识别IgG结合位点的方法
阅读：256发布：2021-09-20
专利汇可以提供识别IgG结合位点的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及具有降低的寡聚化和有效标记的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物以及组合物、产生这样的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物的方法和特别是在 疾病 治疗 和 预防 中利用这样的免疫球蛋白结合物的方法。，下面是识别IgG结合位点的方法专利的具体信息内容。
1.免疫球蛋白结合物，其包括在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)、25(VH)、125(CH1)、248(CH2)、
254(CH2)、286(CH2)、298(CH2)和326(CH2)的残基处具有至少一个突变的免疫球蛋白，其中所述至少一个突变是用半胱氨酸残基和原子或分子的置换，其中所述原子或分子结合到所述半胱氨酸残基。
2.权利要求1所述的免疫球蛋白结合物，其中所述至少一个突变是在选自7(VH)、
20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基处。
3.权利要求1所述的免疫球蛋白结合物，其中所述至少一个突变是在选自248(CH2)和
326(CH2)的残基处。
4.权利要求1所述的免疫球蛋白结合物，其中所述至少一个突变是在选自25(VH)和
286(CH2)的残基处。
5.权利要求1所述的免疫球蛋白结合物，其中所述至少一个突变是在选自254(CH2)和
298(VH)的残基处。
6.权利要求1-5中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
7.权利要求1-5中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述免疫球蛋白包括IgG1。
8.权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其包括人CH1结构域。
9.权利要求1-8中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其包括人CH2结构域。
10.权利要求1-9中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其包括人CH3结构域。
11.权利要求1-10中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其包括人CL结构域。
12.权利要求1-11中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其包括人VH结构域。
13.权利要求1-12中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其包括人VL结构域。
14.权利要求1-13中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其进一步包括具有至少两个活性位点的连接分子，其中第一个活性位点结合到所述免疫球蛋白的所述半胱氨酸残基，第二个活性位点结合到所述原子或分子。
15.权利要求14所述的免疫球蛋白结合物，其中所述连接分子选自腙、二硫化物、肽、螯合剂和马来酰亚胺。
16.权利要求1-15中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述原子或分子选自放射性核素、化学治疗剂、微生物毒素、植物毒素、聚合物、碳水化合物、细胞因子、荧光标记、发光标记、酶-底物标记、酶、肽、肽模拟物、核苷酸、siRNA、微小RNA、RNA模拟物和适配体。
90
17.权利要求1-15中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述原子或分子选自 Y、
131 67 177 213 211
I、Cu、 Lu、Bi、 At、加利车霉素、倍癌霉素、美登木素生物碱、奥利斯汀、蒽环类化合物、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、篦麻毒素、聚乙二醇、羟乙基淀粉和甘露糖基残基。
18.权利要求1-17中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述原子或分子降低未突变免疫球蛋白的免疫原性。
19.权利要求1-17中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述原子或分子增加未突变免疫球蛋白的免疫原性。
20.权利要求1-19中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述免疫球蛋白结合物进一步包括抗原结合活性，所述活性是所述未突变免疫球蛋白的所述抗原结合活性的至少
80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。
21.修饰或分离的免疫球蛋白，其包括在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)、25(VH)、125(CH1)、
248(CH2)、254(CH2)、286(CH2)和326(CH2)残基处的至少一个突变，其中所述至少一个突变是用半胱氨酸残基的置换。
22.权利要求21所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个突变是在选自
7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基处。
23.权利要求21所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个突变是在选自
248(CH2)和326(CH2)的残基处。
24.权利要求21所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个突变是在选自
25(VH)和286(CH2)的残基处。
25.权利要求21所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个突变是在残基
254(CH2)处。
26.权利要求21-25中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白选自包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
27.权利要求21-25中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包括IgG1。
28.权利要求21-27中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CH1结构域。
29.权利要求21-28中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CH2结构域。
30.权利要求21-29中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CH3结构域。
31.权利要求21-30中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CL结构域。
32.权利要求21-31中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人VH结构域。
33.权利要求21-32中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人VL结构域。
34.权利要求21-33中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白进一步包括抗原结合活性，所述活性是所述未突变免疫球蛋白的所述抗原结合活性的至少
80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。
35.分离或重组的多核苷酸，其编码权利要求21-34中任一项所述的免疫球蛋白。
36.载体，其包括权利要求35所述的多核苷酸。
37.权利要求36所述的载体，其进一步包括可操作地连接到所述多核苷酸的可诱导启动子。
38.宿主细胞，其包括权利要求36或权利要求37所述的载体。
39.生产免疫球蛋白的方法，其包括：
(a)提供包括权利要求38所述的宿主细胞的培养基；和
(b)将所述培养基置于所述免疫球蛋白被表达的条件下。
40.权利要求39所述的方法，进一步包括(c)分离所述免疫球蛋白。
41.产生免疫球蛋白结合物的方法，包括：
(a)提供权利要求21-34中任一项所述的免疫球蛋白；
(b)用还原剂还原一个或多个置换的半胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基；和(c)用原子或分子温育所述免疫球蛋白，其中所述原子或分子与所述还原的半胱氨酸残基反应，以形成免疫球蛋白结合物。
42.降低免疫球蛋白结合物的高浓药物制剂中免疫球蛋白表面暴露的半胱氨酸之间交联的方法，包括：
(a)提供免疫球蛋白；
(b)用半胱氨酸残基置换选自7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基，
(c)用还原剂还原一个或多个置换的半胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基；
(c)用原子或分子温育所述免疫球蛋白，其中所述分子与所述还原的半胱氨酸残基反应，以形成免疫球蛋白结合物；和
(d)产生免疫球蛋白结合物的高浓液体制剂，其中所述免疫球蛋白结合物浓度为至少
20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少
125mg/ml或至少150mg/ml。
43.权利要求42所述的方法，其中所述免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
44.权利要求42所述的方法，其中所述免疫球蛋白包括IgG1。
45.权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白包括人CH1结构域。
46.权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白包括人CH2结构域。
47.权利要求42-46中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白包括人CH3结构域。
48.权利要求42-47中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白包括人CL结构域。
49.权利要求42-48中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白包括人VH结构域。
50.权利要求42-49中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白包括人VL结构域。
51.权利要求42-50中任一项所述的方法，其中免疫球蛋白结合物包括抗原结合活性，所述活性是所述未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少
110％、至少120％或至少130％。
52.权利要求1-20中任一项所述的免疫球蛋白结合物在制备包含高浓液体制剂的药物中的用途，其中所述免疫球蛋白结合物为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
53.权利要求52所述的用途，其中所述药物用于治疗自身免疫疾病、免疫学疾病、传染病、炎性疾病、神经学疾病以及包括癌症在内的肿瘤学和瘤性疾病。
54.权利要求52所述的用途，其中所述药物用于治疗充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞和骨髓基质；骨丢失；佩吉特病、破骨细胞瘤；乳腺癌；废用性骨量减少、营养不良、牙周病、高歇病、朗格罕细胞组织细胞增多症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库兴综合征、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤维性骨发育不良、牙周重建和骨折；肉样瘤病；
溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理、和体液恶性高钙血症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；移植排斥、病毒性感染、血液学瘤形成和瘤样病症，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样霉菌病、套细胞淋巴瘤、巨滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，其包括B细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、和T细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿瘤，其包括外周T细胞白血病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大粒状淋巴细胞白血病、朗格罕细胞组织细胞增多症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、没有分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中枢神经系统的肿瘤，例如，脑瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和成视网膜细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌和血管系统的肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、脓毒病和败血症性休克、克罗恩病、牛皮癣、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植物排斥、血液学恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。
55.权利要求52所述的用途，其中所述药物用于治疗菌斑牛皮癣、溃疡性大肠炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、幼年特发性关节炎、黄斑变性、呼吸道合胞病毒、克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤、阿尔茨海默病、青光眼和多发性硬化症。
56.权利要求52-55中任一项所述的用途，其中所述药物进一步包括药学上可接受的赋形剂。
57.权利要求52-56中任一项所述的用途，其中所述制剂包括至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的所述免疫球蛋白结合物，其是非寡聚化单体。
58.权利要求57所述的用途，其中所述单体的百分比通过非还原SDS-PAGE分析测量。
59.权利要求1-20中任一项所述的免疫球蛋白结合物作为非寡聚化药物活性成分的用途。
60.权利要求1-20中任一项所述的免疫球蛋白结合物作为诊断工具的用途。
61.权利要求5-16中任一项所述的免疫球蛋白结合物作为高分子量蛋白标准物的用途。
62.免疫球蛋白结合物作为高分子量蛋白标准物的用途，其中所述免疫球蛋白结合物包括在残基440(CH3)具有至少一个突变的免疫球蛋白，其中所述至少一个突变是用半胱氨酸残基和原子或分子的置换，其中所述原子或分子结合到所述半胱氨酸残基。
63.药物组合物，其包括权利要求1-20中任一项所述的免疫球蛋白结合物和药学上可接受的赋形剂。
64.权利要求63所述的药物组合物，其中所述免疫球蛋白结合物浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
65.权利要求63或权利要求64所述的药物组合物，其中所述免疫球蛋白结合物的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是非寡聚化单体。
66.选择用于突变为半胱氨酸的免疫球蛋白的残基的方法，包括：
(a)计算所述免疫球蛋白所述表面上的第一氨基酸残基的空间聚集倾向；
(b)计算所述第一残基紧邻区域内所述免疫球蛋白的多个残基的空间聚集倾向；和(c)如果所述第一氨基酸残基的所述空间聚集倾向等于0和-0.11的值或位于0和-0.11的值之间，和如果所述多个残基具有小于0的空间聚集倾向，选择用于突变为半胱氨酸的所述第一氨基酸残基。
67.权利要求66所述的方法，其中所述多个残基在所述第一残基的 内。
68.权利要求66所述的方法，其中所述多个残基在所述第一残基的 内。
69.权利要求66所述的方法，其中所述多个残基在所述第一残基的 内。
70.权利要求66所述的方法，其中所述多个残基在所述第一残基的 内。
71.权利要求66-70中任一项所述的方法，其中计算残基的所述空间聚集倾向包括计算具有以所述残基中原子为中心的半径的球形区域的所述空间聚集倾向。
72.权利要求71所述的方法，其中所述球形区域的半径为至少
73.修饰或分离的免疫球蛋白，其包括至少一个表面暴露的残基向半胱氨酸的突变，其中所述残基的所述空间聚集倾向等于0和-0.11的值或位于0和-0.11的值之间，并且其中所述第一残基紧邻区域内所述免疫球蛋白的多个残基的所述空间聚集倾向具有小于0的空间聚集倾向。
74.权利要求73所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述多个残基在所述第一残基的 内。
75.权利要求73所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述多个残基在所述第一残基的 内。
76.权利要求73所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述多个残基在所述第一残基的 内。
77.权利要求73所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述多个残基在所述第一残基的 内。
78.权利要求73-77中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中计算具有以所述残基中原子为中心的半径的球形区域的所述空间聚集倾向。
79.权利要求78所述的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述半径为至少
80.选择突变为半胱氨酸的免疫球蛋白的残基的方法，包括：
(a)选择所述免疫球蛋白的多个氨基酸残基，其中所述多个残基暴露在所述免疫球蛋白的所述表面上；
(b)将所述多个残基中的一个残基突变为半胱氨酸残基；
(c)将所述半胱氨酸残基结合到原子或分子以形成免疫球蛋白结合物；
(d)测试所述免疫球蛋白结合物的交联倾向和赋予所述免疫球蛋白结合物交联倾向值；和
(e)如果所述交联倾向值是I或II，选择用于突变为半胱氨酸的所述残基。
81.权利要求80所述的方法，进一步包括如果小于5％的所述免疫球蛋白结合物形成二聚体并且所述免疫球蛋白结合物没有形成三聚体，赋予所述免疫球蛋白结合物交联倾向值II，其中二聚体和三聚体的形成通过比较型非还原和还原SDS-PAGE测量。
82.权利要求81所述的方法，进一步包括如果小于1％的所述免疫球蛋白结合物形成二聚体，赋予所述免疫球蛋白结合物交联倾向值I，其中二聚体的形成通过比较型非还原和还原SDS-PAGE测量。
识别IgG结合位点的方法
发明领域
[0001] 本公开涉及改良的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物。
[0002] 背景
[0003] 单克隆抗体具有巨大的实验和治疗用途。具有工程化位点特异性荧光或结合性质的抗体衍生物已被开发并使用了许多年。最近，抗体也已被发展为治疗剂，目前呈现最快
增长的药物类别[1]。抗体是通过二硫键结合在一起的两条轻链和两条重链的多结构域蛋
白质。可变区指定结合到特定抗原，恒定区部分通过结合到免疫细胞表面的Fc受体引起
效应子功能。由于在各种疾病治疗中的潜力，抗体目前构成最快速增长的人类治疗剂种类
(Carter.Nature Reviews Immunology.2006，6(5)，343)。自从2001，它们的市场已以35％的平均年生长率增长，这是所有生物技术药物分类中最高的速率(S.Aggarwal.Nature.
BioTech.2007，25(10)1097)。
增长的药物类别[1]。抗体是通过二硫键结合在一起的两条轻链和两条重链的多结构域蛋
白质。可变区指定结合到特定抗原，恒定区部分通过结合到免疫细胞表面的Fc受体引起
效应子功能。由于在各种疾病治疗中的潜力，抗体目前构成最快速增长的人类治疗剂种类
(Carter.Nature Reviews Immunology.2006，6(5)，343)。自从2001，它们的市场已以35％的平均年生长率增长，这是所有生物技术药物分类中最高的速率(S.Aggarwal.Nature.
BioTech.2007，25(10)1097)。
[0004] 抗体结合物的工程化已进一步增加了抗体应用的多样性。在许多实验室技术中，酶或荧光探针与抗体结合以实现测定功能，例如抗原丰度的定量。在靶向治疗的情况下，毒素小分子连接到特异地结合患病细胞上的生物标记的抗体[2-4]。已进行了抗体结合的各
种方法，例如连接到表面赖氨酸[5]、连接到Fc碳水化合物[6]或连接到部分还原的链间二
硫化物[7]。
种方法，例如连接到表面赖氨酸[5]、连接到Fc碳水化合物[6]或连接到部分还原的链间二
硫化物[7]。
[0005] 抗体结合到工程化表面半胱氨酸依然是非常有吸引力的选择，因为大多数抗体不具有半胱氨酸，除了在链内和链间二硫键中消耗的半胱氨酸。小分子可在通过巯基反应化
学如马来酰亚胺连接在半胱氨酸置换的特异位点[8-14]。在CH1和CH3结构域的工程化已
有利避免可变区的抗原结合和CH2效应子功能的干扰。已考虑了通过工程化半胱氨酸的成
功抗体结合的不同标准。例如，在其中实现突变的抗体结构域、突变位点的暴露、将被置换的氨基酸是将要考虑的几个变量。已发展了鉴定适于半胱氨酸工程改造和结合的位点的高
通量筛选方法[15]。与抗体半胱氨酸变体相关的两个最常见的问题是寡聚化和弱标记。然
而，没有预测是否抗体半胱氨酸变体将是稳定的和有效结合的通用工具。此外，半胱氨酸变体目前只为CL、CH1和CH3结构域存在[8，9，11，12，15]。
学如马来酰亚胺连接在半胱氨酸置换的特异位点[8-14]。在CH1和CH3结构域的工程化已
有利避免可变区的抗原结合和CH2效应子功能的干扰。已考虑了通过工程化半胱氨酸的成
功抗体结合的不同标准。例如，在其中实现突变的抗体结构域、突变位点的暴露、将被置换的氨基酸是将要考虑的几个变量。已发展了鉴定适于半胱氨酸工程改造和结合的位点的高
通量筛选方法[15]。与抗体半胱氨酸变体相关的两个最常见的问题是寡聚化和弱标记。然
而，没有预测是否抗体半胱氨酸变体将是稳定的和有效结合的通用工具。此外，半胱氨酸变体目前只为CL、CH1和CH3结构域存在[8，9，11，12，15]。
[0006] 因此，存在另外的可用于产生稳定免疫球蛋白结合物的免疫球蛋白半胱氨酸变体的需要。
[0007] 概述
[0008] 本文描述满足该需要的改良的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物，其显示降低的交联。
[0009] 因此一方面包括免疫球蛋白结合物，其包括在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)、25(VH)、125(CH1)、248(CH2)、254(CH2)、286(CH2)、298(CH2)和326(CH2)的残基处具有至少一个突变的免疫球蛋白，其中至少一个突变是用半胱氨酸残基和原子或分子的置换，其中原子或分子
结合到半胱氨酸残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)和
125(CH1)的残基处。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自248(CH2)和326(CH2)的残
基处。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自25(VH)和286(CH2)的残基处。在某些实
施方式中，至少一个突变是在选自254(CH2)和298(VH)的残基处。在可与前述实施方式组
合的某些实施方式中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可与前述实施方式组
合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人VH
结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人VL结构域。
在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物进一步包括具有至少两个
活性位点的连接分子，其中第一个活性位点结合到免疫球蛋白的半胱氨酸残基，第二个活
性位点结合到原子或分子。在与前述具有连接分子的实施方式组合的某些实施方式中，连
接分子选自腙、二硫化物、肽、螯合剂和马来酰亚胺。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，原子或分子选自放射性核素、化学治疗剂、微生物毒素、植物毒素、聚合物、碳水化合物、细胞因子、荧光标记、发光标记、酶-底物标记、酶、肽、肽模拟物、核苷酸、siRNA、微小RNA、RNA模拟物和适配体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，原子或分子选自
90 131 67 177 213 211
Y、I、Cu、 Lu、Bi、 At、加利车霉素、倍癌霉素、美登木素生物碱(maytanisoid)、奥
利斯汀(auristatin)、蒽环类化合物(anthracyclin)、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、篦麻毒素、聚乙二醇、羟乙基淀粉和甘露糖(mannosyl)残基。在可与前述实施方式组合的某些
实施方式中，原子或分子降低未突变免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组合的
某些实施方式中，原子或分子增加未突变免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组
合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物进一步包括抗原结合活性并且该活性是未突变免
疫球蛋白抗原结合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少
130％。
结合到半胱氨酸残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)和
125(CH1)的残基处。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自248(CH2)和326(CH2)的残
基处。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自25(VH)和286(CH2)的残基处。在某些实
施方式中，至少一个突变是在选自254(CH2)和298(VH)的残基处。在可与前述实施方式组
合的某些实施方式中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可与前述实施方式组
合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人VH
结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人VL结构域。
在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物进一步包括具有至少两个
活性位点的连接分子，其中第一个活性位点结合到免疫球蛋白的半胱氨酸残基，第二个活
性位点结合到原子或分子。在与前述具有连接分子的实施方式组合的某些实施方式中，连
接分子选自腙、二硫化物、肽、螯合剂和马来酰亚胺。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，原子或分子选自放射性核素、化学治疗剂、微生物毒素、植物毒素、聚合物、碳水化合物、细胞因子、荧光标记、发光标记、酶-底物标记、酶、肽、肽模拟物、核苷酸、siRNA、微小RNA、RNA模拟物和适配体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，原子或分子选自
90 131 67 177 213 211
Y、I、Cu、 Lu、Bi、 At、加利车霉素、倍癌霉素、美登木素生物碱(maytanisoid)、奥
利斯汀(auristatin)、蒽环类化合物(anthracyclin)、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、篦麻毒素、聚乙二醇、羟乙基淀粉和甘露糖(mannosyl)残基。在可与前述实施方式组合的某些
实施方式中，原子或分子降低未突变免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组合的
某些实施方式中，原子或分子增加未突变免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组
合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物进一步包括抗原结合活性并且该活性是未突变免
疫球蛋白抗原结合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少
130％。
[0010] 另一个方面包括修饰或分离的免疫球蛋白，其包括在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)、25(VH)、125(CH1)、248(CH2)、254(CH2)、286(CH2)和326(CH2)残基处的至少一个突变，其中至少一个突变是用半胱氨酸残基的置换。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自7(VH)、
20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基处。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自248(CH2)和326(CH2)的残基处。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自25(VH)和286(CH2)的残
基处。在某些实施方式中，至少一个突变是在残基254(CH2)处。在可与前述实施方式组合
的某些实施方式中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可与前述实施方式组合
的某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修
饰或分离的免疫球蛋白包括人VH结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修
饰或分离的免疫球蛋白包括人VL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免
疫球蛋白进一步包括抗原结合活性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少
80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。
20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基处。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自248(CH2)和326(CH2)的残基处。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自25(VH)和286(CH2)的残
基处。在某些实施方式中，至少一个突变是在残基254(CH2)处。在可与前述实施方式组合
的某些实施方式中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可与前述实施方式组合
的某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修
饰或分离的免疫球蛋白包括人VH结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修
饰或分离的免疫球蛋白包括人VL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免
疫球蛋白进一步包括抗原结合活性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少
80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。
[0011] 另一个方面包括分离的或重组的多核苷酸，其编码前述修饰的免疫球蛋白方面和前述实施方式的任意和所有组合的免疫球蛋白。在某些实施方式中，多核苷酸在载体中。在某些实施方式中，载体是表达载体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，可诱导启动子可操作地连接到多核苷酸上。另一方面包括具有前述实施方式中任何一种的载体的宿
主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞能表达由多核苷酸编码的免疫球蛋白。
主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞能表达由多核苷酸编码的免疫球蛋白。
[0012] 另一个方面包括生产免疫球蛋白的方法，所述方法包括提供包含前述方面的宿主细胞的培养基和将培养基置于免疫球蛋白被表达的条件下。在某些实施方式中，方法包括
分离表达的免疫球蛋白的另外步骤。
分离表达的免疫球蛋白的另外步骤。
[0013] 另一个方面包括生产免疫球蛋白结合物的方法，包括提供前述修饰的免疫球蛋白方面和前述实施方式的任意和所有组合的免疫球蛋白，用还原剂还原一个或多个置换的半
胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基，和用原子或分子温育免疫球蛋白，其中所述原子
或分子与还原的半胱氨酸残基反应，以形成免疫球蛋白结合物。
胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基，和用原子或分子温育免疫球蛋白，其中所述原子
或分子与还原的半胱氨酸残基反应，以形成免疫球蛋白结合物。
[0014] 另一个方面包括降低免疫球蛋白结合物的高浓药物制剂中免疫球蛋白表面暴露的半胱氨酸之间交联的方法，所述方法包括提供免疫球蛋白，用半胱氨酸残基置换选自
7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基，用还原剂还原一个或多个置换的半胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基，用原子或分子温育免疫球蛋白，其中所述分子与还原的半胱氨
酸残基反应，以形成免疫球蛋白结合物，和产生免疫球蛋白结合物的高浓液体制剂，其中所述免疫球蛋白结合物浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至
少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与前
述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人
VH结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人VL结构域。在
可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括抗原结合活性并且该活
性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少
120％或至少130％。
7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基，用还原剂还原一个或多个置换的半胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基，用原子或分子温育免疫球蛋白，其中所述分子与还原的半胱氨
酸残基反应，以形成免疫球蛋白结合物，和产生免疫球蛋白结合物的高浓液体制剂，其中所述免疫球蛋白结合物浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至
少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与前
述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人
VH结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人VL结构域。在
可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括抗原结合活性并且该活
性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少
120％或至少130％。
[0015] 另一个方面包括前述免疫球蛋白结合物方面和前述实施方式的任意和所有组合在制备包含高浓液体制剂的药物中的用途，其中所述免疫球蛋白结合物为至少20mg/ml、
至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗自身免疫疾病、免疫学疾
病、传染病、炎性疾病、神经学疾病以及包括癌症在内的肿瘤学和瘤性疾病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞和骨髓基质；骨丢失；佩吉特病、破骨细胞瘤；乳腺癌；废用性骨量减少、营养不良、牙周病、高歇病、朗格罕细胞组织细胞增多症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库兴综合征、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤维性骨发育不良、牙周重建和骨折；肉样瘤病；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理和体液恶性高钙血症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；
移植排斥、病毒性感染、血液学瘤形成和瘤样病症，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样霉菌病、套细胞淋巴瘤、巨滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，其包括B细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤和T细胞急
性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿瘤，其包括外周T细胞白血
