抗-CD100抗体和其使用方法
阅读：121发布：2021-10-01
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1.一种分离的结合分子，其特异性结合与选自2503或67的参比单克隆抗体相同的CD100表位。
2.一种特异性结合CD100的分离的结合分子，所述结合分子竞争性抑制选自2503或
67的参比单克隆抗体与CD100的特异性结合。
3.如权利要求1或2所述的结合分子，其特征在于，包括抗体或其抗原结合片段。
4.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段是单克隆抗体2503或67。
5.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10至少90％相同的氨基酸序列。
6.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18至少90％相同的氨基酸序列。
7.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除20个或更少保守性氨基酸取代外，与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10相同的氨基酸序列。
8.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除20个或更少保守性氨基酸取代外，与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18相同的氨基酸序列。
9.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其片段的VH包括氨基酸序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10。
10.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其片段的VL包括氨基酸序列SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18。
11.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VH和VL包含分别与SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，或分别与SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18至少90％相同的氨基酸序列。
12.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VH和VL包含除各自的20个或更少保守性氨基酸取代外，分别与SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，或分别与SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18相同的氨基酸序列。
13.如权利要求11所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其片段的VH和VL包含分别与SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，或者分别与SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18相同的氨基酸序列。
14.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VH包含Chothia-Kabat重链互补决定区-1(VH-CDR1)氨基酸序列，该氨基酸序列除两个或更少的氨基酸取代外，与SEQ ID NO：6相同。
15.如权利要求14所述的抗体或其片段，其特征在于，所述VH-CDR1氨基酸序列是SEQ ID NO：6。
16.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VH包含Kabat重链互补决定区-2(VH-CDR2)氨基酸序列，该氨基酸序列除4个或更少的氨基酸取代外，与SEQ ID NO：7相同。
17.如权利要求16所述的抗体或其片段，其特征在于，所述VH-CDR2氨基酸序列是SEQ ID NO：7。
18.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VH包含Kabat重链互补决定区-3(VH-CDR3)氨基酸序列，该氨基酸序列除2个或更少的氨基酸取代外，与SEQ ID NO：8相同。
19.如权利要求18所述的抗体或其片段，其特征在于，所述VH-CDR3氨基酸序列是SEQ ID NO：8。
20.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VL包含Kabat轻链互补决定区-1(VL-CDR1)氨基酸序列，该氨基酸序列除4个或更少的氨基酸取代外，与SEQ ID NO：14相同。
21.如权利要求20所述的抗体或其片段，其特征在于，所述VL-CDR1氨基酸序列是SEQ ID NO：14。
22.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VL包含Kabat轻链互补决定区-2(VL-CDR2)氨基酸序列，该氨基酸序列除2个或更少的氨基酸取代外，与SEQ ID NO：15相同。
23.如权利要求22所述的抗体或其片段，其特征在于，所述VL-CDR2氨基酸序列是SEQ ID NO：15。
24.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VL包含Kabat轻链互补决定区-3(VL-CDR3)氨基酸序列，该氨基酸序列除2个或更少的氨基酸取代外，与SEQ ID NO：16相同。
25.如权利要求24所述的抗体或其片段，其特征在于，所述VL-CDR3氨基酸序列是SEQ ID NO：16。
26.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VH包含VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列，在一个或多个所述VH-CDR中，除4个或更少氨基酸取代外，它们分别包含SEQID NO：6、7和8。
27.如权利要求26所述的分离的抗体，其特征在于，所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分别是SEQ ID NO：6、7和8。
28.一种特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VL包含VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列，在一个或多个所述VL-CDR中，除4个或更少氨基酸取代外，它们分别包含SEQID NO：14、15和16。
29.如权利要求28所述的分离的抗体，其特征在于，所述VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别是SEQ ID NO：14、15和16。
30.如权利要求4、6、8、11至13中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述VH构架区具有5个或更少的氨基酸取代。
31.如权利要求5、7、9和10至13中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述VL构架区具有5个或更少的氨基酸取代。
32.如权利要求3-31中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，其结合线性表位。
33.如权利要求3-31中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，其结合非线性构象表位。
34.如权利要求3-33中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，它具有多特异性。
35.如权利要求34所述的抗体或其片段，其特征在于，它具有双特异性。
36.如权利要求3-35中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，它是Fab片段。
37.如权利要求3-35中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，它是F(ab)2片段。
38.如权利要求3-35中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，它是Fv片段。
39.如权利要求3-35中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，它是单链抗体。
40.如权利要求3-35中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，它是多价的且包含至少两条重链和至少两条轻链。
41.如权利要求3-35、39和40中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，其包含选自人κ恒定区和人λ恒定区的轻链恒定区。
42.如权利要求3-35和39-41中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，其包含重链恒定区或其片段。
43.如权利要求42所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链恒定区或其片段是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgE或IgD。
44.如权利要求3-43中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，其结合人和鼠CD100。
45.如权利要求3-44中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，其特异性结合CD100-2 -2
多肽或其片段或者CD100变体多肽的亲和力的特征是解离常数(KD)不大于5x10 M、10 M、-3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -12 -12
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、5.7x10 M、8.4x10 M、10 M、-13 -13 -14 -14 -15 -15
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M或10 M。
46.如权利要求45所述的抗体或其片段，其特征在于，所述CD100多肽或其片段或者CD100变体多肽是人或鼠的。
47.如权利要求46所述的抗体或其片段，其特征在于，所述CD100多肽或其片段或者-9 -9
CD100变体多肽是人的，且所述KD约为5x10 M至6x10 M。
48.如权利要求46所述的抗体或其片段，其特征在于，所述CD100多肽或其片段或者-9 -9
CD100变体多肽是鼠的，且所述KD约为1x10 M至2x10 M。
49.如权利要求3-48中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，其抑制CD100与CD100受体结合。
50.如权利要求49所述的抗体或其片段，其特征在于，所述CD100受体是丛蛋白B1。
51.如权利要求3-50中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段是人源化、灵长化或嵌合的。
52.如权利要求51所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段是人源化的。
53.如权利要求3-52中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，其还包含与其融合的异源多肽。
54.如权利要求3-53中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段偶联于选自下组的药剂：细胞毒剂、治疗剂、细胞生长抑制剂、生物毒素、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应修饰剂、药物、淋巴因子、异源抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)和任何上述药剂中两种或多种的组合。
55.如权利要求54所述的抗体或其片段，其特征在于，所述细胞毒剂选自放射性核素、生物毒素、酶活性毒素或任何所述细胞毒剂中两种或多种的组合。
56.如权利要求54所述的抗体或其片段，其特征在于、所述可检测标记选自酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记或任何所述可检测标记中两种或多种的组合。
57.一种组合物，其包含权利要求1-56中任一项所述的抗体或其片段和运载体。
