寡核苷酸探针及其用途
阅读：486发布：2021-10-08
专利汇可以提供寡核苷酸探针及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了关于结合靶 生物 标志物以及允许表征表型的寡核苷酸的方法和组合物。所述靶标生物标志物可包括微囊泡 抗原 ，包括衍生自不同 疾病 的微囊泡。所述表征可包含疾病或病症的检测、诊断、 预后 、 治疗 诊断或其他表征。，下面是寡核苷酸探针及其用途专利的具体信息内容。
1·一种寡核苷酸，其与SEQIDN0·10558至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源。
2. 多个寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、 600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、 30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、 序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部分与SEQ ID勵.10558至少50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源。
3. 多个寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、 600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、 30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000或500000 个不同的寡核苷酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部分与选自SEQ ID NO. 10559-510558 的序列至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99% 或 100% 同源。
4. 一种寡核苷酸探针文库，其包含SEQ ID NO. 10559-510558列出的寡核苷酸中的至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 或至少 99%。
5. -种寡核苷酸，其包含与选自SEQ ID NO. 510559-510578的序列至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源的核酸 序列或其部分。
6. 多个寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20个不同的寡核苷酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部分与SEQ ID NO.510559-510578 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%同源。
7. -种寡核苷酸，其包含与选自SEQ ID NO. 510579-510598的序列至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源的核酸 序列或其部分。
8. 多个寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20个不同的寡核苷酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部分与SEQ ID NO.510579-510598 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%同源。
9. 一种寡核苷酸，其包含与选自SEQ ID NO. 510599-510763的序列至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源的核酸 序列或其部分。
10. 多个寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、 160或165个不同的寡核苷酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部分与SEQ ID 勵.510599-510763至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99% 或 100% 同源。
11. 多个寡核苷酸，其包含至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、 160或165个不同的寡核苷酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部分与表16中的一行中的 SEQ ID NO.至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99% 或 100% 同源。
12. 根据权利要求1-12中任一项所述的寡核苷酸或多个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸 或多个寡核苷酸包含至少一个选自DNA、RNA、非天然存在的核苷酸、缺失、插入、添加和化学 修饰的功能修饰。
13. -种方法，其包括使寡核苷酸或多个寡核苷酸与样品接触，并且检测所述寡核苷酸 或多个寡核苷酸与样品中的靶标结合的存在或水平，其中任选地所述寡核苷酸或多个寡核 苷酸为根据权利要求1-12中任一项所述。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述样品包含生物样品、有机样品、无机样品、组 织、细胞培养物、体液、血液、血清、细胞、微囊泡、蛋白质复合物、脂质复合物、碳水化合物， 或其任意组合、部分或变化形式。
15. 根据权利要求13所述的方法，其中所述靶标包含细胞、细胞器、蛋白质复合物、脂蛋 白、碳水化合物、微囊泡、膜片段、小分子、重金属、毒素或药物。
16. -种方法，其包括： (a) 使包含微囊泡的生物样品与寡核苷酸探针文库接触，其中任选地该寡核苷酸探针 文库包含根据权利要求1-12中任一项所述的寡核苷酸或多个寡核苷酸； (b) 鉴定与所述微囊泡的至少一部分结合的寡核苷酸；以及 (c) 基于鉴定出的寡核苷酸谱来表征所述样品。
17. -种方法，其包括： (a) 使样品与包含至少 少1018个不同寡核苷酸序列的寡核苷酸的寡核苷酸探针文库接触以在溶液中形成混合物， 其中所述寡核苷酸能够结合样品中的多个实体从而形成复合物，其中任选地所述寡核苷酸 探针文库包含根据权利要求1-12中任一项所述的寡核苷酸或多个寡核苷酸； (b) 将在步骤(a)中由混合物形成的复合物进行分区；以及 (c) 检测在步骤(b)中分区的复合物中存在的寡核苷酸，以对所述样品鉴定寡核苷酸 谱。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述检测步骤包括对所述复合物中的全部或部 分寡核苷酸进行测序，对所述复合物中的全部或部分寡核苷酸进行扩增，和/或使所述复合 物中的全部或部分寡核苷酸与阵列杂交。
19. 一种生成富集的寡核苷酸探针文库的方法，其包括： (a) 使第一寡核苷酸文库与生物测试样品和生物对照样品接触，其中在生物样品中存 在的生物实体与所述第一寡核苷酸文库中存在的多个寡核苷酸之间形成复合物； (b) 将在步骤(a)中形成的复合物进行分区，并分离所述复合物中的寡核苷酸，以对所 述生物测试样品和生物对照样品中的每一个产生寡核苷酸的子集； (c) 使步骤(b)中的所述寡核苷酸的子集与所述生物测试样品和生物对照样品接触，其 中在生物样品中存在的生物实体与所述寡核苷酸的子集中存在的第二多个寡核苷酸之间 形成复合物，从而生成寡核苷酸的第二子集群组；以及 (d)任选地重复步骤b)-C)-次、两次、三次或更多次，以产生寡核苷酸的各自第三、第 四、第五或更多子集群组，从而产生富集的寡核苷酸探针文库。
20. 多个寡核苷酸，其包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、 600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、 30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000或500000 个不同的寡核苷酸序列，其中所述多个寡核苷酸由根据权利要求19所述的方法产生，其中 所述文库能够区分第一表型与第二表型。
21. 根据权利要求20所述的多个寡核苷酸，其中所述第一表型包含疾病或病症，且所述 第二表型包含健康状态;或者其中所述第一表型包含疾病或病症，且所述第二表型包含不 同的疾病或病症;或者其中所述第一表型包含疾病或病症的阶段或进展，且所述第二表型 包含相同疾病或病症的不同阶段或进展;或者其中所述第一表型包含对疗法的正面响应， 且所述第二表型包含对相同疗法的负面响应。
22. -种表征疾病或病症的方法，其包括： (a) 使生物测试样品与根据权利要求1-12中任一项所述的寡核苷酸或多个寡核苷酸接 触； (b) 检测在步骤(a)中、在根据权利要求1-12中任一项所述的寡核苷酸或多个寡核苷酸 与生物测试样品中的靶标之间形成的复合物的存在或水平；以及 (c) 将步骤(b)中检测到的存在或水平与来自生物对照样品的参考水平进行比较，从而 表征所述疾病或病症。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述检测步骤包括对所述复合物中的全部或部 分寡核苷酸进行测序，对所述复合物中的全部或部分寡核苷酸进行扩增，和/或使所述复合 物中的全部或部分寡核苷酸与阵列杂交。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述测序包括高通量测序。
25. 根据权利要求19或权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述生物测试样品和 生物对照样品各自包含组织样品、细胞培养物或生物流体。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述生物流体包含体液。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述体液包含外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑 脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺 液、考珀液或射精前液、女性射出液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包 液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便 水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或脐带血。
28. 根据权利要求26所述的方法，其中所述体液包含血液、血清或血浆。
29. 根据权利要求25所述的方法，其中所述生物流体包含微囊泡。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述复合物在所述寡核苷酸或多个寡核苷酸与 至少一个所述微囊泡之间形成。
31. 根据权利要求19或权利要求22-30中任一项所述的方法，其中所述生物测试样品和 生物对照样品包含分离的微囊泡，其中任选地所述微囊泡使用下述中的至少一种来分离： 色谱法、过滤、超滤、离心、超速离心、流式细胞术、亲和捕获(例如，捕获到平面、柱子或珠子 上）、聚合物沉淀和使用微流体。
32. 根据权利要求22-31中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸或多个寡核苷酸与多 肽或其片段结合。
33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述多肽或其片段是可溶的或膜结合的，其中任 选地所述膜包含微囊泡膜。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述多肽或其片段包含表3或表4中的生物标志 物。
35. 根据权利要求22-34中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸或多个寡核苷酸与所 述生物样品中的微囊泡表面抗原结合。
36. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括乳腺癌、阿尔 茨海默病、支气管哮喘、膀胱移行细胞癌、巨细胞破成骨细胞瘤、脑瘤、结直肠腺癌、慢性阻 塞性肺疾病(COPD)、宫颈鳞状细胞癌、急性心肌梗死(AMI)/急性心力衰竭、克罗恩病、II型 糖尿病、食管癌、喉部鳞状细胞癌、骨髓的急性和慢性白血病、肺癌、恶性淋巴瘤、多发性硬 化、卵巢癌、帕金森病、前列腺腺癌、牛皮癣、类风湿性关节炎、肾细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、 胃腺癌、甲状腺癌、睾丸癌、溃疡性结肠炎或子宫腺癌。
37. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括癌症、恶变前 状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或病症、心血管疾病或病症、神经疾病或病症、 感染性疾病或疼痛。
38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述癌症包括急性淋巴母细胞性白血病;急性髓 样白血病；肾上腺皮质癌;AIDS相关癌症;AIDS相关淋巴瘤;肛门癌；阑尾癌;星形细胞瘤;非 典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤;基底细胞癌;膀胱癌;脑干胶质瘤;脑瘤(包括脑干胶质瘤、中枢 神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、室管 膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经 外胚瘤和松果体母细胞瘤）；乳腺癌;支气管肿瘤;伯基特淋巴瘤;原发部位不明癌;类癌瘤； 原发部位不明肿瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎瘤；宫 颈癌;儿童期癌症;脊索瘤;慢性淋巴细胞白血病;慢性髓性白血病;慢性骨髓增殖性病症； 结肠癌;结直肠癌;颅咽管瘤;皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤;子宫内膜癌;室管膜母 细胞瘤;室管膜瘤;食管癌;成感觉神经细胞瘤;尤因肉瘤;颅外生殖细胞瘤;性腺外生殖细 胞瘤;肝外胆管癌;胆囊癌；胃（胃部)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤 (GIST);妊娠滋养细胞瘤;神经胶质瘤;毛细胞白血病;头颈癌;心脏癌;霍奇金淋巴瘤;下咽 癌;眼内黑色素瘤;胰岛细胞瘤;卡波西肉瘤;肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症;喉癌;唇 癌；肝癌；肺癌；恶性纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤;髓上皮瘤；黑色素瘤;梅克尔细胞 癌;梅克尔细胞皮肤癌；间皮瘤;隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌;多发性内分泌肿瘤 综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤;蕈样肉芽肿;骨髓增生异常综合征;骨 髓增生性肿瘤;鼻腔癌;鼻咽癌；神经母细胞瘤;非霍奇金淋巴瘤;非黑色素瘤皮肤癌;非小 细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌;骨肉瘤;其它脑和脊髓肿瘤;卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生 殖细胞瘤;卵巢低恶性潜在肿瘤;胰腺癌;乳头状瘤病;副鼻窦癌；甲状旁腺癌;盆腔癌；阴茎 癌；咽癌；中度分化的松果体实质肿瘤;松果体母细胞瘤;垂体瘤;浆细胞肿瘤/多发性骨髓 瘤;胸膜肺母细胞瘤;原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤;原发性肝细胞性肝癌;前列腺癌； 直肠癌;肾癌;肾细胞(肾)癌;肾细胞癌;呼吸道癌;视网膜母细胞瘤;横纹肌肉瘤;唾液腺癌 症;塞扎里综合征;小细胞肺癌;小肠癌;软组织肉瘤;鳞状细胞癌;鳞状颈癌；胃部（胃）癌； 幕上原始神经外胚瘤;T细胞淋巴瘤;睾丸癌；咽喉癌;胸腺癌;胸腺瘤；甲状腺癌;移行细胞 癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌;滋养细胞瘤;输尿管癌;尿道癌;子宫癌;子宫肉瘤；阴道 癌;外阴癌;瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或维尔姆斯瘤。
39. 根据权利要求37所述的方法，其中所述恶变前状况包括巴雷特食管。
40. 根据权利要求37所述的方法，其中所述自身免疫性疾病包括炎性肠病（IBD)、克罗 恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎症、脉管炎、银肩病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性 硬化、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状 腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎、舍格伦病、肢端硬皮综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥、 原发性硬化性胆管炎或脓毒症。
41. 根据权利要求37所述的方法，其中所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、充血性心力 衰竭、易损斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件。
42. 根据权利要求37所述的方法，其中所述神经疾病包括多发性硬化(MS)、帕金森病 (PD)、阿尔兹海默病(AD)、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴 呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管病、拉斯马森脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统 性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩侧索硬化、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传 染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如中风）、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。
43. 根据权利要求37所述的方法，其中所述疼痛包括纤维肌痛、慢性神经性疼痛或周围 神经性疼痛。
44. 根据权利要求37所述的方法，其中所述感染性疾病包括细菌感染、病毒感染、酵母 感染、惠普尔病、朊病毒病、硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜 炎、疟疾、结核病、流行性感冒。
45. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括乳腺癌，并且 所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID NO.510559-510598中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30 个或至少 40 个。
46. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括阿尔兹海默 病，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510600、510604、510605、510608、 510609、510612、510614、510629、510632、510633、510634、510641、510642、510643、510646、 510648、510649、510651、510652、510653、510655、510661、510667、510673、510675、510676、 510677、510678、510679、510681、510683、510685、510687、510688、510690、510694、510696、 510702、510707、510709、510726、510727、510728、510729、510730、510731、510732、510737、 510740、510748、510749、510751、510752、510754、510756、510757、510758、510761和510762 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或 全部。
47. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括阿尔兹海默 病，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510599、510601、510603、510606、 510608、510609、510611、510613、510614、510615、510619、510621、510625、510628、510629、 510630、510632、510634、510635、510636、510637、510644、510647、510648、510651、510652、 510654、510657、510665、510666、510667、510668、510677、510678、510679、510687、510692、 510693、510696、510698、510699、510701、510702、510707、510708、510710、510713、510716、 510725、 510726、510728、510731、510732、510733、510734、510736、510741、510748、510749、 510755、510757、510758、510761和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
48. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括支气管哮喘， 并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510601、510614、510619、510623、 510627、510631、510633、510635、510647、510655、510656、510660、510672、510689、510690、 510693、510698、510701、510702、510707、510709、510710、510713、510720、510723、510724、 510726、 510728、510729、510730、510731、510734、510735、510738、510743、510744、510745、 510746、510748、510749、510750、510751、510752、510754、510755、510757、510758、510759、 510760、510761 和 510762 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、25、30、40、45、50个或全部。
49. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括支气管哮喘， 并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510600、510608、510609、510610、 510611、510617、510619、510622、510631、510632、510634、510635、510637、510642、510643、 510644、510652、510655、510657、510658、510665、510668、510673、510675、510676、510677、 510678、510679、510683、510691、510701、510703、510704、510706、510708、510709、510714、 510725、510736、510737、510740、510741、510742和510756中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
50. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括膀胱移行细胞 癌，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510607、510619、510623、510631、 510632、510635、510641、510642、510647、510656、510657、510658、510659、510673、510674、 510683、510686、510693、510695、510701、510702、510707、510708、510711、510716、510722、 510725、510726、510728、510731、510734、510737、510744、510748、510749、510751、510752、 510753、510756、510757、510758、510761 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
51. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括巨细胞破成骨 细胞瘤，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510612、510620、510635、 510637、510641、510644、510648、510658、510662、510663、510667、510668、510670、510676、 510678、510679、510682、510683、510685、510686、510699、510708、510712、510722、510737 和 510753中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、 45、50个或全部。
52. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括脑瘤，并且所 述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510607、510619、510624、510628、510639、 510641、510645、510647、510648、510655、510657、510665、510668、510673、510674、510689、 510695、510698、510699、510705、510710、510711、510712、510713、510716、510734、510737、 510738 和 510762 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、 30、40、45、50个或全部。
53. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括结直肠腺癌， 并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510603、510607、510611、510616、 510618、510619、510623、510624、510641、510644、510646、510647、510655、510656、510672、 510673、510690、510693、510695、510698、510701、510702、510709、510711、510714、510716、 510719、510723、510724、510725、510726、510730、510731、510734、510735、510737、510738、 510743、 510744、510748、510749、510751、510752、510754、510755、510757、510758、510760、 510761、510762和510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、25、30、40、45、50个或全部。
54. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括慢性阻塞性肺 疾病（COPD)，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510604、510608、510609、 510612、 510614、510616、510619、510620、510629、510634、510637、510640、510647、510649、 510653、510661、510666、510667、510669、510673、510678、510682、510689、510690、510701、 510707、510715、510723、510727、510728、510749、510754、510755、510757、510758、510762 和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、 45、50个或全部。
55. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括慢性阻塞性肺 疾病(COPD)，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510601、510609、510611、 510613、 510620、510634、510637、510647、510648、510654、510664、510668、510679、510694、 510696、510698、510699、510701、510705、510706、510710、510718、510734和510741中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
56. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括宫颈鳞状细胞 癌，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510615、510619、510623、510626、 510630、510632、510633、510635、510638、510639、510641、510642、510644、510647、510650、 510655、 510656、510657、510661、510673、510674、510677、510683、510688、510693、510695、 510698、510711、510712、510714、510716、510717、510722、510725、510729、510731、510734、 510737、510743、510745、510747、510753、510755、510756、510758、510759和510763中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
57. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括急性心肌梗死 (AMI)或急性心力衰竭，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID NO. 510607、 510608、510613、510626、510629、510631、510634、510635、510638、510639、510646、510648、 510656、 510667、510669、510671、510672、510675、510682、510689、510698、510701、510707、 510710、510715、510721、510723、510727、510728、510730、510731、510734、510735、510743、 510744、 510748、510749、510751、510752、510757、510758、510760、510761和510762中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
58. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括急性心肌梗死 (AMI)或急性心力衰竭，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID NO. 510599、 510601、510606、510607、510608、510609、510611、510614、510616、510619、510622、510624、 510626、510635、510636、510637、510640、510641、510643、510644、510648、510651、510665、 510668、 510669、510672、510675、510677、510678、510679、510682、510692、510695、510696、 510698、510699、510701、510703、510707、510710、510725、510726、510728、510729、510730、 510731、510733、510734、510736、510743、510750、510751、510752、510755、510757、510758、 510759、510760、510761和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
59. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括克罗恩病，并 且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510600、510602、510608、510611、510624、 510644、510653、510656、510659、510669、510671、510676、510686、510689、510690、510697、 510698、510700、510713、510727、510728、510729、510731、510734、510744、510751和510757 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或 全部。
60. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括克罗恩病，并 且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510610、510611、510615、510618、 510621、510623、510625、510626、510628、510631、510632、510635、510637、510638、510643、 510647、510648、510649、510653、510654、510655、510657、510658、510666、510667、510668、 510672、510675、510677、510678、510679、510680、510682、510684、510689、510691、510694、 510696、510698、510701、510707、510708、510709、510710、510713、510714、510715、510719、 510725、510727、510728、510729、510730、510731、510734、510736、510738、510743、510744、 510748、510750、510751、510755、510757、510758、510759、510760、510761、510762和510763 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或 全部。
61. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括II型糖尿病， 并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510600、510604、510608、510610、 510611、510614、510616、510620、510624、510629、510632、510634、510640、510649、510667、 510669、 510670、510671、510678、510685、510700、510701、510702、510707、510709、510718、 510721、510723、510726、510727、510728、510729、510730、510731、510733、510735、510743、 510748、510749、510752、510754、510755、510757、510758、510760、510761、510762和510763 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或 全部。
62. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括II型糖尿病， 并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510613、510632、510635、510636、 510641、510645、510647、510648、510654、510660、510664、510667、510668、510670、510675、 510684、510691、510695、510696、510706、510710、510734和 510749中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
63. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括食管癌，并且 所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510602、510619、510623、510632、510635、 510638、510641、510644、510653、510656、510661、510671、510682、510689、510693、510698、 510714、510722、510725、510731、510734、510738、510753和510761中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
64. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括喉部鳞状细胞 癌，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510605、510607、510612、510614、 510619、510623、510632、510635、510641、510642、510655、510656、510657、510659、510661、 510668、510673、510674、510689、510690、510693、510695、510698、510708、510712、510732、 510734、510737、510738、510745、510747、510753和510755中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
65. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括骨髓的急性或 慢性白血病，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID NO. 510600、510605、510607、 510610、510612、510628、510631、510633、510641、510644、510650、510664、510670、510673、 510674、510675、510681、510684、510685、510686、510701、510711、510712、510717、510718、 510719、510720、510721、510724、510729、510732、510739、510740、510743、510745、510746、 510747、510752、510754 和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
66. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括肺癌，并且所 述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510604、510626、510628、510631、510633、 510635、510649、510650、510654、510668、510672、510674、510677、510699、510701、510702、 510710、510712、510715、510717、510719、510720、510721、510723、510724、510726、510727、 510733、 510735、510738、510743、510744、510745、510746、510747、510750、510751、510754、 510755、510758、510760 和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
67. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括恶性淋巴瘤， 并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510601、510611、510618、510623、 510624、510631、510632、510636、510638、510641、510644、510645、510647、510656、510660、 510662、510672、510673、510675、510690、510693、510701、510702、510707、510708、510713、 510717、510719、510721、510723、510724、510725、510726、510728、510729、510730、510731、 510734、 510735、510737、510743、510744、510749、510751、510752、510754、510755、510756、 510757、510758、510760、510762 和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
68. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括多发性硬化， 并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510607、510612、510620、510646、 510653、510655、510661、510663、510669、510675、510682、510685、510686、510690、510699、 510701、510710、510713、510731、510738、510747、510758 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
69. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括多发性硬化， 并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510599、510604、510609、510610、 510613、510617、510618、510622、510632、510635、510647、510670、510675、510677、510687、 510690、510692、510695、510701、510706、510708、510731和510733中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
70. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括卵巢癌，并且 所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510618、510626、510628、510633、510638、 510641、510642、510643、510645、510646、510647、510650、510652、510658、510665、510666、 510673、510674、510677、510682、510683、510689、510705、510707、510712、510717、510722、 510724、510729、510732、510735、510737、510745、510746、510747、510753和510756中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
71. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括帕金森病，并 且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510600、510601、510604、510608、510609、 510612、510614、510624、510631、510633、510634、510640、510641、510642、510649、510650、 510651、510653、510667、510673、510675、510676、510677、510683、510686、510689、510694、 510700、510703、510704、510705、510706、510707、510709、510713、510715、510721、510723、 510724、510726、510727、510729、510730、510731、510732、510734、510735、510736、510737、 510739、510740、510741、510742、510744、510745、510746、510747、510748、510751、510752、 510754、 510756、510757、510758、510759、510760、510761和510762中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
72. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括帕金森病，并 且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510601、510606、510608、510609、510610、 510614、510616、510632、510634、510643、510644、510647、510648、510654、510662、510664、 510665、510667、510668、510670、510677、510678、510679、510687、510692、510696、510698、 510699、510701、510703、510704、510706、510708、510710、510722、510727、510734、510736、 510741、510742、510753 和 510756中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
73. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括前列腺腺癌， 并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510600、510603、510607、510619、 510623、510624、510628、510641、510642、510644、510647、510650、510655、510656、510657、 510669、510673、510674、510677、510684、510688、510689、510690、510695、510698、510701、 510709、510710、510718、510726、510734、510737、510738、510739、510757和510762中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
74. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括牛皮癣，并且 所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510601、510608、510609、510611、 510614、510620、510624、510626、510631、510633、510634、510635、510638、510647、510649、 510650、510653、510656、510665、510666、510667、510669、510672、510674、510675、510680、 510685、510689、510698、510702、510707、510711、510712、510715、510717、510719、510720、 510721、510723、510724、510726、510727、510728、510729、510730、510731、510734、510735、 510743、510744、510745、510746、510747、510748、510749、510750、510751、510752、510754、 510755、 510757、510758、510759、510760、510761、510762和510763中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
75. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括牛皮癣，并且 所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510601、510604、510613、510621、 510627、510637、510641、510644、510648、510650、510652、510663、510667、510668、510676、 510680、510681、510699、510701、510703、510705、510709、510710、510722、510734、510739、 510750 和 510753 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、 30、40、45、50个或全部。
76. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括类风湿性关节 炎，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510599、510603、510604、510607、 510608、510609、510614、510616、510622、510625、510627、510629、510630、510634、510635、 510636、510637、510640、510642、510646、510649、510650、510651、510653、510656、510664、 510665、510667、510671、510675、510677、510678、510679、510682、510689、510699、510707、 510726、510727、510728、510729、510731、510733、510737、510738、510748、510755、510758、 510761和 510762 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、 30、40、45、50个或全部。
77. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括类风湿性关节 炎，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510599、510601、510603、510604、 510606、510607、510608、510609、510610、510611、510612、510613、510614、510616、510617、 510618、510622、510623、510625、510629、510630、510634、510635、510636、510637、510638、 510639、510640、510641、510643、510644、510645、510646、510648、510649、510651、510652、 510653、510654、510658、510662、510663、510664、510665、510666、510667、510668、510669、 510671、510673、510677、510678、510679、510682、510685、510692、510696、510697、510698、 510699、510701、510703、510710、510716、510722、510725、510726、510727、510730、510733、 510734、510738、510741、510743、510753、510755和510757中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
78. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括肾细胞癌，并 且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510600、510603、510604、510606、510608、 510614、510616、510622、510628、510629、510630、510632、510634、510635、510640、510644、 510645、510646、510652、510653、510656、510664、510665、510666、510667、510671、510675、 510677、510683、510685、510687、510690、510701、510722、510726、510728、510729、510730、 510731、510732、510733、510734、510738、510748、510749、510752、510753、510758、510761 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、 45、50个或全部。
79. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括皮肤鳞状细胞 癌，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510618、510622、510626、510639、 510641、510642、510650、510658、510673、510674、510683、510696、510708、510712、510717、 510720、510722、510723、510724、510727、510729、510743、510745、510746、510747、510752、 510753、510754、510755、510756、510759、510761和510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
80. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括胃腺癌，并且 所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID NO. 510600、510604、510608、510609、510612、 510626、510631、510632、510634、510639、510653、510658、510663、510667、510681、510689、 510692、510693、510696、510698、510699、510705、510711、510715、510717、510719、510723、 510725、 510729、510731、510734、510735、510736、510743、510746、510748、510751、510754、 510757、510760、510762 和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
81. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括甲状腺癌，并 且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510602、510603、510614、510626、510638、 510641、510644、510646、510653、510658、510659、510661、510662、510674、510689、510693、 510695、510698、510699、510701、510704、510705、510708、510717、510718、510722、510727、 510731、510734、510736、510739、510740、510741、510747、510753 和 510755中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
82. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括睾丸癌，并且 所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510603、510607、510615、510616、 510618、510619、510621、510622、510623、510624、510630、510636、510637、510641、510644、 510645、510647、510650、510654、510655、510656、510657、510659、510662、510665、510670、 510673、510674、510681、510684、510685、510687、510688、510689、510690、510692、510693、 510695、510696、510698、510700、510701、510704、510707、510712、510713、510717、510718、 510726、 510734、510737、510738、510739、510740、510742、510747、510756和510757中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
83. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括溃疡性结肠 炎，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510599、510607、510611、510612、 510616、510620、510621、510622、510624、510626、510632、510633、510636、510646、510655、 510659、510672、510673、510675、510676、510677、510682、510684、510691、510692、510702、 510703、 510704、510705、510706、510707、510709、510710、510715、510721、510723、510724、 510728、510729、510730、510731、510735、510736、510737、510739、510740、510741、510743、 510744、510748、510751、510752、510754、510757、510758、510759、510760、510761和510762 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或 全部。
84. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括溃疡性结肠 炎，并且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510610、510611、510612、510619、 510622、510623、510634、510635、510641、510647、510648、510654、510657、510664、510668、 510670、510671、510676、510677、510678、510679、510689、510691、510696、510701、510703、 510704、 510710、510722、510734、510742和 510753中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。
85. 根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括子宫腺癌，并 且所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510601、510612、510621、510626、510637、 510641、510644、510650、510653、510669、510675、510684、510686、510687、510696、510714、 510717、510722、510739、510743、510745、510746、510753、510755 和 510762中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50中或全部。
86. 根据权利要求45-85中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸或至少一个所述多个 寡核苷酸包含至少一个选自DNA、RNA、非天然产生的核苷酸、缺失、插入、添加和化学修饰的 功能修饰。
87. -种试剂盒，其包含用于实施根据权利要求13-19或22-86中任一项所述的方法的 试剂。
88. 试剂用于实施根据权利要求13-19或22-86中任一项所述的方法的用途。
89. 根据权利要求87所述的试剂盒或者根据权利要求88所述的用途，其中所述试剂包 含寡核苷酸或多个寡核苷酸。
90. 根据权利要求89所述的试剂盒或用途，其中所述寡核苷酸或多个寡核苷酸为根据 权利要求1-12中任一项所述。
91. 根据权利要求89或90所述的试剂盒或用途，其中所述试剂进一步包含下列各项中 的至少一项； a) 被配置用于分离微囊泡的试剂，任选地其中至少一种被配置用于分离微囊泡的试剂 包含针对微囊泡抗原、柱子、基底、过滤单元、聚合物、聚乙二醇、PEG4000、PEG8000、颗粒或 珠子的结合剂； b) 至少一种被配置充当引物或探针的寡核苷酸，其用于扩增、测序、杂交或检测所述寡 核苷酸或多个寡核苷酸；以及 c) 被配置用于从样品中去除一种或多种高丰度蛋白质的试剂，其中任选地所述一种或 多种高丰度蛋白质包含白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白中的至少一种。
92. -种适体，其包含与以下任一项至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源的核酸序列 ：a)如表8所述的SEQID NO.8-21或其可变序列；b)如表11所述的SEQ ID NO.24-43或其可变序列；c)SEQ ID NO.44-10527;d)如表12所述的SEQ ID NO. 10528-10557或其可变序列；或者e)任何前述序列的功 能片段。
93. 根据权利要求92所述的适体，其中所述适体被进一步修饰为包含至少一个化学修 饰。
94. 根据权利要求93所述的适体，其中所述修饰选自核酸的糖位置处的化学取代;磷酸 酯位置处的化学取代；以及碱基位置处的化学取代。
95. 根据权利要求93所述的适体，其中所述修饰选自生物素化、荧光标记的引入，经修 饰的核苷酸的引入，3'加帽，与胺接头的缀合，与高分子量、非免疫原性化合物的缀合，与亲 脂性化合物的缀合，与药物的缀合，与细胞毒性部分的缀合，以及用放射性同位素标记。
96. 根据权利要求95所述的适体，其中所述生物素化、荧光标记或细胞毒性部分与所述 适体的5 '末端缀合。
97. 根据权利要求95所述的适体，其中所述生物素化、荧光标记或细胞毒性部分与所述 适体的3'末端缀合。
98. 根据权利要求95所述的适体，其中所述细胞毒性部分封装在纳米颗粒中。
99. 根据权利要求98所述的适体，其中所述纳米颗粒选自：脂质体、树状聚体和梳状聚 合物。
100. 根据权利要求95所述的适体，其中所述细胞毒性部分包含小分子细胞毒性部分。
101. 根据权利要求100所述的适体，其中所述小分子细胞毒性部分选自长春碱酰肼、加 利车霉素、长春花生物碱、念珠藻素、微管溶素、尾海兔素-10、尾海兔素-15、阿里他汀E、根 霉素、埃博霉素 B、埃博霉素 D、紫杉烷、美登素，及其任意变体和衍生物。
102. 根据权利要求95所述的适体，其中所述放射性同位素选自钇-90、铟-111、碘-131、 镥-177、铜-67、铼-186、铼-188、铋-212、铋-213、砹-211 和锕-225。
103. 根据权利要求95所述的适体，其中所述细胞毒性部分为蛋白质毒素。
104. 根据权利要求103所述的适体，其中所述蛋白质毒素选自白喉毒素、蓖麻毒蛋白、 相思豆毒蛋白、白树毒素和假单胞菌外毒素 A。
105. 根据权利要求95所述的适体，其中所述高分子量、非免疫原性化合物为聚亚烷基 二醇。
106. 根据权利要求105所述的适体，其中所述聚亚烷基二醇为聚乙二醇。
107. 根据权利要求92所述的适体，其中所述适体用发射γ射线的放射性同位素标记。
108. 根据权利要求92所述的适体，其中活性剂与所述适体缀合。
109. 根据权利要求108所述的适体，其中所述活性剂包含治疗剂或诊断剂。
110. 根据权利要求108-109中任一项所述的适体，其中所述治疗剂或诊断剂为选自下 组的治疗剂:酪氨酸激酶抑制剂、激酶抑制剂、生物活性剂、生物分子、放射性核素、阿霉素、 安沙霉素抗生素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺铂、卡铂、卡莫司汀、卡培他滨、苯丁酸 氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、右雷佐生、多西紫杉醇、 多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、 异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯基嘌呤、美法仑、氨甲蝶呤、雷帕霉素（西罗莫 司）、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉酚、帕米膦酸盐、喷司他丁、普利霉素、丙 卡巴肼、利妥昔单抗、链脲菌素、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、噻替派、紫杉烷、长春碱、长春新碱、长 春瑞滨、紫杉醇、考布他汀、(118〇0(161'1]1〇11(16 8、反钼、抗血管内皮生长因子化合物（"抗 VEGF"）、抗-表皮生长因子受体化合物（"抗EGFR"）、5_氟尿嘧啶及其衍生物、放射性核素、多 肽毒素、凋亡诱导剂、治疗敏化剂、酶或活性片段，以及它们的组合。
111. 一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求92-110中任一项所述的适体 或其盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
112. -种治疗或改善疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求 111所述的组合物。
113. 根据权利要求112所述的方法，其中向受试者施用治疗有效量的组合物导致：（a) 相对于单独递送活性剂，该活性剂向病变部位的递送得到增强;或者(b)微囊泡清除得到增 强，导致被适体靶向的微囊泡的血液水平降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%或90%;或者（〇)被适体靶向的微囊泡的生物活性降低至少10%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80% 或 90%。
114. 根据权利要求113所述的方法，其中微囊泡的生物活性包括免疫抑制或遗传信息 的转移。
115. 根据权利要求112-114中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括赘生性、增 生性或炎性疾病或病症。
116. -种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求103所述的适体或其盐，以及 药学上可接受的载体或稀释剂。
117. -种试剂盒，其包含根据权利要求92-110中任一项所述的适体或其药物组合物。
118. -种方法，其包括使根据权利要求92-110中任一项所述的适体与生物样品接触， 以及检测该适体与生物样品中微囊泡的结合的存在或缺失。
119. 根据权利要求118所述的方法，其中所述生物样品包含血液或血液组分。
120. 根据权利要求118所述的方法，其中所述适体在与生物样品接触之前与基底缀合。
121. 根据权利要求120所述的方法，其中所述基底包含珠子。
122. 根据权利要求118所述的方法，其中所述适体与可检测的标记缀合。
123. -种检测怀疑包含微囊泡群体的生物样品中微囊泡群体的存在或水平的方法，其 包括使生物样品与一种或多种对所述微囊泡群体具有特异性的结合剂以及一种或多种根 据权利要求92-110中任一项所述的适体接触，并检测被所述一种或多种结合剂以及所述一 种或多种适体两者识别的微囊泡，从而检测生物样品中所述微囊泡群体的存在或水平。
124. 根据权利要求12 3所述的方法，其中所述一种或多种结合剂包含针对选自表3和表 4的微囊泡表面抗原的抗体或适体，及其组合。
125. 根据权利要求123所述的方法，其中所述一种或多种结合剂在与生物样品接触之 如与基底缀合。
126. 根据权利要求123所述的方法，其中所述一种或多种结合剂与可检测的标记缀合。
127. 根据权利要求123所述的方法，其中所述一种或多种适体在与生物样品接触之前 与基底缀合。
128. 根据权利要求123所述的方法，其中所述一种或多种适体与可检测的标记缀合。
129. 根据权利要求126所述的方法，其中所述一种或多种适体在与生物样品接触之前 与基底缀合。
130. 根据权利要求125所述的方法，其中所述一种或多种适体与可检测的标记缀合。
131. 根据权利要求123-130中任一项所述的方法，其中检测生物样品中微囊泡群体的 存在或水平提供了疾病的诊断、预后或治疗诊断。
132. 根据权利要求131所述的方法，其中所述疾病包括癌症。
133. 根据权利要求132所述的方法，其中所述癌症包括乳腺癌。
134. -种表征疾病或病症的方法，其包括： (a) 使生物测试样品与根据权利要求92-110中任一项所述的一种或多种适体接触； (b) 检测在步骤(a)中在所述一种或多种适体与生物测试样品中被所述一种或多种适 体结合的靶标之间形成的复合物的存在或水平； (c) 使生物对照样品与所述一种或多种适体接触； (d) 检测在步骤(c)中在所述一种或多种适体与生物对照样品中被所述一种或多种适 体结合的靶标之间形成的复合物的存在或水平；以及 (e) 比较步骤(b)和(d)中检测到的存在或水平，从而表征所述疾病或病症。
135. 根据权利要求134所述的方法，其中所述生物测试样品和生物对照样品各自包含 组织样品、细胞培养物或生物流体。
136. 根据权利要求135所述的方法，其中所述生物流体包含体液。
137. 根据权利要求136所述的方法，其中所述体液包含外周血、血清、血浆、腹水、尿液、 脑脊液(CSF )、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列 腺液、考珀液或射精前液、女性射出液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心 包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪 便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或脐带血。
138. 根据权利要求136所述的方法，其中所述体液包含血液、血清或血浆。
139. 根据权利要求135所述的方法，其中所述生物流体包含微囊泡。
140. 根据权利要求134所述的方法，其中所述一种或多种适体与多肽或其片段结合。
141. 根据权利要求134所述的方法，其中所述多肽或其片段是可溶的或膜结合的。
142. 根据权利要求134所述的方法，其中所述多肽或其片段包含表3或表4中的生物标 志物。
143. 根据权利要求134或139所述的方法，其中所述一种或多种适体与生物样品中的微 囊泡表面抗原结合。
144. 根据权利要求134-143中任一项所述的方法，其中所述表征包括疾病或病症的诊 断、预后或治疗诊断。
145. 根据权利要求144所述的方法，其中所述疾病或病症包括癌症。
146. 根据权利要求145所述的方法，其中所述癌症包括乳腺癌。
147. -种试剂盒，其包含用于实施根据权利要求118-146中任一项所述的方法的试剂。
148. 试剂用于实施根据权利要求118-146中任一项所述的方法的用途。
149. 根据权利要求147所述的试剂盒或根据权利要求148所述的用途，其中所述试剂包 含根据权利要求92-110中任一项所述的适体。
150. 根据权利要求149所述的试剂盒或用途，其中所述试剂进一步包含下列各项中的 至少一项： a) 被配置用于分离微囊泡的试剂，任选地其中至少一种被配置用于分离微囊泡的试剂 包含针对微囊泡抗原、柱子、基底、过滤单元、聚合物、聚乙二醇、PEG4000、PEG8000、颗粒或 珠子的结合剂； b) 至少一种被配置充当引物或探针的寡核苷酸，其用于扩增、测序、杂交或检测所述寡 核苷酸或多个寡核苷酸；以及 c) 被配置用于从样品中去除一种或多种高丰度蛋白质的试剂，其中任选地所述一种或 多种高丰度蛋白质包含白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白中的至少一种。
151. -种组合物，其包含用于评估细胞或细胞外囊泡样品的输入寡核苷酸文库，该样 品包含至少两个子集寡核苷酸文库以生成输入寡核苷酸文库，其中所述至少两个子集寡核 苷酸文库中的至少一个以总G和C含量不等于50%的寡核苷酸的量来制备。
152. 根据权利要求151所述的组合物，其中所述总G和C含量小于50 %。
153. 根据权利要求151所述的组合物，其中所述总G和C含量大于50 %。
154. 根据权利要求151所述的组合物，其中至少一个子集文库以大于50%的总G和C含 量来制备，而另一个子集文库以小于50%的总G和C含量来制备。
155. 根据权利要求151所述的组合物，其中所述至少两个子集文库包含分别以25%、 50 %和75 %的G和C含量制备的三个子集文库。
156. 根据权利要求151所述的组合物，其中所述至少两个子集文库以与表13中的至少 两行类似或相等的核苷酸含量来制备。
157. 根据权利要求151所述的组合物，其中所述核苷酸由天然存在的核苷酸构成。
158. 根据权利要求151所述的组合物，其中所述核苷酸包括经修饰的天然存在的核苷 酸。
159. 根据权利要求151所述的组合物，其中所述核苷酸包括非天然存在的核苷酸。
160. -种生成根据权利要求151-159中任一项所述的输入文库的方法，其包括使所述 至少两个子集文库接触以生成所述输入文库。
161. -种寡核苷酸，其具有包含5 '转座子衔接子区域、包含0个或更多个位于所述转座 子衔接子区域5'侧的核苷酸的偏移区域、位于所述偏移区域5'侧的可变区域以及位于所述 可变区域5 '侧的左侧引物区域的序列。
162. 多个寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、 500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、 30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、 序列，其中每一个寡核苷酸序列均包含5'转座子衔接子区域、包含0个或更多个位于所述转 座子衔接子区域5'侧的核苷酸的偏移区域、位于所述偏移区域5'侧的可变区域以及位于所 述可变区域5'侧的左侧引物区域。