病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大粒状淋巴细胞白血病、朗格罕细胞组织细胞增多
症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、没有分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢
性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中枢神经系统的肿瘤，例如，脑瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和成视网膜细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、和血管系统的肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、
肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、脓毒病和败血症性休克、克罗恩病、牛皮癣、硬皮病(schleraderma)、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植物排斥、血液学恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗菌斑牛皮癣、溃疡性大肠炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、幼年特发性关节炎、黄斑变性、呼吸道合胞病毒、克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤、阿尔茨海默病、青光眼和多发性硬化症。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物进一步包括药学
上可接受的赋形剂。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，该制剂包括至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白结合物，是非寡聚化单体。在某些实施方式中，单体的百分比通过非还原SDS-PAGE分析测量。
至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗自身免疫疾病、免疫学疾
病、传染病、炎性疾病、神经学疾病以及包括癌症在内的肿瘤学和瘤性疾病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞和骨髓基质；骨丢失；佩吉特病、破骨细胞瘤；乳腺癌；废用性骨量减少、营养不良、牙周病、高歇病、朗格罕细胞组织细胞增多症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库兴综合征、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤维性骨发育不良、牙周重建和骨折；肉样瘤病；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理和体液恶性高钙血症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；
移植排斥、病毒性感染、血液学瘤形成和瘤样病症，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样霉菌病、套细胞淋巴瘤、巨滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，其包括B细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤和T细胞急
性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿瘤，其包括外周T细胞白血
病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大粒状淋巴细胞白血病、朗格罕细胞组织细胞增多
症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、没有分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢
性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中枢神经系统的肿瘤，例如，脑瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和成视网膜细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、和血管系统的肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、
肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、脓毒病和败血症性休克、克罗恩病、牛皮癣、硬皮病(schleraderma)、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植物排斥、血液学恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗菌斑牛皮癣、溃疡性大肠炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、幼年特发性关节炎、黄斑变性、呼吸道合胞病毒、克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤、阿尔茨海默病、青光眼和多发性硬化症。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物进一步包括药学
上可接受的赋形剂。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，该制剂包括至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白结合物，是非寡聚化单体。在某些实施方式中，单体的百分比通过非还原SDS-PAGE分析测量。
[0016] 另一个方面包括前述免疫球蛋白结合物方面和前述实施方式的任意和所有组合作为非寡聚化药物活性成分的用途。
[0017] 另一个方面包括前述免疫球蛋白结合物方面和前述实施方式的任意和所有组合作为诊断工具的用途。
[0018] 另一个方面包括前述免疫球蛋白结合物方面和前述实施方式的任意和所有组合作为高分子量蛋白标准物的用途。另一个方面包括免疫球蛋白结合物作为高分子量蛋白
标准物的用途，其中免疫球蛋白结合物包括在残基440(CH3)具有至少一个突变的免疫球蛋
白，其中至少一个突变是用半胱氨酸残基和原子或分子的置换，其中所述原子或分子结合
到半胱氨酸残基。
标准物的用途，其中免疫球蛋白结合物包括在残基440(CH3)具有至少一个突变的免疫球蛋
白，其中至少一个突变是用半胱氨酸残基和原子或分子的置换，其中所述原子或分子结合
到半胱氨酸残基。
[0019] 另一方面包括药物组合物，其包括前述免疫球蛋白结合物方面和前述实施方式的任意和所有组合的免疫球蛋白结合物以及药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式中，
免疫球蛋白结合物浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少
50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在可与前述实
施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物的至少80％、至少85％、至少90％、至少
95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是非寡聚化单体。
免疫球蛋白结合物浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少
50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在可与前述实
施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物的至少80％、至少85％、至少90％、至少
95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是非寡聚化单体。
[0020] 另一个方面包括选择用于突变为半胱氨酸的免疫球蛋白的残基的方法，包括计算免疫球蛋白表面上的第一氨基酸残基的空间聚集倾向，计算第一残基紧邻区域内
(immediate proximity)免疫球蛋白的多个残基的空间聚集倾向，和如果第一氨基酸残基
的空间聚集倾向等于0和-0.11的值或位于0和-0.11的值之间，和如果多个残基具有小于
0的空间聚集倾向，选择用于突变为半胱氨酸的第一氨基酸残基。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。在某些实施
方式中，多个残基在第一残基的 内。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。
在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，计算残基的空间聚集倾向包括计算具有以所
述残基中的原子为中心的半径的球形区域的所述空间聚集倾向。在某些实施方式中，球形
区域的半径为至少
(immediate proximity)免疫球蛋白的多个残基的空间聚集倾向，和如果第一氨基酸残基
的空间聚集倾向等于0和-0.11的值或位于0和-0.11的值之间，和如果多个残基具有小于
0的空间聚集倾向，选择用于突变为半胱氨酸的第一氨基酸残基。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。在某些实施
方式中，多个残基在第一残基的 内。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。
在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，计算残基的空间聚集倾向包括计算具有以所
述残基中的原子为中心的半径的球形区域的所述空间聚集倾向。在某些实施方式中，球形
区域的半径为至少
[0021] 另一个方面包括修饰或分离的免疫球蛋白，其包括至少一个表面暴露的残基向半胱氨酸的突变，其中残基的空间聚集倾向等于0和-0.11的值或位于0和-0.11的值之间，
并且其中第一残基紧邻区域内免疫球蛋白的多个残基的空间聚集倾向具有小于0的空间
聚集倾向。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。在某些实施方式中，多个残
基在第一残基的 内。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。在某些实施方
式中，多个残基在第一残基的 内。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，针对具
有以所述残基中的原子为中心的半径的球形区域计算所述空间聚集倾向。在某些实施方式
中，半径为至少
并且其中第一残基紧邻区域内免疫球蛋白的多个残基的空间聚集倾向具有小于0的空间
聚集倾向。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。在某些实施方式中，多个残
基在第一残基的 内。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。在某些实施方
式中，多个残基在第一残基的 内。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，针对具
有以所述残基中的原子为中心的半径的球形区域计算所述空间聚集倾向。在某些实施方式
中，半径为至少
[0022] 另一个方面包括选择突变为半胱氨酸的免疫球蛋白的残基的方法，包括选择免疫球蛋白的多个氨基酸残基，其中多个残基暴露在免疫球蛋白的表面，将多个残基中的一个
残基突变为半胱氨酸残基，将半胱氨酸残基结合到原子或分子以形成免疫球蛋白结合物，
测试免疫球蛋白结合物的交联倾向和赋予免疫球蛋白结合物交联倾向值，和如果交联倾向
值是I或II选择用于突变为半胱氨酸的残基。在某些实施方式中，该方法进一步包括如
果小于5％的免疫球蛋白结合物形成二聚体并且没有免疫球蛋白结合物形成三聚体，赋予
免疫球蛋白结合物交联倾向值II，其中二聚体和三聚体的形成通过比较型非还原和还原
SDS-PAGE测量。在某些实施方式中，该方法进一步包括如果小于1％的免疫球蛋白结合物
形成二聚体，赋予免疫球蛋白结合物交联倾向值I，其中二聚体的形成通过比较型非还原和还原SDS-PAGE测量。
残基突变为半胱氨酸残基，将半胱氨酸残基结合到原子或分子以形成免疫球蛋白结合物，
测试免疫球蛋白结合物的交联倾向和赋予免疫球蛋白结合物交联倾向值，和如果交联倾向
值是I或II选择用于突变为半胱氨酸的残基。在某些实施方式中，该方法进一步包括如
果小于5％的免疫球蛋白结合物形成二聚体并且没有免疫球蛋白结合物形成三聚体，赋予
免疫球蛋白结合物交联倾向值II，其中二聚体和三聚体的形成通过比较型非还原和还原
SDS-PAGE测量。在某些实施方式中，该方法进一步包括如果小于1％的免疫球蛋白结合物
形成二聚体，赋予免疫球蛋白结合物交联倾向值I，其中二聚体的形成通过比较型非还原和还原SDS-PAGE测量。
[0024] 优选实施方式的详述
[0025] 本公开涉及改良的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物，其显示降低的交联。在某些实施方式中，本公开的免疫球蛋白在特定残基处通过半胱氨酸置换被修饰。本公开提供修
饰的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物，制备这样的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物、包含
这样的免疫球蛋白的多价或多特异性分子的方法以及包含本公开的免疫球蛋白、免疫球蛋
白结合物或双特异性分子的药物组合物。
饰的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物，制备这样的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物、包含
这样的免疫球蛋白的多价或多特异性分子的方法以及包含本公开的免疫球蛋白、免疫球蛋
白结合物或双特异性分子的药物组合物。
[0026] 定义
[0027] 本文所谈及的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括整个抗体和其任何抗原结合片段(即，“结合抗原部分”)或单链。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的糖蛋白。每个重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(本文缩
写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区能被进一步细
分成称作互补决定区(CDR)的高度可变区，散布着称作框架区(FR)的更保守的区域。每个
VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以下面的顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、
FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，其包括免疫系统的各种细胞(如，
效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区能被进一步细
分成称作互补决定区(CDR)的高度可变区，散布着称作框架区(FR)的更保守的区域。每个
VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以下面的顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、
FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，其包括免疫系统的各种细胞(如，
效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
[0028] 本文所谈及的术语“抗体结合物”或“免疫球蛋白结合物”包括化学或生物连接到原子或分子的任何免疫球蛋白、抗原结合片段或其单链。原子或分子可包括，例如细胞毒素、放射剂、抗肿瘤药或治疗剂。抗体结合物保留免疫球蛋白或抗原结合片段的免疫反应
性，即，抗体结合物的免疫球蛋白或抗原结合片段具有与原子或分子结合之前免疫球蛋白
的抗原结合活性的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少
100％、至少110％、至少120％或至少130％。
性，即，抗体结合物的免疫球蛋白或抗原结合片段具有与原子或分子结合之前免疫球蛋白
的抗原结合活性的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少
100％、至少110％、至少120％或至少130％。
[0029] 如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗原部分”)是指全长抗体或保留特异性结合抗原能力的抗体的一个或多个片段以及重链或轻链的恒定区的至少一部分。已经显示，抗体结合抗原的功能可以通过全长抗体的片段执行。在术语抗体的“抗原
结合部分”内包含的结合片段的实例包括Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包括由铰链区上的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段，由VH和CH1结构域组成；和Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成。
结合部分”内包含的结合片段的实例包括Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包括由铰链区上的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段，由VH和CH1结构域组成；和Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成。
[0030] 此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH，由分开的基因编码，但是它们可采用重组方法通过合成连接体进行连接，所述合成连接体能使它们形成单条蛋白链，其中VL和
VH区域成对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird et al.，1988 Science
242：423-426；和Huston et al.，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。这种单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合部分”之内。这些抗体片段利用本领域技术人员已
知的传统技术获得，并且片段被筛选用于以与完整抗体相同的方式使用。
VH区域成对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird et al.，1988 Science
242：423-426；和Huston et al.，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。这种单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合部分”之内。这些抗体片段利用本领域技术人员已
知的传统技术获得，并且片段被筛选用于以与完整抗体相同的方式使用。
[0031] 如本文所用，“分离的”抗体或免疫球蛋白是指基本上不含其它成分的抗体或免疫球蛋白，其中这样的抗体或免疫球蛋白是天然发现的。此外，分离的抗体或免疫球蛋白可基本上不含其它细胞物质和/或化学品。
[0032] 如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体成分”是指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组成一般显示对特定表位的单一结合特异性和亲和性。
[0033] 如本文所用，术语“人抗体”意欲包括具有可变区的抗体，其中框架和CDR区域来自人来源的序列。此外，如果抗体包含恒定区，恒定区也来自这样的人序列，例如，人种系序列、或突变形式的人种系序列或抗体，其包含从人框架序列分析导出的共有框架序列，如Knappik，et al.(2000.J Mol Biol 296，57-86)中所述的。
[0034] 本公开的人抗体可包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”没有意欲包括这样的抗体，其中来自另一哺乳动物种类诸如小鼠的种系的CDR序列已经被
接枝到人框架序列。
接枝到人框架序列。
[0035] 如本文所用，术语“人结构域”意欲包括来自人来源的序列的免疫球蛋白恒定区结构域，人来源的序列例如，人种系序列、或突变形式的人种系序列或抗体，其包含从人框架序列分析导出的共有框架序列，如Knappik，et al.(2000.J Mol Biol 296，57-86)中所述的。
[0036] 如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如，从对于人免疫球蛋白基因来说是转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，从转化以表达人抗体的宿主细胞例如从转染瘤分离的抗体，
从重组、组合人抗体文库分离的抗体，以及通过涉及将人免疫球蛋白基因——序列——的
全部或一部分拼接到其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有可变区，其中框架和CDR区域来自人种系免疫球蛋白序列。在某些实施方
式中，然而，这样的重组人抗体可经历体外诱变(或者，当使用对人Ig序列是转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列，其当来自人种系VH和VL序列或涉及人种系VH和VL序列时，可不天然存在于体内人抗体种系储
库之内。
从重组、组合人抗体文库分离的抗体，以及通过涉及将人免疫球蛋白基因——序列——的
全部或一部分拼接到其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有可变区，其中框架和CDR区域来自人种系免疫球蛋白序列。在某些实施方
式中，然而，这样的重组人抗体可经历体外诱变(或者，当使用对人Ig序列是转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列，其当来自人种系VH和VL序列或涉及人种系VH和VL序列时，可不天然存在于体内人抗体种系储
库之内。
[0037] “嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替代或交换，从而抗原结合位点(可变区)被连接到不同或改变的种类的恒定区、效应功能和/或种类、或者赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替代或交换。例如，小鼠抗体可通过用包含本文公开的修饰的人免疫球蛋白的恒定区替代其恒定区而进行修饰。
由于用人恒定区替代，嵌合抗体可保留其特异性同时相比原小鼠抗体或者没有本文公开的
修饰的嵌合抗体整体上具有降低的人中抗原性和降低的聚集。
由于用人恒定区替代，嵌合抗体可保留其特异性同时相比原小鼠抗体或者没有本文公开的
修饰的嵌合抗体整体上具有降低的人中抗原性和降低的聚集。
[0038] “人源化”抗体是保留非人抗体的反应性同时具有较少的人中免疫原性的抗体。这可例如通过保留非人CDR区域并用其人对应物替代抗体剩余部分(即恒定区以及可变区的框架部分)来实现。参见例如Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855，
1984；Morrison and Oi，Adv.Immunol.，44：65-92，1988；Verhoeyen et al.，Science，239：
1534-1536，1988；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498，1991；和Padlan，Molec.Immun.，31：
169-217，1994。人工程化技术的其它实例包括但不限于US 5,766,886中公开的Xoma技术。
1984；Morrison and Oi，Adv.Immunol.，44：65-92，1988；Verhoeyen et al.，Science，239：
1534-1536，1988；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498，1991；和Padlan，Molec.Immun.，31：
169-217，1994。人工程化技术的其它实例包括但不限于US 5,766,886中公开的Xoma技术。
[0039] 如本文所用，术语“连接体”、“连接体单元”或“连接”指包括共价键或共价地将抗体连接到药物或其它分子的原子链的化学部分。连接体包括二价基如烷基二基(alkyldiyl)、亚芳基、杂亚芳基(heteroarylene)，部分如：--(CR2)nO(CR2)n--，烷氧基的重复单元(例如聚亚乙氧基(polyethylenoxy)、PEG、聚亚甲氧基(polymethyleneoxy))和烷
氨基(例如聚乙烯氨基(polyethyleneamino)、Jeffamine(聚环氧烯烃衍生产品).TM.)；
和二元酸酯和酰胺包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯(diglycolate)、丙二酸酯和己酰胺。
氨基(例如聚乙烯氨基(polyethyleneamino)、Jeffamine(聚环氧烯烃衍生产品).TM.)；
和二元酸酯和酰胺包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯(diglycolate)、丙二酸酯和己酰胺。
[0040] 如本文所用，术语“标记”指可共价地连接到抗体的任何部分，并且其作用是：(i)提供可检测的信号；(ii)与第二标记相互作用以修饰由第一或第二标记提供的可检测的信号，例如FRET(荧光共振能量转移)；(iii)稳定相互作用或增加与抗原或配体结合的亲
和性；(iv)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响迁移率，例如电泳迁移率，或细胞渗透性，或(v)提供捕获部分，以调节配体亲和性、抗体/抗原结合或离子络合。
和性；(iv)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响迁移率，例如电泳迁移率，或细胞渗透性，或(v)提供捕获部分，以调节配体亲和性、抗体/抗原结合或离子络合。
[0041] 如本文所用，术语“人性化(Humaneering)”是指将非人抗体转化成工程化人抗体TM的方法(参见例如KaloBios的Humaneering 技术)。
[0042] 如本文所用，“同种型”是指由具有本文公开的易聚集基序(并且因此顺从于本文公开的降低聚集的修饰)的重链恒定区基因提供的任何抗体种类(例如，IgM、IgE、IgG如IgG1或IgG2)。
[0043] 如本文所用，术语“亲和性”是指在单个抗原位点抗体和抗原之间相互作用的强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在许多位点相互作用；
相互作用越多，亲和性越强。本文公开的修饰优选地不降低本文公开的免疫球蛋白或抗体
的亲和性或者亲和性被降低少于30％、少于20％、少于10％、或少于5％。如本文所用，当测定本文公开的修饰是否降低亲和性时，在具有该修饰的免疫球蛋白或抗体与缺乏该修饰
但包括任何不相关突变的相同免疫球蛋白之间进行比较。
相互作用越多，亲和性越强。本文公开的修饰优选地不降低本文公开的免疫球蛋白或抗体
的亲和性或者亲和性被降低少于30％、少于20％、少于10％、或少于5％。如本文所用，当测定本文公开的修饰是否降低亲和性时，在具有该修饰的免疫球蛋白或抗体与缺乏该修饰
但包括任何不相关突变的相同免疫球蛋白之间进行比较。
[0044] 如本文所用，术语“对象(subject)”包括任何人或非人动物。
[0045] 术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类、爬行类等。
[0046] 术语“化学治疗剂”如本文所用指在癌症治疗中有用的化合物。化学治疗剂的例子包括埃罗替尼(TARCEVA(TM)，Genentech/OSI Pharm.)、硼替佐米(Bortezomib)
(VELCADE(TM)，Millenium Pharm.)、氟维司群(FASLODEX(TM)，Astrazeneca)、舒尼替尼
(SU11248，Pfizer)、来曲唑(FEMARA(TM)，Novartis)、甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC(TM)，
Novartis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、奥沙利铂(Eloxatin(TM)，Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、甲酰四氢叶酸、雷帕霉素(Sirolimus，RAPAMUNE(TM)，Wyeth)、拉帕替尼
(Lapatinib)(GSK572016，GlaxoSmithKline)、法尼醇蛋白转移酶抑制剂(Lonafarnib)(SCH
66336)、索拉非尼(BAY43-9006，Bayer Labs.)和吉非替尼(Gefitinib)(IRESSA(TM)，
Astrazeneca)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、烷化剂如塞替派和CYTOXAN(TM)环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶如苯并多
巴(benzodopa)、卡巴醌、meturedopa和uredopa；ethylenimines和methylamelamines
包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代
磷酰胺和trimethylomelamine；聚乙酸(尤其是番荔枝内酯(bullatacin)和布拉它辛
酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替坎)；苔藓抑素；callystatin；
CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；cryptophycins(特别
是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物，
KW-2189和CB 1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍
枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、
cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、胆固醇苯乙酸氮芥、泼尼莫司汀、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀；亚硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀、chlorozotocin、
福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和ranimnustine；抗生素如烯二炔类抗生素(例如，加
利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(Angew Chem Intl.Ed.Engl.
(1994)33：183-186)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双磷酸盐，如氯屈膦酸盐
(clodronate)；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔类抗生素生色
团)、aclacinomysins、放射菌素、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素c、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、
6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN(TM)多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰吗啉
代-多柔比星、2-吡咯代-多柔比星和去氧阿霉素(deoxydoxorubicin))、表柔比星、依索
比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、表柔比星、培洛霉素、紫菜霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；
叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺的如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如甲酰四氢叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺配糖物
(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；
依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登木素生物碱(maytansinoids)如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；
喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙肼(ethylhydrazide)；丙卡巴
肼；PSK(TM)多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦；长春地
辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷，例如，TAXOL(TM)紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM无克列莫佛、紫杉醇的白蛋白-工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Ill.)和TAXOTERE(TM)多西紫
杉醇(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR(TM)吉西他滨；6-巯鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和和卡铂；长春碱；铂；依托泊甙(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；NAVELBINE(TM)长春瑞滨；诺消灵
(novantrone)；替尼泊甙；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；
拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A如维生素A酸；卡培他
滨；和上述任意的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
(VELCADE(TM)，Millenium Pharm.)、氟维司群(FASLODEX(TM)，Astrazeneca)、舒尼替尼
(SU11248，Pfizer)、来曲唑(FEMARA(TM)，Novartis)、甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC(TM)，
Novartis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、奥沙利铂(Eloxatin(TM)，Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、甲酰四氢叶酸、雷帕霉素(Sirolimus，RAPAMUNE(TM)，Wyeth)、拉帕替尼
(Lapatinib)(GSK572016，GlaxoSmithKline)、法尼醇蛋白转移酶抑制剂(Lonafarnib)(SCH
66336)、索拉非尼(BAY43-9006，Bayer Labs.)和吉非替尼(Gefitinib)(IRESSA(TM)，
Astrazeneca)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、烷化剂如塞替派和CYTOXAN(TM)环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶如苯并多
巴(benzodopa)、卡巴醌、meturedopa和uredopa；ethylenimines和methylamelamines
包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代
磷酰胺和trimethylomelamine；聚乙酸(尤其是番荔枝内酯(bullatacin)和布拉它辛
酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替坎)；苔藓抑素；callystatin；
CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；cryptophycins(特别
是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物，
KW-2189和CB 1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍
枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、
cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、胆固醇苯乙酸氮芥、泼尼莫司汀、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀；亚硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀、chlorozotocin、
福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和ranimnustine；抗生素如烯二炔类抗生素(例如，加
利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(Angew Chem Intl.Ed.Engl.