58.如权利要求57所述的组合物，其特征在于，所述运载体选自盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油和其组合。
59.一种分离的多核苷酸，其包含编码抗体VH多肽的核酸，其中所述VH多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20至少90％相同；且包含所述VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合CD100。
60.如权利要求59所述的多核苷酸，其特征在于，优化编码所述VH多肽的核苷酸序列以提高表达而不改变所述VH多肽的氨基酸序列。
61.如权利要求60所述的多核苷酸，其特征在于，所述优化包括鉴定和除去剪接供体和剪接接受体位点。
62.如权利要求60所述的多核苷酸，其特征在于，所述优化包括根据表达所述多核苷酸的细胞优化密码子使用。
63.如权利要求59-62中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述核酸包含含有SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的核苷酸序列。
64.如权利要求63所述的多核苷酸，其特征在于，所述核酸包含由SEQID NO：19或SEQ ID NO：20组成的核苷酸序列。
65.一种分离的多核苷酸，其包含编码抗体VL多肽的核酸，其中所述VL多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22至少90％相同；且包含所述VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合CD100。
66.如权利要求65所述的多核苷酸，其特征在于，优化编码所述VL多肽的核苷酸序列，以提高表达而不改变所述VL多肽的氨基酸序列。
67.如权利要求66所述的多核苷酸，其特征在于，所述优化包括鉴定和除去剪接供体和剪接接受体位点。
68.如权利要求66所述的多核苷酸，其特征在于，所述优化包括根据表达所述多核苷酸的细胞优化密码子使用。
69.如权利要求65-68中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述核酸包含含有SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22的核苷酸序列。
70.如权利要求69所述的多核苷酸，其特征在于，所述核酸包含由SEQID NO：21或SEQ ID NO：22组成的核苷酸序列。
71.一种分离的多核苷酸，其包含编码抗体VH多肽的核酸，其中所述VH多肽的氨基酸序列除20个或更少的保守性氨基酸取代外，与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10相同；且包含所述VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合CD100。
72.一种分离的多核苷酸，其包含编码抗体VL多肽的核酸，其中所述VL多肽的氨基酸序列除20个或更少的保守性氨基酸取代外，与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18相同；且包含所述VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合CD100。
73.一种分离的多核苷酸，其包含编码VH-CDR1氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列除两个或更少的氨基酸取代外，与SEQ ID NO：6相同；其中包含所述VH-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性结合CD100。
74.如权利要求73所述的多核苷酸或其片段，其特征在于，所述VH-CDR1氨基酸序列是SEQ ID NO：6。
75.一种分离的多核苷酸，其包含编码VH-CDR2氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列除
4个或更少的氨基酸取代外，与SEQ ID NO：7相同；其中包含所述VH-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性结合CD100。
76.如权利要求75所述的多核苷酸或其片段，其特征在于，所述VH-CDR2氨基酸序列是SEQ ID NO：7。
77.一种分离的多核苷酸，其包含编码VH-CDR3氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列除两个或更少的氨基酸取代外，与SEQ ID NO：8相同；其中包含所述VH-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合CD100。
78.如权利要求77所述的多核苷酸或其片段，其特征在于，所述VH-CDR3氨基酸序列是SEQ ID NO：8。
79.一种分离的多核苷酸，其包含编码VL-CDR1氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列除
4个或更少的氨基酸取代外，与SEQ ID NO：14相同；其中包含所述VL-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性结合CD100。
80.如权利要求79所述的多核苷酸或其片段，其特征在于，所述VL-CDR1氨基酸序列是SEQ ID NO：14。
81.一种分离的多核苷酸，其包含编码VL-CDR2氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列除
2个或更少的氨基酸取代外，与SEQ ID NO：15相同；其中包含所述VL-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性结合CD100。
82.如权利要求81所述的多核苷酸或其片段，其特征在于，所述VL-CDR2氨基酸序列是SEQ ID NO：15。
83.一种分离的多核苷酸，其包含编码VL-CDR3氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列除
2个或更少的氨基酸取代外，与SEQ ID NO：16相同；其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合CD100。
84.如权利要求83所述的多核苷酸或其片段，其特征在于，所述VL-CDR3氨基酸序列是SEQ ID NO：16。
85.一种分离的多核苷酸，其包含编码抗体VH多肽的核酸，其中所述VH多肽包含VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列，所述氨基酸序列分别含有SEQ ID NO：6、7和8；
其中抗体或其抗原结合片段特异性结合CD100。
86.一种分离的多核苷酸，其包含编码抗体VL多肽的核酸，其中所述VL多肽包含VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列，所述氨基酸序列分别含有SEQ ID NO：14、15和
16；其中抗体或其抗原结合片段特异性结合CD100。
87.如权利要求59-64、71、73-78和85中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，还包含编码融合于抗体VH多肽的信号肽的核酸。
88.如权利要求65-69、72、79-84和86中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，还包含编码融合于抗体VL多肽的信号肽的核酸。
89.如权利要求59-64、71-78、85和87中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，还包含编码融合于抗体VH多肽的重链恒定区CH1结构域的核酸。
90.如权利要求59-64、71-78、85、87和89中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，还包含编码融合于抗体VH多肽的重链恒定区CH2结构域的核酸。
91.如权利要求59-64、71-78、85、87、89和90中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH3结构域的核酸。
92.如权利要求59-64、71-78、85、87和89-91中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，还包含编码融合于所述VH多肽的重链绞链区的核酸。
93.如权利要求91-92中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述重链恒定区是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgE或IgD。
94.如权利要求65-70、72、79-84、86和88中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，还包含编码融合于所述VL多肽的轻链恒定区结构域的核酸。
95.如权利要求94所述的多核苷酸，其特征在于，所述轻链恒定区是人κ。
96.如权利要求59-95中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人和鼠CD100。
97.一种包含权利要求59-96中任一项所述多核苷酸的载体。
98.如权利要求97所述的载体，其特征在于，所述多核苷酸操作性连接于启动子。
99.一种包含权利要求97或98所述载体的宿主细胞。
100.一种产生特异性结合CD100的抗体或其片段的方法，其包括培养权利要求99所述的宿主细胞，和回收所述抗体或其片段。
101.一种通过权利要求100所述方法产生的分离的多肽。
102.一种分离的多肽，其中所述多肽由权利要求59-96中任一项所述的多核苷酸编码。
103.一种分离的抗体或其片段，其包含权利要求101或102所述的多肽。
104.一种组合物，其包含分离的VH编码多核苷酸和分离的VL编码多核苷酸，其特征在于，所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸包含编码分别与SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：17、或者分别与SEQ ID NO：10和SEQID NO：18至少90％相同的氨基酸序列的核酸；并且其中所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段特异性结合CD100。
105.如权利要求104所述的组合物，其特征在于，所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸包含编码分别由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：17，或者分别由SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18组成的氨基酸序列的核酸。
106.一种组合物，其包含分离的VH编码多核苷酸和分离的VL编码多核苷酸，其特征在于，所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸包含编码除少于20个保守性氨基酸取代外，分别与SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：17、或者分别与SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18相同的氨基酸序列的核酸；并且其中所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段特异性结合CD100。
107.如权利要求106所述的组合物，其特征在于，所述VH和VL氨基酸序列分别是SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：17，或者分别是SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18。
108.一种包含分离的VH编码多核苷酸和分离的VL编码多核苷酸的组合物，其特征在于，所述VH编码多核苷酸编码含有VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列的VH多肽，这些氨基酸序列分别由SEQ ID NO：6、7和8组成；其中所述VL编码多核苷酸编码包含VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列的VL多肽，这些氨基酸序列分别由SEQ ID NO：14、
15和16组成；且其中所述VH和VL编码多核苷酸编码的抗体或其片段特异性结合CD100。
109.如权利要求104-108中任一项所述的组合物，其特征在于，所述VH编码多核苷酸还包含编码融合于所述抗体VH多肽的信号肽的核酸。
110.如权利要求104-108中任一项所述的组合物，其特征在于，所述VL编码多核苷酸还包含编码融合于所述抗体VL多肽的信号肽的核酸。