163. 根据权利要求161-162中任一项所述的寡核苷酸或多个寡核苷酸，其中： (a) 所述转座子衔接子区域包含20-40个核苷酸； (b) 所述偏移区域包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸； (c) 所述可变区域包含20-50个核苷酸;和/或 (d) 所述左侧引物区域包含20-40个核苷酸。
164. 根据权利要求161-163中任一项所述的寡核苷酸或多个寡核苷酸，其中： (a) 所述转座子衔接子区域包含与序列5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID 吣.510764)至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%或100%同源的核酸序列； (b) 所述偏移区域包含与下列序列中的至少一个至少约50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源的1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10 个核苷酸：5'-T(SEQ ID N0.510765)、5'-CT(SEQ ID N0.510766)和 5'-ACT(SEQ ID NO.510767)； (c) 所述可变区域包含 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸； (d) 所述可变区域包含根据权利要求151-159中任一项所述的输入寡核苷酸文库;和/ 或 (e) 所述左侧引物区域包含与选自SEQ ID NO. 510768和510769的序列至少约50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源的 核酸序列。
165. -种鉴定适体的方法，其包括使用根据权利要求161-164中任一项所述的寡核苷 酸或多个寡核苷酸进行SELEX选择过程。
166. 根据权利要求165所述的方法，其中所述选择过程包括至少一轮针对感兴趣的靶 标的阳性选择，以及任选的至少一轮针对除了该感兴趣的靶标之外的靶标的阴性选择。
167. -种方法，其包括使寡核苷酸或多个寡核苷酸与样品接触，以及检测所述寡核苷 酸或多个寡核苷酸与样品中靶标的结合的存在或水平，其中任选地所述寡核苷酸或多个寡 核苷酸为根据权利要求161-164中任一项所述。
168. 根据权利要求167所述的方法，其中所述样品包含生物样品、有机样品、无机样品、 组织、细胞培养物、体液、血液、血清、细胞、微囊泡、蛋白质复合物、脂质复合物、碳水化合物 或其任意组合、部分或变化形式。
169. 根据权利要求167所述的方法，其中所述靶标包含细胞、细胞器、蛋白质复合物、月旨 蛋白、碳水化合物、微囊泡、膜片段、小分子、重金属、毒素或药物。
170. -种方法，其包括： (a) 使包含微囊泡的生物样品与寡核苷酸探针文库接触，其中该寡核苷酸探针文库包 含根据权利要求161-164中任一项所述的寡核苷酸或多个寡核苷酸； (b) 鉴定与所述微囊泡的至少一部分结合的寡核苷酸；以及 (c) 基于鉴定出的寡核苷酸谱来表征所述样品。
171. -种方法，其包括： (a) 使样品与包含至少 少1018个不同寡核苷酸序列的寡核苷酸的寡核苷酸探针文库接触以在溶液中形成混合物， 其中所述寡核苷酸能够结合样品中的多个实体从而形成复合物，其中所述寡核苷酸探针文 库包含根据权利要求161-164中任一项所述的寡核苷酸或多个寡核苷酸； (b) 将由混合物在步骤(a)中形成的复合物进行分区；以及 (c) 检测在步骤(b)中分区的复合物中存在的寡核苷酸，以对所述样品鉴定寡核苷酸 谱。
172. 根据权利要求171所述的方法，其中所述检测步骤包括对所述复合物中的全部或 部分寡核苷酸进行测序，对所述复合物中的全部或部分寡核苷酸进行扩增，和/或使所述复 合物中的全部或部分寡核苷酸与阵列杂交。
173. -种表征疾病或病症的方法，其包括： (a) 使生物测试样品与根据权利要求161-164中任一项所述的寡核苷酸或多个寡核苷 酸接触； (b) 检测在步骤(a)中、在根据权利要求161-164中任一项所述的寡核苷酸或多个寡核 苷酸与生物测试样品中的靶标之间形成的复合物的存在或水平；以及 (c) 将步骤(b)中检测到的存在或水平与来自生物对照样品的参考水平进行比较，从而 表征所述疾病或病症。
174. 根据权利要求173所述的方法，其中所述检测步骤包括对所述复合物中的全部或 部分寡核苷酸进行测序，对所述复合物中的全部或部分寡核苷酸进行扩增，和/或使所述复 合物中的全部或部分寡核苷酸与阵列杂交。
175. 根据权利要求174所述的方法，其中所述测序包括高通量测序。
176. 根据权利要求173所述的方法，其中所述生物测试样品和生物对照样品各自包含 组织样品、细胞培养物或生物流体。
177. 根据权利要求176所述的方法，其中所述生物流体包含体液。
178. 根据权利要求177所述的方法，其中所述体液包含外周血、血清、血浆、腹水、尿液、 脑脊液(CSF )、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列 腺液、考珀液或射精前液、女性射出液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心 包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪 便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或脐带血。
179. 根据权利要求177所述的方法，其中所述体液包含血液、血清或血浆。
180. 根据权利要求176所述的方法，其中所述生物流体包含微囊泡。
181. 根据权利要求180所述的方法，其中所述复合物在所述寡核苷酸或多个寡核苷酸 与至少一个所述微囊泡之间形成。
182. 根据权利要求173所述的方法，其中所述生物测试样品和生物对照样品包含分离 的微囊泡，其中任选地所述微囊泡使用下述中的至少一种来分离：色谱法、过滤、超滤、离 心、超速离心、流式细胞术、亲和捕获(例如，捕获到平面、柱子或珠子上）、聚合物沉淀和使 用微流体。
183. 根据权利要求173所述的方法，其中所述寡核苷酸或多个寡核苷酸与多肽或其片 段结合。
184. 根据权利要求183所述的方法，其中所述多肽或其片段是可溶的或膜结合的，其中 任选地所述膜包含微囊泡膜。
185. 根据权利要求184所述的方法，其中所述多肽或其片段包含表3或表4中的生物标 志物。
186. 根据权利要求173所述的方法，其中所述寡核苷酸或多个寡核苷酸与所述生物样 品中的微囊泡表面抗原结合。
187. 根据权利要求173所述的方法，其中所述疾病或病症包括乳腺癌、阿尔茨海默病、 支气管哮喘、膀胱移行细胞癌、巨细胞破成骨细胞瘤、脑瘤、结直肠腺癌、慢性阻塞性肺疾病 (coro)、宫颈鳞状细胞癌、急性心肌梗死(AMI)/急性心力衰竭、克罗恩病、II型糖尿病、食管 癌、喉部鳞状细胞癌、骨髓的急性和慢性白血病、肺癌、恶性淋巴瘤、多发性硬化、卵巢癌、帕 金森病、前列腺腺癌、牛皮癣、类风湿性关节炎、肾细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、胃腺癌、甲状腺 癌、睾丸癌、溃疡性结肠炎或子宫腺癌。
188. 根据权利要求173所述的方法，其中所述疾病或病症包括癌症、恶变前状况、炎性 疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或病症、心血管疾病或病症、神经疾病或病症、感染性疾病 或疼痛。
189. 如权利要求188所述的方法，其中所述癌症包括急性淋巴母细胞性白血病;急性髓 样白血病；肾上腺皮质癌;AIDS相关癌症;AIDS相关淋巴瘤;肛门癌；阑尾癌;星形细胞瘤;非 典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤;基底细胞癌;膀胱癌;脑干胶质瘤;脑瘤(包括脑干胶质瘤、中枢 神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、室管 膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经 外胚瘤和松果体母细胞瘤）；乳腺癌;支气管肿瘤;伯基特淋巴瘤;原发部位不明癌;类癌瘤； 原发部位不明肿瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎瘤；宫 颈癌;儿童期癌症;脊索瘤;慢性淋巴细胞白血病;慢性髓性白血病;慢性骨髓增殖性病症； 结肠癌;结直肠癌;颅咽管瘤;皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤;子宫内膜癌;室管膜母 细胞瘤;室管膜瘤;食管癌;成感觉神经细胞瘤;尤因肉瘤;颅外生殖细胞瘤;性腺外生殖细 胞瘤;肝外胆管癌;胆囊癌；胃（胃部)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤 (GIST);妊娠滋养细胞瘤;神经胶质瘤;毛细胞白血病;头颈癌;心脏癌;霍奇金淋巴瘤;下咽 癌;眼内黑色素瘤;胰岛细胞瘤;卡波西肉瘤;肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症;喉癌;唇 癌；肝癌；肺癌；恶性纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤;髓上皮瘤；黑色素瘤;梅克尔细胞 癌;梅克尔细胞皮肤癌；间皮瘤;隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌;多发性内分泌肿瘤 综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤;蕈样肉芽肿;骨髓增生异常综合征;骨 髓增生性肿瘤;鼻腔癌;鼻咽癌；神经母细胞瘤;非霍奇金淋巴瘤;非黑色素瘤皮肤癌;非小 细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌;骨肉瘤;其它脑和脊髓肿瘤;卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生 殖细胞瘤;卵巢低恶性潜在肿瘤;胰腺癌;乳头状瘤病;副鼻窦癌；甲状旁腺癌;盆腔癌；阴茎 癌；咽癌；中度分化的松果体实质肿瘤;松果体母细胞瘤;垂体瘤;浆细胞肿瘤/多发性骨髓 瘤;胸膜肺母细胞瘤;原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤;原发性肝细胞性肝癌;前列腺癌； 直肠癌;肾癌;肾细胞(肾)癌;肾细胞癌;呼吸道癌;视网膜母细胞瘤;横纹肌肉瘤;唾液腺癌 症;塞扎里综合征;小细胞肺癌;小肠癌;软组织肉瘤;鳞状细胞癌;鳞状颈癌；胃部（胃）癌； 幕上原始神经外胚瘤;T细胞淋巴瘤;睾丸癌；咽喉癌;胸腺癌;胸腺瘤；甲状腺癌;移行细胞 癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌;滋养细胞瘤;输尿管癌;尿道癌;子宫癌;子宫肉瘤；阴道 癌;外阴癌;瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或维尔姆斯瘤。
190. 根据权利要求188所述的方法，其中所述恶变前状况包括巴雷特食管。
191. 根据权利要求188所述的方法，其中所述自身免疫性疾病包括炎性肠病（IBD)、克 罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎症、脉管炎、银肩病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发 性硬化、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE )、桥本甲 状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎、舍格伦病、肢端硬皮综合征、硬皮病、风湿病、器官排 斥、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。
192. 根据权利要求188所述的方法，其中所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、充血性心 力衰竭、易损斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件。
193. 根据权利要求188所述的方法，其中所述神经疾病包括多发性硬化(MS)、帕金森病 (PD)、阿尔兹海默病(AD)、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴 呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管病、拉斯马森脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统 性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩侧索硬化、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传 染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如中风）、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。
194. 根据权利要求188所述的方法，其中所述疼痛包括纤维肌痛、慢性神经性疼痛或周 围神经性疼痛。
195. 根据权利要求188所述的方法，其中所述感染性疾病包括细菌感染、病毒感染、酵 母感染、惠普尔病、朊病毒病、硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜 炎、疟疾、结核病、流行性感冒。
196. -种试剂盒，其包含用于实施根据权利要求165-195中任一项所述的方法的试剂。
197. 试剂用于实施根据权利要求165-195中任一项所述的方法的用途。
198. 根据权利要求196所述的试剂盒或者根据权利要求197所述的用途，其中所述试剂 包含寡核苷酸或多个寡核苷酸。
199.根据权利要求198所述的试剂盒或用途，其中所述寡核苷酸或多个寡核苷酸包含 根据或者源自如权利要求151-159或161-164中任一项所述的文库的至少一种寡核苷酸。
寡核苷酸探针及其用途 交叉引用 本申请要求于2013年8月28日提交的第61/871，107号、于2013年9月6日提交的第61/ 874,621号、于2013年11月6日提交的第61/900,975号、于2013年12月5日提交的第61/912， 471号、于2014年1月6日提交的第61/924,192号、于2014年3月6日提交的第61/949,216号、 于2014年4月3日提交的第61/974,949号、于2014年5月7日提交的第61/990,085号、于2014 年5月16日提交的第61/994，704号以及于2014年7月14日提交的第62/024，436号美国临时 专利申请的权益，所有这些申请均通过引用以其全文并入本文。 通过EFS-WEB提交的序列表
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背景技术
[0005] 本发明总体上涉及能够与微囊泡表面抗原结合的适体的领域，该适体可用作其中 涉及到微囊泡的癌症和/或其它疾病或病症的治疗剂和诊断剂。本发明还涉及用于施用能 够与微囊泡结合的适体的材料和方法。该微囊泡可以从癌症如乳腺癌指示性细胞衍生得 到。
[0007] 适体，如通过噬菌体展示产生的肽或单克隆抗体（"mAb"），能够与所选的靶标特异 性结合并调节靶标的活性，例如，通过结合，适体可以阻断其靶标起作用的能力。通过体外 选择过程从随机序列寡核苷酸池创建，已经针对超过100种蛋白质生成了适体，这些蛋白质 包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白和受体。典型的适体大小为10-15kDa(30-45个核 苷酸），以亚纳摩尔亲和力结合其靶标，并且辨别出密切相关的靶标(例如，适体一般不结合 来自同一基因家族的其它蛋白质）。一系列结构研究已经显示，适体能够使用与驱动在抗 体-抗原复合物中的亲和性和特异性的结合相互作用相同类型的结合相互作用（例如氢键 键合、静电互补性、疏水性接触、空间排阻）。
[0008] 适体具有大量用作治疗剂和诊断剂的所需特征，包括高特异性和亲和力、生物学 效力和出色的药代动力学性能。此外，相比于例如抗体和其它蛋白质生物制剂，它们提供了 特定的竞争优势：
[0009] 速度和控制。适体通过完全在体外的过程产生，这使得能够快速生成初始先导物， 包括治疗性先导物。体外选择使得能够严格控制适体的特异性和亲和性，并且允许生成先 导物，包括针对毒性靶标和非免疫原性靶标两者的先导物。
[0010]毒性和免疫原性。适体作为一个类别，已经显示出没有或几乎没有毒性或免疫原 性。在以高水平的适体(每天l〇mg/kg，持续90天)对大鼠或土拨鼠长期给药的过程中，通过 任何临床、细胞或生物化学方式没有观察到毒性。许多单克隆抗体的效力可能被针对抗体 本身的免疫应答严重限制，然而非常难以引发针对适体的抗体，这最有可能是因为适体不 能经MHC被T细胞呈递，并且免疫应答通常被训练为不识别核酸片段。
[0011]施用。大多数目前获批准的抗体治疗剂是通过静脉内输注施用（通常超过2-4小 时），然而适体可以通过皮下注射施用（在猴体研究中，适体经由皮下施用的生物利用度为 >80% (Tucker等人，J· Chromatography B · 732:203-212，1999))。这一差别主要是因为大 部分治疗性mAb具有相对较低的溶解性，因此必须使用较大体积。由于具有良好的溶解性 (>150mg/ml)和相对较低的分子量(适体：10-50kDa;抗体：150kDa)，适体的每周剂量可以 通过注射以小于〇.5mL的体积递送。另外，适体的较小大小使其能够渗入到不允许抗体或抗 体片段渗入的构象限制区域内，这显示出基于适体的治疗或预防的又一个优势。
[0012] 可放大性和成本。适体是化学合成的，并且易于根据需要按比例放大以满足对于 诊断或治疗应用的生产需求。虽然生产放大中的困难目前限制了一些生物制品的可获得 性，并且大规模蛋白质生产工厂的资本成本是巨大的，但是单个大规模寡核苷酸合成仪可 以生产100kg/年以上，并且仅需要相对适度的初始投资。估计目前以千克规模合成适体的 物品成本为100美元/g，这与高度优化的抗体的成本相仿。
[0013] 稳定性。适体是化学上稳固的。它们在暴露于诸如热和变性剂的因素之后会内在 地适应于重新恢复活性，并且可以在室温下以冻干粉末形式长期储存（>1年）。 援引并入
发明内容
[0015] 本发明的组合物和方法提供结合感兴趣的生物标志物如微囊泡表面抗原或微囊 泡表面抗原的功能片段的适体。在多个实施方案中，本发明的适体用于诊断、预后或治疗诊 断过程，以针对确定提供诊断读数的微囊泡表面抗原的存在或水平对生物样品进行筛选。 该诊断可涉及癌症，例如，乳腺癌。在其它实施方案中，本发明的适体经化学修饰或组成于 用于治疗应用的药物组合物中。
[0016] 在一方面，本发明提供与SEQ ID N0.10558至少50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源的寡核苷酸。在相关的方 面，本发明提供多个寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、 300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、 10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、 不同的寡核苷酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部分与SEQ ID N0.10558至少50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源。
[0017]在另一方面，本发明提供多个寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、 150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、 8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、 200000、300000、400000或500000个不同的寡核苷酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部 分与选自 SEQ ID N0.10559-510558的序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源。在相关的方面，本发明提供一种寡核 苷酸探针文库，其包含SEQ ID N0.10559-510558列出的寡核苷酸中的至少50%、60%、 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 或至少 99%。
[0018] 在又一方面，本发明提供一种寡核苷酸，其包含与选自SEQ ID N0.510559-510578 的序列至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%同源的核酸序列或其部分。在相关的方面，本发明提供多个寡核苷酸，其包含 至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 个不同的寡核苷酸序列，其 中每一个寡核苷酸序列或其部分与SEQ ID N0.510559-510578至少50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源。
[0019] 在再一方面，本发明提供一种寡核苷酸，其包含与选自SEQ ID N0.510579-510598 的序列至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%同源的核酸序列或其部分的寡核苷酸。在相关的方面，本发明提供多个寡核苷 酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 个不同的寡核苷 酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部分与SEQ ID N0.510579-510598至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源。
[0020] 在一方面，本发明提供一种寡核苷酸，其包含与选自SEQ ID N0.510599-510763的 序列至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%同源的核酸序列或其部分。在相关的方面，本发明提供多个寡核苷酸，其包含至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160或165个不同的寡核苷酸序列，其 中每一个寡核苷酸序列或其部分与SEQ ID N0.510599-510763至少50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源。在又一相关的方 面，本发明提供多个寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、 140、150、160或165个不同的寡核苷酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部分与表16中的 一行中的SEQ ID N0.至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99% 或 100% 同源。
[0021] 还可以根据需要对本文提供的核酸序列进行修饰，只要其仍保持功能方面(例如， 与各种靶标结合或表征表型的能力）即可。在此，这样的修饰可以被称为"功能性修饰"。功 能性修饰可增强寡核苷酸的功能方面，或对其没有影响或几乎没有影响。例如，寡核苷酸可 包含DNA或RNA、引入各种非天然核苷酸、引入其它化学修饰或包含各种缺失或插入。这类修 饰可有利于合成、稳定性、递送、标记等，或者可能在实践中没有或几乎没有影响。在一些情 况下，寡核苷酸中的一些核苷酸可被置换，同时保持该寡核苷酸的功能方面。类似地，5 '和 3'侧翼区可被置换。在其它情况下，可确定寡核苷酸的仅一部分引导其功能性，使得其它部 分可被删除或置换。包括多种化学修饰在内的许多合成和修饰核苷酸及多核苷酸的技术在 此公开或是本领域已知的。
[0022] 在一方面，本发明还提供一种方法，其包括使寡核苷酸或多个寡核苷酸与样品接 触，并检测该寡核苷酸或多个寡核苷酸与样品中的靶标结合的存在或水平，其中该寡核苷 酸或多个寡核苷酸可以是本发明上文提供的那些。该样品可包括生物样品、有机样品、无机 样品、组织、细胞培养物、体液、血液、血清、细胞、微囊泡、蛋白质复合物、脂质复合物、碳水 化合物，或其任意组合、部分或变化形式。该靶标可包括细胞、细胞器、蛋白质复合物、脂蛋 白、碳水化合物、微囊泡、膜片段、小分子、重金属、毒素或药物。
[0023] 在相关的方面，本发明提供一种方法，其包括:a)使包含微囊泡的生物样品与寡核 苷酸探针文库接触，其中任选地该寡核苷酸探针文库包含本发明上文提供的寡核苷酸或多 个寡核苷酸;b)鉴定与微囊泡的至少一部分结合的寡核苷酸；以及c)根据鉴定出的寡核苷 酸谱来表征该样品。
[0024] 在另一方面，本发明提供一种方法，其包括:a)使样品与包含至少106、107、108、 "、…'加^加^加^加^加^加^⑴^个或至少⑴^个不同寡核苷酸序列的寡核苷酸 的寡核苷酸探针文库接触，以在溶液中形成混合物，其中该寡核苷酸能够结合样品中的多 个实体从而形成复合物，其中任选地该寡核苷酸探针文库包含如本发明上文提供的寡核苷 酸或多个寡核苷酸;b)将在步骤(a)中由混合物形成的复合物进行分区(partitioning) ;c) 检测在步骤(b)中分区的复合物中存在的寡核苷酸，以对该样品鉴定寡核苷酸谱。在一个实 施方案中，检测步骤包括对复合物中的全部或部分寡核苷酸进行测序，对复合物中的全部 或部分寡核苷酸进行扩增，和/或使复合物中的全部或部分寡核苷酸与阵列杂交。该阵列可 以是任何有用的阵列，如平面的或基于颗粒的阵列。
[0025] 在另一方面，本发明提供一种生成富集的寡核苷酸探针文库的方法，其包括:a)使 第一寡核苷酸文库与生物测试样品和生物对照样品接触，其中在生物样品中存在的生物实 体与第一寡核苷酸文库中存在的多个寡核苷酸之间形成复合物;b)将在步骤(a)中形成的 复合物进行分区，并分离该复合物中的寡核苷酸，以对生物测试样品和生物对照样品中的 每一个产生寡核苷酸的子集;c)使(b)中的寡核苷酸子集与生物测试样品和生物对照样品 接触，其中在生物样品中存在的生物实体与寡核苷酸子集中存在的第二多个寡核苷酸之间 形成复合物，以生成核苷酸的第二子集群组；以及d)任选地重复步骤b)_c)-次、两次、三次 或更多次，以产生寡核苷酸的各自第三、第四、第五或更多个子集群组，从而产生富集的寡 核苷酸探针文库。在相关的方面，本发明提供多个寡核苷酸，其包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、 6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、 100000、200000、300000、400000或500000个不同的寡核苷酸序列，其中所述多个寡核苷酸 由本段中的方法产生，其中该文库能够区分第一表型与第二表型。在一些实施方案中，第一 表型包括疾病或病症，且第二表型包括健康状态;或者其中第一表型包括疾病或病症，且第 二表型包括不同的疾病或病症;或者其中第一表型包括疾病或病症的阶段或进展，且该第 二表型包括相同疾病或病症的不同阶段或进展；或者其中第一表型包括对疗法的正面响 应，且该第二表型包括对相同疗法的负面响应。
[0026] 在又一方面，本发明提供一种表征疾病或病症的方法，其包括:a)使生物测试样品 与本发明提供的寡核苷酸或多个寡核苷酸接触;b)检测在步骤(a)中、在本发明提供的寡核 苷酸或多个寡核苷酸与生物测试样品中的靶标之间形成的复合物的存在或水平；以及c)将 在步骤(b)中检测到的存在或水平与来自生物对照样品的参考水平进行比较，从而表征疾 病或病症。检测步骤可包括对复合物中的全部或部分寡核苷酸进行测序，对复合物中的全 部或部分寡核苷酸进行扩增，和/或使复合物中的全部或部分寡核苷酸与阵列杂交。该测序 可以是高通量或新一代测序。
[0027] 在本发明的方法中，生物测试样品和生物对照样品可各自包含组织样品、细胞培 养物或生物流体。在一些实施方案中，该生物流体包含体液。在本发明的方法中有用的体液 包含外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、 母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper ' s fluid)或射精前液、女性射出 液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙 液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺 抽出物、囊胚腔液或脐带血。在一些优选的实施方案中，该体液包含血液、血清或血浆。该生 物流体可包含微囊泡。在这样的情况下，复合物可在寡核苷酸或多个寡核苷酸与至少一个 微囊泡之间形成。
[0028] 生物测试样品和生物对照样品可以进一步包含分离的微囊泡，其中任选地采用下 述中的至少一种来分离微囊泡:色谱法、过滤、超滤、离心、超速离心、流式细胞术、亲和捕获 (例如，捕获到平面、柱子或珠子上）、聚合物沉淀和使用微流体。囊泡也可在与所述寡核苷 酸或多个寡核苷酸接触后分离。
[0029] 在本发明的方法的多个实施方案中，所述寡核苷酸或多个寡核苷酸与多肽或其片 段结合。该多肽或其片段可以是可溶的或膜结合的，其中任选地该膜包括微囊泡膜。该膜也 可来自细胞，或囊泡的细胞的片段。在一些实施方案中，该多肽或其片段包含表3或表4中的 生物标志物。例如，该多肽或其片段可以是如表3中的一般囊泡标志物，或如表4中的组织相 关的或疾病相关的标志物。所述寡核苷酸或多个寡核苷酸可以与生物样品中的微囊泡表面 抗原结合。例如，所述寡核苷酸或多个寡核苷酸可针对微囊泡从天然文库中富集。
[0030] 通过本文提供的寡核苷酸、多个寡核苷酸或方法检测的疾病或病症可包括任何合 适的、感兴趣的疾病或病症，包括但不限于乳腺癌、阿尔茨海默病、支气管哮喘、膀胱移行细 胞癌、巨细胞破成骨细胞瘤、脑瘤、结直肠腺癌、慢性阻塞性肺疾病（C0PD)、宫颈鳞状细胞 癌、急性心肌梗死(AMI)/急性心力衰竭、克罗恩病、II型糖尿病、食管癌、喉部鳞状细胞癌、 骨髓的急性和慢性白血病、肺癌、恶性淋巴瘤、多发性硬化、卵巢癌、帕金森病、前列腺腺癌、 牛皮癣、类风湿性关节炎、肾细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、胃腺癌、甲状腺癌、睾丸癌、溃疡性结 肠炎或子宫腺癌。
[0031] 在一些实施方案中，该疾病或病症包括癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自 身免疫性疾病或病症、心血管疾病或病症、神经疾病或病症、感染性疾病或疼痛。该癌症可 包括但不限于以下之一：急性淋巴母细胞性白血病；急性髓样白血病；肾上腺皮质癌;AIDS 相关癌症;AIDS相关淋巴瘤;肛门癌；阑尾癌;星形细胞瘤;非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤;基 底细胞癌;膀胱癌;脑干胶质瘤;脑瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横 纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母 细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚瘤和松果体母细胞瘤）； 乳腺癌;支气管肿瘤;伯基特淋巴瘤;原发部位不明癌;类癌瘤;原发部位不明肿瘤；中枢神 经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎瘤；宫颈癌;儿童期癌症;脊索瘤； 慢性淋巴细胞白血病；慢性髓性白血病;慢性骨髓增殖性病症；结肠癌；结直肠癌；颅咽管 瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤;子宫内膜癌；室管膜母细胞瘤;室管膜瘤;食管 癌；成感觉神经细胞瘤(esthesioneuroblastoma);尤因肉瘤;颜外生殖细胞瘤;性腺外生殖 细胞瘤;肝外胆管癌;胆囊癌；胃（胃部)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质 瘤(GIST);妊娠滋养细胞瘤;神经胶质瘤;毛细胞白血病;头颈癌;心脏癌;霍奇金淋巴瘤;下 咽癌;眼内黑色素瘤;胰岛细胞瘤;卡波西肉瘤;肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症;喉癌； 唇癌;肝癌;肺癌;恶性纤维组织细胞瘤骨癌;髓母细胞瘤;髓上皮瘤;黑色素瘤;梅克尔细胞 癌;梅克尔细胞皮肤癌；间皮瘤;隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌;多发性内分泌肿瘤 综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤;蕈样肉芽肿;骨髓增生异常综合征;骨 髓增生性肿瘤;鼻腔癌;鼻咽癌；神经母细胞瘤;非霍奇金淋巴瘤;非黑色素瘤皮肤癌;非小 细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌;骨肉瘤;其它脑和脊髓肿瘤;卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生 殖细胞瘤;卵巢低恶性潜在肿瘤;胰腺癌;乳头状瘤病;副鼻窦癌；甲状旁腺癌;盆腔癌；阴茎 癌；咽癌；中度分化的松果体实质肿瘤;松果体母细胞瘤;垂体瘤;浆细胞肿瘤/多发性骨髓 瘤;胸膜肺母细胞瘤;原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤;原发性肝细胞性肝癌;前列腺癌； 直肠癌;肾癌;肾细胞(肾)癌;肾细胞癌;呼吸道癌;视网膜母细胞瘤;横纹肌肉瘤;唾液腺癌 症;塞扎里综合征;小细胞肺癌;小肠癌;软组织肉瘤;鳞状细胞癌;鳞状颈癌；胃部（胃）癌； 幕上原始神经外胚瘤;T细胞淋巴瘤;睾丸癌；咽喉癌;胸腺癌;胸腺瘤；甲状腺癌;移行细胞 癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌;滋养细胞瘤;输尿管癌;尿道癌;子宫癌;子宫肉瘤；阴道 癌;外阴癌;瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或维尔姆斯瘤。恶变前状况可包括但不限于巴雷特 食管。自身免疫性疾病可包括但不限于炎性肠病(IBD)、克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、 盆腔炎症、脉管炎、银肩病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化、重症肌无力、I型糖尿病、 类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮（SLE)、桥本甲状腺炎（Hashimotc/ s Thyroiditis)、格雷夫斯病（Grave7 s disease)、强直性脊柱炎、舍格伦病（Sjogrens Disease)、肢端硬皮综合征(CREST syndrome)、硬皮病、风湿病、器官排斥、原发性硬化性胆 管炎或脓毒症中的一种。心血管疾病可包括但不限于动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损 斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件中的一种。神经疾病可以包 括但不限于多发性硬化(MS)、帕金森病(PD)、阿尔兹海默病(AD)、精神分裂症、双相型障碍、 抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病(Picks disease)、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑 血管病、拉斯马森脑炎(Rasmusser/ s encephalitis)、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红 斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩侧索硬化、克雅氏病（Creutzfeldt-Jacob disease)、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如中风）、脑外伤、微生 物感染或慢性疲劳综合征中的一种。疼痛可包括但不限于纤维肌痛、慢性神经性疼痛或周 围神经性疼痛中的一种。感染性疾病可包括但不限于细菌感染、病毒感染、酵母菌感染、惠 普尔病(Whipple ' s Disease)、肮病毒病、硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝 炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病或流行性感冒中的一种。技术人员将会理解，本发明的寡核 苷酸或多个寡核苷酸或方法可用于评价任意数目的这些或其它相关的疾病和病症。
[0032] 在本发明的一些实施方案中，所述寡核苷酸或多个寡核苷酸及其使用方法对表征 某些疾病或疾病状态是有用的。按照需要，组装对表征各种疾病有用的寡核苷酸池，以创建 可用作对表征各种疾病有用的探针的主池。例如，本文提供的SEQ ID N0.510599-510763的 组合包含这样的池。技术人员还将会理解，还可以创建对表征特定疾病或病症有用的寡核 苷酸池。可以如本文所述对寡核苷酸及其池进行修饰。
[0033] 在一个实施方案中，该疾病或病症包括乳腺癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或 多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510559-510598中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、25、30个或至少40个。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、 插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0034] 在另一实施方案中，该疾病或病症包括阿尔兹海默病，并且对其表征有用的寡核 苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510604、510605、510608、510609、510612、 510614、510629、510632、510633、510634、510641、510642、510643、510646、510648、510649、 510651、510652、510653、510655、510661、510667、510673、510675、510676、510677、510678、 510679、510681、510683、510685、510687、510688、510690、510694、510696、510702、510707、 510709、510726、510727、510728、510729、510730、510731、510732、510737、510740、510748、 510749、510751、510752、510754、510756、510757、510758、510761和 510762中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。在相关的 实施方案中，该疾病或病症包括阿尔兹海默病，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核 苷酸包含SEQ ID Ν0·510599、510601、510603、510606、510608、510609、510611、510613、 510614、510615、510619、510621、510625、510628、510629、510630、510632、510634、510635、 510636、510637、510644、510647、510648、510651、510652、510654、510657、510665、510666、 510667、 510668、510677、510678、510679、510687、510692、510693、510696、510698、510699、 510701、510702、510707、510708、510710、510713、510716、510725、510726、510728、510731、 510732、510733、510734、510736、510741、510748、510749、510755、510757、510758、510761 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、 45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该 寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0035] 该疾病或病症可包括支气管哮喘，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸 包含SEQ ID Ν0·510601、510614、510619、510623、510627、510631、510633、510635、510647、 510655、510656、510660、510672、510689、510690、510693、510698、510701、510702、510707、 510709、510710、510713、510720、510723、510724、510726、510728、510729、510730、510731、 510734、510735、510738、510743、510744、510745、510746、510748、510749、510750、510751、 510752、510754、510755、510757、510758、510759、510760、510761和 510762中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。该疾病或 病症还可包括支气管哮喘，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID NO·510600、510608、510609、510610、510611、510617、510619、510622、510631、510632、 510634、510635、510637、510642、510643、510644、510652、510655、510657、510658、510665、 510668、 510673、510675、510676、510677、510678、510679、510683、510691、510701、510703、 510704、510706、510708、510709、510714、510725、510736、510737、510740、510741、510742 和 510756中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、 45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该 寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0036] 在一些实施方案中，该疾病或病症包括膀胱移行细胞癌，并且对其表征有用的寡 核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510607、510619、510623、510631、510632、510635、 510641、510642、510647、510656、510657、510658、510659、510673、510674、510683、510686、 510693、510695、510701、510702、510707、510708、510711、510716、510722、510725、510726、 510728、510731、510734、510737、510744、510748、510749、510751、510752、510753、510756、 510757、510758、510761和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、 置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0037] 在另一个实施方案中，该疾病或病症包括巨细胞破成骨细胞瘤，并且对其表征有 用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510612、510620、510635、510637、510641、 510644、510648、510658、510662、510663、510667、510668、510670、510676、510678、510679、 510682、510683、510685、510686、510699、510708、510712、510722、510737和510753中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。 寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能 方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0038] 该疾病或病症可包括脑瘤，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含 SEQ ID Ν0.510607、510619、510624、510628、510639、510641、510645、510647、510648、 510655、510657、510665、510668、510673、510674、510689、510695、510698、510699、510705、 510710、510711、510712、510713、510716、510734、510737、510738 和 510762中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸 可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整 体或部分上得到增强或保持即可。
[0039] 在另一实施方案中，该疾病或病症包括结直肠腺癌，并且对其表征有用的寡核苷 酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510603、510607、510611、510616、510618、510619、 510623、510624、510641、510644、510646、510647、510655、510656、510672、510673、510690、 510693、510695、510698、510701、510702、510709、510711、510714、510716、510719、510723、 510724、510725、510726、510730、510731、510734、510735、510737、510738、510743、510744、 510748、510749、510751、510752、510754、510755、510757、510758、510760、510761、510762 和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、 45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该 寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0040] 在又一实施方案中，该疾病或病症包括慢性阻塞性肺疾病(C0PD)，并且对其表征 有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510604、510608、510609、510612、510614、 510616、510619、510620、510629、510634、510637、510640、510647、510649、510653、510661、 510666、510667、510669、510673、510678、510682、510689、510690、510701、510707、510715、 510723、510727、510728、510749、510754、510755、510757、510758、510762和510763中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。 在相关的实施方案中，该疾病或病症包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)，并且对其表征有用的 寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510601、510609、510611、510613、510620、 510634、510637、510647、510648、510654、510664、510668、510679、510694、510696、510698、 510699、510701、510705、510706、510710、510718、510734和 510741 中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入 各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部 分上得到增强或保持即可。
[0041]该疾病或病症可以是宫颈鳞状细胞癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核 苷酸包含SEQ ID Ν0·510615、510619、510623、510626、510630、510632、510633、510635、 510638、510639、510641、510642、510644、510647、510650、510655、510656、510657、510661、 510673、510674、510677、510683、510688、510693、510695、510698、510711、510712、510714、 510716、510717、510722、510725、510729、510731、510734、510737、510743、510745、510747、 510753、510755、510756、510758、510759和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添 加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或 保持即可。
[0042] 该疾病或病症可包括急性心肌梗死(AM I)或急性心力衰竭，并且对其表征有用的 寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510607、510608、510613、510626、510629、 510631、510634、510635、510638、510639、510646、510648、510656、510667、510669、510671、 510672、510675、510682、510689、510698、510701、510707、510710、510715、510721、510723、 510727、510728、510730、510731、510734、510735、510743、510744、510748、510749、510751、 510752、510757、510758、510760、510761 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。在相关的实施方案中，该疾病或病 症包括急性心肌梗死(AMI)或急性心力衰竭，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷 酸包含SEQ ID N0.510599、510601、510606、510607、510608、510609、510611、510614、 510616、510619、510622、510624、510626、510635、510636、510637、510640、510641、510643、 510644、510648、510651、510665、510668、510669、510672、510675、510677、510678、510679、 510682、510692、510695、510696、510698、510699、510701、510703、510707、510710、510725、 510726、510728、510729、510730、510731、510733、510734、510736、510743、510750、510751、 510752、510755、510757、510758、510759、510760、510761和510762中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入 各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部 分上得到增强或保持即可。
[0043]在一些实施方案中，该疾病或病症包括克罗恩病，并且对其表征有用的寡核苷酸 或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510602、510608、510611、510624、510644、510653、 510656、510659、510669、510671、510676、510686、510689、510690、510697、510698、510700、 510713、510727、510728、510729、510731、510734、510744、510751和 510757中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。在相关的 实施方案中，该疾病或病症包括克罗恩病，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸 包含SEQ ID Ν0·510600、510610、510611、510615、510618、510621、510623、510625、510626、 510628、 510631、510632、510635、510637、510638、510643、510647、510648、510649、510653、 510654、510655、510657、510658、510666、510667、510668、510672、510675、510677、510678、 510679、510680、510682、510684、510689、510691、510694、510696、510698、510701、510707、 510708、510709、510710、510713、510714、510715、510719、510725、510727、510728、510729、 510730、510731、510734、510736、510738、510743、510744、510748、510750、510751、510755、 510757、510758、510759、510760、510761、510762和510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入各种化 学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得 到增强或保持即可。
[0044] 该疾病或病症可包括II型糖尿病，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸 包含SEQ ID Ν0·510600、510604、510608、510610、510611、510614、510616、510620、510624、 510629、 510632、510634、510640、510649、510667、510669、510670、510671、510678、510685、 510700、510701、510702、510707、510709、510718、510721、510723、510726、510727、510728、 510729、510730、510731、510733、510735、510743、510748、510749、510752、510754、510755、 510757、510758、510760、510761、510762和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。相关地，该疾病或病症可包括II型 糖尿病，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510613、510632、 510635、510636、510641、510645、510647、510648、510654、510660、510664、510667、510668、 510670、510675、510684、510691、510695、510696、510706、510710、510734和510749中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。 寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能 方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0045] 在一些实施方案中，该疾病或病症包括食管癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或 多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510602、510619、510623、510632、510635、510638、510641、 510644、510653、510656、510661、510671、510682、510689、510693、510698、510714、510722、 510725、510731、510734、510738、510753 和 510761 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添 加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或 保持即可。
[0046] 在另一实施方案中，该疾病或病症包括喉部鳞状细胞癌，并且对其表征有用的寡 核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510605、510607、510612、510614、510619、510623、 510632、510635、510641、510642、510655、510656、510657、510659、510661、510668、510673、 510674、510689、510690、510693、510695、510698、510708、510712、510732、510734、510737、 510738、510745、510747、510753 和 510755中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺 失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即 可。
[0047] 在又一实施方案中，该疾病或病症包括骨髓的急性或慢性白血病，并且对其表征 有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510605、510607、510610、510612、 510628、510631、510633、510641、510644、510650、510664、510670、510673、510674、510675、 510681、510684、510685、510686、510701、510711、510712、510717、510718、510719、510720、 510721、510724、510729、510732、510739、510740、510743、510745、510746、510747、510752、 510754 和 510763 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、 30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰， 只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0048] 在又一实施方案中，该疾病或病症包括肺癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或多 个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510604、510626、510628、510631、510633、510635、510649、 510650、510654、510668、510672、510674、510677、510699、510701、510702、510710、510712、 510715、510717、510719、510720、510721、510723、510724、510726、510727、510733、510735、 510738、510743、510744、510745、510746、510747、510750、510751、510754、510755、510758、 510760 和 510763 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、 30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰， 只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0049] 该疾病或病症可包括恶性淋巴瘤，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸 包含SEQ ID Ν0·510601、510611、510618、510623、510624、510631、510632、510636、510638、 510641、510644、510645、510647、510656、510660、510662、510672、510673、510675、510690、 510693、510701、510702、510707、510708、510713、510717、510719、510721、510723、510724、 510725、510726、510728、510729、510730、510731、510734、510735、510737、510743、510744、 510749、510751、510752、510754、510755、510756、510757、510758、510760、510762和510763 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或 全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸 的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0050] 该疾病或病症还可包括多发性硬化，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷 酸包含SEQ ID Ν0 · 510607、510612、510620、510646、510653、510655、510661、510663、 510669、510675、510682、510685、510686、510690、510699、510701、510710、510713、510731、 510738、510747、510758 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。相关地，该疾病或病症可包括多发性硬化，并且对 其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510599、510604、510609、510610、 510613、510617、510618、510622、510632、510635、510647、510670、510675、510677、510687、 510690、510692、510695、510701、510706、510708、510731和510733中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入 各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部 分上得到增强或保持即可。[0051 ]在一个实施方案中，该疾病或病症包括卵巢癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或 多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510618、510626、510628、510633、510638、510641、510642、 510643、510645、510646、510647、510650、510652、510658、510665、510666、510673、510674、 510677、510682、510683、510689、510705、510707、510712、510717、510722、510724、510729、 510732、510735、510737、510745、510746、510747、510753和510756中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入 各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部 分上得到增强或保持即可。
[0052] 在另一实施方案中，该疾病或病症包括帕金森病，并且对其表征有用的寡核苷酸 或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510601、510604、510608、510609、510612、510614、 510624、510631、510633、510634、510640、510641、510642、510649、510650、510651、510653、 510667、510673、510675、510676、510677、510683、510686、510689、510694、510700、510703、 510704、510705、510706、510707、510709、510713、510715、510721、510723、510724、510726、 510727、510729、510730、510731、510732、510734、510735、510736、510737、510739、510740、 510741、510742、510744、510745、510746、510747、510748、510751、510752、510754、510756、 510757、 510758、510759、510760、510761 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。在相关的实施方案中，该疾病或病 症包括帕金森病，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510601、 510606、510608、510609、510610、510614、510616、510632、510634、510643、510644、510647、 510648、510654、510662、510664、510665、510667、510668、510670、510677、510678、510679、 510687、510692、510696、510698、510699、510701、510703、510704、510706、510708、510710、 510722、510727、510734、510736、510741、510742、510753和510756中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入 各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部 分上得到增强或保持即可。
[0053] 在又一个实施方案中，该疾病或病症包括前列腺腺癌，并且对其表征有用的寡核 苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510603、510607、510619、510623、510624、 510628、510641、510642、510644、510647、510650、510655、510656、510657、510669、510673、 510674、510677、510684、510688、510689、510690、510695、510698、510701、510709、510710、 510718、510726、510734、510737、510738、510739、510757 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入 各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部 分上得到增强或保持即可。
[0054] 在又一实施方案中，该疾病或病症包括牛皮癣，并且对其表征有用的寡核苷酸或 多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510601、510608、510609、510611、510614、510620、 510624、510626、510631、510633、510634、510635、510638、510647、510649、510650、510653、 510656、510665、510666、510667、510669、510672、510674、510675、510680、510685、510689、 510698、510702、510707、510711、510712、510715、510717、510719、510720、510721、510723、 510724、510726、510727、510728、510729、510730、510731、510734、510735、510743、510744、 510745、510746、510747、510748、510749、510750、510751、510752、510754、510755、510757、 510758、 510759、510760、510761、510762和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添 加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或 保持即可。
[0055] 该疾病或病症可以是牛皮癣，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含 SEQ ID N0.510600、510601、510604、510613、510621、510627、510637、510641、510644、 510648、510650、510652、510663、510667、510668、510676、510680、510681、510699、510701、 510703、510705、510709、510710、510722、510734、510739、510750 和 510753中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸 可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整 体或部分上得到增强或保持即可。
[0056] 该疾病或病症还可以是类风湿性关节炎，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡 核苷酸包含SEQ ID Ν0·510599、510603、510604、510607、510608、510609、510614、510616、 510622、 510625、510627、510629、510630、510634、510635、510636、510637、510640、510642、 510646、510649、510650、510651、510653、510656、510664、510665、510667、510671、510675、 510677、510678、510679、510682、510689、510699、510707、510726、510727、510728、510729、 510731、510733、510737、510738、510748、510755、510758、510761和 510762中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸 可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整 体或部分上得到增强或保持即可。
[0057] 在一些实施方案中，该疾病或病症包括类风湿性关节炎，并且对其表征有用的寡 核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510599、510601、510603、510604、510606、510607、 510608、510609、510610、510611、510612、510613、510614、510616、510617、510618、510622、 510623、 510625、510629、510630、510634、510635、510636、510637、510638、510639、510640、 510641、510643、510644、510645、510646、510648、510649、510651、510652、510653、510654、 510658、510662、510663、510664、510665、510666、510667、510668、510669、510671、510673、 510677、510678、510679、510682、510685、510692、510696、510697、510698、510699、510701、 510703、510710、510716、510722、510725、510726、510727、510730、510733、510734、510738、 510741、510743、510753、510755 和 510757中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺 失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即 可。
[0058] 在另一实施方案中，该疾病或病症包括肾细胞癌，并且对其表征有用的寡核苷酸 或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510603、510604、510606、510608、510614、510616、 510622、510628、510629、510630、510632、510634、510635、510640、510644、510645、510646、 510652、510653、510656、510664、510665、510666、510667、510671、510675、510677、510683、 510685、510687、510690、510701、510722、510726、510728、510729、510730、510731、510732、 510733、510734、510738、510748、510749、510752、510753、510758、510761和510762中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。 寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能 方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0059] 在又一实施方案中，该疾病或病症包括皮肤鳞状细胞癌，并且对其表征有用的寡 核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510618、510622、510626、510639、510641、510642、 510650、510658、510673、510674、510683、510696、510708、510712、510717、510720、510722、 510723、510724、510727、510729、510743、510745、510746、510747、510752、510753、510754、 510755、510756、510759、510761和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺 失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即 可。