(1994)33：183-186)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双磷酸盐，如氯屈膦酸盐
(clodronate)；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔类抗生素生色
团)、aclacinomysins、放射菌素、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素c、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、
6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN(TM)多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰吗啉
代-多柔比星、2-吡咯代-多柔比星和去氧阿霉素(deoxydoxorubicin))、表柔比星、依索
比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、表柔比星、培洛霉素、紫菜霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；
叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺的如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如甲酰四氢叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺配糖物
(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；
依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登木素生物碱(maytansinoids)如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；
喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙肼(ethylhydrazide)；丙卡巴
肼；PSK(TM)多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦；长春地
辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷，例如，TAXOL(TM)紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM无克列莫佛、紫杉醇的白蛋白-工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Ill.)和TAXOTERE(TM)多西紫
杉醇(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR(TM)吉西他滨；6-巯鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和和卡铂；长春碱；铂；依托泊甙(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；NAVELBINE(TM)长春瑞滨；诺消灵
(novantrone)；替尼泊甙；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；
拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A如维生素A酸；卡培他
滨；和上述任意的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0047] 该“化学治疗剂”定义中还包括：(i)起调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，包括，例如，他莫昔芬(包括
NOLVADEX(TM)他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟三苯氧胺、曲沃昔芬、盐酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和FARESTON托瑞米芬；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制
剂，其调节肾上腺中雌激素产生，如，例如，4(5)-咪唑类、氨鲁米特、MEGASE(TM)醋酸甲地孕酮、AROMASIN(TM)依西美坦、福美坦(formestanie)、法倔唑、RIVISOR(TM)伏氯唑、
FEMARA(TM)来曲唑和ARIMIDEX(TM)阿那曲唑；(iii)抗雄激素类如氟他胺、尼鲁米特、比
卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1，3-二氧戊烷核苷胞嘧啶类似物)；(iv)
芳香酶抑制剂；(v)蛋白激酶抑制剂；(vi)脂类激酶抑制剂；(vii)反义寡核苷酸，特别
是在牵涉异常细胞增殖的信号转导通路中抑制基因表达的那些反义寡核苷酸，如，例如，
PKC-α、Ralf和H-Ras；(viii)核酶如VEGF表达抑制剂(例如，ANGIOZYME(TM)核酶)和
HER2表达抑制剂；(ix)疫苗如基因治疗疫苗，例如，ALLOVECTIN(TM)疫苗、LEUVECTIN(TM)疫苗和VAXID(TM)疫苗；PROLEUKIN(TM)rIL-2；LURTOTECAN(TM)拓 扑异构酶1抑 制
剂；ABARELIX(TM)rmRH；(x)抗血管生成剂如贝伐单抗(bevacizumab)(AVASTIN(TM)、
Genentech)；和(xi)上述任意的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
NOLVADEX(TM)他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟三苯氧胺、曲沃昔芬、盐酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和FARESTON托瑞米芬；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制
剂，其调节肾上腺中雌激素产生，如，例如，4(5)-咪唑类、氨鲁米特、MEGASE(TM)醋酸甲地孕酮、AROMASIN(TM)依西美坦、福美坦(formestanie)、法倔唑、RIVISOR(TM)伏氯唑、
FEMARA(TM)来曲唑和ARIMIDEX(TM)阿那曲唑；(iii)抗雄激素类如氟他胺、尼鲁米特、比
卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1，3-二氧戊烷核苷胞嘧啶类似物)；(iv)
芳香酶抑制剂；(v)蛋白激酶抑制剂；(vi)脂类激酶抑制剂；(vii)反义寡核苷酸，特别
是在牵涉异常细胞增殖的信号转导通路中抑制基因表达的那些反义寡核苷酸，如，例如，
PKC-α、Ralf和H-Ras；(viii)核酶如VEGF表达抑制剂(例如，ANGIOZYME(TM)核酶)和
HER2表达抑制剂；(ix)疫苗如基因治疗疫苗，例如，ALLOVECTIN(TM)疫苗、LEUVECTIN(TM)疫苗和VAXID(TM)疫苗；PROLEUKIN(TM)rIL-2；LURTOTECAN(TM)拓 扑异构酶1抑 制
剂；ABARELIX(TM)rmRH；(x)抗血管生成剂如贝伐单抗(bevacizumab)(AVASTIN(TM)、
Genentech)；和(xi)上述任意的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0048] 如本文所用，术语“细胞因子”是由一个细胞群释放的蛋白的总称，其作为细胞间介质作用于另一个细胞。这样的细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状
旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白激素如促滤泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长
因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒管抑制物质；小鼠促性腺激
素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血栓形成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长
因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集
落刺激因子(CSFs)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细
胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(ILs)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和包括LIF和kit配体(KL)在内的其它多肽因子。如本文所述，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细
胞培养物的蛋白和天然序列细胞因子的生物学上活性的等同物。
旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白激素如促滤泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长
因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒管抑制物质；小鼠促性腺激
素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血栓形成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长
因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集
落刺激因子(CSFs)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细
胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(ILs)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和包括LIF和kit配体(KL)在内的其它多肽因子。如本文所述，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细
胞培养物的蛋白和天然序列细胞因子的生物学上活性的等同物。
[0049] 如本文所用，术语“优化的”意指核苷酸序列已经被改变以利用生产细胞或有机体中优选的密码子编码氨基酸序列，生产细胞或有机体一般为真核细胞，例如毕赤酵母
(Pichia)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。优化的核苷酸序列被工程改造以完全
或尽可能多地保留由起始核苷酸序列原始编码的氨基酸序列，其也被称为“亲本”序列。本文也预期了这些序列在其它真核细胞中的优化表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序
列也被称为被优化的。
(Pichia)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。优化的核苷酸序列被工程改造以完全
或尽可能多地保留由起始核苷酸序列原始编码的氨基酸序列，其也被称为“亲本”序列。本文也预期了这些序列在其它真核细胞中的优化表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序
列也被称为被优化的。
[0050] 如本文所用，“抗原结合活性”指免疫球蛋白或免疫球蛋白结合物对其靶抗原的结合特异性。例如，抗原结合活性通过基于细胞的生物测定(例如报告基因测定)、ELISA、表面等离子共振(Biacore)或本领域技术人员已知的其它技术测量。
[0051] 如本文所用，术语“交联倾向(cross-linking propensity)”(CLP)指含有用半胱氨酸置换的突变的修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白结合物在置换的半胱氨酸残基处在不同的免疫球蛋白之间交联的倾向。例如，CLP可通过寡聚化水平测定，寡聚化水平通过非还原SDS-PAGE、尺寸排阻层析、具有尺寸排阻层析的静态或动态激光散射、或本领域技术人员已知的其它技术测量。I类包括是单体的并在标记之后保持稳定的变体。II类的变体在标
记之前和之后含有小百分比的二聚体。III类变体具有更明显的寡聚化倾向，包括形成一些三聚体。IV类变体具有更高的寡聚化倾向，如较三聚体更大的聚集体的存在所证明的，尤其是标记之后。V类包括与IV类的变体相似的高寡聚化倾向的变体，具有另外的结构异常如
纯化的浓缩样品的片段化或染色。
记之前和之后含有小百分比的二聚体。III类变体具有更明显的寡聚化倾向，包括形成一些三聚体。IV类变体具有更高的寡聚化倾向，如较三聚体更大的聚集体的存在所证明的，尤其是标记之后。V类包括与IV类的变体相似的高寡聚化倾向的变体，具有另外的结构异常如
纯化的浓缩样品的片段化或染色。
[0052] 术语“表位(epitope)”意指能特异性结合抗体的蛋白质决定子。表位通常由分子诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面小组组成并且通常具有特异性的三维结构特性以及特异性的电荷特性。构象和非构象表位的区别在于与前者而不是后者的结合在变性溶剂的
存在下被丢失。
存在下被丢失。
[0053] 术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定核酸序列，保守修饰的变体是指那些核酸，其编码相同或基本相同的氨基酸序列，或者其中核酸不将氨基酸序列编码成基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给
定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由
密码子规定的每个位置，密码子可被改变成所述的相应密码子中任何一个而不改变所编码
的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异的一种。本文编码多肽的每个核酸序列也描述该核酸的每个可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的各个密码子
(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)都可
被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各个沉默变异在各个所述序列中
是隐式的。
定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由
密码子规定的每个位置，密码子可被改变成所述的相应密码子中任何一个而不改变所编码
的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异的一种。本文编码多肽的每个核酸序列也描述该核酸的每个可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的各个密码子
(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)都可
被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各个沉默变异在各个所述序列中
是隐式的。
[0054] 对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括多肽序列的各个置换、缺失或添加，其导致氨基酸用化学上类似的氨基酸的置换。提供功能类似的氨基酸的保守置换表在本领域中是熟知的。这种保守修饰的变体是除本公开的多态变体、种间同系物和等位基因之外的，并且没有排除本公开的多态变体、种间同系物和等位基因。下列八组包含互相为保守置换的氨
基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、丝氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、
甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton，Proteins(1984))。
基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、丝氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、
甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton，Proteins(1984))。
[0055] 在两个或多个核酸或多肽序列的语境中，术语“同一的(identical)”或％“同一性(identity)”是指相同的两个或多个序列或子序列。如采用下列序列比较算法之一或者通过手工比对和视觉观察所测，当在比较窗或指定区上比较和比对最大对应时，如果两个
序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(即在指定区域，或者，当未指定时，在整个序列上，60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，两个序列是“基本同一的”。任选地，在长度为至少大约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区
域上，或者更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个
氨基酸)的区域上存在同一性。
序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(即在指定区域，或者，当未指定时，在整个序列上，60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，两个序列是“基本同一的”。任选地，在长度为至少大约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区
域上，或者更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个
氨基酸)的区域上存在同一性。
[0056] 对于序列比较，一般地一个序列作为参考序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，指定子序列坐标，如果必要的话，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定可选的参数。序列比较算法然后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分数。当比较两个序列的同一性
时，序列没有必要是邻接的，但是任何空位将随其携带一个将会降低整体百分数同一性的
罚分。对于blastn，默认参数是空位开放罚分＝5和空位延伸罚分＝2。对于blastp，默认
参数是空位开放罚分＝11和空位延伸罚分＝1。
时，序列没有必要是邻接的，但是任何空位将随其携带一个将会降低整体百分数同一性的
罚分。对于blastn，默认参数是空位开放罚分＝5和空位延伸罚分＝2。对于blastp，默认
参数是空位开放罚分＝11和空位延伸罚分＝1。
[0057] 如本文所用，“比较窗(comparison window)”包括参考任意数目的邻接位置的区段，其包括但不限于20至600个，通常约50至约200个，更通常地约100至约150个邻接位置，其中可以将一个序列与相同数目的邻接位置的参考序列在两个序列最佳比对后进行
比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以
例如通过下列进行：Smith and Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算
法；Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970的同源性比对算法；Pearson and Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85：2444，1988的搜索相似性方法；这些算法的计算机执行(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)；或者手工比对和视觉观察(参见，例
如Brent et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(ringbou ed.，2003))。
比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以
例如通过下列进行：Smith and Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算
法；Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970的同源性比对算法；Pearson and Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85：2444，1988的搜索相似性方法；这些算法的计算机执行(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)；或者手工比对和视觉观察(参见，例
如Brent et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(ringbou ed.，2003))。
[0058] 适于测定序列同一性百分数和序列相似性百分数的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其被分别描述在Altschul et al.，Nuc.Acids Res.25：3389-3402，1977；
和Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410，1990。执行BLAST分析的软件可以通过
National Center for Biotechnology Information(国家生物技术信息中心)公开获得。
该算法涉及首先通过在查询序列中识别长度W的短字串识别高得分序列对(HSPs)，其当与
数据库序列中相同长度的字串对齐时或者匹配或者满足一些正值阀分值T。T被称为相邻
字串分值阀(Altschul et al.，同上)。这些初始相邻字串命中(hit)作为启动搜寻以寻
找包含它们的更长HSPs的种子。字串命中沿着各个序列在两个方向延伸直到可以增加累
积对齐分值。对于核苷酸序列，采用参数M(对于一对匹配残基，赏分值是＞0)和N(对于
错配残基，罚分值总是＜0)计算累计分值。对于氨基酸序列，得分矩阵被用于计算累计分
值。当下列情况时各方向上字串命中的延长停止：累积对齐分值从其获得的最大值下降量
X；由于一个或多个负得分残基对齐累积，累计分值达到零或以下；或者达到任意序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)
采用默认字长(W)11，期望值(E)或10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序
列，BLASTP程序采用默认字长3，期望值(E)10，BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff and
Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)对齐(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。
和Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410，1990。执行BLAST分析的软件可以通过
National Center for Biotechnology Information(国家生物技术信息中心)公开获得。
该算法涉及首先通过在查询序列中识别长度W的短字串识别高得分序列对(HSPs)，其当与
数据库序列中相同长度的字串对齐时或者匹配或者满足一些正值阀分值T。T被称为相邻
字串分值阀(Altschul et al.，同上)。这些初始相邻字串命中(hit)作为启动搜寻以寻
找包含它们的更长HSPs的种子。字串命中沿着各个序列在两个方向延伸直到可以增加累
积对齐分值。对于核苷酸序列，采用参数M(对于一对匹配残基，赏分值是＞0)和N(对于
错配残基，罚分值总是＜0)计算累计分值。对于氨基酸序列，得分矩阵被用于计算累计分
值。当下列情况时各方向上字串命中的延长停止：累积对齐分值从其获得的最大值下降量
X；由于一个或多个负得分残基对齐累积，累计分值达到零或以下；或者达到任意序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)
采用默认字长(W)11，期望值(E)或10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序
列，BLASTP程序采用默认字长3，期望值(E)10，BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff and
Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)对齐(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。
[0059] BLAST算法也执行两序列之间相似性的统计学分析(参见，例如Karlin andAltschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787，1993)。BLAST算法所提供的相似性的一种度量是最小加和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发
生的概率表示。例如，如果测试核酸和参考核酸的比较中最小加和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01以及最优选地小于约0.001，核酸被认为与参考序列相似。
生的概率表示。例如，如果测试核酸和参考核酸的比较中最小加和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01以及最优选地小于约0.001，核酸被认为与参考序列相似。
[0060] 除了上面提到的序列同一性百分数，两个核酸或多肽基本同一的另一表示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽引起的抗体免疫学交叉反应，如下所述。
因此，举例来说，在两肽区别仅在于保守置换的情况下，多肽与第二多肽一般基本上同一。
两核酸序列基本同一的另一表示是两分子或它们的互补体在严格条件下相互杂交，如下所
述。两核酸序列基本同一的又一表示是可用相同的引物扩增序列。
因此，举例来说，在两肽区别仅在于保守置换的情况下，多肽与第二多肽一般基本上同一。
两核酸序列基本同一的另一表示是两分子或它们的互补体在严格条件下相互杂交，如下所
述。两核酸序列基本同一的又一表示是可用相同的引物扩增序列。
[0061] 术语“可操作地连接”是指两个或多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。一般地，它是指转录调节序列和转录序列的功能关系。举例来说，如果它刺激或调节编码序列在合适的宿主细胞或其他表达系统中转录的话，启动子或增强子序列被可操作地连接到
编码序列。一般，被可操作地连接到转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理上
是邻接的，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列如增强子不需要与它们增强其转录的编码序列物理邻接或位于其附近。
编码序列。一般，被可操作地连接到转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理上
是邻接的，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列如增强子不需要与它们增强其转录的编码序列物理邻接或位于其附近。
[0062] 术语“载体”意欲指能够转运另一多核苷酸的多核苷酸分子，该另一多核苷酸与该多核苷酸分子连接。一种载体是“质粒”，其是指另外的DNA区段可被连接到其中的环状双链DNA环。另一种载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可被连接到病毒基因组。某些载体能在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型
哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中后被
整合到宿主细胞的基因组，并且因此与宿主基因组一起被复制。此外，某些载体能指导与它们可操作连接的基因表达。这样的载体在本文被称为“重组表达载体”(或者简单地，“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是以质粒的形式。在本说明书
中，当质粒是最常用的载体形式时，“质粒”和“载体”可交换使用。然而，本公开意欲包括这种其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其起到等同的功能。
哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中后被
整合到宿主细胞的基因组，并且因此与宿主基因组一起被复制。此外，某些载体能指导与它们可操作连接的基因表达。这样的载体在本文被称为“重组表达载体”(或者简单地，“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是以质粒的形式。在本说明书
中，当质粒是最常用的载体形式时，“质粒”和“载体”可交换使用。然而，本公开意欲包括这种其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其起到等同的功能。
[0063] 术语“重组宿主细胞”(或者简单地，“宿主细胞”)是指已引入重组表达载体的细胞。应当理解，这样的术语意欲不仅指特定对象细胞而且指这种细胞的后代。因为某些修饰由于突变或环境影响可发生在后代中，这种后代事实上可能与亲代细胞不相同，但仍被
包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
[0065] 术语“未突变的免疫球蛋白”是指不包括至少一个用半胱氨酸残基置换的突变的免疫球蛋白。如本文所用，未突变的免疫球蛋白可以是为了比较具有和不具有突变的免疫
球蛋白的寡聚倾向或结合效率的目的的假设构建物。举例来说，包含人源化突变以及用于
结合目的的突变为半胱氨酸的鼠科抗体不是未突变的免疫球蛋白。未突变的免疫球蛋白将
是具有人源化突变但不突变为半胱氨酸的抗体。在突变意欲起到包括提供结合位点在内的
一个以上目的的情况下，未突变的免疫球蛋白不包括这样的突变。
球蛋白的寡聚倾向或结合效率的目的的假设构建物。举例来说，包含人源化突变以及用于
结合目的的突变为半胱氨酸的鼠科抗体不是未突变的免疫球蛋白。未突变的免疫球蛋白将
是具有人源化突变但不突变为半胱氨酸的抗体。在突变意欲起到包括提供结合位点在内的
一个以上目的的情况下，未突变的免疫球蛋白不包括这样的突变。
[0066] 术语“聚集基序(aggregation motif)”是指根据下列方法归类在一起的一组残基。首先，识别SAP( 半径)大于0.15的残基。然后识别在SAP( 半径)大于0.15的
各个残基的 之内的所有残基。那么基序是SAP( 半径)大于0.15的残基以及SAP(
半径)大于0.0在SAP( 半径)大于0.15的残基的 之内的所有残基。任何这种具有
共同至少一个残基的基序被反复合并成较大的基序直到没有具有共同残基的剩余基序。这
些剩余基序或者残基组构成聚集基序。
各个残基的 之内的所有残基。那么基序是SAP( 半径)大于0.15的残基以及SAP(
半径)大于0.0在SAP( 半径)大于0.15的残基的 之内的所有残基。任何这种具有
共同至少一个残基的基序被反复合并成较大的基序直到没有具有共同残基的剩余基序。这
些剩余基序或者残基组构成聚集基序。
[0067] 在免疫球蛋白残基以本文的编号被指代的情况下，残基编号是指当目标免疫球蛋白序列与人IgG1免疫球蛋白比对时IgG1分子中相应残基的Kabat编号。通过参考的方式，
人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定结构域被比对：
人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定结构域被比对：
[0068] CH1结构域
[0069] ..A.. 环 ....B.... 环 .C... C′环 ..D.
[0070] 120 130 140 150 160 170
[0071] | | | | | |
[0072] IgG1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
[0073] IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
[0074] IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
[0075] IgG3 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
[0076] .. 环 ...E..... 环 ...F... 环 ..G.... 结合
[0077] 180 190 200 210 220
[0078] | | | | |
[0079] IgG1 PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
[0080] IgG2 PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC
[0081] IgG4 PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG
[0082] IgG3 PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVEPKTP
[0083] (IgG1＝SEQ ID NO：1；IgG2＝SEQ ID NO：2；IgG4＝SEQ ID NO：3；IgG3＝SEQ ID NO：4)
[0084] 铰链
[0085] 上 中 下
[0086] 230
[0087] |
[0088] IgG1 -DKTHT ---------------- CPPCP APELLGG(SEQ ID NO：5)
[0089] IgG2 -VE--- ---------------- CPPCP AP-PVAG(SEQ ID NO：6)
[0090] IgG4 -PP--- ---------------- CPSCP APEFLGG(SEQ ID NO：7)
[0091] IgG3 LGTTHT CPRCPEPK＊＊＊＊＊＊＊＊ CPRCP APELLGG(SEQ ID NO：8)
[0092] CH2结构域
[0093] ..A.. 环 ....B.... 环 ..C.. C′环 ...D
[0094] 240 250 260 270 280 290
[0095] | | | | | |
[0096] IgG1 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
[0097] IgG2 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP
[0098] IgG4 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP
[0099] IgG3 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP
[0100] ... 环 ....E.... 环 ...F..... 环 ..G... 结合3
[0101] 300 310 320 330 340
[0102] | | | | |
[0103] IgG1 REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
[0104] IgG2 REEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPRE
[0105] IgG4 REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE
[0106] IgG3 REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPRE
[0107] (IgG1＝SEQ ID NO：9；IgG2＝SEQ ID NO：10；IgG4＝SEQ ID NO：11；IgG3＝SEQ ID NO：12)
[0108] CH3结构域
[0109] ..A.. 环 ....B.... 环 ..C...C′环 ..D....
[0110] 350 360 370 380 390 400
[0111] | | | | | |
[0112] IgG1 PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
[0113] IgG2 PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS
[0114] IgG4 PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
[0115] IgG3 PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYKTTPPVLDS
[0116] 环 ....E.... 环. ...F... 环 ....G....
[0117] 410 420 430 440
[0118] | | | |
[0119] IgG1 DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0120] IgG2 DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0121] IgG4 DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
[0122] IgG3 DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNHFTQKSLSLSPGK
[0123] (IgG1＝SEQ ID NO：13；IgG2＝SEQ ID NO：14；IgG4＝SEQ ID NO：15；IgG3＝SEQ ID NO：16)
[0124] CL结构域
[0125] 11 12 13 14 15
[0126] 0123456789012345678901234567890123456789
[0127] 恒定的 · KAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWK
[0128] 恒定的 · VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK
[0129] 16 17 18 19
[0130] 0123456789012345678901234567890123456789
[0131] 恒定的 · ADSSPVKAGVETTTPSKQS-NNKYAASSYLSLTPEQWKSH
[0132] 恒定的 · VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
[0133] 20 21
[0134] 01234567890123456789012345
[0135] 恒定的 · RSYSCQVTHEG--STVEKTVAPTECS(SEQ ID NO：17)
[0136] 恒定的 · KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：18)
[0137] VH 和 VL 结 构 域 的 比 对 可 在 Ewert、Honegger 和 Plüchthun，Methods34(2004)184-199中找到。
[0138] 本发明的免疫球蛋白结合物
[0139] 本发明涉及免疫球蛋白结合物，其包括具有至少一个免疫球蛋白表面的残基突变的免疫球蛋白，其中该突变是用半胱氨酸残基的置换。将置换的半胱氨酸残基结合到原子
或分子，所述分子或原子可以是，例如，细胞毒性剂(例如毒素如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团如荧光染料象荧光素或罗丹明、用于成像或放射治疗的金属的螯合剂、肽基或非肽
基标记或检测标签、或清除修饰剂如聚乙二醇的各种同分异构体、结合到第三组分的肽、或另一个碳水化合物或亲脂剂。在另外的实施方式中，该分子可以是酶、肽、肽模拟物、核苷酸如RNA分子、包括siRNA、微小RNA和RNA模拟物、或适配体。
或分子，所述分子或原子可以是，例如，细胞毒性剂(例如毒素如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团如荧光染料象荧光素或罗丹明、用于成像或放射治疗的金属的螯合剂、肽基或非肽
基标记或检测标签、或清除修饰剂如聚乙二醇的各种同分异构体、结合到第三组分的肽、或另一个碳水化合物或亲脂剂。在另外的实施方式中，该分子可以是酶、肽、肽模拟物、核苷酸如RNA分子、包括siRNA、微小RNA和RNA模拟物、或适配体。
[0140] 标记的免疫球蛋白结合物
[0141] 在某些实施方式中，本发明的修饰的免疫球蛋白可与任何标记部分结合，该标记部分可通过反应性半胱氨酸巯基共价地结合到免疫球蛋白(Singh et al(2002)Anal.
Biochem.304：147-15；Harlow E.and Lane，D.(1999)Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification，2nd ed.CRC Press，Boca
Raton，Fla.)。结合的标记可起作用，例如：(i)提供可检测的信号；(ii)与第二标记相互作用以修饰由第一或第二标记提供的可检测的信号，例如以产生FRET(荧光共振能量转移)；
(iii)稳定相互作用或增加与抗原或配体结合的亲和性；(iv)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响迁移率，例如电泳迁移率，或细胞渗透性，或(v)提供捕获部分，以调节配体亲和性、抗体/抗原结合或离子络合。
Biochem.304：147-15；Harlow E.and Lane，D.(1999)Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification，2nd ed.CRC Press，Boca
Raton，Fla.)。结合的标记可起作用，例如：(i)提供可检测的信号；(ii)与第二标记相互作用以修饰由第一或第二标记提供的可检测的信号，例如以产生FRET(荧光共振能量转移)；
(iii)稳定相互作用或增加与抗原或配体结合的亲和性；(iv)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响迁移率，例如电泳迁移率，或细胞渗透性，或(v)提供捕获部分，以调节配体亲和性、抗体/抗原结合或离子络合。
[0142] 标记的免疫球蛋白结合物在诊断测定中是有用的，例如，用于检测特定细胞、组织或血清中目的抗原的表达。为了诊断应用，免疫球蛋白将通常用可检测的部分标记。许多标记是可利用的，它们大体上可被分成以下示例性的类别：
[0143] (a)放射性同位素(放射性核素)，如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111 123 124 25 131 133 177 211 213
In、 I、I、1 I、 I、Xe、 Lu、At或 Bi。放射性同位素标记的免疫球蛋白在靶向受
体的成像试验中是有用的。利用Current Protocols in Immunology，Volumes 1 and 2，
Coligen et al，Ed.Wiley-Interscience，New York，N.Y.，Pubs.(1991)中描述的技术，免疫球蛋白可用配体试剂标记，该试剂结合、螯合或另外络合放射性同位素金属，在那里该试剂与免疫球蛋白的工程化半胱氨酸巯基反应。可络合金属离子的螯合配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA(Macrocyclics，Dallas，Tex.)。放射性核素可通过与本发明的抗体-药物结合物的络合而被靶向(Wu et al(2005)Nature Biotechnology 23(9)：1137-1146)。
In、 I、I、1 I、 I、Xe、 Lu、At或 Bi。放射性同位素标记的免疫球蛋白在靶向受
体的成像试验中是有用的。利用Current Protocols in Immunology，Volumes 1 and 2，
Coligen et al，Ed.Wiley-Interscience，New York，N.Y.，Pubs.(1991)中描述的技术，免疫球蛋白可用配体试剂标记，该试剂结合、螯合或另外络合放射性同位素金属，在那里该试剂与免疫球蛋白的工程化半胱氨酸巯基反应。可络合金属离子的螯合配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA(Macrocyclics，Dallas，Tex.)。放射性核素可通过与本发明的抗体-药物结合物的络合而被靶向(Wu et al(2005)Nature Biotechnology 23(9)：1137-1146)。
[0144] 适于作为用于成像试验的免疫球蛋白标记的金属-螯合物络合物被公开：美国专利 号 5,342,606；5,428,155；5,316,757；5,480,990；5,462,725；5,428,139；5,385,893；
5,739,294；5,750,660；5,834,456；Hnatowich et al(1983)J.Immunol.Methods 65：
147-157；Meares et al(1984)Anal.Biochem.142：68-78；Mirzadeh et al(1990)
Bioconjugate Chem.1：59-65；Meares et al(1990)J.Cancer 1990，Suppl.10：21-26；
Izard et al(1992)Bioconjugate Chem.3：346-350；Nikula et al(1995)Nucl.Med.
Biol.22：387-90；Camera et al(1993)Nucl.Med.Biol.20：955-62；Kukis et al(1998)
J.Nucl.Med.39：2105-2110；Verel et al(2003)J.Nucl.Med.44：1663-1670；Camera et al(1994)J.Nucl.Med.21：640-646；Ruegg et al(1990)Cancer Res.50：4221-4226；Verel et al(2003)J.Nucl.Med.44：1663-1670；Lee et al(2001)Cancer Res.61：4474-4482；
Mitchell，et al(2003)J.Nucl.Med.44：1105-1112；Kobayashi et al(1999)Bioconjugate Chem.10：103-111；Miederer et al(2004)J.Nucl.Med.45：129-137；DeNardo et al(1998)Clinical Cancer Research 4：2483-90；Blend et al(2003)Cancer Biotherapy &
Radiopharmaceuticals 18：355-363；Nikula et al(1999)J.Nucl.Med.40：166-76；
Kobayashi et al(1998)J.Nucl.Med.39：829-36；Mardirossian et al(1993)Nucl.Med.
Biol.20：65-74；Roselli et al(1999)Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals，14：
209-20。
5,739,294；5,750,660；5,834,456；Hnatowich et al(1983)J.Immunol.Methods 65：
147-157；Meares et al(1984)Anal.Biochem.142：68-78；Mirzadeh et al(1990)
Bioconjugate Chem.1：59-65；Meares et al(1990)J.Cancer 1990，Suppl.10：21-26；
Izard et al(1992)Bioconjugate Chem.3：346-350；Nikula et al(1995)Nucl.Med.
Biol.22：387-90；Camera et al(1993)Nucl.Med.Biol.20：955-62；Kukis et al(1998)
J.Nucl.Med.39：2105-2110；Verel et al(2003)J.Nucl.Med.44：1663-1670；Camera et al(1994)J.Nucl.Med.21：640-646；Ruegg et al(1990)Cancer Res.50：4221-4226；Verel et al(2003)J.Nucl.Med.44：1663-1670；Lee et al(2001)Cancer Res.61：4474-4482；
Mitchell，et al(2003)J.Nucl.Med.44：1105-1112；Kobayashi et al(1999)Bioconjugate Chem.10：103-111；Miederer et al(2004)J.Nucl.Med.45：129-137；DeNardo et al(1998)Clinical Cancer Research 4：2483-90；Blend et al(2003)Cancer Biotherapy &
Radiopharmaceuticals 18：355-363；Nikula et al(1999)J.Nucl.Med.40：166-76；
Kobayashi et al(1998)J.Nucl.Med.39：829-36；Mardirossian et al(1993)Nucl.Med.