111.如权利要求104-110中任一项所述的组合物，其特征在于，所述VH编码多核苷酸还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH1结构域的核酸。
112.如权利要求104-111中任一项所述的组合物，其特征在于，所述VH编码多核苷酸还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH2结构域的核酸。
113.如权利要求104-112中任一项所述的组合物，其特征在于，所述VH编码多核苷酸还包含编码融合于所述VH多肽的重链恒定区CH3结构域的核酸。
114.如权利要求104-113中任一项所述的组合物，其特征在于，所述VH编码多核苷酸还包含编码融合于所述VH多肽的重链绞链区的核酸。
115.如权利要求113或114所述的组合物，其特征在于，所述重链恒定区是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgE或IgD。
116.如权利要求104-115中任一项所述的组合物，其特征在于，所述VL编码多核苷酸还包含编码融合于所述VL多肽的轻链恒定区结构域的核酸。
117.如权利要求116所述的组合物，其特征在于，所述轻链恒定区是人κ。
118.如权利要求104-117中任一项所述的组合物，其特征在于，所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸位于单一载体上。
119.如权利要求104-117中任一项所述的组合物，其特征在于，所述VH编码多核苷酸位于第一载体而所述VL编码多核苷酸位于第二载体，所述第二载体与所述第一载体不同。
120.如权利要求118或119所述的组合物，其特征在于，所述VH编码多核苷酸操作性连接于第一启动子而所述VL编码多核苷酸操作性连接于第二启动子。
121.如权利要求120所述的组合物，其特征在于，所述第一和第二启动子是同一个启动子的拷贝。
122.如权利要求120所述的组合物，其特征在于，所述第一和第二启动子不同。
123.如权利要求118-122中任一项所述的组合物，其特征在于，所述第一载体和所述第二载体包含于单一宿主细胞中。
124.如权利要求118-122中任一项所述的组合物，其特征在于，所述第一载体和所述第二载体包含于单独的宿主细胞中。
125.如权利要求104-124中任一项所述的组合物，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人和鼠CD100。
126.如权利要求118所述的载体。
127.如权利要求119所述的第一载体。
128.如权利要求119所述的第二载体。
129.如权利要求126所述的载体，其特征在于，所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸框内融合，由操作性相连的单一启动子共同转录，并共同翻译成单链抗体或其抗原结合片段。
130.如权利要求126所述的载体，其特征在于，所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸由操作性相连的单一启动子共同转录，但单独翻译。
131.如权利要求126所述的载体，其特征在于，所述载体还包含位于所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸之间的IRES序列。
132.如权利要求126所述的载体，其特征在于，所述VH编码多核苷酸和所述VL编码多核苷酸是单独转录的，各自操作性连接于单独的启动子。
133.一种产生特异性结合CD100的抗体或其片段的方法，其包括培养权利要求121所述的宿主细胞，和回收所述抗体或其片段。
134.一种产生特异性结合CD100的抗体或其片段的方法，其包括共同培养权利要求
123所述的单独的宿主细胞，和回收所述抗体或其片段。
135.一种产生特异性结合CD100的抗体或其片段的方法，其包括单独培养权利要求
124所述的单独的宿主细胞、合并所述VH和VL编码多肽和回收所述抗体或其片段。
136.一种宿主细胞，其包含权利要求126或129-132中任一项所述的载体、权利要求
127所述的第一载体或权利要求128所述的第二载体。
137.一种产生特异性结合CD100的抗体或其片段的方法，其包括培养权利要求136所述的宿主细胞，和回收所述抗体或其片段。
138.一种由权利要求137所述方法产生的特异性结合CD100的抗体或其片段。
139.一种在动物内中和CD100的方法，包括将包含以下成分的组合物给予所述动物：
a)权利要求3-56、103和138中任一项所述的分离的抗体或其片段；和
b)药学上可接受的运载体。
140.一种在需要治疗的动物中治疗自身免疫病症或炎性疾病的方法，所述方法包括给予所述动物一种组合物，该组合物包含：
a)权利要求3-56、103和138中任一项所述的分离的抗体或其片段；和
b)药学上可接受的运载体。
141.如权利要求140所述的方法，其特征在于，所述自身免疫病或所述炎性疾病是多发性硬化。
142.如权利要求140所述的方法，其特征在于，所述自身免疫病或所述炎性疾病是关节炎。
143.如权利要求142所述的方法，其特征在于，所述自身免疫病或所述炎性疾病是类风湿性关节炎。
144.一种在需要治疗的动物中治疗癌症的方法，所述方法包括给予所述动物一种组合物，该组合物包含：
a)权利要求3-56、103和138中任一项所述的分离的抗体或其片段；和
b)药学上可接受的运载体。
145.一种在需要治疗癌症的动物中抑制血管新生的方法，所述方法包括给予所述动物一种组合物，该组合物包含：
a)权利要求3-56、103和138中任一项所述的分离的抗体或其片段；和
b)药学上可接受的运载体。
146.如权利要求139-145中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗体或其片段抑制CD100与CD100受体的结合。
147.如权利要求146所述的方法，其特征在于，所述CD100受体是丛蛋白-B1。
148.如权利要求139-147中任一项所述的方法，其特征在于，所述动物是哺乳动物。
149.如权利要求148所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
抗-CD100抗体和其使用方法
[0001] 发明背景
[0002] CD100，也称为脑信号蛋白4D(SEMA4D)，是属于脑信号蛋白基因家族的跨膜蛋白(如SEQ ID NO：1(人)；SEQ ID NO：2(鼠))。CD100在细胞表面上以同源二聚体的形式表达，但细胞活化后，CD100可通过蛋白水解切割从细胞表面上释放，产生活性该蛋白的可溶形式sCD100。参见Suzuki等，Nature Rev.Immunol.3：159-167(2003)；Kukutani等，Nature Immunol.9：17-23(2008)。
[0003] 最初，通过产生对抗活化人T细胞克隆的两种小鼠单克隆抗体BD16和BB18鉴定CD100(Herold等，Int.Immunol.7：1-8(1994))。CD100是免疫系统所表达脑信号蛋白中的首例。CD100在静息T细胞表面上表达丰富，在静息B细胞、单核细胞和专性抗原提呈细胞如树突细胞(DC)上表达较弱。细胞活化可刺激上调CD100在B细胞和树突细胞表面上的表达，以及sCD100的产生。认为CD100既可用作受体通过其胞质结构域传递信号、又可用作配体(Hall等，PNAS 93：11780-11785(1996))。已鉴定的CD100的受体之一是丛蛋白-B1。丛蛋白-B1在非淋巴样组织中表达，是CD100的高亲和(1nM)受体(Tamagnone等，Cell 99：
71-80(1999))。
71-80(1999))。
[0004] CD100是T细胞和B细胞活化的重要介导物。CD100敲除(CD100-/-)小鼠对T依赖性抗原的抗体应答降低，并且T细胞初敏受损。这两项功能在给予sCD100后得到恢复(Shi等，Immunity 13：633-642(2000))。
[0005] 除了已证明的CD100对免疫细胞的作用外，CD100也显示在神经炎性疾病中观察到的脱髓鞘和轴突变性中起到直接作用。炎性脱髓鞘疾病，如MS的发病机理包括涉及免疫细胞的炎性期和选择性脱髓鞘和神经变性的时期。CD100在中枢神经系统(CNS)少突胶质细胞中表达，是轴突变性的抑制剂。CD100表达在脊髓损伤外周的少突胶质细胞中上调(Moreau-Fauvarque等，J.Neuroscience 23：9229-9239(2003))。将表达sCD100的长期活化T细胞与人多能神经前体或来自大鼠脑的原代少突胶质细胞一起培养能诱导凋亡和突起伸长破坏(process extension collapse)(Giraudon等，J.Immunol.172：1246-1255(2004)；Giraudon等，NeuroMolecular Med.7：207-216(2005))。BD16抗-CD100抗体可抑制CD100诱导的神经前体凋亡。
[0006] CD100敲除小鼠能抵抗实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，这是人多发性硬化(MS)的小鼠模型(Kumanogoh等，J.Immulol.169：1175-1181(2002))。
[0007] 其它多项研究已证明，CD100能诱导神经元的生长锥破坏，且据报道在HTLV-1相关脊髓病/热带痉挛性轻截瘫(HAM/TSP)患者的脑脊液(CSF)中sCD100水平急剧升高，进一步支持CD100在神经炎症中的功能相关性。因此，sCD100对少突胶质细胞和神经前体完整性具有直接有害作用，并且CD100可能在脱髓鞘中起致病作用。作为炎症反应和直接脱髓鞘的重要介导物，本领域需要用于治疗炎性疾病和脱髓鞘疾病的CD100中和分子，如抗-CD100抗体。
[0008] CD100也是有效的促血管新生分子。通过CD100结合激活丛蛋白-B1可在体内和体外反式激活c-Met、促进肿瘤细胞的侵袭能力、还能促进血管新生。在较大肿瘤样本中的CD100免疫组化分析揭示出CD100过度表达是头颈癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌和肺癌中非常常见的事件。
[0009] CD100/丛蛋白B1信号转导也能诱导内皮细胞迁移，并促进肿瘤细胞迁移(Conrotto 等，Blood 105：4321-4329(2005)；Giordano 等，Nature Cell Biology4：720-724(2002))。通过CD100-阻断抗体和CD100敲减，可防止CD100诱导的内皮细胞迁移。植入裸小鼠之前，用CD100短发夹RNA(shRNA)敲减头颈鳞状细胞癌(HNSCC)细胞的CD100表达导致肿瘤血管化程度和肿瘤生长水平显著降低(Basile等，PNAS 103：
9017-9022(2006))。近期的报道指出肿瘤基质的炎性浸润和高血管化等级之间紧密相关。
CD100由肿瘤微环境中存在的炎性细胞产生。在缺少CD100的环境中，小鼠乳腺癌细胞产生肿瘤体和转移灶的能力被严重削弱，CD100的来源是肿瘤相关巨噬细胞(Sierra等，JEM205：1673-1685(2008))。因此，本领域还需要用于治疗CD100癌症的CD100中和分子，如抗-CD100抗体。
发明领域
9017-9022(2006))。近期的报道指出肿瘤基质的炎性浸润和高血管化等级之间紧密相关。
CD100由肿瘤微环境中存在的炎性细胞产生。在缺少CD100的环境中，小鼠乳腺癌细胞产生肿瘤体和转移灶的能力被严重削弱，CD100的来源是肿瘤相关巨噬细胞(Sierra等，JEM205：1673-1685(2008))。因此，本领域还需要用于治疗CD100癌症的CD100中和分子，如抗-CD100抗体。
发明领域
[0010] 本发明涉及CD100中和抗体，如人源化单克隆抗体，所述抗体的使用方法，和治疗CD100表达细胞相关病症和疾病的方法。
[0011] 发明概述
[0012] 提供治疗CD100相关疾病的组合物和方法，包括某些类型的自身免疫病、炎性疾病、癌症和侵袭性血管新生。具体说，已经开发了抗-CD100单克隆抗体来中和CD100。小鼠MAb67在体外显示出阻断CD100活性的能力，并在小鼠模型中减轻实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、胶原诱导性关节炎(CIA)和癌症的临床征象的严重性。MAb 2503是人源化的MAb67，已证明它与人和鼠CD100的亲和力提高，并且与MAb 67具有相似的CD100阻断活性。
[0013] 在一个实施方式中，本发明提供分离的结合分子，其与选自2503、67或76的参比单克隆抗体相同的CD100表位特异性结合。
[0014] 在另一实施方式中，本发明提供特异性结合CD100的分离的结合分子，所述结合分子竞争性抑制选自2503、67或76的参比单克隆抗体特异性结合CD100。
[0015] 在另一实施方式中，本发明提供特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段是单克隆抗体2503、67或76。
[0016] 在某些实施方式中，本发明所述特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，该重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：25至少90％相同。在本发明的另一方面，所述抗体或其片段的VH包含除20个或更少保守性氨基酸取代外，与SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：25相同的氨基酸序列。在本发明的另一方面，所述抗体或其片段的VH包含氨基酸序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：25，或由其组成。