[0060] 在多个实施方案中，该疾病或病症包括胃腺癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或 多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510604、510608、510609、510612、510626、510631、 510632、510634、510639、510653、510658、510663、510667、510681、510689、510692、510693、 510696、510698、510699、510705、510711、510715、510717、510719、510723、510725、510729、 510731、510734、510735、510736、510743、510746、510748、510751、510754、510757、510760、 510762 和 510763 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、 30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰， 只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0061] 该疾病或病症可包括甲状腺癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包 含SEQ ID Ν0·510602、510603、510614、510626、510638、510641、510644、510646、510653、 510658、510659、510661、510662、510674、510689、510693、510695、510698、510699、510701、 510704、510705、510708、510717、510718、510722、510727、510731、510734、510736、510739、 510740、510741、510747、510753 和 510755中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺 失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即 可。
[0062] 该疾病或病症还可包括睾丸癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包 含SEQ ID Ν0·510600、510603、510607、510615、510616、510618、510619、510621、510622、 510623、 510624、510630、510636、510637、510641、510644、510645、510647、510650、510654、 510655、510656、510657、510659、510662、510665、510670、510673、510674、510681、510684、 510685、510687、510688、510689、510690、510692、510693、510695、510696、510698、510700、 510701、510704、510707、510712、510713、510717、510718、510726、510734、510737、510738、 510739、510740、510742、510747、510756 和 510757中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添 加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或 保持即可。
[0063] 该疾病或病症可以是溃疡性结肠炎，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷 酸包含SEQ ID Ν0.510599、510607、510611、510612、510616、510620、510621、510622、 510624、 510626、510632、510633、510636、510646、510655、510659、510672、510673、510675、 510676、510677、510682、510684、510691、510692、510702、510703、510704、510705、510706、 510707、510709、510710、510715、510721、510723、510724、510728、510729、510730、510731、 510735、510736、510737、510739、510740、510741、510743、510744、510748、510751、510752、 510754、510757、510758、510759、510760、510761和510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。在相关的实施方案中，该 疾病或病症包括溃疡性结肠炎，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID NO·510610、510611、510612、510619、510622、510623、510634、510635、510641、510647、 510648、510654、510657、510664、510668、510670、510671、510676、510677、510678、510679、 510689、510691、510696、510701、510703、510704、510710、510722、510734、510742和510753 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或 全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸 的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0064] 该疾病或病症还可以是子宫腺癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸 包含SEQ ID Ν0·510601、510612、510621、510626、510637、510641、510644、510650、510653、 510669、510675、510684、510686、510687、510696、510714、510717、510722、510739、510743、 510745、510746、510753、510755 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺 失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即 可。
[0065] 在一方面，本发明提供一种试剂盒，其包含用于实施本文中提供的本发明方法的 试剂。在类似的方面，本发明考虑试剂用于实施本文提供的本发明方法的用途。在实施方案 中，该试剂包含寡核苷酸或多个寡核苷酸。该寡核苷酸或多个寡核苷酸可以是本文提供的 那些。该试剂可包含多种其它有用的组分，包括但不限于以下的一种或多种:a)被配置用于 分离微囊泡的试剂，任选地其中至少一种被配置用于分离微囊泡的试剂包含针对微囊泡抗 原、柱子、基底、过滤单元、聚合物、聚乙二醇、PEG4000、PEG8000、颗粒或珠子的结合剂;b)至 少一种被配置充当引物或探针以供扩增、测序、杂交或检测该寡核苷酸或多个寡核苷酸的 寡核苷酸;和c)被配置用于从样品中去除一种或多种高丰度蛋白质的试剂，其中任选地该 一种或多种高丰度蛋白质包括白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白中的至少一种。 [0066] 在另一方面，本发明提供一种适体，其包含与以下任一项至少约50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源的核酸序列： a)如表8所述的SEQ ID N0.8-21或其可变序列；b)如表11所述的SEQ ID N0.24-43或其可变 序列；c)SEQIDN0.44-10527;d)如表12所述的SEQIDN0.10528-10557或其可变序列，或 e)任何前述序列的功能片段。该适体可识别微囊泡表面抗原。本发明的适体在此可以以DNA 或RNA的形式得到鉴定。除非另有说明，本领域技术人员将会理解，适体可通常以核酸的各 种形式合成。适体还可携带各种化学修饰而仍在本发明的范围内。
[0067] 在一些实施方案中，本发明的适体经修饰以包含至少一种化学修饰。该修饰可包 括但不限于在核酸的糖位置处的化学取代;在磷酸位置处的化学取代；以及在碱基位置处 的化学取代。在一些实施方案中，该修饰选自下组:生物素化，荧光标记的引入，经修饰的核 苷酸的并入，2'-修饰的嘧啶，3'加帽，与胺接头的缀合，与高分子量、非免疫原性化合物的 缀合，与亲脂性化合物的缀合，与药物的缀合，与细胞毒性部分的缀合，以及用放射性同位 素标记，或其它本文公开的修饰。修饰的位置可根据期望而变化。例如，生物素化、荧光标记 或细胞毒性部分可与该适体的5'末端缀合。生物素化、荧光标记或细胞毒性部分还可与该 适体的3'末端缀合。
[0068] 在一些实施方案中，细胞毒性部分封装在纳米颗粒中。该纳米颗粒可选自：脂质 体、树状聚体和梳状聚合物。在其它实施方案中，细胞毒性部分包括小分子细胞毒性部分。 该小分子细胞毒性部分可包括但不限于长春碱酰肼、加利车霉素、长春花生物碱、念珠藻 素、微管溶素（tubulysin)、尾海兔素-10、尾海兔素-15、阿里他汀E(auristatin E)、根霉 素、埃博霉素 B、埃博霉素 D、紫杉烷、美登素，及其任意变体及衍生物。在其它实施方案中，该 细胞毒性部分包含蛋白质毒素。例如，该蛋白质毒素可选自白喉毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆 毒蛋白、白树毒素和假单胞菌外毒素 A。与本发明一起使用的非免疫原性的高分子量化合物 包括聚亚烷基二醇，例如，聚乙二醇。合适的放射性同位素包括钇-90、铟-111、碘-131、镥-177、铜-67、铼-186、铼-188、铋-212、铋-213、砹-211和锕-225。适体可以用发射γ射线的放 射性同位素进行标记。
[0069] 在本发明的一些实施方案中，活性剂与适体缀合。例如，该活性剂可以是治疗剂或 诊断剂。该治疗剂可选自酪氨酸激酶抑制剂、激酶抑制剂、生物活性剂、生物分子、放射性核 素、阿霉素、安沙霉素抗生素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺铂、卡铂、卡莫司汀、卡培他 滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、右雷佐生、多 西紫杉醇、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、 伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯基嘌呤、美法仑、氨甲蝶呤、雷帕霉素 (西罗莫司）、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉酚、帕米膦酸盐、喷司他丁、普利 霉素、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链脲菌素、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、噻替派、紫杉烷、长春碱、长春 新碱、长春瑞滨、紫杉醇、考布他汀、discodermolides、反钼（transplatinum)、抗血管内皮 生长因子化合物（"抗VEGF"）、抗表皮生长因子受体化合物（"抗EGFR"）、5_氟尿嘧啶及其衍 生物、放射性核素、多肽毒素、凋亡诱导剂、治疗敏化剂、酶或其活性片段，以及它们的组合。
[0070] 本发明进一步提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述适体或其盐，以及 药学上可接受的载体或稀释剂。本发明还提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的适体 或其盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。相关地，本发明提供一种治疗或改善疾病或病 症的方法，其包括向有需要的受试者施用该药物组合物。向受试者施用治疗有效量的该组 合物可导致：（a)相对于单独递送活性剂，活性剂向病变部位的递送得到增强;或(b)微囊泡 清除得到增强，导致被适体靶向的微囊泡的血液水平降低至少10 %、20 %、30 %、40 %、 50 %、60 %、70 %、80 %或90 % ;或(c)被适体靶向的微囊泡的生物活性降低至少10 %、20 %、 30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %。在一个实施方案中，微囊泡的生物活性包括免疫 抑制或遗传信息的转移。该疾病或病症可包括但不限于本文公开的那些。例如，该疾病或病 症可包括赘生性、增生性或炎性的、代谢性、心血管的或神经性的疾病或病症。见上文，进一 步见"表型"部分。[0071 ]本发明还提供包含本文公开的适体或其药物组合物的试剂盒。
[0072]在一方面，本发明提供一种方法，其包括使如上述的适体与生物样品接触，以及检 测该适体与生物样品中微囊泡的结合的存在与否。如本文公开的，该生物样品可以是组织、 流体或细胞培养样品。例如，该生物样品可以包含血液或血液组分。在一些实施方案中，适 体在与生物样品接触之前与基底缀合。例如，该基底可包括珠子或平板孔。适体也可以与可 检测的标记缀合。本文提供了该方法的各种配置。例如，见图2A-2B和16A。
[0073] 在相关的方面，本发明提供一种检测怀疑包含微囊泡群体的生物样品中微囊泡群 体的存在或水平的方法，其包括使该生物样品与一种或多种对该微囊泡群体具有特异性的 结合剂以及一种或多种如上所述的适体接触，并检测被该一种或多种结合剂和该一种或多 种适体两者识别的微囊泡，从而检测该生物样品中微囊泡群体的存在或水平。
[0074] 该生物样品可以是组织样品、细胞培养物或体液。该体液可以是任何有用的流体， 包括但不限于以下的一种或多种：外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、 骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或射精前 液、女性射出液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳 糜、胆汁、间隙液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗 液、支气管肺抽出物、囊胚腔液和脐带血。在一些实施方案中，该体液包括血液、血清或血 浆。
[0075] 任何有用的结合剂均可在本方法中使用。在一些实施方案中，该一种或多种结合 剂包括针对选自表3、表4及其组合的微囊泡表面抗原的抗体或适体。例如，该一种或多种结 合剂可以是针对选自下组的微囊泡表面抗原的抗体或适体:EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、 PSMA、B7H3、PSCA、I CAM、STEAP、KLK2、SSX2、SSX4、PBP、SPDEF、EGFR及其组合。该一种或多种 结合剂也可以包括针对选自下组的微囊泡表面抗原的抗体或适体:EGFR、TOP、EpCAM、KLK2 及其组合。
[0076] 本发明考虑到多种配置。例如，可采用"夹心"形式。例如，见图2A-2B。在该方法的 一些实施方案中，一种或多种结合剂在与生物样品接触之前与基底缀合。在该配置中，一种 或多种适体可与可检测的标记缀合，以充当检测剂。在其它实施方案中，一种或多种结合剂 与可检测的标记缀合。在该配置中，一种或多种适体可在与生物样品接触之前与基底缀合， 以充当捕获剂。此外，一种或多种适体可在与生物样品接触之前与基底缀合，并且/或者一 种或多种适体与可检测的标记缀合。在这类情况下，一种或多种适体可充当捕获剂和检测 剂中的任一种或两者。
[0077] 在另一个相关的方面，本发明提供一种表征疾病或病症的方法，其包括：（a)使生 物测试样品与一种或多种如本文提供的适体接触；（b)检测在步骤(a)中在所述一种或多种 适体与生物测试样品中被所述一种或多种适体结合的靶标之间形成的复合物的存在或水 平；以及（c)将在步骤(b)中检测到的存在或水平与来自生物对照样品的参考水平进行比 较，从而表征疾病或病症。该参考水平可来源于在健康样品个体，例如，未患有或不知患有 该疾病或病症的个体中的靶标的水平。该参考水平也可以来源于具有得到治疗的、受到控 制的或者替代的疾病的个体或样品。
[0078] 生物测试样品和生物对照样品可各自包含组织样品、细胞培养物或生物流体。在 一些实施方案中，该生物流体包含体液。该体液可以是任何有用的流体，包括但不限于以下 一种或多种：外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF )、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊 水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或射精前液、女性射出液、汗液、 粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、 脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽出物、囊 胚腔液或脐带血。在一些实施方案中，该体液包含血液、血清或血浆。该生物流体可包含或 被怀疑包含微囊泡。
[0079] 所述一种或多种适体可与多肽或其片段结合。根据需要，该结合可以是混杂的或 选择性的。该多肽或其片段可以是可溶的或膜结合的，例如，在微囊泡或细胞片段的膜中。 该多肽或其片段包含表3或表4中的生物标志物。该一种或多种适体可与生物样品中的微囊 泡表面抗原结合。
[0080] 本文提供的检测适体与微囊泡的结合或表征疾病或病症的方法可包括提供该疾 病或病症的诊断、预后或治疗诊断。该疾病或病症可包括但不限于本文公开的那些。例如， 该疾病或病症可包括癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或病症、心血 管疾病或病症、神经疾病或病症、感染性疾病和/或疼痛。例如，见本文中的"表型"部分。
[0081] 本发明还提供一种试剂盒，其包含用于实施本文方法的试剂，且还提供该试剂用 于实施与本发明的适体有关的方法的用途。例如，该试剂可包含本文公开的适体。该试剂还 可包含其它本文公开的有用的组分，包括但不限于以下至少一种:a)被配置用于分离微囊 泡的试剂，任选地其中至少一种被配置用于分离微囊泡的试剂包含针对微囊泡抗原、柱子、 基底、过滤单元、聚合物、聚乙二醇、PEG4000、PEG8000、颗粒或珠子的结合剂;b)至少一种被 配置充当引物或探针以扩增、测序、杂交或检测该寡核苷酸或多个寡核苷酸的寡核苷酸;和 c)被配置用于从样品中去除一种或多种高丰度蛋白质的试剂，其中任选地该一种或多种高 丰度蛋白质包含白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白中的至少一种。
[0082] 在一方面，本发明提供一种组合物，其包含用于评估细胞或细胞外囊泡样品的输 入寡核苷酸文库，该文库包含至少两个子集寡核苷酸文库以生成输入寡核苷酸文库，其中 该至少两个子集寡核苷酸文库中的至少一个以总G和C含量不等于50%的核苷酸的量来制 备。例如，总G和C含量可以小于50 %，或者总G和C含量可以大于50 %。在一个实施方案中，制 备总G和C含量大于50 %的至少一个子集文库，并且制备总G和C含量小于50 %的另一个子集 文库。在一个实施方案中，该至少两个子集文库包含分别以25 %、50 %和75%的G和C含量制 备的三个子集文库。该至少两个子集文库可以以与表13中的至少两行类似或相等的核苷酸 含量来制备。根据需要，该核苷酸可由天然存在的核苷酸或经修饰的天然存在的核苷酸组 成。该核苷酸还可包括非天然存在的核苷酸。在本文中，这类输入寡核苷酸文库可以被称为 "GC"文库。
[0083] 在相关的方面，本发明提供一种生成本发明的输入寡核苷酸文库的方法，其包括 使至少两个子集寡核苷酸文库接触，以生成该输入寡核苷酸文库。可采用本文所述的方法 对输入寡核苷酸文库进行筛选或富集，以提供各种适体或寡核苷酸探针文库。
[0084] 在一个方面，本发明提供一种寡核苷酸，其具有包含5'转座子衔接子区域、包含0 个或更多个位于该转座子衔接子区域5'侧的核苷酸的偏移区域、位于该偏移区域5'侧的可 变区域以及位于该可变区域5'侧的左侧引物区域的序列。在相关的方面，本发明提供多个 寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、 800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、 50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、10 6、107、108、 109、101(3、10 11、1012、1013、1014、1015、10 16、1017个或至少1018个不同的寡核苷酸序列，其中每 一个寡核苷酸序列均包含5'转座子衔接子区域、包含0个或更多个位于该转座子衔接子区 域5'侧的核苷酸的偏移区域、位于该偏移区域5'侧的可变区域以及位于该可变区域5'侧的 左侧引物区域。这类寡核苷酸在此可被称为"平衡"寡核苷酸。
[0085] 本发明的平衡寡核苷酸或多个寡核苷酸可如下所述:a)转座子衔接子区域包含 20-40个核苷酸;b)偏移区域包含0、l、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸 ;c)可变区域包含20-50个核苷酸;和/或d)左侧引物区域包含20-40核苷酸。在一些实施方案中，该平衡寡核苷酸 如下所述:a)转座子衔接子区域包含与序列5 ' -TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG (SEQ ID 吣.510764)至少约约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%或100%同源的核苷酸序列;b)偏移区域包含与以下序列中的至少一个至 少约 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源的l、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸：5'-T(SEQIDN0·510765)、5'-CT(SEQID N0.510766)和5'-ACT(SEQ ID N0.510767);c)可变区域包含20、21、22、23、24、25 26 27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷 酸；和/或d)左侧引物区域包含与选自SEQ ID NO. 510768和510769的序列至少约50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源的 核苷酸序列。该可变区域可包含如本文提供的"GC"文库序列。
[0086] 在一方面，本发明提供一种鉴定适体的方法，其包括使用平衡寡核苷酸或多个寡 核苷酸作为天然输入文库进行选择或富集过程。本文中描述或提供了这样的选择或富集过 程，包括但不限于SELEX及其变化形式。在一个实施方案中，该选择过程包括至少一轮针对 感兴趣的靶标的阳性选择，以及任选的至少一轮针对除了该感兴趣的靶标之外的靶标的阴 性选择。
[0087] 在另一方面，本发明提供一种方法，其包括使平衡寡核苷酸或多个平衡寡核苷酸 与样品接触，并检测该寡核苷酸或多个寡核苷酸与样品中靶标的结合的存在或水平。该样 品可包括生物样品，如有机样品、无机样品、组织、细胞培养物、体液、血液、血清、细胞、微囊 泡、蛋白质复合物、脂质复合物、碳水化合物，或其任意组合、部分或变化形式。该靶标可以 是任何有用的靶标，包括但不限于细胞、细胞器、蛋白质复合物、脂蛋白、碳水化合物、微囊 泡、膜片段、小分子、重金属、毒素或药物。
[0088] 在相关的方面，本发明提供一种方法，其包括:a)使包含微囊泡的生物样品与寡核 苷酸探针文库接触，其中该寡核苷酸探针文库包含平衡寡核苷酸或多个平衡寡核苷酸;b) 鉴定与微囊泡的至少一部分结合的寡核苷酸；以及c)根据鉴定出的寡核苷酸谱来表征该样 品。
[0089] 在另一个相关的方面，本发明提供一种方法，其包括:a)使样品与包含至少106、 寡核苷酸的寡核苷酸探针文库接触，以在溶液中形成混合物，其中该寡核苷酸能够结合样 品中的多个实体从而形成复合物，其中该寡核苷酸探针文库包含平衡寡核苷酸或多个平衡 寡核苷酸;b)将在步骤(a)中由混合物形成的复合物进行分区；以及c)检测在步骤(b)中分 区的复合物中存在的寡核苷酸，以对样品鉴定寡核苷酸谱。在相关的方面，本发明提供一种 表征疾病或病症的方法，其包括:a)使生物测试样品与平衡寡核苷酸或多个平衡寡核苷酸 接触;b)检测在步骤(a)中、在平衡寡核苷酸或多个寡核苷酸与生物测试样品中的靶标之间 形成的复合物的存在或水平；以及C)将在步骤(b)中检测到的存在或水平与来自生物对照 样品的参考水平进行比较，从而表征该疾病或病症。检测步骤可包括对复合物中的全部或 部分寡核苷酸进行测序，对复合物中的全部或部分寡核苷酸进行扩增，和/或使复合物中的 全部或部分寡核苷酸与阵列杂交。在一些实施方案中，该测序包括高通量测序。
[0090] 在包括使用平衡寡核苷酸或多个平衡寡核苷酸的本发明方法中，生物测试样品和 生物对照样品可各自包含组织样品、细胞培养物或生物流体。在一些实施方案中，该生物流 体包含体液。在本发明的方法中有用的体液可包含外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液 (CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考 珀液或射精前液、女性射出液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋 巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰 液、窦腔灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或脐带血。在一些优选的实施方案中，该体液包 含血液、血清或血浆。该生物流体可包含微囊泡。在这样的情况下，可在寡核苷酸或多个寡 核苷酸与至少一个微囊泡之间形成复合物。生物测试样品和生物对照样品还可包含分离的 微囊泡，其中任选地该微囊泡采用下述中的至少一种来分离:色谱法、过滤、超滤、离心、超 速离心、流式细胞术、亲和捕获(例如，捕获到平面、柱子或珠子上）、聚合物沉淀和使用微流 体。囊泡也可在与寡核苷酸或多个寡核苷酸接触后分离。
[0091] 在包括使用平衡寡核苷酸或多个寡核苷酸的本发明方法的实施方案中，该寡核苷 酸或多个寡核苷酸与多肽或其片段结合。该多肽或其片段可以是可溶的或膜结合的，其中 任选地该膜包括微囊泡膜。该膜也可来自细胞，或囊泡的细胞的片段。在一些实施方案中， 该多肽或其片段包含表3或表4中的生物标志物。例如，该多肽或其片段可以是如表3中的一 般囊泡标志物，或是如表4中的组织相关或疾病相关的标志物。该寡核苷酸或多个寡核苷酸 可与生物样品中的微囊泡表面抗原结合。例如，该寡核苷酸或多个寡核苷酸可针对微囊泡 从天然文库中富集。
[0092] 通过本文提供的寡核苷酸、多个寡核苷酸或包括使用平衡寡核苷酸或多个平衡寡 核苷酸的方法所检测的疾病或病症可包括任何合适的感兴趣的疾病或病症。例如，该疾病 或病症可包括癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或病症、心血管疾病 或病症、神经疾病或病症、感染性疾病和/或疼痛。例如，见本文中的"表型"部分。该疾病或 病症可包括但不限于乳腺癌、阿尔茨海默病、支气管哮喘、膀胱移行细胞癌、巨细胞破成骨 细胞瘤、脑瘤、结直肠腺癌、慢性阻塞性肺疾病（C0PD)、宫颈鳞状细胞癌、急性心肌梗死 (AMI)/急性心力衰竭、克罗恩病、II型糖尿病、食管癌、喉部鳞状细胞癌、骨髓的急性和慢性 白血病、肺癌、恶性淋巴瘤、多发性硬化、卵巢癌、帕金森病、前列腺腺癌、牛皮癣、类风湿性 关节炎、肾细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、胃腺癌、甲状腺癌、睾丸癌、溃疡性结肠炎或子宫腺癌。
[0093] 本发明还提供一种试剂盒，其包含用于实施本文方法的试剂，且还提供该试剂用 于实施本发明的与GC文库或平衡寡核苷酸有关的方法的用途。例如，该试剂可包含一个或 多个寡核苷酸，该寡核苷酸具有来源于GC文库和/或平衡寡核苷酸文库的序列。该试剂还可 包含其它本文公开的有用的组分，包括但不限于以下至少一种:a)被配置用于分离微囊泡 的试剂，任选地其中至少一种被配置用于分离微囊泡的试剂包含针对微囊泡抗原、柱子、基 底、过滤单元、聚合物、聚乙二醇、PEG4000、PEG8000、颗粒或珠子的结合剂 ;b)至少一种被配 置充当引物或探针以扩增、测序、杂交或检测该寡核苷酸或多个寡核苷酸的寡核苷酸;和c) 被配置用于从样品中去除一种或多种高丰度蛋白质的试剂，其中任选地该一种或多种高丰 度蛋白质包含白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白中的至少一种。附图说明
[0094] 图1示出竞争性试验选择策略:将适体的随机池(文库）与靶蛋白一一在该情况下 为EpCAM-一一起温育。在从靶标洗涤和洗脱之后，将洗脱的适体再次添加至靶标并使其结 合。然后将抗体添加至该反应，从而在该抗体的表位处与适体竞争。然后收集被该抗体替换 的适体。
[0095] 图2A-2F示出评价生物标志物如微囊泡表面抗原的方法。图2A是涂覆有捕获剂如 适体或抗体的平面基底的示意图，该捕获剂捕获表达该捕获剂的靶抗原的囊泡。该捕获剂 可结合在从病变细胞（"疾病细胞"）脱落的囊泡的表面上表达的蛋白质。同样可以是适体或 抗体的检测剂带有可检测的标记，在此处为荧光信号。检测剂结合被捕获的囊泡并通过其 荧光标记提供可检测的信号。检测剂可检测通常与囊泡关联的或与起源细胞或疾病例如癌 症相关的抗原。图2B是与捕获剂缀合的颗粒珠子的图示，其捕获表达该捕获剂的靶抗原的 囊泡。该捕获剂可结合在从病变细胞（"疾病细胞"）脱落的囊泡的表面上表达的蛋白质。同 样可以是适体或抗体的检测剂带有可检测的标记，在此处为荧光信号。检测剂结合被捕获 的囊泡并通过其荧光标记提供可检测的信号。检测剂可检测通常与囊泡关联的或与起源细 胞或疾病例如癌症相关的抗原。图2C是筛选方案的示例，该方案可通过采用针对指定生物 标志物的捕获剂和检测剂的不同组合来实施。生物标志物组合可采用如图2A-2B中所示的 试验来检测。图2D-2E呈现用于捕获和检测囊泡以表征表型的说明性流程。图2F呈现用于评 价囊泡有效负载以表征表型的说明性流程。
[0096]图3A-3B示出适体核苷酸序列及其二级结构的非限制性实例。图3A示出序列为5'-CCCCCCGAATCACATGACTTGGGCGGGGGTCG(SEQ ID NO. 1)的32聚体(32-mer)寡核苷酸-适体4的 二级结构。在该图中，示出的序列具有6个添加至末端的胸腺嘧啶核苷酸，其可以充当附接 生物素分子的间隔区。该特定的寡核苷酸对靶标EpCAM具有高结合亲和力（见表5)。其它候 选EpCAM结合剂通过将经测序的寡核苷酸的整个数据库建模为该寡核苷酸的二级结构来鉴 定。图3B示出另一种序列为5 ' -ACCGGATAGCGGTTGGAGGCGTGCTCCACTCG(SEQ ID N0· 2)的32聚 体寡核苷酸，其具有与图3A中的适体不同的二级结构。示出的该适体也具有6-胸腺嘧啶尾。
[0097]图4示出采用细胞消减法产生靶标特异性的一组适体的过程，其中该靶标是与特 定疾病相关的生物标志物。在步骤1中，使寡核苷酸的随机池与来自正常患者的生物样品接 触。在步骤2中，将在步骤1中未结合的寡核苷酸添加至从疾病患者中分离的生物样品。然后 洗脱来自该步骤的结合的寡核苷酸，通过其生物素连接捕获，然后再次与正常的生物样品 混合。然后再次将未结合的寡核苷酸添加至来源于疾病的生物样品并分离。可反复重复该 过程。针对患者样品测试最终洗脱的适体，以测量该组的敏感性和特异性。生物样品可包括 血液，包括血浆或血清，或循环系统的其它组分如微囊泡。
[0098]图5示出结合试验的结果，其显示出在各种靶标浓度下，示例性适体（（适体ID BTX176881(SEQIDN0:3))对靶EpCAM蛋白的结合亲和力。采用生物素尾将待测试的适体固 定至基底，并将其与不同浓度（125、250和500nM)的靶标一起温育。该测试在表面等离子体 共振仪(SPR)上进行。该SPR仪检测该适体与靶标的缔合和解离。施加靶标直到缔合和解离 事件达到平衡，产生曲线的平台期。然后可使用描述每个浓度下的曲线的等式来计算适体 的KD (见表5)。
[0099]图6示出抗EpCAM适体(适体4;SEQ ID N0.1)用于检测微囊泡群体的应用。采用与 珠子缀合的针对指定微囊泡表面抗原的抗体捕获患者血浆样品中的囊泡，该抗原为:A) EGFR ; B) PBP ; C ) EpCAM ; D ) KLK2。使用荧光标记的适体4作为微珠试验中的检测剂 (detector)。该图示出各个小图中的三个癌症(C1-C3)样品和三个正常样品(N1-N3)的平均 中值荧光值(MFI值）。在各个小图中，从左到右的样品顺序为Cl、C2、C3、Nl、N2、N3。
[0100] 图7A示出EPCAM适体CAR003的序列（SEQ ID N0.4)。图7B示出最低自由能（AG)为-30.00kcal/mol的CAR003的最佳二级结构。为了说明，将该适体显示为与图7A中的DNA序列 相对应的RNA适体(SEQ ID N0.5)。图7C示出适体池的纯化。该图包括FPLC色谱图，其中在凝 胶上检查质量后将所有产物和级分分配到池中。图7D示出合成后CAR003适体的不同FPLC级 分的SYBR GOLD染色的凝胶。根据未完成的链的量以从高到低的顺序(池1 -池3)将不同的级 分在池中合并。池1-3对应于在图7C中指出的那些。图7E-F示出CAR003与EPCAM蛋白在含有 roS-BN的25mM HEPES中（图7E)或在含有ImM MgCl2的25mM HEPES中（图7F)的结合。图7G示 出在添加及不添加牛血清蛋白（BSA)的情况下，CAR003与EpCAM在指定的盐中的结合。图7H 示出变性对CAR003与EPCAM蛋白的结合的影响。在各组的四个条中，适体从左至右为:适体 4、CAR003池1、CAR003池2和CAR003池3。图71示出适体针对EPCAM重组蛋白（恒定输入5yg)的 滴定。图7J示出CAR003适体对EPCAM his标记的蛋白质、BSA和HSA(各5yg)的Western印迹。 该凝胶用0.5 % F1 2 7封闭，并用约5 0 μ g / m 1 C A R 0 0 3生物素化的适体级分3探测。用 NeutrAvidin-HRP及随后用SuperSignal West Femto化学发光底物将印迹可视化。
[0101]图8A-8D示出将微囊泡附接至基底的方法。图8A示出羧基化的微球与囊泡表面抗 原的直接缀合。图8B示出微囊泡通过生物素功能化的脂质锚形物向微球上的锚定。图8C示 出抗体与囊泡表面抗原的结合，其中该抗体缀合至羧基化的微球。图8D示出适体与囊泡表 面抗原的结合，其中该适体缀合至羧基化的微球。
[0102] 图9包括用于鉴定选定适体如通过上述过程选择的适体的靶标的示意图。该图示 出栓系至基底901的结合剂902,在这里为了说明的目的为适体。结合剂902可共价地附接至 基底901。结合剂902也可非共价地附接。例如，结合剂902可以包含可被吸引至基底的标记， 例如可与共价附接至基底的抗生物素蛋白/链霉亲和素分子形成复合物的生物素基团。结 合剂902与微囊泡904的表面抗原903结合。在由箭头（i)所指的步骤中，微囊泡被破坏，而留 下完整的在结合剂902与表面抗原903之间的复合物。在由箭头（ii)所指的步骤中，例如通 过洗涤或缓冲液更换去除被破坏的微囊泡905。在由箭头(iii)所指的步骤中，表面抗原903 从结合剂902上释放。可对表面抗原903进行分析以确定其身份。
[0103] 图10A-C示出选定的适体对缀合至各种输入样品的微珠的结合。适体选自适体文 库，与缀合至来源于乳腺癌的微囊泡的微珠结合。实验细节在本文中的实施例中给出。每张 小图显示不同的适体。Y轴表示结合的水平。在每组样品中，示出了 9种纯化的适体候选物的 结合。输入样品在X轴上指明，从左到右如下：1)癌症外来体:适体与缀合至微囊泡的微珠结 合，该微囊泡从来自乳腺癌患者的血浆样品中分离;2)癌症非外来体:适体与微珠结合，该 微珠缀合至通过超速离心去除微囊泡后的来自乳腺癌患者的血浆样品；3)非癌症外来体： 适体与缀合至微囊泡的微珠结合，该微囊泡从来自正常（即，非乳腺癌）患者的血浆样品中 分离;4)非癌症非外来体:适体与微珠结合，该微珠缀合至通过超速离心去除微囊泡后的来 自乳腺癌患者的血浆样品。
[0104] 图11A-G示出用于针对感兴趣的祀标富集起始适体文库的选择方案。在图11A中， "选择A"表示针对从乳腺癌患者和非乳腺癌个体的血浆中分离的微囊泡的13轮阳性选择。 Cal指第1轮癌症囊泡选择，以此类推。nCal指第1轮非癌症囊泡选择，以此类推。"选择B"表 示一种衍生方案，其中使用在"选择A"中的3轮阳性选择之后的适体池作为针对微囊泡的额 外9轮（即4-12轮）阳性和阴性选择的输入物，该微囊泡从乳腺癌患者和非乳腺癌个体的血 浆中分离。"n〇E"表示阴性选择轮次。图11B示出在琼脂糖凝胶上运行指定轮次的富集后回 收的适体文库。示出了针对癌症囊泡（"Ca"）和非癌症微囊泡（"nCa"）选择的适体。图11C示 出到选择轮次1(R1)、7(R7)和13(R13)的适体富集，该适体结合至癌症囊泡（最左侧三个柱 条"Ca"）和非癌症囊泡(最右侧三个柱条"nCa"）。将在指定轮次的选择后的标记的适体与珠 子捕获的微囊泡一起温育。确定了与珠子捕获的微囊泡结合的适体的数目。Y轴表示结合的 适体相比于总输入的百分比。从第7轮到第13轮的下降可能表明非特异性结合物的去除。图 11D和图11E分别表示在9轮"选择B"后，针对癌症和非癌症微囊泡完成的额外选择。图11F呈 现图11D的另一种视图。图11G示出在9轮"选择B"后进行的第三选择"选择(Τ'，其中针对癌症 衍生的(Ca#)和非癌症衍生的(nCa#)微囊泡进行交替轮次的选择。
[0106] 图13A-I示出寡核苷酸探针文库用于区分生物样品类型的开发和应用。
[0107] 图14A-L示出在图13A-I中概括的方法的应用，其通过用寡核苷酸探针文库探测来 源于血浆的微囊泡而应用于区分乳腺癌和正常（即非癌症)样品。
[0108] 图15A-AN包括针对各种适应症，相对于正常样品，采用寡核苷酸探针文库分析的 聚类分析创建的热图。
[0109] 图16A-C示出适体在表征表型的方法中的使用。图16A是示意图1600,其示出可用 于检测和/或定量感兴趣的靶标的试验配置。在该图中，捕获适体1602附接至基底1601。感 兴趣的靶标1603被捕获适体1602结合。检测适体1604也结合至感兴趣的靶标1603。检测适 体1604带有标记1605,该标记可被检测，从而鉴定通过捕获适体1602捕获至基底1601的靶 标。图16B是示意图1610,其示出适体池用于表征表型的使用。提供了针对感兴趣的靶标的 适体池1611。使该池与待表征的测试样品接触1612。将混合物洗涤以去除未结合的适体。解 离并收集剩余的适体1613。鉴定所收集的适体1614,并且利用保留的适体的身份来表征表 型1615。图16C是示意图1620，其示出图16B中的方法的实施。提供被鉴定为结合微囊泡群体 的适体池1621。输入样品包含从测试样品分离的微囊泡1622。使该池与待表征的分离的微 囊泡接触1623。将混合物洗涤以去除未结合的适体，并且解离并收集剩余的适体1625。鉴定 所收集的适体，并且利用保留的适体的身份来表征表型1626。
[0110] 图17A-H示出用于高通量(新一代)测序的优化的适体文库设计。
具体实施方式
[0111] 本发明的一个或多个实施方案的细节在下面所附的说明中阐述。现在描述优选的 方法和材料，虽然任何与本文描述的那些相似或等价的方法和材料也可用于实施或测试本 发明。基于该描述，本发明的其它特征、目的和优势将是显而易见的。在本说明书中，除非上 下文另有明确规定，否则单数形式也包括复数。除非另有限定，否则本文使用的所有技术和 科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。如有冲突，以 本说明书为准。
[0112] 本文公开了可用于评价生物标志物谱的组合物和方法，该生物标志物谱可包括一 种或多种生物标志物的存在或水平。本发明的组合物和方法包括适体的使用，该适体结合 微囊泡表面抗原或其功能片段。该抗原通常包含蛋白质或多肽，但可以是微囊泡表面上所 展示的任何组分，包括脂质和/或碳水化合物。通常，所公开的适体是核酸分子，包括DNA和 RNA，及其变体。所公开的方法包括使用一种或多种本发明的适体的诊断过程和技术，以确 定相关微囊泡表面抗原或其功能片段的水平或存在。或者，本发明的适体还可用作结合剂， 以捕获、分离或富集包含该表面抗原或其功能片段的细胞、细胞片段、囊泡或任何其它片段 或复合物。
[0113] 本发明的组合物和方法包括经鉴定用于评价生物标志物谱的单独的寡核苷酸。本 发明还公开了可用于检测给定样品中的生物标志物谱的寡核苷酸池的组合物和方法。
[0114] 本发明的组合物和方法中公开的适体和序列在此可以以DNA或RNA的形式得到鉴 定。除非另有说明，本领域技术人员将会理解，适体通常可合成为核酸的任一种形式，并带 有各种化学修饰而仍保持在本发明的范围之内。术语适体在本领域中可用来指单个寡核苷 酸，该寡核苷酸通过除Watson crick碱基配对之外的机制特异性地结合感兴趣的祀标，该 机制类似于单克隆抗体与特定抗原的结合。在本公开的范围内，除非明确地指出或以其它 方式在上下文中暗示，术语适体和寡核苷酸可以互换使用，以指代能够区分感兴趣的生物 实体(例如，生物标记物）的寡核苷酸，无论具体实体是否已被鉴定或确切的结合模式是否 已被确定。
[0115] 本发明的适体还可以用来提供体外或体内检测或成像，以提供任何适当的诊断读 数(例如，诊断、预后或治疗诊断）。
[0116] 另外，本发明的适体也可用于治疗或作为特异性靶向细胞、组织或器官的治疗剂。 适体
[0117] SELEX。用于生成适体的一种合适的方法是使用名称为"指数富集的配体系统进化 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)"（〃SELEX〃）的过程， 该方法在1990年6月11日提交、现已放弃的美国专利申请序列号07/536，428、题为〃Nucleic Acid Ligands〃的美国专利号5,475,096以及题为〃Nucleic Acid Ligands〃的美国专利号 5,270，163(也见W0 91/19813)中概括地描述。每个经SELEX鉴定的核酸配体，即每个适体， 均是给定靶化合物或分子的特异性配体。SELEX过程基于独特的视角-核酸在其单体内具有 形成多种二维和三维结构的足够的能力，以及足够的化学通用性，使其能充当基本上任何 化学化合物(无论是单体的还是聚合的）的配体（即，形成特异性结合对）。任何大小或组成 的分子均可充当靶标。
[0118] SELEX依赖于在包含随机化序列的单链寡核苷酸的大文库或池上的起始点。该寡 核苷酸可以是修饰的或未修饰的DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。在一些实例中，该池包含100% 随机或部分随机的寡核苷酸。在其它实例中，该池包含随机或部分随机的寡核苷酸，该寡核 苷酸含有至少一个并入随机化序列内的固定和/或保守的序列。在其它实例中，该池包含随 机或部分随机的寡核苷酸，该寡核苷酸在其5'和/或3'端含有至少一个固定和/或保守的序 列，该序列可包含由寡核苷酸池的所有分子共享的序列。固定序列是诸如以下的序列:PCR 弓丨物的杂交位点、RNA聚合酶(例如，T3、T4、T7和SP6)的启动子序列、限制酶切位点或均聚序 列如聚A或聚T段、催化核心、与亲和柱选择性结合的位点以及其它有助于感兴趣的寡核苷 酸的克隆和/或测序的序列。保守序列是除了先前描述的固定序列之外，由若干个结合相同 靶标的适体共享的序列。
[0119] 该池中的寡核苷酸优选地包括随机化的序列部分以及对高效扩增有用的固定序 列。通常，起始池的寡核苷酸含有固定的5'和3'末端序列，该序列在30-50个随机核苷酸的 内部区域的侧翼。随机化的核苷酸可以通过多种方式产生，包括化学合成以及从随机切割 的细胞核酸中进行大小选择。还可在选择/扩增重复之前或期间通过诱变引入或增加在测 试核酸中的序列变异。
[0120] 寡核苷酸的随机序列部分可具有任意的长度，并且可包含核糖核苷酸和/或脱氧 核糖核苷酸，并可包含修饰的或非天然的核苷酸或核苷酸类似物。参见，例如美国专利号5， 958,691 ;美国专利号5,660,985;美国专利号5,958,691;美国专利号5,698,687;美国专利 号5,817,635;美国专利号5,672,695;以及?(：1'公开冊92/07065。可采用本领域公知的固相 寡核苷酸合成技术从磷酸二酯连接的核苷酸合成随机寡核苷酸。参见，例如，Froehler等 人，Nucl .Acid Res. 14 :5399-5467 (1986)和 Froehler 等人，Tet. Lett .27 :5575-5578 (1986)。还可采用溶液相方法如三酯合成方法合成随机寡核苷酸。参见，例如，Sood等人， Nucl · Acid Res · 4:2557(1977)和Hirose等人，Tet · Lett ·，28:2449(1978)。在自动化DNA合 成设备上进行的典型合成产生1〇14_1〇16个单独的分子，该数目足以满足大多数SELEX实验。 在序列设计中足够大的随机序列区域增大了每个合成分子可能代表独特的序列的可能性。 [0121]寡核苷酸的起始文库可通过在DNA合成仪上的自动化的化学合成生成。为了合成 随机化的序列，在合成过程中的每个核苷酸添加步骤中添加全部四种核苷酸的混合物，从 而允许核苷酸的随机掺入。如上所述，在一个实施方案中，随机寡核苷酸包含完全随机的序 列；然而，在其它实施方案中，随机寡核苷酸可包含非随机的或部分随机的序列段。部分随 机的序列可通过在每个添加步骤中添加不同摩尔比的四种核苷酸来产生。
[0122] 寡核苷酸的起始文库可以是例如，RNA、DNA或RNA/DNA杂合体。在将要使用RNA文库 作为起始文库的那些情况下，通常通过采用T7RNA聚合酶或修饰的T7RNA聚合酶将DNA文库 在体外转录并纯化而产生该RNA文库。然后使该文库与靶标在有利于结合的条件下混合，并 采用相同的一般选择方案使其经历结合、分区和扩增的逐步反复，以达到基本上任何期望 的结合亲和性和选择性标准。更具体地，从含有起始核苷酸池的混合物开始，该SELEX方法 包括以下步骤：（a)使混合物与靶标在有利于结合的条件下接触；（b)将未结合的核酸从已 经特异性结合至靶分子的那些核酸进行分区；（c)使核酸-靶标复合物解离；（d)扩增从核 酸-靶标复合物解离的核酸，以产生核酸的配体富集的混合物；以及(e)根据需要将结合、分 区、解离和扩增的步骤重复多个循环，以产生针对靶分子的高特异性、高亲和性的核酸配 体。在选择RNA适体的那些情况下，SELEX方法还包括以下步骤：（i)在步骤(d)中的扩增之 前，逆转录从核酸-靶标复合物解离的核酸；以及（ii)在重新开始该过程之前，转录来自步 骤(d)的扩增的核酸。
[0123] 在含有大量可能的序列和结构的核酸混合物中，存在广泛的对给定靶标的结合亲 和性。包含例如20种核苷酸随机化区段的核酸混合物可具有42()种候选物可能性。对靶标具 有较高亲和常数的那些最有可能与靶标结合。在分区、解离和扩增后，生成第二核酸混合 物，针对具有较高结合亲和力的候选物进行富集。额外轮次的选择逐渐倾向于更好的配体， 直到所产生的核苷酸混合物主要由仅一种或几种序列构成。然后，可以对其进行克隆、测序 并单独测试作为纯配体或适体的结合亲和力。
[0124] 重复选择和扩增的循环直到达到期望的目标。在最通常的情况下，持续进行选择/ 扩增，直到经循环重复没有获得结合强度的显著提升。该方法通常用于采样约1〇 14种不同的 核酸物质，但可用于采用多达约1〇18种不同的核酸物质。通常，核酸适体分子在5到20个循环 的程序中选择。在一个实施方案中，异质性仅在最初的选择阶段引入而不会在整个复制过 程中发生。
[0125] 在SELEX的一个实施方案中，选择过程对分离那些最强地结合选定靶标的核酸配 体非常有效，以致于仅需要一个循环的选择和扩增。这样的有效选择可在例如色谱型过程 中出现，其中核酸与结合在柱子上的靶标缔合的能力以这样一种方式起作用，使得该柱子 足以能够允许分离和离析具有最高亲和力的核酸配体。
[0126] 在许多情况下，在单个核酸配体得到鉴定之前，不一定需要进行SELEX的迭代步 骤。靶标特异性的核酸配体溶液可包括一类核酸结构或基序，该核酸结构或基序具有若干 保守序列和若干可被置换或添加而不显著影响该核酸配体对靶标的亲和力的序列。通过在 完成之前终止SELEX过程，确定核酸配体溶液家族的若干个成员的序列是可能的。本发明提 供配体池的鉴定及其可联合用于表征测试样品的用途。例如，适体池可通过数轮阳性和阴 性选择来鉴定，以鉴定指示疾病或病况的微囊泡。本发明还提供这类适体池在检测和/或定 量样品中的这类微囊泡中的应用，由此使得能够提供诊断、预后或治疗诊断。
[0127] 已知存在多种核酸一级、二级和三级结构。已表明最常见的参与非Watson-Crick 类相互作用的结构或基序被称为发夹环、对称和非对称凸起、伪结以及它们的无数种组合。 这类基序的几乎所有已知的情况均提示其可在不超过30个核苷酸的核酸序列中形成。由于 这个原因，通常优选的是，具有连续的随机化区段的SELEX程序开始于含有约20至约50个核 苷酸，且在一些实施方案中含有约30至约40个核苷酸的随机化区段的核酸序列。在一个实 例中，5'-固定:随机:3'-固定序列包含约30至约50个核苷酸的随机序列。
[0128] 为了实现许多特定的目标，核心的SELEX方法中已得到改进。例如，美国专利号5， 707，796描述了使用SELEX结合凝胶电泳来选择具有特定结构特征的核酸分子，如弯曲DNA。 美国专利号5,763,177描述了用于选择含有光反应性基团的核酸配体的基于SELEX的方法， 该光反应性基团能够与靶分子结合和/或光交联和/或使靶分子光灭活。美国专利号5,567， 588和美国专利号5，861，254描述了基于SELEX的方法，该方法实现了在对靶分子具有高亲 和力和低亲和力的寡核苷酸之间的高效分区。美国专利号5,496,938描述了用于在已经进 行SELEX过程后获得改进的核酸配体的方法。美国专利号5,705,337描述了用于将配体共价 连接至其靶标的方法。
[0129] SELEX还可用于获得与靶分子上超过一个位点结合的核酸配体，以及用于获得包 含与靶标上特定位点结合的非核酸物质的核酸配体。SELEX提供用于分离和鉴定与任何可 想到的靶标结合的核酸配体的手段，该靶标包括大的和小的生物分子，如核酸结合蛋白质 和不知道结合核酸作为其生物功能的一部分的蛋白质以及辅因子和其它小分子。例如，美 国专利号5，580，737公开了通过SELEX鉴定的核酸序列，其能够高亲和力地结合咖啡因及紧 密相关的类似物，茶碱。
[0130] 反向-SELEX(Counter-SELEX)是一种通过消除与一种或多种非靶标分子具有交叉 反应性的核酸配体来改善核酸配体对靶分子的特异性的方法。反向-SELEX包括以下步骤： (a)准备候选的核酸混合物；（b)使候选混合物与靶标接触，其中可将相对于候选混合物对 靶标具有增大的亲和力的核酸与候选混合物的剩余物进行分区；（ c)将该亲和力增大的核 酸与候选混合物的剩余物进行分区；（d)使该亲和力增大的核酸从靶标上解离；（e)使该亲 和力增大的核酸与一种或多种非靶标分子接触，使得对非靶标分子具有特定亲和力的核酸 配体被去除；以及(f)扩增仅对靶分子具有特定亲和力的核酸，以产生针对具有相对较高的 结合靶分子的亲和力和特异性的核酸序列富集的核酸混合物。如上文针对SELEX所述，重复 选择和扩增的循环直到达到期望的目标。
[0131] 在使用核酸作为治疗剂和疫苗中遇到的一个潜在问题是，在期望的效果显现之 前，其磷酸二酯形式的寡核苷酸可能在体液中被细胞内和细胞外酶如核酸内切酶和核酸外 切酶快速降解。因此SELEX方法包括含有修饰的核苷酸的高亲和力核酸配体的鉴定，该修饰 的核苷酸为该配体给予改善的特性，如改善的体内稳定性或改善的递送特性。这类修饰的 实例包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置处的化学取代。SELEX鉴定的含有修饰核苷酸的 核酸配体例如在美国专利号5，660，985中描述，其描述了含有核苷酸衍生物的寡核苷酸，该 核苷酸衍生物在核糖的2'位置、嘧啶的5位置和嘌呤的8位置处被化学修饰;在美国专利号 5，756，703中描述，其描述了含有各种2'修饰的嘧啶的寡核苷酸；以及在美国专利号5，580， 737中描述，其描述了含有一个或多个用2'-氨基氟U'-F)和/或2^0-甲基 (2' -OMe)取代基修饰的核苷酸的高特异性核酸配体。
[0132] 本发明中涉及的核酸配体的修饰包括但不限于提供其它化学基团的那些修饰，这 些化学基团向核酸配体碱基或向作为整体的核酸配体引入额外的电荷、极化性、疏水性、氢 键键合、静电相互作用和流变性。产生核酸酶抗性寡核苷酸群体的修饰还可包括一个或多 个取代的核苷酸间连接、改变的糖、改变的碱基或其组合。这类修饰包括但不限于2'-位的 糖修饰、5-位的嘧啶修饰、8-位的嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿苷的置换、5-溴或5-碘-尿嘧啶的置换;骨架修饰、硫代磷酸酯或烯丙基磷酸酯修饰、甲基化以及不常见的碱基 配对组合，如异碱基异胞苷和异鸟苷。修饰也可包括3'和5'修饰，如加帽。
[0133] 在一个实施方案中，提供了这样的寡核苷酸，其中P(0)0基团被P(0)S("硫代"）、P (S)S( "二硫代"）、P(0)NR2( "酰胺（amidate)"）4(0)1^4(0)01^、C0或CH2( "甲缩醛 (formacetal)"）或胺(一NH--CH2--CH2--)替代，其中每个R或V独立地为Η或取代的或未 取代的烷基。连接基团可以通过--〇--、--Ν-或一S--键附接至相邻的核苷酸。并非寡核苷 酸中的所有键都必须是相同的。如本文所用的，术语硫代磷酸酯包含的磷酸二酯键中的一 个或多个非桥接氧原子被一个或多个硫原子替代。
[0134] 在进一步的实施方案中，寡核苷酸包含修饰的糖基团，例如，一个或多个羟基被卤 素、脂肪族基团替代，或被官能化为醚或胺。在一个实施方案中，呋喃糖残基的2'位被0-甲 基、0-烷基、0-烯丙基、S-烷基、S-烯丙基或卤素基团中的任一个取代。2'-修饰的糖的合成 方法在例如 Sproat 等人，Nucl.Acid 1^8.19:733-738(1991);0〇1^611等人，仙(31.厶(^(1 Res. 19:2629-2635(1991);以及Hobbs等人，Biochemistry 12:5138-5145(1973)中描述。其 它修饰是本领域普通技术人员已知的。这类修饰可以是SELEX过程前修饰或SELEX过程后修 饰(先前鉴定的未修饰的配体的修饰），或者可以通过并入SELEX过程中而实现。
[0135] SELEX过程前修饰或通过并入SELEX过程中而实现的那些修饰产生既对其SELEX靶 标具有特异性又具有改善的稳定性例如体内稳定性的核酸配体。对核酸配体进行的SELEX 过程后修饰可导致改善的稳定性例如体内稳定性，而不会负面影响核酸配体的结合能力。
[0136] 如在美国专利号5，637，459和美国专利号5，683，867中描述的，SELEX法包括将选 定的寡核苷酸与其它选定的寡核苷酸以及非寡核苷酸功能单元组合。如在例如美国专利6， 011，020、美国专利6，051，698和PCT公开号W0 98/18480中描述的，SELEX法还包括将选定的 核酸配体与亲脂性或非免疫原性的高分子量化合物在诊断或治疗复合物中组合。这些专利 和申请教导了一系列广泛的形状和其它性质与寡核苷酸的有效扩增和复制性质，以及与其 它分子的期望性质的组合。
[0137] 还已经探索了通过SELEX法鉴定针对柔性小肽的核酸配体。小肽具有柔性结构，并 通常在溶液中以多个构象的平衡存在，因此最初认为，结合亲和力可受结合柔性肽时失去 的构象熵的限制。然而，鉴定针对溶液中的小肽的核酸配体的可行性在美国专利号5648214 中得到证明。在该专利中，鉴定了针对物质P--种11个氨基酸的肽-的高亲和力RNA核酸配 体。
[0138] 对本发明的靶标具有特异性和结合亲和力的适体可通过如本文所述的SELEX N过 程来选择。作为SELEX过程的一部分，然后将选择用于结合靶标的序列任选地最小化，以确 定具有所需结合亲和力的最小序列。任选地通过进行序列的随机或定向诱变来优化选定的 序列和/或最小化的序列，以提高结合亲和力或替代地确定该序列中的哪些位置对结合活 性是必需的。此外，可以用掺有修饰的核苷酸的序列来进行选择，以使适体分子对体内降解 稳定化。
[0139] 2'修饰的SELEX
[0140] 为了使适体适合用作治疗剂，其优选是合成便宜、安全且在体内稳定的。由于其对 核酸酶降解的敏感性，野生型RNA和DNA适体通常在体内不稳定。通过在2'-位置处掺入修饰 基团可大大增加对核酸酶降解的抗性。
[0141] 已经成功地将氟和氨基基团并入寡核苷酸池中，随后从该池中选择适体。然而，这 些修饰大大增加了所产生的适体的合成成本，并且在一些情况下可能带来安全性问题，这 是由于通过修饰的寡核苷酸的降解及随后使用该核苷酸作为DNA合成的底物而将修饰的核 苷酸循环到宿主DNA中的可能性。
[0142] 如本文提供的，含有2' -0-甲基（"2' -OMe"）核苷酸的适体可克服一个或多个潜在 的缺点。含有2' -OMe核苷酸的寡核苷酸是核酸酶抗性的并且合成便宜。尽管2' -OMe核苷酸 在生物系统中普遍存在，但在生理条件下天然聚合酶不接受S^OMe NTP为底物，因此不存 在关于S^OMe核苷酸循环到宿主DNA中的安全性问题。用于生成修饰的适体的SELEX法 在例如于2002年12月3日提供的美国临时专利申请序列号60/430，761、于2003年7月15日提 交的美国临时专利申请序列号60/487，474、于2003年11月4日提交的美国临时专利申请序 列号60/517,039、于2003年12月3日提交的美国专利申请序列号10/729,581以及于2004年6 月21 日提交的、题为"Method for in vitro Selection of S'-O-methyl substituted Nucleic Acids"的美国专利申请序列号10/873,856中描述，其每一个均通过引用以其全文 并入本文。 方法
[0143] 生物标志物检测和诊断
[0144] 本发明的适体可在多种方法中用来评估生物样品中的生物标志物，例如，感兴趣 的生物实体如蛋白质、核酸或微囊泡的存在或水平。该适体起结合剂的作用，用于评估同源 靶分子的存在或水平。因此，在涉及诊断、预后或治疗诊断的本发明的多个实施方案中，一 种或多种本发明的适体被配置在基于配体-靶标的试验中，其中一种或多种本发明的适体 与选定的生物样品接触，其中该一种或多种适体与其靶分子缔合或结合。本发明的适体用 于根据所评估的生物样品和所检测的生物标志物来鉴定候选生物印记(biosignature)。在 进一步的实施方案中，适体本身可提供针对特定病况或疾病的生物印记。生物印记是指生 物样品的生物标志物谱，其包括一种或多种感兴趣的生物标志物的存在、水平或其它可评 估的特征(包括但不限于序列、突变、重排、易位、缺失、表观遗传修饰、甲基化、翻译后修饰、 等位基因、活性、复合物配偶体、稳定性、半衰期等）。生物印记可以用来评估诊断和/或预后 标准，例如疾病的存在，疾病分期，疾病监测，疾病分层或检测的监督，疾病的转移或复发或 进展。例如，使用针对微囊泡表面抗原的适体的本发明方法可用于将包含微囊泡抗原的生 物印记与选定的病况或疾病相关联。生物印记还可在临床上用于作出关于治疗模式的决 策，包括治疗干预。生物印记可以进一步在临床上用于作出治疗决策，包括是否实施手术， 或者应该与手术一起使用何种治疗标准(例如术前或术后）。作为说明性实例，指示癌症的 侵袭性形式的循环生物标志物的生物印记可能需要更为激进的手术程序和/或更为激进的 治疗方案来治疗患者。
[0145] 生物印记可在任何本文公开的方法中使用，例如，用来评估受试者是否患有疾病， 是否处于发生疾病的危险中，或者用来评估疾病的阶段或进展。例如，生物印记可用来评估 受试者是否具有前列腺癌、结肠癌或其它本文所述的癌症。此外，生物印记可用来确定疾病 或病况如结肠癌的阶段。包含微囊泡的生物印记/生物标志物谱可包括对微囊泡内的有效 负载(payload)的评估。例如，一种或多种本发明的适体可用来捕获微囊泡群体，由此提供 微囊泡抗原的读数，然后可评估在捕获的微囊泡内的有效负载含量，由此提供有效负载含 量的进一步的生物标志物读数。
[0146] 用于表征表型的生物印记可包括任意数目的有用的标准。如下文进一步描述的， 如本文所用的术语"表型"可指归因于生物印记/生物标志物谱的任何性状或特征。采用本 发明的组合物和/或方法可部分或完整地检测或鉴定表型。在一些实施方案中，对每种生物 标志物使用至少一种标准。在一些实施方案中，使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 30、40、50、60、70、80、90种或至少100种标准。例如，就癌症的表征而言，当受试者被诊断为 患有癌症时，可以使用多种不同的标准：1)来自受试者的样品中微RNA的量是否高于参照 值;2)细胞型特异性囊泡（即，源自特定组织或器官的囊泡）中的微RNA的量是否高于参照 值;或者3)具有一种或多种癌症特异性生物标志物的囊泡中微RNA的量是否高于参照值。如 果微RNA的量低于或等于参照值，可应用类似的规则。所述方法可以进一步包括质量控制措 施，从而在样品满足质量控制措施的情况下为受试者提供结果。在一些实施方案中，如果满 足标准但是质量控制存疑，则重新评估受试者。
[0147] 治疗诊断
[0148] 生物印记可以用于治疗相关的诊断，从而提供可用于诊断疾病或选择正确的治疗 方案的测试，例如提供治疗诊断。治疗诊断包括诊断测试，其提供影响疾病状态的疗法或治 疗的能力。治疗诊断测试以与诊断或预后测试分别提供诊断或预后相类似的方式提供了治 疗诊断。本文所使用的治疗诊断涵盖了任意所需形式的治疗相关测试，其包括预测医学、个 性化医疗、综合医学、药物诊断学（pharma codiagnostics)和Dx/Rx配合（Dx/Rx partnering)。治疗相关测试可以用于预测和评估受试个体中的药物反应，即，提供个性化 医疗。预测药物反应可确定受试者是否是候选治疗剂的可能响应者或可能非响应者，例如， 在受试者暴露于治疗或以其它方式地用该治疗进行处置之前。评估药物反应可以监测对药 物的反应，例如，在开始治疗后的一段时期内监测受试者的改善或改善的缺乏。治疗相关测 试可用于为治疗方法选择特别可能受益于该治疗的受试者，或者提供关于在受试个体中的 治疗效力的早期及客观的指示。因此，本文公开的生物印记可以指示应改变治疗以选择更 有希望的治疗，从而避免延误有益治疗的巨大代价并避免施用无效药物的经济成本和病痛 成本。
[0149] 本发明的组合物和方法可用于鉴定或检测与选定的疾病和病症相关的生物印记， 该疾病和病症包括但不限于心血管疾病、癌症、感染性疾病、脓毒症、神经疾病、中枢神经系 统相关疾病、血管内相关疾病以及自身免疫相关疾病。治疗相关诊断还有助于对药物毒性、 抗药性或药物反应的预测。可开发任何适当诊断测试形式的治疗相关测试，其包括但不限 于，例如，免疫组织化学测试、临床化学、免疫分析、基于细胞的技术、核酸测试或躯体成像 方法。治疗相关测试可以进一步包括但不限于，有助于治疗确定的测试、监测治疗毒性的测 试或对治疗的反应的测试。因此，生物印记可用于预测或监测受试者对治疗的反应。在开 始、去除或改变特定治疗之后，可在不同的时间点对受试者确定生物印记。
[0150] 在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供对受试者是否对治疗发生反应的 确定或预测，该确定或预测是根据生物印记（即，感兴趣的微RNA、囊泡和/或生物标志物）的 一种或多种组分的量的变化、特定生物印记的一种或多种组分的量或针对所述组分检测的 生物印记而作出的。在另一个实施方案中，通过在不同时间点测定生物印记而监测受试者 的状况。确定状况的进展、消退或复发。也可在一定的时程内测量对治疗的反应。因此，本发 明提供了监测受试者中疾病或其它医学状况的状态的方法，其包括从来自受试者的生物样 品中分离和检测生物印记，检测特定生物印记的组分的总量或者检测一种或多种组分的生 物印记(诸如生物标志物的存在、不存在或表达水平）。生物印记可用于监测所述疾病或病 况的状态。
[0151] 也可以鉴定囊泡的一种或多种新型生物印记。例如，一种或多种囊泡可从对药物 治疗或治疗方案有反应的受试者中分离，并与参照如对该药物治疗或治疗方案没有反应的 另一受试者进行比较。可以确定生物印记之间的差异，并用其将其他受试者鉴定为特定药 物或治疗方案的响应者或非响应者。
[0152] 在一些实施方案中，生物印记用于确定特定疾病或病况是否对药物具有抗性，在 这种情况下，医生无需将宝贵的时间浪费在这样的药物治疗上。为了获得对药物选择或治 疗方案的早期验证，对得自受试者的样品确定生物印记。生物印记用于评估特定受试者的 疾病是否具有与抗药性相关的生物标志物。这样的确定使得医生能够将关键的时间以及患 者的经济资源投入到有效的治疗中。
[0153] 生物印记可用于癌症的治疗诊断，例如鉴定患有癌症的受试者是否是特定癌症治 疗的可能的响应者或非响应者。本方法可用于治疗诊断癌症，包括在本文中列出的那些，例 如，在下面的"表型"部分中列出的那些。这些包括但不限于肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺 癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌）、混合性小细胞/大细胞癌以及合并的小细胞癌）、结肠癌、 乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、黑色素瘤、骨癌、胃癌、乳腺癌、 神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状肾癌、头颈部鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨 髓瘤或其它实体瘤。
[0154] 来自患有癌症的受试者的样品中的循环生物标志物(包括与生物样品中存在的组 分(例如，细胞、细胞片段、细胞衍生的细胞外囊泡)相关联的标志物）的生物印记可用于为 受试者选择候选治疗。生物印记可根据本文中提出的本发明的方法来确定。在一些实施方 案中，候选治疗包括针对癌症的标准医护。该治疗可以是癌症治疗，如放射疗法、外科手术、 化学疗法或其组合。该癌症治疗可以是治疗剂如抗癌剂和化疗方案。在本发明的实施方案 中使用的进一步的药物关联和规则可见于2010年2月12日提交的美国专利申请12/658， 770;2010年2月11日提交的国际？(：1'专利申请冊/2010/093465 ;2010年10月27日提交的国际 ?(^专利申请冊/2011/056688;以及2010年12月28日提交的美国临时专利申请61/427,788， 所有这些申请均通过引用以其全文并入本文。参见例如，W0/2011/056688的"表4:治疗选择 的规则总结"。 生物标志物检测
[0155] 本发明的组合物和方法可用于评估生物样品中的任何有用的生物标志物，从而用 于表征与该样品有关的表型。这类生物标志物包括所有类型的生物实体，如蛋白质、核酸、 脂质、碳水化合物、任何这些的复合物，以及微囊泡。与微囊泡表面缔合的或包含在微囊泡 内的各种分子(在本文中称为"有效负载"）可充当生物标志物。微囊泡本身也可用作生物标 志物。
[0156] 本发明的适体可用于评估微囊泡群体的水平或存在。参见例如，图16B-16C。本发 明的适体还可用于评估其特异性靶分子的水平或存在。参见例如，图16A。此外，本发明的适 体用于捕获或分离在存在该适体的靶分子的生物样品中存在的组分。例如，如果给定微囊 泡表面抗原存在于细胞、细胞片段或细胞衍生的细胞外囊泡上。针对生物标志物的结合剂， 包括但不限于本发明提供的适体，可用于捕获或分离细胞、细胞片段或细胞衍生的细胞外 囊泡。参见例如，图2A-2B、16A。可进一步表征这类捕获或分离的适体，以评估存在的其它表 面抗原或内部"有效负载"分子（即，核酸分子、脂质、糖、多肽或其功能片段，或在细胞环境 中存在的、可用作生物标志物的任何其它物质），其中一种或多种生物标志物提供生物印 记，以评估期望的表型，如疾病或病况。参见例如，图2F。因此，本发明的适体不仅可用于评 估一种或多种感兴趣的微囊泡表面抗原，还可用于分离生物样品中存在的组分，其中可进 一步评估该组分本身，以鉴定候选生物印记。
[0157] 本发明的方法可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、25、50、75或100种不同生物标志物的多重分析。例如，可以使用多种差异标记的颗粒来 进行异质囊泡群体的分析。可以存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、25、50、75或100种差异标记的颗粒。所述颗粒可以外部标记（例如使用标签），或 者它们可以内在地标记。各种差异标记的颗粒可以偶联至囊泡的捕获剂，例如结合剂，从而 导致囊泡的捕获。可选择多种捕获剂以表征感兴趣的表型，包括针对一般囊泡生物标志物、 起源细胞特异性生物标志物和疾病生物标志物的捕获剂。随后可用多种结合剂检测所捕获 的囊泡的一种或多种生物标志物。可对结合剂进行直接标记以辅助检测。或者，用第二试剂 标记该结合剂。例如，结合剂可以是针对囊泡上的生物标志物的抗体，其中该结合剂与生物 素连接。第二试剂包含与报告物连接的链霉亲和素，并且可被加入以检测生物标志物。在一 些实施方案中，针对至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、 75或100种不同的生物标志物来分析所捕获的囊泡。例如，多种检测剂（即，所捕获的囊泡或 囊泡群体的多种生物标志物的检测)可以增加所得的信号，允许提高灵敏度、特异性或此两 者，并且使用较少量的样品。可使用超过一种生物标志物进行检测，包括但不限于超过一种 如表3中的一般囊泡标志物。
[0158]基于免疫测定的方法(例如，夹心测定)可用于检测囊泡的生物标志物。实例包括 ELI SA。结合剂可结合至孔。例如，针对囊泡的抗原的结合剂如适体或抗体可附接至孔。可根 据本文所述的方法检测在捕获的囊泡上的生物标志物。图2A示出夹心型免疫测定的说明性 示意图。捕获剂可针对感兴趣的囊泡抗原，例如，一般囊泡生物标志物、起源细胞标志物或 疾病标志物。在该图中，采用针对感兴趣的囊泡抗原的荧光标记的结合剂(检测剂)来检测 捕获的囊泡。多种捕获结合剂可用在例如阵列上的可区分的地址或免疫测定板的不同孔 中。检测结合剂可与捕获结合剂针对同一抗原，或可以针对其它标志物。捕获结合剂可以是 任何有用的结合剂，例如，栓系的适体、抗体和凝集素(lectin)，和/或检测抗体可类似地被 取代为例如可检测的（例如，标记的）适体、抗体、凝集素或其它结合蛋白质或实体。在一个 实施方案中，一种或多种针对一般囊泡生物标志物、起源细胞标志物和/或疾病标志物的捕 获剂可与针对一般囊泡生物标志物如四跨膜蛋白分子或其它在本文表3中的标志物的检测 剂一起使用，该四跨膜蛋白包括但不限于CD9、CD63和CD81中的一种或多种。微囊泡表面抗 原的实例在本文中例如在表3或表4中公开，或是本领域已知的，并且在本发明的方法和组 合物中有用的实例在2011年4月6日提交的题为"Circulating Biomarkers for Disease" 的国际专利公布号W0/2011/127219中公开。
[0159]图2D呈现用于根据本发明的方法分析囊泡的说明性示意图。使用捕获剂来捕获囊 泡，使用检测剂来检测所捕获的囊泡，并且使用捕获的和检测的微囊泡的水平或存在来表 征表型。捕获剂、检测剂和表征表型可以是任何本文所述的那些。例如，捕获剂包括栓系至 基底上的、识别感兴趣的囊泡抗原的抗体或适体，检测剂包括针对感兴趣的囊泡抗原的标 记的抗体或适体，并且表征表型包括疾病的诊断、预后或治疗诊断。在图2D i)所示的方案 中，用一种或多种针对一般囊泡生物标志物(200)的捕获剂捕获囊泡群体。然后，将捕获的 囊泡用针对起源细胞生物标志物（201)和/或疾病特异性生物标志物(202)的检测剂标记。 如果仅使用了起源细胞检测剂(201)，则用于表征表型（203)的生物印记可包括一般囊泡标 志物(200)和起源细胞生物标志物(201)。如果仅使用了疾病检测剂(202)，则用于表征表型 (203)的生物印记可包括一般囊泡标志物(200)和疾病生物标志物(202)。或者，使用检测剂 来检测起源细胞生物标志物（201)和疾病特异性生物标志物（202)两者。在该情况下，用于 表征表型（203)的生物印记可包括一般囊泡标志物(200 )、起源细胞生物标志物(201)和疾 病生物标志物(202)。选择生物标志物组合以表征感兴趣的表型，并且其可选自在本文中例 如在表3或表4中描述的生物标志物和表型。
[0160] 在图2D ii)所示的方案中，用一种或多种针对起源细胞生物标志物(210)和/或疾 病生物标志物(211)的捕获剂捕获囊泡群体。然后采用针对一般囊泡生物标志物(212)的检 测剂检测所捕获的囊泡。如果仅使用了起源细胞捕获剂(210)，则用于表征表型（213)的生 物印记可包括起源细胞生物标志物(210)和一般囊泡标志物(212)。如果仅使用了疾病生物 标志物捕获剂(211)，则用于表征表型（213)的生物印记可包括疾病生物标志物(211)和一 般囊泡生物标志物(212)。或者，使用针对一种或多种起源细胞生物标志物(210)和一种或 多种疾病特异性生物标志物(211)的捕获剂来捕获囊泡。在该情况下，用于表征表型（213) 的生物印记可包括起源细胞生物标志物（210 )、疾病生物标志物（211)和一般囊泡标志物 (213)。选择生物标志物组合以表征感兴趣的表型，并且其可选自本文所述的生物标志物和 表型。
[0161] 本发明的方法包括使用有用的生物标志物的任意组合捕获和检测感兴趣的微囊 泡。例如，可使用一种或多种针对起源细胞、疾病特异性或一般囊泡标志物的任意期望组合 的结合剂捕获微囊泡群体。然后，可使用一种或多种针对起源细胞、疾病特异性或一般囊泡 标志物的任意期望组合的结合剂检测所捕获的微囊泡。图2E表示这类配置的流程图。起源 细胞生物标志物（240)、疾病生物标志物(241)和一般囊泡标志物（242)中的任意一种或多 种用于捕获微囊泡群体。此后，起源细胞生物标志物(243 )、疾病生物标志物(244)和一般囊 泡标志物(245)中的任意一种或多种用于检测所捕获的微囊泡群体。然后使用捕获和检测 的微囊泡的生物印记来表征表型。选择生物标志物组合以表征感兴趣的表型，并且其可选 自本文所述的生物标志物和表型。
[0162] 微囊泡有效负载分子可作为生物印记组的成员进行评估。有效负载分子包括包含 在细胞、细胞片段或囊泡膜内的任何生物实体。这些实体包括但不限于:核酸，例如mRNA、微 RNA或DNA片段；蛋白质，例如可溶的和膜结合的蛋白质；碳水化合物;脂质；代谢物；以及各 种小分子，例如激素。有效负载可以是细胞环境的一部分，其在囊泡形成于该细胞环境中时 被包封。在本发明的一些实施方案中，除检测囊泡表面抗原之外还分析了有效负载。可如上 所述捕获特定的囊泡群体，随后可利用所捕获的囊泡中的有效负载来表征表型。例如，可进 一步分离在基底上捕获的囊泡以评估其中的有效负载。或者，对样品中的囊泡进行检测和 分选而不捕获。可进一步分离这样检测的囊泡以评估其中的有效负载。在一个实施方案中， 通过流式细胞术分选囊泡群体，并且分析所分选的囊泡中的有效负载。在图2F iv)所示的 方案中，采用起源细胞生物标志物（220)、疾病生物标志物（221)和/或一般囊泡标志物 (222)中的一种或多种捕获和/或检测（220)囊泡群体。评估分离的囊泡的有效负载(223)。 在有效负载内检测到的生物印记可用于表征表型(224)。在一个非限制性实例中，可使用针 对一种或多种感兴趣的囊泡抗原的抗体在来自患者的血浆样品中分析囊泡群体。该抗体可 以是栓系至基底上以分离所需囊泡群体的捕获抗体。或者，可以直接标记该抗体，并且通过 使用流式细胞术进行分选而分离所标记的囊泡。从分离的囊泡群体中提取的微RNA或mRNA 的存在或水平可用于检测生物印记。生物印记随后用于诊断、预后或治疗诊断所述患者。
[0163] 在其它实施方案中，在群体(例如，细胞或囊泡）中分析囊泡或细胞有效负载，而无 需首先捕获或检测囊泡的亚群。例如，通常可采用离心、过滤、色谱法或其它如本文所述且 本领域已知的技术从样品中分离细胞或细胞外囊泡群体。随后可分析这类样品组分的有效 负载，以检测生物印记并表征表型。在图2F v)所示的方案中，分离囊泡群体(230)并评估所 分离的囊泡的有效负载(231)。在有效负载内检测到的生物印记可用于表征表型（232)。在 一个非限制性的实例中，采用大小排阻和膜过滤从来自患者的血浆样品中分离囊泡群体。 从囊泡群体中提取的微RNA或mRNA的存在或水平用于检测生物印记。将生物印记随后用于 诊断、预后或治疗诊断所述患者。
[0164] 可选择用来检测囊泡群体的生物标志物，以检测感兴趣的微囊泡群体，例如，提供 选定病况或疾病的诊断、预后或治疗诊断的囊泡群体，该选定病况或疾病包括但不限于癌 症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或病症、心血管疾病或病症、神经疾 病或病症、感染性疾病或疼痛。更多细节见"表型"部分。在一个实施方案中，生物标志物选 自下组:EpCam(上皮细胞粘附分子）、CD9 (四跨膜蛋白CD9分子）、PCSA(前列腺细胞特异抗 原，参见 Rokhl in 等人，5E10 : a prostate-specific sur face-reactive monoclonal antibody .Cancer Lett .1998131:129-36)、CD63(四跨膜蛋白CD63分子）、CD81(四跨膜蛋白 CD81分子）、PSMA(F0LR1，叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原）1)、B7H3 (CD276分子）、PSCA(前 列腺干细胞抗原）、ICAM(细胞间粘附分子）、STEAP(STEAP1，前列腺六跨膜上皮抗原1)、KLK2 (激肽释放酶相关肽酶2)、SSX2 (滑膜肉瘤，X断点2)、SSX4(滑膜肉瘤，X断点4)、PBP(前列腺 结合蛋白）、SPDEF(含有ets转录因子的SAM指向域）、EGFR(表皮生长因子受体)及其组合。这 些标志物中的一种或多种可提供针对特定病况的生物印记，例如，以用于检测癌症，包括但 不限于癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、脑癌或其它类型的如本文 公开的癌症。在一个实施方案中，使用针对这些标志物中的一种或多种的结合剂捕获微囊 泡群体，并使用本发明的适体来帮助检测如本文所述的所捕获的囊泡。在其它实施方案中， 使用本发明的适体捕获微囊泡群体，并使用针对这些标志物中的一种或多种的结合剂来帮 助检测如本文所述的所捕获的囊泡。结合剂可以是任何有用的如本文公开或本领域已知的 结合剂，例如，抗体或适体。