Biol.20：65-74；Roselli et al(1999)Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals，14：
209-20。
[0145] (b)荧光标记如稀土螯合物(铕螯合物)、荧光素种类——包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；包括TAMRA在内的罗丹明种类；丹酰；丽丝胺；花青；藻红蛋白；德克萨斯红；和其类似物。利用，例如，上述Current Protocols in Immunology中公开的技术，荧光标记可被结合到免疫球蛋白。荧光染料和荧光标记试剂包括从Invitrogen/Molecular
Probes(Eugene，Oreg.)和Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，Ill.)商业上可获得的那些荧光染料和荧光标记试剂。
Probes(Eugene，Oreg.)和Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，Ill.)商业上可获得的那些荧光染料和荧光标记试剂。
[0146] c)各种酶-底物标记是可获得的或公开的(美国专利号4,275,149)。酶通常催化生色底物的化学改变，利用各种技术该改变可被测量。例如，酶可催化底物的颜色改变，该颜色改变可通过分光光度方法测量。可选地，酶可改变底物的荧光或化学发光。上面描
述了定量荧光变化的技术。化学发光底物通过化学反应变得电子激活并可然后发光，光可
被测量(例如利用化学发光仪(chemiluminometer))或将能量供给荧光接受器。酶标记
的例子包括萤光素酶(例如，荧火虫荧光素酶和细菌萤光素酶；美国专利号4,737,456)、萤光素、2，3-二氢邻苯二甲酰肼、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳
过氧化物酶、微过氧化物酶和类似物。将酶与抗体结合的技术公开在O′Sullivan et
al (1981)″Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use
in Enzyme Immunoassay″，于Methods in Enzym.(ed J.Langone & H.Van Vunakis)，
Academic Press，New York，73：147-166中。
述了定量荧光变化的技术。化学发光底物通过化学反应变得电子激活并可然后发光，光可
被测量(例如利用化学发光仪(chemiluminometer))或将能量供给荧光接受器。酶标记
的例子包括萤光素酶(例如，荧火虫荧光素酶和细菌萤光素酶；美国专利号4,737,456)、萤光素、2，3-二氢邻苯二甲酰肼、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳
过氧化物酶、微过氧化物酶和类似物。将酶与抗体结合的技术公开在O′Sullivan et
al (1981)″Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use
in Enzyme Immunoassay″，于Methods in Enzym.(ed J.Langone & H.Van Vunakis)，
Academic Press，New York，73：147-166中。
[0147] 酶-底物联合的例子包括，例如：(i)以过氧化氢酶作为底物的辣根过氧化物酶(HRP)，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB))；(ii)以对硝基苯基磷酸作为生色底物的碱性磷酸酶(AP)；和(iii)β-D-半乳
糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如，p-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲
基伞形基(methyl umbellifery)-β-D-半乳糖苷酶。许多其它酶-底物联合对本领域的
技术人员来说是可获得的。为了总览，参见美国专利号4,275,149和4,318,980。
糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如，p-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲
基伞形基(methyl umbellifery)-β-D-半乳糖苷酶。许多其它酶-底物联合对本领域的
技术人员来说是可获得的。为了总览，参见美国专利号4,275,149和4,318,980。
[0148] 标记可直接与本发明的修饰的免疫球蛋白结合。例如，免疫球蛋白可与生物素结合，上述标记的任意三种宽类别可与抗生物素蛋白或链霉抗生物素结合，反之亦然。生物素选择性地结合到链霉抗生物素，因此，该标记可与免疫球蛋白以间接的方式结合。可选地，为了获得标记与免疫球蛋白变体的间接结合，将免疫球蛋白变体与小的半抗原(例如，地
高辛)结合，上述标记的不同种类之一与抗半抗原多肽变体(例如，抗地高辛抗体)结合。
因此，可获得标记与免疫球蛋白变体的间接结合(Hermanson，G.(1996)，于Bioconjugate Techniques Academic Press，San Diego).
高辛)结合，上述标记的不同种类之一与抗半抗原多肽变体(例如，抗地高辛抗体)结合。
因此，可获得标记与免疫球蛋白变体的间接结合(Hermanson，G.(1996)，于Bioconjugate Techniques Academic Press，San Diego).
[0149] 本发明的修饰的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物可用于任何已知的测定方法，如ELISA、竞争性结合测定、直接和间接夹心测定、和免疫沉淀测定(Zola，(1987)单克隆
抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques)，pp.147-158，CRC Press，Inc.)。
抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques)，pp.147-158，CRC Press，Inc.)。
[0150] 检测标记可用于定位、可视化和定量结合或识别事项。本发明的标记的免疫球蛋白结合物可检测细胞表面受体。可检测的标记的免疫球蛋白结合物的另一个用途是基于小
珠的免疫捕获的方法，包括将小珠与荧光标记的抗体结合和检测结合配体之后的光信号。
相似的结合检测方法学利用表面等离子共振(SPR)效应来测量和检测抗体-抗原相互作
用。
珠的免疫捕获的方法，包括将小珠与荧光标记的抗体结合和检测结合配体之后的光信号。
相似的结合检测方法学利用表面等离子共振(SPR)效应来测量和检测抗体-抗原相互作
用。
[0151] 检测标记如荧光染料和化学发光染料(Briggs et al(1997)″Synthesisof Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino
Acids，″J.Chem.Soc.，Perkin-Trans.1：1051-1058)提供可检测的信号并通常应用于标
记免疫球蛋白，优选具有以下性质：(i)标记的免疫球蛋白应产生具有低本底的非常高的
信号，以便小量免疫球蛋白在无细胞和基于细胞的测定中可被敏感地检测；和(ii)标记的
抗体应是不感光的，以便荧光信号可被观察、监测和记录，没有显著的光漂白。对于涉及标记的抗体与膜或细胞表面的细胞表面结合的应用，尤其是肝细胞，该标记优选(iii)具有
好的水溶性以获得有效的结合物浓度和检测灵敏度，并且(iv)对活细胞是无毒的以不破
坏正常的细胞代谢过程或引起早期细胞死亡。
Acids，″J.Chem.Soc.，Perkin-Trans.1：1051-1058)提供可检测的信号并通常应用于标
记免疫球蛋白，优选具有以下性质：(i)标记的免疫球蛋白应产生具有低本底的非常高的
信号，以便小量免疫球蛋白在无细胞和基于细胞的测定中可被敏感地检测；和(ii)标记的
抗体应是不感光的，以便荧光信号可被观察、监测和记录，没有显著的光漂白。对于涉及标记的抗体与膜或细胞表面的细胞表面结合的应用，尤其是肝细胞，该标记优选(iii)具有
好的水溶性以获得有效的结合物浓度和检测灵敏度，并且(iv)对活细胞是无毒的以不破
坏正常的细胞代谢过程或引起早期细胞死亡。
[0152] 细胞荧光强度的直接定量和荧光标记的事项的计数，例如肽-染料结合物的细胞表面结合可在系统(FMAT(TM)8100 HTS System，Applied Biosystems，Foster
City，Calif.)上进行，该系统自动操作混合和读取，用肝细胞或小珠的非放射性测定
(Miraglia，″Homogeneous cell-and bead-based assays for throughput screening
using fluorometric microvolume assay technology ″，(1999)J.of Biomolecular
Screening 4：193-204)。标记的免疫球蛋白的用途还包括细胞表面受体结合测定、免疫捕获测定、荧光联免疫吸附测定(FLISA)、胱天蛋白酶-分裂(Zheng，″Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis
in vivo ″，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：618-23；美 国 专 利 号 6,372,907)、凋 亡 (Vermes， ″ A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of
phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein
labeled Annexin V″(1995)J.Immunol.Methods 184：39-51)和细胞毒性测定。微体积
荧光数字图像测定技术(Fluorometric microvolume assay technology)可用于通过靶
向到细胞表面的分子鉴别上调和下调(Swartzman，″A homogeneous andmultiplexed
immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology″，(1999)Anal.Biochem.271：143-51)。
City，Calif.)上进行，该系统自动操作混合和读取，用肝细胞或小珠的非放射性测定
(Miraglia，″Homogeneous cell-and bead-based assays for throughput screening
using fluorometric microvolume assay technology ″，(1999)J.of Biomolecular
Screening 4：193-204)。标记的免疫球蛋白的用途还包括细胞表面受体结合测定、免疫捕获测定、荧光联免疫吸附测定(FLISA)、胱天蛋白酶-分裂(Zheng，″Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis
in vivo ″，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：618-23；美 国 专 利 号 6,372,907)、凋 亡 (Vermes， ″ A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of
phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein
labeled Annexin V″(1995)J.Immunol.Methods 184：39-51)和细胞毒性测定。微体积
荧光数字图像测定技术(Fluorometric microvolume assay technology)可用于通过靶
向到细胞表面的分子鉴别上调和下调(Swartzman，″A homogeneous andmultiplexed
immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology″，(1999)Anal.Biochem.271：143-51)。
[0153] 标记的本发明的免疫球蛋白结合物通过生物医学和分子成像的各种方法和技术用作成像生物标记和探针，如：(i)MRI(磁共振成像)；(ii)MicroCT(计算机控制断层摄
影术)；(iii)SPECT(单光子发射型计算机体层摄影)；(iv)PET(正电子发射断层摄影术)
Chen et al(2004)Bioconjugate Chem.15：41-49；v)生物发光；(vi)荧光；和(vii)超声。
免疫闪烁成像是成像程序，其中将用放射性物质标记的抗体给予动物或人类患者，获取抗
体在身体中定位的位点的图片(美国专利号6,528,624)。成像生物标记可被客观地测量
和评价为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指示物。生物标记可具有
几种类型：O型是疾病的自然史标记并与已知的临床指标——例如风湿性关节炎中的滑液
炎症的MRI评估——纵向地相关联；I型标记根据作用机制捕获干预的效应，即使该机制可
能与临床结果不相关；II型标记充当替代终点，在那里生物标记的改变或来自生物标记的
信号预测临床益处以“确认”靶反应，如通过CT测量的风湿性关节炎中的骨质侵蚀。成像
生物标记因此可提供关于以下的药物动力(PD)治疗信息：(i)靶蛋白的表达，(ii)治疗剂
与靶蛋白的结合，即选择性，和(iii)清除和半衰期药物代谢动力学数据。体内成像生物标记相对于基于实验室的生物标记的优势包括：非创伤的治疗、可以计量的、全身评估、重复给药和评估，即多时间点，和从临床前(小动物)到临床(人类)结果的潜在的可转移的作
用。对于一些应用，生物成像置换或最小化临床前研究中动物实验的数量。
影术)；(iii)SPECT(单光子发射型计算机体层摄影)；(iv)PET(正电子发射断层摄影术)
Chen et al(2004)Bioconjugate Chem.15：41-49；v)生物发光；(vi)荧光；和(vii)超声。
免疫闪烁成像是成像程序，其中将用放射性物质标记的抗体给予动物或人类患者，获取抗
体在身体中定位的位点的图片(美国专利号6,528,624)。成像生物标记可被客观地测量
和评价为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指示物。生物标记可具有
几种类型：O型是疾病的自然史标记并与已知的临床指标——例如风湿性关节炎中的滑液
炎症的MRI评估——纵向地相关联；I型标记根据作用机制捕获干预的效应，即使该机制可
能与临床结果不相关；II型标记充当替代终点，在那里生物标记的改变或来自生物标记的
信号预测临床益处以“确认”靶反应，如通过CT测量的风湿性关节炎中的骨质侵蚀。成像
生物标记因此可提供关于以下的药物动力(PD)治疗信息：(i)靶蛋白的表达，(ii)治疗剂
与靶蛋白的结合，即选择性，和(iii)清除和半衰期药物代谢动力学数据。体内成像生物标记相对于基于实验室的生物标记的优势包括：非创伤的治疗、可以计量的、全身评估、重复给药和评估，即多时间点，和从临床前(小动物)到临床(人类)结果的潜在的可转移的作
用。对于一些应用，生物成像置换或最小化临床前研究中动物实验的数量。
[0154] 放射性核素成像标记包括放射性核素如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111 123 124 125 131 133 177 211 213
In、 I、I、 I、I、 Xe、Lu、 At或 Bi。放射性核素金属离子可与螯合连接体如
DOTA络合。连接体试剂如DOTA-马来酰亚胺(4-马来酰亚胺丁酰胺苄基(maleimidobut
yramidobenzyl)-DOTA)可通过由氯甲酸异丙酯(isopropylchloroformate)(Aldrich)激
活的氨基苄基-DOTA与4-马来酰亚胺丁酸(maleimidobutyric acid)(Fluka)反应，之
后是Axworthy et al(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(4)：1802-1807)的程序而被制
备。DOTA-马来酰亚胺试剂与修饰的免疫球蛋白的游离半胱氨酸氨基酸反应并在抗体上提
供金属络合配体(Lewis et al(1998)Bioconj.Chem.9：72-86)。螯合连接体标记试剂如
DOTA-NHS(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)是
商业上可获得的(Macrocyclics，Dallas，Tex.)。具有放射性核素标记的抗体的受体靶向
成像可通过肿瘤组织中抗体的递增的积累的检测和定量而提供通路活化标记(Albert et
al(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8：1207-1210)。溶酶体降解之后结合的放射金属可保留
在细胞内。
In、 I、I、 I、I、 Xe、Lu、 At或 Bi。放射性核素金属离子可与螯合连接体如
DOTA络合。连接体试剂如DOTA-马来酰亚胺(4-马来酰亚胺丁酰胺苄基(maleimidobut
yramidobenzyl)-DOTA)可通过由氯甲酸异丙酯(isopropylchloroformate)(Aldrich)激
活的氨基苄基-DOTA与4-马来酰亚胺丁酸(maleimidobutyric acid)(Fluka)反应，之
后是Axworthy et al(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(4)：1802-1807)的程序而被制
备。DOTA-马来酰亚胺试剂与修饰的免疫球蛋白的游离半胱氨酸氨基酸反应并在抗体上提
供金属络合配体(Lewis et al(1998)Bioconj.Chem.9：72-86)。螯合连接体标记试剂如
DOTA-NHS(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)是
商业上可获得的(Macrocyclics，Dallas，Tex.)。具有放射性核素标记的抗体的受体靶向
成像可通过肿瘤组织中抗体的递增的积累的检测和定量而提供通路活化标记(Albert et
al(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8：1207-1210)。溶酶体降解之后结合的放射金属可保留
在细胞内。
[0155] 肽标记方法是众所周知的。参见Haugland，2003，Molecular Probes Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular Probes，Inc.；
Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.3：2；Garman，(1997)Non-Radioactive Labelling：
APractical Approach，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1：
2；Glazer et al(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology(T.S.Work and E.Work，Eds.)American
Elsevier Publishing Co.，New York；Lundblad，R.L.and Noyes，C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein Modification，Vols.I and II，CRC Press，New York；Pfleiderer，G.(1985) ″ Chemical Modification of Proteins ″，Modern Methods in Protein
Chemistry，H.Tschesche，Ed.，Walter DeGryter，Berlin and New York；和Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking，CRC Press，Boca Raton，
Fla.)；De Leon-Rodriguez et al(2004)Chem.Eur.J.10：1149-1155；Lewis et al(2001)Bioconjugate Chem.12：320-324；Li et al(2002)Bioconjugate Chem.13：110-115；Mier et al(2005)Bioconjugate Chem.16：240-237。
Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.3：2；Garman，(1997)Non-Radioactive Labelling：
APractical Approach，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1：
2；Glazer et al(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology(T.S.Work and E.Work，Eds.)American
Elsevier Publishing Co.，New York；Lundblad，R.L.and Noyes，C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein Modification，Vols.I and II，CRC Press，New York；Pfleiderer，G.(1985) ″ Chemical Modification of Proteins ″，Modern Methods in Protein
Chemistry，H.Tschesche，Ed.，Walter DeGryter，Berlin and New York；和Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking，CRC Press，Boca Raton，
Fla.)；De Leon-Rodriguez et al(2004)Chem.Eur.J.10：1149-1155；Lewis et al(2001)Bioconjugate Chem.12：320-324；Li et al(2002)Bioconjugate Chem.13：110-115；Mier et al(2005)Bioconjugate Chem.16：240-237。
[0156] 用两部分——位于足够近的荧光报道分子和猝灭剂——标记的肽和蛋白经历荧光共振能量转移(FRET)。报道基团通常是荧光染料，其被一定波长的光激发并将能量转移
给具有适当斯托克斯位移(Stokes shift)的受体、或猝灭剂、基团，用于以最大亮度发射。
荧光染料包括具有延长的芳香性的分子，如荧光素和罗丹明，和它们的衍生物。荧光报道
分子可以部分或显著地被未受损的肽中的猝灭剂部分淬灭。肽被肽酶或蛋白酶裂解之后，
可检测的荧光增加可被测量(Knight，C.(1995)″Fluorimetric Assays of Proteolytic
Enzymes″，Methods in Enzymology，Academic Press，248：18-34)。
给具有适当斯托克斯位移(Stokes shift)的受体、或猝灭剂、基团，用于以最大亮度发射。
荧光染料包括具有延长的芳香性的分子，如荧光素和罗丹明，和它们的衍生物。荧光报道
分子可以部分或显著地被未受损的肽中的猝灭剂部分淬灭。肽被肽酶或蛋白酶裂解之后，
可检测的荧光增加可被测量(Knight，C.(1995)″Fluorimetric Assays of Proteolytic
Enzymes″，Methods in Enzymology，Academic Press，248：18-34)。
[0157] 本发明的标记的抗体还可用作亲和纯化剂。在该过程中，利用本领域熟知的方法，将标记的抗体固定在固相如葡聚糖凝胶树脂或滤纸上。将固定的抗体与含有将被纯化的抗原的样品接触，此后用合适的溶剂洗支持物，该溶剂将基本上去除样品中除了将要纯化的
抗原外的所有物质，该抗原结合到固定的多肽变体。最后，用另一种合适的溶剂如甘氨酸缓冲液，pH 5.0洗支持物，其将使抗原从多肽变体释放。
抗原外的所有物质，该抗原结合到固定的多肽变体。最后，用另一种合适的溶剂如甘氨酸缓冲液，pH 5.0洗支持物，其将使抗原从多肽变体释放。
[0158] 标记试剂通常具有反应的功能性，其可(i)直接与修饰的免疫球蛋白的半胱氨酸巯基反应以形成标记的抗体，(ii)与连接体试剂反应以形成连接体-标记中间体，或(iii)
与连接体抗体反应以形成标记的抗体。标记试剂的反应功能性包括：马来酰亚胺、卤代乙
酰基(haloacetyl)、碘乙酰胺琥珀酰亚胺酯(iodoacetamide succinimidyl ester)(例如
NHS、N-羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸酯、磺酰氯、2，6-二氯三嗪基(dichlorotriazinyl)、五氟苯酯(pentafluorophenyl ester)和亚磷酰胺，尽管也可利用其它的官能团。
与连接体抗体反应以形成标记的抗体。标记试剂的反应功能性包括：马来酰亚胺、卤代乙
酰基(haloacetyl)、碘乙酰胺琥珀酰亚胺酯(iodoacetamide succinimidyl ester)(例如
NHS、N-羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸酯、磺酰氯、2，6-二氯三嗪基(dichlorotriazinyl)、五氟苯酯(pentafluorophenyl ester)和亚磷酰胺，尽管也可利用其它的官能团。
[0159] 示例性的反应官能团是可检测标记的羧基取代基的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)，例如生物素或荧光染料。标记的NHS酯可被预先形成、分离、纯化和/或鉴定，或它可在
原位形成并与抗体的亲核基团反应。通常，标记的羧基形式由与碳二亚胺试剂例如二环己
基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺或脲阳离子，例如TSTU(O--(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(tetramethyluronium tetrafluoroborate)、HBTU(O-苯并三
唑(benzotriazol)-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(tetramethyluronium
hexafluorophosphate))、或HATU(O-(7-偶氮苯并三唑(azabenzotriazol)-1-基)-N，
N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯)，激活剂，如1-羟基苯并三唑(HOBt)和N-羟基琥
珀酰亚胺的一些组合而被活化以产生标记的NHS酯。在一些情况下，标记和抗体可通过
标记的原位激活和与抗体反应而被偶联以在一个步骤中形成标记-抗体结合物。其它
激活和连结试剂包括TBTU(2-(1H-苯并三唑(benzotriazo)-1-基)-1-1，3，3-四甲基脲
六氟磷酸酯)、TFFH(N，N′，N″，N″′-四甲基脲2-氟-六氟磷酸酯)、PyBOP(苯并三
唑-1-基-氧-三-吡咯烷子基(pyrrolidino)-磷六氟磷酸酯、EEDQ(2-乙氧基-1-乙
氧羰基-1，2-二氢-喹啉)、DCC(二环己基碳二亚胺)；DIPCDI(二异丙基碳二亚胺)、
MSNT(1-(三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑和芳基磺酰基卤化物，例如三异
丙基苯磺酰氯。
原位形成并与抗体的亲核基团反应。通常，标记的羧基形式由与碳二亚胺试剂例如二环己
基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺或脲阳离子，例如TSTU(O--(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(tetramethyluronium tetrafluoroborate)、HBTU(O-苯并三
唑(benzotriazol)-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(tetramethyluronium
hexafluorophosphate))、或HATU(O-(7-偶氮苯并三唑(azabenzotriazol)-1-基)-N，
N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯)，激活剂，如1-羟基苯并三唑(HOBt)和N-羟基琥
珀酰亚胺的一些组合而被活化以产生标记的NHS酯。在一些情况下，标记和抗体可通过
标记的原位激活和与抗体反应而被偶联以在一个步骤中形成标记-抗体结合物。其它
激活和连结试剂包括TBTU(2-(1H-苯并三唑(benzotriazo)-1-基)-1-1，3，3-四甲基脲
六氟磷酸酯)、TFFH(N，N′，N″，N″′-四甲基脲2-氟-六氟磷酸酯)、PyBOP(苯并三
唑-1-基-氧-三-吡咯烷子基(pyrrolidino)-磷六氟磷酸酯、EEDQ(2-乙氧基-1-乙
氧羰基-1，2-二氢-喹啉)、DCC(二环己基碳二亚胺)；DIPCDI(二异丙基碳二亚胺)、
MSNT(1-(三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑和芳基磺酰基卤化物，例如三异
丙基苯磺酰氯。
[0160] 因此本发明的目的是提供如[0007]段中讨论的免疫球蛋白结合物和它们的实施方式的任意和所有组合作为诊断工具的用途。
[0161] 因此本发明的目的是提供如[0007]段中讨论的免疫球蛋白结合物和它们的实施方式的任意和所有组合作为高分子量蛋白标准物的用途。
[0162] 免疫球蛋白聚合物结合物
[0163] 在另外的实施方式中，本发明还考虑免疫球蛋白结合物，其中免疫球蛋白与聚合物连接。通常，聚合物是水溶性的，以便免疫球蛋白组分在水性环境，如生理环境中不
沉淀。合适的聚合物的例子是已被修饰具有单个反应基的聚合物，如用于酰化的活性酯
或用于烷基化的醛。以这种方式，聚合的程度可被控制。反应性醛的例子是聚乙二醇丙
醛、或单-(C1-C10)烷氧基、或其芳氧基衍生物(参见，例如，Harris，et al.，美国专利号
5,252,714)。聚合物可分枝或不分枝。而且，聚合物的混合物可用于产生与抗体组分的结
合物。
沉淀。合适的聚合物的例子是已被修饰具有单个反应基的聚合物，如用于酰化的活性酯
或用于烷基化的醛。以这种方式，聚合的程度可被控制。反应性醛的例子是聚乙二醇丙
醛、或单-(C1-C10)烷氧基、或其芳氧基衍生物(参见，例如，Harris，et al.，美国专利号
5,252,714)。聚合物可分枝或不分枝。而且，聚合物的混合物可用于产生与抗体组分的结
合物。
[0164] 合适的水溶性聚合物没有限制地包括，聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、单-(C1-C10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)PEG、三氟代乙磺酰
(tresyl)单甲氧基PEG、PEG丙醛、双-琥珀酰亚胺碳酸盐PEG、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化
物/环氧乙烷共聚合物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇、葡聚糖、纤维素或其它基于碳水化合物的聚合物。合适的PEG可具有约600至约60,000的分子量，包括，例如，
5,000、12,000、20,000和25,000。结合物还可包括这样的水溶性聚合物的混合物。
(tresyl)单甲氧基PEG、PEG丙醛、双-琥珀酰亚胺碳酸盐PEG、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化
物/环氧乙烷共聚合物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇、葡聚糖、纤维素或其它基于碳水化合物的聚合物。合适的PEG可具有约600至约60,000的分子量，包括，例如，
5,000、12,000、20,000和25,000。结合物还可包括这样的水溶性聚合物的混合物。
[0165] 作为例证，聚烷基氧化物(polyalkyl oxide)部分可被连接到免疫球蛋白组分的N-端。PEG是一个合适的聚烷基氧化物。例如，免疫球蛋白可以用PEG修饰，称作“聚乙二
醇化”过程。免疫球蛋白的聚乙二醇化可通过本领域已知的聚乙二醇化反应进行(参见，
例如，EP 0 154 316，Delgado et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249(1992)、Duncan and Spreafico，Clin.Pharmacokinet.27：290(1994)，and Francis et al.，Int J Hematol 68：1(1998))。例如，聚乙二醇化可通过酰化反应或通
过与反应性聚乙二醇分子的烷基化反应进行。在可选的方法中，免疫球蛋白结合物通过凝
结活化的PEG而形成，其中PEG的末端羟基或氨基已被活化的连接体替代(参见，例如，
Karasiewicz et al.，美国专利号5,382,657)。
醇化”过程。免疫球蛋白的聚乙二醇化可通过本领域已知的聚乙二醇化反应进行(参见，
例如，EP 0 154 316，Delgado et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249(1992)、Duncan and Spreafico，Clin.Pharmacokinet.27：290(1994)，and Francis et al.，Int J Hematol 68：1(1998))。例如，聚乙二醇化可通过酰化反应或通
过与反应性聚乙二醇分子的烷基化反应进行。在可选的方法中，免疫球蛋白结合物通过凝
结活化的PEG而形成，其中PEG的末端羟基或氨基已被活化的连接体替代(参见，例如，
Karasiewicz et al.，美国专利号5,382,657)。
[0166] 通过酰化的聚乙二醇化通常要求将PEG的活性酯衍生物与免疫球蛋白反应。活化的PEG酯的例子是酯化到N-羟基琥珀酰亚胺的PEG。如本文所用，术语“酰化”包括免疫球
蛋白和水溶性聚合物之间以下类型的连接：酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯和类似物。通过酰化制备聚乙二醇抗BCMA-TACI免疫球蛋白的方法将通常包括以下步骤：(a)使免疫球
蛋白与PEG(如PEG的醛衍生物的活性酯)在条件下反应，借此一个或多个PEG基团连接到
免疫球蛋白，和(b)获得反应产物(或多个)。一般而言，酰化反应的最佳反应条件将根据
已知参数和期望的结果而定。例如，PEG：抗体组分的比越大、聚乙二醇化抗体组分产物的百分比越大。
蛋白和水溶性聚合物之间以下类型的连接：酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯和类似物。通过酰化制备聚乙二醇抗BCMA-TACI免疫球蛋白的方法将通常包括以下步骤：(a)使免疫球
蛋白与PEG(如PEG的醛衍生物的活性酯)在条件下反应，借此一个或多个PEG基团连接到
免疫球蛋白，和(b)获得反应产物(或多个)。一般而言，酰化反应的最佳反应条件将根据
已知参数和期望的结果而定。例如，PEG：抗体组分的比越大、聚乙二醇化抗体组分产物的百分比越大。
[0167] 通过酰化的聚乙二醇化的产物通常是聚乙二醇化免疫球蛋白产物，其中赖氨酸ε-氨基通过酰基连接基团被聚乙二醇化。连接键的例子是酰胺。通常，得到的免疫球蛋白组分将是至少95％单、双或三聚乙二醇化，尽管一些具有较高聚乙二醇化程度的种类可根
据反应条件而形成。利用标准的纯化方法，如透析、超滤、离子交换层析、亲和层析等方法可将聚乙二醇化种类与未结合的免疫球蛋白组分分离。
据反应条件而形成。利用标准的纯化方法，如透析、超滤、离子交换层析、亲和层析等方法可将聚乙二醇化种类与未结合的免疫球蛋白组分分离。
[0168] 通过烷基化的聚乙二醇化通常包括在存在还原剂的条件下使PEG的末端醛衍生物与免疫球蛋白组分反应。PEG基团可通过--CH2-NH基团被连接到多肽。
[0169] 通过还原性烷基化以产生单聚乙二醇产物的衍生利用衍生可利用的不同类型的主要氨基的差别反应性。通常，该反应在允许人们利用蛋白质的赖氨酸残基的ε-氨基与
N-端残基的α-氨基之间的pKa差别的pH进行。通过这种选择性的衍生，控制含有反应基
如醛的水溶性聚合物结合到蛋白质。与聚合物的结合主要发生在没有其它反应基如赖氨酸
侧链氨基的显著修饰的蛋白质的N-端。
N-端残基的α-氨基之间的pKa差别的pH进行。通过这种选择性的衍生，控制含有反应基
如醛的水溶性聚合物结合到蛋白质。与聚合物的结合主要发生在没有其它反应基如赖氨酸
侧链氨基的显著修饰的蛋白质的N-端。
[0170] 产生单聚合物(monopolymer)抗体组分结合物分子基本上同源群体的还原性烷基化可包括以下步骤：(a)使抗体组分与活性PEG在还原性烷基化条件下在适于允许
α-氨基的选择性修饰的pH在抗体组分的氨基端反应，和(b)获得反应产物(或多个)。用
于还原性烷基化的还原剂应在水溶液中稳定和优选能只还原在还原性烷基化的最初过程
中形成的希夫碱。优选的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷和吡啶硼烷。
α-氨基的选择性修饰的pH在抗体组分的氨基端反应，和(b)获得反应产物(或多个)。用
于还原性烷基化的还原剂应在水溶液中稳定和优选能只还原在还原性烷基化的最初过程
中形成的希夫碱。优选的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷和吡啶硼烷。
[0171] 对于单聚合物免疫球蛋白结合物的基本上同源的群体，还原性烷基化反应条件是允许水溶性聚合物部分选择性的连接到免疫球蛋白N端的那些条件。这样的反应条件通常
提供在N端赖氨酸氨基和α-氨基之间的pKa差异。该pH还影响聚合物与将使用的蛋白质
的比例。一般而言，如果pH较低，那么将期望聚合物对蛋白质的较大过量，因为活性N-端
α-基团越少，就需要越多的聚合物来达到最适条件。如果pH较高，那么聚合物：抗体组分不需要这样大，因为更多的反应基可利用。通常，pH将落入3至9或3至6的范围。
提供在N端赖氨酸氨基和α-氨基之间的pKa差异。该pH还影响聚合物与将使用的蛋白质
的比例。一般而言，如果pH较低，那么将期望聚合物对蛋白质的较大过量，因为活性N-端
α-基团越少，就需要越多的聚合物来达到最适条件。如果pH较高，那么聚合物：抗体组分不需要这样大，因为更多的反应基可利用。通常，pH将落入3至9或3至6的范围。
[0172] 产生包括多肽和水溶性聚合物部分的结合物的一般方法是本领域已知的。参见，例如，Karasiewicz et al.，美国专利号5,382,657、Greenwald et al.，美国专利号
5,738,846、Nieforth et al.，Clin.Pharmacol.Ther.59：636(1996)、Monkarsh et al.，Anal Biochem.247：434(1997))。
5,738,846、Nieforth et al.，Clin.Pharmacol.Ther.59：636(1996)、Monkarsh et al.，Anal Biochem.247：434(1997))。
[0173] 免疫球蛋白药物结合物
[0174] 在另外的实施方式中，本发明包括免疫球蛋白结合物，其中免疫球蛋白结合到药物或细胞毒性部分。免疫球蛋白药物结合物的药物部分可，例如，包括具有细胞毒性效应
或抑制细胞效应的任何化合物、部分或基团。药物部分没有限制地包括：(i)化学治疗剂，其可充当微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂；(ii)蛋白毒素，其可起到酶的作用；和(iii)放射性同位素。
或抑制细胞效应的任何化合物、部分或基团。药物部分没有限制地包括：(i)化学治疗剂，其可充当微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂；(ii)蛋白毒素，其可起到酶的作用；和(iii)放射性同位素。
[0175] 示例性的药物部分包括但不限于美登木素生物碱、奥利斯汀、多拉司他汀、单端孢霉烯、CC1065、加利车霉素和其它烯二炔类抗生素、紫杉烷、蒽环类抗生素和其立体异构体、同电子排列体、类似物或衍生物。
[0176] 适于用作美登木素生物碱药物部分的美坦辛化合物是本领域已知的，并可根据已知方法从天然来源分离、利用基因工程技术产生(参见Yu et al(2002)PROC.NAT.ACAD.