[0017] 在某些实施方式中，本发明所述特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，该轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：29至少90％相同。在本发明的另一方面，所述抗体或其片段的VL包含除20个或更少保守性氨基酸取代外，与SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：29相同的氨基酸序列。在本发明的另一方面，所述抗体或其片段的VL包含氨基酸序列SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：29，或由其组成。
[0018] 在另一实施方式中，本发明提供特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VH包含以下CDR中至少一个：除2个或更少氨基酸取代外，与SEQ ID NO：6相同的Chothia-Kabat重链互补决定区-1(VH-CDR1)氨基酸序列；除4个或更少氨基酸取代外，与SEQ ID NO：7相同的Kabat重链互补决定区-2(VH-CDR2)氨基酸序列；或者除2个或更少氨基酸取代外，与SEQ ID NO：8相同的Kabat重链互补决定区-3(VH-CDR3)氨基酸序列。
[0019] 在另一实施方式中，本发明提供特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VL包含以下CDR中至少一个：除4个或更少氨基酸取代外，与SEQ ID NO：14相同的Kabat轻链互补决定区-1(VL-CDR1)氨基酸序列；除2个或更少氨基酸取代外，与SEQ ID NO：15相同的Kabat轻链互补决定区-2(VL-CDR2)氨基酸序列；或者除2个或更少氨基酸取代外，与SEQ ID NO：16相同的Kabat轻链互补决定区-3(VL-CDR3)氨基酸序列。
[0020] 在另一方面，本发明抗体或其片段的VH包含VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列，在一个或多个所述VH-CDR中，除2个或更少氨基酸取代外，它们分别包含SEQ ID NO：6、7和8。另一方面，所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分别是SEQ ID NO：6、7和8。
[0021] 在另一方面，本发明抗体或其片段的VL包含VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列，在一个或多个所述VL-CDR中，除2个或更少保守性氨基酸取代外，它们分别包含SEQ ID NO：14、15和16。另一方面，所述VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别是SEQ ID NO：14、15和16。
[0022] 在另一实施方式中，本发明提供特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VH包含以下CDR中至少一个：除2个或更少氨基酸取代外，与SEQ ID NO：26相同的Kabat重链互补决定区-1(VH-CDR1)氨基酸序列；除4个或更少氨基酸取代外，与SEQ ID NO：27相同的Kabat重链互补决定区-2(VH-CDR2)氨基酸序列；或者除2个或更少氨基酸取代外，与SEQ ID NO：28相同的Kabat重链互补决定区-3(VH-CDR3)氨基酸序列。
[0023] 在另一实施方式中，本发明提供特异性结合CD100的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的VL包含以下CDR中至少一个：除4个或更少氨基酸取代外，与SEQ ID NO：30相同的Kabat轻链互补决定区-1(VL-CDR1)氨基酸序列；除2个或更少氨基酸取代外，与SEQ ID NO：31相同的Kabat轻链互补决定区-2(VL-CDR2)氨基酸序列；或者除2个或更少氨基酸取代外，与SEQ ID NO：32相同的Kabat轻链互补决定区-3(VL-CDR3)氨基酸序列。
[0024] 在另一方面，本发明抗体或其片段的VH包含VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列，在一个或多个所述VH-CDR中，除4个或更少氨基酸取代外，它们分别包含SEQ ID NO：26、27和28。另一方面，所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分别是SEQ ID NO：
26、27和28。
26、27和28。
[0025] 在另一方面，本发明抗体或其片段的VL包含VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列，在一个或多个所述VL-CDR中，除4个或更少氨基酸取代外，它们分别包含SEQ ID NO：30、31和32。另一方面，所述VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别是SEQ ID NO：
30、31和32。
30、31和32。
[0026] 在另一方面，本发明抗体或其片段结合人和鼠CD100。在另一方面，本发明抗体或其片段特异性结合CD100多肽或其片段或者CD100变体多肽的亲和力特征是解离常数(KD)-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7不 大 于 5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、5.7x10 M、-12 -12 -13 -13 -14 -14 -15 -15
8.4x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M或10 M。在某些方面，所述CD100多肽或其片段或者CD100变体多肽是人或鼠的。在其它方面，CD100多肽或其片段或-9 -9
者CD100变体多肽是人的，所述KD为约5x10 M至6x10 M。在另一方面，CD100多肽或其片-9 -9
段或者CD100变体多肽是鼠的，所述KD为约1x10 M至2x10 M。
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、5.7x10 M、-12 -12 -13 -13 -14 -14 -15 -15
8.4x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M或10 M。在某些方面，所述CD100多肽或其片段或者CD100变体多肽是人或鼠的。在其它方面，CD100多肽或其片段或-9 -9
者CD100变体多肽是人的，所述KD为约5x10 M至6x10 M。在另一方面，CD100多肽或其片-9 -9
段或者CD100变体多肽是鼠的，所述KD为约1x10 M至2x10 M。
[0027] 在另一方面，本发明抗体或其片段是人源化的、灵长化的或嵌合的。
[0028] 在另一实施方式中，本发明提供包含本发明抗体或其片段以及运载体的组合物。
[0029] 在另一实施方式中，本发明提供一种分离的多核苷酸，其包含编码本发明抗体VH或VL多肽的核酸。在另一方面，本发明多核苷酸包含编码本发明抗体或其片段的核酸或者由其组成。另一方面，本发明提供包含本发明多核苷酸的载体。在另一方面，本发明提供包含本发明载体的宿主细胞。在另一方面，本发明提供一种产生本发明抗体的方法。
[0030] 在另一实施方式中，本发明提供一种在需要治疗的动物中治疗自身免疫病症或炎性疾病的方法，所述方法包括给予所述动物一种组合物，该组合物包含：本发明的分离的抗体或其片段和药学上可接受的运载体。在其它实施方式中，所述自身免疫病或炎性疾病是多发性硬化或关节炎。
[0031] 在另一实施方式中，本发明提供一种在需要治疗的动物中治疗癌症的方法，所述方法包括给予所述动物一种组合物，该组合物包含：本发明的分离的抗体或其片段和药学上可接受的运载体。
[0032] 在另一实施方式中，本发明提供一种在需要治疗癌症的动物中抑制血管新生的方法，所述方法包括给予所述动物一种组合物，该组合物包含：本发明的分离的抗体或其片段和药学上可接受的运载体。
[0033] 另一方面，本发明抗体或其片段抑制CD100与CD100受体的结合。在本发明的另一方面，所述CD100受体是丛蛋白-B1。
[0035] 图1.CD100阻断实验图示。CD100-组氨酸显示与表达丛蛋白B1的稳定细胞系(293/丛蛋白)细胞表面上丛蛋白B1的结合。用生物素偶联的抗-组氨酸标签特异性单克隆抗体和链霉亲和素-APC检测结合于丛蛋白B1的CD100-组氨酸。经流式细胞术检测，能够阻断CD100-组氨酸与丛蛋白B1结合的抗-CD100MAb产生的与293/丛蛋白细胞相关的荧光较低。
[0036] 图2.显示在图1所示的CD100阻断实验中检测兔抗-组氨酸+链霉亲和素-APC(Rb抗-组氨酸+sAPC)、小鼠CD100(只有muCD100)、小鼠CD100+0.625μg/ml MAb(MAb 67、MAb 76和mIgG同种型)和小鼠CD100+0.156μg/ml MAb(MAb 67、MAb 76和mIgG同种型)的流式细胞分析结果。单克隆抗体67和76阻断小鼠CD100与丛蛋白B1受体的结合。
[0037] 图3.MAb 67(67-2)和76(76-1)的吸光度比同种型对照增加说明，单克隆抗体67和76阻断小鼠CD100介导的293/丛蛋白B细胞从纤连蛋白包被平板上解离。
[0038] 图4.临床评分降低说明，与小鼠IgG对照的治疗相比，在SJL小鼠中用30mg/kg抗-CD100MAb 76(1X/周或2X/周)或MAb 67(1X/周或2X/周)治疗能减轻复发缓解型EAE(4A)。通过各个MAb治疗的小组平均分(GMS)的降低百分数在第21天和研究结束之间的比较，进一步说明该结果(4B)。
[0039] 图5.临床评分降低说明，与小鼠IgG对照的治疗相比，在SJL小鼠中用30mg/kg抗-CD100MAb 76(1X/周)或MAb 67(1X/周)治疗能减轻复发缓解型EAE(5A)。通过两个MAb治疗的小组平均分(GMS)的降低百分数在第18天和研究结束之间，，进一步说明该结果(5B)。
[0040] 图6.临床评分降低说明，与小鼠IgG对照的治疗相比，在SJL小鼠中从免疫后第7天开始用30mg/kg抗-CD100MAb 67(1X/周)治疗能减轻复发缓解型EAE。
[0041] 图7.ELISA结果显示由于MAb 2503、MAb 67或IgG对照的竞争性结合，生物素化的67与人CD100(7A)或小鼠CD100(7B)结合的阻断百分数(％)。
[0042] 图8.显示在图1所示的CD100阻断实验中检测的链霉亲和素-APC(只有sAPC)、人CD100(huCD100)、狨CD100(marmCD100)、小鼠CD100(muCD100)、1.0μg同种型和1.0μg MAb(67或2503)的流式细胞分析结果。MAb 67和MAb2503阻断人CD100(8A)、狨(8B)或小鼠(8C)CD100与丛蛋白B1受体的结合。
[0043] 图9.显示由于MAb 67、MAb 2503和IgG对照中和CD100，CD100造成吸光度降低被阻断。抗-CD100 MAb 67和MAb 2503阻断人CD100(9A)和狨CD100(9B)介导的293/丛蛋白细胞从纤连蛋白包被平板上解离。
[0044] 图10.显示将50,000个CT26结肠肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后，野生型Balb/3
c小鼠和CD100-/-小鼠的肿瘤体积变化(mm)。
c小鼠和CD100-/-小鼠的肿瘤体积变化(mm)。
[0045] 图11.显示将50,000个CT26肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后，用1mgMAb 67或1mg对照小鼠IgG治疗的野生型Balb/c小鼠和CD100-/-小鼠(″KO″)的平均腿体积变
3
化(mm)。
3
化(mm)。
[0046] 图12.胶原诱导型关节炎(CIA)总体治疗方案的示意图。
[0047] 图13.显示在600μg MAb 67治疗组中，CIA模型中关节炎疾病发展减缓。600μg MAb 67治疗小鼠的关节炎指数(AI)与600μg阴性对照(IgG1)和600μg阳性对照依那西普 治疗小鼠的AI在第20天开始治疗时的比较(13A)。在第20天或AI≥3时开始治疗时，比较MAb 67治疗与阴性对照(IgG1)和阳性对照依那西普 治疗的关节炎指数(AI)结果(13B)。
[0048] 图14.用铝(氢氧化铝/氢氧化镁)沉淀的(4-羟基-3-硝基苯基)乙酰基偶联的鸡γ球蛋白(″NP-CGG″)对Balb/c小鼠进行初次免疫(14A)和二次免疫(14B)后，600μg MAb 67治疗降低脾脏(SP)和淋巴结(LN)中生发中心(GC)B细胞(″B220+CD38低PNA+″)的数量。也显示了使用或不用NP-CGG免疫的CD100-/-小鼠和Balb/c小鼠的结果。