[0165] 表征表型的方法可采用技术的组合，以评估存在于感兴趣的生物样品中的组分或 组分群体。例如，本发明的适体可用于评估单个细胞，或单个细胞外囊泡，或者细胞群体或 囊泡群体。可将样品分成多个等份，其中单独分析每个等份。例如，确定一个或多个等份的 蛋白质含量，并确定一个或多个其它等份的微RNA含量。可将蛋白质含量和微RNA含量结合 用于表征表型。在另一实施方案中，分离存在于感兴趣的生物样品中的组分，并评估其中的 有效负载(例如，采用本发明的适体捕获囊泡亚群的群体，并进一步评估存在于分离的囊泡 中的核酸或蛋白质）。
[0166] 在一个实施方案中，可通过采用针对微囊泡表面标志物的结合剂来分离具有给定 表面标志物的囊泡群体。参见例如，图24、28、16六。结合剂可以是经鉴定为采用本发明的方 法靶向微囊泡表面标志物的适体。评估分离的囊泡的其它生物标志物，如表面含量或有效 负载，其可以与适体特异性靶标的检测同时进行，或者另外的生物标志物的评估可以在适 体特异性靶标检测之前或之后进行。
[0167] 可通过检测循环生物标志物例如微RNA、蛋白质、囊泡或如本文公开的其它生物标 志物的存在、水平或浓度来定性地或定量地检测生物印记。可使用本领域技术人员所知的 多种技术检测这些生物印记组分。例如，可通过微阵列分析、聚合酶链反应(PCR)(包括基于 PCR的方法，如实时聚合酶链反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链反应(Q-PCR/qPCR)等）、与等 位基因特异性探针杂交、酶突变检测、连接酶链反应(LCR)、寡核苷酸连接分析(0LA)、流式 细胞异源双链体分析、错配的化学切割、质谱法、核酸测序、单链构象多态性(SSCP)、变性梯 度凝胶电泳（DGGE)、温度梯度凝胶电泳（TGGE)、限制片段多态性、基因表达的系列分析 (SAGE)或它们的组合检测生物标志物。可在检测前扩增生物标志物，诸如核酸。还可通过免 疫分析、免疫印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA;EIA)、放射免疫测定(RIA)、流式细 胞术或电子显微法(EM)检测生物标志物。
[0168] 如本文所述，可采用起捕获剂和检测剂作用的本发明的适体检测生物印记。捕获 剂可包含抗体、适体或识别生物标志物并且可用于捕获生物标志物的其它实体。可被捕获 的生物标志物包括循环生物标志物，例如，体液中的溶液中的蛋白质、核酸、脂质或生物复 合物。类似地，捕获剂可用于捕获囊泡。检测剂可包含抗体或识别生物标志物并且可用于检 测生物标志物囊泡或者识别囊泡并且可用于检测囊泡的其它实体。在一些实施方案中，对 检测剂进行标记并且检测该标记，由此检测生物标志物或囊泡。检测剂可以是结合剂，例如 抗体或适体。在其它实施方案中，检测剂包含小分子，诸如膜蛋白标记剂。例如，参见，公开 于Alroy等人的美国专利公开US 2005/0158708中的膜蛋白标记剂。在实施方案中，如本文 所述分离或捕获囊泡，并且使用一种或多种膜蛋白标记剂检测囊泡。在许多情况下，被捕获 剂和检测剂识别的抗原或其它囊泡部分是可互换的。
[0169] 在非限制性的实施方案中，采用对细胞特异性抗原具有特异性的结合剂，通过例 如将捕获抗体或适体栓系至基底上，来捕获在其表面上具有起源细胞特异性抗原和癌症特 异性抗原的囊泡，然后采用针对疾病特异性抗原的结合剂，通过例如用荧光染料标记用于 检测的结合剂并检测由该染料发射的荧光射线，而检测该囊泡。
[0170] 对于本领域技术人员明显的是，在结合剂(如本发明的适体)的靶分子对评价病况 或疾病提供信息的情况下，可使用相同的结合剂既捕获包含靶分子(例如，感兴趣的微囊泡 表面抗原）的组分又经过修饰以包含可检测的标记以便检测靶分子，例如，结合剂:-抗原-结合剂2*，其中*表不可检测的标记;结合剂1和结合剂2可以是相同的结合剂或不同的结合 剂(例如，相同的适体或不同的适体）。此外，结合剂:和结合剂2可选自完全不同的结合剂类 另IJ(例如，抗体、适体、合成抗体、肽-核酸分子，或者被配置为特异性结合或缔合其靶分子的 任何分子）。可仅根据其对靶分子的结合特异性来选择这类结合分子。
[0171] 使用本发明的适体检测生物标志物或捕获样品组分的技术包括使用平面基底如 阵列（例如，生物芯片或微阵列），其中分子作为有利于检测特定生物印记的结合剂固定至 该基底上。阵列可作为用于测定一种或多种生物标志物的试剂盒的一部分提供。在上文中 描述且在本发明的组合物和方法中有用的结合剂的其它实例在2011年4月6日提交的题为 "Circulating Biomarkers for Disease"的国际专利公布号TO/2011/127219中公开，该申 请通过引用以其全文并入本文。本发明的适体可被包括在用于检测和诊断包括症状前疾病 在内的疾病的阵列中。在一些实施方案中，阵列包括定制阵列，其包含经选择以特异性地鉴 定感兴趣的生物标志物的生物分子。可改进定制阵列以检测提高统计性能的生物标志物， 例如对在多变量预测模型（如，逻辑回归、判别分析或回归树模型）中产生改善的交叉验证 错误率的生物印记进行鉴定的额外生物分子。在一些实施方案中，构建定制阵列以研究疾 病、病况或综合征的生物学并且对限定生理状态下的生物印记进行概况分析。用于包含在 定制阵列上的标志物可根据统计标准加以选择，例如在区分表型或生理状态中具有所需水 平的统计显著性。在一些实施方案中，选用P值= 0.05的标准显著性以在微阵列上排除或包 括生物分子。P值可针对多重比较进行校正。作为说明性实例，从来自患有或未患疾病的受 试者的样品中提取的核酸可与高密度微阵列杂交，该微阵列结合数千种基因序列。在具有 或不具有疾病的样品之间具有显著不同水平的核酸可被选为区分样品是否具有该疾病的 生物标志物。可构建定制阵列以检测所选的生物标志物。在一些实施方案中，定制阵列包括 低密度微阵列，其指的是具有较低数目（例如，数十或数百种，而非数千种）的可寻址结合剂 的阵列。可在基底上形成低密度阵列。在一些实施方案中，可定制的低密度阵列使用在平板 孔内的PCR扩增，例如，TaqMan® Gene Expression Assays(Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA的Applied Biosystems)〇
[0172] 本发明的适体或其它有用的结合剂可直接或间接地连接至固体表面或基底。参见 例如，图2A-2B、9、16A。固体表面或基底可以是任何可物理分离的、结合剂可直接或间接地 与之附接的固体，包括但不限于，由微阵列和孔提供的表面、颗粒如珠子、柱、光纤、擦拭物 (wipes)、玻璃和改性的或官能化的玻璃、石英、云母、重氮化膜(纸或尼龙）、聚甲醛、纤维 素、醋酸纤维素、纸、陶瓷、金属、准金属、半导体材料、量子点、涂覆的珠子或颗粒、其它色谱 材料、磁性颗粒;塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯或其它材料的共聚物、聚丙烯、聚 乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟隆材料等）、多糖、尼龙或硝化纤维、树脂、二氧化硅或基于二氧 化硅的材料，包括硅和改性硅，碳、金属、无机玻璃、塑料、陶瓷、导电聚合物(包括聚合物如 聚吡咯和聚吲哚）；微米或纳米结构表面如核酸瓦片阵列、纳米管、纳米线或纳米颗粒装饰 的表面;或多孔表面或凝胶，如甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、糖聚合物、纤维素、硅酸盐或其它 纤维状或链状聚合物。此外，如本领域已知的，可采用含有任意数量材料的钝性或化学衍生 的涂料对基底进行涂覆，该材料包括聚合物，如葡聚糖、丙烯酰胺、明胶或琼脂糖。这类涂料 可有利于对生物样品使用阵列。
[0173] 如在以下的实例中提供的，适体或其它有用的结合剂可与可检测的实体或标记缀 合。合适的标记包括但不限于磁性标记、荧光部分、酶、化学发光探针、金属颗粒、非金属胶 状颗粒、聚合染料颗粒、颜料分子、颜料颗粒、电化学活性物质、半导体纳米晶体或其它纳米 颗粒(包括量子点或金颗粒）、荧光团、量子点或放射性标记。蛋白质标记包括绿色荧光蛋白 (GFP)及其变体(例如，蓝绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白）；以及如下所述的诸如萤光素酶的 发光蛋白质。放射性标记包括但不限于放射性同位素(放射性核素），如 3H、nC、14C、18F、32P、 355、64〇1、686&、86丫、991'。、 111111、1231、1241、1251、1311、 13%、1771^、21^或21如。荧光标记包括但 不限于稀土螯合物（例如，铕螯合物）、罗丹明；荧光素类，包括但不限于FITC、5-羧基荧光 素、6-羧基荧光素；罗丹明类，包括但不限于TAMRA;丹酰;丽丝胺(Lissamine);花青素;藻红 蛋白；德克萨斯红;Cy3、Cy5、dapoxy 1、NBD、级联黄(Cascade Yellow)、丹酰、PyMPO、花、7-二 乙基氨基香豆素-3-羧酸及其它香豆素衍生物、Marina BlueTM、PacifiC BlueTM、CaSCade 811^7'2-蒽磺酰、？71〇30、3,4,9，10-二萘嵌苯-四羧酸、2,7-二氟荧光素（0代8〇116代611™ 488-X)、5-羧基荧光素 、Texas Red™-X、Alexa Fluor 430、5-羧基四甲基罗丹明（5-TAMRA)、 6-羧基四甲基罗丹明（6-TAMRA)、B0DIPY FL、bimane，和 Alexa Fluor 350、405、488、500、 514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700和750，及其衍生物等。参见，例如， "The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies，''第十 版，可在因特网上于probes · invitrogen · com/handbook处找到。焚光标记可以是FAM、dRHO、 5-FAM ^ 6FAM ^ dR6G ^ JOE ^ HEX ^ VIC ^ TET ^ dTAMRA ^ TAMRA ^ NED ^ dROX ^ PET ^ BHQ ^ Go1d540 ^PLIZ ψ 的一种或多种。
[0174] 采用常规技术，可将适体直接或间接地标记，例如，标记通过生物素-链霉亲和素 附接至适体(例如，合成生物素化的适体，其然后能够结合自身缀合至可检测标记的链霉亲 和素分子;非限制性实例是藻红蛋白缀合的链霉亲和素(SAPE))。采用多步程序化学偶联的 方法包括生物素化、使用例如这些化合物的琥珀酰亚胺酯的三硝基苯酚(TNP)或洋地黄毒 苷的偶联。生物素化可通过例如使用D-生物素基-N-羟基琥珀酰亚胺来实现。琥珀酰亚胺基 团在高于7的pH值下有效地与氨基基团反应，在约pH 8.0到约pH 8.5之间优先。或者，适体 没有被标记，而是稍后与第二抗体接触，该第二抗体在第一抗体与感兴趣的抗原结合之后 被标记。
[0175] 各种酶-底物标记也可与本发明的组合物或方法结合使用。这类酶-底物标记是可 商购的（例如，美国专利号4,275，149)。酶通常催化发色底物的化学变化，该变化可采用各 种技术测量。例如，酶可以催化底物的颜色变化，该颜色变化可通过分光光度法测量。或者， 酶可以改变底物的荧光或化学发光。酶标记的实例包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和 细菌萤光素酶;美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、 过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP )、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌 酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、杂环氧化酶(例 如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶）、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。酶-底物组合的实例包括但不 限于：使用过氧化氢酶作为底物的辣根过氧化物酶(H R Ρ )，其中过氧化氢酶氧化染料前体 (例如邻苯二胺(CPD)或3,37 四甲基联苯胺盐酸盐(ΤΜΒ));使用对硝基苯基磷酸酯作 为发色底物的碱性磷酸酶(AP);以及使用发色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或 发荧光底物(4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷酶)的β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)。
[0176] 适体可连接至基底，如平面基底。平面阵列通常以阵列形式包含生物分子的可寻 址位置(例如便签(pad)、地址或微位置）。阵列的大小应取决于该阵列的组成和最终用途。 可以制备包含2种至数千种不同分子的阵列。通常，阵列包含2种至多达100,000种或更多种 分子，这取决于该阵列的最终用途以及制造方法。用于本发明的微阵列包含至少一种生物 分子，该生物分子鉴定或捕获存在于感兴趣的生物印记中的生物标志物，例如构成生物印 记的微RNA或其它生物分子或囊泡。在一些阵列中，使用具有不同或相同组成的多个基底。 因此，平面阵列可包含多个较小的基底。
[0177] 本发明可利用多类型的阵列来检测生物标志物，例如，与感兴趣的生物印记相关 的生物标志物。有用的阵列或微阵列包括但不限于DNA微阵列(诸如cDNA微阵列、寡核苷酸 微阵列和SNP微阵列）、微RNA阵列、蛋白质微阵列、抗体微阵列、组织微阵列、细胞微阵列（亦 称为转染微阵列）、化学化合物微阵列以及碳水化合物阵列(糖阵列）。这些阵列在以上更详 尽地描述。在一些实施方案中，微阵列包含提供识别分子(例如，适体或抗体)的高密度固定 阵列的生物芯片，其中间接监测(例如，通过荧光)生物标志物结合。
[0178] 可用于检测生物印记的一种或多种生物标志物且包含一种或多种适体的阵列或 微阵列可根据美国专利号6,329,209、6,365,418、6,406,921、6,475,808和6,475,809中描 述的方法制备，其每一个均通过引用以全文并入本文。可使用这些专利中描述的方法制备 用于检测本文所述的生物标志物的特定选组的定制阵列。可商购的微阵列也可用于实施本 发明的方法，包括但不限于来自 Affymetrix(Santa Clara，CA)、Illumina(San Diego，CA)、 Agilent(Santa Clara，CA)、Exiqon(Denmark)或Invitrogen(Carlsbad，CA)的那些微阵列。 定制阵列和/或商业化阵列包括如本文所述的用于检测蛋白质、核酸以及其它生物分子和 实体(例如细胞、囊泡、病毒)的阵列。
[0179] 在一些实施方案中，在阵列上布置多种捕获分子，例如，蛋白质、肽或其它核酸分 子。在某些实施方案中，采用使蛋白质变性最小化、使蛋白质活性变化最小化或使蛋白质与 其固定的表面之间的相互作用最小化的方法和材料固定蛋白质。捕获分子可包括一种或多 种本发明的适体。在一个实施方案中，构建用于适体池的杂交的阵列。然后可利用该阵列鉴 定结合样品的池成员，由此促进表型的表征。进一步的细节见图16B-16C和相关的公开内 容。
[0180] 有用的阵列表面可以为任何所需的形状、形式或大小。表面的非限制实例包括芯 片、连续的表面、弯曲表面、柔性表面、膜、板、薄片或管。表面可以具有大约一平方微米至大 约500cm 2的面积。表面的面积、长度和宽度可以根据待实施的试验的需求而变化。考虑因素 可以包括，例如，操作的简易性、形成表面的材料的限制、检测系统的需要、沉积系统（例如 阵列仪)的需要等。
[0181] 在某些实施方案中，希望使用物理手段来分离结合岛或固定的生物分子的组或阵 列:这样的物理分离有助于将不同的组或阵列暴露于不同的感兴趣的溶液。因此，在某些实 施方案中，阵列位于具有任意数目的孔的微孔板中。在这样的实施方案中，孔的底可以充当 用于形成阵列的表面，或者阵列可以在其它表面上形成然后被放置在孔中。在某些实施方 案中，例如在使用不具有孔的表面的情况下，可以形成结合岛或者可将分子固定在表面上 和衬垫上，其具有空间排列的洞以使它们对应于岛或可将生物分子置于表面上。这样的衬 垫优选为液体密封的。衬垫可以在制备阵列的过程中的任何时间放置在表面上，并且如果 不再需要该组或阵列的隔离，则可以除去。
[0182] 在一些实施方案中，固定的分子可以结合与固定分子接触的生物样品中存在的一 种或多种生物标志物或囊泡。在一些实施方案中，固定分子修饰与固定分子接触的一种或 多种囊泡中存在的分子，或者被该分子所修饰。与样品接触一般包括将样品覆盖于阵列上。 [0183]可以使用本领域已知的检测技术来检测溶液中或固定在阵列上的分子的修饰或 结合。这类技术的实例包括免疫技术，例如竞争性结合试验和夹心试验;使用诸如共焦扫描 仪、共焦显微镜或基于CCD的系统之类的装置以及诸如荧光、荧光偏振(FP)、荧光共振能量 转移(FRET)、全内反射荧光(TIRF)、荧光相关谱(FCS)之类的技术进行的荧光检测；比色/光 谱技术;表面等离子体共振(通过该技术测量在表面吸附的物质质量的变化）；使用放射性 同位素的技术，包括常规同位素结合以及闪烁迫近分析(SPA);质谱法，例如基质辅助激光 解吸/电离质谱法(MALDI)和MALDI飞行时间（T0F)质谱法;椭圆光度法，其为测量蛋白质膜 厚度的光学方法;石英晶体微天平(QCM)，其为测量吸附在表面上的材料质量的极灵敏的方 法；扫描探针显微术，例如原子力显微术（AFM)、扫描力显微术（SFM)或扫描电子显微术 (SEM);以及诸如电化学、阻抗、声学、微波和IR/Raman检测这样的技术。例如参见Mere L等 人/'Miniaturized FRET assays and microfluidics：key components for ultra-high-throughput screening/'Drug Discovery Today 4(8) :363-369( 1999) 及其中引 用的文 献；Lakowicz J R,Principles of Fluorescence Spectroscopy，第2片反，Plenum Press (1999)，或Jain KK：Integrative Omics，Pharmacoproteomics，and Human Body Fluids.In：Thongboonkerd V编·Proteomics of Human Body Fluids : Principles， Methods and Applications.Volume l:Totowa，N.J.:Humana Press，2007,各文献均通过 引用以其全文并入本文。
[0184] 微阵列技术可以与质谱(MS)分析和其它工具相结合。质谱的电喷雾的接口可以与 微流体设备中的毛细管集成。例如，一种市售可得的系统包含eTag报告物，其为具有独特且 良好定义的电泳迀移率的荧光标记物;各个标记物通过可切割的键而与生物或化学探针偶 联。各个eTag报告物的不同的迀移率定址使得这些标记物的混合物能够通过毛细管电泳快 速地解卷积和定量。该系统可以对同一样品同时进行基因表达、蛋白质表达和蛋白质功能 的分析，Jain KK: Integrative Omics，Pharmacoproteomics，and Human Body Fluids. In： Thongboonkerd V编辑，Proteomics of Human Body Fluids principles,Methods and Applications.第1卷:Totowa，N.J. :Humana Press，2007,其通过引用以其全文并入本文。
[0185] 生物芯片可包括用于微流体或纳米流体分析的组分。微流体装置可用于分离或分 析生物标志物，诸如测定生物印记。微流体系统允许对用于分离、捕获或检测囊泡、检测微 RNA、检测循环生物标志物、检测生物印记的一种或多种过程以及其它过程进行小型化和区 室化。在该系统的至少一个方面，微流体装置可以使用一种或多种检测试剂，并且该检测试 剂可以用于检测一种或多种生物标志物。在一个实施方案中，该装置检测分离的或结合的 囊泡上的生物标志物。各种探针、抗体、蛋白质或其它结合剂可用于检测微流体系统内的生 物标志物。检测剂可以固定在微流体装置的不同区室内或通过该装置的各个通道进入杂交 或检测反应中。
[0186] 微流体装置中的囊泡可在该微流体装置内裂解并对其内容物进行检测，诸如蛋白 质或核酸，例如DNA或RNA，诸如miRNA或mRNA。核酸可以在微流体装置中在检测前扩增或直 接检测。因此，微流体系统也可用于对各种生物标记物的多重检测。在一个实施方案中，在 微流体装置内捕获囊泡，裂解所捕获的囊泡，并且由囊泡有效负载确定微RNA的生物印记。 生物印记可进一步包含用于捕获囊泡的捕获剂。
[0187] 新型纳米制造技术为以下生物传感应用开启了可能性，该生物传感应用依赖于制 造高密度、精确的阵列，例如，基于核苷酸的芯片和亦称为异质纳米阵列的蛋白质芯片。纳 米流体允许将微芯片中流体分析物的量进一步减少至纳升水平，并且在此所用的芯片被称 为纳米芯片。例如，参见Unger Μ等人，Biotechniques 1999;27(5):1008_14，Kartalov EP 等人，Biotechniques 2006;40(1):85-90，各自通过引用以其全文并入本文。目前市售可得 的纳米芯片提供了简单的单步分析，例如总胆固醇、总蛋白质或葡萄糖分析，其可以通过将 样品与试剂合并，混合并监测反应来运行。基于液相色谱法(LC)和纳米LC分离的无凝胶分 析方法（Cutillas 等人，Proteomics，2005;5:101-112 和 Cutillas 等人，Mol Cell Proteomics2005;4:1038-1051，各自通过引用以其全文并入本文)可以与纳米芯片结合使 用。
[0188] 适用于鉴定疾病、病况、综合征或生理状态的阵列可包括在试剂盒中。试剂盒可包 括本发明的适体，作为非限制性的实例，包括对制备用于固定到阵列的结合岛或区域上的 分子有用的一种或多种试剂、对检测囊泡与固定分子的结合有用的试剂以及使用说明书。
[0189] 本文进一步提供了有助于检测生物样品中的特定生物印记的快速检测装置。该装 置可以将生物样品制备与聚合酶链反应(PCR)集成在芯片上。该装置可促进生物样品中囊 泡的特定生物印记的检测，并且如Pipper等人，Angewandte Chemie，47(21)，ρ· 3900-3904 (2008)中所述提供了实例，该文献通过引用以其全文并入本文。可以使用用于诊断应用的 微/纳米电化学系统（MEMS/NEMS)传感器和经口流体来引入生物印记，如在Li等人，Adv Dent Res 18(1) :3-5(2005)中所述，其通过引用以其全文并入本文。 颗粒阵列
[0190] 作为平面阵列的替代，采用颗粒的分析，如基于珠子的分析也能够与本发明的适 体一起使用。适体很容易与可商购的珠子缀合。参见，例如，51*;[11；^38等人41^1.0161]1.2011 年10月21日，Aptamer functionalized Microgel Particles for Protein Detection;另 见，适体作为治疗剂和诊断剂的综述文章，Brody和Gold，Rev.Mol. Biotech. 2000，74:5-13。
[0191] 使用具有同源配体的珠子涂层和具有特定活性的报告分子、符合高灵敏度自动化 的多参数分析或其它高通量检测分析均可以使用。在基于珠子的分析系统中，生物标志物 或囊泡的结合剂，如捕获剂(例如，捕获抗体），可以固定在可寻址的微球上。如图2B所示，用 于每个单独的结合分析的每种结合剂可以偶联至不同类型的微球（即，微珠)上，并且分析 反应发生在微球的表面上。囊泡的结合剂可以是偶联至珠子的捕获抗体。具有离散的荧光 强度的染色微球分别负载有其合适的结合剂或捕获探针。携带不同结合剂的不同的珠子组 可根据需要合并，以生成定制的珠子阵列。然后将珠子阵列与样品在单个反应容器中温育， 以进行该分析。
[0192] 基于珠子的分析也可与一种或多种本发明的适体一起使用。珠子基底可提供用于 附接一种或多种结合剂(包括适体）的平台。为了多重分析(Multiplexing)，多个不同珠子 组(例如，11 lumina，Luminex)可具有不同的结合剂(对不同的革E1分子为特异性的）。例如，珠 子可以与用来检测感兴趣的抗原的存在(定量或定性地)的本发明适体缀合，或者其也可用 于分离存在于选定生物样品中的组分(例如，包含靶分子的细胞、细胞片段或囊泡，该适体 被配置为与之结合或缔合）。任何有机来源的分子均可以通过使用可商购的试剂盒成功地 缀合至聚苯乙烯珠子。
[0193] -种或多种本发明的适体可与任何基于珠子的底物一起使用，包括但不限于磁性 捕获法、荧光激活细胞分选术(FACS)或激光流式细胞术。磁性捕获法可包括但不限于磁激 活细胞分选(MACS)微珠或磁柱的使用。可被改进以使用本发明适体的基于珠子或颗粒的方 法的实例包括在美国专利号 4,551，435、4,795,698、4,925,788、5，108,933、5，186,827、5， 200,084或5，158,871、7,399,632、8，124,015、8,008,019、7,955,802、7,445,844、7,274， 316、6,773,812、6,623,526、6,599,331、6,057，107、5,736,330、国际专利公布号恥/2012/ 174282、W0/1993/022684中描述的方法和珠子系统。 流式细胞术
[0194] 来自生物样品的循环生物标志物例如蛋白质抗原，或包含生物标志物的细胞、细 胞片段或囊泡的分离或检测还可在流式细胞术过程中采用本发明的适体来实现。作为非限 制性实例，本发明的适体可在包括使用颗粒如珠子或微球的分析中使用。本发明提供作为 结合剂的适体，其可缀合至颗粒。流式细胞术可以用于分选悬浮于流体流中的微观颗粒。当 颗粒通过时，它们可以选择性地带电荷并在它们离开时可以偏转到独立的流动路径中。因 此，有可能以高度的精确性和速度从原始混合物如生物样品中分离群体。流式细胞术允许 对流过光学/电子检测设备的单细胞的物理和/或化学特征同时进行多参数分析。单频率 (颜色）的光束(通常为激光)指向到流体动力学聚焦的流体流上。多个检测器瞄准于流体流 经过光束的点；一个与该光束成一直线（正向散射或FSC)，并且有几个垂直于该光束(侧向 散射或SSC)以及一个或多个荧光检测器。
[0195]通过光束的各悬浮颗粒以某种方式散射光线，并且颗粒中的荧光化学物质可以被 激发以发射频率低于光源的光。散射光与荧光的这种组合被检测器所拾取，并且通过分析 各检测器(一个检测器针对一个荧光发射峰)处亮度的波动，有可能推断关于各单个颗粒的 物理和化学结构的各种事实。FSC与单元尺寸相关，而SSC取决于微粒的内部复杂性，例如细 胞核的形状、细胞质颗粒物的量和类型或者膜的粗糙度。一些流式细胞仪无需荧光而仅使 用光散射进行测量。
[0196]流式细胞仪可以"实时"地每秒分析几千个颗粒，并且可以主动地分开并分离具有 指定性质的颗粒。它们提供了在各分析阶段对于大量单细胞的设定参数的高通量自动化定 量和分离。流式细胞仪可以具有多个激光器和荧光检测器，从而允许使用多种标记按照目 标群体的表型更精确地对其加以指定。因此，流式细胞仪，如多色流式细胞仪，可用于检测 具有多种荧光标记或颜色的一种或多种囊泡。在一些实施方案中，流式细胞仪还可分选或 分离不同的囊泡群体，诸如根据大小或根据不同的标志物。
[0197] 流式细胞仪可具有一个或多个激光器，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个激 光器。在一些实施方案中，流式细胞仪可检测多于一种颜色或荧光标记，诸如至少2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的颜色或荧光标记。例如，流式细胞 仪可具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个荧光检测器。
[0198] 可用于检测或分析一种或多种囊泡、用于分选或分离不同的囊泡群体的商购可得 的流式细胞仪的实例包括但不限于MoFlo™ XDP Cell Sorter(Beckman Coulter，Brea， CA)nMoF1o™ Legacy Cell Sorter(Beckman Coulter,Brea,CA)nBD FACSAria™ Cell Sorter(BD Biosciences，San Jose，CA)、BD™ LSRII(BD Biosciences，San Jose，CA)以及 BD FACSCalibur™(BD Biosciences，San Jose，CA)。如下文进一步描述的，使用多色或多荧 光流式细胞仪可用于囊泡的多重分析。在一些实施方案中，流式细胞仪可分选，并因此根据 一种或多种特征收集或分选超过一个囊泡群体。例如，两个大小不同的囊泡群体，使得每个 群体内的囊泡具有相似的大小范围并且可被差异地检测或分选。在另一实施方案中，两个 不同的囊泡群体被差异地标记。
[0199] 可将得自流式细胞仪的数据以一维的方式作图从而得到柱状图，或者以二维的方 式制作为点状图，或者使用较新的软件以三维方式作图。这些图上的区域可以通过一系列 子集提取(其称为门控(gates))来顺序分离。存在用于诊断和临床目的的特定的门控方案， 特别是关于血液学。这些图通常以对数尺度完成。因为不同荧光染料的发射谱重叠，所以在 检测器处的信号必须通过电子以及计算方式来补偿。用于标记生物标志物的荧光团可包括 在Ormerod，Flow Cytometry 第2版，Spr inger-Verlag，New York(l9")和Nida等人， Gynecologic Oncology 2005;4 889-894中描述的焚光团，该文献通过引用并入本文。在包 括但不限于流式细胞分析的多重分析中，可评估一种或多种不同的靶分子。在一些实施方 案中，至少一种靶分子是采用本发明的适体评估的生物标志物，例如，微囊泡表面抗原。 微流体
[0200] 可将一种或多种本发明的适体布置在任何有用的平面或珠子基底上。在本发明的 一个方面，将一种或多种本发明的适体布置在微流体装置上，从而有助于评估、表征或分离 包含感兴趣的多肽抗原或其功能片段的生物样品的组分。例如，循环抗原或包含该抗原的 细胞、细胞片段或细胞衍生的囊泡可采用一种或多种本发明的适体(或者与其它结合剂一 起)来评估。微流体装置，也可被称为"芯片上实验室"系统、生物医学微机电系统(bioMEM) 或多组件集成系统，可用于分离和分析囊泡。这类系统将允许囊泡结合、生物印记检测的过 程和其它过程小型化和区室化。
[0201] 微流体装置也可用于通过大小差别或亲和选择来分离囊泡。例如，微流体装置可 采用一个或多个通道，该通道用于基于大小或通过使用一种或多种用于从生物样品中分离 囊泡的结合剂而从生物样品中分离囊泡。可将生物样品引入到一个或多个微流体通道中， 这些通道选择性地允许囊泡通过。该选择可基于囊泡的性质，如囊泡的大小、形状、可变形 性或生物印记。
[0202] 在一个实施方案中，可将异质的囊泡群体引入到微流体装置中，由此可获得一个 或多个不同的均质的囊泡群体。例如，不同的通道可具有不同的大小选择或结合剂，以供选 择不同的囊泡群体。因此，微流体装置可分离多种囊泡，其中该多种囊泡的至少一个子集包 含与该多种囊泡的另一个子集不同的生物印记。例如，微流体装置可分离至少2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个不同的囊泡子集，其中囊泡的每个子 集均包含不同的生物印记。
[0203] 在一些实施方案中，微流体装置可包含一个或多个通道，该通道允许囊泡的进一 步富集或选择。在通过第一通道后已被富集的囊泡群体可被引入第二通道中，这允许所需 的囊泡或囊泡群体通过，例如通过存在于第二通道中的一种或多种结合剂进一步富集。
[0204] 基于阵列的分析和基于珠子的分析可与微流体装置一起使用。例如，结合剂可偶 联至珠子，并且该珠子与囊泡之间的结合反应可在微流体装置中进行。还可以采用微流体 装置进行多重分析。不同的区室可包含针对不同囊泡群体的不同结合剂，其中每个群体是 不同的起源细胞特异性囊泡群体。在一个实施方案中，每个群体具有不同的生物印记。在微 球与囊泡之间的杂交反应可在微流体装置中进行，并且反应混合物可递送至检测装置。检 测装置，如双重或多重激光检测系统，可以是微流体系统的一部分，并且可使用激光根据其 颜色编码来鉴定每个珠子或微球，并且另一个激光可检测与每个珠子相关的杂交信号。
[0205] 任何合适的微流体装置可在本发明的方法中使用。可用于囊泡或经调整以用于囊 泡的微流体装置的实例包括但不限于在美国专利号7,591，936、7,581，429、7,579，136、7， 575,722、7,568,399、7,552,741、7,544,506、7,541，578、7,518,726、7,488,596、7,485， 214、7,467,928、7,452,713、7,452,509、7,449,096、7,431，887、7,422,725、7,422,669、7， 419,822、7,419,639、7,413,709、7,411，184、7,402,229、7,390,463、7,381，471、7,357， 864、7,351，592、7,351，380、7,338,637、7,329,391、7,323，140、7,261，824、7,258,837、7， 253,003、7,238,324、7,238,255、7,233,865、7,229,538、7,201，881、7，195,986、7，189， 581、7，189,580、7，189,368、7，141，978、7，138,062、7，135，147、7，125,711、7，118,910、7， 118,661、7,640，947、7,666,361、7,704,735以及国际专利公布TO 2010/072410中描述的那 些装置;这些专利或申请中的每一个均通过引用以其全文并入本文。用于本文公开的方法 的另一实例描述于Chen等人，"Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum vesicles，"Lab on a Chip，2009年12月8日D0I:10.1039/b916199f中。
[0206] 本发明使用的其它微流体装置包括包含弹性体层、阀或栗的装置，包括但不限于 在美国专利号 5,376，252、6,408,878、6,645,432、6,719,868、6,793,753、6,899,137、6， 929,030、7,040,338、7，118,910、7，144,616、7,216,671、7,250，128、7,494,555、7,501， 245、7,601，270、7,691，333、7,754,010、7,837,946;美国专利申请号2003/0061687、2005/ 0084421、2005/0112882、2005/0129581、2005/0145496、2005/0201901、2005/0214173、 2005/0252773、2006/0006067;和欧洲专利号0527905和1065378中公开的那些装置，这些文 件中的每一个均通过引用并入本文。在一些情况下，所述装置的大部分或全部由弹性体材 料构成。某些装置被设计成用包含一个或多个弹性体阀以调节溶液通过该装置的流动的装 置来进行热循环反应(例如，PCR)。所述装置可包含反应位点的阵列，从而允许进行多个反 应。因此，所述装置可用来以多重方式评估循环微RNA，包括从囊泡中分离的微RNA。在一个 实施方案中，所述微流体装置包含(a)在弹性体基底中形成的第一多条流动通道；（b)在弹 性体基底中形成的第二多条流动通道，第二多条流动通道与第一多条流动通道交叉以限定 反应位点的阵列，每个反应位点位于第一和第二流动通道之一的交叉点处；（c)沿第一和第 二多条流动通道布置并在反应位点之间隔开的多个隔离阀，其可被致动以将每个反应位点 内的溶液与其它反应位点处的溶液隔离开，其中所述隔离阀包含一条或多条控制通道，该 控制通道各自与一条或多条流动通道叠加和交叉；以及(d)用于同时致动阀门以将反应位 点彼此隔离开的工具。对所述装置的基本结构的各种改动包含在本发明的范围内。可使用 PCR方法在各个反应位点中检测微RNA。例如，该方法可包括下列步骤：（i)提供微流体装置， 该微流体装置包含:具有通过通道互相流体连通的第一末端和第二末端的第一流体通道； 多条流动通道，每个流动通道终止于末端壁处;其中每条流动通道从第一流体通道分出并 与第一流体通道流体连通，其中从第一流体通道进入流动通道之一的水性流体仅可通过第 一流体通道流出流动通道；以及与第一流体通道流体连通的入口，该入口用于引入样品流 体;其中每个流动通道与阀门关联，当阀门关闭时，其将流动通道的一端与第一流体通道隔 离，由此在阀门与末端壁之间形成隔离的反应位点;控制通道;其中每个阀门都是可偏转的 膜，当向控制通道施加致动力时，该膜偏转到与阀门关联的流动通道内，从而关闭阀门；且 其中当向控制通道施加致动力时，每个流动通道中的阀门关闭，以致在各个流动通道中产 生隔离的反应位点；（ii)将样品流体引入入口，该样品流体填充流动通道；（iii)致动该阀 门以将样品流体分隔到流动通道内的独立部分中；（iv)扩增样品流体中的核酸；（v)分析样 品流体的部分以确定所述扩增是否产生反应。样品流体可含有可扩增的核酸靶标，例如，微 RNA，且条件可以是聚合酶链反应(PCR)条件，以致该反应导致PCR产物的形成。
[0207] 微流体装置可以具有一种或多种附接至通道中的表面或存在于通道中的结合剂。 例如，微通道可具有一种或多种捕获剂，如针对表3中的一种或多种一般微囊泡抗原或表4 中的起源细胞或癌症相关抗原的捕获剂，所述抗原包括但不限于EpCam、CD9、PCSA、CD63、 CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP、KLK2、SSX2、SSX4、PBP、SPDEF和EGFR。捕获剂可以是通 过本发明的方法选择的适体。通道的表面还可以与本发明的封闭适体接触。在一个实施方 案中，微通道表面用抗生物素蛋白处理，并且可向通道中注入经生物素化的捕获剂如抗体 以结合抗生物素蛋白。在其它实施方案中，捕获剂存在于微流体装置的腔室或其它部件中。 捕获剂也可附接至能够经操作而穿过微流体通道移动的珠子上。在一个实施方案中，捕获 剂附接到磁珠上。该珠子可用磁体操作。
[0208] 可使生物样品流入微流体装置或微通道中，其流速为例如至少约1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或5(^1/分钟，如约1-50、5-40、 5-30、3-20或5-15μ1/分钟。微流体装置中可捕获和直接检测一种或多种囊泡。或者，所捕获 的囊泡可在分析前释放并且离开微流体装置。在另一个实施方案中，在微通道中裂解一种 或多种所捕获的囊泡并分析裂解物，例如，检测囊泡内的有效负载。可使裂解缓冲液流过通 道并裂解所捕获的囊泡。例如，可使裂解缓冲液流入装置或微通道，其流速为例如至少约1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、26、27、28、29、30、35、40、45或 50μ1/分钟，如约1-50、5-40、10-30、5-30或10-35μ1/分钟。可收集并分析裂解物，诸如进行 RT-PCR、PCR、质谱法、Western印迹法或其它分析，以检测囊泡的一种或多种生物标志物。 表型
[0209] 本文公开了采用本发明的方法和组合物表征表型的产物和过程。如本文所用的术 语"表型"可以指归因于生物标志物谱的任何性状或特征，该生物标志物谱部分或完全采用 本发明的组合物和/或方法鉴定。例如，表型可以是基于从受试者获得的样品的经表征的生 物标志物谱的诊断、预后或治疗诊断确定。表型可以是如疾病或病况、疾病或病况的阶段、 对疾病或病况的易感性、疾病阶段或病况的预后、生理状态或对治疗剂的响应/潜在响应的 任何可观察的特征或性状。表型可起因于受试者的遗传构成以及环境因素的影响和这两者 之间的相互作用，以及对核酸序列的表观遗传修饰。
[0210] 受试者中的表型可以通过从受试者获得生物样品并使用本发明的组合物和/或方 法分析该样品来表征。例如，表征受试者或个体的表型可以包括检测疾病或病况(包括症状 前的早期阶段检测），确定疾病或病况的预后、诊断或治疗诊断，或者确定疾病或病况的阶 段或进展。表征表型可以包括鉴定针对特定疾病、病况、疾病阶段或病况阶段的适当治疗或 治疗效力，疾病进展的预测和可能性分析，特别是疾病复发、转移扩散或疾病复发。表型也 可以是病况或疾病如癌症或肿瘤的临床上独特的类型或亚型。表型的确定还可以是生理状 况的确定，或器官危境或器官排斥(如移植后）的评估。本文所述的组合物和方法可以在个 体的基础上评估受试者，其可以提供在治疗中的更有效和更经济的决策的益处。
[0211] 在一方面，本发明涉及生物标志物如微囊泡的分析，以提供疾病或病况的诊断、预 后和/或治疗诊断。治疗诊断包括诊断测试，其提供影响疾病或疾病状态的疗法或治疗的能 力。治疗诊断测试以与诊断或预后测试分别提供诊断或预后相似的方式提供治疗诊断。如 本文所用的，治疗诊断涵盖了任何所需形式的治疗相关的测试，包括预测医学、个性化医 学、综合医学、药理诊断学和Dx/Rx配合。治疗相关测试可用于预测和评价受试个体中的药 物反应，即，提供个性化医疗。预测药物反应可以例如在受试者暴露于治疗或以其它方式用 该治疗进行处置之前确定受试者是否是候选治疗剂的可能的响应者或可能的非响应者。评 估药物反应可以监测对药物的反应，例如，在开始治疗后的一段时期内监测受试者的改善 或改善的缺乏。治疗相关测试可用于为治疗方法选择特别可能受益于该治疗的受试者，或 者提供关于在受试个体中的治疗效力的早期及客观的指示。因此，使用本发明的方法和组 合物的分析可指示应该改变疗法以选择更具前景的治疗，从而避免延误有益治疗的巨大代 价并避免施用无效药物的经济成本和病痛成本。
[0212] 因此，本发明的组合物和方法可帮助预测患者是否可能对针对疾病或病症的治疗 有反应。表征表型包括预测受试者的响应者/非响应者状态，其中响应者对疾病的治疗有反 应而非响应者对该治疗无反应。可分析受试者中的生物标志物如微囊泡，并与已知对该治 疗有反应或没有反应的先前受试者的囊泡分析进行比较。如果受试者中的生物标志物谱与 已知对该治疗有反应的先前受试者的生物标志物谱更为接近，则可将该受试者表征或预测 为该治疗的响应者。类似地，如果受试者中的生物标志物谱与已知对该治疗无反应的先前 受试者的生物标志物谱更为接近，则可将该受试者表征或预测为该治疗的非响应者。治疗 可针对任何合适的疾病、病症或其它病况，包括但不限于本文公开的那些。
[0213] 在一些实施方案中，表型包括疾病或病况，如表1或16中列出的那些。例如，表型可 包括检测肿瘤、赘生物或癌症的存在或发生的可能性，或表征该肿瘤、赘生物或癌症(例如， 阶段、等级、侵袭性、转移或复发的可能性，等等）。可通过本文所述的方法或组合物检测或 评估的癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、增生性息肉、腺瘤、结直肠癌、高度 发育异常(high grade dysplasia)、低度发育异常（low grade dysplasia)、前列腺增生、 前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、脑癌(例如胶质母细胞瘤）、血液恶性肿瘤、肝细胞癌、宫颈癌、 子宫内膜癌、头颈癌、食管癌、胃肠道间质瘤(GIST)、肾细胞癌(RCC)或胃癌。该结直肠癌可 以是CRC Dukes B或CRC Dukes C-D。该血液恶性肿瘤可以是B细胞慢性淋巴细胞白血病、B 细胞淋巴瘤_DLBCL、B细胞淋巴瘤-DLBCL-生发中心样、B细胞淋巴瘤-DLBCL-活化B细胞样以 及伯基特淋巴瘤。
[0214] 所述表型可以是恶变前状况，诸如光化性角化病、萎缩性胃炎、白斑病、增殖性红 斑、淋巴瘤样肉芽肿病、白血病前期、纤维化、宫颈非典型增生、子宫颈非典型增生、着色性 干皮病、巴雷特食管、结肠直肠息肉或有可能发展成恶性肿瘤的其它异常组织生长或病变。 诸如HIV和HPV的转化型病毒感染也提供了可根据本发明进行评估的表型。
[0215] 通过本发明的方法表征的癌症可包括但不限于癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病、生殖 细胞瘤、母细胞瘤(blastoma)或其它癌症。癌瘤包括但不限于上皮肿瘤、鳞状细胞肿瘤鳞状 细胞癌、基底细胞肿瘤基底细胞癌、移行细胞乳头状瘤和癌、腺瘤和腺癌（腺体）、腺瘤、腺 癌、皮革样胃胰岛素瘤(linitis plastica insulinoma)、高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性 肠肽瘤、胆管癌、肝细胞癌、囊性腺样癌、阑尾类癌瘤、泌乳素瘤、大嗜酸粒细胞瘤、许特莱氏 细胞腺瘤(hurthle cell adenoma)、肾细胞癌、格拉维茨瘤(grawitz tumor)、多发性内分 泌腺瘤、子宫内膜腺瘤、附件和皮肤附件肿瘤、粘液表皮样肿瘤、囊性、粘液性和浆液性肿 瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、导管、小叶和髓质肿瘤、腺泡细胞肿瘤、复合上皮肿瘤、沃辛肿瘤 (warthir/ s tumor)、胸腺瘤、特化生殖腺肿瘤、性索间质瘤、泡膜细胞瘤、粒膜细胞瘤、卵巢 雄性细胞瘤、支持细胞-间质细胞瘤（sertoli leydig cell tumor)、血管球瘤、副神经节 瘤、嗜铬细胞瘤、血管神经肌瘤、痣与黑色素瘤、黑素细胞痣、恶性黑色素瘤、黑色素瘤、结节 性黑色素瘤、发育不良痣、恶性痣性黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤以及恶性肢端着色斑性 黑色素瘤。肉瘤包括但不限于Askin肿瘤、葡萄状肉瘤(botryodies)、软骨肉瘤、尤因肉瘤、 恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤，其包括:腺泡状软组织肉瘤、血管肉 瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆形细胞瘤、上皮样肉瘤、 骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉 瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和 滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括但不限于慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细 胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤(诸如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症）、脾边缘 区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、亦称为malt淋巴瘤 的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节性边缘区B细胞淋巴瘤(nmzl)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴 瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出 性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、T细胞幼淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血 病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞性白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型、肠病型 T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病/塞扎里综合征、原发 性皮肤CD30阳性T细胞淋巴组织增生性疾病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘 疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、非指定、间变性大细胞淋巴瘤、典 型霍奇金淋巴瘤(结节性硬化、混合细胞性、富淋巴细胞、淋巴细胞耗尽或非耗尽）以及结节 性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。生殖细胞瘤包括但不限于生殖细胞瘤、无性细胞瘤、精原 细胞瘤、非生殖细胞瘤性生殖细胞瘤、胚胎癌、内胚窦肿瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤、多胚瘤和成 性腺细胞瘤。母细胞瘤包括但不限于肾母细胞瘤、髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。其它癌症 包括但不限于唇癌、喉癌、咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺癌（延髓和乳头状甲状 腺癌）、肾癌、肾实质癌、子宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、睾丸癌、泌尿系癌、黑 色素瘤、脑瘤(如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤和外周神经外胚瘤）、胆囊 癌、支气管癌、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、畸胎瘤、视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原 细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤因肉瘤 和浆细胞瘤。
[0216] 在进一步的实施方案中，进行分析的癌症可以是肺癌，包括非小细胞肺癌和小细 胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌）、混合性小细胞/大细胞癌以及合并性小细胞癌）、结肠 癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、皮肤癌、骨癌、胃部癌、乳腺 癌、胰腺癌、胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状癌肾癌、头颈部鳞状细胞癌、白血 病、淋巴瘤、骨髓瘤或实体瘤。
[0217] 在实施方案中，所述癌症包括急性淋巴母细胞性白血病;急性髓样白血病;肾上腺 皮质癌;AIDS相关癌症;AIDS相关淋巴瘤;肛门癌；阑尾癌;星形细胞瘤;非典型畸胎样瘤/横 纹肌样瘤;基底细胞癌;膀胱癌;脑干胶质瘤;脑瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型 畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜母细胞瘤、室 管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚瘤和松果 体母细胞瘤）；乳腺癌;支气管肿瘤;伯基特淋巴瘤;原发部位不明癌;类癌瘤;原发部位不明 肿瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎瘤;宫颈癌;儿童期癌 症;脊索瘤;慢性淋巴细胞白血病;慢性髓性白血病;慢性骨髓增殖性病症;结肠癌;结直肠 癌;颅咽管瘤;皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤;子宫内膜癌;室管膜母细胞瘤;室管膜 瘤;食管癌;成感觉神经细胞瘤;尤因肉瘤;颅外生殖细胞瘤;性腺外生殖细胞瘤;肝外胆管 癌;胆囊癌；胃（胃部)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤(GIST);妊娠滋 养细胞瘤;神经胶质瘤;毛细胞白血病;头颈癌；心脏癌;霍奇金淋巴瘤;下咽癌;眼内黑色素 瘤;胰岛细胞瘤;卡波西肉瘤；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症;喉癌;唇癌;肝癌;恶性 纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤;髓上皮瘤；黑色素瘤;梅克尔细胞癌;梅克尔细胞皮肤 癌；间皮瘤;隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌;多发性内分泌肿瘤综合征;多发性骨髓 瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤;蕈样肉芽肿;骨髓增生异常综合征;骨髓增生性肿瘤;鼻腔 癌;鼻咽癌;神经母细胞瘤;非霍奇金淋巴瘤;非黑色素瘤皮肤癌;非小细胞肺癌；口癌；口腔 癌；口咽癌;骨肉瘤;其它脑和脊髓肿瘤;卵巢癌;卵巢上皮癌;卵巢生殖细胞瘤;卵巢低恶性 潜在肿瘤;胰腺癌;乳头状瘤病；副鼻窦癌；甲状旁腺癌;盆腔癌；阴茎癌；咽癌；中度分化的 松果体实质肿瘤;松果体母细胞瘤;垂体瘤浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤;胸膜肺母细胞瘤;原 发性中枢神经系统（CNS)淋巴瘤；原发性肝细胞性肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；肾细胞 (肾)癌;肾细胞癌;呼吸道癌;视网膜母细胞瘤;横纹肌肉瘤;唾液腺癌症;塞扎里综合征;小 细胞肺癌;小肠癌;软组织肉瘤;鳞状细胞癌;鳞状颈癌；胃部（胃）癌;幕上原始神经外胚瘤； T细胞淋巴瘤;睾丸癌；咽喉癌;胸腺癌;胸腺瘤；甲状腺癌;移行细胞癌；肾盂和输尿管的移 行细胞癌;滋养细胞瘤;输尿管癌;尿道癌;子宫癌;子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；瓦尔登斯特 伦巨球蛋白血症或维尔姆斯瘤。本发明的方法可用于表征这些及其它癌症。因此，对表型的 表征可提供本文公开的癌症之一的诊断、预后和治疗诊断。
[0218] 在一些实施方案中，所述癌症包括急性髓样白血病(AML)、乳腺癌、胆管癌、结直肠 腺癌、肝外胆管腺癌、女性生殖道恶性肿瘤、胃腺癌、胃腺癌、胃肠道间质瘤(GIST)、胶质母 细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、白血病、肝细胞癌、低度胶质瘤、肺细支气管肺泡癌(BAC)、肺非 小细胞肺癌(NSCLC)、肺小细胞癌(SCLC)、淋巴瘤、男性生殖道恶性肿瘤、胸膜恶性孤立性纤 维性肿瘤(MSFT)、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、神经内分泌肿瘤、淋巴结弥漫性大B细胞淋巴 瘤、非上皮性卵巢癌(非-E0C)、卵巢表面上皮癌、胰腺癌、垂体癌、少突神经胶质瘤、前列腺 腺癌、腹膜后或腹膜癌、腹膜后或腹膜肉瘤、小肠恶性肿瘤、软组织肿瘤、胸腺癌、甲状腺癌 或葡萄膜黑色素瘤。本发明的方法可用于表征这些及其它癌症。因此，对表型的表征可提供 本文公开的癌症之一的诊断、预后和治疗诊断。
[0219] 所述表型还可以为炎性疾病、免疫疾病或自身免疫性疾病。例如，所述疾病可以为 炎性肠病（IBD)、克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎症、脉管炎、银肩病、糖尿病、自 身免疫性肝炎、多发性硬化、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑 狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎、舍格伦病、肢端硬皮综合征、硬皮 病、风湿病、器官排斥、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。
[0220] 所述表型还可以包括心血管疾病，如动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损斑块、 中风或局部缺血。所述心血管疾病或病况可以是高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件。
[0221] 所述表型还可以包括神经疾病，如多发性硬化(MS)、帕金森病(PD)、阿尔兹海默病 (AD)、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐 氏综合征、脑血管病、拉斯马森脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、 肌萎缩侧索硬化、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺 血再灌注损伤(例如中风）、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。所述表型还可以是诸如 纤维肌痛、慢性神经性疼痛或周围神经性疼痛的病况。
[0222] 所述表型还可以包括感染性疾病，如细菌、病毒或酵母感染。例如，所述疾病或病 况可以是惠普尔病、朊病毒病、硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、肝炎、梅毒、脑膜炎、 疟疾、结核病或流行性感冒。可以评估囊泡中的病毒蛋白质，如HIV或HCV样颗粒，以表征病 毒病况。
[0223] 所述表型还可以包括围产期或妊娠相关的病况(例如先兆子痫或早产）、代谢疾病 或病况，例如与铁代谢有关的代谢疾病或病况。例如，可以测定在囊泡中的铁调素 (hepcidin)以表征铁缺乏。所述代谢疾病或病况还可以是糖尿病、炎症或围产期状况。
[0224] 本发明的组合物和方法可用于表征可通过生物标志物评估的这些及其它疾病或 病症。因此，对表型的表征可提供对本文公开的疾病或病症之一的诊断、预后和治疗诊断。 受试者
[0225] 可通过分析从受试者获得的生物样品中的一种或多种囊泡（如多种囊泡)来确定 受试者的一种或多种表型。受试者或患者可以包括但不限于哺乳动物，例如牛、禽类、犬、 马、猫、绵羊、猪或灵长动物(包括人及非人灵长动物）。受试者还可以包括：由于濒危而变得 重要的哺乳动物，例如西伯利亚虎;或者具有经济意义的动物，例如用于人类消费的农场饲 养动物，或对人类而言具有社会意义的动物，例如作为宠物或在动物园中饲养的动物。此类 动物的实例包括但不限于:食肉动物，例如猫和狗;猪，包括畜养猪、食用猪和野猪;反刍动 物或有蹄类动物，例如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛、骆驼或马。此外，还包括濒危 的或在动物园中饲养的鸟；以及禽类，更特别的是家养的禽类，即，家禽，例如火鸡和鸡、鸭、 鹅、珍珠鸡。还包括家养的猪和马（包括赛马）。此外，与商业活动有关的任何动物种类也都 被包括在内，例如与农业、水产业和其它活动有关的动物，所述行业中为了经济生产力和/ 或食物链的安全，疾病监测、诊断和疗法的选择是常规措施。
[0226] 受试者可以患有此前存在的疾病或病况，例如癌症。或者，受试者可以并未患任何 已知的此前存在的病况。受试者还可以对现有或过去的治疗是非反应性的，例如对癌症的 治疗是非反应性的。 样品
[0227] 经由本发明的组合物和方法所使用和/或评估的样品包括任何可用于生物标志物 评估的有关生物样品，其包括但不限于组织如活检组织的切片，或在手术或其它操作过程 中取出的组织、体液、尸检样品、出于组织学目的制取的冷冻切片以及细胞培养物。这样的 样品包括血液和血液成分或产物(例如血清、血沉棕黄层、血浆、血小板、红细胞等）、唾液、 恶性渗出液、面颊细胞组织、培养的细胞(例如原代培养物、外植体和转化的细胞）、粪便、尿 液、其它生物流体或体液(例如前列腺液、胃液、肠液、肾液、肺液、脑脊液等）。该样品可包含 是新鲜冷冻且福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)组织块的生物材料，经福尔马林固定、石蜡 包埋的的生物材料，或者在RNA防腐剂+福尔马林固定剂内的生物材料。对每位患者可以使 用超过一个类型的超过一种样品。
[0228] 在本文所述的方法中使用的样品可以是福尔马林固定、石蜡包埋的（FFPE)样品。 FFPE样品可以是一种或多种固定的组织、未染色的载玻片、骨髓芯(bone marrow core)或 凝块、针芯活检、恶性流体和细针抽吸物(FNA)。在一个实施方案中，固定的组织包含来自于 手术或活检的含有肿瘤的福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)组织块。在另一个实施方案中， 未染色的载玻片包含来自石蜡块的未染色的、装载好的、未烘烤的载玻片。在又一个实施方 案中，骨髓芯或凝块包含脱钙的芯。经福尔马林固定的芯和/或凝块可以是石蜡包埋的。在 再一个实施方案中，针芯活检包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个，例如3-4个石蜡包埋 的活检样品。可以使用18号针活检。恶性流体可包含足够体积的新鲜胸膜液/腹膜液来产生 5x5x2mm的细胞团块。该流体可以在石蜡块中用福尔马林固定。在一个实施方案中，针芯活 检包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个，例如4-6个石蜡包埋的抽吸物。
[0229] 样品可以根据本领域技术人员了解的技术来处理。样品可以是但不限于新鲜、冷 冻或固定的细胞或组织。在一些实施方案中，样品包含福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)样 品、新鲜组织或新鲜冰冻的(FF)组织。样品可包含培养的细胞，包括从受试者样品得到的原 代细胞系或无限增殖化细胞系。样品还可以指来自受试者样品的提取物。例如，样品可以包 含从组织或体液中提取的DNA、RNA或蛋白质。许多技术和商业试剂盒可用于该目的。来自个 体的新鲜样品在进一步处理例如细胞裂解和提取之前可以用试剂处理来保存RNA。样品可 以包括出于其它目的收集的冷冻样品。样品可以与诸如以下的有关信息相关联:年龄、性别 和受试者中存在的临床症状;样品的来源；以及样品的收集和储存方法。样品通常从受试者 获得。
[0230]活检包括取出组织样品以供诊断或预后评估并直至组织标本本身的过程。任何本 领域已知的活检技术可应用于本发明的分子概况分析方法。所应用的活检技术可依赖于待 评估的组织类型（例如结肠、前列腺、肾、膀胱、淋巴结、肝、骨髓、血细胞、肺、乳房等）、肿瘤 的大小和类型（例如固体或悬浮的、血液或腹水）以及其它因素。代表性的活检技术包括但 不限于切除活检、切开活检、针吸活检、手术活检和骨髓活检。"切除活检"是指将整个肿瘤 团块与围绕它的少量边缘正常组织一起取出。"切开活检"是指取出包括肿瘤的横截面直径 的一块楔形肿瘤。分子概况分析可以使用肿瘤团块的"针芯活检"或"细针抽吸活检"，其一 般从肿瘤团块内部获得细胞的悬浮物。活检技术例如在Harrison's Principles of Internal Medicine，Kasper等人编，第16版，2005,第70章和整个第V部分中讨论。
[0231]本领域已知的并且没有具体描述的标准分子生物学技术一般是根据Sambrook等 人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York( 1989)，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley 和Sons，Baltimore，Md.(1989)，Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning,John ffiley&Sons ,New York( 1988)，Watson 等人，Recombinant DNA, Scientific American Books，New York，以及Birren等人（编）Genome Analysis：A Laboratory Manual Series， Vols.l_4Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York( 1998)，以及在美国专利号4， 666，828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中阐释的方法，它们通过引用并入 本文。聚合酶链反应（PCR)通常可以如PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)所述进行。
[0232]使用本发明的组合物和方法评估的生物样品可以是任何有用的体液或生物流体， 包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、 耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液）、考珀液或射精前液、女性射出液、汗 液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经 血、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽吸 液或其它灌洗液、细胞、细胞培养物或细胞培养上清液。生物样品还可以包括囊胚腔、脐带 血或母体循环(其可以为胎儿来源或母体来源的）。生物样品还可以为细胞培养物、组织样 品或活检组织，从中可获得囊泡和其它循环生物标志物。例如，可以培养感兴趣的细胞，并 且从培养物中分离囊泡。在各个实施方案中，可使用各种方法，诸如从血液、血浆、血清或任 意前述生物样品中提取核酸分子，使用蛋白质或抗体阵列鉴定多肽(或功能片段)生物标志 物，以及本领域中已知用于鉴定及评估核酸和多肽分子的其它阵列、测序、PCR和蛋白质组 技术，由这样的生物样品直接评估本发明公开的生物标志物或更特别地生物印记(例如，对 核酸或多肽生物标志物或其功能片段的存在或水平的鉴定）。此外，可以首先分离或富集在 这类样品中存在的一种或多种组分，然后进一步处理以评估所选生物标志物的存在或水 平，从而评估给定生物印记(例如，在对蛋白质和/或核酸生物标志物进行概况分析之前的 分呙的微囊泡）。
[0233]表1给出了疾病、病况或生物学状态以及可用于根据本发明的方法进行分析的相 应生物样品的非限制性列表。 表1:针对各种疾病、病况或生物学状态的生物样品的实例
[0234] 本发明的方法可用于使用血液样品或血液衍生物表征表型。血液衍生物包括血浆 和血清。血浆是全血的液体组分，并且约占总血液体积的55%。其主要由水和溶液中的少量 矿物质、盐类、离子、营养物质和蛋白质构成。在全血中，红细胞、白细胞和血小板悬浮于血 浆中。血清是指不含纤维蛋白原或其它凝血因子的血浆(即，全血减去细胞和凝血因子）。
[0235] 生物样品可通过第三方获得，诸如不进行生物标志物分析的一方，无论是对生物 样品的直接评估还是通过对得自生物样品的一种或多种囊泡进行概况分析。例如，样品可 以通过样品所来源的受试者的临床医生、医师或其他保健管理人员获得。或者，生物样品可 以由分析囊泡的同一方获得。此外，所测定的生物样品在防腐条件下归档(如，冷冻)或以其 它方式储存。
[0236] 此外，生物样品可包含来源于起源细胞以及可从受试者的生物流体或细胞外环境 中在细胞外获得的囊泡或细胞膜片段。
[0237] 本发明的方法可包括评估一种或多种囊泡，包括评估囊泡群体。本文所使用的囊 泡是从细胞上脱落的膜囊泡。囊泡或膜囊泡包括但不限于:循环微囊泡(cMV)、微囊泡、外来 体、纳米囊泡、dexosome、泡(b 1 eb)、泡状体(b 1 ebby)、前列腺小体、微粒、管腔内囊泡、膜片 段、管腔内核内体囊泡、核内体样囊泡、胞吐媒介物、核内体囊泡、核内体的囊泡、凋亡小体、 多泡体、分泌囊泡、磷脂囊泡、脂质体囊泡、argosome、texasome、secresome、tolerosome、黑 色素体、oncosome或胞吐的媒介物。此外，尽管囊泡可通过不同的细胞过程产生，但本发明 的方法并不限于或依赖于任何一种机制，只要这样的囊泡存在于生物样品中并且能够通过 本文公开的方法进行表征即可。除非另有说明，否则使用某一种囊泡的方法可以应用于其 它类型的囊泡。囊泡包含球状结构，其具有环绕内区室的类似于细胞膜的脂双层，该内区室 可包含有时被称为有效负载的可溶性组分。在一些实施方案中，本发明的方法使用外来体， 其为直径约40-100nm的小的分泌囊泡。关于膜囊泡(包括类型和特征）的综述参见Thery等 人，Nat Rev Immunol.2009年8月；9(8) :581-93。不同类型囊泡的一些性质包括表2中的性 质：缩写:磷脂酰丝氨酸(PPS);电子显微术(EM)
[0238]囊泡包括脱落的膜结合颗粒，或称"微粒"，其源自于质膜或内膜。囊泡可以从细胞 释放到细胞外环境中。释放囊泡的细胞包括但不限于源自或衍生自外胚层、内胚层或中胚 层的细胞。该细胞可经历遗传的、环境的和/或任意其它的变异或变化。例如，该细胞可以是 肿瘤细胞。囊泡可反映来源细胞的任何变化，并且由此反映起源细胞中的变化，例如，具有 各种基因突变的细胞。在一种机制中，当细胞膜的区段自发地内陷并最终被胞吐出来时，囊 泡在细胞内生成(例如参见Keller等人，Immunol. Lett. 107(2): 102-8(2006))。囊泡还包括 脂双层膜所结合的细胞衍生的结构，其由突出的外凸（起泡）分离和质膜部分的封闭而生 成，或者由包含各种肿瘤来源的膜结合蛋白质的任何细胞内膜结合囊泡结构的输出而生 成，其中膜结合蛋白质包括源自宿主循环的表面结合分子，该分子选择性地结合肿瘤衍生 的蛋白质以及包含在囊泡腔中的分子，包括但不限于肿瘤衍生的微RNA或细胞内蛋白质。泡 和起泡在Charras等人，Nature Reviews Molecular and Cell Biology，第9卷第11 章， p. 730-736(2008)中进一步描述。从肿瘤细胞上脱落到循环或体液中的囊泡可称作"循环肿 瘤衍生囊泡"。当这样的囊泡是外来体时，其可被称为循环肿瘤衍生外来体(CTE)。在一些情 况下，囊泡可源自特定起源细胞。CTE，如起源细胞特异性囊泡一样，一般具有一种或多种独 特的生物标志物，其允许CTE或起源细胞特异性囊泡例如与体液分离，且某些时候以特异性 方式分离。例如，使用细胞或组织特异性标志物鉴定起源细胞。这类细胞或组织特异性标志 物的实例在本文中公开，并且其可进一步见于组织特异性基因表达和调控(TiGER)数据库 (Tissue-specific Gene Expression and Regulation Database)，其可获自 bioinfo · wilmer · jhu · edu/tiger/; Liu等人（2008)TiGER: a database for tissue-specific gene expression and regulation.BMC Bioinformatics.9:271;组织分布数据 库（TissueDistributionDB)，可获自 genome · dkfz-heidelberg · de/menu/tissue_db/ index.html。
[0239] 囊泡可具有大于约10nm、20nm或30nm的直径。囊泡可具有大于40nm、50nm、100nm、 200nm、500nm、lOOOnrn、1500nm、2000nm 或大于 10，000nm 的直径。囊泡可具有约20-2000nm、约 20-1500nm、约 30-1000nm、约 30-800nm、约 30-200nm 或约 30-100nm 的直径。在一些实施方案 中，囊泡具有小于 10，000nm、2000nm、1500nm、1000nm、800nm、500nm、200nm、100nm、50nm、 40nm、30nm、20nm或小于lOnm的直径。本文在提及数值时所使用的术语"约"意味着高于或低 于该数值10%的变化处于所给定的数值所属的范围内。各种类型的囊泡的典型大小在表2 中示出。可评估囊泡以测量单一囊泡或任何数目的囊泡的直径。例如，可测定囊泡群体的直 径范围或囊泡群体的平均直径。囊泡直径可使用本领域中已知的方法评估，例如，诸如电子 显微术这样的成像技术。在一个实施方案中，使用光学粒子检测（optical particle detection)测定一种或多种囊泡的直径。例如，参见2010年7月6日授权的题为"Optical Detection and Analysis of Particles"的美国专利7,751,053;以及2010年7月15日授权 的题为 "Optical Detection and Analysis of Particles" 的美国专利7,399,600〇
[0240] 在一些实施方案中，本发明的方法包括例如直接在生物样品中评估囊泡，而无需 预先从生物样品中分离、纯化或浓缩。例如，样品中的囊泡量本身可提供生物印记，该生物 印记提供诊断、预后或治疗诊断确定。或者，可在分析前从样品中分离、捕获、纯化或浓缩样 品中的囊泡。如所指出的，本文所使用的分离、捕获或纯化包括与样品中的其它组分部分分 离、部分捕获或部分纯化。囊泡分离可使用本文所述的各种技术进行，例如，色谱法、过滤、 离心、流式细胞术、亲和捕获(如，捕获到平面或珠子上)和/或使用微流体。图13A-I和16B-16C提出了使用适体池来评估微囊泡的本发明的方法的概况。
[0241] 可以通过将囊泡特征与参照进行比较而评估囊泡如外来体以提供表型表征。在一 些实施方案中，评估囊泡上的表面抗原。表面抗原可提供囊泡的解剖学来源和/或细胞来源 的指示，以及其它表型信息，例如肿瘤状态。例如，其中针对指示结肠直肠来源和癌症存在 的表面抗原评估在患者样品（例如，体液，如血液、血清或血浆）中发现的囊泡。表面抗原可 包含可在囊泡膜表面上检测到的任何信息性生物实体，包括但不限于表面蛋白质、脂质、碳 水化合物和其它膜组分。例如，对表达肿瘤抗原的结肠衍生囊泡的阳性检测可指示患者患 有结直肠癌。据此，本发明的方法可通过评估例如获自受试者的一种或多种囊泡的疾病特 异性和细胞特异性生物标志物，而用于表征与解剖学或细胞来源相关的任何疾病或病况。
[0242] 在另一个实施方案中，本发明的方法包括评估一种或多种囊泡有效负载，以提供 表型表征。囊泡内的有效负载包括可被检测为包封于囊泡内的任何信息性生物实体，包括 但不限于蛋白质和核酸，例如，基因组的或cDNA、mRNA或其功能片段，以及微RNA(miR)。此 外，本发明的方法涉及检测囊泡表面抗原(与囊泡有效负载一起或不检测囊泡有效负载）以 提供表型表征。例如，可使用囊泡表面抗原特异性的结合剂(例如抗体或适体)表征囊泡，并 且可进一步评估结合的囊泡以鉴定本文公开的一种或多种有效负载组分。如本文所述，具 有感兴趣的表面抗原或具有感兴趣的有效负载的囊泡的水平可与参照进行比较以表征表 型。例如，与参照相比，癌症相关表面抗原或囊泡有效负载(例如肿瘤相关mRNA或微RNA)在 样品中的过表达可指示在样品中存在癌症。根据所需目标样品的选择以及目标样品与所希 望的参照样品的比较，所评估的生物标志物可存在或不存在，提高或降低。目标样品的非限 制实例包括:疾病;治疗/未治疗;不同时间点，如在纵向研究中；参照样品的非限制实例:非 疾病;不同时间点；以及对候选治疗敏感或抗性。 微囊泡分离和分析
[0243] 样品处理
[0244] 可以在分析之前和/或期间分离、纯化、浓缩或以其它方式富集囊泡或囊泡群体。 除非另有说明，本文中提及囊泡或生物标志物组分时使用的术语"纯化的"、"分离的"或类 似用语意在包括这些组分从细胞或生物体中的部分的或完全的纯化和分离。囊泡的分析可 以包括定量生物样品的一种或多种囊泡群体的量。例如，可以对囊泡的异质群体进行定量， 或者可以从囊泡的异质群体分离均质的囊泡群体，例如具有特定生物标志物谱、特定生物 印记或源自特定细胞类型的囊泡群体，并进行定量。如本文所述，囊泡分析还可以包括定量 地或定性地检测囊泡的一种或多种特定的生物标志物谱或生物印记。
[0245] 囊泡可以储存和归档在例如生物流体库(bio-fluid bank)中，并根据需要取回以 供分析。囊泡还可以从之前已经由活体或死亡的受试者中收获并储存的生物样品中分离得 至丨J。此外，可以如King等人，Breast Cancer Res 7(5) :198-204(2005)中所述从已经收集的 生物样品中分离囊泡。囊泡可以从已归档的或储存的样品中分离得到。或者，囊泡可以从生 物样品中分离得到并分析，而无需储存或归档样品。此外，第三方可以获得或储存生物样 品，或者获得或储存囊泡以供分析。
[0246] 富集的囊泡群体可以从生物样品得到。例如，可以使用大小排阻色谱法、密度梯度 离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合从生物样 品中浓缩或分离囊泡。
[0247] 可以使用大小排阻色谱法如凝胶渗透柱、离心或密度梯度离心以及过滤方法。例 如，可以通过差速离心、阴离子交换和/或凝胶渗透色谱法(例如，如美国专利号6，899，863 和6,812,023中所述）、蔗糖密度梯度、细胞器电泳(例如，如美国专利号7，198,923中所述）、 磁激活细胞分选(MACS)或使用纳米膜超滤浓缩器来分离囊泡。可以使用分离或浓缩方法的 各种组合。
[0248] 高丰度蛋白质，如血液样品中的白蛋白和免疫球蛋白，可能妨碍囊泡从生物样品 中的分离。例如，可以使用利用了多种抗体的系统从生物样品中分离囊泡，所述抗体对于在 生物样品如血液中发现的最丰富的蛋白质是特异性的。这样的系统可以一次性地除去可达 数种蛋白质，由此显现出较低丰度的物质，例如起源细胞特异性的囊泡。这种类型的系统可 以用于从生物样品如血液、脑脊液或尿液中分离囊泡。还可以通过如Chromy等人J Proteome Res 2004; 3:1120-1127所述的高丰度蛋白质去除方法来增强囊泡从生物样品中 的分离。在另一个实施方案中，还可以如Zhang等人，Mol Cell Proteomics 2005;4:144-155所述通过使用糖肽捕获去除血清蛋白质，而增强囊泡从生物样品中的分离。此外，可以 如Pisitkun等人，Proc Natl Acad Sci U S A，2004; 101:13368-13373所述通过差速离心、 然后与针对细胞质表位或抗细胞质表位的抗体相接触从生物样品如尿液中分离囊泡。
[0249] 血浆含有许多种蛋白质，包括白蛋白、免疫球蛋白和凝血蛋白如纤维蛋白原。约 60 %的血浆蛋白质包含蛋白质白蛋白（例如人血清白蛋白或HSA)，这有利于血浆的渗透压 以辅助脂质和类固醇激素的转运。球蛋白占血浆蛋白质的约35%，并用于转运辅助免疫功 能的离子、激素和脂质。约4%的血浆蛋白质包含纤维蛋白原，它在血液的凝结中是必要的， 并且可以转化成一种不溶性蛋白质，纤维蛋白。其它类型的血液蛋白质包括:前白蛋白、αΐ 抗胰蛋白酶、αΐ酸性糖蛋白、αΐ胎蛋白、触珠蛋白、α2巨球蛋白、血浆铜蓝蛋白、转铁蛋白、补 体蛋白C3和C4、i32微球蛋白、Μ旨蛋白、γ球蛋白、C反应蛋白（CRP)、脂蛋白（乳糜微粒、VLDL、 LDUHDL)、其它球蛋白（α、β和γ型）、凝血酶原和甘露糖结合凝集素(MBL)。任何这类蛋白 质，包括蛋白质的类别或其衍生物(例如由切割纤维蛋白原得到的纤维蛋白），可以在对样 品进行进一步分析之前从生物样品中选择性耗尽。不受理论的束缚，去除这样的背景蛋白 质可促进对样品中感兴趣的生物标志物更加敏感、准确或精确的检测。