SCI.(USA)99：7968-7973)，或根据已知方法合成制备的美登醇和美登醇类似物。
SCI.(USA)99：7968-7973)，或根据已知方法合成制备的美登醇和美登醇类似物。
[0177] 示例性的美登木素生物碱药物部分包括具有修饰的芳环，如：C-19-脱氯(dechloro)(美国专利号4,256,746)(由安丝菌素(ansamytocin)P2的氢化铝锂还原制
备)；C-20-羟基(或C-20-去甲基(demethyl))+/-C-19-脱氯(美国专利号4,361,650和
4,307,016)(由利用链霉菌属或放线菌属的去甲基或利用LAH的脱氯制备)；和C-20-去甲
氧基(demethoxy)、C-20-酰氧基(--OCOR)，+/-脱氯(美国专利号4,294,757)(由利用酰
氯的酰化制备)的那些美登木素生物碱药物部分和在其它位置具有修饰的那些美登木素
生物碱药物部分。
备)；C-20-羟基(或C-20-去甲基(demethyl))+/-C-19-脱氯(美国专利号4,361,650和
4,307,016)(由利用链霉菌属或放线菌属的去甲基或利用LAH的脱氯制备)；和C-20-去甲
氧基(demethoxy)、C-20-酰氧基(--OCOR)，+/-脱氯(美国专利号4,294,757)(由利用酰
氯的酰化制备)的那些美登木素生物碱药物部分和在其它位置具有修饰的那些美登木素
生物碱药物部分。
[0178] 示例性的美登木素生物碱药物部分还包括具有如下修饰的那些：C-9-SH(美国专利号4,424,219)(由美登醇与H2S或P2S5的反应制备)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/
CH2 OR)(美国专利号4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国
专利号4,450,254)(由诺卡氏菌属(Nocardia)制备)；C--I 5-羟基/酰氧基(美国专
利号4,364,866)(由链霉菌属转化美登醇制备)；C-15-甲氧基(美国专利号4,313,946
和4,315,929)(分离自Trewia nudlflora)；C-18-N-去甲基(美国专利号4,362,663和
4,322,348)(由用链霉菌属去甲基美登醇制备)；和4，5-脱氧(美国专利号4,371,533)(由
美登醇的三氯化钛/LAH还原制备)。已知美坦辛化合物上的许多位置用于作为连接位置，
取决于连接的类型。例如，为了形成酯键，具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰的C-14位、用羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位都是合适的。
CH2 OR)(美国专利号4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国
专利号4,450,254)(由诺卡氏菌属(Nocardia)制备)；C--I 5-羟基/酰氧基(美国专
利号4,364,866)(由链霉菌属转化美登醇制备)；C-15-甲氧基(美国专利号4,313,946
和4,315,929)(分离自Trewia nudlflora)；C-18-N-去甲基(美国专利号4,362,663和
4,322,348)(由用链霉菌属去甲基美登醇制备)；和4，5-脱氧(美国专利号4,371,533)(由
美登醇的三氯化钛/LAH还原制备)。已知美坦辛化合物上的许多位置用于作为连接位置，
取决于连接的类型。例如，为了形成酯键，具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰的C-14位、用羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位都是合适的。
[0179] 美坦辛化合物通过抑制微管蛋白、微管素的聚合，抑制有丝分裂过程中微管的形成而抑制细胞增殖(Remillard et al(1975)Science 189：1002-1005)。美坦辛和美登木素生物碱是高细胞毒性的，但是它们在癌症治疗中的临床应用已大大受限于它们严重的全身
副作用，该副作用主要源于它们对肿瘤的选择性差。由于对中枢神经系统和胃肠系统严重
的不良反应，利用美坦辛的临床试验已中断了(Issel et al(1978)Can.Treatment.Rev.5：
199-207)。
副作用，该副作用主要源于它们对肿瘤的选择性差。由于对中枢神经系统和胃肠系统严重
的不良反应，利用美坦辛的临床试验已中断了(Issel et al(1978)Can.Treatment.Rev.5：
199-207)。
[0180] 美登木素生物碱药物部分是免疫球蛋白药物结合物中有吸引力的药物部分，因为它们：(i)相对易于通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生而制备，(ii)顺从于与适于通过非-二硫化物连接体结合到抗体的官能团的衍生化，(iii)在血浆中稳定，和(iv)有效抵
抗许多种肿瘤细胞系(US 2005/0169933；WO 2005/037992：美国专利号5,208,020)。
抗许多种肿瘤细胞系(US 2005/0169933；WO 2005/037992：美国专利号5,208,020)。
[0181] 与其它药物部分一样，为本发明的化合物考虑了美登木素生物碱药物部分的所有立体异构体。
[0182] 免疫球蛋白药物结合物的药物部分还包括多拉司他汀和它们的肽类似物和衍生物——奥利斯汀(美国专利号5,635,483；5,780,588)。多拉司他汀和奥利斯汀已显示
干扰微管动力学、GTP水解和核分裂和细胞分裂(Woyke et al(2001)Antimicrob.Agents
and Chemother.45(12)：3580-3584)和具有抗癌症(美国专利号5,663,149)和抗真菌活
性(Pettit et al(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。各种形式的多
拉司他汀或奥利斯汀药物部分可通过肽药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端共价地连接
到抗体(WO 02/088172；Doronina et al(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784；
Francisco et al(2003) Blood 102(4)：1458-1465)。
干扰微管动力学、GTP水解和核分裂和细胞分裂(Woyke et al(2001)Antimicrob.Agents
and Chemother.45(12)：3580-3584)和具有抗癌症(美国专利号5,663,149)和抗真菌活
性(Pettit et al(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。各种形式的多
拉司他汀或奥利斯汀药物部分可通过肽药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端共价地连接
到抗体(WO 02/088172；Doronina et al(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784；
Francisco et al(2003) Blood 102(4)：1458-1465)。
[0183] 示例性的奥利斯汀实施方式包括N端连接的单甲基奥利斯汀药物部分DE和DF，公开在WO 2005/081711；Senter et al，Proceedings of the American Association for Cancer Research，Volume 45，Abstract Number 623，2004年3月28日出现，其中每个公
开以其全部通过引用被清楚地并入。
开以其全部通过引用被清楚地并入。
[0184] 通常，基于肽的药物部分可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键而制备。这样的肽键可例如，根据液相合成方法(参见E.Schroder and K.Luibke，″The
Peptids″，volume 1，pp 76-136，1965，Academic Press)被制备，该方法在肽化学领域是众所周知的。
Peptids″，volume 1，pp 76-136，1965，Academic Press)被制备，该方法在肽化学领域是众所周知的。
[0185] 药物部分包括加利车霉素、和其类似物和衍生物。抗生素的加利车霉素家族能在亚皮摩尔浓度引起双链DNA断裂。对于加利车霉素家族的结合物的制备，参见
美 国 专 利 号 5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701，5,770,710；
I I I
5,773,001；5,877,296。可利用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1、α2、α3、I I
N-acetyl-γ1、PSAG和θ1(Hinman et al Cancer Research 53：3336-3342(1993)，Lode et al Cancer Research 58：2925-2928(1998)。
美 国 专 利 号 5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701，5,770,710；
I I I
5,773,001；5,877,296。可利用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1、α2、α3、I I
N-acetyl-γ1、PSAG和θ1(Hinman et al Cancer Research 53：3336-3342(1993)，Lode et al Cancer Research 58：2925-2928(1998)。
[0186] 蛋白毒素包括，例如，白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A链(Vitetta et al(1987)
Science，238：1098)、相思豆毒素(abrin)A链、蒴莲根毒素A链、α-次黄嘌呤、油桐
(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋
白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)(WO 93/21232)。
Science，238：1098)、相思豆毒素(abrin)A链、蒴莲根毒素A链、α-次黄嘌呤、油桐
(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋
白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)(WO 93/21232)。
[0187] 治疗性放射性同位素包括，例如，2P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212 212
Bi、 Pb、和Lu的放射性同位素。
Bi、 Pb、和Lu的放射性同位素。
[0188] 放射性同位素或其它标记可以以已知方法被掺入到结合物中(Fraker etal(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57； ″ Monoclonal Antibodies
in Immunoscintigraphy ″Chatal，CRC Press 1989)。 碳14标 记 的1-异 硫 氰酸
酯基苯基(isothiocyanatobenzyl)-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(methyldiethylene
triaminepentaacetic acid)(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体结合的示例性的螯合剂
(WO 94/11026)。
in Immunoscintigraphy ″Chatal，CRC Press 1989)。 碳14标 记 的1-异 硫 氰酸
酯基苯基(isothiocyanatobenzyl)-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(methyldiethylene
triaminepentaacetic acid)(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体结合的示例性的螯合剂
(WO 94/11026)。
[0189] 连接体
[0190] 在本发明的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括具有至少两个活性位点的连接分子。一个活性位点连接到免疫球蛋白的置换的半胱氨酸残基，其它活性位点连接到原
子或分子。“连接体”是双功能或多功能部分，其可用于连接一个或多个药物部分和免疫球蛋白单元以形成免疫球蛋白结合物。利用具有结合到药物或其它分子和结合到免疫球蛋白
的反应功能性的连接体可方便地制备免疫球蛋白结合物。具有半胱氨酸置换的修饰的免
疫球蛋白的半胱氨酸巯基可与连接体试剂、药物部分或药物-连接体中间体的官能团形成
键。
子或分子。“连接体”是双功能或多功能部分，其可用于连接一个或多个药物部分和免疫球蛋白单元以形成免疫球蛋白结合物。利用具有结合到药物或其它分子和结合到免疫球蛋白
的反应功能性的连接体可方便地制备免疫球蛋白结合物。具有半胱氨酸置换的修饰的免
疫球蛋白的半胱氨酸巯基可与连接体试剂、药物部分或药物-连接体中间体的官能团形成
键。
[0191] 一方面，连接体具有活性位点，该活性位点具有与存在于抗体上的亲核半胱氨酸反应的亲电子基团。抗体的半胱氨酸巯基与连接体上的亲电子基团反应并与连接体形成共
价键。有用的亲电子基团包括，但不限于马来酰亚胺和卤乙酰胺(haloacetamide)基团。
价键。有用的亲电子基团包括，但不限于马来酰亚胺和卤乙酰胺(haloacetamide)基团。
[0192] 根据Klussman，et al(2004)，Bioconjugate Chemistry 15(4)：765-773的766页的结合方法，本发明的修饰的免疫球蛋白与连接体试剂或药物-连接体中间体反应，与亲电子的官能团如马来酰亚胺或α-卤素羰基反应。
[0193] 连接体可包括氨基酸残基。氨基酸单元，当存在时，连接免疫球蛋白与本发明的免疫球蛋白药物结合物的药物部分。
[0194] 氨基酸连接体可以是，例如，二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。包括氨基酸单元的氨基酸残基包括天然存在的那些氨基酸残基，以及次要氨基酸(minor amino acids)和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。
[0195] 氨基酸单元可被一种或多种酶——包括肿瘤相关的蛋白酶——酶促裂解，以释放药物部分。
[0196] 在另一个实施方式中，连接体可以是用于超过一个药物部分通过分枝的、多功能连接体部分与抗体共价结合的树枝型连接体(Sun et al(2002)Bioorganic & Medicinal
Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun et al(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry
11：1761-1768)。树枝连接体可增加药物与抗体的摩尔比，即负载，这与免疫球蛋白药物结合物的能力有关。因此，当修饰的免疫球蛋白只具有一个活性半胱氨酸巯基时，许多药物部分可通过树枝连接体结合。
Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun et al(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry
11：1761-1768)。树枝连接体可增加药物与抗体的摩尔比，即负载，这与免疫球蛋白药物结合物的能力有关。因此，当修饰的免疫球蛋白只具有一个活性半胱氨酸巯基时，许多药物部分可通过树枝连接体结合。
[0197] 在另一个实施方式中，连接体可被调节溶解度或反应性的基团置换。例如，依赖-
用于制备免疫球蛋白结合物的合成途径，带有电荷的取代基如磺酸盐(--SO3)或铵，可增
加试剂的水溶性和促进连接体试剂与免疫球蛋白或药物部分的偶联反应，或促进免疫球蛋
白-连接体中间体与药物部分、或药物-连接体中间体与免疫球蛋白的偶联反应。
用于制备免疫球蛋白结合物的合成途径，带有电荷的取代基如磺酸盐(--SO3)或铵，可增
加试剂的水溶性和促进连接体试剂与免疫球蛋白或药物部分的偶联反应，或促进免疫球蛋
白-连接体中间体与药物部分、或药物-连接体中间体与免疫球蛋白的偶联反应。
[0198] 本发明的化合物清楚地考虑，但不限于用以下连接体试剂制备的免疫球蛋白结合物：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC、和硫代-SMPB、
和SVSB(琥珀酰亚胺-(4-乙烯砜)苯甲酸盐)，并包括双马来酰亚胺试剂：DTME、BMB、
BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)3和BM(PEO)4，它们商业上可购自Pierce Biotechnology，
Inc.，Customer Service Department，P.O.Box 117，Rockford，Ill.61105 U.S.A，U.S.A
1-800-874-3723，International +815-968-0747。参见2003-2004 Applications Handbook and Catalog第467-498页。双马来酰亚胺试剂允许半胱氨酸的巯基以相继或同时发生
的方式与含有巯基的药物部分、标记或连接体中间体结合。除马来酰亚胺外的其它官能
团——其与半胱氨酸的巯基、药物部分、标记或连接体中间体反应——没有限制地包括碘
乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸盐和异硫氰酸盐。
和SVSB(琥珀酰亚胺-(4-乙烯砜)苯甲酸盐)，并包括双马来酰亚胺试剂：DTME、BMB、
BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)3和BM(PEO)4，它们商业上可购自Pierce Biotechnology，
Inc.，Customer Service Department，P.O.Box 117，Rockford，Ill.61105 U.S.A，U.S.A
1-800-874-3723，International +815-968-0747。参见2003-2004 Applications Handbook and Catalog第467-498页。双马来酰亚胺试剂允许半胱氨酸的巯基以相继或同时发生
的方式与含有巯基的药物部分、标记或连接体中间体结合。除马来酰亚胺外的其它官能
团——其与半胱氨酸的巯基、药物部分、标记或连接体中间体反应——没有限制地包括碘
乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸盐和异硫氰酸盐。
[0199] 因此本发明的目的是提供免疫球蛋白结合物，其包括在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)、25(VH)、125(CH1)、248(CH2)、254(CH2)、286(CH2)、298(CH2)和326(CH2)的残基处具有至少一个突变的免疫球蛋白，其中至少一个突变是用半胱氨酸残基和原子或分子的置换，
其中原子或分子结合到半胱氨酸残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自7(VH)、
20(VL)、22(VL)和125(CH1)处的残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自248(CH2)和326(CH2)处的残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自25(VH)和286(CH2)处的
残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自254(CH2)和298(VH)处的残基。在可与
前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可与
前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与前述实施方式组合的
某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方
式中，免疫球蛋白结合物包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球
蛋白结合物包括人VH结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结
合物包括人VL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物进
一步包括具有至少两个活性位点的连接分子，其中第一个活性位点结合到免疫球蛋白的半
胱氨酸残基，第二个活性位点结合到原子或分子。在与前述具有连接分子的实施方式组合
的某些实施方式中，连接分子选自腙、二硫化物、肽、螯合剂和马来酰亚胺。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，原子或分子选自放射性核素、化学治疗剂、微生物毒素、植物毒素、聚合物、碳水化合物、细胞因子、荧光标记、发光标记、酶-底物标记、酶、肽、肽模拟物、核苷酸、siRNA、微小RNA、RNA模拟物和适配体。在可与前述实施方式组合的某些实施方
90 131 67 177 213 211
式中，原子或分子选自 Y、 I、Cu、Lu、 Bi、At、加利车霉素、倍癌霉素、美登木素生物碱、奥利斯汀、蒽环类化合物、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、篦麻毒素、聚乙二醇、羟乙基淀粉和甘露糖基残基。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，原子或分子降低未突变
免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，原子或分子增加未
突变免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结
合物进一步包括抗原结合活性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80％、
至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。
其中原子或分子结合到半胱氨酸残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自7(VH)、
20(VL)、22(VL)和125(CH1)处的残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自248(CH2)和326(CH2)处的残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自25(VH)和286(CH2)处的
残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自254(CH2)和298(VH)处的残基。在可与
前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可与
前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与前述实施方式组合的
某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方
式中，免疫球蛋白结合物包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球
蛋白结合物包括人VH结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结
合物包括人VL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物进
一步包括具有至少两个活性位点的连接分子，其中第一个活性位点结合到免疫球蛋白的半
胱氨酸残基，第二个活性位点结合到原子或分子。在与前述具有连接分子的实施方式组合
的某些实施方式中，连接分子选自腙、二硫化物、肽、螯合剂和马来酰亚胺。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，原子或分子选自放射性核素、化学治疗剂、微生物毒素、植物毒素、聚合物、碳水化合物、细胞因子、荧光标记、发光标记、酶-底物标记、酶、肽、肽模拟物、核苷酸、siRNA、微小RNA、RNA模拟物和适配体。在可与前述实施方式组合的某些实施方
90 131 67 177 213 211
式中，原子或分子选自 Y、 I、Cu、Lu、 Bi、At、加利车霉素、倍癌霉素、美登木素生物碱、奥利斯汀、蒽环类化合物、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、篦麻毒素、聚乙二醇、羟乙基淀粉和甘露糖基残基。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，原子或分子降低未突变
免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，原子或分子增加未
突变免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结
合物进一步包括抗原结合活性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80％、
至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。
[0200] 因此本发明的目的是提供修饰或分离的免疫球蛋白，其包括在选自7(VH)、20(VL)、22(VL)、25(VH)、125(CH1)、248(CH2)、254(CH2)、286(CH2)和326(CH2)残基处的至少一个突变，其中至少一个突变是用半胱氨酸残基的置换。在某些实施方式中，至少一个突变是在选
自7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)处的残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自248(CH2)和326(CH2)处的残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自25(VH)和
286(CH2)处的残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在残基254(CH2)处。在可与前述
实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可与前述
实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与前述实施方式组合的某些
实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些
实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人VH结构域。在可与前述实施方式组合的某些
实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人VL结构域。在可与前述实施方式组合的某些
实施方式中，免疫球蛋白进一步包括抗原结合活性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结
合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。
自7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)处的残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自248(CH2)和326(CH2)处的残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在选自25(VH)和
286(CH2)处的残基。在某些实施方式中，至少一个突变是在残基254(CH2)处。在可与前述
实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可与前述
实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与前述实施方式组合的某些
实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些
实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人VH结构域。在可与前述实施方式组合的某些
实施方式中，修饰或分离的免疫球蛋白包括人VL结构域。在可与前述实施方式组合的某些
实施方式中，免疫球蛋白进一步包括抗原结合活性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结
合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。
[0201] 免疫球蛋白药物结合物的制备