[0049] 图15.显示将50,000个CT26结肠肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后，野生型Balb/3
c小鼠的肿瘤体积变化(mm)。显示从第1天开始每周注射1mg MAb 67的小鼠与注射IgG对照的小鼠相比的结果。该研究进行至肿瘤生长延迟结束。
c小鼠的肿瘤体积变化(mm)。显示从第1天开始每周注射1mg MAb 67的小鼠与注射IgG对照的小鼠相比的结果。该研究进行至肿瘤生长延迟结束。
[0050] 图16.显示将50,000个BCA34成纤维细胞肿瘤细胞皮下注射到小鼠腹部区域后，3
野生型Balb/c小鼠和CD100-/-小鼠(″SEMA4D-/-″)的肿瘤体积变化(mm)(16A)。显示将50,000个BCA34成纤维细胞肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后，用1mg MAb 67或1mg
3
对照小鼠IgG治疗的野生型Balb/c小鼠的平均大腿体积变化(mm)(16B)。
野生型Balb/c小鼠和CD100-/-小鼠(″SEMA4D-/-″)的肿瘤体积变化(mm)(16A)。显示将50,000个BCA34成纤维细胞肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后，用1mg MAb 67或1mg
3
对照小鼠IgG治疗的野生型Balb/c小鼠的平均大腿体积变化(mm)(16B)。
[0051] 图17.显示将50,000个EMT6小鼠乳腺癌肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后，野生3
型Balb/c小鼠和CD 100-/-小鼠(″SEMA4D-/-″)的肿瘤体积变化(mm)。
型Balb/c小鼠和CD 100-/-小鼠(″SEMA4D-/-″)的肿瘤体积变化(mm)。
[0052] 图18.显示在无胸腺裸小鼠中，向小鼠的胁部肌肉内皮下注射两个HN12头颈肿瘤3
后的肿瘤体积变化(mm)。显示从移植后第1天开始每周注射1mgMAb 2503的小鼠与注射IgG4对照的小鼠相比的结果。
后的肿瘤体积变化(mm)。显示从移植后第1天开始每周注射1mgMAb 2503的小鼠与注射IgG4对照的小鼠相比的结果。
[0053] 图19.显示在无胸腺裸小鼠中，向小鼠的腿部肌肉内皮下注射两个HN6HIF1a3
mODD头颈肿瘤后的肿瘤体积变化(mm)。显示从移植后第1天开始每周注射1mg MAb 2503的小鼠与注射IgG4对照的小鼠相比的结果(19A)。来自IgG4对照和MAb 2503治疗的小鼠的代表性肿瘤照片(19B)。
mODD头颈肿瘤后的肿瘤体积变化(mm)。显示从移植后第1天开始每周注射1mg MAb 2503的小鼠与注射IgG4对照的小鼠相比的结果(19A)。来自IgG4对照和MAb 2503治疗的小鼠的代表性肿瘤照片(19B)。
[0054] 图20.大鼠中进行的MAb2503单次静脉内注射饱和分析的饱和百分数结果。通过静脉内单次注射将0、0.01、0.1、1.0、10和100mg/kg剂量MAb 2503给予Sprague-Dawley大鼠。对雄性(20A)和雌性(20B)大鼠在不同时间点的裂解全血进行基于流式细胞术的饱和实验，以确定细胞靶点(SEMA4D)被MAb 2503饱和的百分数。
[0055] 图21.猕猴中进行的MAb2503单次静脉内注射饱和分析的饱和百分数结果。通过单次静脉内注射将0、0.01、0.1、1.0、10和100mg/kg剂量的MAb 2503给予猕猴。在对不同时间点的裂解全血进行基于流式细胞术的饱和实验，以确定细胞靶点(SEMA4D)被MAb2503饱和的百分数(雄性和雌性数据合并)。
[0056] 发明详述
[0057] I.定义
[0058] 需要注意，术语“一个”或“一种”物质指一种或多种该物质；例如，“一种抗-CD100抗体”应理解为代表一种或多种抗-CD100抗体。例如，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。
[0059] 本文所用术语“肿瘤”是指无论恶性或良性的所有成瘤性细胞生长和增殖，以及所有的癌和癌前的细胞和组织。
[0060] “侵袭性血管新生”指支持病理状况，包括恶性和非恶性肿瘤的血管形成以及黄斑变性中新血管的异常形成。
[0062] 本文所用术语“多肽”包括单数形式和复数形式，涵盖酰胺键(也称肽键)线性连接的单体(氨基酸)所组成的分子。术语“多肽”指两个或多个氨基酸的任何一条链或多条链，而非具体长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或其它任何用于指两个或多个氨基酸的一条或多条链的术语均包含于“多肽”的定义内，术语“多肽”可与这些术语替代或互换使用。术语“多肽”还指多肽表达后修饰的产物，这些修饰包括但不限于糖基化，乙酰基化，磷酸化，酰胺化，通过已知保护/封闭基团衍生化，蛋白酶切割或非天然氨基酸修饰。多肽可能由天然生物来源衍生或由重组技术产生，但不一定由标明的核酸序列翻译而来。可以任何方式产生多肽，包括化学合成。
[0063] 本发明多肽的大小可以是约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个或者2,000个或更多个氨基酸。多肽可具有确定的三维结构，但它们不一定具有这种结构。具有确定三维结构的多肽称为折叠多肽，不具有确定的三维结构、但可采用大量不同构象的多肽称为非折叠多肽。本文所用术语“糖蛋白”指偶联于至少一个糖部分的蛋白质，所述糖部分通过某些氨基酸残基，如丝氨酸残基或天冬酰胺残基的含氧或含氮侧链连接于蛋白质。
[0064] “分离的”多肽或其片段、变体或衍生物指不在其天然环境中的多肽。不要求特定的纯化水平。例如，可从其自然或天然环境中取出分离多肽。根据本发明目的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，通过任何合适技术分离、分级、部分或基本上纯化的天然或重组多肽也是如此。
[0065] 本发明多肽也包括上述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，及其任何组合。提到本发明抗-CD100抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保持相应的本发明抗体或本发明抗体多肽的至少一部分抗原结合特性的任何多肽。除本文其它部分讨论的具体抗体片段外，本发明多肽的片段还包括蛋白酶水解片段，以及缺失片段。本发明抗-CD100抗体和抗体多肽的变体包括上述片段，以及具有因氨基酸取代、缺失或插入而改变氨基酸序列的多肽。变体可以是天然产生的或非天然产生的。可使用本领域所知的诱变技术产生非天然变体。变体多肽可包含保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。多肽变体本文中也称作“多肽类似物”。本文所用抗-CD100抗体或抗体多肽的“衍生物”指具有由官能性侧链基团反应化学衍生的一个或多个残基的对象多肽。“衍生物”还包括那些含有一个或多个20种标准氨基酸的天然氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；鸟氨酸可取代赖氨酸。本发明抗-CD100抗体和抗体多肽的衍生物可包括经改变具有本发明参比抗体或抗体多肽上不存在的额外特征的多肽。
[0066] 术语“多核苷酸”包括单个核酸和多个核酸，指分离的核酸分子或构建物，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(如酰胺键，如肽核酸(PNA)中的酰胺键)。术语“核酸”指多核苷酸中存在的任何一种或多种核酸区段，如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸指从其天然环境中取出的核酸分子，DNA或RNA。例如，根据本发明目的，包含在载体中的编码抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其它例子包括保持于异源宿主细胞的重组多核苷酸或纯化(部分或基本上纯化)在溶液中的多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明，分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
[0067] 本文所用术语“编码区”指由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但它可被认为是编码区的一部分，而任何侧接序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等均不是编码区的一部分。本发明的两个或多个编码区可安置在同一多核苷酸构建物中，例如在同一载体上，或者在单独的多核苷酸构建物中，例如在单独(不同)载体上。而且，任何载体可包含单个编码区，或者可包含两个或多个编码区，例如，单一载体可单独编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码与抗-CD100抗体或其片段、变体或衍生物的编码核酸融合或不融合的异源编码区。异源编码区包括但不限于专用的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能结构域。
[0068] 在某些实施方式中，所述多核苷酸或核酸是DNA。当指DNA时，包含多肽编码核酸的多核苷酸通常包含启动子和/或其它转录或翻译控制元件，这些元件与一个或多个编码区可操作地连接。可操作地连接指，当基因产物如多肽的编码区与一个或多个调控序列以此方式连接时，将使该基因产物的表达受到该调控序列的影响或控制。如果启动子功能的诱导使编码所需基因产物的mRNA转录，且如果两个DNA片段间连接的属性不干扰表达调控序列指导基因产物表达或不干扰转录DNA模板的能力，则两个DNA片段(如多肽编码区及其相连的启动子)“可操作地连接”。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，则启动子区域与多肽编码核酸可操作地连接。启动子可以是仅在预先确定的细胞中指导DNA实质转录的细胞特异性启动子。启动子以外的其它转录控制元件如增强子、操纵子、阻抑物和转录终止信号，可与多核苷酸可操作地连接以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其它转录控制区。
[0069] 许多转录控制区是本领域技术人员已知的。它们包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥作用的转录控制区，例如但不限于，来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子-A联用)、猿病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如劳氏肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括衍生自脊椎动物基因，例如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔β-珠蛋白的那些，以及能够在真核细胞中控制基因表达的其它序列。其它合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子，以及淋巴因子诱导型启动子(如干扰素或白介素诱导的启动子)。
[0070] 类似地，本领域普通技术人员了解各种翻译控制元件。它们包括但不限于：核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。
[0071] 在其它实施方式中，本发明多核苷酸是RNA，例如，信使RNA(mRNA)形式。
[0072] 本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码指导本发明多核苷酸编码多肽分泌的分泌或信号肽的其它编码区联合。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白质链向粗面内质网外的输出过程启动，就将这些序列从成熟蛋白质上切掉。本领域普通技术人员了解，脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合于所述多肽N末端的信号肽，它们从完整或“全长”多肽上切掉后产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方式中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或者使用仍然能够指导与其操作性相连的多肽分泌的该序列的功能衍生物。或者，可采用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列代替。