[0250] 血液或血液衍生物（例如血浆或血清）中的高丰度蛋白质包括但不限于白蛋白、 IgG、转铁蛋白、纤维蛋白原、IgA、a2-巨球蛋白、IgM、*^-抗胰蛋白酶、补体C3、结合球蛋白、载 脂蛋白A1、载脂蛋白A3、载脂蛋白Β、αι_酸性糖蛋白、血衆铜监蛋白、补体C4、Clq、IgD、肖ij白 蛋白（甲状腺素运载蛋白）和纤溶酶原。这些蛋白质可以使用市售可得的柱子和试剂盒耗 尽。这样的柱子的实例包括来自Agilent Technologies(Santa Clara，CA)的多亲和去除系 统(Multiple Affinity Removal System)。该系统包括多个设计用于耗尽不同蛋白质谱的 柱体，包括下列具有根据制造商所述的性能特征的柱体:Human 14,其除去总蛋白质的约 94 % (白蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、转铁蛋白、触珠蛋白、纤维蛋白原、α2巨球蛋白、α 1 -酸 性糖蛋白（血清类粘蛋白）、IgM、载脂蛋白ΑΙ、载脂蛋白ΑΙΙ、补体C3和甲状腺素运载蛋白）； Human 7,其除去总蛋白质的大约85-90%(白蛋白、IgG、IgA、转铁蛋白、触珠蛋白、抗胰蛋白 酶和纤维蛋白原）；Human 6,其除去总蛋白质的大约85-90% (白蛋白、IgG、IgA、转铁蛋白、 触珠蛋白和抗膜蛋白酶）；人白蛋白/IgG柱，其除去总蛋白质的大约69% (白蛋白和IgG);以 及人白蛋白柱，其除去总蛋白质的大约50-55%(白蛋白）。来自Sigma-Aldr ich的 ProteoPrep®20血楽_免疫耗尽试剂盒（PΓOteoPΓep®20PlasmaImmunodepletionKit) 旨在从人血浆或血清中特异性去除20种丰度最高的蛋白质，即大约去除血浆或血清中的总 蛋白质量的97-98%(3丨811^-41(11'；[(311，31:丄011丨8，]\10)。根据该制造商所述，卩1'〇160?比卩® 20去除：白蛋白、IgG、转铁蛋白、纤维蛋白原、IgA、a2-巨球蛋白、IgM、^-抗胰蛋白酶、补体 C3、结合球蛋白、载脂蛋白A1、A3和酸性糖蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体C4、Clq; IgD、前白 蛋白和纤溶酶原。Sigma-Aldrich还制造 Pr〇te〇Prep®柱来去除白蛋白（HSA)和免疫球蛋 白（IgG)。来自 Beckman Coulter (Fullerton，CA)的ProteomeLab IgY-12 高容量蛋白质组分 区试剂盒（ProteomeLab IgY_12High Capacity Proteome Partitioning kit)被专门设计 用于从人类生物流体如血浆和血清中去除十二种高丰度蛋白质（白蛋白、IgG、转铁蛋白、纤 维蛋白原、IgA、α2_巨球蛋白、IgM、α 1-抗胰蛋白酶、触珠蛋白、血清类粘蛋白、载脂蛋白A-I、 载脂蛋白Α-ΙΙ)。这类系统一般依赖于免疫耗尽来去除目标蛋白，例如使用小配体和/或完 整的抗体。来自 Millipore (EMD Millipore Corporation，Billerica，MA，USA)的 PureProteome™人白蛋白/免疫球蛋白耗尽试剂盒（PureProteome™ Human Albumin/ Immunoglobulin Depletion Kit)是基于磁珠的试剂盒，它能够实现白蛋白和所有免疫球 蛋白（即IgG、IgA、IgM、IgE和IgD)从人血清或血浆样品中的高效耗尽(通常>99%)。也来自 Millipore 的 pr〇te〇Extract® 白蛋白/1^ 去除试剂盒（pr〇te〇Extract®Albumin/igG Removal Kit)被设计用于从体液样品中耗尽>80%的白蛋白和IgG。其它类似的蛋白质耗 尽产品包括但不限于下列各项:Aurum™ Affi-Gels Blue mini试剂盒(Aurum™ Affi-Gels Blue mini kit，Bi 〇-Rad，Hercules，CA，USA) ; Vivapure® 抗-HSA/I gG试剂盒（ Vivapure® anti-HSA/IgG kit，Sartorius Stedim Biotech，Goettingen，Germany)， Qproteome白蛋白/IgG耗尽试剂盒（Qproteome albumin/IgG depletion kit，Qiagen， Hilden，Germany); Seppro® MIXED12-LC20柱(GenWay Biotech，San Diego，CA，USA);高 丰度血清蛋白耗尽试剂盒（Abundant Serum Protein Depletion Kit，Norgen Biotek Corp.，Ontario，Canada) ;GBC人白蛋白/IgG/转铁蛋白三合一耗尽柱/试剂盒（GBC Human Albumin/IgG/Transferrin 3in IDepletion Column/Kit，Good Biotech Corp.，Taiwan)〇 可以使用这些系统和类似系统从生物样品中去除高丰度蛋白质，从而改善检测低丰度循环 生物标志物如蛋白质和囊泡的能力。[0251 ] 促凝血酶原激酶是通过将凝血酶原转化成凝血酶来帮助血液凝固的血浆蛋白质。 凝血酶反过来又充当将可溶性纤维蛋白原转化成不可溶性纤维蛋白链以及催化多种其它 凝固相关反应的丝氨酸蛋白酶。因此，促凝血酶原激酶是可以用于促进纤维蛋白原/纤维蛋 白（凝血因子)从血浆中沉淀出来的蛋白质。除了免疫亲和蛋白质去除以外或者作为免疫亲 和蛋白质去除的替代，可以使用促凝血酶原激酶处理血液样品来耗尽纤维蛋白原/纤维蛋 白。除了如上所述的免疫亲和蛋白质去除之外或者作为如上所述的免疫亲和蛋白质去除的 替代，可以使用本领域已知的方法进行促凝血酶原激酶去除。其它蛋白质和/或其它样品微 粒的沉淀也可以改善样品中循环生物标志物如囊泡的检测。例如，可以使用本领域已知的 硫酸铵处理来沉淀免疫球蛋白以及其它高丰度蛋白质。
[0252]在一个实施方案中，本发明提供了一种检测生物样品中一种或多种循环生物标志 物如微囊泡的存在或水平的方法，该方法包括：（a)提供包含或被怀疑包含一种或多种循环 生物标志物的生物样品；（b)从步骤(a)提供的生物样品中选择性耗尽一种或多种丰度蛋白 质；（c)从步骤(b)中耗尽的样品中亲和选择所述一种或多种循环生物标志物，从而检测一 种或多种循环生物标志物的存在或水平。该生物样品可包含体液，例如外周血、血清、血浆、 腹水、尿液、脑脊液(CSF )、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、 精液、前列腺液、考珀液或射精前液、女性射出液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和 腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜 分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液、脐带血，或任意这些的衍生 物。在一些实施方案中，该生物样品包含外周血、血清或血浆。在囊泡检测之前从血浆中选 择性耗尽一种或多种丰度蛋白质的说明性方案和结果可以在2013年11月26日提交的国际 专利公布号W0/2014/082083的实施例40中找到，该专利公开通过引用以其全文并入本文。
[0253] 丰度蛋白质可包含样品中以足够高的浓度存在于样品中从而潜在地干扰下游处 理或分析的蛋白质。通常，丰度蛋白质并不是样品的任何进一步分析的靶标。丰度蛋白质可 构成样品中的总蛋白质量的至少10- 5、1〇-4、1〇-3、0·01、0·02、0·03、0·04、0·05、0·06、0·07、 0·08、0·09、0·1、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或至少 99%。在一 些实施方案中，丰度蛋白质以样品中的总蛋白质量的不到1〇_5%存在，例如在感兴趣的稀有 的靶标的情况下。如本文所述，在血液或其衍生物的情况下，所述一种或多种丰度蛋白质可 包含白蛋白、IgG、转铁蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、IgA、α2-巨球蛋白、IgM、α 1 -抗胰蛋白 酶、补体C3、结合球蛋白、载脂蛋白Α1、Α3和Β;^-酸性糖蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体C4、Clq、 IgD、前白蛋白（甲状腺素运载蛋白）、纤溶酶原、其中任意物质的衍生物，及其组合中的一种 或多种。血液或血液衍生物中的所述一种或多种丰度蛋白质还可包含白蛋白、免疫球蛋白、 纤维蛋白原、前白蛋白、α 1抗胰蛋白酶、α 1酸性糖蛋白、α 1胎蛋白、触珠蛋白、α2巨球蛋白、血 楽铜监蛋白、转铁蛋白、补体蛋白C3和C4、02微球蛋白、β脂蛋白、γ球蛋白、C反应蛋白 (CRP)、脂蛋白（乳糜微粒、VLDL、LDL、HDL)、其它球蛋白（α、β和γ型）、凝血素、甘露糖结合凝 集素(MBL)、其中任意物质的衍生物及其组合中的一种或多种。
[0254] 在一些实施方案中，选择性耗尽一种或多种丰度蛋白质包括使生物样品与促凝血 酶原激酶接触来起始纤维蛋白的沉淀。该一种或多种丰度蛋白质还可以通过免疫亲和法、 沉淀法或其组合来耗尽。例如，样品可以用促凝血酶原激酶处理来沉淀纤维蛋白，然后可根 据需要使该样品通过柱子来去除HSA、IgG和其它丰度蛋白质。
[0255] "选择性耗尽"一种或多种丰度蛋白质包括以比消耗样品中另一实体如另一种蛋 白质或微囊泡(包括用于下游处理或分析的感兴趣的靶标)更高的百分比从样品中耗尽丰 度蛋白质。选择性耗尽一种或多种丰度蛋白质可包括以样品中另一实体如另一种蛋白质或 微囊泡(包括用于下游处理或分析的感兴趣的靶标)1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6 倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14 倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100 倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、10 4倍、105倍、106 倍、 107 倍、108 倍、109 倍、101° 倍、1011 倍、1012 倍、1013 倍、1014 倍、1015 倍、1016 倍、1017 倍、1018 倍、1019 倍、102°倍或更高的速率耗尽丰度蛋白质。在一个实施方案中，与丰度蛋白质的耗尽相比，不 存在或极少存在感兴趣的靶标的可观察到的耗尽。在一些实施方案中，从生物样品中选择 性耗尽一种或多种丰度蛋白质包括耗尽所述一种或多种高丰度蛋白质的至少25%、30%、 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。
[0256] 用非严格大小排阻步骤可进一步促进高丰度蛋白质以及其它非所需实体的去除。 例如，可以用高分子量截止值大小排阻步骤处理样品，以优先富集除了较低分子量蛋白质 和其它实体之外的高分子量囊泡。在一些实施方案中，用分子量截止值(MWC0)为500、600、 700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、 7500、8000、8500、9000、9500、10000或大于10000千道尔顿(1^^)的柱子(例如凝胶过滤柱） 或过滤器处理样品。在一个实施方案中，使用700kDa过滤柱。在这样的步骤中，囊泡将被保 留或者在所述柱子或过滤器中比较低分子量的实体流动得更慢。这样的柱子和过滤器在本 领域中已知。
[0257] 还可以通过使用声处理（例如通过施加超声波）、去污剂、其它膜活化剂或它们的 任何组合来增强从生物样品中分离或富集囊泡。例如，可以将超声能量施加到潜在的肿瘤 部位，并且不被理论所限制，可以增加囊泡从组织中的释放，从而可以使用本文公开的一种 或多种方法来分析或评估来自生物样品的富集的囊泡群体。
[0258] 通过本文描述的检测循环生物标志物的方法，例如抗体亲和分离，必要时可使用 各种浓缩或分离程序优化所得结果的一致性。这样的步骤可包括搅拌(诸如振荡或涡旋）、 不同的分离技术(诸如基于聚合物如使用PEG的分离)和在过滤和其它步骤期间浓缩至不同 水平。本领域技术人员应当了解，这样的处理可在测试包含囊泡的样品的各个阶段进行。在 一个实施方案中，对样品自身(例如，体液，诸如血浆或血清)进行涡旋。在一些实施方案中， 在一个或多个样品处理步骤(例如，囊泡分离)进行之后对样品进行涡旋。可根据需要在一 些或全部适当的样品处理步骤中进行搅拌。可在各个步骤中引入添加剂以改善所述过程， 例如，控制感兴趣的生物标志物的聚集或降解。
[0259] 还可按照需要通过使用各种试剂处理样品而优化结果。这类试剂包括用于控制聚 集的添加剂或用于调节pH或离子强度的添加剂。控制聚集的添加剂包括封闭剂如牛血清白 蛋白（BSA)、牛奶或StabilGuard® (无 BSA的封闭剂；产品编号为SG02，Surmodics，Eden Prairie，MN)，离液剂如盐酸胍，和去污剂或表面活性剂。有用的离子型去污剂包括十二烷 基硫酸钠(SDS，月桂基硫酸钠(SLS))、月桂醇聚醚硫酸钠(SLS，月桂基醚硫酸钠(SLES))、月 桂基硫酸铵(ALS)、西曲溴铵（cetrimonium bromide)、西曲氯铵（cetrimonium chloride)、 西曲硬脂酸铵（cetrimonium stearate)等。有用的非离子(两性离子）去污剂包括聚乙二 醇、聚山梨醇酯20(亦称为吐温20)、其它聚山梨醇酯类（如40、60、65、80等）、1^如11-乂（如 父100、乂114)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(0^5)、0^30、脱氧胆酸、脱氧 胆酸钠、NP-40、糖苷类、辛基-硫代葡萄糖苷、麦芽糖苷等。在一些实施方案中，Pluronic F-68(-种显示降低血小板聚集的表面活性剂）用于在分离和/或检测期间处理包含囊泡的样 品。F68可在0.1%至10%的浓度下使用，例如，1%、2.5 %或5%的浓度。可使用各种酸、碱、 缓冲液或盐调节溶液的pH和/或离子强度，包括但不限于，氯化钠(NaCl)、磷酸盐缓冲盐水 (PBS)、tris缓冲的盐水(TBS)、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾、柠檬酸钠和盐水-柠檬酸钠(SSC)缓 冲液。在一些实施方案中，以0.1 %至10 %的浓度添加 NaCl，例如1 %、2.5 %或5 %的最终浓 度。在一些实施方案中，以0.005%至2%的浓度添加吐温20,例如0.05%、0.25%或0.5%的 最终浓度。用于本发明的封闭剂包含惰性蛋白质，例如乳蛋白、脱脂干乳蛋白（non-fat dry milk protein)、白蛋白、BSA、酪蛋白或血清，诸如新生牛血清(NBCS)、山羊血清、兔血清或 鲑鱼血清。所述蛋白质可以0.1%至10%的浓度加入，例如1%、2%、3%、3.5%、4%、5%、 6%、7%、8%、9%或10%的浓度。在一些实施方案中，BSA可以0.1 %至10%的浓度加入，例 如1%、2%、3%、3.5%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的浓度。在一个实施方案中，根据 2005年7月13日提交的美国专利申请11/632946中给出的方法处理样品，该申请通过引用以 其全文并入本文。可使用可商购的封闭剂，诸如来自Pierce(Thermo Fisher Scientific， Rockford，IL的分部）的SuperBlock、StartingBlock、Protein-Free。在一些实施方案中，以 0.1 %至10 %的浓度加入SSC/去污剂(例如，具有0.5 %的吐温20或0.1 %的Tri ton-X 100的 20X SSC)，例如以1.0%或5.0%的浓度。
[0260]可根据需要使用本文所述的方案和处理的各种组合优化检测囊泡和其它循环生 物标志物的方法。可通过搅拌、分离方法和添加剂的各种组合优化检测方案。在一些实施方 案中，在分离步骤之前和之后涡旋患者样品，并且使用包括BSA和/或F68在内的封闭剂处理 样品。这类处理可减少大聚集物或者蛋白质或其它生物碎片的形成，并且因此提供更为一 致的检测结果读出。[0261 ]过滤和超滤
[0262]可以通过以下方式从生物样品中分离囊泡:通过过滤模块过滤来自受试者的生物 样品以及从该过滤模块收集包含囊泡的滞留物，从而从生物样品中分离囊泡。该方法可包 括通过包含过滤器(在本文中也称为选择膜)的过滤模块过滤来自受试者的生物样品；以及 从该过滤模块收集包含囊泡的滞留物，从而从生物样品中分离囊泡。例如，在一个实施方案 中，过滤器保留大于约100千道尔顿的分子。在这类情况下，微囊泡一般见于过滤过程的滞 留物内，而较小的实体如蛋白质、蛋白质复合物、核酸等会通过进入到滤液中。[0263 ]当确定一种或多种微囊泡的生物印记时可以使用该方法。该方法还可以进一步包 括使过滤得到的滞留物与多个基底接触，其中每个基底偶联至一种或多种捕获剂，并且所 述多个基底的每个子集包含与所述多个基底的另一个子集不同的捕获剂或捕获剂组合。
[0264] 本文还提供了一种确定样品中囊泡的生物印记的方法，该方法包括:通过过滤模 块过滤来自患有病症的受试者的生物样品，从该过滤模块收集包含一种或多种囊泡的滞留 物，以及确定所述一种或多种囊泡的生物印记。在一个实施方案中，该过滤模块包含截留大 于约100或150千道尔顿的分子的过滤器。
[0265] 本文公开的方法可进一步包括通过如下步骤来表征受试者的表型:通过过滤模块 过滤来自受试者的生物样品；从该过滤模块收集包含一种或多种囊泡的滞留物;检测该一 种或多种囊泡的生物印记；以及基于该生物印记表征受试者的表型，其中表征具有至少 70%的灵敏度。在一些实施方案中，表征包括确定具有生物印记的一种或多种囊泡的量。并 且，该表征可以具有约80 %至100 %的灵敏度。
[0266] 本文还提供了一种对多种囊泡的多重分析的方法。在一些实施方案中，该方法包 括通过过滤模块过滤来自受试者的生物样品；从该过滤模块收集包含所述多种囊泡的滞留 物;将所述多种囊泡施加至多种捕获剂，其中所述多种捕获剂偶联至多个基底，并且所述多 个基底的每个子集与所述多种基底的另一子集差异地标记;捕获所述多种囊泡的至少一个 子集；以及针对所捕获的囊泡的至少一个子集确定生物印记。在一个实施方案中，每个基底 偶联至一种或多种捕获剂，并且所述多个基底的每个子集包含与所述多个基底的另一子集 相比不同的捕获剂或捕获剂组合。在一些实施方案中，所述多个基底的至少一个子集内在 地标记，如包含一种或多种标记。该基底可以是颗粒或珠子，或其任意组合。在一些实施方 案中，该过滤器截留大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、 110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、 1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、 9000、9500、10000或大于10000千道尔顿(1^)&)的分子。在一个实施方案中，该过滤模块包含 截留大于约100或150千道尔顿的分子的过滤器。在一个实施方案中，该过滤模块包含截留 大于约9、20、100或150千道尔顿的分子的过滤器。在又一个实施方案中，该过滤模块包含截 留大于约7000kDa的分子的过滤器。
[0267] 在一些实施方案中，用于多种囊泡的多重分析的方法包括通过过滤模块过滤来自 受试者的生物样品，其中该过滤模块包含截留大于约100千道尔顿的分子的过滤器;从该过 滤模块收集包含所述多种囊泡的滞留物;将所述多种囊泡施加至多种捕获剂，其中所述多 种捕获剂偶联至微阵列；在该微阵列上捕获所述多种囊泡的至少一个子集；以及对于所捕 获的囊泡的至少一个子集确定生物印记。在一些实施方案中，该过滤器截留大于1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、 180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、 4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000或大于10000 千道尔顿(kDa)的分子。在一个实施方案中，该过滤模块包含截留大于约100或150千道尔顿 的分子的过滤器。在一个实施方案中，该过滤模块包含截留大于约9、20、100或150千道尔顿 的分子的过滤器。在又一个实施方案中，该过滤模块包含截留大于约7000kDa的分子的过滤 器。
[0268] 生物样品可以在通过过滤分离之前净化。净化包括选择性去除分子碎片和其它不 需要的物质。例如，可以去除可能干扰循环生物标志物的检测的分子碎片和其它组分。该净 化可以通过低速离心进行，例如以约5,00(^8、4,00(^8、3,00(^8、2,00(^8、1，00(^8或更低 来进行。然后可以收集并过滤含有囊泡的上清液或净化的生物样品，以从净化的生物样品 中分离囊泡。在一些实施方案中，生物样品在通过过滤分离囊泡之前并不净化。
[0269] 在一些实施方案中，从样品中分离囊泡并不使用高速离心，例如超速离心。例如， 分离可能不需要使用例如约l〇〇,〇〇〇xg或更高的离心速度。在一些实施方案中，从样品中分 离囊泡使用小于50，000xg、40，000xg、30，000xg、20，000xg、15,000xg、12，000xg 或10,000xg 的速度。
[0270] 可以使用任意数目的适用过滤器配置来过滤感兴趣的样品。在一些实施方案中， 用于从生物样品中分离循环生物标志物的过滤模块为基于纤维的过滤柱。例如，该纤维可 以是中空的聚合纤维，例如聚丙烯中空纤维。可以通过用栗装置如蠕动栗将样品流体如本 文公开的生物流体栗入过滤模块中来将生物样品引入到过滤模块中。栗流速可以变化，例 如为约 0·25、0·5、1、1·5、2、2·5、3、3·5、4、4·5、5、6、7、8、9或10mL/分钟。该流速可以考虑到 诸如过滤模块的尺寸和通量等配置来调节。
[0271] 过滤模块可以是膜过滤模块。例如，膜过滤模块可包含滤片膜，诸如装配于搅拌单 元仪器(例如包含磁力搅拌器）中的亲水聚偏二氟乙烯(PVDF)滤片膜。在一些实施方案中， 样品由于在滤膜任一侧所建立的压力梯度而移动通过过滤器。
[0272] 过滤器可包含具有低疏水吸附性和/或高亲水特性的材料。例如，过滤器可具有用 于截留囊泡而透过大多数蛋白质的平均孔径以及亲水性的表面，由此限制蛋白质吸附。例 如，过滤器可包含选自聚丙烯、PVDF、聚乙烯、聚氟乙烯、纤维素、仲醋酸纤维素 secondary cellulose acetate、聚乙稀醇和乙稀乙烯基醇（EVAL®,Kuraray Co.，0kayama，Japan) 的材料。可用于过滤器中的其它材料包括但不限于聚砜和聚醚砜。
[0273] 过滤模块可以具有截留大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、 70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、 800或900千道尔顿(kDa)的分子的过滤器，例如MW⑶(分子量截止值)分别为约1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、 190、200、250、300、400、500、600、700、800或900kDa的过滤器。在一些实施方案中，过滤模块 具有 1000kDa、1500kDa、2000kDa、2500kDa、3000kDa、3500kDa、4000kDa、4500kDa、5000kDa、 5500kDa、6000kDa、6500kDa、7000kDa、7500kDa、8000kDa、8500kDa、9000kDa、9500kDa、 lOOOOkDa或大于lOOOOkDa的MWC0。可使用具有9kDa、20kDa和/或150kDa的MWC0范围的超滤 膜。在一些实施方案中，该过滤模块中的过滤器具有约O.OUm至约0.15μπι的平均孔径，并且 在一些实施方案中，具有约0.05μπι至约0.12μπι的平均孔径。在一些实施方案中，该过滤器具 有约0 · 06μηι、0 · 07μηι、0 · 08μηι、0 · 09μηι、0 · 1μηι、0 · Ilym或0 · 2ym的平均孔径。
[0274] 过滤模块可以是市售可得的柱子，例如一般用于浓缩蛋白质或分离蛋白质（例如 超滤）的柱子。实例包括但不限于，来自Millpore(Billerica，MA)的柱，诸如Amicon®离 心过滤器，或来自Pierce® (Rockford，IL)的柱，诸如Pierce Concentrator过滤器装置。 来自Pierce的有用的柱包括具有9kDa、20kDa和/或150kDa的MWC0的一次性超滤离心装置。 这些浓缩器由与圆锥装置结合的高性能再生纤维素膜组成。该过滤器可以如美国专利6， 269，957或6，357，601中所述，两个申请均通过引用以其全文并入本文。
[0275] 可以从过滤模块收集包含分离的囊泡的滞留物。可通过从过滤器上冲洗滞留物而 收集该滞留物。不受理论的束缚，选择具有亲水表面性质的过滤器组成，从而限制蛋白质吸 附，可用于更容易地收集滞留物，并使严苛或耗时的收集技术的使用降至最低
[0276] 然后，可如本发明进一步描述的，将所收集的滞留物用于随后的分析，诸如评估滞 留物中的一种或多种囊泡的生物印记。该分析可在所收集的滞留物上直接进行。或者，可在 对一种或多种囊泡进行分析之前进一步浓缩或纯化所收集的滞留物。例如，可以使用大小 排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合(如 本文所述)来进一步浓缩该滞留物或者从该滞留物中进一步分离囊泡。在一些实施方案中， 该滞留物可经历另一个过滤步骤。或者，在用过滤器分离囊泡之前，可以使用包括但不限于 大小排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合 的技术来浓缩或分离囊泡。
[0277] 可使用过滤器组合来浓缩和分离生物标志物。例如，生物样品可首先通过孔隙度 或孔径为约〇. 〇 1M1至约1 ΟμLΉ，例如0.01 μLΉ至约2μηι或约0.05μηι至约1.5μηι的过滤器过滤，然 后过滤该样品。例如，可先将生物样品通过孔隙度或孔径为约〇. 〇lym至约1 Ομπι，例如0.0Ιμπι 至约2μηι或约0.05μηι至约1.5μηι的过滤器过滤，然后通过过滤模块过滤该生物样品，该过滤 模块具有截留大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、 120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、 1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、 9000、9500、10000或大于10000千道尔顿(1^) &)的分子的过滤器，例如110)(分子量截止值） 分别为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、 140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、 2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、 10000或大于lOOOOkDa的过滤器。在一些实施方案中，过滤器的孔径为约0.01、0.02、0.03、 0·04、0·05、0·06、0·07、0·08、0·09、0·1、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1·0、1·1、 1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.(^111。该过 滤器可以是注射器式滤器。因此，在一个实施方案中，该方法包括在将样品通过包含截留大 于约100或150千道尔顿的分子的过滤器的过滤模块过滤之前，将生物样品通过过滤器如注 射器式滤器过滤，其中该注射器式滤器的孔隙度为大于约Ιμπι。在一个实施方案中，该过滤 器是1.2μΜ过滤器，并且过滤之后使样品穿过具有150kDa截止值的7ml或20ml浓缩柱。可以 使用多个浓缩柱，例如串联使用。例如，7000MWC0过滤单元可以在150MWC0单元之前使用。
[0278] 过滤模块可以是微流体装置的组件。微流体装置，也可被称为"芯片上实验室"系 统、生物医学微机电系统(bioMEM)或多组件集成系统，可用于分离和分析囊泡。这类系统将 允许囊泡结合、生物标志物检测的过程和其它过程(诸如本发明进一步描述的过程)小型化 和区室化。
[0279] 过滤模块和评估可以如Grant，R.等人，A filtration-based protocol to isolate human Plasma Membrane-derived Vesicles and exosomes from blood plasma，J Immunol Methods(2011)371:143-51(Epub 2011 年6月30日）所述进行，这篇参考 文献通过引用以其全文并入本文。
[0280] 微流体装置也可用于通过包含过滤模块来分离囊泡。例如，微流体装置可采用一 个或多个通道，该通道用于基于来自生物样品的大小从生物样品中分离囊泡。可将生物样 品引入到一个或多个微流体通道中，这些通道选择性地允许囊泡通过。微流体装置可进一 步包含结合试剂或者超过一个分离模块，以基于囊泡的性质(例如大小、形状、可变形性、生 物标志物谱或生物印记)选择囊泡。
[0281] 来自过滤步骤的滞留物可在评估其中的微囊泡或其它生物标志物之前进一步处 理。在一个实施方案中，在生物标志物评估之前稀释该滞留物，例如用合适的稀释剂如生物 相容的缓冲液稀释。在一些情况下，连续稀释该滞留物。在一方面，本发明提供了一种用于 检测来自生物样品的微囊泡群体的方法，其包括:a)使用孔径为Ο.ΟΙμπι至约ΙΟμπι或者分子 量截止值(MWC0)为约lkDa至lOOOOkDa的选择膜来浓缩生物样品；b)将来自浓缩步骤的滞留 物稀释成一个或多个等份；以及c)使滞留物的一个或多个等份中的每一个与对于微囊泡群 体中的至少一种微囊泡的分子具有特异性的一种或多种结合剂接触。在一个相关的方面， 本发明提供了一种用于检测来自生物样品的微囊泡群体的方法，其包括:a)使用孔径为 Ο.ΟΙμπι至约ΙΟμπι或者分子量截止值(MWC0)为约lkDa至lOOOOkDa的选择膜来浓缩生物样品； 以及b)使来自浓缩步骤的滞留物的一个或多个等份与对于微囊泡群体中的至少一种微囊 泡的分子具有特异性的一种或多种结合剂接触。
[0282] 所述选择膜的大小可以设置为截留滞留物中的所需生物标志物或者允许所需生 物标志物通过过滤器进入到滤液中。过滤膜可以选择为具有一定的孔径或MWC0值。选择膜 可以具有约 0·01、0·02、0·03、0·04、0·05、0·06、0·07、0·08、0·09、0·1、0·2、0·3、0·4、0·5、 0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.喊2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、 7·0、8·0、9·0或ΙΟ.Ομπι 的孔径。选择膜也可以具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、 40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、 500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或100001^^的 MffCO〇
[0283] 可以将滞留物分离和/或稀释成任意数目的所需等份。例如，未经任何稀释或相同 稀释度的多个等份可用于确定重复性。在另一个实例中，不同稀释度的多个等份可用于构 建浓度曲线。在一个实施方案中，将滞留物分离和/或稀释成至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 100、150、200、250、300、350或400个等份。这些等份可以为相同稀释度或不同稀释度。
[0284] 稀释系数是混合物(稀释剂和等份的混合物）的最终体积除以等份的初始体积的 比。滞留物可以以约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、 110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、 1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、 9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000和/或100000的 稀释系数稀释成一个或多个等份。例如，滞留物可以以约500的稀释系数稀释成一个或多个 等份。
[0285] 为了估计浓度或者形成曲线，可以将滞留物稀释成多个等份。在该方法的一个实 施方案中，滞留物可以以约1〇〇、250、500、1000、10000和100000的稀释系数稀释成一个或多 个等份。根据需要，该方法可以进一步包括检测滞留物的每个等份中的微囊泡的量，例如与 一种或多种结合剂形成复合物的微囊泡的量。可以用曲线来确定所检测的每个等份中微囊 泡的量相对于稀释系数的线性范围。对于生物样品检测的微囊泡的浓度可以使用在一个或 多个等份中确定的在线性范围内的微囊泡的量来确定。该浓度可以与参照浓度进行比较， 以便例如如本文所述表征表型。
[0286] 本发明还提供一种相关的方法，其包括将来自受试者的生物样品通过过滤模块过 滤，并收集包含囊泡的滤液，从而从生物样品中分离囊泡。在这样的情况下，细胞和其它大 实体可以保留在滞留物中，而微囊泡穿过进入到滤液中。应当理解，可以协同使用截留和过 滤微囊泡的策略。例如，可以使用允许微囊泡穿过的选择膜过滤样品，从而将微囊泡从大颗 粒(细胞、复合物等）中分离出来。然后可以将包含微囊泡的滤液用截留微囊泡的选择膜过 滤，从而将微囊泡从较小的颗粒(蛋白质、核酸等）中分离出来。分离的微囊泡可以根据本发 明的方法进一步评估，例如用以表征表型。
[0287] 沉淀
[0288] 可以使用聚合物沉淀法来分离囊泡。该方法可以与本文所述的其它分离方法结合 使用，或取代本文所述的其它分离方法使用。在一个实施方案中，将含有囊泡的样品与聚乙 二醇(PEG)的制剂接触。该聚合物制剂与含有囊泡的样品一起温育，然后通过离心沉淀。PEG 可以与囊泡结合，并且可以通过添加捕获部分例如聚乙二醇化的结合蛋白质如抗体来处 理，以便特异性地捕获囊泡。技术人员将会理解，除了PEG外还可以使用其它聚合物，例如 PEG衍生物，包括具有不同分子量的甲氧基聚乙二醇、聚（环氧乙烷）以及通式为H〇-CH2-(CH2-0-CH2-)n-CH 2-OH的多种聚合物。分离效率可取决于多种因素，包括聚合物链的长度以 及所用聚合物的浓度。在优选的实施方案中，PEG4000或PEG8000可以以1 %、2%、3%、4%、 5%、6%、7%、8%、9%或10%例如4%或8%的浓度使用。
[0289] 在本发明的一些实施方案中，使用聚合物沉淀法从样品中浓缩囊泡，并使用另一 方法将分离的囊泡进一步分开。第二步可用于鉴定囊泡的亚群，例如展示特定生物标志物 的亚群。第二分离步骤可包括如本文所述的大小排阻、结合剂、抗体捕获步骤、微珠。
[0290]在一个实施方案中，使用来自 System Biosciences，Mountain View，CA USA的 ExoQuick™和ExoQuick-TC™试剂盒分离囊泡。这些试剂盒使用基于聚合物的沉淀法来沉淀 囊泡。类似地，可以使用来自 Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad，CA USA)的Total Exosome Isolation(自血清）或Total Exosome Isolation(自细胞培养基）试剂盒分离囊 泡。Total Exosome Isolation试剂迫使较难溶的组分如囊泡离开溶液，使之能够通过较短 的低速离心收集。往生物样品中加入试剂，溶液在2°C至8°C下温育过夜。通过标准离心回收 沉淀的囊泡。
[0291]结合剂
[0292] 结合剂(又称结合试剂)包括能结合靶生物标志物的试剂。结合剂可对靶生物标志 物具有特异性，意味着该试剂能结合靶生物标志物。靶标可为本文公开的任何有用的生物 标志物，如囊泡表面上的生物标志物。在一些实施方案中，靶标为单一分子，如单一蛋白质， 使得结合剂对单一蛋白质具有特异性。在其它实施方案中，靶标可为一组分子，如具有相似 表位或部分的家族或一组蛋白质，使得结合剂对该家族或这组蛋白质具有特异性。这组分 子也可以是一类分子，如蛋白质、DNA或RNA。结合剂可以是用来通过结合囊泡的组分或生物 标志物而捕获囊泡的捕获剂。在一些实施方案中，捕获剂包含可结合囊泡上的抗原的抗体 或其片段或适体。如本文进一步描述的，捕获剂可任选地偶联到基底上并用来分离囊泡。
[0293] 结合剂是结合循环生物标志物如囊泡或囊泡的组分的试剂。结合剂可用作捕获剂 和/或检测剂。捕获剂可结合和捕获循环生物标志物，诸如通过结合囊泡的组分或生物标志 物而进行。例如，捕获剂可以是与囊泡上的抗原结合的捕获抗体或捕获抗原。检测剂可与循 环生物标志物结合，由此帮助对生物标志物的检测。例如，包含隔离至基底的抗体或适体的 捕获剂可用于捕获样品中的囊泡，并且包含携带标记的抗体或适体的检测剂可用于通过对 检测剂的标记进行检测而检测所捕获的囊泡。在一些实施方案中，使用识别相同囊泡生物 标志物的捕获剂和检测剂评估囊泡。例如，可使用四跨膜蛋白，例如通过使用结合至基底的 抗CD9抗体来捕获囊泡群体，并且可使用荧光标记的抗CD9抗体标记所捕获的囊泡，从而检 测所捕获的囊泡。在其它实施方案中，使用识别不同囊泡生物标志物的捕获剂和检测剂评 估囊泡。例如，可使用细胞特异性标志物，例如通过使用结合至基底的抗PCSA抗体来捕获囊 泡群体，并且可使用荧光标记的抗CD9抗体标记所捕获的囊泡，从而检测所捕获的囊泡。类 似地，可使用一般囊泡标志物，例如通过使用结合至基底的抗CD9抗体来捕获囊泡群体，并 且可使用针对细胞特异性或疾病特异性标志物的荧光标记抗体标记所捕获的囊泡，从而检 测所捕获的囊泡。
[0294] 被结合剂识别的生物标志物在本文中有时称作抗原。除非另有说明，本文使用的 抗原意在包括能够被结合剂结合的任何实体，无论结合剂的类型或生物标志物的免疫原性 如何。该抗原进一步包括其功能片段。例如，抗原可包括能被结合剂结合的蛋白质生物标志 物，包括能被结合剂结合的蛋白质片段。
[0295] 在一个实施方案中，使用与囊泡上的生物标志物结合的捕获剂捕获囊泡。如本发 明进一步描述的，捕获剂可偶联至基底上并且用于分离囊泡。在一个实施方案中，使用捕获 剂对存在于基底或样品中的囊泡进行亲和捕获或分离。
[0296] 可以在从生物样品中浓缩或分离囊泡之后使用结合剂。例如，在分离或检测具有 特定生物印记的囊泡之前，可首先从生物样品中分离囊泡。可使用针对生物标志物的结合 剂分离或检测具有特定生物印记的囊泡。可从异质的囊泡群体中分离或检测具有特定生物 印记的囊泡。或者，可在不进行事先的分离或浓缩步骤的情况下对包含囊泡的生物样品使 用结合剂。例如，使用结合剂直接从生物样品中分离或检测具有特定生物印记的囊泡。
[0297] 结合剂可以是可与囊泡组分结合的核酸、蛋白质或其它分子。结合剂可以包含 DNA、RNA、单克隆抗体、多克隆抗体、Fab、Fal/、单链抗体、合成抗体、适体(DNA/RNA)、类肽、 zDNA、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、凝集素、合成的或天然存在的化学化合物(包括但不限 于药物、标记试剂）、树状聚体或它们的组合。例如，结合剂可以是捕获抗体。在本发明的实 施方案中，结合剂包括膜蛋白标记剂。例如，参见，公开于Alroy等人的美国专利公布号US 2005/0158708中的膜蛋白标记剂。在一个实施方案中，如本文所述分离或捕获囊泡，并且使 用一种或多种膜蛋白标记剂检测囊泡。
[0298] 在某些情况下，可以使用单一的结合剂来分离或检测囊泡。在其它情况中，可以使 用不同结合剂的组合来分离或检测囊泡。例如，可以使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同的结合剂来从生物样品中分离或检测囊 泡。此外，如下文中进一步描述的，用于囊泡的一种或多种不同的结合剂可以形成囊泡的生 物印记。
[0299] 还可以使用不同的结合剂来进行多重分析。例如，可以通过使用不同的结合剂来 分离或检测各个囊泡群体从而进行对多于一个囊泡群体的分离或检测。不同的结合剂可以 与不同的颗粒结合，其中所述不同的颗粒被标记。在另一个实施方案中，可以将包含不同结 合剂的阵列用于多重分析，其中所述不同的结合剂被差异地标记，或者可以根据结合剂在 阵列上的位置来确定。如下文中所述，可以最高在标记或检测方法的分辨能力下完成多重 分析。结合剂可用于检测囊泡，例如用于检测起源细胞特异性囊泡。一种结合剂或多种结合 剂本身可形成结合剂谱，其提供了囊泡的生物印记。一种或多种结合剂可选自2011年4月6 日提交的、名为"Circulating Biomarkers for Disease"的国际专利公布号W0/2011/ 127219的图2,该申请通过引用以其全文并入本文。例如，如果在从异质的囊泡群体中差异 检测或分离囊泡中使用2种、3种、4种或更多种结合剂检测或分离囊泡群体，则该囊泡群体 的特定结合剂谱提供了该特定囊泡群体的生物印记。可使用任何数目的结合剂以多重方式 检测囊泡。因此，结合剂还可用于形成囊泡的生物印记。该生物印记可用于表征表型。
[0300] 所述结合剂可以是凝集素。凝集素是选择性地结合多糖和糖蛋白的蛋白质，且广 泛地分布于植物和动物中。例如，为了分离囊泡可使用来自雪花莲(Galanthus nivalis)的 雪花莲凝集素（"GNA"）形式的凝集素、来自黄水仙(Narcissus pseudonarcissus)的黄水仙 凝集素（"NPA"）形式的凝集素以及来自蓝绿藻类椭孢念珠藻(Nostoc ellipsosporum)的名 为"蓝藻抗病毒蛋白（cyanovirin)" 的凝集素（Boyd等人，Antimicrob Agents Chemother 41(7):1521 1530，1997;Hammar等人，Ann N Y Acad Sci 724:166 169，1994;Kaku等人， Arch Biochem Biophys 279(2) :298304,1990)。这些凝集素可与具有高甘露糖含量的糖蛋 白结合(Chervenak等人，Biochemistry34( 16): 5685 5695，1995)。高甘露糖糖蛋白是指具 有α-1-3或α-1-6甘露糖-甘露糖连接形式的甘露糖-甘露糖连接的糖蛋白。
[0301] 所述结合剂可以是结合一种或多种凝集素的试剂。凝集素捕获可应用于生物标志 物组织蛋白酶D的分离，这是因为其为能够结合凝集素雪花莲凝集素(GNA)和伴刀豆球蛋白 A(ConA)的糖基化蛋白质。
[0302] 使用凝集素捕获囊泡的方法和装置在2010年11月30日提交的、名为"METHODS AND SYSTEMS FOR IS0LATING，ST0RING，AND ANALYZING VESICLES" 的国际专利公布W0/2011/ 066589;2009年 12月3 日提交的、名为"AFFINITY CAPTURE OF CIRCULATING BIOMARKERS" 的 国际专利公布W〇/2010/065765、2010年6月4日提交的、名为"METHODS AND MATERIALS FOR ISOLATING EX0S0MES"的国际专利公布W0/2010/141862;以及2007年3月9日提交的、名为 "EXTRACORPOREAL REMOVAL OF MICROVESICULAR PARTICLES" 的国际专利公布W0/2007/ 103572中描述，这些申请的每一篇都通过引用以其全文并入本文。
[0303] 所述结合剂可以是抗体。例如，可以使用一种或多种对于囊泡上存在的一种或多 种抗原具有特异性的抗体来分离囊泡。例如，囊泡可在其表面上具有CD63,并且可使用针对 CD63的抗体或捕获抗体来分离该囊泡。或者，来源于肿瘤细胞的囊泡可表达EpCam，该囊泡 可以使用针对EpCam和⑶63的抗体来分离。用于分离囊泡的其它抗体可包括针对⑶9、PSCA、 TNFR、CD63、B7H3、MFG-E8、EpCam、Rab、CD81、STEAP、PCSA、PSMA或5T4的抗体或捕获抗体。用 于分离囊泡的其它抗体可包括针对DR3、STEAP、epha2、TMEM211、MFG-E8、组织因子（TF)、 unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TR0P2或TETS的抗体或捕获抗体。
[0304] 在一些实施方案中，所述捕获剂是针对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、 PSCA、ICAM、STEAP或EGFR的抗体。所述捕获剂也可以用于鉴定囊泡的生物标志物。例如，诸 如针对CD9的抗体的捕获剂将把CD9鉴定为囊泡的生物标志物。在一些实施方案中，可以使 用多种捕获剂，例如在多重分析中。所述多种捕获剂可包含针对以下一种或多种的结合剂： CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR。在一些实施方案中，所 述多种捕获剂包含针对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、MFG-E8和/或EpCam的结合剂。在 其它实施方案中，所述多种捕获剂包含针对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、PSCA、 ICAM、STEAP和/或EGFR的结合剂。所述多种捕获剂包含针对TMEM211、MFG-E8、组织因子(TF) 和/或CD24的结合剂。
[0305]本文所提及的抗体可以是免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分， 即，包含特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子和合成抗体。该免疫球蛋白分子可以是 免疫球蛋白分子的任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亚类。抗体包括但不限于多克 隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、合成抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段 和FUl/ )2片段、Fv或F/部分、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体或者上文 所述的任意抗体的表位结合片段。如果抗体优先地与抗原结合，并且例如与另一种分子具 有低于约30%、20%、10%、5%或1%的交叉反应性，则该抗体，或者通常情况下的任何分 子，"特异性地结合"抗原(或其它分子）。
[0306]结合剂还可以是多肽或肽。多肽以其最广义的理解使用，并且可以包括亚单位氨 基酸、氨基酸类似物或拟肽的序列。亚单位可以通过肽键连接。该多肽可以是天然存在的多 肽的天然存在形式、加工形式(例如通过酶消化）、化学合成的多肽或重组表达的。可以使用 标准技术进行化学合成用于本发明的方法中的多肽。该多肽可以包含D-氨基酸(其对L-氨 基酸特异性蛋白酶具有抗性）、D-和L-氨基酸的组合、β氨基酸或各种其它设计或非天然存 在的氨基酸（例如甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸和Να-甲基氨基酸等），从而赋予特定的性 质。合成的氨基酸可以包括对应赖氨酸的鸟氨酸以及对应亮氨酸或异亮氨酸的正亮氨酸。 此外，该多肽可以具有拟肽键，例如酯键，从而制备具有新性质的多肽。例如，可以生成引入 了还原肽键的多肽，即，Ri-Ofe-NH-fc，其中心和办为氨基酸残基或序列。可以将还原肽键作 为二肽亚单位引入。这样的多肽对蛋白酶活性具有抗性，并且在体内具有延长的半衰期。多 肽还可以包括类肽(N-取代的甘氨酸），其中侧链连接到沿分子骨架的氮原子上，而非如在 氨基酸中一样连接到碳上。在本申请的全文中，多肽和肽可互换使用，即，在使用术语肽 的情况下，其还可以包括多肽，而在使用术语多肽的情况下，其还可包括肽。除非另有说明， 在本申请的全文中，术语"蛋白质"与术语"多肽"和"肽"也可互换使用。
[0307] 囊泡可以使用结合剂分离、捕获或检测。该结合剂可以是结合囊泡"看家蛋白质" 或一般囊泡生物标志物的试剂。该生物标志物可以是CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、 Rab-5b、膜联蛋白V、MFG-E8或其它常观察到的囊泡标志物，包括表3中列出的标志物。此外， 可以选择此处或表3中公开的任何标志物来鉴定疾病或病况的候选生物印记，其中一种或 多种选定的生物标志物在参与疾病或病况的机理中具有直接或间接的作用或功能。
[0308] 所述结合剂也可以是与来源于特定细胞类型如肿瘤细胞（例如，针对组织因子、 EpCam、B7H3、RAGE或CD24的结合剂)或特定起源细胞的囊泡结合的试剂。用于分离或检测囊 泡的结合剂可以是针对选自2011年4月6日提交的、名为"Circulating Biomarkers for Disease"的国际专利公布号W0/2011/127219的图1的抗原的结合剂，这篇申请通过引用以 其全文并入本文。针对囊泡的结合剂也可以选自国际专利公布号W0/2011/127219的图2中 列举的结合剂。该结合剂可以针对抗原例如四跨膜蛋白、MFG-E8、膜联蛋白V、5T4、B7H3、小 窝蛋白、CD63、CD9、E-钙粘着蛋白、组织因子、]^^48、丁]\^]\1211丄024、？5〇八、？〇5八、？5]\^、1^13-5B、STEAP、TNFR1、CD81、EpCam、CD59、CD81、I CAM、EGFR或CD66。针对血小板的结合剂可以是 糖蛋白，如6?1&-11&、6?1113-1113、6?11113、6?113或6?1乂。结合剂可以针对包括0)9 4外2、 Erb4、CD81、Erb3、MUC16、CD63、DLL4、HLA-Drpe、B7H3、IFNAR、5T4、PCSA、MICB、PSMA、MFG-E8、 Mucl、PSA、Muc2、Unc93a、VEGFR2、EpCAM、VEGF A、TMPRSS2、RAGE、PSCA、CD40、Mucl7、IL-17-RA和CD80中的一种或多种的抗原。例如，结合剂可以是CD9、CD63、CD81、B7H3、PCSA、MFG-E8、 MUC2、EpCam、RAGE和Mucl7中的一种或多种。一种或多种结合剂，例如一种或多种针对两种 或更多种抗原的结合剂，可用于分离或检测囊泡。所用的结合剂可以基于分离或检测来源 于独特细胞类型的囊泡或起源细胞特异性囊泡的需求而选择。该结合剂可以是表4中的一 种或多种囊泡标志物。
[0309] 结合剂还可以直接或间接连接至固体表面或基底。固体表面或基底可以是任何可 物理分离的、结合剂可直接或间接地与之附接的固体，包括但不限于由以下物质提供的表 面:微阵列和孔、颗粒如珠子、柱、光纤、擦拭物、玻璃和改性的或官能化的玻璃、石英、云母、 重氮化膜(纸或尼龙）、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、纸、陶瓷、金属、准金属、半导体材料、量 子点、涂覆的珠子或颗粒、其它色谱材料、磁性颗粒;塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙 烯或其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(PTFE，Teflon®》 等）、多糖、尼龙或硝化纤维素、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅）、 碳、金属、无机玻璃、塑料、陶瓷、导电聚合物(包括聚合物如聚吡咯和聚吲哚）；微米或纳米 结构表面如核酸瓦片阵列、纳米管、纳米线或纳米颗粒装饰的表面;或多孔表面或凝胶，如 甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、糖聚合物、纤维素、硅酸盐或者其它纤维状或链状聚合物。此外， 如本领域已知的，可以使用含有任意数量材料的钝性或化学衍生的涂料对基底进行涂覆， 该材料包括聚合物，如葡聚糖、丙烯酰胺、明胶或琼脂糖。这类涂料可有利于对生物样品使 用阵列。
[0310] 例如，用于分离囊泡的抗体可以结合至固体基底如孔，如市售可得的平板(例如得 自Nunc，Mi lan，Italy)。可以使用抗体涂覆各孔。在一些实施方案中，用于分离囊泡的抗体 结合至诸如阵列的固体基底。该阵列可以具有分子相互作用、结合岛、生物分子、区带、域的 预定的空间排列，或者结合岛或者分布于离散边界内的结合剂的空间排列。此外，术语阵列 在本文中可以用于指在表面上排列的多阵列，例如可以为表面上具有阵列的多个拷贝的情 况。这种具有多阵列的表面还可以称为多重阵列或重复阵列。
[0311] 阵列通常含有可寻址部分，该部分能够检测实体的存在，例如，通过结合事件检测 样品中的囊泡。阵列可被称为微阵列。阵列或微阵列包括但不限于DNA微阵列，如cDNA微阵 列、寡核苷酸微阵列和SNP微阵列、微RNA阵列、蛋白质微阵列、抗体微阵列、组织微阵列、细 胞微阵列(又称转染微阵列）、化学化合物微阵列和碳水化合物阵列(糖阵列）ANA阵列通常 包含能结合样品中存在的序列的可寻址的核苷酸序列。微RNA阵列，例如来自路易斯维尔大 学的MMChips或购自Agilent的商业系统，可用于检测微RNA。蛋白质微阵列可用于鉴定蛋白 质-蛋白质相互作用，包括但不限于鉴定蛋白质激酶的底物、转录因子蛋白质活化，或鉴定 生物活性小分子的靶标。蛋白质阵列可包括不同蛋白质分子(通常为抗体)或与感兴趣的蛋 白质结合的核苷酸序列的阵列。在非限制性实例中，蛋白质阵列可用来检测在其表面上具 有特定蛋白质的囊泡。抗体阵列包含点印在蛋白质芯片上的抗体，该抗体作为捕获分子用 来从样品（例如，从细胞或组织裂解物溶液）中检测蛋白质或其它生物物质。例如，抗体阵列 可用来从体液(例如，血清或尿液）中检测囊泡关联的生物标志物。组织微阵列包含以阵列 方式组装的单独的组织芯，以允许多重组织分析。细胞微阵列，又称转染微阵列，包含多种 捕获剂，如抗体、蛋白质或脂质，这些捕获剂可与细胞相互作用以促进其在可寻址位置的捕 获。由于囊泡与细胞膜之间的相似性，细胞阵列也可用于捕获囊泡。化学化合物微阵列包含 化学化合物的阵列，且可用来检测蛋白质或能与该化合物结合的其它生物物质。碳水化合 物阵列（糖阵列)包含碳水化合物的阵列，并且可检测例如能与糖部分结合的蛋白质。技术 人员应理解，根据本发明的方法可以采用类似的技术或改进。
[0312] 结合剂还可以与颗粒如珠子或微球结合。例如，对囊泡成分具有特异性的抗体可 以与颗粒结合，并且抗体结合的颗粒可以用于从生物样品中分离囊泡。在一些实施方案中， 该微球可以是磁性的或荧光标记的。此外，用于分离囊泡的结合剂可以是固体基底本身。例 如，可以使用胶乳珠，例如醛/硫酸盐珠 (Interfacial Dynamics，Portland，0R)。
[0313] 此外，还可以使用与磁珠结合的结合剂来分离囊泡。例如，可以收集来自患者的生 物样品如血清以用于结肠癌筛查。该样品可以与偶联到磁性微珠上的抗-CCSA_3(结肠癌特 异性抗原)一起温育。低密度微柱可以放置在MACS分离器的磁场中，然后用缓冲溶液如Tris 缓冲盐水洗涤该柱。然后，将磁性免疫复合物施加到柱上，并可以丢弃未结合的非特异性的 物质。可以通过从分离器中移出柱并将其放置在收集管上来回收CCSA-3选择的囊泡。可以 将缓冲液加入到柱上，并可以通过施加与该柱一起提供的柱塞来释放磁标记的囊泡。可以 在IgG洗脱缓冲液中稀释分离的囊泡，然后可将复合物离心从而将微珠与囊泡分离。可将分 离的起源细胞特异性囊泡的沉淀重悬浮于缓冲液如磷酸盐缓冲盐水中，并进行定量。或者， 由于抗体捕获的起源细胞特异性囊泡与磁性微珠之间的强吸附力，可以使用蛋白水解酶如 胰蛋白酶来释放所捕获的囊泡而无需离心。可以将蛋白水解酶与抗体捕获的起源细胞特异 性囊泡一起温育足以释放所述囊泡的时间。
[0314]优选地使用用于分离囊泡的结合剂如抗体与包含感兴趣的囊泡的生物样品接触 至少足以使结合剂与囊泡的组分结合的一段时间。例如，抗体可以与生物样品接触不同的 时间间隔，时间范围从数秒，包括但不限于约10分钟、30分钟、1小时、3小时、5小时、7小时、 10小时、15小时、1天、3天、7天或10天。
[0315]可以对结合剂进行标记以促进检测，该结合剂例如为对2011年4月6日提交的、名 为"Circulating Biomarkers for Disease" 的国际专利公布号TO/2011/127219(该申请通 过引用以其全文并入本文）的图1中列举的抗原具有特异性的抗体，或者国际专利公布号 TO/2011/127219的图2中列举的结合剂。合适的标记包括但不限于磁性标记、荧光部分、酶、 化学发光探针、金属颗粒、非金属胶状颗粒、聚合染料颗粒、颜料分子、颜料颗粒、电化学活 性物质、半导体纳米晶体或包括量子点或金颗粒在内的其它纳米颗粒、荧光团、量子点或放 射性标记。各种蛋白质、放射性标记、荧光标记、酶标记和其它标记在上文进一步描述。
[0316] 可将结合剂直接或间接地标记，例如标记通过生物素-链霉亲和素附接至抗体。或 者，抗体没有被标记，而是稍后与第二抗体接触，该第二抗体在第一抗体与感兴趣的抗原结 合之后被标记。
[0317] 根据所用的分离或检测方法，结合剂可以连接至固体表面或基底，如阵列、颗粒、 孔和上文所述的其它基底。用于将抗体直接化学偶联至细胞表面的方法在本领域中是已知 的，并且可以包括，例如，使用戊二醛或马来酰亚胺活化的抗体进行偶联。使用多步程序进 行化学偶联的方法包括生物素化，使用例如这些化合物的琥珀酰亚胺酯的三硝基苯酚 (TNP)或洋地黄毒苷的偶联。可通过例如使用D-生物素基-N-羟基琥珀酰亚胺来完成生物素 化。琥珀酰亚胺基团在高于7的pH值下有效地与氨基基团反应，在约pH 8.0至约pH 8.5之间 优先。可以通过例如使用二硫苏糖醇处理细胞然后加入生物素马来酰亚胺而完成生物素 化。
[0318] 基于颗粒的实验
[0319] 作为平面阵列的替代，采用颗粒或微球的分析，如基于珠子的分柝，也能够与结合 剂一起使用。例如，抗体或适体很容易与可商购的珠子缀合。参见例如Fan等人，IIlumina universal bead arrays . Methods EnzymO 1 . 2006 410 : 57-73 ; Srinivas 等人 Anal·Chem· 2011年10月21日，Aptamer functionalized Microgel Particles for Protein Detection;另见，关于适体作为治疗剂和诊断剂的综述文章，Brody和Gold， Rev.Mol.Biotech.2000，74:5-13。
[0320] 使用具有同源配体的珠子涂层和具有特定活性的报告分子、符合高灵敏度自动化 的多参数分析或其它高通量检测分析均可以使用。在基于珠子的分析系统中，生物标志物 或囊泡的结合剂，如捕获剂(例如，捕获抗体），可以固定在可寻址的微球上。如图2B所示，用 于每个单独的结合分析的每种结合剂可以偶联至不同类型的微球（即，微珠)上，并且分析 反应发生在微球的表面上。囊泡的结合剂可以是偶联至珠子上的捕获抗体。具有离散的荧 光强度的染色微球分别负载有其合适的结合剂或捕获探针。携带不同结合剂的不同的珠子 组可根据需要合并，以生成定制的珠子阵列。然后将珠子阵列与样品在单个反应容器中温 育，以进行该分析。
[0321]对本发明的方法有用的各种颗粒/珠子基底和系统在上文中进一步描述。
[0322]流式细胞术
[0323] 在本发明的多个实施方案中，使用在上文中进一步详细描述的流式细胞术来评估 生物样品中的微囊泡群体。若需要，可以通过使用一种或多种一般囊泡标志物标记囊泡来 将微囊泡群体从样品中的其它颗粒(例如细胞碎片、蛋白质聚集体等）中分选出来。一般囊 泡标志物可以为表3中的标志物。常用的囊泡标志物包括四跨膜蛋白如CD9、CD63和/或 CD81。包含一种或多种四跨膜蛋白的囊泡在本文中有时被称为"Tet+"，以表示该囊泡是四 跨膜蛋白阳性的。分选出的微囊泡可以用本文所述的方法进一步评估。例如，可以用流式或 其它方法检测所分选的微囊泡上的表面抗原。在一些实施方案中，评估所分选的微囊泡内 的有效负载。作为一个说明性的实例，微囊泡群体与针对感兴趣的表面抗原的标记的结合 剂相接触，使用流式细胞术分选该接触的微囊泡，并且评估微囊泡内的有效负载。根据需 要，该有效负载可以是多肽、核酸(例如mRNA或微RNA)或其它生物实体。如本文所述使用这 样的评估来表征表型，例如诊断、预后或治疗诊断癌症。
[0324] 在一个实施方案中，使用流式分选来将微囊泡群体与其它生物复合物区分开。在 一个非限制性的实例中，使用流式方法来检测Ag 〇2+/Tet+和Ag〇2+/Tet-颗粒，从而分别将 Ago2+囊泡与无囊泡的Ago2+复合物分离。
[0325] 多重分析
[0326] 多重实验包括可在单一分析中同时测量多种分析物的实验。可以以多重方式评估 囊泡和相关生物标志物。可以使用不同的结合剂对不同的循环生物标志物，例如微RNA、蛋 白质或囊泡群体进行多重分析。不同的生物标志物，例如不同的囊泡群体，可以用不同的结 合剂来分离或检测。可以使用如上文所述的不同的信号标记如荧光团、量子点或放射性标 记来标记生物样品中的各个群体。该标记可以直接缀合至结合剂，或者间接地用于检测结 合囊泡的结合剂。在多重分析中检测的群体数目取决于标记的分辨能力和信号的总和，因 为与两种或更多种亲和元件结合的两种以上的差异标记的囊泡群体可以产生总和的信号。
[0327] 可以进行至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75 或100种不同循环生物标志物的多重分析。例如，一种对起源细胞具有特异性的囊泡群体可 以与对不同起源细胞具有特异性的第二囊泡群体一起分析，其中各个群体用不同的标记物 标记。或者，具有特定的生物标志物或生物印记的囊泡群体可以与具有不同生物标志物或 生物印记的第二囊泡群体一起分析。在某些情况下，可在单一分析中评估数百种或数千种 囊泡。
[0328] 在一个实施方案中，通过将包含多于一种囊泡群体的多种囊泡施加到多个基底如 珠子上来进行多重分析。各个珠子与一种或多种捕获剂偶联。将多个珠子分为子集，其中具 有相同捕获剂或捕获剂组合的珠子形成珠子的子集，从而使珠子的各个子集具有不同于另 一个珠子的子集的捕获剂或捕获剂组合。然后，珠子可以用于捕获包含与捕获剂相结合的 组分的囊泡。所述不同子集可以用于捕获不同的囊泡群体。然后，可以通过检测一种或多种 生物标志物来分析捕获的囊泡。
[0329] 流式细胞术可以与基于颗粒或基于珠子的分析组合使用。使用具有同源配体的珠 子涂层和符合高灵敏度自动化的具有特定活性的报告分子多参数免疫分析或其它高通量 检测分析均可以使用。例如，各个子集中的珠子与另一子集的珠子是差异标记的。在基于颗 粒的分析系统中，针对囊泡的结合剂或捕获剂如捕获抗体可以固定于可寻址的珠子或微球 上。针对每个单独结合分析(例如当结合剂为抗体时的免疫分析)的每种结合剂可以偶联至 不同类型的微球(即，微珠子)上，并且结合分析反应在微球的表面上发生。微球可以根据不 同的标记而区别开，例如与具有不同捕获剂的另一种微球相比，具有特定捕获剂的微球具 有不同的信号标记。例如，微球可以染色为具有离散的荧光强度，从而使得具有特定结合剂 的微球的荧光强度不同于具有不同结合剂的另一种微球的荧光强度。被不同捕获剂结合的 生物标志物可以使用不同标记来差异地检测。
[0330] 微球可以使用至少2种不同的标记或染料进行标记或染色。在一些实施方案中，使 用至少3、4、5、6、7、8、9或10种不同的标记对微球进行标记。多个微球中的不同微球可以具 有多于一种的标记或染料，其中各个微球子集具有不同比例和组合的标记或染料，从而可 以检测具有不同结合剂的不同微球。例如，各种比例和组合的标记和染料可以允许不同的 荧光强度。或者，各种比例和组合可以用于产生不同的检测模式以鉴定结合剂。微球可在外 部进行标记或染色，或者可以具有内在的荧光或信号标记。珠子可以单独地负载它们合适 的结合剂，并因此可以根据差异标记的微球(不同的结合剂与之偶联)上的不同结合剂来分 离不同的囊泡群体。
[0331] 在另一个实施方案中，可以使用平面基底进行多重分析，其中该基底包含多种捕 获剂。所述多种捕获剂可以捕获一个或多个囊泡群体，并检测所捕获的囊泡的一种或多种 生物标志物。根据下文进一步描述的，平面基底可以为微阵列或其它基底。
[0332]结合剂
[0333]可以使用针对囊泡的新组分的结合剂(例如感兴趣的囊泡特有的新抗原的抗体） 来分离或检测囊泡。可以使用与基底如阵列或多个颗粒结合的已知组成的不同测试化合物 来分离或鉴定感兴趣的囊泡特有的新抗原，这可以允许仅使用小部分空间而对大量的化 学/结构空间进行充分取样。所鉴定的新抗原还可以充当囊泡的生物标志物。例如，针对起 源细胞特异性囊泡鉴定的新抗原可以是有用的生物标志物。
[0334]与接触样品关联使用的术语"剂"或"试剂"可表示设计用于结合、杂交、缔合或以 其它方式检测或促进检测靶分子的任何实体，该靶分子包括靶多肽、肽、核酸分子、瘦素、月旨 质或如本文所述的或本领域已知的可被检测的任何其它生物实体。这些剂/试剂的实例是 本领域公知的，且包括但不限于通用的或特定的核酸引物、核酸探针、抗体、适体、类肽、肽 核酸、锁定核酸、凝集素、树状聚体、化学化合物或本文描述的或本领域已知的其它实体。
[0335] 可以通过针对测试化合物筛选均质的或异质的囊泡群体来鉴定结合剂。由于基底 表面上各测试化合物的组成是已知的，所以这构成了对亲和性元件的筛选。例如，测试化合 物阵列在基底可寻址位置上的特定位置处包含测试化合物，并可以用于鉴定针对囊泡的一 种或多种结合剂。测试化合物全部都可以是不相关的或者是基于核心序列或结构的较小变 化而相关的。不同的测试化合物可以包括给定测试化合物的变体(例如多肽的亚型）、结构 上或组成上不相关的测试化合物或它们的组合。
[0336] 测试化合物可以是类肽、多糖、有机化合物、无机化合物、聚合物、脂质、核酸、多 肽、抗体、蛋白质、多糖或其它化合物。测试化合物可以是天然的或合成的。测试化合物可以 包含基于任意多种键或键组合(例如酰胺、酯、醚、硫醇、自由基加成、金属配位等）的直链或 支链的杂聚化合物、枝状结构、环状结构、腔结构或者具有在于其上进行特定加成时起到支 架作用的多个临近的连接位点的其它结构，或者由它们组成。可以使用本领域中的标准方 法将测试化合物点样于基底上或进行原位合成。此外，测试化合物可以以组合方式进行点 样或原位合成，以检测有用的相互作用，例如协同结合。
[0337] 测试化合物可以是具有已知的氨基酸序列的多肽，因此，对测试化合物与囊泡的 结合进行检测可以实现对可以用作结合剂的已知氨基酸序列的多肽的鉴定。例如，可以将 均质的囊泡群体施加到载玻片上的点样阵列上，该阵列含有数种至1，〇〇〇,〇〇〇种具有可变 氨基酸长度的测试多肽。所述多肽可以通过C-末端附接至表面。所述多肽的序列可以由19 种氨基酸(不包括半胱氨酸）随机生成。结合反应可以包括非特异性的竞争剂，如使用另一 种染料标记的过量的细菌蛋白质，从而可以测定针对每种多肽结合靶标的特异性比率。可 以选择具有最高特异性和结合的多肽。各点上多肽的身份是已知的，且由此可以容易地鉴 定。一旦鉴定出对均质囊泡群体如起源细胞特异性囊泡具有特异性的新抗原，则随后可以 在下文所述的方法中使用这些抗原分离这类起源细胞特异性囊泡。
[0338] 还可以使用阵列来鉴定作为囊泡结合剂的抗体。测试抗体可以附接至阵列，并针 对异质囊泡群体进行筛选，以鉴定可以用于分离或鉴定囊泡的抗体。还可以使用抗体阵列 来筛选均质的囊泡群体，如起源细胞特异性囊泡。除了鉴定抗体以分离或检测均质的囊泡 群体之外，还可以鉴定对均质的群体具有特异性的一种或多种蛋白质生物标志物。可以使 用市售可得的平台，其具有附接至阵列的预选的测试抗体或定制选择的测试抗体。例如，可 以使用前列腺癌细胞衍生的囊泡来筛选来自Full Moon Biosystems的抗体阵列，其将针对 8(：1-父1^1^1、角蛋白15、0)81/^?厶-1、0)9、上皮特异性抗原化5厶)和肥大细胞糜蛋白酶的 抗体鉴定为结合剂，并且所鉴定的蛋白质可以用作囊泡的生物标志物。该生物标志物可以 在囊泡中或囊泡上存在或不存在、低表达或过表达、突变或修饰，并用于表征病况。
[0339] 还可以通过肽阵列鉴定待用作结合剂的抗体或合成抗体。另一种方法是采用通过 抗体噬菌体展示产生合成抗体。抗体(例如Fab)的M13噬菌体文库作为外壳蛋白的融合体展 示在噬菌体颗粒的表面上。各噬菌体颗粒展示独特的抗体，并且还包封了包含编码DNA的载 体。可以构建高度多样性的文库，并表示为噬菌体池，其可以用于选择结合固定的抗原的抗 体。固定的抗原保留了抗原结合噬菌体，而未结合的噬菌体通过洗涤除去。可以通过大肠杆 菌宿主的感染来扩增保留的噬菌体池，并可将扩增的池用于另外轮次的选择，从而最终得 到抗原结合克隆占优势的群体。在这一阶段，可以分离单个噬菌体克隆并进行DNA测序，从 而解码所展示的抗体的序列。通过使用噬菌体展示以及本领域中已知的其它方法，可以产 生针对囊泡的高亲和力设计抗体。
[0340] 基于珠子的分析还可以用于鉴定新型结合剂以分离或检测囊泡。测试抗体或肽可 以缀合至颗粒。例如，珠子可以缀合至抗体或肽，并用于检测和定量在囊泡群体的表面上表 达的蛋白质，从而发现并特异性地选择可以靶向来自特定组织或肿瘤类型的囊泡的新型抗 体。可以通过使用市售可得的试剂盒，根据制造商提供的说明书，使任何有机来源的分子顺 利地缀合至聚苯乙烯珠子。每个珠子集都可以以某种可检测的波长染色，并且每一个都可 以与已知的抗体或肽连接，该抗体或肽可以用于特异性地测量哪些珠子与外来体蛋白质连 接，从而与之前缀合的抗体或肽的表位相匹配。珠子可以染色为具有离散的荧光强度，使得 具有不同强度的每个珠子具有如上所述的不同结合剂。
[0341] 例如，根据凭经验确定的动态分析范围，可以将纯化的囊泡制剂在分析缓冲液中 稀释至合适的浓度。可以制备充足体积的偶联珠子，并将大约ΐμL的抗体偶联的珠子等分至 孔中，并调节至约50μ1的最终体积。一旦将抗体偶联的珠子加入到真空匹配板中，可洗涤该 珠子以确保合适的结合条件。然后，可以将适当体积的囊泡制剂加入到待测定的各孔中并 温育该混合物，例如15-18小时。可以使用检测抗体稀释溶液制备充足体积的检测抗体，并 与混合物一起温育1小时或更长。随后，可在加入由链霉亲和素藻红蛋白组成的检测抗体 (表达生物素)混合物之前洗涤珠子。然后，可以洗涤珠子，并真空抽吸数次，然后使用与仪 器一起提供的软件在悬液阵列系统上进行分析。之后，可以从该分析阐明可用于选择性地 提取囊泡的抗原的身份。
[0342] 使用了成像系统的分析可以用于检测并定量在囊泡的表面上表达的蛋白质，从而 发现并特异性地选择和富集来自特定组织、细胞或肿瘤类型的囊泡。可以使用缀合至多孔 多重碳涂覆板的抗体、肽或细胞。可以通过使用排列于图案化的碳工作表面上的捕获抗体 对孔中的多种分析物进行同时测量。然后，可以在具有增强电-化学发光板的电极孔中，使 用以试剂标记的抗体检测分析物。任何有机来源的分子可以顺利地缀合至碳涂覆板。可以 通过该分析鉴定出囊泡表面上表达的蛋白质，并可将其作为靶标用于特异性地选择和富集 来自特定组织或肿瘤类型的囊泡。
[0343] 结合剂也可以是特定靶标的适体。本文中与结合剂相关使用的术语"特异性的"可 意指结合剂对其靶标比对其它靶标具有更高的亲和力，通常具有高得多的亲和力，但不需 要该结合剂对其靶标绝对特异性。
[0344]微流体
[0345] 用于分离或鉴定囊泡的方法可与微流体装置组合使用。可以使用微流体装置实施 诸如本文所述的分离或检测囊泡的方法。微流体装置，亦可称为"芯片上实验室"系统、生物 医学微机电系统(bioMEM)或多组件集成系统，可用于分离和分析囊泡。这类系统将允许囊 泡结合、生物印记检测的过程和其它过程小型化和区室化。
[0346] 微流体装置也可用于通过大小差别或亲和选择来分离囊泡。例如，微流体装置可 采用一个或多个通道，该通道用于基于大小或通过使用一种或多种用于从生物样品中分离 囊泡的结合剂而从生物样品中分离囊泡。可将生物样品引入到一个或多个微流体通道中， 这些通道选择性地允许囊泡通过。该选择可基于囊泡的性质，如囊泡的大小、形状、可变形 性或生物印记。
[0347] 在一个实施方案中，可将异质的囊泡群体引入到微流体装置中，由此可获得一个 或多个不同的异质的囊泡群体。例如，不同的通道可具有不同的大小选择或结合剂，以供选 择不同的囊泡群体。因此，微流体装置可分离多种囊泡，其中该多种囊泡的至少一个子集包 含与该多种囊泡的另一个子集不同的生物印记。例如，微流体装置可分离至少2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个不同的囊泡子集，其中囊泡的每个子 集均包含不同的生物印记。
[0348] 在一些实施方案中，微流体装置可包含一个或多个通道，该通道允许囊泡的进一 步富集或选择。在通过第一通道后已被富集的囊泡群体可被引入第二通道中，这允许所需 的囊泡或囊泡群体通过，例如通过存在于第二通道中的一种或多种结合剂进一步富集。
[0349] 基于阵列的分析和基于珠子的分析可与微流体装置一起使用。例如，结合剂可偶 联至珠子，并且该珠子与囊泡之间的结合反应可在微流体装置中进行。还可以采用微流体 装置进行多重分析。不同的区室可包含针对不同囊泡群体的不同结合剂，其中每个群体是 不同的起源细胞特异性囊泡群体。在一个实施方案中，每个群体具有不同的生物印记。在微 球与囊泡之间的杂交反应可在微流体装置中进行，并且反应混合物可递送至检测装置。检 测装置，如双重或多重激光检测系统，可以是微流体系统的一部分，并且可使用激光根据其 颜色编码来鉴定每个珠子或微球，并且另一个激光可检测与每个珠子相关的杂交信号。
[0350] 各种微流体装置和方法在上文中描述。
[0351] 组合分离方法
[0352]技术人员将理解，可以根据需要组合样品处理以及分离和浓缩循环生物标志物如 囊泡的各种方法。例如，可以处理生物样品来防止聚集，去除不需要的颗粒和/或耗尽高丰 度蛋白质。可以选择所用的步骤来优化下游分析步骤。接着，可以例如通过色谱法、离心、密 度梯度、过滤、沉淀或亲和技术来分离生物标志物如囊泡。可以组合任意数目的后续步骤， 例如可对样品进行色谱法、离心、密度梯度、过滤和沉淀中的一种或多种，以分离或浓缩所 有或大部分微囊泡。在接下来的步骤中，可以使用亲和技术(例如使用针对一种或多种感兴 趣的靶标的结合剂)来分离或鉴定携带所需生物标志物谱的微囊泡。可以使用微流体系统 来进行这些步骤中的部分或全部。
[0353] 分离和分析微囊泡的一个示例性但非限制性的分离方案包括如下步骤:血浆或血 清收集_>高丰度蛋白质去除_>超滤_>纳米膜浓缩_>流式细胞术或基于颗粒的分析。
[0354] 使用本文公开或本领域已知的方法，循环生物标志物如囊泡可以分离或浓缩至少 约2倍、3倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、20倍、25倍、30倍、 35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120 倍、125 倍、130 倍、140 倍、150 倍、160 倍、170 倍、175 倍、180 倍、190 倍、200倍、225 倍、250 倍、 275 倍、300 倍、325 倍、350 倍、375 倍、400 倍、425 倍、450 倍、475 倍、500 倍、525 倍、550 倍、575 倍、600 倍、625 倍、650 倍、675 倍、700 倍、725 倍、750 倍、775 倍、800 倍、825倍、850 倍、875 倍、 900倍、925倍、950倍、975倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000 倍、4000倍、5000倍、6000 倍、7000倍、8000倍、9000倍或至少10，000倍。在一些实施方案中，囊泡被分离或浓缩至少1 个数量级、2个数量级、3个数量级、4个数量级、5个数量级、6个数量级、7个数量级、8个数量 级、9个数量级或10个数量级或更多个数量级。
[0355] 一旦被浓缩或分离，可以评估循环生物标志物，从而例如表征如本文所述的表型。 在一些实施方案中，浓缩或分离步骤本身揭示了感兴趣的表型。例如，亲和方法可以检测感 兴趣的特定生物标志物的存在或水平。
[0356] 本文所述的各种分离和检测系统可用于分离或检测循环生物标志物如囊泡，该生 物标志物提供关于与这些疾病或病症有关的诊断、预后、疾病分层、治疗诊断、响应者/非响 应者状态的预测、疾病监控、治疗监控等的信息。分离技术的组合在本发明的范围内。在一 个非限制性的实例中，可以使样品通过色谱柱，以基于诸如电泳移动率的大小等性质来分 离囊泡，然后可以使囊泡通过微流体装置。可以在这些步骤之前、期间或之后使用结合剂。
[0357] 本发明的方法和组合物可以与使用如本文所述的这些方法分离或检测的微囊泡 一起使用。在多个非限制性的实例中：由本发明的方法提供的适体可用作生物标志物如蛋 白质或微囊泡的捕获剂和/或检测剂;样品如体液可在使用一种或多种本文所述的技术(例 如色谱法、离心、流式细胞术、过滤、亲和分离、聚合物沉淀等)分离样品中的微囊泡之前与 本发明的寡核苷酸探针文库接触;在微囊泡与本发明的适体或寡核苷酸探针文库接触之 前，使用一种或多种本文所述的技术(例如色谱法、离心、流式细胞术、过滤、亲和分离、聚合 物沉淀等)分离样品中的微囊泡。在这样的过程中，可以在任何合适的步骤中全部或部分地 去除污染物，如高丰度蛋白质。本发明考虑到用于评估微囊泡和其它生物标志物的这类技 术的这些及各种其它有用的重复。 生物标志物
[0358] 如本文所述，本发明的方法和组合物可以在分析中使用从而检测一种或多种感兴 趣的生物标志物的存在或水平。该生物标志物可以为本文公开的或者本领域技术人员已知 的任何有用的生物标志物。在一个实施方案中，该生物标志物包含蛋白质或多肽。除非另有 说明，在本文中所用的"蛋白质"、"多肽"和"肽"可互换地使用。该生物标志物可以是核酸， 包括DNA、RNA以及本文公开的或本领域已知的其任意一种的各种亚种。该生物标志物可以 包含脂质。该生物标志物可以包含碳水化合物。该生物标志物还可以是复合物，例如包含蛋 白质、核酸、脂质和/或碳水化合物的复合物。在一些实施方案中，该生物标志物包含微囊 泡。在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中，在不知道被适体池的每个成员靶向 的准确微囊泡抗原的情况下，使用适体池来评估感兴趣的微囊泡群体的存在和/或水平。参 见例如图16B-C。在其它情况下，根据本发明的方法评估与微囊泡关联的生物标志物。参见 例如图2A-2F;图16A。
[0359] 包含超过一种生物标志物的生物印记可以包含一种类型的生物标志物或多种类 型的生物标志物。作为一个非限制性的实例，生物印记可以包含多种蛋白质、多种核酸、多 种脂质、多种碳水化合物、多种生物标志物复合物、多种微囊泡，或其任意组合。例如，生物 印记可以包含一种或多种微囊泡、一种或多种蛋白质以及一种或多种微RNA，其中，在适当 情况下，所述一种或多种蛋白质和/或一种或多种微RNA任选地与作为表面抗原和/或有效 负载的微囊泡相关联。
