NH2；
(xxiii)Ac-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(xxiv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxvi)DOTA-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(xxvii)DOTA-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；和(xxviii)DOTA-Cpa-[DCys-Pal-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]DTyr-NH2。
15.权利要求14所述的试剂盒，其中所述促生长素抑制素拮抗剂选择性结合SSTR2。
16.一种用于放射成像癌症或治疗癌症的化合物，包含有效量的、与促生长素抑制素拮抗剂偶联的放射性核素，其中所述拮抗剂结合SSTR2并选自由下述组成的组：
(i)DOTA-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(ii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(iii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(iv)H2N-Cpa-c[DCys-L-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(v)H2N-Cpa-c[DCys-D-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(vi)H2N-Cpa-c[DCys-Leu-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(vii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(viii)Cbm-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(ix)DOTA-βAla-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(x)DOTA-Peg-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-NH2；
(xii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Cha-NH2；
(xiii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Hor)-NH2；
(xiv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-NH2；
(xv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Cbm)-NH2；
(xvi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-GlyOH；
(xvii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OCH3)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xviii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OH)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xix)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xx)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-Trp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxi)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxiii)Ac-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(xxiv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；
(xxvi)DOTA-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；
(xxvii)DOTA-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；和(xxviii)DOTA-Cpa-[DCys-Pal-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]DTyr-NH2。
17.权利要求16所述的化合物，其中所述拮抗剂选择性结合SSTR2，并且不显著内化入表达SSTR2的细胞，并且减少奥曲肽诱导的SSTR2内化。

说明书全文

促生长素抑制素受体2拮抗剂

[0001] 相关申请

[0002] 本申请是专利合作条约(PCT)申请，要求2008年4月16日提交的美国申请号12/104,318的优先权，其是PCT申请号PCT/US2007/081,430和美国申请号11/872,367的部分继续，这两个申请都在2007年10月15日提交，要求2006年10月16日提交的美国临时申请60/829,637的权益。这些申请的内容在此通过引用整体并入。

[0003] 政府支持

[0004] 本发明的内容得到国家卫生研究院授予的资助号DK-59953的支持。政府可对本发明具有某些权利。

背景技术

[0005] 环状十四肽促生长素抑制素-14(SRIF)最初从下丘脑分离并被鉴定为生长激素(GH)从垂体前叶释放的生理抑制剂。该十四肽在3-位置和14-位置的两个半胱氨酰氨基酸残基的硫氢基之间具有桥联键或环化键。SRIF和SRIF相关类似物影响多个细胞过程，特别是与GH释放相关的那些过程，还抑制某些肿瘤的生长。例如，类似物[D-Trp8]-SRIF具有氨基酸序列：(环314)H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH，并且具有比SRIF高得多的抑制GH释放的效价。

[0006] SRIF通过与膜结合的结构相似受体家族相互作用而引发其生物效应。五种SRIF受体已经被克隆并称为SSTR 1-5。所有五种受体以高亲和力结合SRIF和28氨基酸SRIF肽SRIF-28(来自猪胃肠道以及猪和羊的下丘脑)。已经鉴定了各种SSTR的激动剂和拮抗剂。

[0007] 促生长素抑制素肽和类似物可以被修饰以实现选择性结合个体SSTR。此类肽和类似物用于例如区分个体受体的个体信号传导功能。受体特异性肽和类似物的使用已经导致不同受体亚型介导体内SRIF不同功能的观念。

[0008] 例如，SSTR2和SSTR5的选择性拮抗剂已经被鉴定并用于揭示这些受体的不同功能。认为这两种受体是外周组织中主要的亚型。认为SSTR2介导对生长激素、胰高血糖素和胃酸分泌的抑制。激动剂奥曲肽显示对SSTR2的一定特异性。相反，SSTR5表现为主要参与控制胰岛素和淀粉酶释放。已经描述了分别对SSTR2和SSTR5具有特异性的类似物。

[0009] SSTR3介导对胃平滑肌收缩的抑制。显示了特异性结合SSTR3的促生长素抑制素类似物。SSTR4存在于脑垂体、肺、胃肠道、肾和某些肿瘤中，基本上排除其他SRIF受体。认为它在结合SRIF后被活化。SSTR4和SSTR1特异性配体已经用于例如治疗内皮细胞的方法中。对SSTR4特异性的受体选择性促生长素抑制素肽类似物是本领域已知的。

[0010] 促生长素抑制素受体在病理状态、特别是胃肠道的神经内分泌肿瘤中表达。源于促生长素抑制素靶组织的大多数人类肿瘤具有保守的促生长素抑制素受体。促生长素抑制素信号传导的效应首先发现于生长激素生成腺瘤和TSH生成腺瘤中；约一半的内分泌失活腺瘤展示促生长素抑制素受体。90％的类癌和大部分胰岛细胞癌，包括它们的转移，通常具有高密度的促生长素抑制素受体。然而，仅10％的结肠直肠癌且没有外分泌胰腺癌含有促生长素抑制素受体。肿瘤中的促生长素抑制素受体可以例如使用体外结合方法或使用体内成像技术来鉴定；后者允许准确定位患者中的肿瘤及其转移。因为胃肠胰腺肿瘤中促生长素抑制素受体是功能性的，它们的鉴定可用于评估类似物抑制患者中过度激素释放的治疗效力。

[0011] 鉴于其作为诊断和治疗靶的用途，需要强力结合SSTR2同时显示仅最小倾向结合其他四种受体的促生长素抑制素拮抗剂。对于用作诊断成像剂而言，此类拮抗剂具有超越SSTR2选择性激动剂的优点，因为所述拮抗剂优选不被内化。

发明内容

[0012] 本发明描述了与新颖SSTR2-特异性拮抗剂相关的组合物以及使用所述拮抗剂的方法。

[0013] 一个实施方案涉及与选自由下述组成的组的SSTR2结合的促生长素抑制素拮抗剂：(i)DOTA-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；(ii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(iii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(iv)H2N-Cpa-c[DCys-L-Agl(NMe. 苯甲酰基 )-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(v)H2N-Cpa-c[DCys-D-Agl(NMe. 苯甲酰基 )-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(vi)H2N-Cpa-c[DCys-Leu-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(vii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(viii)Cbm-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(ix)DOTA-βAla-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(x)DOTA-Peg-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-NH2；(xii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Cha-NH2；(xiii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Hor)-NH2；(xiv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-NH2；
(xv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Cbm)-NH2；(xvi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-GlyOH；(xvii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OCH3)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xviii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OH)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xix)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xx)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-Trp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xxi)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xxii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xxiii)Ac-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；(xxiv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xxv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xxvi)DOTA-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；(xxvii)DOTA-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；和(xxviii)DOTA-Cpa-[DCys-Pal-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]DTyr-NH2。在特定实施方案中，拮抗剂不显著内化入表达SSTR2的细胞并减少奥曲肽诱导的SSTR2内化。在特定实施方案中，促生长素抑制素拮抗剂还包括螯合剂、络合剂、缀合剂或标记。在特定实施方案中，拮抗剂相对于其他组织优先被肿瘤吸收。在特定实施方案中，拮抗剂相对于其他组织优先被肿瘤吸收。在特定实施方案中，肿瘤细胞中拮抗剂吸收与肾细胞中拮抗剂吸收的比值为至少约2.0，在施用后4小时测量。

[0014] 一个实施方案涉及放射成像癌症的方法，包括(a)施用包含促生长素抑制素拮抗剂和放射性核素的组合物；和(b)检测所述放射性核素，其中所述促生长素抑制素拮抗剂选自由下述组成的组：(i)DOTA-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；(ii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(iii)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(iv)H2N-Cpa-c[DCys-L-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(v)H2N-Cpa-c[DCys-D-Agl(NMe.苯甲酰基 )-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(vi)H2N-Cpa-c[DCys-Leu-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(vii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(viii)Cbm-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(ix)DOTA-βAla-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(x)DOTA-Peg-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xi)H2N-Cpa-c[DCys -Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-NH2；(xii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Cha-NH2；(xiii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Hor)-NH2；(xiv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-NH2；
(xv)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Cbm)-NH2；(xvi)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-GlyOH；(xvii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OCH3)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xviii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OH)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xix)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xx)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-Trp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xxi)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xxii)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xxiii)Ac-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；(xxiv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xxv)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；(xxvi)DOTA-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；(xxvii)DOTA-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；和(xxviii)DOTA-Cpa-[DCys-Pal-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]DTyr-NH2。在特定实施方案中，促生长素抑制素拮抗剂结合SSTR2。在特定实施方案中，促生长素抑制素拮抗剂选择性结合SSTR2。

[0015] 一个实施方案涉及组合物制备用于治疗肿瘤的药剂的用途，其中所述组合物包含本发明所述的促生长素抑制素拮抗剂和放射性核素。在特定实施方案中，促生长素抑制素拮抗剂选择性结合SSTR2。

[0016] 一个实施方案涉及用于诊断放射成像癌症的试剂盒，包含(a)适合容器中本发明所述的促生长素抑制素拮抗剂，其中促生长素抑制素拮抗剂：(i)用至少一种放射性核素标记；(ii)未标记并与适合容器中至少一种用于标记的放射性核素一起提供；或(iii)未标记并能够随后用至少一种放射性核素标记；和(b)使用说明书。在特定实施方案中，促生长素抑制素拮抗剂选择性结合SSTR2。

[0017] 一个实施方案涉及用于治疗癌症的试剂盒，包含(a)适合容器中本发明描述的促生长素抑制素拮抗剂，其中，在放射性核素标记促生长素抑制素拮抗剂后，拮抗剂以对于癌症治疗而言的治疗有效量存在，并且其中促生长素抑制素拮抗剂：(i)用至少一种放射性核素标记，(ii)未标记并与适合容器中至少一种用于标记的放射性核素一起提供，或(iii)未标记并能够随后用至少一种放射性核素标记；和(b)使用说明书。在特定实施方案中，促生长素抑制素拮抗剂选择性结合SSTR2。

[0018] 一个实施方案涉及放射成像或治疗癌症的化合物，包含有效量的、与本发明所述促生长素抑制素拮抗剂偶联的放射性核素。在特定实施方案中，拮抗剂选择性结合SSTR2，不显著内化入表达SSTR2的细胞中，并且减少奥曲肽诱导的SSTR2的内化。附图说明

[0019] 图1示例说明了一些sst2拮抗剂的拮抗性质，使用钙释放分析。

[0020] 图2示例说明，尽管对照激动剂[Tyr3]-奥曲肽可以减少sst2内化，但测试的sst2选择性拮抗剂甚至以10μM的浓度单独给予时没有效应。而且，它们防止由[Tyr3]-奥曲肽诱导的sst2内化。