[0073] 广义来说，本发明″结合分子″或″抗原结合分子″指特异性结合抗原决定簇的分子。在一个实施方式中，所述结合分子特异性结合CD100，如大约150kDa的跨膜CD100多肽或大约120kDa的可溶性CD100多肽(通常称为sCD100)。在另一实施方式中，本发明结合分子是抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，本发明结合分子包括抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方式中，本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方式中，本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方式中，本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方式中，本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方式中，本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少六个CDR。
[0074] 本发明涉及某些抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非特别提到完整大小的抗体，如天然产生的抗体，术语“抗-CD100抗体”包括完整大小的抗体以及这种抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然产生的抗体或免疫球蛋白分子，或以类似于抗体分子的方式结合抗原的工程改造的抗体分子或片段。
[0075] 本文所用术语“人”或“完全人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，包括分离自人免疫球蛋白文库的抗体或不表达内源性免疫球蛋白的一种或多种人免疫球蛋白的转基因动物，如下文所述，例如，Kucherlapati等的美国专利5,939,598。“人”或“完全人”抗体也包括至少包含重链可变区或至少包含重链和轻链可变区的抗体，其中所述可变区具有人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列。
[0076] “人”或“完全人”抗体还包括如上所述包含本文所述抗体分子(如VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)或基本由其组成或由其组成的“人”或“完全人”抗体，所述抗体或其片段免疫学特异性结合于CD100多肽或其片段或变体。可利用本领域技术人员已知的标准技术在编码人抗-CD100抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于，导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，相对于参比VH区、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL区、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3，该变体(包括衍生物)编码少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于
3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。
3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。
[0077] 在某些实施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代，如下详述。或者，也可沿所有或一部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变引入，可筛选所得突变体的生物学活性，以鉴定保持活性(例如，结合CD100多肽，如结合人CD100、鼠CD100或同时结合人和鼠CD100的能力)的突变体。“人”或“完全人”抗体的这类变体(或其衍生物)也可称为“优化”或“为抗原结合所优化”的人或完全人抗体，包括与抗原亲和力提高的抗体。
[0078] 术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白至少包括重链可变区，通常至少包括重链和轻链的可变区。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是众所周知的。参见例如，Harlow等(1988)Antibodies：ALaboratory Manual(《抗体：实验室手册》)(第2版；冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))。
[0079] 正如下文中详细讨论的，术语“免疫球蛋白”包括可通过生化性质区分的各种类型的多肽。本领域技术人员应理解，重链分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ，μ，α，δ，ε)，其中还有一些小类(如γ1-γ4)。该链的特性决定抗体分“类”为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白小类(同种型)如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等已被良好表征，且已知能产生特殊功能特性。根据本文公开内容，本领域技术人员不难区分这些类和同种型的修饰形式，因此，它们涵盖在本发明范围内。所有免疫球蛋白类型明显属于本发明范围，以下讨论通常论及免疫球蛋白分子的IgG类。在IgG中，标准的免疫球蛋白分子包括分子量约为23,000道尔顿的两个相同的轻链多肽和分子量为53,000-70,000的两个相同的重链多肽。这四条链通常通过二硫键结合起来形成“Y”构型，其中轻链从Y的口部开始夹叉重链，并延续通过可变区。
[0080] 轻链分类为kappa或lambda(κ、λ)。各重链类可与κ或λ轻链结合。通常，通过杂交瘤、B细胞或遗传工程改造的宿主细胞产生免疫球蛋白时，轻链和重链互相共价结合，两条重链的“尾部”通过共价二硫键或非共价连接互相结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的分叉末端的N末端走向每条链底部的C末端。
[0081] 轻链和重链都可以分成结构和功能同源的区域。术语“恒定”和“可变”从功能角度使用。在这方面，应理解轻链(VL或VK)和重链(VH)部分的可变区决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区产生重要的生物学特性，例如分泌、跨胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。通常，恒定区结构域的编号越大，离抗体的抗原结合位点或氨基末端越远。N-末端部分是可变区，C-末端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基末端。
[0082] 如上所述，可变区允许抗体选择性识别和特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL和VH结构域、或这些可变区内的互补决定区(CDR)亚组组合形成确定三维抗原结合位点的可变区。在Y的每条臂末端形成的这种四联抗体结构构成抗原结合位点。更具体说，所述抗原结合位点由各VH和VL链带有的三个CDR决定。在一些情况下，例如在衍生自羊驼或根据羊驼免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子中，完整的免疫球蛋白分子可仅由重链构成而不含轻链。参见例如，Hamers-Casterman等，Nature 363：446-448(1993)。
[0083] 在天然产生的抗体中，每个抗原结合域上出现的六个“互补决定区”或“CDR”是短的非毗连氨基酸序列，随着抗体在水性环境中确定其三维构型时，它们特别定位以形成抗原结合域。抗原结合域中的其余氨基酸称为“构架”区，该区域的分子间变化较小。构架区主要采用β-片层构象，CDR形成环连接β-片层结构，并在某些情况下构成β-片层结构的部分。因此，构架区通过链间非共价相互作用形成支架为CDR提供正确定位。通过定位的CDR形成的抗原结合域能确定与免疫反应性抗原上表位互补的表面。这种互补表面促进抗体与其关联表位的非共价结合。本领域普通技术人员不难鉴定任何给定的重链或轻链可变区中包含CDR和构架区的氨基酸，因为它们已被精确定义(见下)。
[0084] 除非另有明确说明，在本领域使用和/或接受某术语的两种或多种定义的情况下，本文所用的该术语的定义应包括所有这些含义。具体例子是使用术语“互补决定区”(CDR)描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非毗连抗原结合位点。这一特定区域的描述可参见通过引用全文纳入本文的Kabat等(1983)美国健康和公共服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，Sequences of Proteins of Immunological Interest(“具有免疫学重要性的蛋白质序列”)，Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)()，互相比较时，所述定义包括重叠的氨基酸残基或氨基酸残基亚组。尽管如此，应用任一定义指代抗体或其变体的CDR均应落入本文所定义和使用的术语的范围。
合适氨基酸残基包括上文引用的各参考文献中定义的CDR，如下表1所示以作比较。包括特定CDR的准确残基编号取决于CDR的序列和大小。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可常规确定哪些残基包括哪个具体CDR。
合适氨基酸残基包括上文引用的各参考文献中定义的CDR，如下表1所示以作比较。包括特定CDR的准确残基编号取决于CDR的序列和大小。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可常规确定哪些残基包括哪个具体CDR。
[0085] 表1.CDR定义1
[0086]Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
[0087] 1表1中所有CDR定义的编号均根据Kabat等所述的编号规则(见下)。
[0088] Kabat等也定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可毫无疑义地将“Kabat编号”系统应用于任何可变区序列，而不依赖序列本身外的任何实验数据。本文所用的“Kabat编号”指Kabat等(1983)美国健康和公共服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，Sequences of Proteins of Immunological Interest(“具免疫学重要性的蛋白质序列”)中所述的编号系统。除非另有说明，提到本发明抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中具体氨基酸残基的编号时，均指按照Kabat编号系统的编号。
[0089] 本发明的抗体或抗原结合片段、变体、或其衍生物包括但不限于：多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长化或嵌合抗体，单链抗体，表位结合片段如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、Fab表达文库产生的片段和抗-独特型(抗-Id)抗体(包括例如，本文所述抗-CD100抗体的抗-Id抗体)。ScFv分子是本领域已知的，参见例如，美国专利号5,892,019。本发明抗体可以是任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2等)或小类的免疫球蛋白分子。
[0090] 本文所用术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包括下组中的至少一个：CH1结构域、铰链(如上部、中部和/或下部绞链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或者其变体或片段。例如，本发明所用的结合多肽可包括含有CH1结构域的多肽链；含有CH1结构域、绞链区的至少一部分和CH2结构域的多肽链；含有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；含有CH1结构域、绞链区的至少一部分和CH3结构域的多肽链，或者含有CH1结构域、绞链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一实施方式中，本发明多肽包括含有CH3结构域的多肽链。另外，本发明所用的结合多肽可能缺少CH2结构域的至少一部分(例如，所有CH2结构域或其部分)。如上所述，本领域技术人员应理解，可修饰这些结构域(例如重链部分)，以使它们的氨基酸序列不同于天然产生的免疫球蛋白分子。
[0091] 在本文公开的某些抗-CD100抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与该多聚体的第二条多肽链的相同。或者，本发明含有重链部分的单体不同。例如，各单体可包含不同的靶结合位点，形成，例如，双特异性抗体。