[0360]在一些实施方案中，用囊泡表面抗原来检测囊泡。通常被表达的囊泡表面抗原可 以被称为"看家蛋白质"或一般囊泡生物标志物。生物标志物可以是⑶63、CD9、CD81、⑶82、 ⑶37、⑶53、Rab-5b、膜联蛋白V或MFG-E8。四跨膜蛋白一一一类具有四个跨膜结构域的膜蛋 白--可以用作一般囊泡生物标志物。四跨膜蛋白包括⑶151、⑶53、⑶37、CD82、⑶81、CD9 和⑶63。在哺乳动物中已经鉴定出超过30种四跨膜蛋白 2)、TSPAN3(TSP-3)、TSPAN4(TSP-4、NAG-2)、TSPAN5(TSP-5)、TSPAN6(TSP-6)、TSPAN7 (CD231、TALLA-l、A15)、TSPAN8(C0-029)、TSPAN9(NET-5)、TSPAN10(0culospanin)、TSPANll (CD151样）、了5?厶附2(呢1'-2)、了5?厶价3(呢1'-6)、了5?厶价4、了5?厶价5(呢1'-7)、了5卩厶附6(丁]\14-B)、TSPAN17、TSPAN18、TSPAN19、TSPAN20(UPlb、UPKlB)、TSPAN21(UPla、UPKlA)、TSPAN22 (RDS、PRPH2)、TSPAN23(R0M1)、TSPAN24(CD151)、TSPAN25(CD53)、TSPAN26(CD37)、TSPAN27 (CD82)、TSPAN28(CD81)、TSPAN29(CD9)、TSPAN30(CD63)、TSPAN31(SAS)、TSPAN32(TSSC6)、 TSPAN33和TSPAN34。其它通常观察到的囊泡标志物包括表3中所列举的那些标志物。这些蛋 白质中的一种或多种可以是对于使用本发明的方法和组合物来表征表型而言有用的生物 标志物。 表3:在来自多种细胞类型的囊泡中观察到的蛋白质
[0361]本文所述的这些类型的生物标志物中的任意生物标志物可以通过本发明的方法 和组合物来使用和/或评估。示例性的生物标志物包括但不限于表4中的那些。所述标志物 可以作为蛋白质或mRNA检测，该蛋白质或mRNA可以自由循环，或者与其它生物分子复合地 循环。在适当的情况下，表4中的标记物也可以用于如本文所述捕获和/或检测囊泡以供表 征表型。在一些情况下，使用多种捕获和/或检测剂来增强鉴定。例如参见图2D-E。这些标志 物可以作为囊泡表面抗原和/或囊泡有效负载来检测。"说明性类别"表示对该适应症来说， 该标志物是其已知的标志物。技术人员将理解，所述标志物在某些情况下还可以以替代的 设置来使用。例如，可用于表征一种类型疾病的标志物也可以在合适的情况下用于表征另 一种疾病。考虑这样一个非限制性的实例：肿瘤标志物可以用作来源于不同谱系的肿瘤的 生物标志物。表4中的生物标志物参照物是本领域通常使用的参照物。基因的别名和描述可 以使用多种线上数据库找到，所述线上数据库包括GeneCards® (WWW. genecards. org)、 HUGO基因命名法（www· genenames ·org)、Entrez Gene(www.ncbi .nlm.nih.gov/entrez/ query·fcgi?db=gene)、UniProtKB/Swiss_Prot(www.uniprot·org)、UniProtKB/TrEMBL (www·uniprot·org)、0MIM(www·ncbi·nlm·nih·gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM)、 GeneLoc(genecards · weizmann · ac · i 1/geneloc/)和Ensembl (www· ensembl · org) 〇 -般而 言，下文中的基因符号和名称对应于被HUGO核准的基因符号和名称，蛋白质名称是被 UniProtKB/Swiss-Prot推荐的名称。还提供了常见的替代形式。在一些情况下，生物标志物 以Ensembl参考编号来提及，Ensembl参考编号的形式是"ENSG"后面接着数字，例如 ENSG00000005893,其对应于LAMP2。在表4中，仅仅出于简明的目的，"E."有时用来表示 "ENSG00000"。例如，"E.005893"表示"ENSG00000005893"。当蛋白质名称表示前体时，也隐 含成熟的蛋白质。在本申请的全文中，基因和蛋白质符号可以互换使用，若有必要，其含义 可以从上下文中得出。 表4:示例性的生物标志物
[0362] 可以合并到本发明的方法和组合物中的其它生物标志物的实例包括但不限于 2012年6月14日提交的国际专利申请号PCT/US2012/042519(W0 2012/174282)以及2012年8 月8日提交的国际专利申请号PCT/US2012/050030(W0 2013/022995)中公开的那些。
[0363] 在本发明的多个实施方案中，用于检测或评估本文公开的任意病况或疾病的生物 标志物或生物印记可包含标志物的几种不同类别之一中的一种或多种生物标志物，其中所 述类别包括但不限于以下一种或多种：1)疾病特异性生物标志物;2)细胞或组织特异性生 物标志物;3)囊泡特异性标志物(例如一般囊泡生物标志物）；4)血管生成特异性生物标志 物；以及5)免疫调节生物标志物。所有这些标志物的实例在本文中公开，并且对于本领域普 通技术人员来说是已知的。此外，被表征为在特定疾病或病况中起作用的本领域已知的生 物标志物可适合在本发明的组合物和方法中用作靶标。在进一步的实施方案中，与囊泡关 联的这类生物标志物可以全部为囊泡表面标志物或者囊泡表面标志物和囊泡有效负载标 志物（即，被囊泡包围的分子）的组合。所评估的生物标志物可以来自于来源的组合。例如， 可以通过评估蛋白质、核酸、囊泡、循环生物标志物、来自组织样品的生物标志物等的组合 来检测或表征疾病或病症。此外，如本文所指出的，所评估的生物样品可以是任何生物流 体，或者可以包含在这类生物流体中存在的单个组分（例如囊泡、核酸、蛋白质或其复合 物)。
[0364] EpCAM是在许多肿瘤细胞上表达的一种泛上皮分化抗原。它与钙粘着蛋白-连环蛋 白途径非常复杂地相关，因而与负责细胞内信号传导和极性的基础WNT途径非常复杂地相 关。它已经在胃肠癌、泌尿道癌以及其它癌症的治疗中用作免疫治疗靶标。（Chaudry MA， Sales K，Ruf P，Lindhofer H，Winslet MC(2007年4月）.Br.J.Cancer96(7):1013-9·)。它 在未分化的多能干细胞中表达。EpCAM是包括至少两种I型膜蛋白的家族的成员，并且作为 同型钙不依赖性细胞附着分子起作用。该基因中的突变导致先天性簇绒肠病。EpCAM已在来 源于不同谱系的癌细胞的微囊泡表面上观察到。EpCAM在本文的多个实例中用作示例性的 表面抗原。技术人员将理解，使用EpCAM的多个实施方案和实例也可以用于其它微囊泡表面 抗原。 治疗剂
[0365] 本文所用的"治疗有效量"是指在哺乳动物中缓解(到一定程度，如由熟练的执业 医师所判断的)疾病或病况的一种或多种病状的组合物的量。此外，组合物的"治疗有效量" 是指使得与疾病或病况相关或导致疾病或病况的生理或生化参数部分或完全恢复正常的 量。本领域熟练的临床医师可以确定组合物的治疗有效量，从而在例如静脉内、皮下、腹膜 内、口服或通过吸入施用该组合物时治疗或预防特定疾病状况或病症。治疗有效所需的组 合物的准确量将取决于许多因素，除了许多患者特有的考虑因素之外还有例如活性剂的比 活性、所用的递送装置、药剂的物理特性、给药目的。但是，一旦理解了本发明阐述的公开内 容，治疗有效量的确定在本领域普通熟练临床医师的技能范围内。
[0366] 本文所用的术语"治疗"、"处理"、"疗法"和"治疗方法"是指治愈性治疗、预防性治 疗或防止性治疗。"预防性治疗"的一个例子是预防或减轻靶向疾病(例如癌症或其它增生 性疾病)或其相关状况的几率。需要治疗的患者包括已经患有疾病或病况的患者以及易于 患有要预防的疾病或病况的患者。本文所用的术语"治疗"、"处理"、"疗法"和"治疗方法"还 描述了出于对抗疾病或有关状况的目的对于哺乳动物的管理和照护，并且包括施用组合物 以缓解疾病、病况的病状、副作用或其它并发症。对于癌症的治疗方法包括但不限于手术、 化学疗法、放射疗法、基因疗法和免疫疗法。
[0367] 本文所用的术语"药剂"或"药物"或"治疗剂"是指化学化合物、化学化合物的混合 物、生物大分子或从被怀疑具有治疗性质的生物材料如细菌、植物、真菌或动物(尤其是哺 乳动物)细胞或组织制得的提取物。所述药剂或药物可以被纯化、基本上纯化或部分纯化。 根据本发明的"药剂"还包括放射疗法药剂或"化疗剂"。
[0368] 本文所用的术语"诊断剂"是指在病变组织例如肿瘤的成像中使用的任何化学品。
[0369] 本文所用的术语"化疗剂"是指具有抗癌、瘤和/或增生性疾病的活性，或者具有直 接杀死癌细胞的能力的药剂。
[0370]本文所用的"药物制剂"包括用于人类和兽医用途并且没有显著不利的毒理效应 的制剂。本文所用的"药学上可接受的制剂"是指使得本发明的核酸分子能够有效分布在对 于其所需活性最合适的物理位置上的组合物或制剂。
[0371] 本文所用的术语"药学上可接受的载体"意在包括任何和所有的与药物施用兼容 的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。对于药学上有效的物质 使用这类介质和制剂在本领域中是熟知的。除了常规介质或药剂与活性化合物不相容外， 应考虑它们在组合物中使用。
[0372] 作为癌症治疗剂的适体-毒素缀合物
[0373] 大量以前的工作已经研发出抗体-毒素缀合物（"免疫缀合物"）的概念作为一系列 适应症的潜在疗法，其大多数针对癌症的治疗，主要集中在血液肿瘤。对于靶向递送的多种 不同有效负载已在临床前和临床研究中测试，包括蛋白质毒素、高效价小分子细胞毒素、放 射性同位素和脂质体封装的药物。尽管这些努力已经成功产生了三种经roA批准的用于血 液肿瘤的疗法，但免疫缀合物作为一个类别(尤其是对于实体瘤)已经在历史上产生了令人 失望的结果，这已经被归因于抗体的多种不同性质，包括对于非人源抗体发生中和抗体应 答的趋势，在实体瘤中有限的渗透，由毒素缀合导致的靶标结合亲和力的丧失，以及限制了 总治疗指数的抗体半衰期和毒素缀合物半衰期之间的不平衡（由Ref f和Heard，Critical Reviews in 0ncology/Hematology，40(2001) :25-35)综述）。
[0374] 适体在功能上与抗体类似，除了其吸收、分布、代谢和分泌（"ADME"）性质在本质上 不同，并且它们通常缺乏许多一般与抗体相关联的免疫效应物功能(例如，抗体依赖性细胞 的细胞毒性、补体依赖性细胞毒性）。在比较前述适体和抗体的许多性质时，几个因素提示 经由适体的毒素递送相比于用抗体递送提供了几个具体的优势，最终为其提供了更好的作 为治疗剂的潜力。经由适体的毒素递送相对于抗体的优势的几个实例如下：
[0375] 1)适体-毒素缀合物完全是化学合成的。化学合成对缀合物的性质提供了更多控 制。例如，可以精准限定连接的化学计量(毒素与适体之比）以及位点。可以容易地测试不同 的连接体化学法。适体折叠的可逆性意味着缀合过程中活性的丧失是不太可能的，并且在 调节缀合条件中提供了更多灵活性以使产率最大化。
[0376] 2)较小的尺寸允许更好的肿瘤渗透。抗体进入实体瘤的较差渗透通常被引用为限 制缀合方法的效率的一个因素。参见Colcher，D.，Goel，A.，Pavlinkova，G.，Beresford，G.， Booth,B. ,Batra,S.K.(1999)uEffects of genetic engineering on the pharmacokinetics of antibodies/'Q.J.Nucl .Med.，43:132-139。比较未PEG化的抗腫生 蛋白C适体与相应抗体的性质的研究证实了有效摄取到肿瘤中（通过肿瘤:血液比率定义） 以及位于肿瘤的适体出乎意料地长期存在（ti/2> 12小时）的证据(Hicke，B.J.，Stephens， A . ff. ,7/ Escort aptamers ： a delivery service for diagnosis and therapy"， J. Cl in. Invest.,106：923-928(2000))〇
[0377] 3)可调的PK。可以容易地调整适体半衰期/代谢来匹配有效负载的性质，从而优化 将毒素递送至肿瘤的能力，同时使得全身暴露最小化。对适体骨架的适当修饰以及高分子 量PEG的加入应该使得有可能将适体的半衰期匹配于缀合的毒素/连接体的固有半衰期，从 而使得对携带毒素的非功能性代谢物的全身暴露最小化(预测如果t 1/2(适体）<>t1/2(毒素））。
[0378] 4)相对较低的材料要求。给药水平有可能将受到细胞毒性有效负载的内在毒性的 限制。这样，单疗程将有可能需要相对小量的适体（
[0379] 5)肠胃外施用对于该适应症是优选的。对于开发替代制剂来推动患者/医师接受 将没有特殊需求。
[0380]本发明提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本发明提供的适体或其盐， 以及药学上可接受的载体或稀释剂。本发明还提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量 的适体或其盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。相关地，本发明提供了一种治疗或改善 疾病或病症的方法，其包括对有需要的患者施用所述药物组合物。对患者施用治疗有效量 的组合物可导致：（a)活性剂向病变部位的递送相对于活性剂单独递送的提高;或者(b)微 囊泡清除的提高，这导致被适体靶向的微囊泡的血液水平降低至少10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%或90%;或者（〇)被适体靶向的微囊泡的生物活性降低至少10%、 20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %。在一个实施方案中，微囊泡的生物活性包 含免疫抑制或遗传信息的转移。所述疾病或病症可包括但不限于本文所公开的那些。例如， 所述疾病或病症可包括赘生性、增生性或炎性的、代谢性、心血管的或神经性的疾病或病 症。参见例如"表型"部分。 适体鉴定方法
[0381] 核酸序列折叠成对于其核苷酸序列特定的二级和三级基序。这些基序将核酸序列 上的正电荷和负电荷定位在使序列能够结合至靶分子(例如蛋白质和其它氨基酸序列）上 的特定位置的位置上。这些结合序列在本领域中作为适体是已知的。由于在即使相对较短 的一段核苷酸（例如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸）中也有数万亿可能的独特核苷酸序列，可 以产生大量不同的基序，这导致适用于几乎任何所需蛋白质或其它靶标的适体。
[0382] 适体通过以下步骤产生：随机产生具有特定长度，通常为20-80个碱基对长，例如 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、 70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个碱基对的寡核苷酸。然后将这些随机寡核苷酸与 感兴趣的蛋白质靶标一起温育。几个洗涤步骤之后，收集并扩增与靶标结合的寡核苷酸。然 后将扩增的适体加入到靶标，重复这一过程，通常15-20次。本领域技术人员已知的该过程 的一个常用形式为SELEX法。
[0383]最终结果包含对靶标具有高亲和力的一种或多种适体。本发明提供了可用于提供 所需特征的对这类得到的适体的进一步处理：1)竞争性结合分析，用以鉴定针对所需表位 的适体;2)基序分析，用以在电脑中鉴定高亲和力结合的适体；以及3)基于微囊泡的适体筛 选分析，用以鉴定可用于检测特定疾病的适体。这些方法在下文更详细描述，并在实施例中 进一步描述。
[0384]本发明进一步涉及与通过本发明的方法发现的序列高度同源的适体序列。"高度 同源性"一般是指在多核苷酸序列和参照序列之间40%或更高的同源性，优选60%或更高 的同源性，更优选80 %或更高的同源性，甚至更优选85 %、90 %、91 %、92 %、93 %、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性。在一个实施方案中，参照序列包含本文提供 的一种或多种适体的序列。同源性百分比（也称为同一性百分比）通常在两个最佳比对的序 列之间进行。用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。序列的最佳比对和比较可以 例如使用在"Wilbur和Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80:726-30(1983)" 中所述的算法 进行。同源性计算也可以使用BLAST进行，BLAST可在位于www. ncbi . nlm. nih. gov/BLAST/的 NCBI服务器上找到（Altschul S F等人，Nucleic Acids Res. 1997;25(17):3389-402; Altschul S F等人，J Mol.Biol.l990;215(3):403-10)。在分离的多核苷酸在长度上长于 或等于参照序列（例如通过本文所述的方法鉴定的序列）的情况下，用参照序列的全长进行 比较。在分离的多核苷酸短于参照序列（例如短于通过本文所述的方法鉴定的序列）时，对 相同长度(不包括同源性计算所需的任何环）的参照序列的区段进行比较。
[0385] 本发明进一步涉及作为通过本发明的方法发现的序列的功能片段的适体序列。在 适体序列的背景下，该适体序列的"功能片段"可以包含与全长序列结合相同的靶标的子序 列。在一些情况下，候选适体序列来自于含有5'前导序列和/或3'尾序列的文库的成员。这 样的先导序列或尾序列可以用来促进引物结合以用于扩增或捕获等。在这些实施方案中， 全长序列的功能片段可包含没有先导和/或尾序列的候选适体序列的子序列。 竞争性抗体添加
[0386] 已知的适体产生方法可能包括从靶序列洗脱所有结合的适体。在一些情况下，这 不足以鉴定所需的适体序列。例如，当试图在分析中替换抗体时，可能需要仅仅收集与被替 代的抗体的特定表位结合的适体。本发明提供了一种方法，其包括向适体/靶标反应中添加 将被替代的抗体，从而能够选择性收集与抗体表位结合的适体。在一个实施方案中，该方法 包括将包含随机产生的寡核苷酸的反应混合物与感兴趣的靶标一起温育，从反应混合物中 去除不结合该靶标的未结合的适体，向反应混合物中加入与感兴趣的表位结合的抗体，以 及收集被该抗体替代的适体。该靶标可以是蛋白质。参见例如图1，其示出了用于鉴定针对 EpCam的特定表位的适体的方法。 基序分析
[0387] 在大多数适体实验中，鉴定出与靶标结合的多个适体序列。这些适体将具有不同 的结合亲和力。产生足以评估其中每一个的亲和力的大量这样的适体可能费时费力。为了 鉴定大量具有最高亲和力的适体而无需物理地筛选大子集，本发明提供了一种方法，其包 括分析针对感兴趣的靶标的一种或多种高亲和力适体的二维结构。在一个实施方案中，该 方法包括针对具有类似二维结构或基序、但不一定具有类似一级序列的适体来筛查数据 库。在一个实施方案中，该方法包括用传统方法如本文公开的或本领域已知的方法(例如表 面等离子体共振结合分析，见图5)来鉴定高亲和力适体，粗略估计该高亲和力适体的二维 结构，以及从预测具有与该高亲和力适体类似的二维结构的序列池中鉴定适体。由此，该方 法提供了也与感兴趣的靶标结合的候选物池。可以使用本领域已知的方法，例如通过用市 售可得的软件程序进行的自由能（AG)计算，来预测寡核苷酸的二维结构，所述市售可得的 软件程序例如是Vienna或mFo Id，例如Mathews，D ·，Sabina，J.，Zucker，M. &Turner， H.Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters provides robust prediction of RNA secondary structure.J.Mol.Biol.288,911-940(1999);Hofacker等 人，Monatshefte f.Chemie 125:167-188(1994);以及 Hofacker，I.L.Vienna RNA secondary structure server.Nucleic Acids Res.31，3429_3431(2003)所述，其通过引 用以其全文并入本文。参见图3。可以使用高通量测序平台例如来自Life Technologies的 Ion Torrent平台从随机产生的适体候选物池中对序列池进行测序。对于来自预测具有与 高亲和力适体类似的二维结构的序列池的适体的鉴定可以包括将所得序列加载到所选择 的计算机程序中，以鉴定具有与高亲和力适体类似的二维结构的序列池的成员。然后可以 通过例如表面等离子体共振结合分析等，在原位确定序列池的亲和力。 适体消减方法
[0388]为了开发检测疾病例如癌症的分析，通常对来自正常和疾病患者的已知生物标志 物的大群体进行筛选，以便鉴定与疾病相关的标志物。该过程仅在已经描述了辨别性标志 物的情况下才有效。为了解决该问题，本发明提供一种方法，其包括通过在开始时将适体与 非靶标微囊泡或细胞一起温育而将非辨别性适体从大适体池中消减。非靶标细胞可以是正 常细胞或从其中脱落的微囊泡。然后将不结合正常微囊泡或细胞的适体与病变的微囊泡或 细胞一起温育。于是结合病变的微囊泡或细胞但不结合正常细胞的适体是用于检测该疾病 的分析的可能的候选物。该过程与是否知道在病变样品中存在特定标志物无关。
[0389] 消减法可用于鉴定优先识别所需靶标群体的适体。在一个实施方案中，消减法用 于鉴定与对照(例如，正常或无病的）群体相比优先识别来自患病靶标群体的靶标的适体。 病变的靶标群体可以是来自一个或多个患病个体的囊泡群体，而对照群体包含来自一个或 多个无病个体的囊泡。该疾病可以是癌症或其它本文公开或本领域已知的疾病。因此，该方 法提供相比于对照靶标优先鉴定疾病靶标的适体。
[0390] 循环微囊泡可分离自对照样品，例如来自不存在感兴趣的疾病(如不存在癌症）的 "正常"个体的血浆。样品中的囊泡采用本文公开或如本领域已知的方法分离。例如，囊泡可 通过以下一种方法从血衆中分离：过滤、超滤、纳米膜超滤、ExoQuick试剂（System Biosciences，Inc ·，Mountain View，CA)、离心、超速离心、使用分子拥挤试剂（例如，来自 Life Technologies的TEXIS)、聚合物沉淀(例如，聚乙二醇(PEG))、亲和分离、亲和选择、免 疫沉淀、色谱法、大小排阻或任意这些方法的组合。虽然超速离心法可能更倾向于产生外来 体大小的囊泡，但在每种情况下分离的微囊泡将是囊泡类型的混合物并且将是各种大小 的。将随机生成的寡核苷酸文库(例如，如本文实施例所述产生的）与分离的正常囊泡一起 温育。例如，通过将囊泡离心并收集含有非结合适体的上清液来分离不结合这些囊泡的适 体。然后使这些非结合适体与从疾病患者中分离(例如，使用如上所述的相同方法）的囊泡 接触，以使得适体能够识别该疾病囊泡。下一步，收集与病变囊泡结合的适体。在一个实施 方案中，将囊泡分离然后使用离液剂(例如，SDS或相似的去污剂)裂解，然后通过使裂解混 合物通过亲和柱来捕获适体。在生物素缀合的适体池的情况下，亲和柱可含有链霉亲和素 珠子。分离的适体是扩增的适体。然后可重复该过程例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19 或 20 次或更多次。
[0391] 在本发明的一个方面，鉴定了适体谱，其可用于表征感兴趣的生物样品。在一个实 施方案中，使例如至少ΚΚΙΟ^ΙΟ^ΙΟ'ΙΟ^ΙΟ^ΙΟ'ΙΟ^ΙΟ^ΙΟ 10、^11、！。12、^13、！。14、^ 15、 1016、1017、1018、10 19个或至少102()个寡核苷酸的随机生成的寡核苷酸的池与来自对照群体 的感兴趣的生物组分或靶标接触。分离不结合来自对照群体的感兴趣的生物组分或靶标的 寡核苷酸，然后与来自测试群体的感兴趣的生物组分或靶标接触。保留结合来自测试群体 的感兴趣的生物组分或靶标的寡核苷酸。可利用保留的寡核苷酸重复该过程，这是通过使 保留的寡核苷酸与来自对照群体的感兴趣的生物组分或靶标接触，分离不结合来自对照群 体的感兴趣的生物组分或靶标的保留寡核苷酸，并再次使这些分离的寡核苷酸与来自测试 群体的感兴趣的生物组分或靶标接触，并分离结合的寡核苷酸。"组分"或"靶标"可以是寡 核苷酸能够结合的、存在于样品中的任何物质(例如，多肽、肽、核酸分子、碳水化合物、脂质 等）。然后可重复该过程例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次 或更多次。所得的寡核苷酸包含能够差异地检测测试群体与对照的适体。这些适体提供适 体谱，该适体谱包含采用一种或多种适体确定的生物印记，例如，包含采用一种或多种适体 检测的组分或靶标的存在或水平的生物印记。
[0392] 示例性的过程在图4中示出，其展示了使用来自正常（非癌症)个体的囊泡作为对 照，鉴定优先识别癌症囊泡的适体的方法。在该图中例举了外来体，但技术人员将理解，其 它微囊泡可以相同的方式使用。所得的适体可提供能够差异地检测癌症囊泡与正常囊泡的 谱。技术人员将理解，可采用相同的步骤来得到用于表征任何感兴趣的疾病或病况的适体 谱。
[0393] 在一个实施方案中，本发明提供一种通过上述方法鉴定的、编码多肽或其片段的 分离的多核苷酸。本发明还提供一种分离的多核苷酸，其具有与通过上述方法鉴定的核苷 酸序列至少60%相同的核苷酸序列。更优选地分离的核酸分子与通过上述方法鉴定的核苷 酸序列至少 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或更高地相同。在分离的多核苷酸在长度上长于或等于参照序列（例如通过上述 方法鉴定的序列）的情况下，用参照序列的全长进行比较。在分离的多核苷酸短于参照序列 (例如短于通过上述方法鉴定的序列）时，对相同长度(不包括同源性计算所需的任何环）的 参照序列的区段进行比较。
[0394] 在相关的方面，本发明提供一种采用适体谱表征生物表型的方法。该适体谱可以 采用上述方法确定。可确定测试样品的适体谱，并将其与对照适体谱比较。该表型可以是疾 病或病症，如癌症。表征表型可包括但不限于提供诊断、预后或治疗诊断。因此，适体谱可以 为从中获得测试样品的受试者提供诊断、预后和/或治疗诊断读出。
[0395] 在另一实施方案中，通过使适体分子池与测试样品接触，使相同的适体池与对照 样品接触，并鉴定差异地结合测试样品中而不是对照样品(反之亦然）中的组分或靶标的一 种或多种适体分子，从而确定测试样品的适体谱。如在生物测试样品或对照样品的上下文 中使用的"组分"或"靶标"可以是适体能够结合的、存在于样品中的任何物质（例如，多肽、 肽、核酸分子、碳水化合物、脂质等）。例如，如果样品是血浆或血清样品，则适体分子可结合 多肽生物标志物，该多肽生物标志物在疾病状态下单独表达或与未患病的受试者相比差异 地表达(过表达或低表达）。测试样品中的适体谱与对照样品中的适体谱的比较可基于适体 结合的定性和定量量度(例如，结合相对于不结合，或在测试样品中的结合水平相对于在参 考对照样品中的不同的结合水平）。
[0396] 在一方面，本发明提供一种鉴定靶标特异性适体谱的方法，其包括使生物测试样 品与适体分子池接触，使该池与对照生物样品接触，鉴定结合所述测试样品中的组分但不 结合对照样品的一种或多种适体，由此鉴定所述生物测试样品的适体谱。在一个实施方案 中，针对疾病样品选择适体池，并将其与参照样品比较，可采用常规测序技术对结合疾病样 品中的组分而不结合参照样品中的组分的子集中的适体进行测序，以鉴定结合的子集，由 此鉴定针对特定疾病样品的适体谱。以这种方式，适体谱提供了用于检测其它被筛选的样 品中的疾病的个性化平台。此外，通过选择合适的参照或对照样品，适体谱可以为从中获得 测试样品的受试者提供诊断、预后和/或治疗诊断读出。
[0397] 在相关的方面，本发明提供一种选择适体池的方法，其包括：（a)使生物对照样品 与寡核苷酸池接触；（b)分离不结合该生物对照样品的寡核苷酸的池的第一子集；（c)使该 生物测试样品与该寡核苷酸池的第一子集接触；以及(d)分离结合该生物测试样品的寡核 苷酸的池的第二子集，由此选择适体池。寡核苷酸池可包含任意数目的所需的序列，例如， 至少 10、ΙΟ2、ΙΟ3、ΙΟ4、ΙΟ5、ΙΟ 6、ΙΟ7、ΙΟ8、ΙΟ9、ΙΟ1。、ΙΟ 11、ΙΟ12、ΙΟ13、ΙΟ14、ΙΟ15、ΙΟ 16、ΙΟ17、ΙΟ18、 ΙΟ19个或至少102()个寡核苷酸可存在于起始池中。可重复步骤(a)-(d)以进一步精炼该适体 池。在一个实施方案中，这些步骤重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19次或至少20次。
[0398] 如本文所述，生物测试样品和生物对照样品可包含微囊泡。在一个实施方案中，生 物测试样品以及任选的生物对照样品包含体液。该体液可包括但不限于外周血、血清、血 浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF )、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗 液、精液、前列腺液、考珀液、射精前液、女性射出液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜 液、腹膜液、恶性肿瘤液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴 道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽出物或其它灌洗液。生物测 试样品以及任选的生物对照还可包含肿瘤样品，例如，来自肿瘤或肿瘤组织的细胞。在其它 实施方案中，生物测试样品以及任选的生物对照样品包含细胞培养基。在实施方案中，生物 测试样品包含病变的样品而生物对照样品包含无病的样品。因此，适体池可用于提供疾病 的诊断、预后和/或治疗诊断读出。
[0399] 如所提到的，本发明可用于评估微囊泡。微囊泡是有力的生物标志物，因为囊泡提 供一种包含多条信息的生物实体。例如，如所述的，囊泡可具有多种表面抗原，其每一种均 提供互补的信息。考虑癌症标志物和组织特异性标志物。如果两种标志物都单独存在于样 品中，例如，都是循环蛋白质或核酸，那么可能无法确定癌症标志物和组织特异性标志物是 否来自于相同的解剖学位置。然而，如果癌症标志物和组织特异性标志物都是单个微囊泡 上的表面抗原，则囊泡本身连接两种标志物并提供疾病的指示(通过癌症标志物)和疾病的 起源(通过组织特异性标志物）。此外，囊泡可具有任意数目的表面抗原以及可被评估的有 效负载。因此，本发明提供一种用于鉴定结合剂的方法，其包括使多种细胞外微囊泡与随机 生成的结合剂文库接触，鉴定对该细胞外微囊泡的一种或多种组分具有亲和性的结合剂文 库的子集。该结合剂可包括适体、抗体和/或任何其它有用类型的本文公开的或本领域已知 的结合剂。
[0400] 在相关的方面，本发明提供一种用于鉴定多种靶配体的方法，其包括：（a)使参照 微囊泡群体与能够结合一种或多种微囊泡表面标志物的多种配体接触，（b)分离多种参照 配体，其中该多种参照配体包含对参照微囊泡群体不具有亲和性的多种配体的子集；（c)使 一种或多种测试微囊泡与该多种参照配体接触；以及(d)从该多种参照配体中鉴定与该一 种或多种测试微囊泡上的表面标志物形成复合物的配体子集，由此鉴定该多种靶配体。术 语"配体"可以指与另一化学实体结合以形成较大复合物的分子或分子基团。因此，结合剂 包括配体。所述多种配体可包括适体、抗体和/或本文描述或本领域已知的其它有用的结合 剂。
[0401] 本发明还提供包含一种或多种用于实施上述方法的试剂的试剂盒。在一个实施方 案中，该一种或多种试剂包含潜在结合剂的文库，该结合剂文库包括适体、抗体和本文描述 或本领域已知的其它有用的结合剂中的一种或多种。
[0402]阴性和阳性适体选择
[0403]适体可用于各种生物分析，包括依赖于结合剂的多种类型的分析。例如，在基于免 疫的分析中可使用适体代替抗体或与抗体一起使用。本发明提供一种适体筛选方法，其鉴 定在整个分析步骤中不结合任何表面(基底、管、过滤器、珠子、其它抗原等)但特异性结合 感兴趣的抗原的适体。该分析依赖阴性选择来去除结合最终分析的非靶抗原组分的适体。 阴性选择之后是用于鉴定结合所需抗原的适体的阳性选择。
[0404] 在一方面，本发明提供一种鉴定对感兴趣的靶标具有特异性的适体的方法，其包 括(a)使候选适体池与一种或多种分析组分接触，其中该分析组分不包含感兴趣的靶标； (b)回收不结合(a)中的一种或多种分析组分的候选适体池的成员；（c)在一种或多种混杂 靶标的存在下，使在(b)中回收的候选适体池的成员与感兴趣的靶标接触；以及(d)回收在 步骤(c)中结合感兴趣的革E1标的候选适体，由此鉴定对该感兴趣的革E1标具有特异性的适体。 在该方法中，步骤(a)和(b)提供阴性选择以去除结合非靶实体的适体。相反，步骤(c)和(d) 通过鉴定结合感兴趣的靶标但不结合其它混杂靶标(例如，可存在于包含感兴趣的靶标的 生物样品中的其它抗原）的适体来提供阳性选择。候选适体的池可包含至少1〇、1〇 2、1〇3、 104、105、106、10 7、108、109、101()、1011、10 12、1013、1014、1015、1016、10 17、1018、1019种或至少1020 种核酸序列。一种用于实施该方法的说明性途径在实施例7中提供。
[0405] 在一些实施方案中，步骤(a)-(b)是任选的。在其它实施方案中，在进行步骤(C)中 的阳性选择之前，将步骤(a)-(b)重复至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19次或至少20次。阳性选择也可进行多轮。在鉴定对感兴趣的靶标具有特异性的适 体之前，可重复步骤(c)-(d)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19次 或至少20次。多个轮次可提供改善的选择严格性。
[0406] 在一些实施方案中，在阴性选择期间与适体池接触的一种或多种分析组分包括基 底、珠子、平面阵列、柱、管、孔或过滤器中的一种或多种。技术人员将理解，该分析组分可包 括可能是生物测定的一部分的任何物质。
[0407] 感兴趣的靶标可以是任何合适的实体，其在被适体识别时可得到检测。在一个实 施方案中，感兴趣的靶标包括蛋白质或多肽。除非另有说明，如本文所用的，"蛋白质"、"多 肽"和"肽"可互换使用。感兴趣的靶标可以是核酸，包括DNA、RNA和如本文公开或本领域已 知的其任意一种的各种亚种。感兴趣的靶标可包括脂质。感兴趣的靶标可包括碳水化合物。 感兴趣的靶标可以是复合物，例如，包含蛋白质、核酸、脂质和/或碳水化合物的复合物。在 一个实施方案中，感兴趣的靶标包括微囊泡。在这类情况下，适体可以是针对微囊泡表面抗 原例如蛋白质的结合剂。一般微囊泡表面抗原包括四跨膜蛋白⑶9、⑶63、CD81、⑶63、⑶9、 0)81、0082、0)37、0053、1^^513、膜联蛋白¥和1^648。其它的一般微囊泡表面抗原在本文的 表3中提供。
[0408] 微囊泡表面抗原也可以是疾病或病症的生物标志物。在这类情况下，适体可用于 提供疾病或病症的诊断、预后或治疗诊断。例如，一种或多种蛋白质可包括PSMA、PCSA、 B7H3、EpCam、ADAM-10、BCNP、EGFR、IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、SERPINB3、SPDEF、SSX2和 SSX4 中的一种或多种。这些标志物可用于检测前列腺癌。其它的微囊泡表面抗原在本文的表3-4 中提供。
[0409] -种或多种混杂靶标可以是除了感兴趣的靶标之外的抗原。例如，混杂靶标可以 是可存在于待测定的样品中的另一种实体。作为非限制性的实例，考虑待评估的样品是来 自个体的血浆样品。感兴趣的靶标可以是存在于样品中的蛋白质，例如，微囊泡表面抗原。 在该情况下，混杂靶标可选自可能存在于血浆样品中的任何其它抗原。因此，阳性选择应提 供识别感兴趣的靶标、但与混杂靶标具有最小(若存在)相互作用的候选适体。在一些实施 方案中，感兴趣的靶标和一种或多种混杂靶标包含相同类型的生物实体，例如，全部为蛋白 质、全部为核酸、全部为碳水化合物或全部为脂质。作为非限制性的实例，感兴趣的靶标可 以是选自由SSX4、SSX2、I¾P、KLK2、SPDEF和EpCAM组成的组的蛋白质，并且一种或多种混杂 靶标包含该组的其它成员。在其它实施方案中，感兴趣的靶标和一种或多种混杂靶标包含 不同类型的生物实体，例如，蛋白质、核酸、碳水化合物和脂质的任意组合。一种或多种混杂 靶标也可包含不同类型的生物实体，例如，蛋白质、核酸、碳水化合物和脂质的任意组合。
[0410] 在一个实施方案中，本发明提供一种通过上述方法鉴定的分离的多核苷酸或其片 段。本发明还提供一种分离的多核苷酸，其具有与通过上述方法鉴定的核苷酸序列至少 60%相同的核苷酸序列。更优选地，分离的核酸分子与通过上述方法鉴定的核苷酸序列至 少 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高地相同。在分离的多核苷酸在长度上长于或等于参照序列（例如通过上述方法鉴定 的序列）的情况下，用参照序列的全长进行比较。在分离的多核苷酸短于参照序列（例如短 于通过上述方法鉴定的序列）时，对相同长度（不包括同源性计算所需的任何环）的参照序 列的区段进行比较。
[0411] 在相关的方面，本发明提供一种选择一组适体的方法，其包括：（a)使适体池与来 自第一样品的微囊泡群体接触；（b)富集对来自第一样品的微囊泡群体显示出亲和性的适 体亚池；（c)使该亚池与来自第二样品的第二微囊泡群体接触；以及(d)耗尽对来自第二样 品的第二微囊泡群体显示出亲和性的第二适体亚池，由此选择对来自第一样品的微囊泡群 体具有优先亲和性的一组适体。
[0412] 第一样品和/或第二样品可包含如本文公开的生物流体。例如，该生物流体可包括 但不限于血液、血液衍生物、血浆、血清或尿液。第一样品和/或第二样品也可来源于细胞培 养物。
[0413] 在一个实施方案中，第一样品包含癌症样品而第二样品包含对照样品，如非癌症 样品。第一样品和/或第二样品可各自包含合并的样品。例如，第一样品和/或第二样品可包 含来自 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、 90、100个或超过100个个体的体液。在这类情况下，可选择池的成员来代表所需的表型。在 非限制性的实例中，第一样品池的成员可来自癌症患者，而第二样品池的成员可来自非癌 症对照。
[0414] 可将步骤(a)-(d)重复期望的次数，以便进一步富集对来自第一样品的微囊泡群 体具有优先亲和性的适体池。例如，可将步骤(a)-(d)重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20次或超过20次。来自步骤(d)的输出可用作重复的步骤(a)的输 入。在实施方案中，在重复步骤(a)-(d)之前，将第一样品和/或第二样品用不同的样品替 换。在非限制性的实例中，第一样品池的成员可来自癌症患者，而第二样品池的成员可来自 非癌症对照。在步骤(a)-(d)的后续重复期间，第一样品池可包含来自与前面轮次不同的癌 症患者的样品。类似地，第二样品池可包含来自与前面轮次不同的对照的样品。
[0415] 该方法还可包括通过例如DNA测序鉴定选定的适体组的成员。根据需要，该测序可 以通过新一代测序进行。
[0416] 该方法还可包括鉴定选定的适体组的靶标。本文公开了用于鉴定适体靶标的方 法。
[0417] 适体靶标鉴定
[0418] 上述方法和试剂盒可用于鉴定区分两个生物标志物群体的结合剂。如在这部分中 描述的，本发明还提供鉴定结合剂的靶标的方法。例如，该方法还可包括鉴定被该结合剂识 别的靶微囊泡的表面标志物。
[0419] 在一个实施方案中，本发明提供一种鉴定结合剂的靶标的方法，其包括：（a)使结 合剂与靶标接触以使靶标与结合剂结合，其中该靶标包含微囊泡的表面抗原；（b)在不破坏 靶标与结合剂的结合的条件下破坏微囊泡；（c)分离靶标与结合剂之间的复合物；以及(d) 鉴定被结合剂结合的靶标。该结合剂可以是通过上述方法鉴定的结合剂，例如，适体、配体、 抗体或可区分两个生物标志物群体的其它有用的结合剂。
[0420] 图9中示出用于实施该方法的说明性示意图。该图示出拴系至基底901的结合剂 902,在这里为了说明的目的为适体。结合剂902可共价地附接至基底901。结合剂902也可非 共价地附接。例如，结合剂902可以包含可被吸引至基底的标记，例如可与共价附接至基底 的抗生物素蛋白/链霉亲和素分子形成复合物的生物素基团。这可以使得在溶液中时在适 体与微囊泡之间形成复合物，随后采用生物素标记捕获适体。结合剂902与微囊泡904的表 面抗原903结合。在由箭头（i)所指的步骤中，微囊泡被破坏，而留下完整的在结合剂902与 表面抗原903之间的复合物。在由箭头(ii)所指的步骤中，例如通过洗涤或缓冲液更换去除 被破坏的微囊泡905。在由箭头（iii)所指的步骤中，表面抗原903从结合剂902上释放。可采 用本文公开和/或本领域已知的方法对表面抗原903进行分析以确定其身份。该方法的靶标 可以是与微囊泡相关联的任何有用的生物实体。例如，该靶标可包括蛋白质、核酸、脂质或 碳水化合物，或本文公开或本领域已知的其它生物实体。
[0421] 在该方法的一些实施方案中，在破坏微囊泡之前使靶标与结合剂交联。不受理论 的束缚，该步骤可帮助在囊泡破坏的同时维持结合剂与靶标之间的复合物。可使用本文公 开或本领域已知的任何有用的交联方法。在实施方案中，该交联包括光交联、酰亚胺酯交联 剂、辛二亚氨酸二甲酯、N-羟基丁二酰亚胺-酯交联剂、双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯 (853)、醛、丙烯醛、巴豆醛、甲醛、碳二亚胺交联剂川小/-二环己基碳二亚胺(00〇、1^-二 异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC或EDAC)、琥珀 酰亚胺基-4_(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马 来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯（磺基-SMCC)、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺基-2-(6-[生物 素胺基]-2-(对叠氮基苯甲酰氨基）_己胺基）乙基_1，3夂二硫代丙酸酯（磺基-SffiD)、2-[N2-(4-叠氮-2,3,5,6-四氟苯甲酰基)-N6-(6-生物素-氨基己酰基)-L-赖氨酰基]乙基甲 烧硫代横酸酯(Mts-Atf-生物素；可从Thermo Fisher Scientific Inc，Rockford IL.获 得）、2-{N2-[N6-(4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酰基-6-氨基-己酰基)-N6-(6-生物素胺基 己酰基）-L-赖氨酰基胺基]}乙基甲烷硫代磺酸酯（Mts-Atf-LC-生物素；可从Thermo Fisher Scientific Inc获得）、光反应性氨基酸（例如，L-光-亮氨酸和L-光-蛋氨酸，参见 例如，Suchanek，M.等人（2005) .Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein-protein interactions.Nat.Methods 2:261-267)、N-羟基 琥珀酰亚胺(NHS)交联剂、NHS-叠氮化物试剂（例如，NHS-叠氮化物、NHS-PEG4-叠氮化物、 NHS-PEG12-叠氮化物；均可从Thermo Fisher Scientific，Inc.获得）、NHS-膦试剂（例如， NHS-膦、磺基-NHS-膦；均可从Thermo Fisher Scientific，Inc.获得)或其任意组合或修 饰。
[0422] 可采用多种方法破坏微囊泡。例如，可采用机械力、化学剂或其组合破坏囊泡膜。 在实施方案中，破坏微囊泡包括使用去污剂、表面活性剂、溶剂、酶中的一种或多种或其任 意有用的组合。该酶可包括溶菌酶、溶葡萄球菌酶、酶解酶、纤维素酶、变溶菌素、聚糖酶、蛋 白酶和甘露聚糖酶中的一种或多种。该去污剂或表面活性剂可包括以下一种或多种：辛基 硫代葡糖苷(0TG)、辛基β-葡糖苷(0G)、非离子去污剂、Triton X、吐温20、脂肪醇、鲸蜡醇、 硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、油醇、聚氧乙烯二醇烷基醚(Brij)、八乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇 单十二烷基醚、聚氧丙烯二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚、癸基葡糖苷、月桂基葡糖苷、辛基葡糖 苷、聚氧乙烯二醇辛基酚醚、聚氧乙烯二醇烷基酚醚、壬苯醇醚-9、甘油烷基酯、月桂酸甘油 酯、聚氧乙烯二醇失水山梨醇烷基酯、聚山梨醇酯、失水山梨醇烷基酯、椰油酰胺MEA、椰油 酰胺DEA、十二烷基二甲基氧化胺、聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物、泊洛沙姆、聚乙氧基 牛脂胺（Ρ0ΕΑ)、两性离子去污剂、3-[ (3-胆酰胺基丙基）二甲基氨基]-1-丙烷磺酸酯 (CHAPS)、直链烷基苯磺酸酯(LAS)、烷基苯酚乙氧基化物(APE)、椰油酰胺基丙基羟基磺基 甜菜碱、甜菜碱、椰油酰胺基丙基甜菜碱、卵磷脂、离子型去污剂、十二烷基硫酸钠(SDS)、西 曲溴铵（CTAB)、十六烷基三甲基氯化铵（CTAC)、奥替尼啶二盐酸盐、氯化十六烷基吡啶 (CPC)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)、5-溴-5-硝基-1，3-二氧杂环己烷、二甲基双十八烷 基氯化铵、双十八烷基二甲基溴化铵（D0DAB)、脱氧胆酸钠、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇 (Tergi to 1型NP-40; NP-40)、月桂基硫酸铵、聚乙二醇单月桂基醚硫酸钠（月桂基醚硫酸钠 (SLES))、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、羧酸烷基酯、硬脂酸钠、月桂酰肌氨酸钠、基于羧酸的含氟 表面活性剂、全氟壬酸酯、全氟辛酸酯(PF0A或PF0)以及生物表面活性剂。可以使用的机械 破坏方法包括但不限于机械剪切、珠磨、匀浆、微流化、超声处理、弗氏压碎器、冲击、胶体 磨、减压、渗透压冲击、热解、冻融、干燥或其任意组合。
[0423] 如图9所示，可将结合剂拴系至基底上。可在结合剂与靶标之间的复合物形成之前 或之后拴系结合剂。基底可以是如本文公开或本领域已知的任何有用的基底。在一个实施 方案中，基底包括微球。在另一个实施方案中，基底包括平面基底。结合剂也可被标记。分离 靶标与结合剂之间的复合物可包括通过该标记捕获结合剂。例如，该标记可以是生物素标 记。在这类情况下，结合剂可通过生物素-抗生物素蛋白结合事件而附接至基底上。
[0424] 在从结合剂释放后鉴定靶标的方法将取决于感兴趣的靶标的类型。例如，当靶标 包含蛋白质时，鉴定靶标可包括质谱法(MS)、肽质量指纹分析(PMF;蛋白质指纹分析）、测 序、N-末端氨基酸分析、C-末端氨基酸分析、Edman降解、色谱法、电泳、二维凝胶电泳(2D凝 胶）、抗体阵列以及免疫测定的使用。核酸可通过测序鉴定。
[0425] 技术人员将理解，该方法可用于鉴定任何合适的靶标，包括与囊泡无关的那些靶 标。例如，对于图9，除了由箭头（i)指出的步骤（即，破坏微囊泡)外的所有步骤均可对循环 靶标如蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物或其组合实施。
[0426] 样品表征
[0427] 本发明的适体可用于表征生物样品。例如，适体可用于结合样品中的生物标志物。 结合的生物标志物的存在或水平可指示实例的特征，如与样品有关的疾病或病症的诊断、 预后或治疗诊断。
[0428] 在一方面，本发明提供一种适体，其包含与以下任一项至少约50 %、55 %、60 %、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源的核酸序列： a)如表8所述的SEQ ID N0.8-21或其可变序列；b)如表11所述的SEQ ID N0.24-43或其可变 序列；c)SEQIDN0.44-10527;d)如表12所述的SEQIDN0.10528-10557或其可变序列，或 e)任何前述序列的功能片段。在相关的方面，本发明提供一种表征疾病或病症的方法，其包 括：（a)使生物测试样品与一种或多种本发明的适体例如本段中的任何适体或其修饰物接 触；（b)检测在步骤(a)中在所述一种或多种适体与生物测试样品中被所述一种或多种适体 结合的靶标之间形成的复合物的存在或水平；（c)使生物对照样品与所述一种或多种适体 接触；（d)检测在步骤(c)中在所述一种或多种适体与生物对照样品中被所述一种或多种适 体结合的靶标之间形成的复合物的存在或水平；以及(e)比较步骤(b)和(d)中检测到的存 在或水平，从而表征该疾病或病症。
[0429] 该生物测试样品和生物对照样品可各自包括组织样品、细胞培养物或生物流体。 在一些实施方案中，生物测试样品和生物对照样品包含相同的样品类型，例如都是组织样 品或者都是流体样品。在其它实施方案中，不同的样品类型可用于测试和对照样品。例如， 对照样品可包括工程化的或以其它方式人造的样品。
[0430] 生物流体可包含体液。体液可包括但不限于以下一种或多种:外周血、血清、血浆、 腹水、尿液、脑脊液(CSF )、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、 精液、前列腺液、考珀液或射精前液、女性射出液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和 腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜 分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或脐带血。在一些实施方案 中，体液包括血液、血清或血浆。[0431 ]生物流体可包含微囊泡。例如，生物流体可以是组织、细胞培养物或包含从样品中 的细胞释放的微囊泡的体液。微囊泡可以是循环微囊泡。
[0432] -种或多种适体可结合靶生物标志物，例如，对表征样品有用的生物标志物。该生 物标志物可包含多肽或其片段，或本文所述或本领域已知的其它有用的生物标志物(脂质、 碳水化合物、复合物、核酸等）。在实施方案中，多肽或其片段是可溶的或膜结合的。膜结合 的多肽可包含细胞表面抗原或微囊泡表面抗原。生物标志物可以是选自表3或表4的生物标 志物。
[0433] 该表征可包括疾病或病症的诊断、预后或治疗诊断。多种疾病和病症可采用本发 明的组合物和方法进行表征，包括但不限于癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免 疫性疾病或病症、心血管疾病或病症、神经疾病或病症、感染性疾病和/或疼痛。更多细节参 见例如本文的"表型"部分。在实施方案中，疾病或病症包括增生性或赘生性疾病或病症。例 如，该疾病或病症可以是癌症。在一些实施方案中，癌症包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺 癌、结直肠癌、黑色素瘤或脑癌。
[0434] 图16A是示意图1600,其示出可采用一种或多种本发明的适体检测和/或定量感兴 趣的靶标的试验配置。捕获适体1602附接至基底1601。基底可以是平面基底、孔、微珠、或如 本文公开或本领域已知的其它有用的基底。感兴趣的靶标1603被捕获适体1602结合。感兴 趣的靶标可以是任何合适的实体，其在被适体或其它结合剂识别时可被检测。感兴趣的靶 标可包括蛋白质或多肽、核酸，包括DNA、RNA及其各种亚种、脂质、碳水化合物、复合物，例 如，包含蛋白质、核酸、脂质和/或碳水化合物的复合物。在一个实施方案中，感兴趣的靶标 包含微囊泡。感兴趣的靶标可以是微囊泡表面抗原。感兴趣的靶标可以是表3或表4中的生 物标志物，包括与生物标志物关联的囊泡。可采用各种如本文所述的技术，例如色谱法、过 滤、离心、流式细胞术、亲和捕获(例如，捕获至平面表面、柱子或珠子上)和/或采用微流体 从样品中分离微囊泡输入物。检测适体1604也结合至感兴趣的靶标1603。检测适体1604带 有标记1605,该标记可被检测，从而鉴定通过捕获适体1602捕获至基底1601的靶标。该标记 可以是荧光标记、放射性标记、酶或如本文公开的其它可检测的标记。捕获适体1602或检测 适体1604可被替代为另一种结合剂，例如，抗体。例如，靶标可以用抗体捕获并可用适体检 测，反之亦反。当感兴趣的靶标包含复合物时，捕获剂和检测剂(适体、抗体等)可识别相同 或不同的靶标。例如，当靶标是微囊泡时，捕获剂可识别一种微囊泡表面抗原，而检测剂识 别另一种微囊泡表面抗原。或者，捕获剂和检测剂可识别相同的表面抗原。
[0435] 本发明的适体可以以DNA或RNA的形式得到鉴定和/或用于各种目的。除非另有说 明，本领域技术人员将会理解，适体可通常以核酸的各种形式合成。适体还可带有各种化学 修饰并且保持在本发明的范围内。
[0436] 在一些实施方案中，本发明的适体经修饰以包含至少一种化学修饰。该修饰可包 括但不限于在核酸的糖位置处的化学取代;在磷酸位置处的化学取代；以及在碱基位置处 的化学取代。在一些实施方案中，该修饰选自：生物素化，荧光标记的引入，经修饰的核苷酸 的掺入，修饰的嘧啶，3'加帽，与胺接头的缀合，与高分子量、非免疫原性化合物的缀合， 与亲脂性化合物的缀合，与药物的缀合，与细胞毒性部分的缀合，以及用放射性同位素标 记，或其它本文公开的修饰。修饰的位置可根据期望而变化。例如，生物素化、荧光标记或细 胞毒性部分可与该适体的5'末端缀合。生物素化、荧光标记或细胞毒性部分还可与该适体 的3'末端缀合。
[0437] 在一些实施方案中，细胞毒性部分封装在纳米颗粒中。该纳米颗粒可选自：脂质 体、树状聚体和梳状聚合物。在其它实施方案中，细胞毒性部分包括小分子细胞毒性部分。 该小分子细胞毒性部分可包括但不限于长春碱酰肼、加利车霉素、长春花生物碱、念珠藻 素、微管溶素、尾海兔素-10、尾海兔素-15、阿里他汀E、根霉素、埃博霉素 B、埃博霉素 D、紫杉 烷、美登素，及其任意变体及衍生物。在其它实施方案中，该细胞毒性部分包含蛋白质毒素。 例如，该蛋白质毒素可选自白喉毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白树毒素和假单胞菌外 毒素 A。与本发明一起使用的非免疫原性的高分子量化合物包括聚亚烷基二醇，例如，聚乙 二醇。合适的放射性同位素包括钇-90、铟-111、碘-131、镥-177、铜-67、铼-186、铼-188、铋-212、铋-213、砹-211和锕-225。适体可以用发射γ射线的放射性同位素进行标记。
[0438] 在本发明的一些实施方案中，活性剂与适体缀合。例如，该活性剂可以是治疗剂或 诊断剂。该治疗剂可选自酪氨酸激酶抑制剂、激酶抑制剂、生物活性剂、生物分子、放射性核 素、阿霉素、安沙霉素抗生素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺铂、卡铂、卡莫司汀、卡培他 滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、右雷佐生、多 西紫杉醇、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、 伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯基嘌呤、美法仑、氨甲蝶呤、雷帕霉素 (西罗莫司）、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉酚、帕米膦酸盐、喷司他丁、普利 霉素、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链脲菌素、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、噻替派、紫杉烷、长春碱、长春 新碱、长春瑞滨、紫杉醇、考布他汀、discodermolides、反钼（transplatinum)、抗血管内皮 生长因子化合物（"抗VEGF"）、抗表皮生长因子受体化合物（"抗EGFR"）、5_氟尿嘧啶及其衍 生物、放射性核素、多肽毒素、凋亡诱导剂、治疗敏化剂、酶或其活性片段，以及它们的组合。
[0439] 用来表征样品的寡核苷酸池
[0440] 生物学中存在的复杂性和异质性向了解生物系统和疾病提出了挑战。多样性在细 胞、组织、个体和疾病状态之内和之间以不同水平存在。参见，例如，图13A。图13B概述了不 同的生物实体，其可被评估以表征这类样品。如图所示，当从评估DNA转至RNA、转至蛋白质， 最后转至蛋白质复合物时，多样性和复杂性的量显著增加。本发明的寡核苷酸探针文库方 法可用来表征复杂的生物源，例如，组织样品、细胞、循环肿瘤细胞、微囊泡和复合物如蛋白 质和蛋白脂质复合物。
[0441] 表征生物样品的当前方法可能不足以解决这样的复杂性和多样性。如图13C所示， 当前这类方法通常在测量多样性与复杂性之间权衡。例如，考虑到高通量测序技术。新一代 方法可在单一分析中查询数以1000计的分子靶标。然而，这类方法仅探测单独的DNA和/或 RNA分子，因而遗漏了蛋白质和生物复合物的极大多样性。另一方面，流式细胞术可探测生 物复合物，但限于少量的预定义的配体。例如，单一分析可探测预定义靶标的少量差异标记 的抗体。
[0442] 本发明的寡核苷酸探针文库可以克服当前生物检测技术的以上挑战。可调整起始 文库的大小以测量同文库成员一样多的不同实体。在这一实例中，初始未经训练的寡核苷 酸文库具有测量1〇 12或更多生物特征的潜能。可根据需要构建更大的和/或不同的文库。所 述技术适合于在不假设什么"应该不同"的情况下寻找样品之间的差异。例如，探针文库可 基于单独的蛋白质、蛋白质修饰、蛋白质复合物、脂质、核酸、不同的折叠或构象或能够区分 感兴趣的样品的任何事物来区分。因此，所述方法提供了鉴定生物样品中的差异的无偏方 法，它可用来鉴定不同的感兴趣的群体。
[0443] 在其表面可包含在不同构型和复合物中的任何数目的生物标志物的微囊泡的情 况下，使用寡核苷酸文库探针来评估样品可被称为拓扑寡核苷酸谱分析:TOP™。尽管如上所 述，术语适体和寡核苷酸通常在本文中可互换使用，但是"经典的"单独的适体与TOP探针之 间的一些差异如下。单独的适体可包含选择为与已知的特定靶标以抗体样"锁匙(key-in-lock)"结合模式结合的单独寡核苷酸。它们可基于对预定靶标的特异性和结合亲和力而单 独地评估。然而，TOP探针可包含旨在产生多探针特征（signature)的寡核苷酸的文库。TOP 探针包含许多潜在的结合形式(静电、疏水、Watson-Crick、多寡核苷酸复合物等ΚΤ0Ρ探针 特征具有鉴定异质的患者亚群的潜能。例如，如本文所示，可组装单一 TOP文库以区分多个 疾病状态。不同于典型的单一适体，可以或可以不分离或鉴定所述结合靶标。应当理解，鉴 定单独适体的筛选方法，例如SELEX，还可用来富集原始的寡核苷酸文库，以鉴定TOP探针文 库。
[0444] 本发明的一般方法概括在图13D中。该方法的一种输入包含具有测量1012个或更多 生物特征的潜能的随机化寡核苷酸文库。如该图所概括的，该方法鉴定在两种输入样品类 型之间不同的所需数目（例如，约1〇 5_1〇6)。随机化寡核苷酸文库与第一和第二样品类型接 触，并鉴定与每个样品结合的寡核苷酸。比较结合的寡核苷酸群体，并且保留与一个或另一 个生物输入样品特异性结合的寡核苷酸以用于寡核苷酸探针文库，而丢弃结合两个生物输 入样品的寡核苷酸。这一经训练的寡核苷酸探针文库随后可与新的测试样品接触，并且确 定结合该测试样品的寡核苷酸的身份。该测试样品基于结合的寡核苷酸的谱进行表征。参 见，例如，图13H。
[0445] 细胞外囊泡提供了一种用来对由许多互相关联的来源驱动的生物复杂性和多样 性进行概况分析的有吸引力的工具。在患者间微囊泡群体之间或甚至在来自不同状况(例 如，应激、饮食、锻炼、休息、疾病等)下的单一患者的微囊泡群体中可能具有大量的异质性。 即使在通过囊泡生物标志物分离和分选微囊泡之后，在各种疾病状态的微囊泡群体内的分 子表型的多样性也可能对鉴定表面结合配体提出挑战。囊泡表面膜蛋白质复合物使这种情 况进一步复杂化。寡核苷酸探针文库可用来解决这种挑战，并允许表征生物表型。该方法结 合了多样化寡核苷酸文库和高通量(新一代)测序技术的力量来探测细胞外微囊泡的复杂 性。参见图13E。
[0446] TOP™谱分析除了提供对样品中存在/不存在各种生物标志物的检测外，还可提供 对动态事件的定量测量。例如，结合探针可检测蛋白质复合物或其它的翻译后修饰，以允许 区分含有相同蛋白质但生物构型不同的样品。这样的构型示于图13F-G中。在图13F中，具有 各种表面标志物的微囊泡由示例微囊泡样品群体示出：样品群体A。显示的结合探测寡核苷 酸1301与两个表面标志物1302和1303以给定的特殊关系接触。这里，可以保留对于这些功 能复合物和空间关系为唯一的探针。相反，在图13F中示出的微囊泡样品群体B中，两个表面 标志物1302和1303以不同的空间关系被发现。这里，由于不存在相互作用组分1302与1303 的空间关系，探针1301未结合。
[0447] 用于使用TOP™谱分析来评估样品的示例性方法1310示于图13H中。探测文库1311 与样品1312混合。样品可以如本文所述，例如来自患有或怀疑患有疾病的受试者的体液。使 探针结合样品1313，并使微囊泡沉淀1315。丢弃包含未结合的寡核苷酸的上清液1314。洗脱 与沉淀物1315结合的寡核苷酸探针1316并测序1317。如通过测序1317确定的由结合的寡核 苷酸探针生成的谱1318用来表征样品1312。例如，谱1318可与参照物进行比较，例如，以确 定该谱是否类似或不同于指示疾病或健康状态或其它感兴趣的表型表征的参照谱。所述比 较可指示疾病的存在，提供诊断、预后或治疗诊断，或以其它方式表征与样品1312相关的表 型。图131示出了使用TOP™谱分析来表征表型的另一示意图。收集患者样品如本文公开的体 液1321。样品与TOP™文库池接触1322。例如，使用超速离心、过滤、聚合物沉淀或其它合适的 技术或本文公开的技术的组合，从接触的样品中分离微囊泡(MV)1323。收集结合分离的微 囊泡的寡核苷酸并确定其身份1324。结合的寡核苷酸的身份可通过任何有用的技术来确 定，诸如测序、高通量测序(例如，NGS)、包括但不限于qPCR的扩增，或者例如与基于平面或 颗粒的阵列杂交。结合的寡核苷酸的身份用来表征例如含有疾病相关的微囊泡的样品。
[0448] 在一方面，本发明提供了一种表征样品的方法，其包括使样品与不同的寡核苷酸 的池(例如，适体池)接触，以及确定该池中的各种寡核苷酸结合样品的频率。例如，鉴定与 非癌症患者相比优选结合来自癌症患者的微囊泡的寡核苷酸池。例如，收集来自怀疑患有 癌症的患者的测试样品，并使其与寡核苷酸池接触。从测试样品中洗脱结合测试样品的寡 核苷酸，收集并鉴定，并且将结合的寡核苷酸的组成与已知结合癌症样品的那些进行比较。 各种测序、扩增和杂交技术可用来鉴定洗脱的寡核苷酸。例如，当使用大的寡核苷酸池时， 寡核苷酸鉴定可通过高通量方法如新一代测序或经由杂交来进行。如果测试样品以类似于 来自癌症患者的微囊泡的方式(例如，通过生物信息学分类方法所确定的)被寡核苷酸池结 合，那么该测试样品同样指示癌症。使用该方法，结合一种或多种微囊泡抗原的寡核苷酸池 可以用来表征样品，而不需要知道寡核苷酸池的每一个成员的精确靶标。本文实施例19-20 说明了本发明的实施方案。
[0449] 在一方面，本发明提供了一种表征测试样品的状况的方法，其包括:使微囊泡样品 与能够结合存在于所述微囊泡样品中的一种或多种靶标的多个寡核苷酸接触，鉴定与所述 样品形成复合物的一组寡核苷酸，其中所述组被预先确定为表征样品的状况，从而表征样 品的状况。
[0450] 在有关的方面，本发明提供了一种鉴定与测试样品相关的一组寡核苷酸的方法， 其包括：（a)使微囊泡样品与多个寡核苷酸接触，分离与该微囊泡样品形成复合物的一组寡 核苷酸，（b)测定每一个寡核苷酸的序列和/或拷贝数，从而鉴定与所述测试样品相关的一 组寡核苷酸。
[0451] 在另一有关的方面，本发明提供了一种将样品诊断为癌性或倾向于癌性的方法， 其包括使微囊泡样品与多个寡核苷酸接触，所述寡核苷酸被预先确定为与来自非癌症样品 的微囊泡相比优选与来自癌症样品的微囊泡形成复合物。
[0452] 所述寡核苷酸可通过测序来鉴定，例如，通过染料终止(Sanger)测序或高通量方 法。高通量方法可包括对大量核酸进行快速测序的技术，包括新一代技术，如大规模平行特 征测序(MPSS);聚合酶克隆测序;454焦磷酸测序；IIlumina(Solexa)测序;SOLiD测序；Ion Torrent半导体测序;DNA纳米球测序;Heliscope单分子测序;单分子实时（SMRT)测序，或其 它方法如纳米孔DNA测序;隧道电流DNA测序;杂交测序;采用质谱法测序;微流体Sanger测 序;基于显微术的技术;RNAP测序;体外病毒高通量测序。所述寡核苷酸还可通过杂交技术 来鉴定。例如，可以使用具有可寻址位置以杂交并从而检测所述池的各种成员的微阵列。
[0453] 所述多个寡核苷酸或寡核苷酸池可包含任何所需数目的寡核苷酸，以允许表征样 品。在多个实施方案中，所述池包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、 800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000个或至少10000个不同的寡核 苷酸成员。
[0454] 所述多个寡核苷酸可通过一个或多个步骤的阳性或阴性选择进行预先选择，其中 阳性选择包括针对与测试样品相比具有基本相似特征的样品选择寡核苷酸，并且其中阴性 选择包括针对与测试样品相比具有基本不同特征的样品选择寡核苷酸。基本相似的特征意 指用于阳性选择的样品在一个或多个感兴趣的特征上代表测试样品。例如，用于阳性选择 的样品可以来自癌症患者或细胞系，并且测试样品可以是来自患有或怀疑患有癌症的患者 的样品。基本不同的特征意指用于阴性选择的样品在一个或多个感兴趣的特征上不同于测 试样品。例如，用于阴性选择的样品可以来自未患癌症的个体或细胞系（例如，"正常的"或 "对照"样品），并且测试样品可以是来自患有或怀疑患有癌症的患者的样品。癌症可以是乳 腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、脑癌或其它癌症。
[0455] 通过选择代表检测和/或区分所需的表型的样品，表征可包括诊断、预后或治疗诊 断任何数目的疾病或病症。可使用本发明的组合物和方法表征各种疾病和病症，包括但不 限于，癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫性疾病、自身免疫病或失调、心血管疾病或病症、神 经疾病或病症、传染病和/或疼痛。进一步的细节参见例如本文的"表型"部分。在实施方案 中，所述疾病或病症包括增生性或赘生性疾病或病症。例如，所述疾病或病症可以是癌症。 在一些实施方案中，该癌症包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、黑色素瘤或脑 癌。
[0456] 图16B是示意图1610,其示出使用寡核苷酸池来表征样品的表型，诸如以上列出的 那些。提供了针对感兴趣的靶标的寡核苷酸池1611。例如，可富集寡核苷酸池以靶向一种或 多种微囊泡。该池的成员可结合不同的靶标(例如，微囊泡表面抗原)或所述一种或多种微 囊泡上存在的相同靶标的不同的表位。使该池与待表征的测试样品接触1612。例如，测试样 品可以是来自患有或怀疑患有给定疾病或病症的个体的生物样品。将混合物洗涤以去除未 结合的寡核苷酸。从样品中洗脱或以其它方式解离剩余的寡核苷酸并收集1613。例如通过 测序或杂交鉴定所收集的寡核苷酸1614。经鉴定的寡核苷酸的存在和/或拷贝数用来表征 表型1615。例如，寡核苷酸池可被选择为优选识别从癌细胞中脱落的微囊泡的寡核苷酸。可 采用该方法检测样品是否保留结合癌症相关微囊泡的寡核苷酸，从而允许将样品表征为癌 性的或不是癌性的。
[0457] 图16C是示意图1620，其示出图16B中的方法的实施。提供被鉴定为结合微囊泡群 体的寡核苷酸池1621。输入样品包括包含微囊泡的测试样品1622。例如，测试样品可以是来 自患有或怀疑患有给定疾病或病症的个体的生物样品。使该池与待表征的分离的微囊泡接 触1623。使用如本文所述的各种技术，例如，色谱法、过滤、超滤、离心、超速离心、流式细胞 仪、亲和捕获(例如，捕获到平面表面、柱或珠子上）、聚合物沉淀和/或使用微流体，可在接 触1623之前或之后从样品中分离微囊泡群体。洗涤混合物以去除未结合的寡核苷酸，并且 从样品中洗脱或以其它方式分离剩余的寡核苷酸，然后收集1624。鉴定收集的寡核苷酸 1625,并且利用保留的寡核苷酸的存在和/或拷贝数来如上所述表征表型1626。
[0458] 如上所述，在图16C的实施方案中，寡核苷酸池1620与包含或预期包含微囊泡的生 物样品直接接触。微囊泡此后从样品中分离，并洗涤混合物以去除未结合的寡核苷酸，然后 分离并收集剩余的寡核苷酸1624。如上所述进行以下步骤。作为该备选构型的示例，生物样 品例如血液、血清或血浆样品与寡核苷酸池直接接触。随后通过本文公开的各种技术分离 微囊泡，包括但不限于超速离心、超滤、流式细胞术、亲和分离、聚合物沉淀、色谱法、它们的 各种组合等。然后例如通过测序、杂交或扩增来鉴定剩余的寡核苷酸。
[0459] 在有关的方面，本发明提供了包含多个寡核苷酸的物质的组合物，其可用来实施 包括使用寡核苷酸池来表征表型的方法。所述多个寡核苷酸可包含任何本文所述的那些寡 核苷酸。
[0460] 在有关的方面，本发明提供了一种进行高通量测序的方法，其包括:对具有微囊泡 样品的多个寡核苷酸进行至少一个（i)阴性选择或（ii) 一个阳性选择;获得一组寡核苷酸 以提供所述多个寡核苷酸的阴性结合剂子集或阳性结合剂子集，其中所述多个寡核苷酸的 阴性结合剂子集不结合微囊泡样品，并且其中所述多个寡核苷酸的阳性结合剂子集结合微 囊泡样品；使阴性结合剂子集或阳性结合剂子集与测试样品接触;洗脱与测试样品结合的 寡核苷酸以提供多个洗脱寡核苷酸；以及对多个洗脱寡核苷酸进行高通量测序以鉴定所述 多个洗脱寡核苷酸的成员的序列和/或拷贝数。可如本文所公开的那样使用微囊泡样品进 行多个寡核苷酸的阴性和阳性选择。通过多个洗脱寡核苷酸的成员的序列和/或拷贝数揭 示的寡核苷酸谱可如本文所述用来表征测试样品的表型。
[0461] 在类似的方面，本发明提供了用于鉴定对测试样品具有特异性的寡核苷酸的方 法。该方法包括：（a)对于样品富集多个寡核苷酸以提供预先测定为与靶标样品形成复合物 的一组寡核苷酸；（b)使(a)中的多个寡核苷酸与测试样品接触，以使寡核苷酸与测试样品 形成复合物；（c)回收在(b)中形成复合物的寡核苷酸，以提供寡核苷酸的回收子集;和(d) 通过高通量测序或杂交对寡核苷酸的回收子集进行概况分析，从而鉴定对测试样品具有特 异性的寡核苷酸。该测试样品可包含多个微囊泡。该寡核苷酸可包括RNA、DNA或两者。在一 些实施方案中，该方法进一步包括进行信息学分析以鉴定寡核苷酸的子集，该寡核苷酸包 含与预先确定为与祀标样品形成复合物的寡核苷酸至少50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或至少 99% 的序列同 一性。
[0462] 在一方面，本发明提供与SEQ ID N0.10558至少50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源的寡核苷酸。在相关的方 面，本发明提供多个寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、 300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、 10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、 不同的寡核苷酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部分与SEQ ID N0.10558至少50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源。
[0463] 在另一方面，本发明提供多个寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、 150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、 8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、 200000、300000、400000或500000个不同的寡核苷酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部 分与选自 SEQ ID N0.10559-510558的序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源。在相关的方面，本发明提供一种寡核 苷酸探针文库，其包含SEQ ID N0.10559-510558列出的寡核苷酸中的至少50%、60%、 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 或至少 99%。
[0464] 在又一方面，本发明提供一种寡核苷酸，其包含与选自SEQ ID N0.510559-510578 的序列至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%同源的核酸序列或其部分。在相关的方面，本发明提供多个寡核苷酸，其包含 至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 个不同的寡核苷酸序列，其 中每一个寡核苷酸序列或其部分与SEQ ID N0.510559-510578至少50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源。
[0465] 在再一方面，本发明提供一种寡核苷酸，其包含与选自SEQ ID N0.510579-510598 的序列至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%同源的核酸序列或其部分的寡核苷酸。在相关的方面，本发明提供多个寡核苷 酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 个不同的寡核苷 酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部分与SEQ ID NO.510579-510598至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源。
[0466] 在一方面，本发明提供一种寡核苷酸，其包含与选自SEQ ID N0.510599-510763的 序列至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%同源的核酸序列或其部分。在相关的方面，本发明提供多个寡核苷酸，其包含至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160或165个不同的寡核苷酸序列，其 中每一个寡核苷酸序列或其部分与SEQ ID N0.510599-510763至少50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源。在又一相关的方 面，本发明提供多个寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、 140、150、160或165个不同的寡核苷酸序列，其中每一个寡核苷酸序列或其部分与表16中的 一行中的SEQ ID N0.至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99% 或 100% 同源。
[0467] 在一方面，本发明还提供一种方法，其包括使寡核苷酸或多个寡核苷酸与样品接 触，并检测该寡核苷酸或多个寡核苷酸与样品中的靶标结合的存在或水平，其中该寡核苷 酸或多个寡核苷酸可以是本发明上文提供的那些。该样品可包括生物样品、有机样品、无机 样品、组织、细胞培养物、体液、血液、血清、细胞、微囊泡、蛋白质复合物、脂质复合物、碳水 化合物，或其任意组合、部分或变化形式。该靶标可包括细胞、细胞器、蛋白质复合物、脂蛋 白、碳水化合物、微囊泡、膜片段、小分子、重金属、毒素或药物。
[0468] 在相关的方面，本发明提供一种方法，其包括:a)使包含微囊泡的生物样品与寡核 苷酸探针文库接触，其中任选地该寡核苷酸探针文库包含本发明上文提供的寡核苷酸或多 个寡核苷酸;b)鉴定与微囊泡的至少一部分结合的寡核苷酸；以及c)根据鉴定出的寡核苷 酸谱来表征该样品。
[0469]在另一方面，本发明提供一种方法，其包括：a)使样品与包含至少106、107、10 8、 "、…'加^加^加^加^加^加^⑴^个或至少⑴^个不同寡核苷酸序列的寡核苷酸 的寡核苷酸探针文库接触，以在溶液中形成混合物，其中该寡核苷酸能够结合样品中的多 个实体从而形成复合物，其中任选地该寡核苷酸探针文库包含如本发明上文提供的寡核苷 酸或多个寡核苷酸;b)将由混合物在步骤(a)中形成的复合物进行分区(partitioning) ;c) 检测在步骤(b)中分区的复合物中存在的寡核苷酸，以对该样品鉴定寡核苷酸谱。在一个实 施方案中，检测步骤包括对复合物中的全部或部分寡核苷酸进行测序，对复合物中的全部 或部分寡核苷酸进行扩增，和/或使复合物中的全部或部分寡核苷酸与阵列杂交。该阵列可 以是任何有用的阵列，如平面的或基于颗粒的阵列。
[0470]在另一方面，本发明提供一种生成富集的寡核苷酸探针文库的方法，其包括:a)使 第一寡核苷酸文库与生物测试样品和生物对照样品接触，其中在生物样品中存在的生物实 体与第一寡核苷酸文库中存在的多个寡核苷酸之间形成复合物;b)将在步骤(a)中形成的 复合物进行分区，并分离该复合物中的寡核苷酸，以对生物测试样品和生物对照样品中的 每一个产生寡核苷酸的子集;c)使(b)中的寡核苷酸子集与生物测试样品和生物对照样品 接触，其中在生物样品中存在的生物实体与寡核苷酸子集中存在的第二多个寡核苷酸之间 形成复合物，以生成核苷酸的第二子集群组；以及d)任选地重复步骤b)-c)-次、两次、三次 或更多次，以产生寡核苷酸的各自第三、第四、第五或更多个子集群组，从而产生富集的寡 核苷酸探针文库。在相关的方面，本发明提供多个寡核苷酸，其包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、 6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、 100000、200000、300000、400000或500000个不同的寡核苷酸序列，其中所述多个寡核苷酸 由本段中的方法产生，其中该文库能够区分第一表型与第二表型。在一些实施方案中，第一 表型包括疾病或病症，且第二表型包括健康状态;或者其中第一表型包括疾病或病症，且第 二表型包括不同的疾病或病症;或者其中第一表型包括疾病或病症的阶段或进展，且该第 二表型包括相同疾病或病症的不同阶段或进展；或者其中第一表型包括对疗法的正面响 应，且该第二表型包括对相同疗法的负面响应。[0471 ]在又一方面，本发明提供一种表征疾病或病症的方法，其包括:a)使生物测试样品 与本发明提供的寡核苷酸或多个寡核苷酸接触;b)检测在步骤(a)中、在本发明提供的寡核 苷酸或多个寡核苷酸与生物测试样品中的靶标之间形成的复合物的存在或水平；以及c)将 在步骤(b)中检测到的存在或水平与来自生物对照样品的参考水平进行比较，从而表征疾 病或病症。检测步骤可包括对复合物中的全部或部分寡核苷酸进行测序，对复合物中的全 部或部分寡核苷酸进行扩增，和/或使复合物中的全部或部分寡核苷酸与阵列杂交。该测序 可以是高通量或新一代测序。