[0021] 图3显示ELISA内化分析中另一类似物(32)的拮抗性质。

[0022] 图4是显示拮抗剂纯度和内化效力的表。

[0023] 图5是显示拮抗剂结合性质的表。

[0024] 图6A和6B显示了显示如实施例11所述SSTR2类似物吸收的数据。

具体实施方式

[0025] 如本发明所述，除非特别指明表示仅一个，否则“一”或“一个”表示一个或多个。

[0026] 本发明使用的“施用”涵盖所有向患者提供物质的适合方式。常用途径包括口服、舍下、经粘膜、经皮、直肠、阴道、皮下、肌肉内、静脉内、动脉内、鞘内、经导管、经植入体等。在一些实施方案中，组合物在肿瘤附近施用或直接施用至肿瘤，例如通过直接注射入肿瘤或当肿瘤是血液肿瘤时注射入血液。

[0027] 本发明使用的“患者”包括任何脊椎动物，包括马、羊、山羊、牛、猪、鸟、猫和灵长类物种。患者可以是例如人。本领域普通技术人员将认识到，就一种物种而讨论的特定的免疫共刺激分子、信号传导分子、细胞标志、细胞类型、感染剂等可以在不同物种中具有相应的类似物，并且此类类似物及其在相应和相关物种中的使用包括在本发明内。

[0028] 本发明使用的“肿瘤”包括实体瘤和非实体瘤；以及从癌前病变和良性肿瘤到癌、恶性和转移肿瘤的不同的肿瘤发育阶段。

[0029] 如本发明使用的，例如在SSTR2拮抗剂上下文中，“吸收”指与肿瘤结合存在的拮抗剂的量；并且区别于“内化”，“内化”指个体细胞水平上的作用，例如分子进入细胞内环境的能力。因此，本发明各种实施方案具有高度吸收但不内化。

[0030] 如本发明使用的，所有温度是℃，并且所有比值按体积计。液体物质的百分比也按体积计。

[0031] 术语“选择性地结合”或“选择性结合”在本发明指拮抗剂优先结合特定结合配偶体，例如，选择性结合SSTR2的拮抗剂强力结合SSTR2，同时表现出对其他SSTR或结合配偶体的弱结合或无结合。通常，“选择性”拮抗剂对选择性受体的结合比其对其他受体的结合强约10倍、约100倍或约1000倍(或更高)。

[0032] 本发明涉及预想不到的发现：特定修饰有效产生与其他克隆SRIF受体相比对SSTR2具有选择性的SRIF肽类似物。已经发现对SSTR2高度选择性的一类促生长素抑制素肽类似物。这些肽类似物是促生长素抑制素拮抗剂，并且尽管不内化入具有SSTR2受体的细胞中，但这些类似物以比相当的受体选择性促生长素抑制素肽激动剂更大的量被吸收。这些肽选择性结合克隆的SSTR2而不活化受体，并且这些肽类似物被碘化或以其他方式被放射性标记时，保留其期望的生物学性质。因此，这些新肽用于确定肿瘤位置和受体SSTR2的细胞表达，以及用于调节某些药理学功能，而无作为此前施用SRIF特征的某些伴随的副作用。这些SRIF肽拮抗剂被放射性标记时可用于例如闪烁扫描术以在体外或体内定位表达这些受体的肿瘤，使用SPECT或PET。除放射性标记以外的标记是本领域已知的，例如荧光标记，并且可选择地使用。当肽类似物包括适合的螯合的放射性核素时，这些类似物用作适合治疗肿瘤的放射性核素疗法的放射性药物。

[0033] 提供了对SRIF受体SSTR2具有选择性亲和力的SRIF肽拮抗剂；它们优选地还对SSTR2具有高亲和力，例如等于约10nm或更小的KD。这些肽包括SRIF的缩短的环状类似物，其中环部分被缩短至仅六个残基，并且其中在N末端存在一个残基并且优选地在C末端添加一个残基。换言之，1-，4-，5-，6-，11-，12-和13-位置残基从14-残基的天然SRIF中缺失，产生各种七肽。这些七肽可以具有在C末端添加的残基，例如残基15，以形成奥曲肽。

[0034] 标准的三字母缩写表示α-氨基酸残基，并且其中氨基酸残基具有异构形式，除非另外明确指明，否则其代表L-形式的氨基酸(例如，Ser＝L-丝氨酸)。“L”或“D”指特定氨基酸的D-异构体和L-异构体。当下文提及肽中位置时，参考天然14-残基促生长素抑制素(SRIF)肽的相应位置进行编号。

[0035] 表现出对SSTR2期望特异性的代表性肽拮抗剂的实例包括例如其中位置1、4-6和11-13的残基优选被消除的拮抗剂。实例包括(环3-14)Xaa1-Xaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15；其中Xaa1是des-Xaa；Xaa2是Trp(A)、Phe(B)、Nal或Tyr (其中A是H、Cl、F、Br、Me、NO2、OMe或N-甲酰基并且B是H、卤素、CH3、NO2或OCH3)；D-Xaa3是D-Cys、D-Pen、D-HCys或具有SH-侧链的另一D-异构体α-氨基酸；
Xaa4、Xaa5和Xaa6是des-Xaa；Xaa7是Aph(Q1)、Ala(噻吩基)、Tyr、ITyr或Trp(A)(其中Q1是Cbm、OH-Cbm、CH3-Cbm、OCH3-Cbm、OEt-Cbm、Cbm-Et(OEt)2或Hor)；Xaa8是D-Trp(A)、Trp(A)、Tyr、D-Tyr、Phe(B)、D-Phe(B)、L或D-BzlHis、L或D-(DNP)His、L或D-Aph(Cbm)；
α α α
Xaa9是Lys、N MeLys、hLys、N MehLys、Orn或N MeOrn；Xaa10是Thr、Ser或Val；Xaa11、Xaa12和Xaa13是des-Xaa；Xaa14是Cys、Pen、hCys或具有SH侧链的L-异构体α-氨基酸；
并且Xaa15是2Nal、D-2Nal、Aph(Q2)、D-Aph(Q2)、(R1)Cha、(R1)D-Cha、(R1)Leu、(R1)D-Leu、α
Tyr、D-Tyr、Trp、D-Trp或des-Xaa(其中R1是H或C Me，并且Q2是Cbm、OH-Cbm、CH3-Cbm、OCH3-Cbm或OEt-Cbm)。此外，2-位的Tyr可以被放射性碘标记、络合、缀合或螯合至与肽类似物的N末端残基的α-氨基直接或经接头连接的物质。该物质可以发挥作用，例如连接放射活性核素(即放射性核素)至肽。例如，大环螯合剂，例如DOTA，可以添加在N末端，通过将其与Xaa2直接结合或者使用接头例如GABA(γ氨基丁酸，参见例如美国专利号
6,022,523，其内容在此通过引用整体并入)或βAla间接与Xaa2结合。

[0036] SRIF类似物的另一实例包括氨基酸序列(环3-14)Xaa1-Xaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Lys-Thr-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Cys；其中Xaa2是取代的Phe；D-Xaa3是D-Cys；Xaa7是Aph(Q1)、Tyr或ITyr；并且Xaa8是D-Trp或D-Aph(Cbm)；并且其中其他的Xaa基团如本发明所描述。

[0037] 本发明使用的“Trp”和“D-Trp”指未取代的残基以及其中在Trp的5-或6-位置进行氢的单取代的残基。这些位置上的取代可以包括例如氯代、氟代、溴代、甲基、硝基和甲氧基，使用氯代、氟代和溴代或使用甲酰基取代吲哚N的氢。

[0038] 本发明使用的“Nal”指在β-碳原子上被萘基取代的丙氨酸异构体，与萘的连接优选在环的2位置或者任选在1位置。

[0039] 本发明使用的“Aph”指氨基苯基丙氨酸，其中氨基优选连接至苯环的4位置，但是连接在2-或3-位置一般是等价的。本发明使用的“Aph(Cbm)”指4-脲基-苯基丙氨酸。Aph(OH-Cbm)表示4-(3-羟基)-脲基-苯基丙氨酸。本发明使用的“Aph(CH3-Cbm)”指
4-(3-甲基)-脲基-苯基丙氨酸。本发明使用的“Aph(OCH3-Cbm)”指4-(3-甲氧基)-脲基-苯基丙氨酸。本发明使用的“Aph[(EtO)2Et-Cbm]”指4-{3-[2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙基]}-脲基-苯基丙氨酸。本发明使用的“ITyr”指碘化的L-酪氨酸。本发明使用的“Cpa”指氯-Phe，例如4-ClPhe。本发明使用的“Aph(Hor)”指4-[(2，6-二氧-六氢-嘧啶-4-羰基)-氨基]-苯基丙氨酸。本发明使用的“SRIF”指14-残基环状促生长素抑制素肽。本发明使用的“Cha”指环己基胺。本发明使用的“Pen”指青霉胺(β-巯基缬氨酸)。本发明使用的“hLys”或“hCys”指在侧链具有一个额外CH2基团的α-氨基酸。

[0040] C末端通常被酰胺化，尽管可以使用等价物，例如Gly-OH。肽的N末端可以各种方式修饰而不显著不利地影响结合亲和力。认为对这些环状肽的所有修饰被包括作为整体发明肽的部分。例如，可以络合剂或缀合剂(Z)的形式向N末端氨基酸进行多种添加，然后络合剂或缀合剂(Z)可用于将需要的部分结合至肽或提供标记。此类部分Z一般可选自由下述组成的组：基于DOTA的螯合剂和基于DTPA的螯合剂、基于NOTA的螯合剂、羰基化合物、2-肼基烟酰胺(HYNIC)、N4-螯合剂、去铁案(desferrioxamin)和NxSy-螯合剂，全部任选与放射性同位素、用于加卤的酪氨酸(Tyr)、荧光染料或生物素络合。Cpa还可用作氚化的前体。可以连接螯合剂，例如DTPA、DOTA、HYNIC和P2S2-COOH。螯合剂包括例如p-NH2-Bz-DOTA(2-p-氨基苄基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)和DOTA-p-NH2-酰苯胺[1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(对氨基酰苯胺)]。或者，如果需要，螯合剂可通过适合的接头(L)共价连接至N末端。适合的接头包括例如酪氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、聚乙二醇、脂肪酸及其衍生物、β-丙氨酸、5-氨基戊酸、肌氨酸和葡萄糖醛酸。当Tyr出现在N末端时，其可以被放射性碘化或以其他方式标记。具有超过约20个氨基酸的酰基还可以存在于N末端，因为如果需要，N末端残基还可用大的部分酰化而不损失选择性。