[0092] 本文公开的诊断和治疗方法中所用结合分子的重链部分可衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含衍生自IgG1分子的CH1结构域和衍生自IgG3分子的绞链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分衍生自IgG1分子、部分衍生自IgG3分子的绞链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分衍生自IgG1分子、部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。
[0093] 本文所用术语“轻链部分”包括衍生自免疫球蛋白轻链，如κ或λ轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链部分包含VL或CL结构域中的至少一个。
[0094] 本文所述的抗-CD100抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可根据它们识别或特异性结合的抗原如本文所述的靶多肽(如CD100)的表位或部分进行描述或说明。靶多肽与抗体的抗原结合域特异性相互作用的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶多肽可包含单个表位，但通常包含至少两个表位，并可包括任意数量的表位，这取决于抗原的大小、构象和类型。而且，应该注意到，靶多肽上的“表位”可以是或可包括非多肽元件，例如表位可包括糖侧链。
[0095] 据信，抗体的肽或多肽表位最小大约是4-5个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至少七个，更优选至少九个，最优选至少约15个至30个氨基酸。由于CDR能以三联形式识别抗原性肽或多肽，所以包含表位的氨基酸不一定是毗连的，在某些情况下甚至不一定在同一肽链上。本发明抗-CD100抗体识别的肽或多肽表位可包含CD100中至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或约15至30个毗连或非毗连的氨基酸的序列。
[0096] “特异性结合”通常指该抗体通过其抗原结合域结合于表位，并且该结合必然伴随着抗原结合域和表位之间的某种程度的互补。按照这一定义，抗体通过其抗原结合域与表位的结合易于与随机无关表位的结合时，称该抗体“特异性结合”该表位。本文术语“特异性”用于定性分析某种抗体与某种表位结合的相对亲和力。例如，可认为抗体“A”对某给定表位的特异性高于抗体“B”，或者可以说抗体“A”结合表位“C”的特异性高于它对相关表位“D”的特异性。
[0097] “优先结合”指与结合相关的、相似的、同源的或类似的表位相比，该抗体更容易特异性结合某表位。因此，与相关表位相比，“优先结合”给定表位的抗体更可能结合该表位，即便这种抗体可能与相关表位发生交叉反应。
[0098] 作为非限制性示例，如果抗体与第一表位结合的解离常数(KD)低于抗体与第二表位的KD，则可认为抗体优先结合第一表位。在另一个非限制性例子中，如果抗体与第一表位结合的亲和力使KD比抗体与第二表位的KD低至少一个数量级，则可认为抗体优先结合第一抗原。在另一个非限制性例子中，如果抗体与第一表位结合的亲和力使KD比抗体与第二表位的KD低至少两个数量级，则可认为抗体优先结合第一表位。
[0099] 在另一个非限制性例子中，如果抗体与第一表位结合的解离速率(k(off))比抗体与第二表位的k(off)低，则可认为抗体优先结合第一表位。在另一个非限制性例子中，如果抗体与第一表位结合的亲和力使k(off)比抗体与第二表位的k(off)低至少一个数量级，则可认为抗体优先结合第一表位。在另一个非限制性例子中，如果抗体与第一表位结合的亲和力使k(off)比抗体与第二表位的k(off)低至少两个数量级，则可认为抗体优先结合第一表位。可以说，本文所述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合本文公开的靶多肽(如CD100，如人、鼠或者人和鼠的CD100)或其片段或变体，其解离速率(k(off))低于-2 -1 -2 -1 -3 -1 -3 -1或等于5X10 s 、10 s 、5X10 s 或10 s 。更优选地，可以说，本发明抗体结合本文所述的靶多肽(如CD100，如人、鼠、或者人和鼠的CD100)或其片段或变体，其解离速率(k(off))-4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1 -6 -1 -6 -1 -7 -1 -7 -1
低于或等于5X10 s 、10 s 、5X10 s 、或10 s 、5X10 s 、10 s 、5X10 s 或10 s 。
低于或等于5X10 s 、10 s 、5X10 s 、或10 s 、5X10 s 、10 s 、5X10 s 或10 s 。
[0100] 可以说，本文所述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合本文公开的靶多肽(如CD100，如人、鼠或者人和鼠CD100)或其片段或变体，其结合速率(k(on))高于或等3 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1 4 -1 -1
于10M s 、5X10M s 、10M s 或5X10M s 。更优选地，可以说，本发明抗体结合本文公开的靶多肽(如CD100，如人、鼠或者人和鼠的CD100)或其片段或变体，其结合速率(k(on))
5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1 6 -1 -1 7 -1 -1
高于或等于10M s 、5X10M s 、10M s 或5X10M s 或10M s 。
于10M s 、5X10M s 、10M s 或5X10M s 。更优选地，可以说，本发明抗体结合本文公开的靶多肽(如CD100，如人、鼠或者人和鼠的CD100)或其片段或变体，其结合速率(k(on))
5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1 6 -1 -1 7 -1 -1
高于或等于10M s 、5X10M s 、10M s 或5X10M s 或10M s 。
[0101] 如果抗体优先结合给定表位以至于在某种程度上阻断参比抗体与该表位的结合，则称该抗体能竞争性抑制参比抗体与给定表位的结合。竞争性抑制可通过本领域已知的任何方法确定，例如竞争ELISA实验。可以说，抗体将参比抗体与给定表位的结合竞争性抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
[0102] 本文所用术语“亲和力”是单独表位与免疫球蛋白分子的CDR结合强度的衡量。参见例如，Harlow等(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版)，第27-28页。本文所用术语“亲合力”指免疫球蛋白群体和抗原间复合物的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度。参见例如，Harlow，第29-34页。亲合力既与群体中单独免疫球蛋白分子与特定表位的亲和力相关，也与免疫球蛋白分子和抗原的价态相关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复表位结构的抗原，例如多聚体之间的相互作用是高亲合力的一个例子。
[0103] 本发明的抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或其衍生物也可按照其交叉反应性进行描述或说明。本文所用术语“交叉反应性”指对某一种抗原具有特异性的抗体与第二种抗原发生反应的能力；它是两种不同抗原性物质之间相关性的衡量。因此，如果抗体结合于诱导其形成的表位以外的其他表位，则它具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，在某些情况下甚至比原始表位更适用。
[0104] 例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关但不相同的表位，例如，与参比表位至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％相同(按照本领域已知方法和本文所述方法计算)的表位。如果抗体不结合与参比表位少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％和少于50％相同(按照本领域已知方法和本文所述方法计算)的表位，则可以说该抗体具有很小的交叉反应性或不具有交叉反应性。如果某抗体不结合某表位的任何其它类似物、直向同源物或同源物，则可认为该抗体对该表位“高度特异”。
[0105] 本发明的抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可根据与本发明多肽，例如，CD100，如人、鼠或者人和鼠的CD100的结合亲和力进行描述或说明。-2 -2 -3 -3 -4 -4
优选的结合亲和力包括解离常数或Kd低于5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-5 -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 -10 -10
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-11 -11 -12 -12 -13 -13 -14 -14 -15 -15
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M或10 M的那些。在某些实施方式中，本发明的抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段结合人CD100的-9 -9
Kd约为5x10 至6x10 。在另一实施方式中，本发明的抗-CD100结合分子，如抗体或其抗-9 -9
原结合片段结合鼠CD100的Kd约为1x10 至2x10 。
优选的结合亲和力包括解离常数或Kd低于5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-5 -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 -10 -10
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-11 -11 -12 -12 -13 -13 -14 -14 -15 -15
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M或10 M的那些。在某些实施方式中，本发明的抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段结合人CD100的-9 -9
Kd约为5x10 至6x10 。在另一实施方式中，本发明的抗-CD100结合分子，如抗体或其抗-9 -9
原结合片段结合鼠CD100的Kd约为1x10 至2x10 。
[0106] 本发明的抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可能是“多特异性”的，例如是双特异性、三特异性或更多特异性的，这意味着它能同时识别和结合一种或多种不同抗原(如蛋白质)上出现的两种或更多种不同表位。因此，抗-CD100抗体是“单特异性”还是“多特异性”如“双特异性”，是指结合多肽发生反应的不同表位的数量。多特异性抗体可以是对本文所述的靶多肽的不同表位有特异性，或是对靶多肽以及异源表位，例如异源多肽或固体支持材料有特异性。
[0107] 本文所用术语“价态”指结合多肽或CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段中存在的潜在结合域，如抗原结合域的数量。各结合域特异性结合一种表位。当结合多肽或CD100结合分子包含一个以上结合域时，对具有两个结合域的抗体来说各结合域可特异性结合同一表位时，称为“二价单特异性”，或对具有两个结合域的抗体来说特异性结合不同表位时，称为“二价双特异性”。抗体或其抗原结合片段也可以是双特异性，每种特异性有二价(称为“双特异性四价抗体”)。在另一实施方式中，可制备四价小抗体或结构域缺失抗体。
[0108] 双特异性二价抗体及其制备方法可参见例如，美国专利号5,731,168；5,807,706；5,821,333；以及美国专利申请公开号2003/020734和2002/0155537，通过引用将其全部内容纳入本文。双特异性四价抗体及其制备方法可参见例如，WO 02/096948和WO 00/44788，通过引用将其全部内容纳入本文。总地参见，国际公开号WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、WO 92/05793；Tutt等，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利号4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920和5,601,819；以及Kostelny等，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