[0202] 一方面，本发明包括生产免疫球蛋白结合物的方法。利用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂，免疫球蛋白药物结合物可通过几个途径制备，包括：(1)修饰的免疫球蛋白的半胱氨酸基团与连接体试剂反应，以通过共价键形成免疫球蛋白-连接体
中间体，之后与活化的药物部分反应；和(2)药物部分的亲核基团与连接体试剂反应，以通过共价键形成药物-连接体中间体，之后与修饰的免疫球蛋白的半胱氨酸基团反应。结合
方法(1)和(2)可利用多种修饰的免疫球蛋白、药物部分和连接体以制备本发明的免疫球
蛋白药物结合物。
中间体，之后与活化的药物部分反应；和(2)药物部分的亲核基团与连接体试剂反应，以通过共价键形成药物-连接体中间体，之后与修饰的免疫球蛋白的半胱氨酸基团反应。结合
方法(1)和(2)可利用多种修饰的免疫球蛋白、药物部分和连接体以制备本发明的免疫球
蛋白药物结合物。
[0203] 抗体半胱氨酸巯基是亲核的并能与连接体试剂和药物-连接体中间体上的亲电子基团反应以形成共价键，连接体试剂和药物-连接体中间体包括：(i)活性酯如NHS酯、
HOBt酯、卤甲酸盐(haloformates)和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物，如卤乙酰胺
(haloacetamides)；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团；和(iv)通过硫化物交换的二硫化物，包括吡啶基二硫化物。药物部分上的亲核基团包括，但不限于：能与连接体部分和连接体试剂上的亲电子基团反应以形成共价键的胺、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、氨硫脲、肼羧化物和芳酰肼基(arylhydrazide groups)。
HOBt酯、卤甲酸盐(haloformates)和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物，如卤乙酰胺
(haloacetamides)；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团；和(iv)通过硫化物交换的二硫化物，包括吡啶基二硫化物。药物部分上的亲核基团包括，但不限于：能与连接体部分和连接体试剂上的亲电子基团反应以形成共价键的胺、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、氨硫脲、肼羧化物和芳酰肼基(arylhydrazide groups)。
[0204] 美坦辛可以，例如转化为May-SSCH3，其可被还原为游离的巯基May-SH，并与修饰的抗体反应(Chari et al(1992)Cancer Research 52：127-131)以产生具有二硫化物连接体的美登木素生物碱-抗体免疫结合物。具有二硫化物连接体的抗体-美登木素生物碱结
合物已被报道(WO 04/016801；美国专利号6,884,874；US2004/039176A1；WO 03/068144；
US 2004/001838A1；美国专利号6,441,163、5,208,020、5,416,064；WO 01/024763)。二硫化物连接体SPP由连接体试剂N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶基硫代(pyridylthio))戊酸酯构
成。
合物已被报道(WO 04/016801；美国专利号6,884,874；US2004/039176A1；WO 03/068144；
US 2004/001838A1；美国专利号6,441,163、5,208,020、5,416,064；WO 01/024763)。二硫化物连接体SPP由连接体试剂N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶基硫代(pyridylthio))戊酸酯构
成。
[0205] 在某些条件下，通过用还原剂如DTT(Cleland′s试剂、二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦氢氯化物；Getz et al(1999)Anal.Biochem.Vol 273：73-80；Soltec
Ventures，Beverly，Mass.)或本领域技术人员已知的其它还原剂处理，可以使修饰的免疫球蛋白有活性，用于与连接体试剂结合。
Ventures，Beverly，Mass.)或本领域技术人员已知的其它还原剂处理，可以使修饰的免疫球蛋白有活性，用于与连接体试剂结合。
[0206] 因此本发明的目的是提供生产免疫球蛋白结合物的方法，通过如下步骤进行：提供如段落[0008]或[0019]和它们的实施方式的任意和所有组合中所讨论的修饰或分离的
免疫球蛋白，用还原剂还原一个或多个置换的半胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基的
方法，和温育免疫球蛋白和原子或分子，其中所述原子或分子与还原的半胱氨酸残基反应
以形成免疫球蛋白结合物。
免疫球蛋白，用还原剂还原一个或多个置换的半胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基的
方法，和温育免疫球蛋白和原子或分子，其中所述原子或分子与还原的半胱氨酸残基反应
以形成免疫球蛋白结合物。
[0207] 空间聚集倾向
[0208] 一方面，本文的发明涉及选择蛋白质表面上的残基以突变为半胱氨酸的方法和降低修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白结合物的交联的方法。本发明可用于产生具有降低的交
联倾向的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物，即，浓缩的溶液中的免疫球蛋白或免疫球蛋白
结合物保持基本上单体形式而不是较高有序聚集的多聚体。本文的方法代表了评价蛋白质
交联倾向的计算方法的能力进步。特别地，这些方法至少部分基于SAA(溶剂可及面积)的
计算，其在本领域已知用于表征蛋白质的表面。SAA给出与溶剂接触的每个氨基酸或蛋白质结构的表面积。当探针球在蛋白质表面，即蛋白结构模型的表面上翻滚时，可典型地通过计算探针球体的中心轨迹计算SAA。探针球体具有与水分子相同的半径， ″′下面描
述的计算SAA的可选方法是本领域已知的并与本文描述的方法一致。尽管SAA对表征蛋白
质的表面非常有用，但是由于下面的缺点，发现它不足以表征蛋白质表面上潜在的易聚集
的疏水碎片(patch)，
联倾向的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物，即，浓缩的溶液中的免疫球蛋白或免疫球蛋白
结合物保持基本上单体形式而不是较高有序聚集的多聚体。本文的方法代表了评价蛋白质
交联倾向的计算方法的能力进步。特别地，这些方法至少部分基于SAA(溶剂可及面积)的
计算，其在本领域已知用于表征蛋白质的表面。SAA给出与溶剂接触的每个氨基酸或蛋白质结构的表面积。当探针球在蛋白质表面，即蛋白结构模型的表面上翻滚时，可典型地通过计算探针球体的中心轨迹计算SAA。探针球体具有与水分子相同的半径， ″′下面描
述的计算SAA的可选方法是本领域已知的并与本文描述的方法一致。尽管SAA对表征蛋白
质的表面非常有用，但是由于下面的缺点，发现它不足以表征蛋白质表面上潜在的易聚集
的疏水碎片(patch)，
[0209] 1.SAA不区分疏水和亲水区域
[0210] 2.SAA与残基的疏水性不成正比(例如，MET具有较LEU更多的表面面积，但是较不疏水)
[0211] 3.SAA没有表明几个疏水残基是否是邻近的，并因此能增强某一区域的疏水性。这些残基在一级序列或三级结构——即使它们在一级序列上很远——可为邻近的。不管怎样，它们能增强抗体表面上某一碎片的疏水性。
[0212] 通过根据下面的公式计算暴露的氨基酸部分的疏水性产生本文描述的一个度量——有效SAA：
[0213]
[0214] 有效SAA的另外实施方式进一步包括合计在一级蛋白质序列中相邻的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个(例如，二个、三个、四个、五个、六个等)氨基酸残基的有效SAA。尽管有效SAA代表超过基本SAA的提高，但是它还是缺乏完全地说明折叠
的蛋白质结构和说明在蛋白质序列中不相邻的氨基酸可以是在蛋白质折叠的二级、三级或
四级结构中互相靠近的事实的能力。这样的蛋白质折叠可形成易聚集区域，其不仅仅出现
在一级结构中，或只可通过更强大地分析折叠的蛋白质结构而被检测。
的蛋白质结构和说明在蛋白质序列中不相邻的氨基酸可以是在蛋白质折叠的二级、三级或
四级结构中互相靠近的事实的能力。这样的蛋白质折叠可形成易聚集区域，其不仅仅出现
在一级结构中，或只可通过更强大地分析折叠的蛋白质结构而被检测。
[0215] 本发明提供新的、更先进的称作空间聚集倾向的度量，其将突出蛋白质表面上的某一碎片或区域的有效疏水性。针对在蛋白结构模型的原子上或附近的限定的空间区域计
算空间聚集倾向。
算空间聚集倾向。
[0216] 在该语境中，“限定的空间区域”是选择的用以在蛋白质结构上或附近捕获局部物理结构和/或化学环境的三维空间或体积。在特别优选的实施方式中，针对具有以蛋白质中的原子(例如蛋白结构模型中的原子)为中心的半径R的球形区域计算空间聚集倾向。
还可针对具有以化学键为中心或定位在接近结构模型的空间中的半径R的球形区域计算
空间聚集倾向。相应地，在另一实施方式中，可针对集中在原子附近，例如集中在空间上距特定原子或化学键的中心 之间，更优选地 之间，更优选地 之间的点上的限定
的空间区域计算SAP。
还可针对具有以化学键为中心或定位在接近结构模型的空间中的半径R的球形区域计算
空间聚集倾向。相应地，在另一实施方式中，可针对集中在原子附近，例如集中在空间上距特定原子或化学键的中心 之间，更优选地 之间，更优选地 之间的点上的限定
的空间区域计算SAP。
[0217] 在某些实施方式中，选择的半径R在 至 之间。在特定的实施方式中，选择的半径是至少 至少 至少 至少 至少 至少 至少 至少 至少 至少
至少 至少 至少 至少 或至少 在某些实施方式中，选择的半径在
至 之间，在 至 之间，或在 至 之间。在特定的实施方式中，选择的半径是
或
至少 至少 至少 至少 或至少 在某些实施方式中，选择的半径在
至 之间，在 至 之间，或在 至 之间。在特定的实施方式中，选择的半径是
或
[0218] 在其他的实施方式中，计算空间聚集倾向的区域不是球形的。该区域的可能的形状可进一步包括立方体、圆柱体、圆锥体、椭圆的球状体、锥体、半球或可用于封闭空间部分的任何其它形状。在这样的实施方式中，可使用除了半径外的量度，例如从形状的中心到面或顶点的距离选择区域的大小。
[0219] 在某个实施方式中，可使用SAP选择蛋白质尤其抗体或免疫球蛋白中的残基，其可被半胱氨酸置换，而不增加蛋白质交联的倾向。本发明期望使识别可被半胱氨酸置换的
残基而不增加蛋白质交联倾向的过程流线化。
残基而不增加蛋白质交联倾向的过程流线化。
[0220] 因此，一般地说，针对蛋白质中的特定原子计算空间聚集倾向的方法包括(a)识别代表该蛋白质的结构模型中的一个或多个原子，其中一个或多个原子位于以特定原子
为中心或其附近的限定空间区域内；(b)针对限定空间区域中的一个或多个原子中的每一
个，计算原子的溶剂可及面积(SAA)与完全暴露的同一残基中原子的SAA的比；(c)用一个
或多个原子的原子疏水性乘以每个比；和(d)合计步骤(c)的乘积；借此该和是针对特定
原子的SAP。
为中心或其附近的限定空间区域内；(b)针对限定空间区域中的一个或多个原子中的每一
个，计算原子的溶剂可及面积(SAA)与完全暴露的同一残基中原子的SAA的比；(c)用一个
或多个原子的原子疏水性乘以每个比；和(d)合计步骤(c)的乘积；借此该和是针对特定
原子的SAP。
[0221] 在相关的实施方式中，可根据不同的方法计算SAP，所述方法包括(a)识别代表蛋白质的结构模型中的一个或多个氨基酸残基，其中一个或多个氨基酸残基具有以特定原子
为中心或其附近的限定空间区域内的至少一个原子；(b)针对识别的一个或多个氨基酸残
基中的每一个，计算氨基酸中原子的溶剂可及面积(SAA)与完全暴露的同一残基中原子的
SAA的比；(c)用如通过氨基酸疏水性标度(scale)所测定的一个或多个氨基酸残基的疏水
性乘以每个比；和(d)对步骤(c)的乘积求和；借此该和是特定原子的SAP。在优选的实施
方式中，在步骤(a)之前通过允许结构模型与分子动力学模拟中的溶剂相互作用来处理结
构模型。当氨基酸被识别为具有限定的空间区域内的至少一个原子时，可能需要至少一个
原子专有地是氨基酸侧链中的原子。可选地，它可以是需要成为主链原子的原子。
为中心或其附近的限定空间区域内的至少一个原子；(b)针对识别的一个或多个氨基酸残
基中的每一个，计算氨基酸中原子的溶剂可及面积(SAA)与完全暴露的同一残基中原子的
SAA的比；(c)用如通过氨基酸疏水性标度(scale)所测定的一个或多个氨基酸残基的疏水
性乘以每个比；和(d)对步骤(c)的乘积求和；借此该和是特定原子的SAP。在优选的实施
方式中，在步骤(a)之前通过允许结构模型与分子动力学模拟中的溶剂相互作用来处理结
构模型。当氨基酸被识别为具有限定的空间区域内的至少一个原子时，可能需要至少一个
原子专有地是氨基酸侧链中的原子。可选地，它可以是需要成为主链原子的原子。
[0222] 在其它实施方式中，该方法可进一步包括任选地在步骤(a)之前进行分子动力学模拟和重复步骤(a)-(d)，每次在许多时间步骤进行进一步的分子动力学模拟，由此产生
多个如步骤(d)中的和，和计算这些和的平均数；借此该计算的平均数是针对特定原子的
SAP。
多个如步骤(d)中的和，和计算这些和的平均数；借此该计算的平均数是针对特定原子的
SAP。
[0223] 本领域的技术人员将理解，使用经分子动力学模拟计算的值的平均数的本发明实施方式将是计算上更强化的。这样的实施方式在某些情况下也将提供空间聚集倾向的更精
确或高度分辨的图。然而，本文讨论的实验已显示，当不使用分子动力学平均技术时，该方法仍然是高度准确的。在一种优选的实施方式中，可针对数据库例如蛋白质数据库(PDB)
中的所有蛋白质结构计算空间聚集倾向值，由此很快识别所有已知蛋白质结构上的疏水残
基和碎片。该方法允许大批蛋白质的快速筛选以识别潜在的易聚集区域和/或蛋白质相互
作用位点。
确或高度分辨的图。然而，本文讨论的实验已显示，当不使用分子动力学平均技术时，该方法仍然是高度准确的。在一种优选的实施方式中，可针对数据库例如蛋白质数据库(PDB)
中的所有蛋白质结构计算空间聚集倾向值，由此很快识别所有已知蛋白质结构上的疏水残
基和碎片。该方法允许大批蛋白质的快速筛选以识别潜在的易聚集区域和/或蛋白质相互
作用位点。
[0224] 在优选的应用中，空间聚集倾向被描述
[0225] 通过下面的公式：
[0226] SAP原子＝∑模拟平均值(∑原子的R内的原子((SAA-R/SAA-fe)*原子-hb)
[0227] 其中：
[0228] 1)SAA-R是在每个模拟快照(snapshot)上计算的半径R内侧链原子的SAA。优选地通过计算当在蛋白质表面上翻滚时探针球体中心的轨迹而在模拟模型中计算SAA。探针
球体具有与水分子相同的半径， 本领域的技术人员将理解，计算SAA的其它方法将
与这里描述的计算SAP的方法相一致。例如，可只在氨基酸侧链原子上计算SAA。也可只在
氨基酸主链原子(即肽主链的那些原子和结合的氢)上计算SAA。可选地，可只在氨基酸主
链原子上计算SAA，排除结合的氢；
球体具有与水分子相同的半径， 本领域的技术人员将理解，计算SAA的其它方法将
与这里描述的计算SAP的方法相一致。例如，可只在氨基酸侧链原子上计算SAA。也可只在
氨基酸主链原子(即肽主链的那些原子和结合的氢)上计算SAA。可选地，可只在氨基酸主
链原子上计算SAA，排除结合的氢；
[0229] 2)SAA-fe是在优选的实施方式中，通过计算完全伸展的三肽‘Ala-X-Ala’构象中中间残基的侧链SAA，获得的完全暴露的残基(说的是氨基酸‘X’)的侧链SAA；和
[0230] 3)原 子-hb 是 如 上 所 述 使 用 Black和 Mould(Black and Mould，Anal.Biochem.1991，193，72-82)的疏水性标度获得的原子疏水性。该标度被标准化以使甘氨酸疏水性为零。因此，在疏水性标度上，疏水性比甘氨酸大的氨基酸为正并且疏水性比甘氨酸小的氨基酸为负。
[0231] “完全暴露的”残基是三肽Ala-X-Ala完全伸展构象中的残基X。本领域的技术人员将理解，该排列被设计以至于在这样的残基X上的SAA的计算将产生可利用的最大溶剂
可及面积。相应地，考虑可在计算中使用除丙氨酸外的其它残基而不完全破坏或改变结果。
可及面积。相应地，考虑可在计算中使用除丙氨酸外的其它残基而不完全破坏或改变结果。
[0232] 如上所述，可将本发明的方法应用于任何蛋白结构模型，其包括利用上述相同公式的X射线结构。
[0233] 相似地，如果得不到X射线结构，可将相同的空间聚集倾向参数应用到通过同源建模产生的结构，并且SAP参数可利用上述相同公式计算。
[0234] 在某些实施方式中，对蛋白结构模型中的所有原子计算空间聚集倾向。在一些实施方式中，可对每个单个蛋白质残基或一小组残基进行原子空间聚集倾向值平均化。
[0235] SAP方法的用途
[0236] 一方面，本发明可如上面所描述的用于识别蛋白质中疏水的氨基酸残基、区域或碎片。不想要保持于特定的阈值，认为具有空间聚集倾向＞0的原子或氨基酸残基是疏水
的或位于易聚集区域中。根据蛋白质的类型、特定的结构和其存在的溶剂，可期望使用稍微低于零的截止值，例如通过选择具有大于-0.1、-0.15、-0.2等的空间聚集倾向的原子或残基，识别原子或残基。可选地，为了选择最强的疏水性原子、残基或碎片，可期望使用更严格的截止值，例如0、0.05、0.1、0.15、0.2等。此外，因为算法将更高的数给予碎片中心处的残基，因此满足截止值的残基的3A、4A、5A、7.5A或10A内的残基也可被选择用于突变成更小疏水性的残基以降低聚集。在另一个实施方式中，仅仅选择具有大于连续地(即沿着蛋白
质序列)或在优选实施方式中，空间上(即在三维结构中)在附近的原子或残基的空间聚
集倾向的原子或残基可能是有利的。选择疏水碎片中的原子或残基的一个优选的方法是
将计算的空间聚集倾向值，例如使用彩色编码或数字编码，绘制到它们所衍生的蛋白结构
模型上，因此使在蛋白质表面的空间聚集倾向中的差别可视化，并因此允许疏水碎片或残
基容易选择。在特别优选的实施方式中，使用选择用于半径的两个值分开进行空间聚集倾
向的计算，这两个值一个具有较高的分辨率，例如5A，一个具有较低的分辨率，例如10A。在这样的实施方式中，可在具有较低分辨率图的蛋白质结构上看到较大或较宽的疏水碎片。
一旦在低分辨率图上选择感兴趣的疏水碎片，可在较高分辨率的图中更详细地观察那些碎
片，这可在一些实施方式中允许本领域的技术人员更容易地或更准确地选择残基以突变或
修饰。例如，当在较高分辨率的图中观察疏水碎片时，可期望为突变选择具有最高SAP得分的残基或是最疏水的残基(例如根据Black和Mould，Anal.Biochem.1991，193，72-82的标
度，碎片中最疏水的残基)。
的或位于易聚集区域中。根据蛋白质的类型、特定的结构和其存在的溶剂，可期望使用稍微低于零的截止值，例如通过选择具有大于-0.1、-0.15、-0.2等的空间聚集倾向的原子或残基，识别原子或残基。可选地，为了选择最强的疏水性原子、残基或碎片，可期望使用更严格的截止值，例如0、0.05、0.1、0.15、0.2等。此外，因为算法将更高的数给予碎片中心处的残基，因此满足截止值的残基的3A、4A、5A、7.5A或10A内的残基也可被选择用于突变成更小疏水性的残基以降低聚集。在另一个实施方式中，仅仅选择具有大于连续地(即沿着蛋白
质序列)或在优选实施方式中，空间上(即在三维结构中)在附近的原子或残基的空间聚
集倾向的原子或残基可能是有利的。选择疏水碎片中的原子或残基的一个优选的方法是
将计算的空间聚集倾向值，例如使用彩色编码或数字编码，绘制到它们所衍生的蛋白结构
模型上，因此使在蛋白质表面的空间聚集倾向中的差别可视化，并因此允许疏水碎片或残
基容易选择。在特别优选的实施方式中，使用选择用于半径的两个值分开进行空间聚集倾
向的计算，这两个值一个具有较高的分辨率，例如5A，一个具有较低的分辨率，例如10A。在这样的实施方式中，可在具有较低分辨率图的蛋白质结构上看到较大或较宽的疏水碎片。
一旦在低分辨率图上选择感兴趣的疏水碎片，可在较高分辨率的图中更详细地观察那些碎
片，这可在一些实施方式中允许本领域的技术人员更容易地或更准确地选择残基以突变或
修饰。例如，当在较高分辨率的图中观察疏水碎片时，可期望为突变选择具有最高SAP得分的残基或是最疏水的残基(例如根据Black和Mould，Anal.Biochem.1991，193，72-82的标
度，碎片中最疏水的残基)。
[0237] 在具体的实施方式中，识别蛋白上的易聚集区域的方法包括：(a)将如根据本文描述的方法中的任何一个所计算的针对蛋白质中原子的SAP绘制到结构模型上；和(b)识
别具有SAP＞0的许多原子的蛋白质内的区域；其中易聚集区域包括：包含所述许多原子
的氨基酸。在这样的实施方式中，可针对蛋白质中的所有原子或部分原子计算SAP。考虑一个人可只针对感兴趣的特定残基或许多组残基计算SAP。
别具有SAP＞0的许多原子的蛋白质内的区域；其中易聚集区域包括：包含所述许多原子
的氨基酸。在这样的实施方式中，可针对蛋白质中的所有原子或部分原子计算SAP。考虑一个人可只针对感兴趣的特定残基或许多组残基计算SAP。
[0238] 在相似的实施方式中，绘制原子的SAP得分(或者在氨基酸残基上进行平均的SAP得分)可能是有教益的。这种显示沿着蛋白质的原子或残基的SAP得分的绘图允许峰容易
识别，这可表明用于代替的候选物。在特别优选的实施方式中，将沿着蛋白质中的原子或残基的SAP得分绘制在曲线图中，针对图中的峰计算曲线下面积(AUC)。在这样的实施方式
中，具有较大AUC的峰代表较大或较疏水的易聚集区域。在特定的实施方式中，将期望选择用于替代的一个或多个残基，该残基被识别为存在于峰中，或更优选地在具有大AUC的峰
中。
识别，这可表明用于代替的候选物。在特别优选的实施方式中，将沿着蛋白质中的原子或残基的SAP得分绘制在曲线图中，针对图中的峰计算曲线下面积(AUC)。在这样的实施方式
中，具有较大AUC的峰代表较大或较疏水的易聚集区域。在特定的实施方式中，将期望选择用于替代的一个或多个残基，该残基被识别为存在于峰中，或更优选地在具有大AUC的峰
中。
[0239] 在特定的实施方式中，本发明可用于选择用于突变为半胱氨酸的免疫球蛋白的残基。如本文所用，计算免疫球蛋白表面上第一氨基酸残基的SAP值。如果SAP值是等于0
和-0.11的值或位于0和-0.11的值之间，那么选择第一氨基酸残基用于突变为半胱氨酸。
在另外的实施方式中，计算第一残基的临近区域内免疫球蛋白的多个残基的SAP值。如果
多个残基具有小于0的SAP值，那么选择第一残基用于突变为半胱氨酸。
和-0.11的值或位于0和-0.11的值之间，那么选择第一氨基酸残基用于突变为半胱氨酸。
在另外的实施方式中，计算第一残基的临近区域内免疫球蛋白的多个残基的SAP值。如果
多个残基具有小于0的SAP值，那么选择第一残基用于突变为半胱氨酸。
[0240] 免疫球蛋白变体可通过本领域已知的任何方法制备，包括位点定向诱变和其它的重组DNA技术，例如参见美国专利号5284760；5556747；5789166；6878531；5932419和
6391548。
6391548。
[0241] 在特定的实施方式中，本发明可用于制备可结合到原子或分子的免疫球蛋白变体，这是通过用可用于将免疫球蛋白结合到原子或分子的天然氨基酸残基、修饰的氨基酸
残基、稀有的氨基酸残基、非天然氨基酸残基或氨基酸类似物或衍生物替代通过本文描述
的方法中的任何一个识别的免疫球蛋白表面上暴露的至少一个氨基酸残基进行的。在优选
的实施方式中，用半胱氨酸替代免疫球蛋白表面上暴露的氨基酸残基。在其它实施方式中，用赖氨酸、天冬氨酸或吡咯赖氨酸(pyrorlysine)替代氨基酸残基。
残基、稀有的氨基酸残基、非天然氨基酸残基或氨基酸类似物或衍生物替代通过本文描述
的方法中的任何一个识别的免疫球蛋白表面上暴露的至少一个氨基酸残基进行的。在优选
的实施方式中，用半胱氨酸替代免疫球蛋白表面上暴露的氨基酸残基。在其它实施方式中，用赖氨酸、天冬氨酸或吡咯赖氨酸(pyrorlysine)替代氨基酸残基。
[0242] 非天然氨基酸的合成是本领域技术人员已知的，并进一步在，例如美国专利公布号2003-0082575中被描述。一般而言，可使用将非天然的、修饰的或稀有的氨基酸合成
或掺入进蛋白质的本领域已知的任何方法，包括但并不限于出版物Liao J.Biotechnol
Prog.2007 Jan-Feb；23(1)：28-31；Rajesh，and Iqbal.Curr Pharm Biotechnol.2006
Aug；7(4)：247-59；Cardillo et al.Mini Rev Med Chem.2006Mar；6(3)：293-304；Wang et al.Annu Rev Biophys Biomol Struct.2006；35：225-49；Chakraborty et al.，and Glycoconj J.2005 Mar；22(3)：83-93中描述或引用的那些方法。作为进一步的例子，可使用Ambrx ReCODETM技术如本文描述的方法所示将非天然氨基酸或稀有氨基酸形成和掺入
到蛋白质中。
或掺入进蛋白质的本领域已知的任何方法，包括但并不限于出版物Liao J.Biotechnol
Prog.2007 Jan-Feb；23(1)：28-31；Rajesh，and Iqbal.Curr Pharm Biotechnol.2006
Aug；7(4)：247-59；Cardillo et al.Mini Rev Med Chem.2006Mar；6(3)：293-304；Wang et al.Annu Rev Biophys Biomol Struct.2006；35：225-49；Chakraborty et al.，and Glycoconj J.2005 Mar；22(3)：83-93中描述或引用的那些方法。作为进一步的例子，可使用Ambrx ReCODETM技术如本文描述的方法所示将非天然氨基酸或稀有氨基酸形成和掺入
到蛋白质中。
[0243] 根据本发明的免疫球蛋白变体和免疫球蛋白结合物能显示，例如，如通过非还原SDS-PAGE所测定的提高的或改进的稳定性。
[0244] 因此本发明的目的是提供分离的或重组的多核苷酸，其编码如在段落[0008]和
[0009]以及他们的实施方式的任意和所有组合中所讨论的修饰免疫球蛋白。在某些实施方式中，多核苷酸在载体中。在某些实施方式中，载体是表达载体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，诱导型启动子可操作地连接到多核苷酸上。另一方面包括具有前述实
施方式中任何一种的载体的宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞能表达通过多核苷酸
编码的免疫球蛋白。
施方式中任何一种的载体的宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞能表达通过多核苷酸
编码的免疫球蛋白。
[0245] 因此本发明的目的是提供产生具有降低的交联倾向的免疫球蛋白的方法，所述方法包括提供包含前述段落的宿主细胞的培养基和将该培养基置于免疫球蛋白被表达的条
件下。在某些实施方式中，方法包括分离表达的免疫球蛋白的另外步骤。
件下。在某些实施方式中，方法包括分离表达的免疫球蛋白的另外步骤。
[0246] 因此本发明的目的是提供选择用于突变为半胱氨酸的免疫球蛋白的残基的方法，包括计算免疫球蛋白表面上的第一氨基酸残基的空间聚集倾向，计算第一残基紧邻区域
内免疫球蛋白的多个残基的空间聚集倾向，和如果第一氨基酸残基的空间聚集倾向等于0
和-0.11的值或位于0和-0.11的值之间，和如果多个残基具有小于0的空间聚集倾向，选
择第一氨基酸残基以突变为半胱氨酸。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。
在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。在某些实施方式中，多个残基在第一残
基的 内。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。在可与前述实施方式组合
的某些实施方式中，计算残基的空间聚集倾向包括针对具有以残基中的原子为中心的半径
的球形区域计算空间聚集倾向。在某些实施方式中，球形区域的半径为至少
内免疫球蛋白的多个残基的空间聚集倾向，和如果第一氨基酸残基的空间聚集倾向等于0
和-0.11的值或位于0和-0.11的值之间，和如果多个残基具有小于0的空间聚集倾向，选
择第一氨基酸残基以突变为半胱氨酸。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。
在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。在某些实施方式中，多个残基在第一残
基的 内。在某些实施方式中，多个残基在第一残基的 内。在可与前述实施方式组合
的某些实施方式中，计算残基的空间聚集倾向包括针对具有以残基中的原子为中心的半径
的球形区域计算空间聚集倾向。在某些实施方式中，球形区域的半径为至少
[0247] 在一些实施方式中，本发明进一步涉及用于根据本发明方法测定SAP的计算机编码。在其它的实施方式中，本发明涉及致力于执行本发明的方法的计算机、超级计算机或计算机集群。在另一个方面，本发明提供用于选择突变为半胱氨酸的蛋白质残基的基于网络
的、基于服务器的或基于互联网的服务，该服务包括接收来自用户(例如通过互联网)的关
于蛋白质(例如蛋白结构模型)的数据或从数据库检索这样的数据，这样服务提供者能产
生、检索或存取蛋白质的静态结构，任选地包括蛋白质的分子动力学建模以提供蛋白质的
动态结构，基于这样产生的静态或动态结构测定针对蛋白质的原子或残基的SAP，和将SAP
数据，例如，作为服务供给者用所述SAP数据绘制的结构模型，返回给用户。在一些实施方式中，用户是人。在其它的实施方式中，用户是计算机系统或自动化的计算机算法。
的、基于服务器的或基于互联网的服务，该服务包括接收来自用户(例如通过互联网)的关
于蛋白质(例如蛋白结构模型)的数据或从数据库检索这样的数据，这样服务提供者能产