[0041] 已经通过测试本发明类似物肽与五种不同克隆的人SRIF受体的相互作用而证明了其对SSTR2的结合选择性。一般而言，表达受体的重组细胞经洗涤和匀浆而制备适合缓冲液中粗制蛋白匀浆。在典型分析中，将适量的来自细胞匀浆的蛋白质放入小体积的处于适当pH的适当分析缓冲液中。以适宜的浓度向混合物中添加候选物质，例如潜在的SRIF激动剂和拮抗剂，并监测候选物质与报告多肽之间的相互作用。结合SSTR2但对其他受体也显示亲和性的受体拮抗剂可以用于本发明的各种组合物和方法，包括用于肿瘤成像和治疗的试剂盒、组合物和方法。在优选实施方案中，本发明多肽仅明显强力结合SSTR2，并且它们的结合表现出高亲和力。

[0042] 对克隆的SRIF受体进行受体结合分析，并使用竞争性分析产生IC50值，IC50值指示从50％结合位点替代被测量的靶配体饱和浓度所必需的竞争性配体的浓度。

[0043] 本发明还涉及例如内部操作地检测人体中健康状态下不含有大量SSTR2的组织中恶性肿瘤的方法。该方法包括例如(i)向这种人施用一种组合物，该组合物包含足以通99m 161 90 177 123
过γ检测探针检测的量的SSTR2选择性肽，其中所述肽例如用 Tc、 Tb、Y、Lu、 I或
125
I放射活性标记，和(ii)在允许活性物质结合并吸收入肿瘤以及血液清除放射性后，使这种人经受通过使用γ检测探针的身体相关区域的放射检测技术。

[0044] 在一个实施方案中，本发明SRIF拮抗剂对SSTR2具有高度选择性，并且它们以大于对SSTR2仅部分特异性的其他已知SRIF肽激动剂的量被吸收。更重要地，认为SRIF拮抗剂用于治疗表达SSTR2的肿瘤细胞。此类治疗可包括例如放射疗法，其成功直接取决于肿瘤吸收的辐射的量。由于它们被肿瘤细胞吸收而不必然被肿瘤细胞内化，因此，本发明拮抗剂比已知激动剂更有效用于肿瘤放疗。

[0045] 本发明拮抗剂还用于闪烁扫描术以确定表达SSTR2的细胞和组织在全身的分布。通过放射性扫描或磁共振的外部成像的使用允许在体内半定量检测。

[0046] 本发明拮抗剂还用于选择性阻断某些由SSTR2介导的药理学效应。SRIF的许多效应是本领域已知的或会知道的。

[0047] 放射性标记的拮抗剂用于治疗性治疗人体中健康状态下不含大量SSTR2的组织中的恶性肿瘤。放射性标记的SSTR2-选择性肽拮抗剂可以有效用于闪烁扫描术或用于186 188
对抗或控制肿瘤的量包括于组合物中而被施用。放射性标记的肽可例如使用 Re、 Re、
111 113m 71 90 67 99m 169 121 127 142 143 66 67 68 72 127 195
In、 In、As、Y、Cu、 Tc、 Er、 Sn、 Te、 Pr、 Pr、Ga、Ga、Ga、Ga、Te、Pt、
211 198 199 161 109 165 149 151 153 157 159 166 172 169 175 177
At、Au、 Au、 Tb、 Pd、 Dy、 Pm、 Pm、 Sm、 Gd、 Gd、 Ho、 Tm、 Yb、 Yb、Lu、
105 114 124 131
Rh、 Ag、I或 I来标记。

[0048] 标记的SRIF类似物用于药物筛选分析以筛选以高亲和力结合SSTR2并且是高度有效拮抗剂的新的有效肽和非肽物质。使用本发明所述对受体SSTR2具有选择性的配体，可以获得对重组产生的受体的基线活性。然后可以进行标记配体和候选物对SSTR2的竞争性结合分析以确定相对结合亲和力。或者，受体功能的抑制剂或修饰剂(例如拮抗剂)的有希望的候选物可直接加入分析混合物以确定此类候选物对受体的效应。通过比较在候选物存在或不存在时的受体活性程度，则可以获得有关候选物质对受体正常功能效应的信息并因此确定与已知SSTR2选择性类似物相比其作为激动剂或拮抗剂的功能。下述实施例描述的环状SRIF肽是拮抗剂，并且它们用来介导SSTR2的正常功能。

[0049] 本发明描述的肽可通过经典溶液合成来合成，但是酰胺化的肽优选通过本领域已知的在甲基二苯甲胺(MBHA)树脂或BHA树脂上的固相技术合成。具有游离羧基C末端的肽可如美国专利号7,019,109中的教导来合成，其内容在此通过引用整体并入。具有酰胺化C末端的肽可如美国专利号.5,874,227的教导来合成，其内容在此通过引用整体并入。固相合成以逐步方式在C末端开始向链中添加氨基酸的方式进行。本领域已知的侧链保护基作为具有特定反应性侧链的任何氨基酸的部分被加入，并且任选地可用于其它情况(例如Trp)，其中此类氨基酸偶联至建立在树脂上的链上。此类合成提供完全保护的中间体肽基树脂。保护基团一般在氧化而在Cys侧链之间产生二硫键之前分离并且肽从树脂载体裂解。

[0050] 本发明描述的SRIF类似物还用于治疗性适应症，例如促生长素抑制素调节剂。这种用途中，类似物一般在小于约100微克/千克体重、小于1000微克/千克体重、小于约100微克/千克体重、小于约10微克/千克体重或小于约1微克/千克体重的水平是有效的。为了延长的作用，可能需要使用约0.1至约2.5毫克/千克体重的剂量水平使用。这些类似物溶于水并因此可制备为相对浓缩的溶液以施用。

[0051] 本发明的肽不仅提供用于结合SSTR2的更有效的配体，而且使用标记肽(例如本发明肽的放射性标记形式)可促进更有效拮抗剂的药物筛选。

[0052] 本领域已知的筛选分析可采用直接来自重组宿主的受体多肽SSTR2，并且可用于鉴定用于阻断或模拟促生长素抑制素期望的某些方面同时消除可产生自其他受体的活化或阻断的激素的不期望方面的物质。在这方面，如果需要放射性碘化类似物用于筛选目的，则可以在N末端添加Tyr而取代DOTA，或者可以在2位置使用Tyr而取代Cpa，或者适合的放射性配体可通过DOTA螯合剂连接。使用候选化合物的竞争性结合分析可首先以该方式对SSTR2进行以检索高结合亲和力；然后通过筛选多个SRIF受体，可以确认是否存在需要的仅对该受体的选择性结合。非放射性标记的肽可用于治疗所有已知表达SSTR2的器官的疾病，所述器官包括肺、胃肠道和肾。

[0053] 因为向SRIF类似物N末端添加不表现为不利影响选择性结合，应该清楚，这些化合物可与放射活性核素络合，目的是将该物质载至肿瘤或希望细胞凋亡的其他组织。例如，适合的螯合剂可用于将SRIF类似物与前述高度放射活性的金属络合。适合螯合放射活性金属原子的螯合基团的一些实例是四配位基螯合剂或基团，衍生自乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺戊乙酸(DTPA)、环己基1，2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-0，0′-二(2-氨基乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、N，N-二(羟基苄基)-乙二胺-N，N′-二乙酸(HBED)、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)、羟基乙二胺三乙酸(HEDTA)、1，4，8，11-四氮杂环-十四烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(TETA)、取代的DTPA、取代的EDTA。其他的螯合剂以及放射活性剂公开于WO 95/22341和WO 04/082722以及美国专利公布2004/0242842和2005/0070470，其完整内容在此通过111 99m
引用并入。螯合剂可衍生自例如EDTA和DOTA。一些适合的盐是 In-oxinte、Tc-酒石酸盐，其一般可以在对肽拮抗剂无害的条件下以简单方式形成。

[0054] SRIF拮抗剂的溶解度可通过使用亲水化合物(例如氢化乳清酸(Hor)或类似物)酰化N末端氨基、或通过与适合异氰酸酯(例如异氰酸甲酯或异氰酸异丙酯)反应以在N末端产生脲基而得到提高。如本领域已知增加SRIF拮抗剂作用持续时间的其他物质也可在N末端连接。

[0055] 与药学或兽医学可接受载体组合形成药物组合物的这些SRIF拮抗剂或其非毒性盐可以静脉内、皮下、肌内、经皮例如鼻内、脑脊髓内或口服施用于动物，包括人和其他哺乳动物。被设计用于检测组织中的恶性人肿瘤(包括其转移)的此类药物组合物除了药学可接受载体物质以外可以包括任选的药学可接受佐剂、足以外部成像以通过γ检测探针检测或用于对抗或控制肿瘤的作为活性物质的标记的肽拮抗剂。肽拮抗剂应该是至少约90％纯的并且优选应该具有至少约98％的纯度；然而，较低的纯度是有效的，并且很可用于非人的哺乳动物。该纯度表示所述肽构成存在的所有类似肽和肽片段的所述重量％。对人的施用应该在医生指导下对抗具体肿瘤和癌症或调节其中SSTR2受体发挥控制功能的其他病状，例如与酪氨酸磷酸酶偶联以便能够刺激该酶以介导SRIF的抗增殖效应。所需剂量根据待治疗的特定病状、病状严重度以及所需治疗的持续时间而变化。

[0056] 肿瘤通常表达几种类型的肽受体(Reubi，J.和Waser，B.，Eur.J.Nucl.Med.Molec.Imaging，30：781-793，2003)。多个肽受体的此类组可以包括sst2受体以及铃蟾肽受体、CCK受体、VIP受体、GLP-1受体、神经降压素受体、促胰液素受体、神经调节肽B受体和CRF受体等。在这种情况下，SSTR2拮抗剂作为混合物与这些各种受体的一种或多种放射性标记拮抗剂的组合施用应该非常明显地改善此类肿瘤的体内靶向。

[0057] 此类肽拮抗剂通常以药学或兽医学可接受的非毒性盐形式施用，例如酸加成盐或金属络合物，例如与锌、铁、钙、钡、镁、铝或类似物的金属络合物。此类非毒性盐的示例有盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、鞣酸盐、草酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、藻酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐及类似物。