[0472] 在本发明的方法中，生物测试样品和生物对照样品可各自包含组织样品、细胞培 养物或生物流体。在一些实施方案中，该生物流体包含体液。在本发明的方法中有用的体液 包含外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、 母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或射精前液、女性射出液、汗液、粪便物、 毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、脓、皮脂、 呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或 脐带血。在一些优选的实施方案中，该体液包含血液、血清或血浆。该生物流体可包含微囊 泡。在这样的情况下，复合物可在寡核苷酸或多个寡核苷酸与至少一个微囊泡之间形成。
[0473] 生物测试样品和生物对照样品可以进一步包含分离的微囊泡，其中任选地采用色 谱法、过滤、超滤、离心、超速离心、流式细胞术、亲和捕获(例如，捕获到平面、柱子或珠子 上）、聚合物沉淀和使用微流体中的至少一种来分离微囊泡。囊泡也可在与所述寡核苷酸或 多个寡核苷酸接触后分离。
[0474] 在本发明的方法的多个实施方案中，所述寡核苷酸或多个寡核苷酸与多肽或其片 段结合。该多肽或其片段可以是可溶的或膜结合的，其中任选地该膜包括微囊泡膜。该膜也 可来自细胞，或囊泡的细胞的片段。在一些实施方案中，该多肽或其片段包含表3或表4中的 生物标志物。例如，该多肽或其片段可以是如表3中的一般囊泡标志物，或如表4中的组织相 关的或疾病相关的标志物。所述寡核苷酸或多个寡核苷酸可以与生物样品中的微囊泡表面 抗原结合。例如，所述寡核苷酸或多个寡核苷酸可针对微囊泡从天然文库中富集。
[0475] 通过本文提供的寡核苷酸、多个寡核苷酸或方法检测的疾病或病症可包括任何合 适的、感兴趣的疾病或病症，包括但不限于乳腺癌、阿尔茨海默病、支气管哮喘、膀胱移行细 胞癌、巨细胞破成骨细胞瘤、脑瘤、结直肠腺癌、慢性阻塞性肺疾病（COPD)、宫颈鳞状细胞 癌、急性心肌梗死(AMI)/急性心力衰竭、克罗恩病、II型糖尿病、食管癌、喉部鳞状细胞癌、 骨髓的急性和慢性白血病、肺癌、恶性淋巴瘤、多发性硬化、卵巢癌、帕金森病、前列腺腺癌、 牛皮癣、类风湿性关节炎、肾细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、胃腺癌、甲状腺癌、睾丸癌、溃疡性结 肠炎或子宫腺癌。
[0476]在一些实施方案中，该疾病或病症包括癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自 身免疫性疾病或病症、心血管疾病或病症、神经疾病或病症、感染性疾病或疼痛。该癌症可 包括但不限于以下之一：急性淋巴母细胞性白血病；急性髓样白血病；肾上腺皮质癌;AIDS 相关癌症;AIDS相关淋巴瘤;肛门癌；阑尾癌;星形细胞瘤;非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤;基 底细胞癌;膀胱癌;脑干胶质瘤;脑瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横 纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母 细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚瘤和松果体母细胞瘤）； 乳腺癌;支气管肿瘤;伯基特淋巴瘤;原发部位不明癌;类癌瘤;原发部位不明肿瘤；中枢神 经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎瘤；宫颈癌;儿童期癌症;脊索瘤； 慢性淋巴细胞白血病；慢性髓性白血病;慢性骨髓增殖性病症；结肠癌；结直肠癌；颅咽管 瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤;子宫内膜癌；室管膜母细胞瘤;室管膜瘤;食管 癌;成感觉神经细胞瘤;尤因肉瘤;颅外生殖细胞瘤;性腺外生殖细胞瘤;肝外胆管癌;胆囊 癌；胃（胃部)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤(GIST);妊娠滋养细胞 瘤;神经胶质瘤;毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；眼内黑色素瘤;胰 岛细胞瘤;卡波西肉瘤；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌;唇癌;肝癌;肺癌;恶性 纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤;髓上皮瘤；黑色素瘤;梅克尔细胞癌;梅克尔细胞皮肤 癌；间皮瘤;隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌;多发性内分泌肿瘤综合征;多发性骨髓 瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤;蕈样肉芽肿;骨髓增生异常综合征;骨髓增生性肿瘤;鼻腔 癌;鼻咽癌;神经母细胞瘤;非霍奇金淋巴瘤;非黑色素瘤皮肤癌;非小细胞肺癌；口癌；口腔 癌；口咽癌;骨肉瘤;其它脑和脊髓肿瘤;卵巢癌;卵巢上皮癌;卵巢生殖细胞瘤;卵巢低恶性 潜在肿瘤;胰腺癌;乳头状瘤病；副鼻窦癌；甲状旁腺癌;盆腔癌；阴茎癌；咽癌；中度分化的 松果体实质肿瘤;松果体母细胞瘤;垂体瘤;浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤;胸膜肺母细胞瘤； 原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤;原发性肝细胞性肝癌;前列腺癌;直肠癌；肾癌；肾细胞 (肾)癌;肾细胞癌;呼吸道癌;视网膜母细胞瘤;横纹肌肉瘤;唾液腺癌症;塞扎里综合征;小 细胞肺癌;小肠癌;软组织肉瘤;鳞状细胞癌;鳞状颈癌；胃部（胃）癌;幕上原始神经外胚瘤； T细胞淋巴瘤;睾丸癌；咽喉癌;胸腺癌;胸腺瘤；甲状腺癌;移行细胞癌；肾盂和输尿管的移 行细胞癌;滋养细胞瘤;输尿管癌;尿道癌;子宫癌;子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；瓦尔登斯特 伦巨球蛋白血症或维尔姆斯瘤。恶变前状况可包括但不限于巴雷特食管。自身免疫性疾病 可包括但不限于炎性肠病（IBD)、克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎症、脉管炎、银 肩病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛 皮癣、系统性红斑狼疮(SLE )、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎、舍格伦病、肢端硬 皮综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥、原发性硬化性胆管炎或脓毒症中的一种。心血管疾病 可包括但不限于动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、 血管阻塞或血栓形成事件中的一种。神经疾病可以包括但不限于多发性硬化(MS)、帕金森 病(PD)、阿尔兹海默病(AD)、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、 痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管病、拉斯马森脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系 统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩侧索硬化、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、 传染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如中风）、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征中 的一种。疼痛可包括但不限于纤维肌痛、慢性神经性疼痛或周围神经性疼痛中的一种。感染 性疾病可包括但不限于细菌感染、病毒感染、酵母菌感染、惠普尔病、朊病毒病、硬化、耐甲 氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病或流行性感冒中的一 种。技术人员将会理解，本发明的寡核苷酸或多个寡核苷酸或方法可用于评价任意数目的 这些或其它相关的疾病和病症。
[0477] 在本发明的一些实施方案中，所述寡核苷酸或多个寡核苷酸及其使用方法对表征 某些疾病或疾病状态是有用的。按照需要，组装对表征各种疾病有用的寡核苷酸池，以创建 可用作对表征各种疾病有用的探针的主池。例如，本文提供的SEQ ID N0.510599-510763的 组合包含这样的池。技术人员还将会理解，还可以创建对表征特定疾病或病症有用的寡核 苷酸池。还可以根据需要对本文提供的序列进行修饰，只要其仍保持功能方面(例如，与各 种靶标结合或表征表型的能力）即可。例如，寡核苷酸可包含DNA或RNA、引入各种非天然核 苷酸、引入其它化学修饰或包含各种缺失或插入。这类修饰可有利于合成、稳定性、递送、标 记等，或者可能在实践中没有或几乎没有影响。在一些情况下，寡核苷酸中的一些核苷酸可 被置换，同时保持该寡核苷酸的功能方面。类似地，5'和3'侧翼区可被置换。在其它情况下， 可确定寡核苷酸的仅一部分引导其功能性，使得其它部分可被删除或置换。大量合成和修 饰核苷酸及多核苷酸的技术在此公开或是本领域已知的。
[0478] 在一个实施方案中，该疾病或病症包括乳腺癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或 多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510559-510598中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、25、30个或至少40个。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、 插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0479] 在另一实施方案中，该疾病或病症包括阿尔兹海默病，并且对其表征有用的寡核 苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510604、510605、510608、510609、510612、 510614、510629、510632、510633、510634、510641、510642、510643、510646、510648、510649、 510651、510652、510653、510655、510661、510667、510673、510675、510676、510677、510678、 510679、510681、510683、510685、510687、510688、510690、510694、510696、510702、510707、 510709、510726、510727、510728、510729、510730、510731、510732、510737、510740、510748、 510749、510751、510752、510754、510756、510757、510758、510761和 510762中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。在相关的 实施方案中，该疾病或病症包括阿尔兹海默病，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核 苷酸包含SEQ ID Ν0·510599、510601、510603、510606、510608、510609、510611、510613、 510614、510615、510619、510621、510625、510628、510629、510630、510632、510634、510635、 510636、510637、510644、510647、510648、510651、510652、510654、510657、510665、510666、 510667、510668、510677、510678、510679、510687、510692、510693、510696、510698、510699、 510701、510702、510707、510708、510710、510713、510716、510725、510726、510728、510731、 510732、510733、510734、510736、510741、510748、510749、510755、510757、510758、510761 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、 45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该 寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0480] 该疾病或病症可包括支气管哮喘，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸 包含SEQ ID Ν0·510601、510614、510619、510623、510627、510631、510633、510635、510647、 510655、510656、510660、510672、510689、510690、510693、510698、510701、510702、510707、 510709、 510710、510713、510720、510723、510724、510726、510728、510729、510730、510731、 510734、510735、510738、510743、510744、510745、510746、510748、510749、510750、510751、 510752、510754、510755、510757、510758、510759、510760、510761和 510762中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。该疾病或 病症还可包括支气管哮喘，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID NO·510600、510608、510609、510610、510611、510617、510619、510622、510631、510632、 510634、510635、510637、510642、510643、510644、510652、510655、510657、510658、510665、 510668、510673、510675、510676、510677、510678、510679、510683、510691、510701、510703、 510704、510706、510708、510709、510714、510725、510736、510737、510740、510741、510742 和 510756中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、 45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该 寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0481] 在一些实施方案中，该疾病或病症包括膀胱移行细胞癌，并且对其表征有用的寡 核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510607、510619、510623、510631、510632、510635、 510641、510642、510647、510656、510657、510658、510659、510673、510674、510683、510686、 510693、510695、510701、510702、510707、510708、510711、510716、510722、510725、510726、 510728、510731、510734、510737、510744、510748、510749、510751、510752、510753、510756、 510757、510758、510761和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、 置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0482] 在另一个实施方案中，该疾病或病症包括巨细胞破成骨细胞瘤，并且对其表征有 用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510612、510620、510635、510637、510641、 510644、510648、510658、510662、510663、510667、510668、510670、510676、510678、510679、 510682、510683、510685、510686、510699、510708、510712、510722、510737和510753中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。 寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能 方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0483] 该疾病或病症可包括脑瘤，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含 SEQ ID Ν0.510607、510619、510624、510628、510639、510641、510645、510647、510648、 510655、510657、510665、510668、510673、510674、510689、510695、510698、510699、510705、 510710、 510711、510712、510713、510716、510734、510737、510738 和 510762中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸 可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整 体或部分上得到增强或保持即可。
[0484] 在另一实施方案中，该疾病或病症包括结直肠腺癌，并且对其表征有用的寡核苷 酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510603、510607、510611、510616、510618、510619、 510623、510624、510641、510644、510646、510647、510655、510656、510672、510673、510690、 510693、510695、510698、510701、510702、510709、510711、510714、510716、510719、510723、 510724、510725、510726、510730、510731、510734、510735、510737、510738、510743、510744、 510748、510749、510751、510752、510754、510755、510757、510758、510760、510761、510762 和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、 45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该 寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0485] 在又一实施方案中，该疾病或病症包括慢性阻塞性肺疾病(C0PD)，并且对其表征 有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510604、510608、510609、510612、510614、 510616、510619、510620、510629、510634、510637、510640、510647、510649、510653、510661、 510666、510667、510669、510673、510678、510682、510689、510690、510701、510707、510715、 510723、510727、510728、510749、510754、510755、510757、510758、510762和510763中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。 在相关的实施方案中，该疾病或病症包括慢性阻塞性肺疾病(C0PD)，并且对其表征有用的 寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510601、510609、510611、510613、510620、 510634、510637、510647、510648、510654、510664、510668、510679、510694、510696、510698、 510699、510701、510705、510706、510710、510718、510734和 510741 中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入 各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部 分上得到增强或保持即可。
[0486] 该疾病或病症可以是宫颈鳞状细胞癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核 苷酸包含SEQ ID Ν0·510615、510619、510623、510626、510630、510632、510633、510635、 510638、510639、510641、510642、510644、510647、510650、510655、510656、510657、510661、 510673、510674、510677、510683、510688、510693、510695、510698、510711、510712、510714、 510716、510717、510722、510725、510729、510731、510734、510737、510743、510745、510747、 510753、510755、510756、510758、510759和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添 加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或 保持即可。
[0487] 该疾病或病症可包括急性心肌梗死(AM I)或急性心力衰竭，并且对其表征有用的 寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510607、510608、510613、510626、510629、 510631、510634、510635、510638、510639、510646、510648、510656、510667、510669、510671、 510672、510675、510682、510689、510698、510701、510707、510710、510715、510721、510723、 510727、510728、510730、510731、510734、510735、510743、510744、510748、510749、510751、 510752、510757、510758、510760、510761 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。在相关的实施方案中，该疾病或病 症包括急性心肌梗死(AMI)或急性心力衰竭，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷 酸包含SEQ ID NO.510599、510601、510606、510607、510608、510609、510611、510614、 510616、510619、510622、510624、510626、510635、510636、510637、510640、510641、510643、 510644、510648、510651、510665、510668、510669、510672、510675、510677、510678、510679、 510682、510692、510695、510696、510698、510699、510701、510703、510707、510710、510725、 510726、510728、510729、510730、510731、510733、510734、510736、510743、510750、510751、 510752、510755、510757、510758、510759、510760、510761和510762中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入 各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部 分上得到增强或保持即可。
[0488] 在一些实施方案中，该疾病或病症包括克罗恩病，并且对其表征有用的寡核苷酸 或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510602、510608、510611、510624、510644、510653、 510656、510659、510669、510671、510676、510686、510689、510690、510697、510698、510700、 510713、510727、510728、510729、510731、510734、510744、510751和 510757中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。在相关的 实施方案中，该疾病或病症包括克罗恩病，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸 包含SEQ ID Ν0·510600、510610、510611、510615、510618、510621、510623、510625、510626、 510628、 510631、510632、510635、510637、510638、510643、510647、510648、510649、510653、 510654、510655、510657、510658、510666、510667、510668、510672、510675、510677、510678、 510679、510680、510682、510684、510689、510691、510694、510696、510698、510701、510707、 510708、510709、510710、510713、510714、510715、510719、510725、510727、510728、510729、 510730、510731、510734、510736、510738、510743、510744、510748、510750、510751、510755、 510757、510758、510759、510760、510761、510762和510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入各种化 学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得 到增强或保持即可。
[0489] 该疾病或病症可包括II型糖尿病，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸 包含SEQ ID Ν0·510600、510604、510608、510610、510611、510614、510616、510620、510624、 510629、 510632、510634、510640、510649、510667、510669、510670、510671、510678、510685、 510700、510701、510702、510707、510709、510718、510721、510723、510726、510727、510728、 510729、510730、510731、510733、510735、510743、510748、510749、510752、510754、510755、 510757、510758、510760、510761、510762和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。相关地，该疾病或病症可包括II型 糖尿病，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510613、510632、 510635、510636、510641、510645、510647、510648、510654、510660、510664、510667、510668、 510670、510675、510684、510691、510695、510696、510706、510710、510734和510749中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。 寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能 方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0490] 在一些实施方案中，该疾病或病症包括食管癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或 多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510602、510619、510623、510632、510635、510638、510641、 510644、510653、510656、510661、510671、510682、510689、510693、510698、510714、510722、 510725、510731、510734、510738、510753 和 510761 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添 加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或 保持即可。
[0491] 在另一实施方案中，该疾病或病症包括喉部鳞状细胞癌，并且对其表征有用的寡 核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510605、510607、510612、510614、510619、510623、 510632、510635、510641、510642、510655、510656、510657、510659、510661、510668、510673、 510674、510689、510690、510693、510695、510698、510708、510712、510732、510734、510737、 510738、510745、510747、510753 和 510755中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺 失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即 可。
[0492] 在又一实施方案中，该疾病或病症包括骨髓的急性或慢性白血病，并且对其表征 有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510605、510607、510610、510612、 510628、510631、510633、510641、510644、510650、510664、510670、510673、510674、510675、 510681、510684、510685、510686、510701、510711、510712、510717、510718、510719、510720、 510721、510724、510729、510732、510739、510740、510743、510745、510746、510747、510752、 510754 和 510763 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、 30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰， 只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0493] 在又一实施方案中，该疾病或病症包括肺癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或多 个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510604、510626、510628、510631、510633、510635、510649、 510650、510654、510668、510672、510674、510677、510699、510701、510702、510710、510712、 510715、510717、510719、510720、510721、510723、510724、510726、510727、510733、510735、 510738、510743、510744、510745、510746、510747、510750、510751、510754、510755、510758、 510760 和 510763 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、 30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰， 只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0494] 该疾病或病症可包括恶性淋巴瘤，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸 包含SEQ ID Ν0·510601、510611、510618、510623、510624、510631、510632、510636、510638、 510641、510644、510645、510647、510656、510660、510662、510672、510673、510675、510690、 510693、510701、510702、510707、510708、510713、510717、510719、510721、510723、510724、 510725、510726、510728、510729、510730、510731、510734、510735、510737、510743、510744、 510749、510751、510752、510754、510755、510756、510757、510758、510760、510762和510763 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或 全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸 的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0495] 该疾病或病症还可包括多发性硬化，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷 酸包含SEQ ID N0 · 510607、510612、510620、510646、510653、510655、510661、510663、 510669、510675、510682、510685、510686、510690、510699、510701、510710、510713、510731、 510738、510747、510758 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。相关地，该疾病或病症可包括多发性硬化，并且对 其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID N0.510599、510604、510609、510610、 510613、510617、510618、510622、510632、510635、510647、510670、510675、510677、510687、 510690、510692、510695、510701、510706、510708、510731和510733中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入 各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部 分上得到增强或保持即可。
[0496] 在一个实施方案中，该疾病或病症包括卵巢癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或 多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510618、510626、510628、510633、510638、510641、510642、 510643、510645、510646、510647、510650、510652、510658、510665、510666、510673、510674、 510677、510682、510683、510689、510705、510707、510712、510717、510722、510724、510729、 510732、510735、510737、510745、510746、510747、510753和510756中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入 各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部 分上得到增强或保持即可。
[0497] 在另一实施方案中，该疾病或病症包括帕金森病，并且对其表征有用的寡核苷酸 或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510601、510604、510608、510609、510612、510614、 510624、510631、510633、510634、510640、510641、510642、510649、510650、510651、510653、 510667、510673、510675、510676、510677、510683、510686、510689、510694、510700、510703、 510704、510705、510706、510707、510709、510713、510715、510721、510723、510724、510726、 510727、510729、510730、510731、510732、510734、510735、510736、510737、510739、510740、 510741、510742、510744、510745、510746、510747、510748、510751、510752、510754、510756、 510757、510758、510759、510760、510761 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。在相关的实施方案中，该疾病或病 症包括帕金森病，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0.510601、 510606、510608、510609、510610、510614、510616、510632、510634、510643、510644、510647、 510648、510654、510662、510664、510665、510667、510668、510670、510677、510678、510679、 510687、510692、510696、510698、510699、510701、510703、510704、510706、510708、510710、 510722、510727、510734、510736、510741、510742、510753和510756中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入 各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部 分上得到增强或保持即可。
[0498] 在又一个实施方案中，该疾病或病症包括前列腺腺癌，并且对其表征有用的寡核 苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510603、510607、510619、510623、510624、 510628、510641、510642、510644、510647、510650、510655、510656、510657、510669、510673、 510674、510677、510684、510688、510689、510690、510695、510698、510701、510709、510710、 510718、510726、510734、510737、510738、510739、510757 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。寡核苷酸可引入 各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部 分上得到增强或保持即可。
[0499] 在又一实施方案中，该疾病或病症包括牛皮癣，并且对其表征有用的寡核苷酸或 多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510601、510608、510609、510611、510614、510620、 510624、510626、510631、510633、510634、510635、510638、510647、510649、510650、510653、 510656、510665、510666、510667、510669、510672、510674、510675、510680、510685、510689、 510698、510702、510707、510711、510712、510715、510717、510719、510720、510721、510723、 510724、510726、510727、510728、510729、510730、510731、510734、510735、510743、510744、 510745、510746、510747、510748、510749、510750、510751、510752、510754、510755、510757、 510758、510759、510760、510761、510762和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添 加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或 保持即可。
[0500] 该疾病或病症可以是牛皮癣，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含 SEQ ID Ν0.510600、510601、510604、510613、510621、510627、510637、510641、510644、 510648、510650、510652、510663、510667、510668、510676、510680、510681、510699、510701、 510703、510705、510709、510710、510722、510734、510739、510750 和 510753中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸 可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整 体或部分上得到增强或保持即可。
[0501] 该疾病或病症还可以是类风湿性关节炎，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡 核苷酸包含SEQ ID Ν0·510599、510603、510604、510607、510608、510609、510614、510616、 510622、 510625、510627、510629、510630、510634、510635、510636、510637、510640、510642、 510646、510649、510650、510651、510653、510656、510664、510665、510667、510671、510675、 510677、510678、510679、510682、510689、510699、510707、510726、510727、510728、510729、 510731、510733、510737、510738、510748、510755、510758、510761和 510762中的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸 可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整 体或部分上得到增强或保持即可。
[0502] 在一些实施方案中，该疾病或病症包括类风湿性关节炎，并且对其表征有用的寡 核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510599、510601、510603、510604、510606、510607、 510608、510609、510610、510611、510612、510613、510614、510616、510617、510618、510622、 510623、 510625、510629、510630、510634、510635、510636、510637、510638、510639、510640、 510641、510643、510644、510645、510646、510648、510649、510651、510652、510653、510654、 510658、510662、510663、510664、510665、510666、510667、510668、510669、510671、510673、 510677、510678、510679、510682、510685、510692、510696、510697、510698、510699、510701、 510703、 510710、510716、510722、510725、510726、510727、510730、510733、510734、510738、 510741、510743、510753、510755 和 510757中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺 失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即 可。
[0503] 在另一实施方案中，该疾病或病症包括肾细胞癌，并且对其表征有用的寡核苷酸 或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510603、510604、510606、510608、510614、510616、 510622、510628、510629、510630、510632、510634、510635、510640、510644、510645、510646、 510652、510653、510656、510664、510665、510666、510667、510671、510675、510677、510683、 510685、510687、510690、510701、510722、510726、510728、510729、510730、510731、510732、 510733、510734、510738、510748、510749、510752、510753、510758、510761和510762中的至 少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或全部。 寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能 方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0504] 在又一实施方案中，该疾病或病症包括皮肤鳞状细胞癌，并且对其表征有用的寡 核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510618、510622、510626、510639、510641、510642、 510650、510658、510673、510674、510683、510696、510708、510712、510717、510720、510722、 510723、510724、510727、510729、510743、510745、510746、510747、510752、510753、510754、 510755、510756、510759、510761和 510763中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺 失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即 可。
[0505] 在多个实施方案中，该疾病或病症包括胃腺癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或 多个寡核苷酸包含SEQ ID Ν0·510600、510604、510608、510609、510612、510626、510631、 510632、510634、510639、510653、510658、510663、510667、510681、510689、510692、510693、 510696、510698、510699、510705、510711、510715、510717、510719、510723、510725、510729、 510731、510734、510735、510736、510743、510746、510748、510751、510754、510757、510760、 510762 和 510763 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、 30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰， 只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0506] 该疾病或病症可包括甲状腺癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包 含SEQ ID Ν0·510602、510603、510614、510626、510638、510641、510644、510646、510653、 510658、510659、510661、510662、510674、510689、510693、510695、510698、510699、510701、 510704、 510705、510708、510717、510718、510722、510727、510731、510734、510736、510739、 510740、510741、510747、510753 和 510755中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺 失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即 可。
[0507] 该疾病或病症还可包括睾丸癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包 含SEQ ID Ν0·510600、510603、510607、510615、510616、510618、510619、510621、510622、 510623、 510624、510630、510636、510637、510641、510644、510645、510647、510650、510654、 510655、510656、510657、510659、510662、510665、510670、510673、510674、510681、510684、 510685、510687、510688、510689、510690、510692、510693、510695、510696、510698、510700、 510701、510704、510707、510712、510713、510717、510718、510726、510734、510737、510738、 510739、510740、510742、510747、510756 和 510757中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添 加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或 保持即可。
[0508] 该疾病或病症可以是溃疡性结肠炎，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷 酸包含SEQ ID Ν0.510599、510607、510611、510612、510616、510620、510621、510622、 510624、 510626、510632、510633、510636、510646、510655、510659、510672、510673、510675、 510676、510677、510682、510684、510691、510692、510702、510703、510704、510705、510706、 510707、510709、510710、510715、510721、510723、510724、510728、510729、510730、510731、 510735、510736、510737、510739、510740、510741、510743、510744、510748、510751、510752、 510754、510757、510758、510759、510760、510761和510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。在相关的实施方案中，该 疾病或病症包括溃疡性结肠炎，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含SEQ ID NO·510610、510611、510612、510619、510622、510623、510634、510635、510641、510647、 510648、510654、510657、510664、510668、510670、510671、510676、510677、510678、510679、 510689、510691、510696、510701、510703、510704、510710、510722、510734、510742和510753 中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50 个或 全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸 的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即可。
[0509] 该疾病或病症还可以是子宫腺癌，并且对其表征有用的寡核苷酸或多个寡核苷酸 包含SEQ ID Ν0·510601、510612、510621、510626、510637、510641、510644、510650、510653、 510669、510675、510684、510686、510687、510696、510714、510717、510722、510739、510743、 510745、510746、510753、510755 和 510762中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50个或全部。寡核苷酸可引入各种化学修饰、添加、缺 失、插入、置换或其它修饰，只要该寡核苷酸的功能方面在整体或部分上得到增强或保持即 可。
[0510] 在一方面，本发明提供一种试剂盒，其包含用于实施本文中提供的本发明方法的 试剂。在类似的方面，本发明考虑试剂用于实施本文提供的本发明方法的用途。在实施方案 中，该试剂包含寡核苷酸或多个寡核苷酸。该寡核苷酸或多个寡核苷酸可以是本文提供的 那些。该试剂可包含多种其它有用的组分，包括但不限于以下的一种或多种:a)被配置用于 分离微囊泡的试剂，任选地其中至少一种被配置用于分离微囊泡的试剂包含针对微囊泡抗 原、柱子、基底、过滤单元、聚合物、聚乙二醇、PEG4000、PEG8000、颗粒或珠子的结合剂;b)至 少一种被配置充当引物或探针以供扩增、测序、杂交或检测该寡核苷酸或多个寡核苷酸的 寡核苷酸;和C)被配置用于从样品中去除一种或多种高丰度蛋白质的试剂，其中任选地该 一种或多种高丰度蛋白质包括白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白中的至少一种。
[0511] 优化的寡核苷酸文库构建
[0512] 如本文所述，通过针对一个或多个感兴趣的靶标而筛选或富集输入寡核苷酸文库 来生成单独的适体和寡核苷酸探针文库。该输入文库可被称为起始或原始(na'ive)寡核苷 酸文库，并可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、 800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、 50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、10 6、107、108、 109、101(3、10 11、1012、1013、1014、1015、10 16、1017个或至少1018个不同的寡核苷酸序列。该文库 通常在5'和/或3'端上包含已知序列，以促进引物结合、探针结合、杂交、扩增、测序等。这些 侧翼区可围绕包含随机生成的序列的部分，该随机生成的序列创建文库多样性。本发明提 供了增强用于文库构建的侧翼区和可变区两者的寡核苷酸序列。这样的构建体可增强原始 文库的任何所需特征，以在筛选和富集应用中使用，其包括但不限于合成、多样性和序列确 定。可以单独或一起使用增强的本发明的侧翼区和可变区。关于说明性的实例参见本文的 实施例19和23。
[0513] 在一方面，本发明提供了一种组合物，其包含用于评估包含至少两个子集寡核苷 酸文库的细胞或细胞外囊泡样品的输入寡核苷酸文库，以生成输入寡核苷酸文库，其中所 述至少两个子集寡核苷酸文库中的至少一个被制备为具有总G和C含量不等于50%的核苷 酸量。例如，总G和C含量可以小于50 %，或者总G和C含量可以大于50%。在一个实施方案中， 至少一个子集文库被制备为具有大于50%的总G和C含量，并且另一个子集文库被制备为具 有小于50%的总G和C含量。在一个实施方案中，所述至少两个子集文库包含制备为G和C含 量分别为25%、50 %和75 %的三个子集文库。所述至少两个子集文库可以被制备为具有类 似于或等于表13中的至少两行的核苷酸的量。所述核苷酸根据需要可以由天然存在的核苷 酸或修饰的天然存在的核苷酸组成。所述核苷酸还可包含非天然存在的核苷酸。这样的输 入寡核苷酸文库在本文可被称为"GC"文库。所述GC文库可作为原始输入文库中的可变区而 生成，以用于进一步筛选或富集的目的。参见实施例19。
[0514]在相关的方面，本发明提供一种生成本发明的输入寡核苷酸文库的方法，其包括 使至少两个子集寡核苷酸文库接触，以生成该输入寡核苷酸文库。可采用本文所述的方法 对输入寡核苷酸文库进行筛选或富集，以提供各种适体或寡核苷酸探针文库。
[0515]在一个方面，本发明提供一种寡核苷酸，其具有包含5'转座子衔接子区域、包含0 个或更多个位于该转座子衔接子区域5'侧的核苷酸的偏移区域、位于该偏移区域5'侧的可 变区域以及位于该可变区域5'侧的左侧引物区域的序列。在相关的方面，本发明提供多个 寡核苷酸，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、 800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、 50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、10 6、107、108、 109、101(3、10 11、1012、1013、1014、1015、10 16、1017个或至少1018个不同的寡核苷酸序列，其中每 一个寡核苷酸序列均包含5'转座子衔接子区域、包含0个或更多个位于该转座子衔接子区 域5'侧的核苷酸的偏移区域、位于该偏移区域5'侧的可变区域以及位于该可变区域5'侧的 左侧引物区域。这类寡核苷酸在此可被称为"平衡"寡核苷酸。参见实施例23。
[0516] 本发明的平衡寡核苷酸或多个平衡寡核苷酸可以是这样的:a)转座子衔接子区域 包含20-40个核苷酸;b)偏移区域包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸;c)可变区域包 含20-50个核苷酸；和/或d)左侧引物区域包含20-40核苷酸。在一些实施方案中，该平衡寡 核苷酸是这样的：a )转座子衔接子区域包含与序列5'_ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQIDN0·510764)至少约约50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同源的核苷酸序 列；b)偏移区域包含与以下序列中的至少一个至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核 苷酸：5'-T(SEQ ID N0.510765)、5'-CT(SEQ ID N0.510766)和 5'-ACT(SEQ ID 吣.510767);。）可变区域包含10、11、12、13、14、15，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或多 于50个核苷酸；和/或d)左侧引物区域包含与选自SEQ ID NO. 510768和510769的序列至少 约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%同源的核苷酸序列。该可变区域可包含如本文提供的"GC"文库序列。
[0517] 在一方面，本发明提供一种鉴定适体的方法，其包括使用平衡寡核苷酸或多个寡 核苷酸作为天然输入文库进行选择或富集过程。本文中描述或提供了这样的选择或富集过 程，包括但不限于SELEX及其变化形式。在一个实施方案中，该选择过程包括至少一轮针对 感兴趣的靶标的阳性选择，以及任选的至少一轮针对除了该感兴趣的靶标之外的靶标的阴 性选择。
[0518] 在另一方面，本发明提供一种方法，其包括使平衡寡核苷酸或多个平衡寡核苷酸 与样品接触，并检测该寡核苷酸或多个寡核苷酸与样品中靶标的结合的存在或水平。该样 品可包括生物样品，如有机样品、无机样品、组织、细胞培养物、体液、血液、血清、细胞、微囊 泡、蛋白质复合物、脂质复合物、碳水化合物，或其任意组合、部分或变化形式。该靶标可以 是任何有用的靶标，包括但不限于细胞、细胞器、蛋白质复合物、脂蛋白、碳水化合物、微囊 泡、膜片段、小分子、重金属、毒素或药物。
[0519]在相关的方面，本发明提供一种方法，其包括:a)使包含微囊泡的生物样品与寡核 苷酸探针文库接触，其中该寡核苷酸探针文库包含平衡寡核苷酸或多个平衡寡核苷酸;b) 鉴定与微囊泡的至少一部分结合的寡核苷酸；以及c)根据鉴定出的寡核苷酸谱来表征该样 品。
[0520]在另一个相关的方面，本发明提供一种方法，其包括:a)使样品与包含至少106、 寡核苷酸的寡核苷酸探针文库接触，以在溶液中形成混合物，其中该寡核苷酸能够结合样 品中的多个实体从而形成复合物，其中该寡核苷酸探针文库包含平衡寡核苷酸或多个平衡 寡核苷酸;b)将由混合物在步骤(a)中形成的复合物进行分区；以及c)检测在步骤(b)中分 区的复合物中存在的寡核苷酸，以对样品鉴定寡核苷酸谱。在相关的方面，本发明提供一种 表征疾病或病症的方法，其包括:a)使生物测试样品与平衡寡核苷酸或多个平衡寡核苷酸 接触;b)检测在步骤(a)中、在平衡寡核苷酸或多个寡核苷酸与生物测试样品中的靶标之间 形成的复合物的存在或水平；以及C)将在步骤(b)中检测到的存在或水平与来自生物对照 样品的参考水平进行比较，从而表征该疾病或病症。检测步骤可包括对复合物中的全部或 部分寡核苷酸进行测序，对复合物中的全部或部分寡核苷酸进行扩增，和/或使复合物中的 全部或部分寡核苷酸与阵列杂交。在一些实施方案中，该测序包括高通量测序。
[0521] 在包括使用平衡寡核苷酸或多个寡核苷酸的本发明方法中，生物测试样品和生物 对照样品可各自包含组织样品、细胞培养物或生物流体。在一些实施方案中，该生物流体包 含体液。在本发明的方法中有用的体液可包含外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液 (CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考 珀液或射精前液、女性射出液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋 巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰 液、窦腔灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或脐带血。在一些优选的实施方案中，该体液包 含血液、血清或血浆。该生物流体可包含微囊泡。在这样的情况下，可在寡核苷酸或多个寡 核苷酸与至少一个微囊泡之间形成复合物。生物测试样品和生物对照样品还可包含分离的 微囊泡，其中任选地该微囊泡采用色谱法、过滤、超滤、离心、超速离心、流式细胞术、亲和捕 获(例如，捕获到平面、柱子或珠子上）、聚合物沉淀和使用微流体中的至少一种来分离。囊 泡也可在与寡核苷酸或多个寡核苷酸接触后分离。
[0522] 在包括使用平衡寡核苷酸或多个寡核苷酸的本发明方法的实施方案中，该寡核苷 酸或多个寡核苷酸与多肽或其片段结合。该多肽或其片段可以是可溶的或膜结合的，其中 任选地该膜包括微囊泡膜。该膜也可来自细胞，或囊泡的细胞的片段。在一些实施方案中， 该多肽或其片段包含表3或表4中的生物标志物。例如，该多肽或其片段可以是如表3中的一 般囊泡标志物，或是如表4中的组织相关或疾病相关的标志物。该寡核苷酸或多个寡核苷酸 可与生物样品中的微囊泡表面抗原结合。例如，该寡核苷酸或多个寡核苷酸可针对微囊泡 从天然文库中富集。
[0523] 通过本文提供的寡核苷酸、多个寡核苷酸或包括使用平衡寡核苷酸或多个寡核苷 酸的方法所检测的疾病或病症可包括任何合适的感兴趣的疾病或病症。例如，该疾病或病 症可包括癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或病症、心血管疾病或病 症、神经疾病或病症、感染性疾病和/或疼痛。例如，见本文中的"表型"部分。该疾病或病症 可包括但不限于乳腺癌、阿尔茨海默病、支气管哮喘、膀胱移行细胞癌、巨细胞破成骨细胞 瘤、脑瘤、结直肠腺癌、慢性阻塞性肺疾病(C0PD)、宫颈鳞状细胞癌、急性心肌梗死(AMI)/急 性心力衰竭、克罗恩病、II型糖尿病、食管癌、喉部鳞状细胞癌、骨髓的急性和慢性白血病、 肺癌、恶性淋巴瘤、多发性硬化、卵巢癌、帕金森病、前列腺腺癌、牛皮癣、类风湿性关节炎、 肾细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、胃腺癌、甲状腺癌、睾丸癌、溃疡性结肠炎或子宫腺癌。 本发明还提供一种试剂盒，其包含用于实施本文方法的试剂，且还提供该试剂用于实 施本发明的与GC文库或平衡寡核苷酸有关的方法的用途。例如，该试剂可包含一个或多个 寡核苷酸，该寡核苷酸具有来源于GC文库和/或平衡寡核苷酸文库的序列。该试剂还可包含 其它本文公开的有用的组分，包括但不限于以下至少一种:a)被配置用于分离微囊泡的试 剂，任选地其中至少一种被配置用于分离微囊泡的试剂包含针对微囊泡抗原、柱子、基底、 过滤单元、聚合物、聚乙二醇、PEG4000、PEG8000、颗粒或珠子的结合剂;b)至少一种被配置 充当引物或探针以扩增、测序、杂交或检测该寡核苷酸或多个寡核苷酸的寡核苷酸;和c)被 配置用于从样品中去除一种或多种高丰度蛋白质的试剂，其中任选地该一种或多种高丰度 蛋白质包含白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白中的至少一种。 试剂盒
[0524] 本发明还提供一种包含用于实施本发明的方法的一种或多种试剂的试剂盒。例 如，所述一种或多种试剂可以是一种或多种适体、缓冲液、封闭剂、酶或它们的组合。所述一 种或多种试剂可包含用于实施本方法的任何有用的试剂，包括但不限于适体文库、诸如微 珠或平面阵列或孔的基底、用于生物标志物和/或微囊体分离(例如，经由色谱法、过滤、超 滤、离心、超速离心、流式细胞术、亲和捕获(例如，捕获到平面表面、柱或珠子上）、聚合物沉 淀和使用微流体）的试剂、针对特定靶标的适体、促进生物标志物/微囊体群体的检测的适 体池、诸如用于核酸测序或扩增的引物的试剂、用于核酸杂交的阵列、可检测的标记、溶剂 或缓冲液等、各种连接体、各种分析组分、封闭剂等。所述一种或多种试剂还可包含由本发 明提供的各种组合物。在一个实施方案中，所述一种或多种试剂包含一种或多种本发明的 适体。所述一种或多种试剂可包含基底，诸如平面基底、柱或珠子。所述试剂盒可含有使用 所述一种或多种试剂进行各种分析的说明书。
[0525] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含本文提供的适体或组合物。所述试剂盒可被 配置为实施本文提供的方法。例如，所述试剂盒可包含本发明的适体、基底，或本发明的适 体和基底两者。
[0526] 在一个实施方案中，所述试剂盒被配置为进行分析。例如，所述试剂盒可含有用于 检测生物样品中生物实体的存在或水平的一种或多种试剂和说明书。在这类情况下，所述 试剂盒可包含针对感兴趣的生物实体的一种或多种结合剂。所述一种或多种结合剂可与基 底结合。
[0527] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含提供生物样品的特定适体谱的一组适体。适 体谱可包括但不限于可用来表征特定疾病或病症的谱。例如，所述疾病或病症可以是增生 性疾病或病症，包括但不限于癌症。所述疾病或病症可选自表16中的疾病或病症。 实施例 实施例1:结合靶标的DNA寡核苷酸的鉴定
[0528] 靶标附着至固体基底，诸如载玻片或磁珠。对于磁珠制备，珠子与浓度范围为0.1 至lmg/ml的革巴蛋白一起温育。根据由特定的珠子制造商提供的化学反应，使革巴蛋白缀合至 珠子。通常，这包括经由N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)官能团过程的偶联。与靶标缀合后，未占用 的NHS基团成为无活性的。
[0529] 向容纳有稳定化的靶标的容器中添加随机生成的某个长度如32个碱基对长的寡 核苷酸(oligos)。每一个寡核苷酸在5'或3'端处含有6个胸腺啼啶核苷酸（"胸腺啼啶尾"）， 以及与胸腺嘧啶尾缀合的单分子生物素。可以添加额外的生物素分子。每一个寡核苷酸还 被制备为在每个末端上具有对应于PCR扩增引物（"引物尾"）的一段短核苷酸(5-10个碱基 对长）。所述序列显示不存在胸腺嘧啶尾或引物尾。
[0530]寡核苷酸与靶标在500微升反应体积中，在37°C的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，在指 定的温度和时间下一起温育。
[0531]靶标/寡核苷酸组合用缓冲液洗涤1-10次，以去除未结合的寡核苷酸。洗涤的次数 随着该过程的每一次重复而增加(如下所述）。
[0532] 与靶标结合的寡核苷酸使用含有离液剂如7M尿素或1 % SDS的缓冲液进行洗脱，并 使用生物素标签收集。使用对添加至寡核苷酸的随机化区的5'和3'序列具有特异性的引 物，通过聚合酶链反应扩增寡核苷酸。向靶标再次添加扩增的寡核苷酸，以用于另一轮选 择。该过程根据需要进行重复，以观察结合富集。 实施例2:竞争性分析
[0533] 如以上实施例1所述进行该过程，不同之处在于使用针对靶标的已知配体如抗体 来洗脱结合的寡核苷酸物质（不使用离液剂或同时使用离液剂）。在此情况下，使用来自 Santa Cruz Biotechnology，Inc.的抗EpCAM抗体从祀标EpCAM上洗脱适体。 实施例3:筛选和亲和力分析
[0534] 上述结合分析生成的所有适体均使用高通量测序平台进行测序，诸如来自Life Technologies的Ion Torrent：
[0535]文库制备-在根据制造商方案连接条形码与衔接子序列(Life Technologies)之 后合并适体。简而言之，使用以下步骤制备适体的等摩尔池:针对最终的文库浓度，适当地 采用Bioanalyzer™仪器和Agilent DNA 1000试剂盒或Agilent高灵敏度试剂盒分析每一个 文库的等份。使用商购可得的软件(Agilent)测定每一个扩增子文库的摩尔浓度(nmol/L)。
[0536] 以最高的可能浓度制备文库的等摩尔池。
[0537] 计算合并的文库原液的合并浓度。
[0538] 使用以下方程确定文库池的模板稀释系数:模板稀释系数=(文库池浓度[PM])/ 26pM)〇
[0539] 模板制备-使用新鲜稀释的文库，使用常规测序方案对以上提供的结合分析产生 的适体池进行测序。可以根据需要使用高通量(NextGen)测序方法。
[0540] 基于直接的或竞争性分析选择二十种适体，以评估与EpCAM的结合(如上所述）。
[0541] 亲和力测量-随后使用体外结合平台测试这二十种适体的结合亲和力。可使用 T200控制软件，用SPR例如Biacore SPR机器进行该步骤，如下：
[0542] 将抗原稀释至32nM的浓度。
[0543]制备动力学所需的稀释液，起始于32nM，制备抗原的两倍稀释液，至0.5nM。
[0544] Biacore 200控制软件采用以下条件进行编程:溶液:HBS-EP+缓冲液;循环数:3; 接触时间：120s ;流速：30μ1 /min;解离时间：300s ;溶液：甘氨酸-HC1 pH2.5 ;接触时间： 120s;流速:20μ1/πΰη;稳定时间段:0s。随后使用以上的SPR分析或者评估适体的所需功能 的备选体外分析来测量这些适体的结合亲和力。
[0545] 图5显示适体BTX176881(SEQ ID N0:3)的SPR数据。该图包括指示浓度（nM)的 EpCAM蛋白质的生物素化适体的1:1拟合模型的缔合图和解离图。表5显示了由图5中示出的 SPR测量结果计算的Kd值。此外，表5显示了BTX187269(SEQ ID N0:6)和适体4(SEQ ID NO. 1)的SPR数据和计算的Kd值。 表5:由SPR测量结果计算的KD值*对于单一参考方法通过全局拟合获得的Kd、R2和Chi2值。 实施例4:基序分析
[0546]按照实施例3的方法鉴定感兴趣的祀标的高亲和力适体。一旦鉴定了高亲和力适 体，随后使用软件程序分析其序列，以估计它的二维折叠结构。用于基序鉴定的众所周知的 序列比对程序和算法可用来鉴定序列基序，并减少甚至序列的大数据集的维数。而且，软件 程序如Vienna和mfold是适体选择领域中的技术人员所公知的，并且可用来在二级结构基 序(共有的形状）的基础上对序列进一步分组。参见图3A和图3B的示例结构预测。共有的二 级结构当然不能保证有完全相同的三维结构。因此，适体的"湿性实验室(wet-lab)"验证仍 然是有用的，因为迄今没有一组计算机模拟工具能够完全预测一组适体候选物之中的最优 适体。 实施例5:基于微囊泡的适体消减试验
[0547]使用以下方法之一从正常血浆(例如，从没有癌症的个体）中分离循环微囊泡：1) 使用ExoQuick试剂根据制造商的方案进行分离;2)超速离心，包括以50，000至150，000g旋 转1至20个小时，随后将沉淀物重悬于PBS中；3)使用来自Life Technologies的TEXIS试剂 根据制造商的方案进行分离;和4)过滤方法。更详细地描述过滤方法如下：
[0548] 将注射器和过滤器（1 ·2μηι Acrodisc Syringe Filter Versapor Membrane Non-Pyrogenic Ref:4190，Pall Life Sciences)放置在未使用的7ml 150K MWC0柱上（Pierce 浓缩器，150K MWC0(分子量截止值）7ml。部件编号：89922)。用在无菌分子级水中制备的 5.2ml经过滤的IX PBS装入注射器的开放端。
[0549] 将患者血浆(900_1000μ1)移至注射器中的PBS中，吸移混合两次。
[0550] 将血浆过滤到7mll50K MWC0柱中。[0551 ]在20°C(16°C至24°C)下将7mll50K MWC0柱以2000xg离心 1 小时。
[0552]旋转1小时后，将溢流倒入10%漂白剂中，丢弃。
[0553] 目视检查样品体积。如果血浆浓缩液在浓缩器管的8.5ml刻度以上，则在2000xg、 20 °C (16 °C至24 °C )下以10分钟的增量继续离心血浆样品，每次离心后检查体积，直到血浆 浓缩液为8.0至8.5ml。
[0554] 在柱上缓慢吸移混合至少6次，并调整移液器以确定血浆浓缩液体积。如果体积在 100μ1与目标体积之间，则转移血浆浓缩液至先前标记的共聚物1.5ml管中。如果体积仍然 大于目标体积，则重复以上离心步骤。