生、检索或存取蛋白质的静态结构，任选地包括蛋白质的分子动力学建模以提供蛋白质的
动态结构，基于这样产生的静态或动态结构测定针对蛋白质的原子或残基的SAP，和将SAP
数据，例如，作为服务供给者用所述SAP数据绘制的结构模型，返回给用户。在一些实施方式中，用户是人。在其它的实施方式中，用户是计算机系统或自动化的计算机算法。
[0248] 在一些实施方式中，本发明提供SAP计算系统，包括：用于将用于计算SAP的网络服务通过互联网提供给用户终端的网络服务器；用于贮存关于计算方法、氨基酸疏水性等
一般信息的数据库和用于基于数据库中的信息和用户通过互联网提供或传输的信息执行
SAP计算的计算服务器。
一般信息的数据库和用于基于数据库中的信息和用户通过互联网提供或传输的信息执行
SAP计算的计算服务器。
[0249] 在一些实施方式中，网络服务器和计算服务器是相同的计算机系统。在一些实施方式中，计算机系统是超级计算机、集群计算机或单个的工作站或服务器。在相关的实施方式中，SAP计算系统的网络服务器进一步包括用于控制全部操作的控制器、用于连接互联网的网络连接单元和用于将用于计算SAP的网络服务提供给通过互联网连接的用户终端的
网络服务器单元。
网络服务器单元。
[0250] 此外，本发明的实施方式进一步涉及具有计算机可读介质的计算机存储产品，该产品含有用于执行各种计算机执行的操作的程序编码，所述计算机执行的操作例如计算针
对结构模型的SAP、计算SAA、计算有效SAA、操纵结构模型、实施分子动力学模拟、组织和储存相关数据、或执行本文描述的其它操作。计算机可读介质是能储存数据的任何数据存储
设备，该数据此后能被计算机系统读取。计算机可读介质的例子包括但并不限于硬盘、软
盘、闪存驱动器、光盘(例如CD、DVD、HD-DVD、蓝光光盘等)和专门配置的硬件装置诸如特定用途集成电路(ASICs)或可编程逻辑器件(PLDs)。还能将计算机可读介质作为包括在遍
及偶联的计算机系统网络的载波中的数据信号而分布，以便使计算机可读代码以分布的形
式储存和执行。本领域的技术人员将理解，上面描述的硬件和软件组件是具有标准设计和
构造的。上面描述的计算机、互联网、服务器和服务相关的实施方式可进一步应用到SAA和有效SAA以及SAP。
对结构模型的SAP、计算SAA、计算有效SAA、操纵结构模型、实施分子动力学模拟、组织和储存相关数据、或执行本文描述的其它操作。计算机可读介质是能储存数据的任何数据存储
设备，该数据此后能被计算机系统读取。计算机可读介质的例子包括但并不限于硬盘、软
盘、闪存驱动器、光盘(例如CD、DVD、HD-DVD、蓝光光盘等)和专门配置的硬件装置诸如特定用途集成电路(ASICs)或可编程逻辑器件(PLDs)。还能将计算机可读介质作为包括在遍
及偶联的计算机系统网络的载波中的数据信号而分布，以便使计算机可读代码以分布的形
式储存和执行。本领域的技术人员将理解，上面描述的硬件和软件组件是具有标准设计和
构造的。上面描述的计算机、互联网、服务器和服务相关的实施方式可进一步应用到SAA和有效SAA以及SAP。
[0251] 包含免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物的药物组合物
[0252] 在另一个方面，本发明提供组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体一起配制的、通过本发明的方法产生的一种或多种免疫球蛋白结合物。本发明的药物组合物还能在联合治疗中施用，也即能与其它药剂组合。例如，联合治疗能包括与至少一种其它抗癌药剂组合的本发明的免疫球蛋白结合物。
[0253] 如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗的和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊椎或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据给药途径，可将活性化合物，即本发明的免疫球蛋白或其变体，包在材料中以保护化合物免受酸的作用和可使化合物失活的其它天然条件。
[0254] 本发明的药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”指保留母体化合物的期望生物学活性和不赋予任何不期望的毒理学作用的盐(参见，例如Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱
加成盐。酸加成盐包括来自无毒的无机酸，诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及来自无毒的有机酸诸如脂肪族一羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等的那些盐。碱加成盐包括来自碱土金属，诸如钠、钾、镁、钙等，以及来自无毒的有机胺，诸如N，N′-二苄乙烯二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些盐。
加成盐。酸加成盐包括来自无毒的无机酸，诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及来自无毒的有机酸诸如脂肪族一羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等的那些盐。碱加成盐包括来自碱土金属，诸如钠、钾、镁、钙等，以及来自无毒的有机胺，诸如N，N′-二苄乙烯二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些盐。
[0255] 本发明的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶的抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
[0256] 可在本发明的药物组合物中使用的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油，诸如橄榄油，和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。例如，通过包衣材料，诸如卵磷脂的使用，通过分散的情况下需要的粒度的维持和通过表面活性剂的使用能维持适当的流动性。
[0257] 这些组合物还可含有佐剂诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌操作和通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等确保阻止微生物的存在。还可期望将等渗剂，诸如糖、氯化钠等包括进组合物。此外，通过包含延迟吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和明胶可带来可注射的药物形式的延长的吸收。
[0258] 药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于无菌注射溶液或分散液的即时制备的无菌粉末。这些用于药学活性物质的介质和剂的使用是本领域已知的。除了在
任何常规的介质或剂与活性化合物不相容的情况下，考虑其在本发明的药物组合物中的使
用。也能将补充的活性化合物掺入进组合物。
任何常规的介质或剂与活性化合物不相容的情况下，考虑其在本发明的药物组合物中的使
用。也能将补充的活性化合物掺入进组合物。
[0259] 示例性的制剂包括至少一种本发明的免疫球蛋白结合物和能包括较低浓度的稳定剂，除了本文公开的方法，其能用于阻止或减少免疫球蛋白的交联。相应地，在含有通过本发明的方法产生的免疫球蛋白结合物的药物组合物的开发中可使用用于阻止交联的常
规方法。例如，许多种稳定或解聚化合物可根据它们的预期的用途和它们的生物学毒性包
括在本发明的药物组合物中。这样的稳定化合物可包括，例如环糊精及其衍生物(美国
专利号5730969)、烷基葡糖苷组合物(美国专利申请号11/474,049)、蛋白伴侣分子的使
用(例如LEA(Goyal et al.，Biochem J.2005，388(Pt 1)：151-7；美国专利号5688651的
方法)、甜菜碱化合物(Xiao，Burn，Tolbert，Bioconjug Chem.2008 May 23)、表面活性剂(例如Pluronic F127、Pluronic F68、Tween 20(Wei et al.International Journal of
Pharmaceutics.2007，338(1-2)：125-132))和美国专利号5696090、5688651和6420122中
描述的方法。
规方法。例如，许多种稳定或解聚化合物可根据它们的预期的用途和它们的生物学毒性包
括在本发明的药物组合物中。这样的稳定化合物可包括，例如环糊精及其衍生物(美国
专利号5730969)、烷基葡糖苷组合物(美国专利申请号11/474,049)、蛋白伴侣分子的使
用(例如LEA(Goyal et al.，Biochem J.2005，388(Pt 1)：151-7；美国专利号5688651的
方法)、甜菜碱化合物(Xiao，Burn，Tolbert，Bioconjug Chem.2008 May 23)、表面活性剂(例如Pluronic F127、Pluronic F68、Tween 20(Wei et al.International Journal of
Pharmaceutics.2007，338(1-2)：125-132))和美国专利号5696090、5688651和6420122中
描述的方法。
[0260] 此外，使用不同种类的赋形剂的组合在制剂中稳定蛋白质，特别是抗体，例如(1)二糖(例如蔗糖、海藻糖)或多元醇(例如山梨醇、甘露醇)通过优先的排除充当稳定剂并且还能在冻干期间充当冷冻保护剂，(2)表面活性剂(例如Polysorbat 80、Polysorbat
20)通过最小化界面象液体/冰、液体/材料表面和/或液体/气体界面上蛋白质的相互作
用起作用，和(3)缓冲液(例如磷酸盐-、柠檬酸盐-、组氨酸)有助于控制和维持制剂pH。
因此，除了本发明的方法外可以使用这样的二糖多元醇、表面活性剂和缓冲液以进一步稳
定免疫球蛋白和防止它们的聚集。
20)通过最小化界面象液体/冰、液体/材料表面和/或液体/气体界面上蛋白质的相互作
用起作用，和(3)缓冲液(例如磷酸盐-、柠檬酸盐-、组氨酸)有助于控制和维持制剂pH。
因此，除了本发明的方法外可以使用这样的二糖多元醇、表面活性剂和缓冲液以进一步稳
定免疫球蛋白和防止它们的聚集。
[0261] 治疗组合物典型地在制造和贮存条件下必须是无菌的和稳定的。能将组合物配制为溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其它规则结构。载体可以是含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。
例如，通过包衣诸如卵磷脂的使用、通过分散的情况下需要的粒度的维持和通过表面活性
剂的使用能维持适当的流动性。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇诸如甘露醇、山梨醇，或氯化钠将是优选的。通过将延迟吸收的剂，例如单硬脂酸盐和明胶包括在组合物中能带来可注射组合物的延长的吸收。
例如，通过包衣诸如卵磷脂的使用、通过分散的情况下需要的粒度的维持和通过表面活性
剂的使用能维持适当的流动性。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇诸如甘露醇、山梨醇，或氯化钠将是优选的。通过将延迟吸收的剂，例如单硬脂酸盐和明胶包括在组合物中能带来可注射组合物的延长的吸收。
[0262] 能通过将活性化合物以需要的量掺入到具有如所需要的、上面列举的一种成分或成分组合的适当溶剂中，接下来通过灭菌微滤来制备无菌注射溶液。一般地，通过将活性化合物掺入进含有基本的分散介质和需要的来自上面列举的那些其它成分的无菌载体中制
备分散体。在用于无菌注射溶液制备的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和
冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上任何另外期望的来自其先前无菌过滤的溶液的成
分的粉末。
备分散体。在用于无菌注射溶液制备的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和
冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上任何另外期望的来自其先前无菌过滤的溶液的成
分的粉末。
[0263] 能与载体材料结合以产生单剂型的活性成分的量将根据被治疗的受试者和特定的施用方式而变化。能与载体材料结合以产生单剂型的活性成分的量将通常是产生疗效的
组合物的量。一般地，100％中，这个量的范围将是约0.01％至约99％的活性成分，优选地约0.1％至约70％，最优选地约1％至约30％的与药学上可接受的载体组合的活性成分。
组合物的量。一般地，100％中，这个量的范围将是约0.01％至约99％的活性成分，优选地约0.1％至约70％，最优选地约1％至约30％的与药学上可接受的载体组合的活性成分。
[0264] 因此本发明的目的是提供降低免疫球蛋白结合物的高浓药物制剂中免疫球蛋白表面暴露的半胱氨酸之间交联的方法，所述方法包括提供免疫球蛋白，用半胱氨酸残基置
换选自7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基，用还原剂还原一个或多个置换的半胱
氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基，用原子或分子温育免疫球蛋白，其中所述分子与还
原的半胱氨酸残基反应，以形成免疫球蛋白结合物，和产生免疫球蛋白结合物的高浓液体
制剂，其中所述免疫球蛋白结合物浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少
50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。
在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方
式中，免疫球蛋白包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球
蛋白包括人VH结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人VL
结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括抗原结合活
性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少
110％、至少120％或至少130％。
换选自7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)的残基，用还原剂还原一个或多个置换的半胱
氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基，用原子或分子温育免疫球蛋白，其中所述分子与还
原的半胱氨酸残基反应，以形成免疫球蛋白结合物，和产生免疫球蛋白结合物的高浓液体
制剂，其中所述免疫球蛋白结合物浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少
50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。
在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方
式中，免疫球蛋白包括人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球
蛋白包括人VH结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括人VL
结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白结合物包括抗原结合活
性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少
110％、至少120％或至少130％。
[0265] 因此本发明的目的是提供修饰的免疫球蛋白制剂，其可由段落[0007]中讨论的免疫球蛋白结合物和它们的实施方式中任意和所有组合构成，其中所述免疫球蛋白结合
物浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少
100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml。在某些实施方式中，免疫球蛋白结合物浓度
大于在相同条件下在浓缩的液体溶液中已知具有高寡聚化形式寡聚体倾向的免疫球蛋白
结合物的浓度。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，至少80％、至少85％、至少
90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白结合物是非寡聚化单体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该制剂包括药学上可接受
的赋形剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该免疫球蛋白制剂包括
至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白结合物，该免疫球蛋白结合物是非寡聚化单体。
物浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少
100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml。在某些实施方式中，免疫球蛋白结合物浓度
大于在相同条件下在浓缩的液体溶液中已知具有高寡聚化形式寡聚体倾向的免疫球蛋白
结合物的浓度。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，至少80％、至少85％、至少
90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白结合物是非寡聚化单体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该制剂包括药学上可接受
的赋形剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该免疫球蛋白制剂包括
至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白结合物，该免疫球蛋白结合物是非寡聚化单体。
[0266] 因此本发明的目的是提供段落[0007]中讨论的免疫球蛋白结合物和它们的实施方式中任意和所有组合作为非寡聚化药物活性成分的用途。
[0267] 因此本发明的目的是提供药物组合物，其包括段落[0007]中讨论的免疫球蛋白结合物和它们的实施方式中任意和所有组合和药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式
中，免疫球蛋白结合物浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，免疫球蛋白结合物浓度大于在相同条件下在浓缩的液体溶液中已知具有高寡聚化形
式寡聚体倾向的免疫球蛋白结合物的浓度。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，
至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％
的免疫球蛋白结合物是非寡聚化单体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方
式中，该免疫球蛋白制剂包括至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少
97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白结合物，该免疫球蛋白结合物是非寡聚化单体。
在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，寡聚化通过非还原SDS-PAGE进行测量。
中，免疫球蛋白结合物浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，免疫球蛋白结合物浓度大于在相同条件下在浓缩的液体溶液中已知具有高寡聚化形
式寡聚体倾向的免疫球蛋白结合物的浓度。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，
至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％
的免疫球蛋白结合物是非寡聚化单体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方
式中，该免疫球蛋白制剂包括至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少
97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白结合物，该免疫球蛋白结合物是非寡聚化单体。
在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，寡聚化通过非还原SDS-PAGE进行测量。
[0268] 调整剂量方案以提供最佳期望的反应(例如治疗反应)。例如，可施用单个大丸剂(bolus)，可随着时间施用几个分次剂量或可如治疗情形的紧急度所指示的按比例地减
少或增加剂量。配制以剂量单位形式的胃肠外组合物以使施用容易和剂量均匀是尤其有利
的。如本文所用的剂量单位形式指适合用作用于将被治疗的受试者的单一剂量的物理离散
单位；每个单位含有计算的预定数量的活性化合物以与需要的药物载体联合地产生期望的
疗效。针对本发明的剂量单位形式的说明受指示于并直接依赖于：(a)活性化合物的独特
特性和将要达到的特定疗效，和(b)在复合这样的活性化合物以在个体中获得灵敏治疗的
领域中固有的限制。
少或增加剂量。配制以剂量单位形式的胃肠外组合物以使施用容易和剂量均匀是尤其有利
的。如本文所用的剂量单位形式指适合用作用于将被治疗的受试者的单一剂量的物理离散
单位；每个单位含有计算的预定数量的活性化合物以与需要的药物载体联合地产生期望的
疗效。针对本发明的剂量单位形式的说明受指示于并直接依赖于：(a)活性化合物的独特
特性和将要达到的特定疗效，和(b)在复合这样的活性化合物以在个体中获得灵敏治疗的
领域中固有的限制。
[0269] 对于免疫球蛋白结合物的施用，剂量范围是每kg宿主体重约0.0001至100mg，更通常地0.01至5mg。例如剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体
重或10mg/kg体重或1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周一次、每两周一次、每
三周一次、每四周一次、一个月一次、每3个月一次或每3至6个月一次施用。用于本发明
的免疫球蛋白结合物的优选剂量方案包括通过静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其
中采用以下的给药方案之一给予抗体：(i)每四周，进行六个剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg体重一次，接下来每三周1mg/kg体重。
重或10mg/kg体重或1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周一次、每两周一次、每
三周一次、每四周一次、一个月一次、每3个月一次或每3至6个月一次施用。用于本发明
的免疫球蛋白结合物的优选剂量方案包括通过静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其
中采用以下的给药方案之一给予抗体：(i)每四周，进行六个剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg体重一次，接下来每三周1mg/kg体重。
[0270] 可选地，本发明的免疫球蛋白结合物作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率可根据患者施用的物质的半衰期而变化。一般而言，人类抗
体显示最长的半衰期，接下来是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。剂量和频率可根据治疗是否是预防性的或治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时期内以相对不频繁的间隔
施用相对低的剂量。一些患者连续接受治疗持续他们生命的剩余部分。在治疗性应用中，
有时需要在相对短的间隔以相对高的剂量直到疾病的进展被降低或终止，优选地直至患者
显示疾病症状的部分或完全改善。之后，可给患者施用预防性方案。
体显示最长的半衰期，接下来是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。剂量和频率可根据治疗是否是预防性的或治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时期内以相对不频繁的间隔
施用相对低的剂量。一些患者连续接受治疗持续他们生命的剩余部分。在治疗性应用中，
有时需要在相对短的间隔以相对高的剂量直到疾病的进展被降低或终止，优选地直至患者
显示疾病症状的部分或完全改善。之后，可给患者施用预防性方案。
[0271] 本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可变化以获得活性成分的量，该量对达到针对特定患者、组合物和施用方式的期望的治疗反应是有效的，而对患者没有
毒性。选择的剂量水平将依赖许多种药物代谢动力学因素，包括使用的本发明的特定组合
物、或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的特定化合物的排泄速度、治疗的持续时间、与使用的特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料、正被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状态和以前的病史和医学领域中众所周知的类似因素。
毒性。选择的剂量水平将依赖许多种药物代谢动力学因素，包括使用的本发明的特定组合
物、或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的特定化合物的排泄速度、治疗的持续时间、与使用的特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料、正被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状态和以前的病史和医学领域中众所周知的类似因素。
[0272] 本发明的免疫球蛋白结合物的“治疗上有效的剂量”优选地导致疾病症状严重性降低、无疾病症状周期的频率和持续时间增加、或由于疾病折磨所致的损害或残疾停止。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未治疗的受试者，“治疗上有效的剂量”优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选地至少约40％，甚至更优选地至少约60％，更优选地至少约
80％。能在预示人类肿瘤中效力的动物模型系统中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。可选
地，能通过熟练的实施者所知的试验检查化合物抑制例如体外抑制的能力来评价组合物的
这种性质。治疗有效量的治疗化合物能减小肿瘤大小或另外改善受试者中的症状。本领域
的普通技术人员将能基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重性和特定的组合物或选择
的施用途径这样的因素确定这样的量。
80％。能在预示人类肿瘤中效力的动物模型系统中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。可选
地，能通过熟练的实施者所知的试验检查化合物抑制例如体外抑制的能力来评价组合物的
这种性质。治疗有效量的治疗化合物能减小肿瘤大小或另外改善受试者中的症状。本领域
的普通技术人员将能基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重性和特定的组合物或选择
的施用途径这样的因素确定这样的量。
[0273] 能使用本领域已知的许多种方法中的一个或多个通过一个或多个施用途径施用本发明的组合物。如熟练的技术人员所将理解的，施用的途径和/或方式将根据期望的结
果而变化。用于本发明的结合部分的优选的施用途径包括静脉内的、肌肉内的、真皮内的、腹膜内的、皮下的、脊椎的或其它肠胃外的施用途径，例如通过注射或输注。短语“胃肠外施用”如本文所用指除了肠的和局部施用外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内的、肌肉内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、真皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、硬膜外的和胸骨内的注射和输注。
果而变化。用于本发明的结合部分的优选的施用途径包括静脉内的、肌肉内的、真皮内的、腹膜内的、皮下的、脊椎的或其它肠胃外的施用途径，例如通过注射或输注。短语“胃肠外施用”如本文所用指除了肠的和局部施用外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内的、肌肉内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、真皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、硬膜外的和胸骨内的注射和输注。