[0058] 还可能希望经延长的时段(例如从单次施用后一周至一年的时段)递送这些SRIF拮抗剂，并且可以如本领域公知的，利用缓释、储库或植入剂型。剂型可以含有例如在体液中具有低溶解度的化合物的药学可接受的非毒性盐，例如与多元酸的酸加成盐、与多价金属阳离子的盐或两种盐的组合。相对不溶性盐可以配制成凝胶，例如硬脂酸铝凝胶。适合注射的缓释储库制剂还可以含有分散或封装于缓慢降解的、非毒性或非抗原性聚合物的SRIF拮抗剂或其盐，所述聚合物例如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物，例如在美国专利号3,773,919中所述。

[0059] 治疗有效量的肽拮抗剂应该在医生指导下施用，并且药物组合物通常含有与常规的药学或兽医学可接受的载体结合的肽。认为治疗有效量是经计算为实现所需效应的预定量。所需剂量根据特定治疗和所需治疗持续时间而变化；然而，预期约10微克至约1微克/千克体重/天的剂量将用于治疗性治疗。可能特别有利的是如之前所述以储库或长效形式施用此类化合物。治疗有效量通常是当以生理上可接受的组合物外周(例如静脉内)施用时足以实现其约0.1μg/ml至约100μg/ml、约1μg/ml至约50μg/ml或至少约2μg/ml(通常5至10μg/ml)的血浆浓度的SRIF拮抗剂的量。以这些量，它们可用于按需要影响胃分泌。

[0060] 当组合物用于成像或治疗性治疗时，放射性标记的化合物的差贮藏期限和/或放射性核素的短半衰期可能要求使用者在临床医院或实验室进行放射性核素的标记反应。在此类情况下，可以“试剂盒”的形式为使用者提供各种反应成分。进行所需反应所必需的操作应该尽可能简单以使使用者能够使用正常为一次性的工具从试剂盒制备放射活性标记的组合物。因此，用于制备放射性药物组合物、检测和定位组织中的恶性肿瘤及其转移的试剂盒可以包含(i)SSTR2选择性肽、惰性药学可接受的载体和/或配制剂以及任选的佐剂，(ii)放射活性金属同位素的盐或螯合物的溶液，和(iii)含有使试剂盒中存在的成分反应的处方的使用说明书。

[0061] 用作此类试剂盒的成分的肽拮抗剂可以通过与螯合剂反应而被衍生化。得到的肽缀合物提供以简单方式牢固连接放射性核素的便利。含N二-或多乙酸或其衍生物，例如111 113m
前面提到的化合物，已经证明非常适合使各种金属放射性核素(例如 In和 In)连接至肽分子。提供于使用者的试剂盒还可以包含上文定义的其他成分以及使用说明书，而具有有限的贮藏期限的放射性核素的盐或螯合物的溶液可以单独提供给使用者。

[0062] 制备用99mTc、186Re或188Re标记的放射性药物组合物的试剂盒除了上述(i)和(ii)中定义的成分外可以包含例如还原剂以及需要时的螯合剂，和(iii)使用说明书，具有使99m 186 188
试剂盒成分与高锝酸盐溶液形式的 Tc或与高铼酸盐溶液形式的 Re或 Re反应的处方。如果需要，试剂盒的各种成分可以被组合，条件是它们是相容的。试剂盒应该包含还原高锝酸盐或高铼酸盐的还原剂，例如连二亚硫酸盐、金属还原剂或络合物稳定还原剂，例如SnCl2、Sn(II)-酒石酸盐、Sn(II)-膦酸盐或焦磷酸盐、或Sn(II)-葡庚糖酸盐。高锝酸盐或高铼酸盐溶液可以简单地获自适合的供应商。当放射性核素存在于试剂盒本身中时，与肽的络合物生成反应可以简单地通过在中性介质中组合各组分并使它们反应而发生。为了该目的，放射性核素可以与结合至如前所述比较弱的螯合剂的螯合物形式的肽反应。

[0063] 当试剂盒包含前述衍生化的肽并预期用于制备用99mTc、186Re或188Re标记的放射性药物组合物时，放射性核素将优选以高锝酸盐或高铼酸盐溶液的形式单独添加。这种情况下，试剂盒将包含适合的还原剂和需要时的螯合剂，前者还原高锝酸盐或高铼酸盐。可以使用还原剂，例如连二亚硫酸盐或金属还原剂。成分可以任选地被组合，条件是它们是相容的。其中组合的成分优选被冻干的这种单组份试剂盒适合通过使用者与放射性核素溶液反应。可以使用金属还原剂，例如Sn(II)、Ce(III)、Fe(II)、Cu(I)、Ti(III)或Sb(III)；Sn(II)。试剂盒的肽组份可以提供为溶液，例如生理盐水溶液的形式或在一些缓冲溶液中，但是其优选以干燥状态、例如冻干状态存在。当用作注射液体的组份时，其应该是无菌的。
当组份是干燥状态时，使用者应该使用无菌生理盐水溶液作为溶剂。如果需要，组份可以用适合的稳定剂以常规方式稳定，所述稳定剂例如抗坏血酸、龙胆酸或这些酸的盐。

[0064] 尽管已经就其优选实施方案描述了本发明，但应该理解，可以做出对本领域普通技术人员而言显而易见的各种改变和调整而不背离所附权利要求中提出的本发明范围。尽管权利要求在肽序列方面不同地限定了本发明，但应该理解，这预期包括公知为其完全等价物并且最经常施用的其非毒性盐。

[0065] 下述实施例被包括以说明本发明优选实施方案。本领域技术人员应理解，随后实施例中公开的技术代表发明人发现在实施本发明中作用良好的技术，并因此可以被认为构成其实施的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解可以对公开的具体实施方案进行许多改变并且依然获得同样或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。在此所有专利、申请和参考文献的公开内容通过引用明确并入本发明。

[0066] 实施例

[0067] 下述实施例示例说明提供许多体现本发明各种特征的SRIF肽拮抗剂。每个肽中，位置3和位置14(根据SRIF编号)的半胱氨酸残基通过环化二硫键结合并且可以注释为“(环3-14)”或“c[ ]”。

[0068] 实施例1.

[0069] 合成了促生长素抑制素类似物DOTA-des-AA1，4，5，6，11，12，13[Cpa2，D-Cys3，Tyr7，8
D-4Aph(Cbm)]-SRIF-2Nal-NH2，具有下述结构：(环3-14)DOTA-Cpa-D-Cys-Tyr-D-4Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys-2Nal-NH2。(肽28)。采用BOC策略的固相方法用于以逐步方式在MBHA树脂上合成八肽，大体如‘277专利“实施例II”所述。Boc-D-4Aph(Cbm)-OH被预先制备并在位置8偶联。

[0070] 在从树脂切割肽并同时通过HF去除侧链保护基(除了从Lys去除Fmoc)之后，通过添加10％碘在甲醇中的溶液直至得到的溶液保持橙色，然后搅拌40分钟并用抗坏血酸猝灭，肽在75％乙酸溶液中被氧化以产生二硫桥。通过制备型RP-HPLC纯化粗肽，使用从基线％B(洗脱剂A＝0.1％TFA，洗脱剂B＝60％CH3CN，40％A)1％B/分钟增量的线性梯度，流速100ml/min。然后通过向无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF，3.5ml)中纯化肽(32mg，～20μM)添加DMF(1ml)中的DOTA-NHS.3TFA.HPF6(Macrocyclics，Dallas，TX)(198mg，～20μM)和N，N′-二异丙基乙胺(DIPEA)(36μl，～22μM)，将DOTA偶联在N末端作为螯合剂。混合物在室温搅拌过夜。反应进程通过分析HPLC跟踪，并且MS分1，4，5，6，11，12，13 2 3 7 8
析显示获得了预期产物纯的DOTA-des-AA [Cpa，D-Cys，Tyr，D-4Aph(Cbm)，
9
Lys(Fmoc)]-SRIF-2Nal-NH2。反应完全后，通过添加4ml的20％哌啶在DMF中的溶液并
9 1，4，5，6，11，12，13 2 3
等待30分钟而实现从Lys 侧链除去Fmoc保护基。DOTA-des-AA [Cpa，D-Cys，
7 8
Tyr，D-4Aph(Cbm)]-SRIF-2Nal-NH2通过使用上述相同条件的制备型RP-HPLC脱盐。最终环状DOTA-肽-缀合物的纯度通过分析型CZE测定。其是94％纯的。

[0071] MS分析显示[M+H]+质量为1583.72Da，其非常接近1583.62Da的计算质量。该肽在下文被称为28号肽。

[0072] 实施例2.

[0073] 实施例1中描述的初始合成被重复，具有两个改变；在7-位置和8-位置使用1，4，5，6，11，12，13 2 3 7
4Aph(Cbm)和D-Trp以提供八肽-树脂：des-AA [Cpa，D-Cys，4Aph(Cbm)，
8 9
D-Trp，Lys(Fmoc)]-SRIF-2Nal-MBHA树脂。

[0074] 在从酰胺树脂切割肽并同时通过HF从氨基酸侧链去除保护基(除了从Lys去除Fmoc)之后，通过添加10％碘在甲醇中的溶液直至得到的溶液保持橙色，然后搅拌40分钟并用抗坏血酸猝灭，肽在75％乙酸溶液中被氧化以产生二硫桥。通过制备型RP-HPLC纯化粗肽，使用从基线％B(洗脱剂A＝0.1％TFA，洗脱剂B＝60％CH3CN，40％A)1％B/分钟增量的线性梯度，流速100ml/min。向无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF，3.5ml)中纯化肽(34mg～24μM)添加DMF(150μl)中的DOTA-NHS.3TFA.HPF6(Macrocyclics，Dallas，TX)(24mg，24.2μM)和N，N′-二异丙基乙胺(DIPEA)(40μl，24μM)。混合物在室温搅拌过9
夜。反应进程通过分析HPLC跟踪，反应完全后，向反应混合物添加1ml哌啶以从Lys 侧
1，4，5，6，11，12，13 2 3 7
链去除Fmoc保护基持续30分钟，得到DOTA-des-AA [Cpa，D-Cys，4Aph(Cbm)，
8
D-Trp]-SRIF-2Nal-NH2，其具有下式：(环3-14)DOTA-Cpa-D-Cys-4Aph(Cbm)-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2Nal-NH2。

[0075] 该肽通过使用上述相同条件的制备型RP-HPLC脱盐。最终环状DOTA-肽-缀合物+的纯度通过分析型CZE测定为约98％纯。MS分析显示[M+H] 质量为1606.50Da，其非常接近1606.64Da的计算值。该肽在下文被称为14号肽。

[0076] 实施例3.