[0555] 将在无菌分子级水中制备的经过滤的约45ml的IX PBS倒入50ml圆锥管，以待在下 一步中使用。
[0556] 添加适量的经过滤的IX PBS，以重建样品至目标体积。
[0557] 使用任何分离方法产生的微囊泡将包括囊泡类型的混合物，并且将会是不同的大 小，可能的例外是超速离心方法，该方法可能有利于分离外来体大小的颗粒。
[0558] 随机生成的寡核苷酸（如以上实施例1中所述产生的）与分离的正常囊泡在PBS中 在室温或4°C下一起温育过夜。
[0559] 通过以50,000至150,00(^离心囊泡1至20个小时，并收集上清液，来分离不与这 些囊泡结合的适体。
[0560] 通过使混合物流经含有链霉亲和素涂覆的珠子的柱，从上清液中收集适体寡核苷 酸。随后将这些适体添加至从患病患者中分离出的囊泡中（使用如上相同的方法），并在PBS 中在室温或4°C下温育过夜。[0561 ] 随后将囊泡以50,000至150,00(^8离心1至20个小时，然后丢弃上清液。将囊泡重 悬于PBS中，并使用SDS或一些类似的去污剂裂解。
[0562] 随后通过使裂解混合物流经链霉亲和素涂覆的珠子的柱而捕获适体。然后，分离 的适体经历一轮PCR以扩增产物。
[0563] 该过程随后重复一组次数，例如，5次。剩余的适体池已耗尽识别发现于"正常"血 浆中的微囊泡的适体。因此，该方法可用来在该池中富集识别癌症囊泡的适体。参见图4。 实施例6:使用抗EpCAM适体检测微囊泡
[0564] 适体可用作结合剂以检测生物标志物。在该实施例中，适体用作结合剂以检测与 微囊泡相关联的EpCAM蛋白质。
[0565] 图6示出了使用抗EpCAM适体(适体4;SEQ ID NO. 1)来检测血浆样品中的微囊泡群 体。从三个患有前列腺癌的男性和三个没有前列腺癌的男性(被称为对照或正常）中获得血 衆样品。针对以下感兴趣的微囊泡表面蛋白质抗原的抗体缀合至微珠 （Luminex Corp， AuStin，TX):图6A)EGFR(表皮生长因子受体）；图6B)PBP(前列腺结合蛋白；也称为PEBPl(磷 脂酰乙醇胺结合蛋白1));图6C)EpCAM(上皮细胞粘附分子）；和图6D)KLK2(激肽释放酶相关 肽酶2)。使用珠子缀合的抗体捕获血浆样品中的微囊泡。荧光标记的适体4用作微珠分析中 的检测剂。图6显示了针对珠子捕获的和适体4检测的微囊泡的平均中位荧光值(MFI值）。每 张图单独地显示了三种癌症(C1-C3)和三个正常样品（N1-N3)。这些数据显示，前列腺癌样 品平均比正常样品具有更高水平的含有靶蛋白的微囊泡。 实施例7:适体的阴性和阳性选择
[0566] 适体可用于各种生物分析，包括依赖结合剂的许多类型的分析。例如，适体可代替 抗体而在基于免疫的分析中使用。该实施例提供了适体筛选方法，它鉴定在整个分析步骤 中不结合任何表面(基底、管、过滤器、珠子、其它抗原等)和特异性结合感兴趣的抗原的适 体。该分析依赖于阴性选择以去除结合最终分析的非靶标抗原组分的适体。该阴性选择之 后进行阳性选择以鉴定结合所需抗原的适体。
[0567]预备实验采用五个各具有1015个序列的DNA适体文库来完成，并且预扩增可变长度 (60、65、70、75、80-聚体)并进行链分离，使得正向链(非生物素化的）充当适体。进行多轮阴 性选择和阳性选择。在每一轮之前，PCR扩增回收的适体产物，并且使用标准方法进行链分 离。如下进行选择：
[0568] 阴性选择
[0569] 1.制备珠子阴性选择混合物:将1200个非磁珠与标准封闭剂一起温育20min。
[0570] 2.向具有4.5μ1各珠子混合物的PCR带管中添加50μ1的适体文库（总计5个文库）。 在550rpm搅拌下37°C温育2h。[0571 ] 3.用PBS-BN缓冲液预湿润过滤板（1.2ym，Millipore)。添加150μ1 PBS-BN。
[0572] 4.将样品从PCR带管中转移至过滤板，在550rpm搅拌下室温温育lh。
[0573] 5.使用真空歧管将溢流从过滤板中收集至收集(NBS)板中。
[0574] 6.根据需要浓缩并清洁样品以去除过量的材料。
[0575] 阴性选择过程重复高达6-7次。
[0576] 阳性选择
[0577]开始之前，使用本领域已知的条件，将感兴趣的蛋白质生物标志物(此处，SSX4、 SSX2、PBP、KLK2、SPDEF)缀合至所需的非磁性微珠。重组的纯化起始材料包括:来自NOVu S Biologicals(Littleton，CO，USA)的SPDEF重组蛋白，目录号H00025803-P01;来自Novus的 KLK2重组蛋白，目录号H00003817-P02;来自Novus的SSX2重组蛋白，目录号H00006757-P01; 来自Fitzgerald Industries International(Action，MA，USA)的PBP重组蛋白，目录号 30R-1382;来自 GenWay Biotech，Inc ·( San Diego，CA，USA)的SSX4重组蛋白，目录号GWB-E219AC〇
[0578] 1.珠子封闭：将所需数目的各珠子(8400x数目的适体文库(5)x超额因子（1.2))与 起始封闭剂一起温育20min。
[0579] 2.将50μ1的各适体文库样品混合至PCR带管，添加具有特定抗原的2.3μ1的珠子样 品。在550rpm搅拌下37°C温育2h。
[0580] 3.用？83-8祕爰冲液预湿润过滤板（1.2以111，]^11丨？〇代）。添加15(^1?83-8叱 [0581 ] 4.将样品从PCR带管中转移至过滤板，在550rpm搅拌下室温温育lh。
[0582] 5.用PBS-BN洗涤3次，添加50μ1的PBS，并从过滤器的顶部将样品收集至1.5ml管。
[0583] 阳性选择重复高达16次。某些轮次的阳性选择具有附加步骤，以如下处理回收的 RNA( 即，剩余的适体候选物）：
[0585] 1.第三次洗涤(PBS-BN)之后，从过滤器的顶部将25μ1样品收集至1.5ml管中。
[0586] 2.将过滤板在45°C下温育约lOmin，并立即使用真空洗涤。用PBS-BN洗涤平板多于 三次。
[0587] 3.向平板添加50μ1的PBS，并重复步骤2。
[0588] 4.最后洗涤之后，向孔中添加25μ1的PBS。将样品充分混合，并从过滤器的顶部收 集到1.5ml管中。
[0589] 阳性选择的第9轮如下修改:
[0590] 1.在步骤5)中最终洗涤之后，向适体混合物中添加5μg/ml链霉亲和素-PE，并在 550rpm搅拌下室温温育。
[0591] 2.过滤板上的样品用PBS-BN(+附加的500mM NaCl)洗涤3次。
[0592] 3.用常规PBS-BN进行一次额外的洗涤。
[0593] 4.向样品添加50μ1的PBS，然后如上收集至1.5ml管中。
[0594] 5.样品储存在_20°C。
[0595] 阳性选择的第14轮如下修改:
[0596] 此轮开始之前，使用本领域已知的方法将感兴趣的抗原（SSX4、SSX2、PBP、KLK2、 SPDEF)缀合至羧化磁珠。
[0597] 1.珠子封闭：取所需数目的各个非磁珠（3000x数目的适体文库（5)x超额因子 (1.2))，添加起始封闭剂(3:1，封闭每1200个珠子），制备4种抗原和补充物的5种混合物，其 每一种具有缀合至磁珠的不同靶标抗原（参见以下表6,其中除了所示的以外，抗原缀合至 非磁珠），温育20min。 表6:珠子封闭混合物
[0598] 2.向PCR带管添加50μ1的适体文库，向具有预选择的相应适体文库的管中添加具 有在磁珠上的靶标抗原的珠子混合物，并在550rpm搅拌下37°C温育2h。
[0599] 3.用PBS-BN缓冲液预湿过滤板，添加150μ1 PBS-BN。
[0600] 4.将样品从PCR带管中转移至过滤板，在以550rpm搅拌下室温温育lh。[06011 5.最后（标准）洗涤之后，添加5μg/ml链霉亲和素-PE，在550rpm搅拌下室温温育 30min0
[0602] 6.用PBS-BN(+附加的500mM NaCl)洗涤3次。
[0603] 7.用常规PBS-BN进行一次附加的洗涤。
[0604] 8 ·向样品添加50μ1的PBS，然后如上收集至1 · 5ml管中。
[0605] 9.使用磁性支架去除磁珠，并用新鲜的PBS缓冲液代替。
[0606] 10.样品储存在_20°C，以用于后续的DNA提取和链分离。
[0607]在稍后一轮的阳性选择中实施的任选步骤旨在增加适体结合的严格性(例如，增 加热或盐浓度）。 实施例8:抗EpCAM适体的发现和表征
[0608]在该实施例中，表征使用以上实施例中的技术鉴定的针对EpCAM的适体。在如上所 述选择EpCAM结合适体的池之后，使用Ion Torrent标准方案（Life Technologies， Carlsbad，CA)对适体文库进行测序。先导候选物被选为具有(a)跨越具有完整预期长度产 物的所有读取序列的高丰度基序和(b)强二级结构（图7B)的那些。
[0609] 针对与SSX4、SSX2、PBP、KLK2和SPDEF重组蛋白竞争的缀合至MicroPlex珠子的 EPCAM蛋白质选择适体。针对附接至Fc标签的EpCAM，在初始轮次中选择适体的一部分，并在 第8轮之后，将选择切换至具有组氨酸标签的EPCAM。针对附接至组氨酸标签的EpCAM，在初 始轮次中选择适体的另一部分，并在第8轮之后，将选择切换至具有Fc标签的EPCAM。使用Fc 和组氨酸标签进行蛋白质纯化和捕获的方法对于本领域的技术人员是已知的。
[0610] 适体表征
[0611] CAR003是使用以上方法鉴定的适体候选物。作为RNA适体，具有备选尾序列的 CAR003具有以下RNA序列（SEQ ID N0.5):
[0613] 进一步表征CAR003。根据需要通过将生物素部分附接至S'KAROOSJ+S'KSEQ ID N0.4))端或3'端（CAROOSJ.S'KSEQ ID N0.7))来修饰EpCAM适体CAR003。使用链霉亲 和素-生物素系统，生物素可用于结合适体，例如，用于标记、捕获和/或锚定。图7B示出了 CAR003的最优二级结构，其具有-30.0 Okcal/mo 1的最小自由能（Δ G)。为了说明的目的，所 述适体显示为对应于CAR003DNA序列（SEQIDN0.4,7)的RNA适体(SEQIDN0.5)。
[0614] 合成和纯化。使用AKTA OligoPilot 100合成仪（GE Healthcare Life Sciences Corp.，Piscataway，NJ)，采用3'生物素和脱三苯甲基重新合成选择的CAR003适体。采用阴 离子交换色谱法通过FPLC纯化产物。如所示将FPLC之后的若干级分合并为图7C中指示的池 1-3。该图包括FPLC色谱图，所有产物和级分在凝胶上检查过质量后分配在池中。图7D示出 了具有合成后的CAR003适体的不同FPLC级分的SYBR GOLD染色凝胶。基于未完成的链的量， 按照从高到低的顺序将不同的级分合并在池中（池1-池3)。池1-3对应于图7C中指示的那 止匕 -、〇
[0615] CAR003适体表征。使用以下内部开发的分析，测试纯化的CAR003适体与具有多组 氨酸标签（"Hi s标记的"）的重组EPCAM蛋白质的结合。抗Hi s标签缀合的珠子与EPCAM-Hi s标 记的蛋白质进行混合。用链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE)标记待测试的适体。EpCAM珠子和 SA-PE标记的适体进行混合。在如本文所述的珠子分析中，结合被测定为中位荧光值。MFI值 (图7E-F)随着SA-PE标记的适体与重组EpCAM的结合的增加而增加。图7E-F示出了在含有 PBS-BN(PBS，l%BSA，0·05%叠氮化物，pH7·4)的25mMHEPES中（图7E)或在含有lmMMgCl2 的25mM HEPES中（图7F)，CAR003与EPCAM蛋白的结合。EPCAM适体，适体4(参见以上），用于比 较。如图所示，CAR003池3在存在MgCl 2的情况下（图7F)比在存在BSA的情况下（图7E)更有效 地结合其靶标。
[0616] 为了进一步理解其性能，在存在BSA和MgCl2两者的情况下在不同的缓冲液中测试 CAR003结合。图7G示出了在添加或不添加牛血清白蛋白（BSA)的所示的盐中CAR003与EpCAM 的结合。再一次，当不存在BSA时，CAR003与EpCAM的结合更有效。而且，对150mM NaCl进行测 试，但并没有显示出改善CAR003性能超过MgCl2。
[0617]可能影响适体的性能的另一因素是用不同的盐组合物变性。图7H示出了变性对 CAR003与EPCAM蛋白质结合的影响。从图中可见，适体的变性对CAR003与EpCAM的结合具有 正面影响，该影响类似于MgCl 2对CAR003的影响。然而，在存在MgCl2的情况下变性可能不能 协同改善CAR003与EpCAM的结合。有趣的是，在测试的条件下与对照适体4相比，CAR003表现 得更稳定。
[0618]在珠子分析环境中CAR003对EpCAM的亲和力在如上的相同分析中进行评估，其中 在恒定的抗原输入中滴定适体。图71示出了针对EPCAM重组蛋白（恒定输入5yg)的适体的滴 定。在测试的条件下，适体4相比于CAR003具有更高的对EPCAM蛋白质的亲和力，如由起始于 5yg的适体输入的饱和水平所示的。
[0619]为了评估CAR003的特异性，使用蛋白质印迹法针对EPCAM重组蛋白和包含牛血清 白蛋白（BSA)和人血清白蛋白（HSA)的对照进行测试。图7J示出了CAR003适体相比于EPCAM h i s标记的蛋白质、B SA和HSA (各5yg)的蛋白质印迹。凝胶用0.5 % F12 7封闭，并用约5 Oyg/m 1 CAR003生物素化的适体级分3进行探测。印迹采用NeutrAvidin-HRP然后SuperSignal West Femto化学发光基底进行可视化。采用CAR003适体探测的蛋白质印迹显示适体对EPCAM蛋白 质超过白蛋白的明显倾向。
[0620] 血浆样品的CAR003测试。采用CAR003对来自五个前列腺癌和五个正常受试者的血 浆样品进行测试，以使用捕获微囊泡的珠子缀合的蛋白质检测微囊泡，并采用SA-PE标记的 适体来检测囊泡。SA-PE标记的适体4检测剂用作对照。癌症超过正常的倍数变化示于表7 中。显示在没有归一化（"原始的"）或相对于阴性对照归一化的情况下的倍数变化。采用针 对所示的33乂4、？8?、3^^?4?041、1(1^2和33乂2的珠子缀合的抗体捕获囊泡。 表7:用于检测微囊泡的CAR003
[0621] 在测试的条件下，用CAR003检测的样品与用适体4检测相比具有更低的MFI值，而 CAR003具有更好的信噪比，并显示出使用SSX4、SH)EF、EPCAM和SSX2捕获标志物在癌症与正 常样品之间更好的分离。
[0622] 对照适体
[0623] 适体的特征(大小、稳定性、结合亲和力和特异性等)可与对EpCAM或其它靶标具有 特异性的对照适体进行比较。例如，适体与抗VEGF适体5'生物素 -CA ATT GGG CCC GTC CGT ATG GTG GGT(SEQ ID N0.22)如Kaur and Yung，2012中所述进行比较。
[0624] 参考文献： 1 · Mill ler，J ·等人〃 Selection of high affinity DNA-aptamer for activated protein C using capillary electrophoresis.^Research in Pharmaceutical Sciences 7.5(2012)：S987〇 2·Cerchia，L·和V·de Franciscis.^Nucleic Acid Aptamers Against Protein Kinases,Current medicinal chemistry 18.27(2011):4152_4158〇 3 · Wu，Jie 等人〃 Identification，Characterization and Application of a G_ Quadruplex Structured DNA Aptamer against Cancer Biomarker Protein Anterior Gradient Homolog 2.〃PloS ONE 7.9(2012):e46393 4. Mitkevich，01ga V.等人〃DNA aptamers detecting generic amyloid epitopes, Prion6.4(2012):400-406。 5. Kaur H,Yung L-YL(2012)Probing High Affinity Sequences of DNA Aptamer against VEGFi65.PLoS ONE 7(2)：e31196.doi：10.1371/journal.pone.0031196〇 实施例9:适体靶标鉴定
[0625] 在该实施例中，缀合至微球体的适体用于帮助确定由如上所述的文库筛选方法鉴 定的两种适体的靶标。一般方法示于图9中。该方法用于验证CAR003的靶标以识别EpCAM， CAR003是一种由文库筛选鉴定的适体。参见以上关于CAR003的详述。在该方法中，在与微球 体连接之前，CAR003的序列进行随机重排。微球体用作对照而与靶标结合，该靶标类似于但 不完全等同于预期的靶分子。
[0626] 使用的方案如下：
[0627] 1)候选物适体(此处，CAR003)和阴性对照适体(此处，随机排列的CAR003)采用修 饰进行合成，以允许捕获(此处，适体被生物素化)和交联(此处，使用来自Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL、目录号为33073的磺基-SBED生物素标记转移试剂和试剂 盒以允许光致交联）。
[0628] 2)每一种适体与具有感兴趣的靶标的微囊泡单独地混合(此处，BrCa细胞系微囊 泡)。
[0629] 3)温育以使适体结合靶标之后，向混合物施加紫外光以引发适体与微囊泡靶标的 交联。
[0630] 4)裂解微囊泡，从而使交联的适体-靶标复合物释放至溶液中。[0631 ] 5)使用链霉亲和素涂覆的基底从溶液中捕获交联的适体-靶标复合物。
[0632] 6)对于各适体的交联的适体-靶标复合物在SDS-PAGE凝胶电泳上单独运行。采用 考马斯蓝(Coomasie Blue)染色使捕获的蛋白质祀标可视化。
[0633] 7)交联和结合步骤可能是混杂的，使得包含预期靶标及随机蛋白质的多个条带将 在每一个凝胶上出现。在具有候选物适体(此处，CAR003)而非相关的阴性对照适体(此处， 随机排列的CAR003)的凝胶上出现的条带中，将发现预期的靶标。从凝胶上切下对应于靶标 的条带。
[0634] 8)使用质谱分析法(MS)从切下的条带中鉴定适体靶标。 实施例10:针对源自乳腺癌(BrCa)的微囊泡的适体
[0635] 在该实施例中，筛选适体文库以鉴定区分乳腺癌患者的血液中循环的微囊泡与在 健康的对照个体(即，没有乳腺癌）的血液中循环的微囊泡的适体。
[0636] 从60名乳腺癌患者(BrCa+)的池的血浆中分离微囊泡。从60名非癌症样品(BrCa-) 的池中分离微囊泡。使用超速离心（120,000 Xg)从血浆中分离微囊泡。微囊泡在超速离心产 生的沉淀物中。保存超速离心产生的上清液被用作对照。来自两种样品类型的微囊泡与 MagPlex珠子(Luminex Corp，Austin TX)缀合。任选地，分离的微囊泡与抗HSA/IgG/血纤蛋 白原珠子一起温育，以去除这些高丰度血液蛋白质。然而，可优化缀合步骤以有助于微囊泡 的缀合，使得高丰度蛋白质的去除没有问题。
[0637] 使用的适体文库包含2'F SUL1 RNA适体文库。所述 N40-CAGACGACUCGCUGAGGAUCCGAGA-3'（SEQ ID N0.23)。适体文库包含三个部分:正向引物-l5个核苷酸，可变区-40个核苷酸;反向引物-25个核苷酸。所有嘧啶(C和U)均为2 /氟修饰 的。
[0638] 适体文库与癌症或对照微囊泡缀合的珠子一起温育。结合微囊泡的适体对于两种 样品类型平行地进行十三轮阳性选择。关于选择方案，参见图11A中的"选择A"。关于阳性选 择步骤的详细方案，参见以下实施例11。未进行阴性选择。
[0639] 使用包括Ion Torrent NGS(Life Technologies，Inc.，Carlsbad，CA)的新一代测 序技术对从以上阳性选择中保留的适体进行测序。还可以使用MiSeq系统（Illumina，Inc.， San Diego，CA)。对序列进行比较以鉴定在癌症样品发现而在对照样品中没有发现的适体， 反之亦然。这样的适体提供可用于区分BrCa与非BrCa样品的候选物。
[0640] 从这些程序中获得的许多代表性序列示于表8中。在针对BrCa微囊泡而选择的适 体池中而非针对非癌症样品选择的适体池中鉴定表中的序列。在表8中，所述序列从左至右 显示5'至3'，其中各个全序列包含指示的5'前导序列，接着指示的可变序列，接着指示的3' 尾序列。各个序列来源于具有前导和尾(参见以上详述），并且在中间具有可变序列的文库。 应当理解，公开在表8中的核苷酸序列还可以在一定程度上进行修饰，该程度使得所得修饰 产生具有与公开的序列约 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%和99%同源的适体，并保留与微囊泡抗原或其功能片段结合的功能性。 表8: BrCa微囊泡适体候选物序列[0641 ]表8中各个序列以两种变体进行合成，以用于进一步研究:5'生物素化和3'生物素 化。这提供了根据需要可以在5'端或3'端被捕获的适体变体。进一步合成适体，其中各个嘧 啶(C和U)为2'氟修饰的。
[0642] 序列表中提供了对应于表8中各个RNA序列的DNA序列，其中DNA序列直接跟在其相 应的RNA序列的后面。例如SEQIDN0.9是对应于RNA序列SEQIDN0.8的DNA序列，等等。同 样地，合成适体的DNA形式以用于进一步表征。
[0643] 使用适体的阳性选择来鉴定以上适体，所述适体识别与微球体缀合的BrCa和非 BrCa微囊泡。 实施例11:适体文库选择方案
[0644] 该实施例提供了在以上实施例中进行的SUL1 RNA文库选择的方案。根据需要其它 的适体文库和样品输入可遵照所述方案。
[0645]
[0646] 在工作之前工作间用80%Et0H进行清洁。
[0647] 珠子为MagPlex珠子(Luminex Corp.，Austin，TX)。可根据需要置换其它的珠子。
[0648] 制备缓冲液/试剂： •MilliQ水 • lOOmM MgCl2 • 5x转录缓冲液(200mM三羟甲基氨基甲烷pH7.9) • lx PBS #具有3mM MgCl2的lx PBS • lOx PBS •选择缓冲液(具有0.1%BSA和3mM MgCl2的lx PBS)
[0649] 选择开始之前，去除珠子储存缓冲液，并用lx PBS w/3mM MgCl2洗涤珠子1次(在 所有4个管中总计200uL)。每次选择使用200，000个珠子。
[0650] 使2'F SUL1 RNA池与微囊泡涂覆的磁珠结合 [0651 ]缩写：TK-转录;NTC-没有模板对照。
[0652]步骤： 1. 第1轮:使lnmol纯化的2'F SUL1 RNA与20μ1重悬的珠子（与微囊泡缀合的）混合。 10uL的 10x PBS+l%BSA，3yl 100mM MgCh和47uLH20。得到最终浓度为lx PBS，0.1%BSA， 3mM MgCbo 1.1在该步骤中添加 MgCl2得到浓度为3mM的MgCl2。这是整个过程的结合浓度。 1.2以下轮:使20μ1转录产物(在内含有15mM MgCl2)与20μ1的经洗涤的微囊泡涂覆的 珠子和具有1%BSA，51uL Η20的9uL 10x PBS混合。不需要附加的MgCl2,因为在经稀释的转 录产物(TK)中的MgCl2提供了最终浓度为3mM的MgCl 2。 2. 在37 °C下温育30min，在lOOOrpm下摇动，并且每10分钟吸取混合物。 3. 洗涤珠子： 3.1 -次洗涤循环包括： 3.1.1从磁体中移取珠子 3.1.2使珠子离开磁体重悬于100μΙ lx PBS+3mM MgCh。 3.1.3使样品离开磁体温育30秒。 3.1.4将样品放回磁体上，并等待直到珠子在侧面上。 3.1.5去除并丢弃上清液。 3.1.6 离开磁体重悬于100μΙ lx PBS+3mM MgCl2+0.1%BSA。 3.1.7使样品离开磁体温育3分钟。 3.1.8将样品放回磁体上，并等待直到珠子在侧面上。 3.1.9去除并丢弃上清液。 3.2第1轮:将珠子混合物放置在磁体上，并去除上清液。用100μΙ lx PBS+3mMMgCl2+ 0.1 %BSA洗涤一次(通过吸移混合珠子），并丢弃缓冲液。 3.3以下轮:每个第二轮增加洗涤步骤，增加一个洗涤步骤至3个洗涤步骤。 4. 向珠子样品中添加55μ1 MilliQ水。 5. 通过在80 °C下温育珠子样品5min洗脱RNA。 5.1检查是否具有50μ1，如果没有则离心样品，以从顶部旋除冷凝水。 5.2将上清液转移至新的小瓶中。快速操作，以避免链重新结合珠子。 5.2.1使用5(^1洗脱液用于以下1^〇?，并在-20°(：下储存其余部分。
[0653] 回收适体候选物的RT-PCR
[0654] 建议 •其余的RT-PCR样品和TK-PCR样品在-20 °C下储存 •RNA可在4 °C下储存约lh •RT-PCR产物可在4 °C下储存过夜。 •在转录之后立即进行最优RNA质量的下一个选择循环。 •避免涡旋RNA •在冰上混合 •使用0.5ml PCR管 •每个RT-PCR应当具有无模板对照(NTC)，其中用水代替模板 •不要冻-融DTT超过一次 6. 在第一轮之前制备主混合物，它用0.5pmol RNA进行检查，并在-20°C下储存48μ1的 等份直至使用。 表9:RT-PCR主混合物7. 添加50μ1 Mi 11 iQ水作为阴性对照(NTC)(首先吸取它)或50μ1选择洗脱液。吸移混合 物。 8. 在65°C下温育5min。 9. 冷却至4 °C之后，添加： 9· 11μ1 Superscript II逆转录酶（Invitrogen，编号 18064)(20〇υ/μ1) 9·21μ1 GoTaqFlexi DNA聚合酶(5个单位/yl)Promega编号Μ8305。 PCR-程序(SARTPCR) a) lOmin 54°C (该步骤仅针对逆转录酶，应当需要更多轮，不要重复步骤A。） b) lmin 95 °C c) lmin 60 °C d) lmin 72 °C 10. 循环步骤b_d 10.1第1轮b-d 4个循环。在4%琼脂糖凝胶上运行5yL PCR产物。 10.1.1后续轮:第一轮之后RNA的量减少，导致所需的PCR循环增加。为了测定每次所需 的循环数，从先前的一轮选择中检查来自琼脂糖凝胶的条带强度。使用那个循环数来开始 下一轮RT-PCR。注意:总是在琼脂糖凝胶上检查结果。 10.1.1.1琼脂糖凝胶结果:应该看见目标长度的产物条带。条带强度应当与50bp分子 量标记带大致相同（如果不是，则强度较小）。如果条带强度不足(几乎不能看见），循环适当 更多的量，并重新检查琼脂糖凝胶。
[0655]
[0656] 所有的混合在冰上进行。制备转录主混合物并在-20 °C下储存85.7μ1的等份直至 使用。 11. 在使用前验证贮有的200mM三羟甲基氨基甲烷pH7.9的pH。pH随着时间的变化可能 导致关于转录的问题。 表10:SUL1文库的转录(TK)主混合物12. 向主混合物中添加 ΙΟμΙ RT-PCR产物。 13. 添加 ΙμL RNA酶抑制剂(40个单位/μL) 13.1 Promega重组RNA酶抑制剂核糖核酸酶抑制剂编号Ν2515/Ν2511 14. 添加4μ1 T7Y639F突变的聚合酶(25UAU使用:每个反应总计100U) 15. 在37 °C下反应进行30min 16. 使用转录产物直接用于下一轮选择。如果下一步不可行，则在-20C下冷冻转录产 物。
[0657] 后续轮
[0658] 重复珠子温育，尽可能经常地需要RT-PCR和转录。设法使上述所有轮的样品具有 相似条带强度的RT-PCR产物。
[0659] 结合分析
[0660] 在有待确定的所需轮的选择之后进行结合分析，以评估癌症选择的适体与对照珠 子(与来自血浆超速离心的上清液缀合，参见以上）的非特异性结合，并且同样对于非癌症 对照样品。还可以进行结合分析，以评估选择的适体与预期的靶标微囊泡的结合。[0661 ] Cherenkov方案:使用32P放射性标记的适体文库进行。
[0662] 选择缓冲液的最终浓度：lx PBS+3mM MgCl2+0.01%BSA pH 7.4
[0663] 洗涤缓冲液：lx PBS+3mM MgCl2pH7.4 1. 从-80 °C的冷冻机中移取微囊泡样品并融化。 2. 将珠子放置在磁体(每个样品实验200，000个)上，去除珠子存储缓冲液。 3. 每个用lx PBS，3mM MgCl2缓冲液洗涤lx 200yL 1分钟。汇集珠子使得一个管中200， 000个。 4. 使珠子重悬于70yL的选择缓冲液中。（每个样品ΙΟμΙ的10x PBS，1 %BSA+3yL 100mM MgCl2+57yL H2O)。 5. 向它们各自的样品中添加30yL放射性标记的RNA适体文库。 6. 在37 °C下以lOOOrpm摇动温育30min。 7. 将样品放置在磁体上。 8. 移取并保存上清液。 9. 珠子用200yL洗涤缓冲液lx PBS 3mM MgCl2pH7.4洗涤，离开磁体温育3分钟。 10. 将样品放置在磁体上，移取并保存洗涤溶液。 11. 重复步骤9,10。 12. 向样品中添加100yL水，吸移混合物。 13. 在80 °C下加热5分钟。 14. 将样品放置在磁体上，移取上清液并保存。 15. 将珠子重悬于100yL水中。 16. 使用闪烁计数器测量每个级分的放射性。 17. 分析存在的背景结合的量。
[0664] 阴性选择
[0665] 根据需要，在使适体文库与同靶标微囊泡缀合的珠子一起温育之前，添加阴性选 择步骤（即，以上程序"使2'F SUL1 RNA池与微囊泡涂覆的磁珠结合"）。在微囊泡从样品中 过滤或沉积之后，可以使用与上清液或输入样品（例如，血浆)缀合的珠子(被称为"没有微 囊泡涂覆的珠子"、"排除微囊泡的样品"或类似的)进行阴性选择。步骤为：
[0666] 1)在如上所述转录之后以来自所需轮的适体文库产物开始。开始之前洗涤珠子： 去除存储缓冲液，用200yL洗涤缓冲液洗涤珠子，随后如下所述放置缓冲液：
[0667] 2)阴性选择步骤:添加并吸取20μ1转录产物（15mM MgCl2)与新鲜洗涤的没有微囊 泡涂覆的珠子的混合物和具有l%BSA，70yL H20的10uL 10x PBS。不需要附加的MgCl2,因为 在经稀释的转录产物(TK)中的MgCl2提供了最终浓度为3mM的MgCl 2。
[0668] 3)在37 °C 下温育 30min，在 1 OOOrpm 下摇动。
[0669] 4)移取上清液并将其添加至阳性选择珠子(直接地）中，所述珠子是经洗涤的微囊 泡涂覆的珠子。
[0670] 继续阳性选择温育。参见以上2'F SUL1 RNA池与微囊泡涂覆的磁珠结合，在步骤2 开始。通过转录的附加步骤如以上详细描述。 实施例12:源自乳腺癌(BrCa)的微囊泡的附加适体
[0671] 在该实施例中，筛选适体文库以鉴定区分乳腺癌患者的血液中循环的微囊泡与在 健康的对照个体（即，没有乳腺癌）的血液中循环的微囊泡的适体。该程序使用与以上实施 例10相同的样品和适体文库。该实施例中程序的不同在于阴性选择在第三轮阳性选择之后 的每个阳性选择开始之前进行。
[0672] 阴性选择用于去除结合癌症和非癌症蛋白质的可溶/丰富/非信息性和常见的蛋 白质的适体。阴性选择包括对针对BrCa+微囊泡选择的适体候选物进行阴性选择，如下：（i) 使用与来自BrCa+血浆超速离心步骤的上清液(它应当不含有微囊泡)缀合的微珠 ；（i i)使 用与来自BrCa-血浆超速离心步骤的上清液(它应当不含有微囊泡)缀合的微珠；（iii)使用 与BrCa-微囊泡缀合的微珠。还可对针对BrCa-微囊泡选择的适体候选物进行阴性选择，如 下：（i)使用与来自BrCa+血浆超速离心步骤的上清液(它应当不含有微囊泡)缀合的微珠； (i i )使用与来自BrCa-血浆超速离心步骤的上清液（它应当不含有微囊泡）缀合的微珠； (iii)使用与BrCa+微囊泡缀合的微珠。在阳性选择轮之间如本文所述进行阴性选择轮。
[0673] 从60个乳腺癌患者(BrCa+)的池的血浆中分离微囊泡。从60个非癌症样品(BrCa-) 的池中分离微囊泡。使用超速离心（120，OOOxg)从血浆中分离微囊泡。微囊泡在来自超速离 心的颗粒中。来自超速离心的上清液被保存以用作对照。来自两种样品类型的微囊泡与 MagPlex珠子（Luminex Corp，Austin TX)缀合。
[0674] 使用的适体文库包含2'F SUL1 RNA适体文库。所述 N40-CAGACGACUCGCUGAGGAUCCGAGA-3'（SEQ ID N0.23)。适体文库包含三个部分:正向引物-l5个核苷酸，可变区-40个核苷酸;反向引物-25个核苷酸。所有嘧啶(C和U)均为2 /氟修饰 的。
[0675] 适体文库与癌症或对照微囊泡缀合的珠子一起温育。结合微囊泡的适体对于两种 样品类型平行地进行九轮阳性选择。超速离心后在第4-9轮阳性选择之前，针对与输入血浆 上清液缀合的珠子进行阴性选择。对于阳性/阴性选择方案，参见图11A "选择B"和图11D-11E。对于阳性选择和阴性选择步骤的方案，参见以上实施例11。
[0676] 使用包括Ion Torrent NGS(Life Technologies，Inc.，Carlsbad，CA)的新一代测 序技术对从以上阳性选择中保留的适体进行测序。还可以使用MiSeq系统（Illumina，Inc.， San Diego，CA)。对序列进行比较以鉴定在癌症样品中发现而在对照样品中未发现的适体， 反之亦然。这样的适体提供可用于区分BrCa与非BrCa样品的候选物。
[0677] 根据以下程序分析测序数据：
[0678] 步骤1:在针对与排除微囊泡的癌症血浆缀合的珠子的阴性选择，接着针对与癌症 微囊泡缀合的珠子的阳性选择之后，根据在第9轮中回收的整个适体池中的频率把序列排 序。
[0679] 步骤2:计算步骤1中所述样品与（i)针对排除微囊泡的癌症血浆的附加阴性选择 之后的相同样品；（ii)针对非癌症微囊泡的附加阴性选择之后的相同样品；（iii)针对排除 微囊泡的非癌症血浆的附加阴性选择之后的相同样品之间的倍数变化。
[0680] 步骤3:基于在步骤2中计算的倍数变化把序列排序，以鉴定在对于源自乳腺癌的 微囊泡而选择的适体池中哪些序列是丰富的或不足的。
[0681] 步骤4:基于固结分析的结果去除可能的突变序列(例如，由于PCR或其它的错误）。
[0682] 步骤5:鉴定在所有三种变体(步骤2中的i、i i和i i i)中倍数变化 大于3且最小频率为50的序列。
[0683] 对于针对与非癌症微囊泡缀合的珠子而选择的适体，进行与步骤1-5中相同的选 择方案。
[0684] 从这些程序中获得的许多代表性序列示于表11。在针对BrCa微囊泡而选择的适体 池中而非针对非癌症样品选择的适体池中鉴定表中的序列。在表11中，所述序列从左至右 显示5'至3'，其中各个全序列包含指示的5'前导序列，接着指示的可变序列，接着指示的3' 尾序列。各个序列来源于具有前导和尾(参见以上详述），并且在中间具有可变序列的文库。 应当理解，公开在表11中的核苷酸序列还可以在一定程度上进行修饰，该程度使得所得修 饰产生具有与公开的序列约 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%和99%同源的适体，并保留与微囊泡抗原或其功能片段结合的功能性。 表11: BrCa微囊泡适体候选物序列
[0685] 表11中各个序列以两种变体进行合成，以用于进一步研究：5'生物素化和3'生物 素化。这提供了根据需要可以在5'端或3'端被捕获的适体变体。进一步合成适体，其中各个 嘧啶(C和U)被2'氟修饰。适体还可以被合成为对应于表11中的各RNA序列的DNA序列。适体 文库还可以基于预测的二级序列、自由能和如本文所述的其它参数进行过滤。
[0686] 图10A-C显示了表11中的适体与同不同输入样品缀合的微珠的结合。适体示于以 上各图，并且各适体的图显示在表11中的ID列。参见表11。输入样品从左至右示于X轴，如 下：1)癌症外来体:与微珠结合的适体，所述微珠与从来自乳腺癌患者的血浆样品中分离出 的微囊泡缀合;2)癌症非外来体:与微珠结合的适体，所述微珠与来自乳腺癌患者的通过超 速离心去除微囊泡之后的血浆样品缀合;3)非癌症外来体:与微珠结合的适体，所述微珠与 从来自正常（即，非乳腺癌）患者的血浆样品中分离出的微囊泡缀合;4)非癌症非外来体:与 微珠结合的适体，所述微珠与来自乳腺癌患者的通过超速离心去除微囊泡之后的血浆样品 缀合。如图10A-C所示，每个适体均能够区分与上清液对照样品相对的癌症微囊泡样品与非 癌症微囊泡。而且，表11中的所有序列(除了 BCE10和BCE14)被观测为，相比于源自非癌症的 微囊泡更大量地与源自癌症的微囊泡结合，BCE10和BCE14被观测为相比于源自癌症的微囊 泡更大量地与源自非癌症的微囊泡结合。
[0687] SEQ ID N0.44-10527包括如下的序列列表:经该实施例中鉴定，相比于该实施例 中描述的其它样品（例如，与上清液对照或非癌症微囊泡缀合的珠子），这些序列优先与缀 合至从来自乳腺癌患者的血浆样品中分离出的微囊泡的微珠结合。这些序列包括在以上所 述的步骤2中选择的序列的结合(即，针对与来自乳腺癌患者的微囊泡缀合的微珠而选择的 以及：（i)针对排除微囊泡的癌症血浆的附加阴性选择之后的相同物；（ii)针对非癌症微囊 泡的附加阴性选择之后的相同物；（iii)针对排除微囊泡的非癌症血浆的附加阴性选择之 后的相同物)SEQ ID NO.44-10527表示来自如上所述的具有5'和3'尾的起始文库的40个核 苷酸可变区（参见，例如SEQ ID NO.23和表11)。这些适体可用于检测来源于乳腺癌细胞或 非乳腺癌细胞的微囊泡。在如本文所述的不同应用中，适体可用于癌症的诊断、预后或治疗 诊断。
[0688] 基于在该实施例中进行的比较，获得了结合不同起始输入的适体，其包括:1)超越 源自非癌症的微囊泡而优选结合源自癌症的微囊泡的适体;2)超越源自癌症的微囊泡而优 选结合源自非癌症的微囊泡的适体;3)结合源自非癌症的微囊泡和源自癌症的微囊泡两者 的适体(例如，"通用"结合剂）；和4)结合已排除微囊泡的血浆组分的适体。
[0689] 该实施例中的适体文库进一步经历四轮附加的阴性和阳性选择。对于阳性/阴性 选择方案，参见图11G"SELEX C"。如该实施例所述进行阳性选择。使用与非癌症微囊泡缀合 的珠子进行阴性选择轮，作为通过针对与癌症微囊泡缀合的珠子的阳性选择而获得的适体 的阴性选择。类似地，使用与癌症微囊泡缀合的珠子进行阴性选择轮，作为通过针对与非癌 症微囊泡缀合的珠子的阳性选择而获得的适体的阴性选择。 实施例13:疾病诊断
[0690] 该实施例示出了使用本发明的适体诊断增生性疾病。
[0691] 诸如在实施例10或实施例11中鉴定的结合源自BrCa的微囊泡的合适的量的适体， 经由本领域已知的化学方法进行合成。使用本领域已知的结合方法，所述适体与适合于检 测的诊断剂诸如荧光部分缀合。
[0692] 将该组合物施加于从遭受与微囊泡的超表达相关的增生性疾病例如乳腺癌的测 试组患者中采集的血液样品中分离出的微囊泡。将该组合物同样地施加于从没有遭受增生 性疾病的阴性对照组中采集的血液样品中分离出的微囊泡。
[0693] 关于测试组样品使用合适的检测技术(例如，微珠分析或流式细胞仪)指示疾病的 存在，而施加于对照组样品的相同技术指示疾病的不存在。
[0694]该结果显示本发明的适体在诊断增生性疾病中是有用的。 实施例14:治疗适体
[0695] 该实施例示出了使用本发明的适体治疗小鼠的增生性疾病。
[0696] 诸如在实施例10或实施例12中鉴定的结合源自BrCa的微囊泡的合适的量的适体， 经由本领域已知的化学方法进行合成。使用本领域已知的结合方法，所述适体与化学治疗 剂诸如Doxi 1缀合。该缀合物在含水组合物中配制。
[0697] 以一个或多个剂量向遭受与微囊泡的超表达相关的增生性疾病例如乳腺癌模型 的测试组小鼠静脉注射施用该组合物。根据相应的剂量方案，向没有遭受增生性疾病的对 照组静脉注射施用完全相同的组合物。
[0698]肿瘤样品和/或小鼠幸存者的病理分析显示测试组中的死亡率和/或发病率增加， 超过了对照组。
[0699]该结果显示本发明的适体在治疗增生性疾病中是有用的。
[0700] 有用的适体可用于治疗其它生物例如人的乳腺癌。 实施例15:寡核苷酉爱-测序检测方、法
[0701] 该实施例示出了使用寡核苷酸池检测指示目标表型的微囊泡。该方法利用针对指 示目标表型的目标靶标而富集的寡核苷酸的池。该实施例中的方法允许有效使用寡核苷酸 的文库来优选地识别靶标实体。
[0702]为了说明的目的，在该实施例中采用来自体液样品的微囊泡靶标描述该方法。技 术人员将理解，通过针对所需的输入样品富集寡核苷酸文库，该方法可延伸至其它类型的 靶标实体(例如，细胞、蛋白质和不同的其它生物复合物）、样品（例如，组织、细胞培养物、活 组织检查和其它体液)和其它的表型(其它癌症、其它疾病等）。
[0703]通用工作流：
[0704] 1)获得未知医学起源的患者的样品(血浆、血清、尿或任何其它的生物样品），并对 它们进行相应预处理，以确保目标靶标的可用性(参见以下）。其中目标靶标是微囊泡群体， 可分离微囊泡并任选与固体支持物诸如微珠结合。
[0705] 2)使预处理的样品暴露于携带对目标靶标的某种特异性的寡核苷酸池中。如本文 所述，携带对目标靶标的某种特异性的寡核苷酸池可使用不同的选择方案富集，例如，使用 如上所述阴性选择的非癌症微囊泡和阳性选择的癌症微囊泡。可根据需要使用DNA或RNA寡 核苷酸。
[0706] 3)使寡核苷酸文库与样品接触。
[0707] 4)洗脱与靶标结合的任何寡核苷酸。
[0708] 5)对洗脱的寡核苷酸测序。可以使用新一代测序方法。
[0709] 6)分析来自测序的寡核苷酸谱。已知结合目标靶标的寡核苷酸的谱指示在输入样 品内靶标的存在。所述谱可用于表征样品为，例如，癌症或非癌症。
[0710] 方案变化:
[0711] 可进行不同配置的分析。以下是四种实例方案，用于寡核苷酸测序分析的目的。样 品可以是任何生物样品。
[0712] 方案 1:[07Ί3]超速离心1 -5ml体液样品（例如，血楽；/血清/尿）（120K xg，无鹿糖），其中洗涤沉淀 物两次以分离微囊泡。
[0714] 测量含有经分离的微囊泡的回收样品的总蛋白质浓度。
[0715] 使经分离的微囊泡与磁珠(例如MagPlex珠子(Luminex Corp.Austin TX))缀合。
[0716] 使缀合的微囊泡与目标寡核苷酸池一起温育。
[0717] 通过保留的珠子使用磁体洗涤未结合的寡核苷酸。
[0718]洗脱与微囊泡结合的寡核苷酸。
[0719] 扩增和纯化经洗脱的寡核苷酸。
[0720] 寡核苷酸测序(例如，新一代方法;Ion Torrent:融合PCR、乳液PCR、测序）
[0721] 评估寡核苷酸谱。
[0722] 方案 2:
[0723] 该备选方案不包括微囊泡分离步骤、微囊泡与珠子缀合或单独的划分步骤。这可 能呈现寡核苷酸与输入样品的非特异性结合。
[0724] 从体液样品中去除细胞/碎片并用含MgCl2(2mM)的PBS稀释样品。
[0725] 预混合用以上寡核苷酸制备的样品。
[0726] 超速离心寡核苷酸/样品混合物(120K xg，无蔗糖）。洗涤沉淀的微囊泡。
[0727] 回收沉淀物并洗脱与微囊泡结合的寡核苷酸。
[0728] 扩增和纯化经洗脱的寡核苷酸。
[0729] 寡核苷酸测序(例如，新一代方法;Ion Torrent:融合PCR、乳液PCR、测序）
[0730]评估寡核苷酸谱。
[0731] 方案 3:
[0732] 该方案使用过滤代替超速离心，并且将需要更少的时间和样品体积。
[0733] 从体液样品中去除细胞/碎片并用含MgCl 2 (2mM)的PBS稀释样品。
[0734]预混合用以上寡核苷酸制备的样品。
[0735] 将样品装载至过滤器（SM50K或300K MWC0过滤器或任何其它的可以消除未结合 或不需要的寡核苷酸）中。使样品离心以浓缩。经浓缩的样品将含有微囊泡。
[0736] 洗涤浓缩液。变体1:用以上指定的缓冲液稀释浓缩液至原始体积并重复离心。变 体2:用以上指定的缓冲液稀释浓缩液至原始体积，并转移浓缩液至新的过滤器元件，然后 离心。重复两次。
[0737] 回收浓缩液并洗脱与微囊泡结合的寡核苷酸。
[0738] 扩增和纯化经洗脱的寡核苷酸。
[0739] 寡核苷酸测序(例如，新一代方法；Ion Torrent:融合PCR、乳液PCR、测序）
[0740]评估寡核苷酸谱。[0741 ]方案 4:
[0742]超速离心1 -5ml体液样品（120Kxg，无蔗糖），其中洗涤沉淀物2次以分离微囊泡。
[0743] 预混合微囊泡与寡核苷酸池。
[0744] 将样品装载至300K MWC0过滤器元件并离心（2000xg)。浓缩率为约3x。
[0745] 洗涤浓缩液。变体1:用以上指定的缓冲液稀释浓缩液至原始体积并离心。重复两 次。变体2:用以上指定的缓冲液稀释浓缩液至原始体积，并转移浓缩液至新的过滤器元件， 然后离心。重复两次。
[0746] 回收浓缩液并洗脱与微囊泡结合的寡核苷酸。
[0747] 扩增和纯化经洗脱的寡核苷酸。
[0748] 寡核苷酸测序(例如，新一代方法；Ion Torrent:融合PCR、乳液PCR、测序）
[0749]评估寡核苷酸谱。
[0750] 在以上方案的变化中，聚合物沉淀用于从患者样品中分离微囊泡。例如，向样品中 添加寡核苷酸，然后4%或8%浓度的PEG4000或PEG8000用于沉淀并从而分离微囊泡。如上 继续进行洗脱、回收和序列分析。 实施例16:使用寡核苷酸测序检测源自乳腺癌的微囊泡
[0751] 以上实施例15中的方法用于检测来源于乳腺癌细胞的体液样品中的微囊泡。寡核 苷酸文库包括以上实施例12中描述的寡核苷酸的子集，与非癌症个体相比所述寡核苷酸的 子集优选与来自乳腺癌患者的微囊泡结合。所述序列在本文以SEQ ID N0.24-10527列出。 该方法用于检测存在或不存在指示乳腺癌的微囊泡。
[0752] 测试样品包括从被安排经受乳腺活组织检查的患者中收集的血浆样品。测试样品 是有待通过本发明的方法进行表征的样品。执行该方法以确定存在或不存在源自乳腺癌的 微囊泡。 实施例17:微囊泡的适体选择
[0753] 在"干净"条件下，当非靶分子(竞争剂）的干扰最小化时，通常执行传统的适体选 择技术（即，SELEX)以富集特定靶标的适体。然而，选择的适体的不同应用需要所述适体在 各种各样的环境中结合它们的靶标，例如，在具有大量潜在干扰分子的生物样品或组织培 养基中。在这一情况下，在选择过程期间不存在的这种干扰分子可能干扰通过在更理想的 条件中选择的适体的靶标识别。该实施例提供了筛选适体文库的适体选择过程，以便选择 对于靶标高度特异性的适体，并且该过程还能够在包含潜在干扰分子的生物样品中进行。
[0754] 在该实施例中，所述靶标包括微囊泡，使得筛选相比于正常(非癌症对照）的微囊 泡而结合源自癌症的微囊泡的适体文库的成员。技术人员将理解，该方法可延伸至其它类 型的靶标实体(例如，细胞、蛋白质、不同的其它生物复合物）。该方法可采用不同的样品类 型（例如，组织、细胞培养物、活组织检查和不同的体液），并可针对能够通过针对所需的输 入样品富集适体文库而用于表征不同表型(各种癌症、其它疾病等）的靶分子。此外，可切换 癌症和正常样品以筛选优选结合正常样品的适体。
[0755] 变体1:基于微囊泡的适体选择与排除微囊泡的血浆竞争。工作流：
[0756] ->使用超速离心从癌症和正常血浆样品中分离微囊泡。包含排除微囊泡的样品的 上清液作为阴性对照样品储存。
[0757] ->将经分离的微囊泡捕获/缀合至磁珠。
[0758] ->使用与来自以上的上清液（即，排除微囊泡的血浆)混合的微囊泡缀合的珠子开 始适体筛选和选择过程。用MgCl 2补充上清液。可以平行完成源自癌症和正常(源自非癌症 的）的微囊泡的适体筛选和选择。每一轮根据需要包括阴性和阳性选择。
[0759] 因为初始适体文库被同时暴露于来自血浆的微囊泡靶标和竞争剂(可溶蛋白质） 中，从微囊泡/珠子中回收的适体可能对于微囊泡膜上的靶标更具特异性。这样的适体可以 在生物样品中有效进行，而不需要在靶标结合/检测之前广泛纯化靶标。
[0760] 变体2:源自癌症的微囊泡(例如，从癌细胞中脱落的）与从正常样品中分离出的微 囊泡竞争适体选择。工作流：[0761 ]->使用超速离心从癌症和正常血浆样品中分离微囊泡。
[0762]->将经分离的源自癌症的微囊泡捕获/缀合至磁珠。
[0763] _>使用与补充有MgCl2的正常微囊泡(非缀合的）混合的癌症微囊泡缀合的珠子开 始适体筛选和选择过程。仅通过保留仅用磁珠保留的适体进行源自癌症的微囊泡的适体筛 选和选择。
[0764]因为适体文库将同时暴露于两种类型的微囊泡(癌症和正常的）中，该方法选择在 存在非癌症微囊泡的情况下优选结合源自癌症的微囊泡的适体。
[0765]变体3:源自癌症的微囊泡(例如，从癌细胞中脱落的）与正常血浆(没有排除微囊 泡)竞争适体选择。工作流：
[0766] ->使用超速离心从癌症血浆样品中分离微囊泡。
[0767] ->将经分离的源自癌症的微囊泡捕获/缀合至磁珠。
[0768] _>使用与补充有MgCl2的正常血浆(非缀合的）混合的癌症微囊泡缀合的珠子开始 适体筛选和选择过程。仅通过保留仅用磁珠保留的适体进行癌症微囊泡的适体筛选和选 择。
[0769]该方法合并了来自以上变体1和2的优点。每一轮均包括与正常血浆的竞争。在存 在干扰血浆蛋白质和其它生物实体的情况下，适体可能对靶标更具选择性。
[0770] 变体4:在混合的珠子上平行的癌症/正常的适体选择。工作流：
[0771] ->将源自癌症的微囊泡捕获/缀合至磁珠。
[0772] ->将正常(非癌症)的微囊泡捕获/缀合至非磁珠。
[0773] ->混合两种珠子组并采用起始适体文库进行适体筛选和选择过程。
[0774] ->与适体文库一起温育之后分离磁珠和非磁珠。使用磁体捕获磁珠，然后离心以 分离非磁珠。
[0775] ->分别洗涤分离的磁珠和非磁珠。
[0776] _>分别从两种类型的珠子中洗脱并重新扩增适体。
[0777] ->第2轮:混合从两种类型的珠子中扩增的适体池并添加至混合的珠子。
[0778] ->重复以上
[0779] 变体4的潜在优点包括：（i)使用适体文库的相同的等份开始癌症和非癌症微囊泡 两者的适体筛选和选择过程；（ii)在每一轮中利用一种混合物中的癌症与非癌症微囊泡之 间的竞争；（iii)上清液可作为附加的竞争剂添加以增加选择严格性；（iv)平行富集竞争中 的癌症和非癌症特异性适体，以产生鉴定仅正常或仅癌症（因为具有结合任何一个的选择） 的适体。 实施例18:鉴定源自乳腺癌(BrCa)的微囊泡的适体
[0780] 在该实施例中，筛选适体文库以鉴定区分乳腺癌患者的血液中循环的微囊泡与在 健康的对照个体（即，没有乳腺癌）的血液中循环的微囊泡的适体。该程序使用与以上实施 例12中类似的样品、起始适体文库以及阳性和阴性选择轮。该实施例中的程序在以下所示 的分析逻辑和工作流方面是不同的：
[0781] 分析逻辑
[0782] 与实施例12中相比的测序数据分析的备选变体被应用于来自癌症/非癌症富集的 SUL1RNA文库的数据，所述数据是在阳性和阴性选择的第10轮(R10)之后在癌症/非癌症外 来体和相应的排除微囊泡的血浆上探测的(参见实施例12)。分析在该实施例中使用的测序 数据的特定修饰如下：
[0783] -使用特定适体的频率而非原始读计数，原始读计数可能受到总的回收和重新扩 增的影响。特定适体的读计数归一化为总计数(具有正确引物的所有适体长度)考虑到在整 个群体中特定适体的相对丰度，其可以提高在从靶标中洗脱与测序之间的所有步骤的一致 性。
[0784] -第一次作为适体选择的标准而使用的特定适体(适体从靶标中洗脱的频率/在输 入文库中相同适体的频率）的富集，允许无视计数而快速估计所有适体的结合能力。注意， 之前使用的所有适体选择策略仅考虑到最高频率的适体。
[0785] -使用倍数变化来测量与靶标相对非靶标的结合中的差异。其中倍数变化仅用于 已经证明富集的适体的频率。
[0786] -RNA相对DNA:因为采用双链DNA和RNA的混合物完成了选择。适体的任何一种形式 可能是结合剂。为了解决这个问题，四个样品用双链DNA适体文库(第10轮选择的前体)进行 探测，并且特定RNA适体的频率被在DNA版本中的相同适体的频率分割。
[0787] 分析工作流
[0788] 1)计算在总读数中具有正确引物的各适体的频率。
[0789] 2)使从与癌症微囊泡的结合中回收的序列与输入文库以及从与其它三种类型的 样品（排除微囊泡的癌症血浆上清液、非癌症微囊泡、排除微囊泡的非癌症上清液）的结合 中回收的那些序列，以及从双链DNA结合中回收的那些重叠。
[0790] 3)计算相比于输入文库与癌症微囊泡结合的RNA文库中特定适体的"富集"。考虑 到基于输入与结合群体之间适体频率的差异的三种阈值类别：相比于输入，2-5倍、5-10倍 和多于10倍的更高的频率。
[0791] 4)计算相比于与排除微囊泡的癌症血浆、非癌症微囊泡和排除微囊泡的非癌症血 浆结合的文库中的相同序列，与癌症微囊泡结合的RNA文库中特定适体的"倍数变化"。考虑 到倍数变化大于或等于2。
[0792] 5)计算关于癌症微囊泡的特定RNA适体相比于富集的相应DNA适体的频率的差。具 有0.5-1.5的RNA/双链DNA频率比的适体可以以双链DNA和RNA两种版本结合微囊泡。具有大 于或等于2的RNA/双链DNA频率比的适体可以以RNA适体的方式更有效地结合。
[0793] 6)过滤大于10的关于"富集"的数据，三种对照类型的样品（排除微囊泡的癌症血 浆上清液、非癌症微囊泡、排除微囊泡的非癌症上清液)的倍数变化> =2。这提供了适体的 第一列表。重复过滤5-10和2-5范围的关于"富集"的数据将相应地得到适体的第二和第三 列表。
[0794] 7)考虑在适体最终列表中RNA/双链DNA比以鉴定哪个适体版本（即，DNA或RNA)可 能具有更有效的结合。
[0795] 从这些程序中获得的许多代表性序列示于表12。使用以上工作流鉴定表中的序 列，以相比于其它血浆组分或非癌症血浆选择性地结合从BrCa血浆中分离出的微囊泡。在 表12中，所述序列从左至右显示5'至3'，其中各个全序列包含指示的5'前导序列，接着指示 的可变序列，接着指示的3'尾序列。各个序列来源于具有前导和尾(参见以上详述），并且在 中间具有可变序列的文库。应当理解，公开在表12中的核苷酸序列还可以在一定程度上进 行修饰，该程度使得所得修饰产生具有与公开的序列约50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%同源的适体，并保留与微囊泡抗原或其功能 片段结合的功能性。 表12: BrCa微囊泡适体候选物序列
[0796] 在表12中的适体被鉴定为在针对癌症微囊泡相对非癌症微囊泡而选择的适体池 中具有相比于输入文库至少10倍和至少5倍更普遍的富集。
[0797] 表12中各个序列以两种变体进行合成，以用于进一步研究。5'生物素化和3'生物 素化。这提供了根据需要可以在5'端或3'端被捕获的适体变体。进一步合成适体，其中各个 嘧啶(C和U)被2'氟修饰。对应于表12中各个RNA序列的DNA序列提供于表中，其中DNA序列直 接跟在其相应的RNA序列的后面。例如SEQ ID N0.10529是对应于RNA序列SEQ ID N0.10528 的DNA序列，等。如上所述，合成两种形式的适体以用于进一步表征。 实施例19:适体文库生成
[0798] 在该实施例中，使用不同浓度的核苷酸代替典型的等摩尔浓度，生成具有高度多 样性的适体文库。参见图12。在提供这种变化的核苷酸浓度方面，产生的随机序列文库根据 核苷酸输入的特定浓度包含具有A/T与G/C之间的不同比的寡核苷酸。此外，所得文库提供 了更大的化学和结构多样性的寡核苷酸分子，其益处是提供了将存在于复合输入样品（例 如，组织或组织组分、细胞或细胞组分、细胞外囊泡等）中的多个靶标的更多的潜在结合配 偶子。这种高度多样化随机文库被用作输入来富集对于存在于输入样品中的所需靶标具有 高亲和力的寡核苷酸。出乎意料地，发现了显示与疾病相对非疾病样品（例如，癌症相对非 癌症)差异结合的适体，所述适体当利用标准等摩尔浓度的核苷酸时是不可用的。
[0799] 如本文所述，通过若干轮选择处理起始适体输入文库，以富集诸如通过测序提供 差异读出的子集文库。起始输入文库本身可包含多个子集文库，其中使用不同浓度的G和C 核苷酸生成每一个子集文库，以便生成具有较高或较低的最终GC含量的核酸。在本发明的 这一方面，超出25 %的各个不同浓度的核苷酸(例如，仅仅作为一个例子，12.5 %各个A/T和 37.5%各个GC)可以包括与G/C核苷酸相比增加/减小的A/T浓度。例如，使用特定文库的G 和/或C核苷酸浓度生成一个或多个随机序列文库，该文库是任何地方的约5 %至约95 % (其 包括任何的5至95单一计量单位范围）的总核苷酸浓度。示例性但非限制性的核苷酸浓度示 于表13。 表13:适体文库生成的示例性核苷酸百分比
[0800]用于选择一个或一组适体的起始输入文库可以由具有不同核苷酸含量的至少一 个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)子集文库组成。各个子集文库可以包含例如1012个 不同的寡核苷酸（1.7pmol的80个碱基文库）。在一个非限制性的实例中，输入文库由三个子 集文库组成，各自分别具有25 %、50 %和75 %的GC含量。基于本文申请人的学说，如本文所 公开的，子集文库的数目和各子集文库的GC含量两者均可变化，以提供不同的输入文库，这 对于本领域的普通技术人员是显而易见的。可以使用小于、等于或大于50%G和/或C的核苷 酸来生成在输入文库中使用的子集文库。
[0801] 因此，本发明提供了一种生成具有高度多样性的起始寡核苷酸文库的方法。这种 文库提供了在使用适体文库作为区分两种样品/状态的根据来评估疾病或病况方面的改 进。它可明显区别于鉴定对于特定已知或未知的靶标特异性的适体的传统技术。在不同的 实施方案中，所使用的核苷酸可以是天然的核苷酸，经修饰的核苷酸，使用非天然的核苷酸 或它们的组合。这种经修饰的或非天然的核苷酸的种类是已知的。 实施例20:寡核苷酸探针文库
[0802] 在该实施例中，使用寡核苷酸检测方法(参见，例如，以上实施例15)把乳腺癌患者 样品与正常（即，由阴性活组织检查所证实的非乳腺癌）的生物样品区分开。用于检测和/或 区分样品的寡核苷酸文库可以在本文被称为"寡核苷酸探针文库"或"寡核苷酸谱分析文 库"。针对来源于乳腺癌患者和正常(非癌症)个体的血液的微囊泡训练随机化寡核苷酸文 库。使用关于图13D的上述方法。参见图14A。
[0803] 缺乏经验的输入寡核苷酸文库包括具有以下序列： 5'-ATCCAGAGTGACGCAGCA-30n-TGGACACGGTGGCTTAGT-3'（SEQ ID 如.10558)的3/磷酸 化ssDNA寡核苷酸文库，其中η包括A、T、C、G、U或其它核苷酸。如上所示，各寡核苷酸具有中 心30核苷酸可变区的18个核苷酸引物区。仅有的修饰是单一的3'磷酸化核苷酸。进行阳性 选择，其中来自乳腺癌患者的血浆样品与未经训练的输入文库进行接触。通过超速离心收 集样品中的微囊泡，并且洗脱并收集与微囊泡一起保留的寡核苷酸。使用保留的寡核苷酸 作为下一轮选择的输入，重复这些步骤。随后通过使文库与非癌症患者血浆接触，部分经训 练的文库经受阴性选择。通过超速离心收集样品中的微囊泡，丢弃结合非癌症微囊泡的寡 核苷酸，保留在超速离心上清液中发现的那些寡核苷酸（即，没有结合非癌症微囊泡的那 些）。再次重复进行针对来自癌症患者的微囊泡的阳性选择。处理经训练的文库以去除PCR 和其它非特异性产品。剩余的寡核苷酸包括优选识别源自癌症的微囊泡的经训练的寡核苷 酸探针文库。反向重复这一相同过程，以鉴定优选识别源自非癌症的微囊泡的经训练的寡 核苷酸探针文库（即，针对非癌症样品的阳性选择和针对癌症样品的阴性选择）。通过混合 一半重量的各文库创建联合文库。利用该过程并经由新一代测序(Illumina MiSeq平台）确 定文库组成，创建1，395，706个单一序列的寡核苷酸池。其中，一次检测843，729个序列。寡 核苷酸池中按最多至最少出现的顺序排序的500,000个最常出现的序列在本文中并入SEQ ID N0.10559-510558。
[0804] 采用寡核苷酸探针文库测试样品的方案描述在以下实施例21中。简而言之，使血 浆样品与经训练的寡核苷酸探针文库接触。使用超速离心从接触的血浆样品中分离微囊 泡。与微囊泡一起保留的寡核苷酸被洗脱并使用新一代测序方法进行测序。测定结合微囊 泡的保留的寡核苷酸的频率。
[0805]使用以上方法开发的寡核苷酸探针文库显示良好的回收率、信噪比和再现性。图 14B显示了结合输入样品（即，血浆微囊泡）的寡核苷酸的数目的图。获得输入样品(标有"血 衆"）与结合的寡核苷酸的数目之间的线性关系(r 2 = 0.99)。与此相反，很少有任何寡核苷 酸与包含人血清白蛋白（标有"HSA"）或无微囊泡的血浆上清液(标有"SN"）的对照样品结 合。图14C显示该方法高度可再现，其中多个测序运行显示高度线性相关。在该图中，以lx和 2x浓缩探测来自单一样品的微囊泡。以两倍于结合2x输入的许多寡核苷酸观察到线性关 系。该图是许多这种实例中的一个。当比较关于相同样品的不同测序运行或相同血浆样品 的不同超速离心制备时，观察到类似的线性关系。与此相反，当比较不同患者样品之间的测 序谱时，观察到大的扩散。因此，患者样品之间的差异显著大于技术变化的来源，这显示该 方法能够测量潜在生物系统的方差。图14D显示通过比较已知实际输入与测得的输出而形 成的标准曲线。每一个样品的标准曲线的纳入允许样品之间的绝对量化和归一化。
[0806]重要的是，我们观察到，该方法的方差是测序深度的函数，并因此可以通过进行测 序运行的次数来控制。图14E示出了这一要点。通过对结合输入样品的探针文库进行测序而 获得结果。该图显示了针对检测到的结合的寡核苷酸的数目而标绘的变异系数(CV)。如上 可见，经测序的寡核苷酸的数目越大使得检测的序列具有越低的CV。因此，所述分析是可再 现的，因为方差可通过增加收集的量或测序数据而受到控制。图14F揭示了检测的高频率寡 核苷酸的分布。框内的适体指示可再现寡核苷酸的子集(CV<0.2)。这些寡核苷酸具有作为 单独标志物的潜在用途。
[0807]根据图14B-14F的结果，针对乳腺癌和正常样品而训练的寡核苷酸探针文库的检 测在低噪音的情况下是可再现的。鉴定显示乳腺癌与正常样品的最大分离的寡核苷酸探针 文库的单独成员。图14G显示了对于血浆中的乳腺癌微囊泡而富集的寡核苷酸探针文库的 测序谱(频率相对计数)的图。在图中观察到标志物的多个亚群体。图14H显示了四个单独的 寡核苷酸的图，该图显示出乳腺癌患者与活组织检查阴性对照之间的差异。这些寡核苷酸 被鉴定为优选结合癌症样品。还可以组合多个单独的寡核苷酸。图141显示了优选结合癌症 样品的20个单独寡核苷酸的组合的图。如图可见，在乳腺癌患者与活组织检查阴性对照之 间观察到完全分离。这些20个单独的寡核苷酸的序列示于表14。类似地，图14J显示了由优 选结合正常样品的四个代表性的单独寡核苷酸获得的结果，并且图14K显示了优选结合正 常样品的20个单独寡核苷酸的组合的图。这些20个单独的寡核苷酸的序列示于表14。如图 141，在乳腺癌患者与活组织检查阴性对照之间观察到完全分离。 表14:使用寡核苷酸探针文库检测乳腺癌
[0808] 可以组合任何数目的单独寡核苷酸的结果。例如，图14L显示了通过组合相对正常 样品(NC1-9)优选结合癌症样品（C1-10)的46个单独寡核苷酸而获得的结果。选择这些46个 寡核苷酸，因为其显示癌症和正常样品之间频率的倍数变化为2.2。如上，在这些样品中观 察到的灵敏度和特异性均为100%。
[0809] 该实施例示出了寡核苷酸探针文库的开发和区分血浆样品和癌症或非癌症的寡 核苷酸探针文库的用途。如上所示，该方法提供了样品之间100%的分离。技术人员将理解， 该方法可用于区分其它类型的生物实体(例如，细胞、蛋白质复合物)与表型（例如，不同的 癌症、不同的疾病）。 实施例21:用于多种指示的寡核苷酸探针文库
[0810] 在该实施例中，对如上所述在实施例20中的寡核苷酸探针文库关于区分多种类型 的癌症和其它疾病与正常（即，非疾病的）的样品的能力进行测试。对于该实施例血浆和血 清基于样品可用性被用作输入样品。
[0811]文库富集的一般方法如下。起始缺乏经验的文库基于如上所述实施例20中的SEQ ID N0.10558。该文库包含约1012个独特代表(例如，单链DNA寡核苷酸、ssDNA)。进行若干阳 性富集(结合）以及相反富集(减少的）步骤。对于结合特定样品群体(例如，该实施例中的乳 腺癌患者）的微囊泡的寡核苷酸的富集，起始文库与由患者样品获得的血浆的池进行混合 并温育。进行离心步骤以分离样品中的微囊泡。已成功使用超速离心或采用低速离心的聚 合物沉淀(例如，PEG4000、PEG8000)。对微囊泡具有亲和力和特异性的寡核苷酸在离心过程 中保持结合，而非特异性结合通过添加竞争剂(例如，鲑鱼精DNA、tRNA、SI、CM-D、它们的组 合等）而受到抑制。当丢弃上清液时，非结合的寡核苷酸和非外来蛋白质的结合剂（诸如 HSA)被去除。从重悬的微囊泡颗粒中回收(洗脱)结合的寡核苷酸。为了排除来自第二样品 群体(例如，健康的对照诸如非癌症患者）的结合剂的文库，回收的寡核苷酸池与来自第二 样品群体的样品的池进行混合，并且在对照样品中的微囊泡的结合剂通过丢弃由离心产生 的颗粒而去除。在第二阳性富集中，上清液（目前其包含结合第一样品群体而非第二样品群 体的寡核苷酸)与来自第一样品群体的另一等份的分离的微囊泡进行混合，并回收代表单 轮富集的文库的结合剂。该方案可迭代多次，以进一步富集文库并降低它的复杂性。在最终 步骤中，文库通过PCR进行扩增，并通过λ核酸外切酶消化回复至 SSDNA，并进行清理。进行相 同的程序以富集相对于第一(癌症)群体的第二(对照)群体的结合剂。两个富集的文库的组 合包含具有靶标特征的两种样品群体的结合剂，例如，上调和下调的癌症标志物两者的结 合剂。富集的文库的组合随后用作寡核苷酸探测文库。富集（文库中含有的拷贝和种类数 目）的过程之后是qPCR和高通量测序。
[0812]针对如实施例20中单独的样品，对富集的寡核苷酸探针文库进行测试。方案描述 在以下实施例22中。简而言之，使血浆或血清样品与经训练的寡核苷酸探针文库接触。使用 超速离心从接触的样品中分离微囊泡。与微囊泡一起保留的寡核苷酸被洗脱并使用新一代 测序方法进行测序。测定结合微囊泡的保留的寡核苷酸的频率。该方法用于把正常的血清 或血浆与来自如表16中所示的各种指示的血清或血浆区分开。使用聚类分析创建热度图， 并示于图15A-AN中的指示。寡核苷酸被选为那些在状况与正常样品之间具有p<0.1，以及 在所有样品中显示出至少1〇〇倍(作为质量测量)的寡核苷酸。过滤后，保留165个序列，如表 15所示。在图15A-AN中的图中，单独的寡核苷酸示于Y轴，而样品示于X轴(正常样品也同样 表不）。表15中的序列是没有侧翼测序引物区的输入文库的可变区。表16表不在图15A-AN的 相应热度图中显示为不同指示的来自表15的序列。 表15:过滤选择寡核苷酸探针文库以检测不同状况表16:使用寡核苷酸探针文库检测不同状况
[0813] 图15A-AN中的数据显示寡核苷酸探针文库能够区分疾病和正常样品。这通过该图 中的患病样品的聚类可以看出。例如，在图15A中，该图中阿尔兹海默病样品聚集在左边，而 正常样品聚集在右边。图15H结直肠癌、图15L心血管疾病和图15X多发性硬化示出了类似的 结果。在图15E中，除了膀胱癌样品之一的所有样品发现于中心聚类。图15K宫颈癌是类似 的。技术人员将理解，寡核苷酸探针文库的一般性质可通过针对多种输入样品训练和组合 所得寡核苷酸池而得到强化。
[0814] 在该实施例中，在乳腺癌环境中训练的寡核苷酸探针文库用作通用探针，以区分 正常样品与各种患病样品（例如，癌症、自身免疫、神经学的和心血管的）。出乎意料地，该文 库从正常样品中有效区分出大部分的患病样品。不受理论束缚，该技术因为寡核苷酸文库 针对多样化微囊泡群体而进行训练并仍含有许多多样性而工作是可能的。 实施例22:采用寡核苷酸探针文库的体液探测
[0815] 以下方案用于使用例如以上实施例15和20-21中的寡核苷酸探针文库探测体液诸 如血浆或血清样品。
[0816] 输入寡核苷酸文库：
[0817] 每个样品使用2ng的输入寡核苷酸文库。
[0818] 输入寡核苷酸文库是两个文库的混合物，癌症和非癌症富集的浓度为16.3ng/ul。
[0819] 使用适体缓冲液(在IX PBS中3mM MgCl2)稀释至〇.2ng/ul日常储存。
[0820]从日常储存(等于2ng文库）中添加10ul至每个指封管(optiseal)管。
[0821] 材料：
[0822] PBS，Hyclone SH30256.01，LN:AYG165629,瓶#8237，exp.7/2015
[0823] 圆底离心管，Beckman 326820，LN:P91207
[0824] Opt i Seal离心管和插头，异质同晶聚合物Koni cal，Beckman 361621，批号 Z10804SCA
[0826] 超速离心机转子：50.4TI，Beckman Caris ID#0478
[0827] 方案:
[0828] 1在4°C下预冷台式离心机、超速离心机、桶和转子。
[0829] 2融化血浆或血清样品
[0830] 3使用适体缓冲液(在IX PBS中3mM MgCl2)以1:2稀释lml的样品。
[0831] 4在4°C下以2000xg旋转30min去除碎片（台式离心机）。
[0832] 5转移所有样品的上清液至圆底圆锥
[0833] 6在4°C下以12,000xg旋转45min去除另外的碎片。
[0834] 7转移所有样品的约1.8ml的上清液至新的OptiSeal钟形顶管(独特标记的）。
[0835] 8将2ng(在10ul中）的DNA探测文库添加至各个optiseal管。
[0836] 9用适体缓冲液QS至4.5ml
[0837] 10在OptiSeal钟形顶管上安装帽
[0838] 11在帽周围涂敷石蜡膜以防止泄漏
[0839] 12在室温下使血浆与寡核苷酸探针文库旋转温育1小时
[0840] 13去除石蜡膜(但不去除帽）[0841 ] 14在各个塞紧的管的顶部放置恰好的隔离物
[0842] 15在管上标记颗粒面积，确保该标记从中心朝外。
[0843] 16在4°C下以120,000xg旋转管2hr(内排，33,400rpm)以使微囊泡沉淀。
[0844] 17检查标记仍然从中心指向外部。
[0845] 18通过从颗粒标志物的对侧收集液体并使用10ml注射器筒和21G2针，从颗粒中完 全去除上清液
[0846] 19将上清液丢弃在生物危害废弃物容器中
[0847] 20添加用IX PBS稀释的 lml的3mM MgC12
[0848] 21以1600rpm轻柔地涡旋5sec，并在室温下温育5min。
[0849] 22用经IX PBS稀释的3mM Mg C12 QS至约4.5mL。
[0850] 23在OptiSeal钟形顶管上安装帽[0851 ] 24在各个塞紧的管的顶部放置恰好的隔离物
[0852] 25在管上标记颗粒面积，确保该标记从中心朝外。
[0853] 26在4°C下以120，OOOxg旋转管70min(内排，33，400rpm)以使微囊泡沉淀。
[0854] 27检查标记仍然从中心指向外部。
[0855] 28通过从颗粒标志物的对侧收集液体并使用10ml注射器筒和21G2针，从颗粒中完 全去除上清液
[0856] 29将上清液丢弃在生物危害废弃物容器中
[0857] 30添加用IX PBS稀释的 lml的3mM MgC12。
[0858] 31以1600rpm轻柔地涡旋5sec，并在室温下温育5min。
[0859] 32用经IX PBS稀释的3mM MgC12 QS至约4.5mL。
[0860] 33在OptiSeal钟形顶管上安装帽[0861 ] 34在各个塞紧的管的顶部放置恰好的隔离物
[0862] 35在管上标记颗粒面积，确保该标记从中心朝外。
[0863] 36在4°C下以120，OOOxg旋转管70min(内排，33，400rpm)以使微囊泡沉淀。
[0864] 37检查标记仍然从中心指向外部。
[0865] 38保存上清液的等份（100ul放入1 · 5ml管中）
[0866] 39通过从颗粒标志物的对侧收集液体并使用10ml注射器筒和21G2针，从颗粒中完 全去除上清液
[0867] 40将50ul无核糖核酸酶的水添加至颗粒侧。
[0868] 41留15min在实验台上温育
[0869] 42使用干净的剪刀剪掉管的顶部。
[0870] 43使颗粒重悬，在颗粒侧上下吸液[0871 ] 44测量体积，记下体积以便归一化所有的样品
[0872] 45转移测得的具有结合的寡核苷酸的重悬洗脱微囊泡至不含核糖核酸酶的1.5ml Eppendorf管
[0873] 46归一化所有样品至lOOul，以保持它甚至跨越样品和实验之间。
[0874] 新一代测序样品制备:
[0875] I)使用50ul的以上样品，使其重悬于lOOul H20中和含有微囊泡/寡核苷酸的复合 物中，作为转座子PCR中的模板，14次循环。
[0876] II)AMPure转座子PCR产物，使用全部回收以索引PCR，10次循环。
[0877] III)检查凝胶上的索引PCR产物，如果条带可见则进行AMPure。如果条带不可见则 添加3次循环，检查凝胶。纯化后用QuBit定量化产物，并进行变性和稀释以装载至HiSeq流 动池 （Illumina Inc.，San Diego，CA) 〇
[0878] IV)每一个流动池，5个样品将被多路复用。每个HiSeq 10个样品。
[0879] 数据分析(例如，如在实施例21中）:
[0880]匹配两种引物序列的来自HiSeq分析的所有序列读数彼此进行比较。计算各单一 序列读数的计数，并用作结合的信号。序列计数通过各样品的序列读数的总数进行归一化。 比较各单一序列的归一化的计数以鉴定寡核苷酸，所述寡核苷酸显示在来自相同样品类型 (即血清和血浆)的疾病状况与正常对照之间与样品结合的不同水平。仅考虑所有样品的平 均计数大于100的序列。如果样品之间的相似性显示在热度图和树状图中，使用分层聚类和 程度将来自具有差异结合的适体的寡核苷酸数据进行聚类。 实施例23:高通量测序的最优适体文库设计[0881 ]在典型的适体文库构建中，例如，用于选择目的诸如SELEX，文库的每个成员包含 在两个保守的侧翼序列之间插入的可变核苷酸序列区。在各种用途中，保守区可以用作扩 增诸如用于选择轮之间的PCR扩增的引发位点、测序和杂交的引发位点。正向和反向引物可 以在本文中被称为左(5')和右(3')端引物。由于适体文库序列的两端是完全相同的，该文 库被认为是低多样性以用于测序目的。这可能导致在扩增中引入偏倚或其它这种偏倚。在 一些高通量测序方法的情况下，例如，对于基于Illumina的新一代测序(NGS)，第一测序读 数在克隆扩增后在流动池的表面上建立聚类。在文库成员的开始具有相同碱基区使得更难 以区分荧光信号，并相应地更难以进行测序。Illumina建议对低多样性文库进行测序的各 种解决方案：（i)混合含有样品的文库与50 %噬菌体PhiX基因组以引入多样性；（i i)将对照 样品添加至在同一流动池中的不同泳道；和（iii)使一个样品内的文库错开。选项（i)和 (ii)减少了一半的总测序输出，并因此不是最优的。选项（iii)显示可变的结果：它成功地 应用于MiSeq NGS仪器，但不是在HiSeq NGS仪器上。
[0882] 该实施例描述了备选适体文库设计，它通过向自身文库引入多样性而使适体文库 的测序更有效。该实施例中的适体文库设计论述如下：1)没有在对照样品PhiX中掺加示踪 剂的情况下，在高通量测序仪器上对适体文库测序;2)在最大容量下在高通量测序仪器上 对适体文库测序;和3)在最大质量下在高通量测序仪器上对适体文库测序。作为说明，在该 实施例中使用该方法以帮助在其最大容量下使用MiSeq仪器。虽然该实施例聚焦在MiSeq平 台上用于说明的目的，但是该方法可以在任何合适的环境中使用，例如，寡核苷酸文库的多 样性可能存在争议的情况。
[0883] 设计缺乏经验的寡核苷酸文库（即，适体候选物文库），使得测序起点从保守外部 区（引物)转移到可变区。文库的左侧引物用转座子适体代替，该转座子适体与测序引物互 补。转座子适体与35核苷酸可变区之间插入的是0、1、2或3个核苷酸，它们用于创建在文库 设计中的偏移量。图17A显示了适体文库的右臂引物，它跟在可变区（即，SEQ ID NO.510768)的后面。除了提高多样性之外，单轮PCR可以用于采用该方法(例如，将索引和用 于杂交的衔接子添加至流动池）制备用于NGS的样品。这导致更有效的样品制备，并且可以 减少由PCR生成的潜在突变体的数目。
[0884] 在文库设计中的这一变化以并入转座子衔接子和偏移量改善了经测序的文库的 可变区中的测序质量。如下进一步所讨论的对图17C-D进行比较。为了进一步改善文库，左 面引物的序列也被设计为减少潜在的序列重叠，例如，通过图17A中的框所指示的，所述框 指示在使用图中单一序列（SEQ ID N0.510768)的错开的设计中具有重叠核苷酸的14个位 置。具有平衡设计的重新设计的引物序列中只包含五个位置，其中两个碱基是重叠的。参见 图 17B(显示SEQ ID N0.510769)。
[0885] 图17(：-17?示出了测序质量，其反映在每一个把369 383测序循环％>030。030相 当于错误碱基判定1/1000次的概率。图17C显示了采用起始设计的寡核苷酸文库的较低质 量测序的实例，其中所述测序从文库的保守的（完全相同的）部分开始。没有向测序运行中 添加 PhiX DNA。即使文库具有错开的设计，碱基判定软件已经错误判定这些区。
[0886] 图17D显示了标准文库的测序质量的实例，其中转座子衔接子被并入文库作为右 臂引物。在这一情况下，在可变区直接开始测序，这导致极大地提高了测序质量。然而，一旦 测序到达左臂引物，质量就下降。
[0887] 图17E显示了在图17A的引入错开的设计之后文库的测序质量的实例。如图可见， 测序质量相比于先前的非错开的设计得到提高。然而，在引物区的中间的若干碱基被潜在 地错误判定。
[0888] 为了最终调整测序质量，左臂引物的序列如图17B所示被重新平衡。图17F显示对 于图17E上大部分的较低的Q30得分碱基，质量提高了约50%。该设计改善了引物序列的碱 基判定，并允许与起始适体文库模式大部分有效匹配。
[0889] 图17C(最初的）和图17F(优化设计）的比较显示了适体文库设计和相应地测序质 量/输出的改善。
[0890] 改善的适体文库设计的附加优点通过针对目标生物靶标的适体序列的富集的效 率，和采用高通量测序的现有容量有效管理文库的可能性来证明。图17G-H显示了在针对乳 腺癌血浆外来体的富集之后相比于新的一步平衡文库设计（"F-TRin-35n-B" ；图17H)的传 统适体文库设计（"NPlm-30n" ；图17G)。如这些图中所示，改善的设计允许更有效的富集，如 下所示：（i)跨越不同读计数的种类数的正态分布下不同群体的存在；（ii)来自其余文库的 具有低计数的种类的改善的分离，这使得从它们最有可能通过PCR偏倚或在HiSeq SBS步骤 过程中创建的分析中排除序列；（iii)在富集的群体中的每一种类的平均读计数在2000-3000个拷贝的范围内，它允许增加测序通量;和(iv)当探测生物标本时最小化的技术变化。
[0891] 所得适体文库可如本文所述用于开发单独适体或寡核苷酸探针文库，例如，开发 诊断测定。
[0892] 尽管本发明的优选实施方案已在本文中进行了演示和描述，对于本领域的技术人 员而言很明显这些实施方案仅以示例性的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情 况下可想到大量的改变、变动和替换。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方 案可用于实施本发明。下列权利要求意图限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范 围中的方法和结构及它们的等同物。
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