[0274] 可选地，能通过非胃肠外途径诸如局部的、表皮的或粘膜的施用途径施用本发明的免疫球蛋白结合物，例如鼻内地、经口地、阴道地、直肠地、舌下地或局部地。
[0275] 能将活性化合物与载体一起制备，该载体将保护该化合物抵抗快速释放，诸如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴片和微囊化递送系统。能使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这样的制剂的制备的许多方法是取得专利权的或通常是本领域的技术人员已知的。参见，例如Sustained
and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
[0276] 治疗组合物能与本领域已知的医疗器材一起施用。例如，在优选的实施方式中，本发明的治疗组合物能与无针皮下注射装置，诸如美国专利号5,399,163；5,383,851；
5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置一起施用。众所周知的植入物和在本发明中有用的模块的例子包括：美国专利号4,487,603，其公开了用
于以控制的速度分配药物的可植入微量输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了用于通
过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确的输注速度递
送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续的药物递送的变速流可
植入的输液器；美国专利号4,439,196，其公开了具有多腔小室的渗透性药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。
5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置一起施用。众所周知的植入物和在本发明中有用的模块的例子包括：美国专利号4,487,603，其公开了用
于以控制的速度分配药物的可植入微量输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了用于通
过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确的输注速度递
送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续的药物递送的变速流可
植入的输液器；美国专利号4,439,196，其公开了具有多腔小室的渗透性药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。
[0277] 因此本发明的目的是提供段落[0007]中讨论的免疫球蛋白结合物和它们的实施方式中任意和所有组合在包含高浓液体制剂的药物的制备中的用途，其中所述免疫球蛋白
结合物浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少
100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗
自身免疫疾病、免疫学疾病、传染病、炎性疾病、神经学疾病以及包括癌症在内的肿瘤学和瘤性疾病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞和骨髓基质；骨丢失；佩吉特病、破骨细胞瘤；乳腺癌；废用性骨量减少、营养不良、牙周病、高歇病、朗格罕细胞组织细胞增多症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库兴综合征、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤维性骨发育不良、牙周重建和骨折；肉样瘤病；
溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理和体液恶性高钙血症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；移植排斥、病毒性感染、血液学瘤形成和瘤样病症，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样
霉菌病、套细胞淋巴瘤、巨滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，其包括B细胞急性成淋巴细胞白
血病/淋巴瘤、和T细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿
瘤，其包括外周T细胞白血病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大粒状淋巴细胞白血病、
朗格罕细胞组织细胞增多症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、没有分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中枢神经系统的肿瘤，例如，脑瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和成视网膜细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、和血管系统的肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、脓毒病和败血症性休克、克罗恩病、牛皮癣、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植物排斥、血液学恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗菌斑牛皮癣、溃疡性大肠炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、幼年特发性关节炎、黄斑变性、呼吸道合胞病毒、克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤、阿尔茨海默病、青光眼和多发性硬化症。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物的用途进一步包括药学上可接受的赋形剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施
方式中，该药物中的免疫球蛋白结合物显示至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的非寡聚化单体。在某些实施方式中，寡聚化通
过非还原SDS-PAGE进行测量。
实施例
结合物浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少
100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗
自身免疫疾病、免疫学疾病、传染病、炎性疾病、神经学疾病以及包括癌症在内的肿瘤学和瘤性疾病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞和骨髓基质；骨丢失；佩吉特病、破骨细胞瘤；乳腺癌；废用性骨量减少、营养不良、牙周病、高歇病、朗格罕细胞组织细胞增多症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库兴综合征、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤维性骨发育不良、牙周重建和骨折；肉样瘤病；
溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理和体液恶性高钙血症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；移植排斥、病毒性感染、血液学瘤形成和瘤样病症，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样
霉菌病、套细胞淋巴瘤、巨滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，其包括B细胞急性成淋巴细胞白
血病/淋巴瘤、和T细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿
瘤，其包括外周T细胞白血病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大粒状淋巴细胞白血病、
朗格罕细胞组织细胞增多症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、没有分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中枢神经系统的肿瘤，例如，脑瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和成视网膜细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、和血管系统的肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、脓毒病和败血症性休克、克罗恩病、牛皮癣、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植物排斥、血液学恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗菌斑牛皮癣、溃疡性大肠炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、幼年特发性关节炎、黄斑变性、呼吸道合胞病毒、克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤、阿尔茨海默病、青光眼和多发性硬化症。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物的用途进一步包括药学上可接受的赋形剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施
方式中，该药物中的免疫球蛋白结合物显示至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的非寡聚化单体。在某些实施方式中，寡聚化通
过非还原SDS-PAGE进行测量。
实施例
[0278] 本文描述的实施例指本发明的具体的、非限制的实施方式。
[0279] 实施例1：抗体半胱氨酸变体的设计、表达和结合
[0280] 设计一组IgG1半胱氨酸变体，以便表示每个免疫球蛋白折叠结构域(表1)。根据抗体-1的X线结构设计变体1-13。变体14选自另一个IgG1，抗体-2的结构，其通过
抗体-1的同源建模而构建。所有位点暴露于抗体表面。极性残基，如丝氨酸和苏氨酸和
精氨酸，或带电荷的残基，如赖氨酸，用半胱氨酸置换。轻链和重链基因被亚克隆到载体
gWIZ(Genlantis)并工程化，用于通过瞬时转染哺乳动物细胞进行蛋白表达。抗体变体
被重新合成(GeneArt)或通过定点诱变PCR产生并通过测序而验证。通过用聚乙烯亚胺
(Polysciences)作为转染试剂瞬时转染Freestyle HEK 293细胞(Invitrogen)，抗体野生
型和变体以10-100mg水平表达。转染后7-10天收集细胞培养上清液。将抗体在蛋白A柱
(GE Healthcare)上纯化，用50mM柠檬酸盐缓冲液，pH 3.5洗脱，并以100mM Tris pH 7.0
缓冲液更换缓冲液，用于荧光标记。
抗体-1的同源建模而构建。所有位点暴露于抗体表面。极性残基，如丝氨酸和苏氨酸和
精氨酸，或带电荷的残基，如赖氨酸，用半胱氨酸置换。轻链和重链基因被亚克隆到载体
gWIZ(Genlantis)并工程化，用于通过瞬时转染哺乳动物细胞进行蛋白表达。抗体变体
被重新合成(GeneArt)或通过定点诱变PCR产生并通过测序而验证。通过用聚乙烯亚胺
(Polysciences)作为转染试剂瞬时转染Freestyle HEK 293细胞(Invitrogen)，抗体野生
型和变体以10-100mg水平表达。转染后7-10天收集细胞培养上清液。将抗体在蛋白A柱
(GE Healthcare)上纯化，用50mM柠檬酸盐缓冲液，pH 3.5洗脱，并以100mM Tris pH 7.0
缓冲液更换缓冲液，用于荧光标记。
[0281] 抗体变体的表达和纯化之后，工程化的表面半胱氨酸大部分被氧化。例如变体4和6都具有小于每抗体分子0.3个自由巯基，与具有工程化表面半胱氨酸的抗体的预期的
2.0相反。我们比较了温和的还原剂——TCEP(Tris[2-羧乙基]膦氢氯化物)和较强的
还原剂——DTT(二硫苏糖醇)对来自I类的变体和来自IV类的变体的效果。最初，非寡
聚化变体4显示每抗体0.13个自由巯基，而高度寡聚化变体6具有每抗体0.25个自由巯
基。在以下五种不同的条件中处理野生型的等分试样、变体4和变体6：1)没有还原剂，2)
TCEP，10×，1小时，3)TCEP，20×，1小时，4)DTT，5×，15分钟，和5)DTT，10×，15分钟。去除还原剂之后，将样品在非还原PAGE上分解并对自由巯基定量。野生型和变体的结果比较显
示，TCEP处理足以还原非寡聚化形式(变体4)中的半胱氨酸，对WT(野生型)几乎没有影
响。然而，来自寡聚体(变体6)的半胱氨酸只在较苛刻的处理之后才被还原。甚至低水平
的DTT处理导致WT和两个变体抗体的片段化。表面半胱氨酸被引入的位点对脱帽(decap)
工程化半胱氨酸以结合的能力具有深的影响。
2.0相反。我们比较了温和的还原剂——TCEP(Tris[2-羧乙基]膦氢氯化物)和较强的
还原剂——DTT(二硫苏糖醇)对来自I类的变体和来自IV类的变体的效果。最初，非寡
聚化变体4显示每抗体0.13个自由巯基，而高度寡聚化变体6具有每抗体0.25个自由巯
基。在以下五种不同的条件中处理野生型的等分试样、变体4和变体6：1)没有还原剂，2)
TCEP，10×，1小时，3)TCEP，20×，1小时，4)DTT，5×，15分钟，和5)DTT，10×，15分钟。去除还原剂之后，将样品在非还原PAGE上分解并对自由巯基定量。野生型和变体的结果比较显
示，TCEP处理足以还原非寡聚化形式(变体4)中的半胱氨酸，对WT(野生型)几乎没有影
响。然而，来自寡聚体(变体6)的半胱氨酸只在较苛刻的处理之后才被还原。甚至低水平
的DTT处理导致WT和两个变体抗体的片段化。表面半胱氨酸被引入的位点对脱帽(decap)
工程化半胱氨酸以结合的能力具有深的影响。
[0282] 尝试不同的方法用于标记之前工程化表面巯基的特异性还原。TCEP和DTT是使用的两种试剂，利用Ellman’s试剂(Invitrogen)定量自由巯基的水平。我们发现L-半胱
氨酸在我们的位点特异性标记实验中作用最好，所以利用以下的两步法方案。首先，将变体用100-200倍过量的L-半胱氨酸在37℃温育4小时，之后通过缓冲液更换到50mM Tris/
EDTA。其次，将样品用5-10倍过量的Alexa488马来酰亚胺染料(Invitrogen)在室温温育
1小时或用10倍过量的芘马来酰亚胺染料(Invitrogen)在室温温育12小时。去除游离染
料之后，缓冲液更换到50mM磷酸盐缓冲液pH 7.0中，根据制造厂商的方案(Invitrogen)
将蛋白标记的效率计算为每摩尔蛋白染料的摩尔(mol染料/mol蛋白)。
氨酸在我们的位点特异性标记实验中作用最好，所以利用以下的两步法方案。首先，将变体用100-200倍过量的L-半胱氨酸在37℃温育4小时，之后通过缓冲液更换到50mM Tris/
EDTA。其次，将样品用5-10倍过量的Alexa488马来酰亚胺染料(Invitrogen)在室温温育
1小时或用10倍过量的芘马来酰亚胺染料(Invitrogen)在室温温育12小时。去除游离染
料之后，缓冲液更换到50mM磷酸盐缓冲液pH 7.0中，根据制造厂商的方案(Invitrogen)
将蛋白标记的效率计算为每摩尔蛋白染料的摩尔(mol染料/mol蛋白)。
[0283] 实施例2：工程化抗体半胱氨酸变体的鉴定
[0284] 通过SDS-PAGE分析未标记和标记的抗体样品。利用7.5％、10％和12％的凝胶进行非还原分析。12％的凝胶用于具有DTT的加热样品的还原分析。通常，每泳道加样
5-10μg样品。用考马斯蓝染色之前在UV灯下观察荧光图像。抗体消化通过GluC(1∶20
的重量酶/重量抗体，于25℃持续12-24小时)和链霉蛋白酶(1∶20的重量酶/重量抗
体，于37℃持续1hr)进行。
5-10μg样品。用考马斯蓝染色之前在UV灯下观察荧光图像。抗体消化通过GluC(1∶20
的重量酶/重量抗体，于25℃持续12-24小时)和链霉蛋白酶(1∶20的重量酶/重量抗
体，于37℃持续1hr)进行。
[0285] 非还原性凝胶显示单体以及二聚体、三聚体的存在，在一些情况下，甚至存在较高级的寡聚体。还原性凝胶显示根据表面半胱氨酸被工程化的地方，轻链或重链专有的标记。分析标记和未标记的变体1-6的抗原结合特异性。变体保持野生型的80％和130％内的活
性，标记之后一些活性丧失。未标记的变体1保持野生型活性的大约110％，而标记的变体
1保持大约80％。未标记的变体2保持野生型活性的大约105％，而标记的变体2保持略
小于100％的活性。未标记和标记的变体3均保持野生型活性的大约110％。未标记的变
体4保持野生型活性的大约125％，而标记的变体4保持大约95％的活性。未标记的变体5
保持野生型活性的大约120％，而标记的变体6保持大约100％的活性。最后，未标记的变
体6保持野生型活性的大约115％，而标记的变体6保持大约90％的活性。类似于未标记
的负体，标记的变体6显示高的寡聚化倾向。
性，标记之后一些活性丧失。未标记的变体1保持野生型活性的大约110％，而标记的变体
1保持大约80％。未标记的变体2保持野生型活性的大约105％，而标记的变体2保持略
小于100％的活性。未标记和标记的变体3均保持野生型活性的大约110％。未标记的变
体4保持野生型活性的大约125％，而标记的变体4保持大约95％的活性。未标记的变体5
保持野生型活性的大约120％，而标记的变体6保持大约100％的活性。最后，未标记的变
体6保持野生型活性的大约115％，而标记的变体6保持大约90％的活性。类似于未标记
的负体，标记的变体6显示高的寡聚化倾向。
[0286] 大多数变体在接近每摩尔抗体2.0摩尔染料(每抗体分子两个相同的半胱氨酸)的最佳效率被标记。高于2.0的标记效率是不期望的，因为这将提示链内二硫化物的部分
分裂和标记。具有高寡聚化倾向的变体如变体6、变体11和变体5没有有效地标记。甚至
在其它变体中，标记条件如反应时间和染料与蛋白的比例在个体基础上必须被优化，这是
因为不是所有的工程化半胱氨酸都同样地易于结合。在携带工程化半胱氨酸的链上特异地
标记变体1-14。利用链霉蛋白酶对变体的蛋白水解处理对大多数变体产生不同的荧光模
式，但是对具有邻近置换的变体，如变体3和12，产生相似的模式。因此，大多数变体被有效地和特异地标记。
分裂和标记。具有高寡聚化倾向的变体如变体6、变体11和变体5没有有效地标记。甚至
在其它变体中，标记条件如反应时间和染料与蛋白的比例在个体基础上必须被优化，这是
因为不是所有的工程化半胱氨酸都同样地易于结合。在携带工程化半胱氨酸的链上特异地
标记变体1-14。利用链霉蛋白酶对变体的蛋白水解处理对大多数变体产生不同的荧光模
式，但是对具有邻近置换的变体，如变体3和12，产生相似的模式。因此，大多数变体被有效地和特异地标记。
[0287] 将该组半胱氨酸变体区分为五类交联倾向(表1)。I类包括是单体并在标记之后保持稳定的变体。II类变体在标记之前和之后含有小百分比的二聚体。III类变体具有更
显著的寡聚体化倾向，包括形成一些三聚体。如比三聚体大的聚集物的存在所证明的，IV类变体具有更高的寡聚体化倾向，尤其是标记之后。V类包括与IV类变体相似的高寡聚化倾
向的变体，具有另外的结构异常如纯化的浓缩样品的片段化或着色。
显著的寡聚体化倾向，包括形成一些三聚体。如比三聚体大的聚集物的存在所证明的，IV类变体具有更高的寡聚体化倾向，尤其是标记之后。V类包括与IV类变体相似的高寡聚化倾
向的变体，具有另外的结构异常如纯化的浓缩样品的片段化或着色。
[0288] 实施例3：工程化抗体半胱氨酸变体的应用
[0289] 将具有低交联倾向的半胱氨酸变体(变体1-4、7、10、12-14)以高特异性和有效性和很少的寡聚化进行标记。用马来酰亚胺染料的标记只是这些抗体变体上位点特异性结合的一个实例。具有其它功能性如结合特异性或毒性的分子可被同样的连接。因此，该组变体在抗体变体的储库上扩展以用作靶向治疗中的有效负载载体或用作体外和体内荧光分析。
[0290] 为了说明变体之一的荧光应用，我们分析了与荧光团芘结合的变体发射模式。当两个芘分子靠近在一起时，已知作为激基(excimer)荧光，在465nm具有特征性的发射增
加。我们用芘马来酰亚胺标记变体4和7并监测发射光谱。虽然变体4在465nm显示基础
水平的发射，但是变体7显示强的激基荧光。考虑到变体7的CH1中工程化半胱氨酸的位
置，在Fab结构域的内侧上，观察到的结果与已知的相对于Fc的Fab的剪切作用相关联。因
此，该变体可用于抗体结构域动力学的分析。
加。我们用芘马来酰亚胺标记变体4和7并监测发射光谱。虽然变体4在465nm显示基础
水平的发射，但是变体7显示强的激基荧光。考虑到变体7的CH1中工程化半胱氨酸的位
置，在Fab结构域的内侧上，观察到的结果与已知的相对于Fc的Fab的剪切作用相关联。因
此，该变体可用于抗体结构域动力学的分析。
[0291] 变体6的高寡聚化倾向提示抗体半胱氨酸变体的另一个效用，其被更详细地探究。将标记的变体6进行凝胶过滤层析以从寡聚体分离单体，将含有蛋白的部分在7.5％
非还原SDS-PAGE凝胶上分辨并在用考马斯蓝染色之前和之后进行分析。变体6的凝胶过
滤分析显示标记和交联之间的竞争：种类的MW越高，标记效率(荧光水平所显示的)越低。
最高MW的种类具有0.5的标记效率，而单体种类具有1.0的标记效率，最初的标记样品具
有0.8的标记效率。具有多个寡聚体的抗体变体，变体6呈现抗体寡聚化的极好对照和高
分子量蛋白的合适标准，具有另外的功能性——其可被位点特异地标记。
非还原SDS-PAGE凝胶上分辨并在用考马斯蓝染色之前和之后进行分析。变体6的凝胶过
滤分析显示标记和交联之间的竞争：种类的MW越高，标记效率(荧光水平所显示的)越低。
最高MW的种类具有0.5的标记效率，而单体种类具有1.0的标记效率，最初的标记样品具
有0.8的标记效率。具有多个寡聚体的抗体变体，变体6呈现抗体寡聚化的极好对照和高
分子量蛋白的合适标准，具有另外的功能性——其可被位点特异地标记。
[0292] 实施例4：半胱氨酸变体的交联倾向(CLP)和空间聚集倾向(SAP)之间的相关性
[0293] 比较半胱氨酸变体的交联倾向(CLP)和空间聚集倾向(SAP)，在该半胱氨酸变体中特定的氨基酸用半胱氨酸置换。基于非还原SDS-PAGE分析给每个变体指定CLP。突变残
基的SAP值来自 半径的计算结果。我们在SAP-编码的抗体-1结构上覆盖工程化半胱氨
酸变体。
基的SAP值来自 半径的计算结果。我们在SAP-编码的抗体-1结构上覆盖工程化半胱氨
酸变体。
[0294] 观察到以下相关性。用半胱氨酸置换的所有氨基酸在-0.27至0.00的范围里具有负的SAP值。这与用于置换的极性或带电荷氨基酸的选择是一致的。所有CLPI类变体具
有0.00和-0.11之间的SAP(变体3、4、7、10、12)，所有CLP II类变体具有-0.12和-0.23
之间的SAP(变体1、2、13)。然而，存在在具有高CLP的那些范围中具有SAP的变体(例如
变体8、9和11)。高度交联变体变体8和11邻近SAP位点。具有CLP III的变体5靠近
CH2中的高SAP位点，而CLP II的变体2不是。然而，在CH3中的变体6和变体10之间，VH
中的变体9和14之间没有这种相关性。
有0.00和-0.11之间的SAP(变体3、4、7、10、12)，所有CLP II类变体具有-0.12和-0.23
之间的SAP(变体1、2、13)。然而，存在在具有高CLP的那些范围中具有SAP的变体(例如
变体8、9和11)。高度交联变体变体8和11邻近SAP位点。具有CLP III的变体5靠近
CH2中的高SAP位点，而CLP II的变体2不是。然而，在CH3中的变体6和变体10之间，VH
中的变体9和14之间没有这种相关性。
[0295] 另外的观察结果由变体14制造。如果附近有高SAP区，那么变体14不能表达，而当该高SAP区被低SAP区替换，它就表达。与在天然的抗体-2背景中的变体14的产率
(0.34mg/L)相比，观察到在稳定的抗体-2中变体14高100倍的产率(35.6mg/L培养物)。
当半胱氨酸被引入到接近高SAP值的蛋白表面时，变体14在不同背景中的相对产率显示结
构问题。当邻近工程化半胱氨酸的疏水碎片中的两个疏水的氨基酸由赖氨酸置换时，该问
题得以解决。
(0.34mg/L)相比，观察到在稳定的抗体-2中变体14高100倍的产率(35.6mg/L培养物)。
当半胱氨酸被引入到接近高SAP值的蛋白表面时，变体14在不同背景中的相对产率显示结
构问题。当邻近工程化半胱氨酸的疏水碎片中的两个疏水的氨基酸由赖氨酸置换时，该问
题得以解决。
[0296] 综上所述，相关性在半胱氨酸变体的稳定性与SAP之间存在：1)具有低交联倾向的半胱氨酸变体具有稍微负的SAP(0.00至-0.11)，2)具有更负的SAP(-0.12至-0.23)的
半胱氨酸变体更易于交联，和3)高SAP碎片的紧邻区域中的半胱氨酸变体更可能交联或具
有结构异常。结论1和2与先前限定的观点一致，该观点是完全暴露的残基可能更易于交
联[9]。
半胱氨酸变体更易于交联，和3)高SAP碎片的紧邻区域中的半胱氨酸变体更可能交联或具
有结构异常。结论1和2与先前限定的观点一致，该观点是完全暴露的残基可能更易于交
联[9]。
[0297] 实施例5-结论
[0298] 我们设计了一组人IgG1半胱氨酸变体，其广泛地分布在抗体分子上，每个免疫球蛋白折叠结构域至少一个变体。这些变体中的大部分是稳定的，并能被有效和特异地结合，而不显著丧失抗原结合活性。因此，稳定的抗体变体加到用于有效负载分子的位点特异结
合的变体储库。如果荧光团连接到工程化半胱氨酸，那么可分析特定结构域的动力学。高
度寡聚化变体也是有益的，因为很多多聚体为抗体聚集物和为通常高分子量蛋白提供方便
的标准物。
合的变体储库。如果荧光团连接到工程化半胱氨酸，那么可分析特定结构域的动力学。高
度寡聚化变体也是有益的，因为很多多聚体为抗体聚集物和为通常高分子量蛋白提供方便
的标准物。
[0299] 这里描述的抗体半胱氨酸变体的交联倾向和SAP方法之间的相关性显示，SAP方法学可用于筛选具有降低的交联的结合位点。SAP技术是基于计算机的，因此它减少变体设计中的时间和实验工作。CLP/SAP比较显示部分和不是完全暴露的氨基酸的置换产生最稳
定的变体。而且，该比较显示邻近的疏水碎片应被避免。
定的变体。而且，该比较显示邻近的疏水碎片应被避免。
[0300] 这里描述的工程化人IgG1表面半胱氨酸变体为治疗性抗体的位点特异性结合提供新位点和识别另外变体的方法。几乎没有交联倾向的变体在发展用于靶向治疗的抗体中
具有极大的效用。本文公开的半胱氨酸变体包括在先前表示的结构域(CL、CH1、CH3)以及在先前未表示的结构域(VL、VH、CH2)中的新位点。
具有极大的效用。本文公开的半胱氨酸变体包括在先前表示的结构域(CL、CH1、CH3)以及在先前未表示的结构域(VL、VH、CH2)中的新位点。
[0301] 而且，标记的变体可用作一组位点特异性荧光抗体标志用于体外和体内实验室研究。荧光标记的产物可通过提供给研究团体抗体和其它蛋白试剂的生物技术公司(如
Thermo Scientific Pierce、GE Healthcare和Invitrogen)被商业化。
Thermo Scientific Pierce、GE Healthcare和Invitrogen)被商业化。
[0302] 高度交联变体6是有用的蛋白质凝胶或其它层析技术标准。它可由提供蛋白试剂的公司(例如Invitrogen、Bio-Rad和Pierce)推向市场。
[0303] CLP和SAP之间的相关性进一步提示我们先前描述的SAP技术的商业应用。对SAP的考虑可改善用于位点特异性结合的稳定的抗体半胱氨酸变体的设计。
[0304] 表1
[0305]变体 结构域 残基 CLP SAP
1 CH2 K248 II -0.12
2 CH2 K326 II -0.19
3 VL T22 I -0.07
4 CL T197 I -0.03
5 CH2 N286 III -0.27
6 CH3 S440 IV -0.09
7 CH1 S125 I -0.06
8 CH2 S298 V -0.19
9 VH S25 III -0.07
10 CH3 S442 I 0.00
11 CH2 S254 V -0.06
12 VL T20 I -0.04
13 CH3 S415 II -0.23
14 VH S7 I -0.11
1 CH2 K248 II -0.12
2 CH2 K326 II -0.19
3 VL T22 I -0.07
4 CL T197 I -0.03
5 CH2 N286 III -0.27
6 CH3 S440 IV -0.09
7 CH1 S125 I -0.06
8 CH2 S298 V -0.19
9 VH S25 III -0.07
10 CH3 S442 I 0.00
11 CH2 S254 V -0.06
12 VL T20 I -0.04
13 CH3 S415 II -0.23
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p.603-9.
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2008.332(1-2)：p.41-52.
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