[0077] 实施例1提出的合成被重复，在C末端省略2Nal并用4Aph(Hor)替代Tyr7。Boc-4Aph(Hor)-OH如所述预制备(Jiang，G.等，J.Med.Chem.，44：453-467)。肽的切割、脱保护、环化和纯化如实施例1进行。纯化的环状肽具有下式：(环3-14)DOTA-Cpa-D-Cys-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys-NH2。其根据CZE具有约98％的纯度。其称为33号肽。
+
MS分析显示[M+H] 质量为1525.68Da，其非常接近1525.58Da的计算值。

[0078] 实施例4.

[0079] 实施例1中提出的合成被重复，具有一个改变，在N末端使用pNO2-Phe替代pCl-Phe。肽的切割、脱保护、环化和纯化如实施例1进行。纯化的环状肽具有下式：(环3-14)DOTA-pNO2-Phe-D-Cys-Tyr-D-4Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys-2Nal-NH2。其根据CZE具有约+
98％的纯度，其称为5号肽。MS分析显示[M+H] 质量为1594.17Da，其非常接近1594.65Da的计算值。

[0080] 实施例5.

[0081] 实施例1中描述的初始合成被重复，具有一个改变；使用Aph(Hor)替代7-位1，4，5，6，11，12，13 2 3 7 8
置的Tyr以提供八肽-树脂：des-AA [Cpa，D-Cys，4Aph(Hor)，D-Aph(Cbm)，
9 1，4，5，
Lys(Fmoc)]-SRIF-2Nal-MBHA树脂。然后如实施例2所述进行反应，得到DOTA-des-AA
6，11，12，13 2 3 7 8
[Cpa，D-Cys，4Aph(Hor)，D-Aph(Cbm)]-SRIF-2Nal-NH2，其具有下式：(环3-14)DOTA-Cpa-D-Cys-4Aph(Hor)-D-Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys-2Nal-NH2(肽30)。

[0082] 最终环状DOTA-肽-缀合物的纯度通过分析型CZE测定为约98％纯。MS分析显+示[M+H] 质量为1722.56Da，其非常接近1722.65Da的计算值。

[0083] 实施例6.

[0084] 实施例5提出的合成被重复，在C末端用D-Tyr替代2Nal。肽的切割、脱保护、环化和纯化如实施例1进行。纯化的环状肽具有下式：(环3-14)DOTA-Cpa-D-Cys-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys-D-Tyr-NH2。其根据CZE具有约98％的纯度。其称为31号肽。+
MS分析显示[M+H] 质量为1688.83Da，其非常接近1688.64Da的计算值。

[0085] 实施例7.

[0086] 实施例4提出的合成被重复，在C末端用D-Tyr替代2Nal。肽的切割、脱保护、环化和纯化如实施例1进行。纯化的环状肽具有下式：(环3-14)DOTA-pNO2-Phe-D-Cys-Tyr-D-4Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys-D-Tyr-NH2。其根据CZE具有约98％的纯度。其称为3号肽。MS+分析显示[M+H] 质量为1560.63Da，其非常接近1560.83Da的计算值。

[0087] 实施例8.

[0088] 实施例7提出的合成被重复，具有两个改变，在7-位置使用ITyr并且在8-位1，4，5，6，11，12，13 2 3 7 8
置使用D-Trp以提供八肽-树脂：des-AA [pNO2-Phe，D-Cys，ITyr，D-Trp，
9
Lys(Fmoc)]-SRIF-D-Tyr-MBHA树脂。

[0089] 当肽从酰胺树脂被切割并大体上如实施例2所述进行反应之后，获得具有下式的肽：(环3-14)DOTA-pNO2-Phe-D-Cys-ITyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-D-Tyr-NH2(肽32)。最终环+状DOTA-肽-缀合物的纯度通过分析型CZE测定为约98％纯。MS分析显示[M+H] 质量为
1667.74Da，其非常接近1667.52Da的计算值。

[0090] 实施例9.

[0091] 体外生物分析：根据其结合在CHO-K1细胞和CCL39细胞上表达的分离的克隆受体的能力在体外测试各种促生长素抑制素类似物的效应。编码多个促生长素抑制素受体亚型的基因的分子克隆允许这些受体在哺乳动物细胞中的个体表达及其各自药理特征的表征。已经克隆了五个此类受体亚型，称为SSTR1至SSTR5(Raynor，K.等，Mol.Pharmacol.，43：
838-844，1993；Raynor，K.等，Mol.Pharmacol.，44：385-392，1993)。这些参考文献描述了可用于确定特定SRIF类似物是否与物种受体亚型的一个或多个选择性结合以及它们是以高亲和力还是低亲和力与此类受体亚型结合。每个受体亚型可以介导不同但是重叠的SRIF生理效应。结果，与受体SSTR2选择性结合的化合物可用于调节SRIF特定的生理功能而不可能具有由其他SRIF受体介导的另一种SRIF生理功能所引起的不希望的效应。

[0092] CHO-K1细胞在Ham’s F-12培养基中培养，并且CCL39细胞在补充了10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml 链霉素的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基/Ham’s F-12(1∶1)混合物中在含有5％CO2的湿润空气中37℃培养。细胞用冰冷0.05M Tris-HCl(pH 7.4)洗涤并刮入冰冷0.05M Tris-HCl(pH 7.4)，离心收集，并使用转子/定子系统在相同缓冲液中匀浆。在4℃下120g离心5分钟后，收集上清液并再次在4℃下48,000g离心30分钟。得到的沉淀悬浮于冰冷Tris缓冲液，转移到微量离心管中，在4℃下20,000g离心15分钟。抽掉上清液后，膜沉淀在-80℃保存。

[0093] 对固定在显微镜载玻片上的20μm厚的膜沉淀冷冻切片进行受体放射自显影，然后保存在-20℃。对于每个测试化合物，使用以强亲和力与全部五种受体结合的通用促生长125 8 22 25
素抑制素配体放射性配体 I-[Leu，D-Trp ，Tyr ]-促生长素抑制素28进行完全替换实验。使用范围0.1-1000nM的不断增加浓度的未标记肽。使用相同的不断增加浓度的未标记的促生长素抑制素-28平行运行，作为对照。在使用本领域已知的计算机辅助图像处理系统对数据量化之后计算IC50值。

[0094] 在100nM的浓度，28号肽对SRIF-28配体与SSTR1、SSTR3、SSTR4和SSTR5的结合具有最小效应。相反，其选择性结合SSTR2，替代放射性配体与人SSTR2的结合，IC50值约1.8nM。

[0095] 某些SRIF类似物抑制125I-[Leu8，D-Trp22，Tyr24]SRIF-28与各种克隆的人SRIF受体的放射性配体结合的效价显示于下表1，其中IC50值以纳米摩尔浓度给出。括号中的数字表示特定结合测试进行的次数。

[0096] 表1.

[0097]

[0098] 而且，测试并报告于表1中的所有肽显示无显著的细胞内化，同时拮抗奥曲肽诱导的内化。第28、5、30、31、3和32号肽在体内表现出非常良好的结合性质和优良的肿瘤靶向性质(即在4h和24h时sst2肿瘤中大的吸收)以及优良的肿瘤：肾比值；这可以被过量冷肽阻断。

[0099] 裸小鼠中HEK-sst2细胞植入

[0100] 按照Swiss regulations(approval 789)的指导原则维持、治疗和护理动物。无胸腺雌性裸小鼠被皮下植入一千万新鲜悬浮于无菌PBS中的HEK-sst2细胞。接种后10至14天，小鼠显示实体可察觉的肿瘤块(肿瘤重量60-150mg)并用于体内生物分布实验。

[0101] 使用亚型选择性配体的促生长素抑制素受体放射自显影在体外测试的切除肿瘤样品中获得实际仅表达sst2的转染肿瘤的确认。

[0102] 111In-标记的拮抗剂和激动剂的体内生物分布

[0103] 小鼠在尾静脉注射在0.1ml NaCl溶液(0.9％，含有0.1％BSA)中10pmol的111
In-放射性标记肽(大约0.15-0.2MBq)。在注射后4h或24h研究生物分布。感兴趣的器官被收集、吸干、称重、测量其放射性并计算每克注射活性百分比(％IA/g)。

[0104] 一个实验中，5μCi 111In-标记的28号肽注射入带有HEK-sst2肿瘤的裸小鼠，每个样品组3-4只小鼠。2000-倍(按mol计)未标记化合物存在抑制结合。生物分布结果提供于表2。

[0105] 表2.

[0106]器官 4h 4h阻断 24h
血液 0.26 0.03 0.19 0.03 0.06 0.01
心脏 0.36 0.03 0.12 0.01 0.09 0.01
肝 1.52 0.03 0.88 0.10 0.52 0.08
脾 0.62 0.06 0.36 0.10 0.28 0.05
肺 2.31 1.25 0.30 0.10 0.31 0.08
肾 7.48 0.43 6.95 0.39 4.50 0.36
胃 20.27 2.55 1.84 0.37 3.38 0.69
肠 1.44 1.18 0.25 0.04 0.23 0.05
肾上腺 3.17 0.69 0.21 0.01 0.77 0.14
胰腺 29.83 2.86 2.41 0.73 2.35 0.47
闹垂体 8.29 3.38 0.21 0.06 1.73 0.84
肌肉 0.19 0.05 0.06 0.01 0.10 0.05
骨 1.23 0.24 0.16 0.05 0.85 0.66
sst2肿瘤 28.41 2.98 2.36 0.27 21.49 0.95

[0107]

[0108] 当5μCi 111In-标记的14号肽注射入带有HEK-sst2肿瘤的裸小鼠时观察到下述生物分布(表3)，每个样品组三只小鼠。

[0109] 表3.

[0110]177

[0111] 使用 Lu-标记的14号肽的类似实验(5μCi注射入带有HEK-sst2肿瘤的裸小鼠，每个样品组三只小鼠)给出下述生物分布(表4)，表示为肿瘤：器官中的信号比值。

[0112] 表4.

[0113]器官 4h 24h
血液 0.20 0.061
心脏 0.25 0.084
肝 0.80 0.399
脾 1.03 0.232
肺 2.88 0.438
肾 10.82 6.034
胃 17.26 1.825
肠 0.96 0.282
肾上腺 2.85 1.370
胰腺 26.11 1.177
闹垂体 20.18 8.637
肌肉 0.22 0.153
骨 1.06 0.915
sst2 34.90 25.650

[0114]

[0115] 通过比较，111In-标记的33号肽在注射5μCi进入携带HEK-sst2和sst3肿瘤的裸小鼠之后显示下述生物分布(表5)，每个样品组4只小鼠。1000-倍未标记的化合物的存在抑制了结合：

[0116] 表5.

[0117]器官 4h STDEV 4h阻断 STDEV 24h STDEV
血液 0.12 0.01 0.12 0.01 0.04 0.01
心脏 0.06 0.01 0.05 0 0.05 0.02
肝 0.33 0.04 0.32 0.04 0.25 0.08
脾 0.17 0.03 0.2 0.01 0.12 0.02
肺 0.27 0.06 0.21 0.04 0.18 0.1
肾 13.74 1.26 10.3 1.75 7.07 1.12
胃 0.16 0.02 0.12 0.01 0.12 0.03
肠 0.11 0.02 0.09 0 0.06 0.01
肾上腺 0.26 0.04 0.23 0.05 0.15 0.04
胰腺 0.06 0.01 0.05 0.01 0.04 0.01
闹垂体 0.46 0.36 0.14 0.1 0.05 0.04
肌肉 0.03 0.01 0.02 0.01 0.03 0.01
骨 0.09 0.06 0.04 0.03 0.06 0.01
sst2 3.56 0.65 0.22 0.14 1.21 0.31
sst3 0.22 0.03 0.14 0.07 0.21 0.11

[0118] 相对于sst2肿瘤的生物分布显示于表6

[0119] 表6.

[0120]器官 4h 4h阻断 24h
血液 29.7 1.8 30.3
肾 0.3 0.0 0.2
胰腺 59.3 4.4 30.3
闹垂体 7.7 1.6 24.2
肌肉 118.7 11.0 40.3
骨 39.6 5.5 20.2

[0121] 111In-标记的5号肽在注射5μCi进入携带HEK-sst2肿瘤的裸小鼠之后显示下述生物分布(表7)，每个样品组3-4只小鼠。2000-倍未标记的化合物的存在抑制了结合。

[0122] 表7.

[0123]111

[0124] 30号肽被更详细地研究。 In-标记的30号肽在注射5μCi进入携带HEK-sst2肿瘤的裸小鼠之后显示下述生物分布(表8)，每个样品组4只小鼠。2000-倍过量的冷肽显示了阻断。

[0125] 表8.选定器官的肿瘤：器官比值

[0126]器官 1h 4h 4h阻断 24h 48h 72h
血液 19.7 112.8 75.6 519.6 657.5 307.3
心脏 27.9 88.2 88.2 259.8 263.0 184.4
肝 10.2 18.3 7.6 34.6 23.1 18.8
脾 13.2 27.1 13.2 66.6 47.0 36.9
肺 2.6 18.4 22.0 61.9 69.2 46.1
肾 2.4 3.3 0.9 4.3 3.5 3.2
胃 1.4 2.1 18.9 7.5 4.6 5.7
肠 7.9 25.0 44.1 81.2 54.8 61.5
肾上腺 2.5 5.5 26.5 16.8 16.0 13.2
胰腺 0.6 1.2 23.0 7.0 6.5 6.0
闹垂体 2.4 2.9 8.1 5.4 10.4 9.9
肌肉 41.5 165.9 132.3 288.7 263.0 92.2
骨 18.2 43.4 22.0 44.0 35.5 29.7

[0127]

[0128] 177Lu-标记的30号肽在注射5μCi进入携带HEK-sst2肿瘤的裸小鼠之后显示下述生物分布(表9)，每个样品组四只小鼠。

[0129] 表9.

[0130]器官 4h 24h 72h
肿瘤：血液 95.82 2380.57 2679.44
肿瘤：心脏 29.24 217.19 129.21
肿瘤：肝 6.60 16.81 13.57
肿瘤：脾 15.47 21.01 20.61
肿瘤：肺 5.37 94.69 29.51
肿瘤：肾 3.04 4.83 3.13
肿瘤：胃 0.48 0.89 0.90
肿瘤：肠 7.27 20.27 6.74
肿瘤：肾上腺 1.26 10.00 2.50
肿瘤：胰腺 0.39 0.62 0.84
肿瘤：闹垂体 1.70 9.09 4.08
肿瘤：肌肉 148.53 332.56 750.80
肿瘤：骨 11.04 35.08 82.58
111

[0131] In-标记的31号肽在注射5μCi进入携带HEK-sst2肿瘤的裸小鼠之后显示下述生物分布(表10)，每个样品组四只小鼠。

[0132] 表10.

[0133]

[0134]111

[0135] 相同方案下，In-标记的3号肽显示表11的分布。

[0136] 表11.

[0137]

[0138] 本发明肽不仅提供对结合SSTR2更具选择性配体，而且使用标记的肽(例如28号肽的放射性标记形式)促进对更有效拮抗剂的药物筛选。

[0139] 实施例10.

[0140] 起始材料。容量为0.3-0.4mequiv/g的MBHA树脂用于固相合成。所有具有侧链保护的Boc-N-保护的氨基酸：Cys(Mob)、Lys(ε-2Cl-Z)、Lys(Fmoc)、Thr(Bzl)、Tyr(2Br-Z)和ITyr(3Br-Bzl)可商业途径获得(Bachem Inc.，Torrance，CA；Chem Impex，Wood Dale，IL；Reanal，Budapest，Hungary)，除了Boc-Aph(Cbm)-OH、Boc-DAph(Cbm)-OH、Boc-Aph(Cbm-OCH3)-OH、Boc-Aph(Cbm-OH)-OH、Boc-Aph(Hor)-OH、Fmoc-D/L-Agl(NMe，Boc)-OH(Jiang，G. 等，Prot.Pep.Lett.，3：219-224，1996)Fmoc-D-Agl(Boc)-OH(Sypniewski，M. 等，J.Org.Chem.，65：6595-6600，2000)Boc-5F-Trp-OH，Boc-5F-DTrp-OH在实验室合成。1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，
10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺)酯3CH3COOH.HPF6(DOTA-NHS)购自Macrocyclics Inc.(Dallas，TX，USA)。所有试剂和溶剂是ACS级并且不需进一步纯化而使用。

[0141] 肽合成。肽通过固相方法人工或在CS-Bio肽合成仪CS536型上合成。基于最初树脂取代的3当量过量的Boc-氨基酸(1.2mmol)用于每次偶联。肽偶联通过DIC/HOBt(1.2mmol/1.8mmol)在二甲基甲酰胺(DMF)中介导1小时并通过定量水合茚三酮测试监测(Kaiser，E.等，Anal.Biochem.，34：595-598，1970)。使用三氟乙酸(TFA)(60％于CH2Cl2中，1-2％乙二醇或间甲酚)实现Boc去除20分钟。TFA处理后异丙醇(1％间甲酚)洗涤，然后用三乙胺(TEA)溶液(10％于CH2Cl2)、甲醇、三乙胺溶液、甲醇和CH2Cl2连续洗涤完成中和顺序。13的N末端的脲基(Cbm)被引入树脂上。中和后，完全组装肽的N末端Boc基团用TFA去保护，使用N-甲基吡咯烷酮(NMP)(4mL)中的NaOCN(100mg，0.65mmol)和冰醋酸3mL/克初始树脂进行甲氨酰化。混合物在室温搅拌30分钟，水合茚三酮测试表明完全反应。然后通过含有清除剂茴香醚(10％v/v)和二甲硫(5％v/v)的HF使完整的肽在0℃去保护并从树脂裂解60分钟。二乙醚沉淀的粗肽通过添加碘(在甲醇中的10％溶液)直至出现稳定的橙色而在75％乙酸(200mL)中环化。四十分钟后，添加抗坏血酸以猝灭过量的碘。

[0142] 为了合成9，使用了未拆分的Fmoc-D/L-Agl(NMe，Boc)-OH，并且两种异构体在标准HPLC纯化步骤中容易被分离(Miller，C和Rivier，J.，Biopolymers，40：265-317，1996)。通过与作为已知旋光构型的异构体单独合成的类似物比较HPLC洗脱行为来试验性地推断两种异构体的旋光构型。总之：在位置7偶联Fmoc-DAgl(Boc)-OH之后，侧链保护性Boc基团用60％TFA去除、洗涤、中和并至在二氯甲烷中膨胀的0.9g肽树脂(0.36mmol/g)，与DIEPA(500μL)一起添加Dod-Cl(130mg；0.5mmol)。混合物振摇一小时以完成烷基化。
洗涤树脂并在添加NMP(18mL)中甲酰胺(2mL，37％溶液)和乙酸(100μL)后振摇。5分钟后，添加氰基硼氢化钠(300mg)，振摇混合物60分钟。使用TFA(60％)去除Dod基团30分钟后，使用苯甲酰氯(500μL)酰化侧链的游离仲氨基(Kaljuste K.和Undén，A.，Int.J.Pept.Prot.Res.，42：118-124，1993)。用NMP中20％哌啶以两个连续的5分钟和15分α
钟处理去除N -Fmoc保护基之后，进行标准的延伸方案，直至肽完整。肽被切割、去保护和环化。在HPLC上，该D构型异构体与之前从使用未拆分氨基酸进行的合成洗脱的异构体共
7
洗脱，因此，较慢洗脱的肽(9)被试验性地鉴定为含有类似物的L-Agl(NMe，苯甲酰基)。

[0143] 一般而言，为了合成DOTA-肽-缀合物，Lys9的侧链用Fmoc保护基保护，该保护9
基在HF裂解后保留。向无水DMF(800μL)中的RP-HPLC纯化的[Lys(Fmoc)]sst2-拮抗剂(～20μM)添加在DMF(160μL)中的DOTA-NHS-酯(38mg，48μM)和N，N′-二异丙基乙胺(DIPEA)(40μL，24μM)。混合物在室温搅拌5小时。通过分析型HPLC跟踪反应进程。
9
反应完全后，进行制备型RP-HPLC纯化，产生纯的DOTA-[Lys(Fmoc)]-sst2-拮抗剂。使用
20％哌啶/DMF溶液实现从Lys侧链去除Fmoc保护基，得到DOTA-sst2-拮抗剂，其进一步通过制备型RP-HPLC纯化。

[0144] 肽的纯化。通过制备型RP-HPLC在实验室填充有反相300 Vydac C18二氧化硅(15-20μm粒度)的5×30cm柱上纯化粗的冷冻干燥的肽。使用从基线％B以1％B/3min增加的线性梯度以100mL/min的流速洗脱肽(洗脱剂A＝0.25 N TEAP pH 2.25，洗脱剂B＝60％CH3CN，40％A)。所有肽经受第二次纯化步骤，使用洗脱剂A＝水中0.1％TFA和B＝60％CH3CN/40％A在相同柱上进行，使用从基线％B以1％B/min增加的线性梯度。纯化的分析型HPLC筛选在Vydac C18柱(0.46×25cm，5μm粒度，300 孔径)上进行，所述柱连接至Rheodyne注射器、两个Waters 泵501型、系统控制程序、Kratos 750UV检测器和Houston Instruments D-5000长条纸记录器。含有产物的级分被收集并经受冻干。

[0145] SRIF类似物的鉴定(FIG.4)。最终肽的纯度通过分析型RP-HPLC测定，分析型RP-HPLC使用0.1M TEAP pH 2.5作为洗脱剂A和60％CH3CN/40％A作为洗脱剂B的线性梯度在Hewlett-Packard Series II 1090液相色谱仪上进行，所述液相色谱仪连接至Vydac C18柱(0.21×15cm，5μm粒度，300 孔径)、362型控制器和Think喷墨打印机。进行毛细管区带电泳(CZE)分析。通过HPLC和CZE发现每个肽具有＞95％的纯度。在ABI-Perseptive DE-STR仪器上测量质谱(MALDI-MS)。仪器采用重复率为20Hz的氮激光(337nm)。应用的加速电压为20kV。在延迟的提取模式记录谱图(300ns延迟)。所有谱图以正反射模式记录。谱图是100次激光发射的总和。基质α-氰基-4-羟基肉桂酸制备为在0.3％三氟乙+ +酸和50％乙腈中的饱和溶液。每个肽观察到的单同位素(M+H) 值与计算的(M+H) 值相应。

[0146] 试剂。所有试剂是可用的最好等级并且购自普通供应商。[Tyr3]-奥曲肽(Reubi，J.，Neurosci.Lett.，49：259-26，1984)来自Novartis Inc.(Basel，Switzerland)。所有其他肽，包括Coy-14(Rajeswaran，W.等，J.Med.Chem.，44：1305-1311，2001)在Salk Institute合成。sst2A受体的R2-88抗体如前所述产生并且已经被广泛表征(Gu，Y.和Schonbrunn，A.，Mol.Endocrinol.，11：527-537，1997)。第二抗体Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG(H+L)来自Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)，单克隆抗-T7抗体来自Novagen(Madison，WI)，山羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶缀合物来自Bio-Rad Laboratories，Inc.(Hercules，OR)；Fluo-4NW钙分析试剂盒来自Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)，辣根过氧化物酶的底物混合物(ABTS)来自Bio-Rad Laboratories，Inc.(Hercules，OR)，乳白蛋白水解物来自HyClone(Logan，UT)。

[0147] 细胞系。稳定表达克隆的五种人ssts的CHO-K1，CCL39细胞和表达T7-表位标签人sst2A受体(HEK-sst2)的HEK293细胞系如本发明之前所述培养。所有培养试剂来自Gibco BRL，Life Technologies，(Grand Island，NY)。

[0148] 受体放射自显影。细胞膜沉淀如前所述制备，并储存在-80℃。对固定在显微镜载玻片上的膜沉淀的20μm厚冷冻(Microm HM 500，Walldorf，Germany)切片进行放射自显影，然后储存在-20℃。对于测试化合物的每一个，使用15,000cpm/100μL和8 22 125
范围0.1-1000nM的浓度递增的未标记肽，使用通用SRIF放射性配体[Leu，D-Trp ，
25 125
I-Tyr ]-SRIF-28( I-[LTT]-SRIF-28)(2,000Ci/mmol；Anawa，Wangen，Switzerland)进行完全替代实验。作为对照，未标记的SRIF-28使用相同递增浓度平行进行。切片
125
与 I-[LTT]-SRIF-28在含有1％BSA、40mg/L杆菌肽和10mmol/L MgCl2的170mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)中室温下孵育2小时以抑制内源性蛋白酶。孵育的切片在含有
0.25％BSA的冷170mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)中洗涤两次。在短暂浸入蒸馏水以除去过量盐之后，切片被快速干燥并暴露于Kodak BioMax MR胶片一周。使用计算机辅助图像处理系统量化数据后计算IC50值。含有已知量的同位素、对组织等价配体浓度交叉校准的组
125
织标准品(放射自显影的[ I]微量表，GE Healthcare；Little Chalfont，UK)用于量化(Reubi，J.，J.Nucl.Med.，36：1846-1853，1995)。

[0149] 基于免疫荧光的sst2内化分析。使用sst2特异性抗体R2-88，使用HEK-sst2对sst2进行基于免疫荧光显微镜的内化分析。HEK-sst2细胞用单独的媒介物、浓度为100nM的3 3
激动剂[Tyr]-奥曲肽、浓度为100nM的[Tyr]-奥曲肽在过量的待测试SRIF类似物(浓
3
度是[Tyr]-奥曲肽的100倍)存在下处理，或者用浓度为10μM的待测试SRIF类似物单独处理，然后处理用于免疫荧光显微术。

[0150] sst2内化的定量分析(ELISA)。使用定量细胞表面上T7-表位-标签人sst2的ELISA来测定受体内化。HEK-sst2细胞接种在聚D-赖氨酸涂覆的24-孔板(250,000细胞/孔)的培养基中，并在37℃和5％CO2下培养一天。在分析当天，细胞与稀释1∶3000的单克隆抗-T7抗体在含有5g/L乳白蛋白水解酶+20mM HEPES，pH 7.4(DMEM-LH)的DMEM中室温下孵育2小时以标记细胞表面受体。用DMEM-LH洗涤以除去未结合抗体之后，细胞在37℃和5％CO2下孵育30分钟，在所示浓度下添加或不添加配体。通过将板置于冰浴中而终止孵育。然后用冷PBS洗涤细胞两次并在室温下用PBS(pH 7.4)中3％低聚甲醛固定10分钟。通过在室温下与含有1％牛血清白蛋白(BSA；级分V；SERVA，Heidelberg，Germany)的PBS孵育细胞60分钟来封闭非特异性结合位点。然后将细胞在室温下与山羊抗鼠辣根过氧化物酶缀合物在含有1％BSA的PBS中孵育60分钟。用PBS再次洗涤三次之后，通过添加0.3mL的辣根过氧化物酶的底物混合物(ABTS)来测量抗体结合。在室温下大约30min孵育之后测量OD405。配体处理之后保留在细胞表面的sst2的量计算为处理细胞中测量的吸光度，表示为未处理细胞中吸光度的百分比。非特异性吸光度在其中HEK293-sst2细胞无抗-T7抗体孵育的实验中测定。

[0151] 每个数据点代表二次重复进行的三个实验的平均值±SEM。

[0152] 钙释放分析。细胞内钙释放在HEK-sst2中测量，使用之前所述的Fluo-4NW钙分析试剂盒(Magrys，A.等，J.Clin.Immunol.，27：181-192，2007；Michel，N.等，Mol.Biol.Cell.，17：3578-3590，2006)。简言之，HEK-sst2细胞被接种(25,000细胞/孔)于聚D-赖氨酸(20μg/mL)涂覆的96孔板中病在37℃和5％CO2下培养基中培养一天。在实验当天，细胞用含有2.5mM丙磺舒的分析缓冲液(1×HBSS，20mM HEPES)洗涤，然后在37℃和5％CO2下用在含有2.5mM丙磺舒的分析缓冲液中的100μL/孔的Fluo-4NW染料加载30分钟，然后再室温下进一步加载30分钟。为了测量用待测试的SRIF类似物刺激后细胞内钙动员，e染料加载的细胞转移至SpectraMax M2(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)。在室温下动力学记录细胞内钙动员60s，监测在所示浓度类似物存在下520nm(λex＝485nm)处的荧光发射。在添加25μM离子霉素后测量最大荧光(Fmax)。对染料加载的未处理细胞进行基线(对照)测量。数据显示为Fmax的百分比(％Fmax)。所有实验一式三份重复至少三次。

[0153] 图4所示所有类似物通过人工或在MBHA树脂上自动合成，使用Boc-策略，而异丙基碳二亚胺(DIC)/HOBt(1-羟基苯并三唑)用于酰胺键形成，三氟乙酸(TFA)用于Boc去除。肽树脂在清除剂存在下用氟化氢(HF)处理以解放完全去保护的粗线性肽。半胱氨酸环9
化通过在酸性环境下的碘介导。纯化使用多HPLC步骤进行。DOTA偶联至溶液中Lys(Fmoc)保护的类似物。肽纯度通过HPLC、毛细管区带电泳和质谱鉴定。观察到的每个肽的单同位素质量(M+H)+值对应于计算的质量(M)值。

[0154] 为了考察其ssts结合性质，测试了肽结合表达五种人ssts的细胞的膜沉淀的冷8 22
冻切片的能力(图5)。对于每个测试化合物，使用通用SRIF放射性配体[Leu，DTrp ，
125 25
I-Tyr ]SRIF-28进行完整替换实验，使用范围0.1-1000nM的递增浓度的未标记的肽。未标记的SRIF-28使用相同递增浓度平行进行，作为对照。

[0155] 据报道，在奥曲肽支架(H-DPhe2-c[Cys3-Phe7-DTrp8-Lys9-Thr10-Cys14]-Thr15-ol，SRIF编号)中位置3和位置3的手型反转是使SRIF激动剂转化为拮抗剂的关键结构修饰。其他取代导致部分选择性的拮抗剂乙酰基-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2或H-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2。这些拮抗剂表现为对sst2的优先高度结合亲和力，并且对sst3、sst4和sst5较低或没有亲和力。没有一个类似物结合sst1。使用这些前导化合物，设计了比目前报道的那些对sst2更具亲和力(＞3倍)和更具选择性的SRIF拮抗剂(Bass，R.等，Mol.Pharmacol.，50：709-715，1996；Hocart，S.等，J.Med.Chem.，42：1863-1871，1999)。

[0156] 合成了拮抗剂的类似物，如乙酰基-pNO2Phe2-c[DCys3-Tyr7-DTrp8-Lys9-Thr10-Cys14 15 2 3 7 8 9 10 14 15
]-DTyr -NH2(1)和H-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr -Cys ]-2Nal -NH2(7)，以考察不同取代对结合亲和力、受体亚型选择性、总体亲水性和激动和拮抗作用的影响。

[0157] 1中DOTA对N末端乙酰基的取代(IC50＝3.6nM，sst2)得到2，其以IC50＝1.5nM111 90 177
结合至sst2，表明对于用 In、Y或 Lu放射性标记以体外靶向而言关键的DOTA部分被sst2良好耐受(图5)。

[0158] 在2中引入DAph(Cbm)8替代DTrp8，产生3(IC50＝0.75nM)。值得注意的是，这两种取代是累加的，因此产生该系列中最有效的sst2拮抗剂，对其他受体的任何一个不具有15 15
可测量的结合亲和力。3中DTyr 被2Nal 进一步替代，产生对sst2具有类似结合亲和力的5(IC50＝1.3nM)。类似物4是与5具有相同序列但在其N末端没有DOTA的肽，依然具有对sst2优良的结合亲和力(IC50＝2.6nM)，并且还可测量地结合sst3(IC50＝384nM)。位置7中Tyr被Aph(Hor)取代得到6，与母体4比较，对sst2结合亲和力和选择性没有影响(分别地，在sst2时IC50＝2.6和2.7Nm；在sst3时IC50＝384nM和451nM；并且在其他三个受体没有结合亲和力)(图5)。

[0159] H-Cpa2-c[DCys3-Tyr7-DTrp8-Lys9-Thrl0-Cys14]-2Nall5-NH2(7)还用作sst2-选择性拮抗剂的第二前导化合物。该拮抗剂在结合分析中的IC50值等于：在sst2/3/5分别为5.7、112和218nM，与26、93和48nM的受体值相比较。在分析中，7在sst2比报道的效力大5倍，而在sst2比报道效力小5倍。

[0160] 而7中Lys9的Nα-甲基化产生8，在sst2的结合亲和力增加5倍(分别地，Ki＝26nM和5.51nM)，在sst3或sst5(Ki＝约50-100nM)没有提高，这里显示在sst2没有此类提高的结果不支持该发现，并且因此，在其他sst2-选择性类似物的设计中未使用该取代。取
7
而代之的是，使用L-Agl(NMe，苯甲酰基) 合成9，试图限制位置7的侧链的取向。在设计sst3-选择性拮抗剂中利用了此类氨基甘氨酸衍生物(发生)的使用。而9与7相比，损失了对sst2的一些结合亲和力(3-倍)，它还损失了对st3和sst5相当的结合亲和力。这一发现进一步表明，位置7对于所有三个sst2，3，5是关键的。事实上，具有D-Agl(NMe，苯甲酰
7
基) 的10在sst2损失了结合亲和力，同时保留了与7类似的在sst3/4/5的结合亲和力，因此实现了鉴定负责结合任何特定受体(本例中为sst2)的残基/构型的目标之一。

[0161] 而在7中Phe被Leu取代产生11，11损失了10倍对sst2的结合亲和力和选择性，被Aph(Cbm)取代产生12，12表现出与7在五种ssts类似的结合亲和力和选择性。12的N末端甲氨酰化产生12，与12相比略微提高了在sst3/4的结合亲和力，并损失了一定的对sst2的结合亲和力。添加DOTA至12产生14，其sst2结合亲和力类似于12并且提高了对sst2的选择性。有趣的是，在14中DOTA和八肽之间加入间隔物(例如15中的βAla和16中的Peg)意想不到地不利于sst2结合亲和力，但有利于sstB3结合亲和力并且对sst1/4/5无影响(Chen，X.等，J.Nucl.Med.，45：1776-1783，2004；Antunes，P.等，Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging，34：982-983，2007)。

[0162] 根据2Nal15可以有助于sst3、sst4和sst5结合袋的发现，17(失去该残基)被合15
成并在与母体12比较时具有类似的结合亲和力。12中2Nal 被不同的其他残基取代(例如，18中的Cha、19中的Aph(Hor)、20中的DAph(Cbm)和21中的Aph(Cbm))不显著影响在sst2的亲和力或选择性。值得注意的是，20(D-构型且IC50＝5.4nM)和21(L-构型且IC50＝15nM)之间在sst2的结合亲和力仅相差3倍，其中C末端氨基酸分别具有D构型或L构型。这支持了之前DTyr(如1和2中)或2Nal(如4和5中)都被等同接受的发现。另一方面，20的序列被如22中的甘氨酸-OH延伸导致在所有受体的亲和力显著损失。

[0163] 为了调节7的总体亲水性(位置7的Tyr)，在位置7引入了下述氨基甲酸酯7 7 7
(Aph(Cbm))12、(Aph(CONH-OCH3))23和(Aph(CONH-OH))24。而这些类似物的结合亲和力不同于母体7的结合亲和力，这些类似物在中性pH的HPLC的洗脱顺序表明，24(RT＝
31.6min)可以比7(RT＝34.8min)、12(RT＝31.9min)和23(RT＝34.2min)更具有亲水性。因为亲水性可能是临床相关放射性配体的关键标准，当选择临床候选物时，结构上的细微差别可能帮助这些类似物中的一个。12、23和24在sst2结合亲和力和选择性方面不优于7的事实支持了残基7不是sst2药效团的必要促进因素的发现。

[0164] 然后考察了位置8的取代效应。可能5F-Trp是Trp8的有利的取代(Meyers，C.等，Biochemistry，17：2326-2330，1978)。当被引入12而产生25和26时，观察到对三种sst2/3/5的结合亲和力的略微提高，这是含有5F-DTrp的25所预期的，但对相应的含有L-异构体的26不是。然而，对任一类似物没有观察到选择性的提高。

[0165] 有利的是发现7中DTrp8被DAph(Cbm)8取代产生27在sst2选择性以及提高的结合亲和力方面明显优势。在N末端添加DOTA的进一步衍生化产生28，额外增加对sst2的结合亲和力并在所有其他受体高于500倍的选择性。

[0166] 27和28中用Aph(Hor)取代Tyr7产生29和30。而29保留了在sst2的高结合亲和力，它还表现出中等的对sst3的结合亲和力；在sst3的结合亲和力在引入DOTA(30)后损7
失。2中用ITyr取代Tyr 产生32，其结合亲和力类似于2在sst2的结合亲和力。

[0167] 然后30中的2Nal15被DTyr15取代产生31。该实施例中提出的类似物中，31(因为其亲水性，RT＝13.2min)可能就生物分布和最终临床考察而言是超过结合分析中等同有效和选择性的3(RT＝13.6min)、5(RT＝26.1min)、28(RT＝26.7min)、
29(RT＝27.7min)或32(RT＝25.0min)的优选候选物。值得注意的是，29-31中
发现的二肽序列-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-与degarelix(Fe-200486)中发现的相同，degarelix(Fe-200486)是一种促性腺激素释放激素拮抗剂，其中它在稳定翻转和延长作用持续时间方面起重要作用。

[0168] 相比较而言，本实施例中提出的最亲和的含有DOTA的拮抗剂(3和31)具有比SRIF-28大3至4倍的结合亲和力，而对其他四种ssts的任何一个没有可检测的结合亲和力，因此是临床应用中潜在的候选物。

[0169] 本实施例中测试的所有类似物在稳定表达人sst2的HEK293细胞中的钙释放分析3
中是拮抗剂。单独测试它们，它们在达10μM时不影响钙释放。然而，sst2激动剂[Tyr]-奥曲肽的激动效应可以被单独施加的100倍过量的每个类似物竞争性拮抗。图1使用钙释放分析示例说明一些sst2拮抗剂的拮抗性质。

[0170] 类似物3、31和32的拮抗性质还在基于荧光的内化分析中证实(Cescato，R.等，J.Nucl.Med.，47：502-511，2006)，使用稳定表达sst2的HEK293细胞。图2示例说明，尽管3
对照激动剂[Tyr]-奥曲肽可诱导sst2内化，但测试的sst2-选择性拮抗剂即使在10μM的
3
浓度单独给予时没有效应。而且，它们防止了由[Tyr]-奥曲肽诱导的sst2内化。图3显示在ELISA内化分析中另一种类似物(32)的拮抗性质。

[0171] 总结，本实施例中报道的类似物的大部分在纳摩尔范围对sst2具有高亲和结合力，并且通常对sst2具有高选择性。最佳的化合物是3和31(IC50值低于1nM)，随后是32、5、28、2和29。所有这些拮抗剂是特别令人感兴趣的，因为它们都包括DOTA部分，使它们成为体内肿瘤靶向的候选物。

[0172] 本实施例中具体类似物的参考如下：

[0173] (1)Ac-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；

[0174] (2)DOTA-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；

[0175] (3)DOTA-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；

[0176] (4)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0177] (5)DOTA-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0178] (6)H2N-pNO2Phe-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0179] (7)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0180] (8)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0181] (9)H2N-Cpa-c[DCys-L-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0182] (10)H2N-Cpa-c[DCys-D-Agl(NMe.苯甲酰基)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0183] (11)H2N-Cpa-c[DCys-Leu-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0184] (12)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0185] (13)Cbm-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0186] (14)DOTA-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0187] (15)DOTA-βAla-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0188] (16)DOTA-Peg-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0189] (17)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-NH2；

[0190] (18)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Cha-NH2；

[0191] (19)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Hor)-NH2

[0192] (20)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-NH2

[0193] (21)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-Aph(Cbm)-NH2；

[0194] (22)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DAph(Cbm)-GlyOH；

[0195] (23)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OCH3)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0196] (24)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(CONH-OH)-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2

[0197] (25)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0198] (26)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Cbm)-5F-Trp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0199] (27)H2N-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0200] (28)DOTA-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0201] (29)H2N-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0202] (30)DOTA-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2；

[0203] (31)DOTA-Cpa-c[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2；和[0204] (32)DOTA-pNO2Phe-c[DCys-ITyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2。

[0205] 实施例11.

[0206] 其他肽类似物被合成并用于确定它们在不同时间点在HEKsst2中的生物分布的分析中。吸收数据显示于图6A和B。

[0207] 类似物命名如下：

[0208] JR11：DOTA-Cpa-[DCys-Aph(Hor)-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]DTyr-NH2

[0209] LM3：DOTA-Cpa-[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]DTyr-NH2

[0210] LM4：DOTA-Cpa-[DCys-Pal-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]DTyr-NH2

[0211] 表12.

[0212]

[0213]
24h
JR11 0.7±0.12 11.5±0.5 23±2.4 6.29 -2.5
LM3 0.45±0.06 22.5±2.4 24.4±1.7 5.72 -2.14
LM4 0.5±0.2 13.2±0.9 -2.26

[0214] 根据本公开内容，本发明公开和要求保护的所有组合物和方法可以被制备并执行而无过度实验。虽然已经就优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员明显的是，可以对组合物和/或方法以及本发明所述方法的步骤或步骤顺序做出改变，而不背离本发明的构思、精神和范围。更具体说，明显的是，化学或生理学上相关的某些物质可以替代本发明描述的物质，同时获得相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有此类相似的替代和调整被认为在本发明的精神、范围和构思中。

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