[0109] 如前所述，各种免疫球蛋白类的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。本文所用术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变区，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(最靠氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域邻近VH结构域，并且位于免疫球蛋白重链分子的绞链区的氨基末端。
[0110] 本文所用术语“CH2结构域”包括用常规编号方案大概从抗体的残基244延伸至残基360的重链分子部分(残基244至360，Kabat编号系统；和残基231-340，EU编号系统；参见Kabat EA等)。CH2结构域是独特的，因为它与其它结构域不是紧密配对的。恰恰相反，两个N-连接的分支糖链间插在完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。CH3结构域已有很多记载，它从IgG分子的CH2结构域向C末端延伸，并包含大约108个残基。
[0111] 本文所用术语“绞链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的重链分子部分。该绞链区包括约25个残基并具有挠性，因此使两个N-末端抗原结合区能独立移动。绞链区可细分成三个不同结构域：上部、中部和下部绞链区(Roux等，J.Immunol.161：4083(1998))。
[0112] 本文所用术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包括可形成二硫键或与第二个巯基桥接的巯基。在大部分天然产生的IgG分子中，CH1和CL区域通过二硫键相连，两条重链通过对应于Kabat编号系统239和242位(EU编号系统是226或229位)的两个二硫键相连。
[0113] 本文所用术语“嵌合抗体”指免疫反应性区域或位点获自或衍生自第一物种，而恒定区(根据本发明，可能是完整的、一部分或修饰的)获自第二物种的任何抗体。在优选实施方式中，靶结合区域或位点来自非人来源(如小鼠或灵长动物)而恒定区是人的(例如，本文所述的单克隆抗体(MAb)2368)。
[0114] 本文所用术语“工程抗体”指如果必要，通过部分构架区置换和序列改变至少部分置换来自已知特异性抗体的一个或多个CDR，以改变重链或轻链或二者中的可变区的抗体。虽然CDR可衍生自与产生构架区的抗体属于同一类或亚类的抗体，但考虑到CDR衍生自不同类的抗体，优选衍生自不同物种的抗体。将已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR移植到人重链或轻链构架区内形成的工程抗体在本文中称为“人源化抗体”。可能不一定需要用来自供体可变区的完整CDR代替所有CDR就能将一种可变区的抗原结合能力转移给另一可变区。相反，可能只需要转移维持靶结合活性所必需的那些残基。
[0115] 进一步认识到，人源化抗体的重链或轻链或二者中可变区内的构架区可仅包含人来源的残基，在这种情况下人源化抗体的这些构架区称为“完全人构架区”(例如，MAb2503)。或者，如果需要，可以在人源化抗体的重链或轻链或二者的可变区的人构架区的相应位置内工程改造供体可变区的构架区的一个或多个残基，以维持适当的结合或提高与CD100抗原的结合。因此，以此方式工程改造的人构架区包含人和供体构架区残基的混合物，在本文中称为“部分人构架区”。
[0116] 例如，抗-CD100抗体的人源化过程可基本按照Winter和同事所述方法进行(Jones 等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann 等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，即用啮齿动物或突变型啮齿动物CDR或CDR序列代替人抗-CD100抗体的相应序列。也参见美国专利号5,225,539；5,585,089；
5,693,761；5,693,762；5,859,205；通过引用纳入本文。所得的人源化抗-CD100抗体将在人源化抗体的重链和/或轻链的可变区的完全人构架区内，包含至少一个啮齿动物或突变型啮齿动物CDR。在一些情况下，人源化抗-CD100抗体的一个或多个可变区的构架区内的残基被相应非人人(例如，啮齿动物)残基代替(参见例如，美国专利号5,585,089；
5,693,761；5,693,762；和6,180,370)，在这种情况下所得的人源化抗-CD100抗体将在重链和/或轻链的可变区内包含部分人构架区。
5,693,761；5,693,762；5,859,205；通过引用纳入本文。所得的人源化抗-CD100抗体将在人源化抗体的重链和/或轻链的可变区的完全人构架区内，包含至少一个啮齿动物或突变型啮齿动物CDR。在一些情况下，人源化抗-CD100抗体的一个或多个可变区的构架区内的残基被相应非人人(例如，啮齿动物)残基代替(参见例如，美国专利号5,585,089；
5,693,761；5,693,762；和6,180,370)，在这种情况下所得的人源化抗-CD100抗体将在重链和/或轻链的可变区内包含部分人构架区。
[0117] 而且，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有的残基。进行这些修饰，以进一步改善抗体性能(例如，获得所需亲和力)。通常，人源化抗体将基本上包含至少一个、通常两个可变区的全部，其中全部或基本上全部的CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，全部或基本上全部的构架区是人免疫球蛋白序列的构架区。人源化抗体还任选包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白的Fc。更多的细节参见Jones等，Nature，331：522-525(1986)；Riechmann 等，Nature，332：323-329(1988)； 和 Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)，通过引用全文纳入本文。因此，这类“人源化”抗体可包括其中明显小于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列所取代的抗体。实践中，人源化抗体通常是一些CDR残基和可能的一些构架残基被啮齿动物抗体中相似位点的残基所取代的人抗体。参见例如，美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；
5,859,205。也参见美国专利号6,180,370和国际公开号WO 01/27160，其中公开了人源化抗体和用于产生对预定抗原亲和力提高的人源化抗体的技术。
5,859,205。也参见美国专利号6,180,370和国际公开号WO 01/27160，其中公开了人源化抗体和用于产生对预定抗原亲和力提高的人源化抗体的技术。
[0118] 本文所用术语“连接”、“融合的”和“融合”可以互换使用。这些术语指通过某些方式如化学偶联或重组将两个或更多的元件或组件结合在一起。“框内融合”指以维持原有ORF正确翻译读框的方式，将两个或多个多核苷酸开放阅读框(ORF)连接形成连续的较长ORF。因此，重组融合蛋白是包含两个或多个片段的单一蛋白质，所述片段对应原始ORF编码的多肽(这些片段在自然条件下通常不如此连接)。尽管阅读框为连续的融合片段，但片段仍可被物理或空间分割，如框内接头序列。例如，编码免疫球蛋白可变区CDR的多核苷酸可框内融合，但用编码至少一个免疫球蛋白构架区或额外CDR区的多核苷酸间隔开，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分共同翻译。
[0119] 在多肽的情况下，“线性序列”或“序列”是多肽中从氨基到羧基的方向上氨基酸的顺序，在序列中相邻的残基是多肽一级结构中的毗连残基。
[0120] 本文所用术语“表达”指基因产生生化物质如多肽的过程。该过程包括在细胞内基因的任何功能表现，包括但不限于，基因敲除以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于，基因转录成信使RNA(mRNA)和这类mRNA翻译成多肽。若最终期望产物是生化物质，则表达包括产生该生化物质和任何前体。基因表达产生“基因产物”。本文所用的基因产物可以是核酸，如基因转录产生的信使RNA，或由转录物翻译得到的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰，例如聚腺苷酸化的核酸，或具有翻译后修饰，如甲基化、糖基化、加入脂质、连接其它蛋白质亚基、经蛋白酶水解切割等的多肽。
[0121] 本文所用术语“治疗”和“治疗处理”都指治疗性处理和预防性或预防方法，其目的是防止或减缓(缓解)不期望的生理改变或病症，例如多发性硬化、关节炎或癌症的进展。有益或所需的临床结果包括但不限于可检测或不可检测地：缓解症状、减轻疾病程度、疾病状态稳定(即不恶化)、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态和缓解(部分或完全)。
“治疗”也可以指与不接受治疗的预计生存期相比延长生存期。需要治疗的人包括已经患有病症或失调的人，以及倾向于患有病症或失调的人或需预防病症或失调的人。
“治疗”也可以指与不接受治疗的预计生存期相比延长生存期。需要治疗的人包括已经患有病症或失调的人，以及倾向于患有病症或失调的人或需预防病症或失调的人。
[0122] “对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指需要诊断、预防或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、饲养动物、家畜和动物园动物、运动动物或宠物，如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等等。
[0123] 本文所用术语“给予抗-CD100抗体时能够获益的对象”和“需要治疗的动物”包括能够从给予抗-CD100抗体和/或从抗-CD100抗体治疗，即减轻或预防疾病的治疗中获益的对象，如哺乳动物对象，该抗体可用于(例如)检测抗-CD100多肽(如用于诊断方法)。如本文更详细描述的，抗-CD100抗体可以非偶联形式使用，或者可偶联于(例如)药物、前药或同位素。
[0124] II.靶多肽描述
[0125] 本文所用术语“CD100”和“CD100多肽”可互换使用。在某些实施方式中，CD100在细胞表面表达或由细胞分泌。在另一实施方式中，CD100结合于膜。在另一实施方式中，CD100是可溶的，如，sCD100。在其它实施方式中，CD100可包括全长CD100或其片段，或者CD100变体多肽，其中CD100的片段或CD100变体多肽保持全长CD100的一些或全部功能特性。
[0126] 全长人CD100蛋白是由两条150kDa的多肽链组成的同源二聚跨膜蛋白。CD100属于细胞表面受体的脑信号蛋白家族，也称为SEMA4D。人和小鼠Sema4D/CD100都可以由其跨膜形式经蛋白水解切割形成120-kDa可溶形式，表明存在两种Sema4D同种型(Kumanogoh等，J.Cell Science 116(7)：3464(2003))。脑信号蛋白由可溶性和膜结合的蛋白质组成，这些蛋白质最初定义为轴突-导向因子，它在建立神经元和其合适靶点之间的准确联系中起到重要作用。结构上视为IV类脑信号蛋白的CD100由氨基末端的信号序列，后接特征性‘Sema’结构域构成，其包含17个保守的半胱氨酸残基、Ig-样结构域、富赖氨酸臂(stretch)、疏水性跨膜区和胞质尾。
[0127] CD100的各多肽链包括约13个氨基酸的信号序列，后接约512个氨基酸的脑信号蛋白结构域、约65个氨基酸的免疫球蛋白-样(Ig-样)结构域、104个氨基酸的富赖氨酸臂、约19个氨基酸的疏水性跨膜区和110个氨基酸的胞质尾。胞质尾中酪氨酸磷酸化的共有位点支持预测的CD100与酪氨酸激酶的结合(Schlossman等编(1995)Leucocyte Typing V(《白细胞分型V》)(牛津的牛津大学出版社(Oxford University Press，Oxford))。
[0128] 已经鉴定了CD100的两类受体。一种受体--丛蛋白-B1在非淋巴样组织中表达，是CD100的高亲和(1nM)受体(Tamagnone等，Cell 99：71-80(1999))。已证明，CD100刺激丛蛋白B1信号转导能诱导神经元的生长锥破坏，并诱导少突胶质细胞的突起延伸破坏(process extension collapse)和凋亡(Giraudon等，J.Immunol.172：1246-1255(2004)；Giraudon等，NeuroMolecular Med.7：207-216(2005))。与CD100结合后，丛蛋白B1信号转导介导R-Ras的失活，导致整联蛋白介导的与胞外基质的附连降低，以及Rho激活，导致细胞骨架重排造成的细胞破坏。参见Kruger等，Nature Rev.Mol.Cell Biol.6：
789-800(2005)；Pasterkamp，TRENDS in Cell Biology 15：61-64(2005))。
789-800(2005)；Pasterkamp，TRENDS in Cell Biology 15：61-64(2005))。
[0129] 在淋巴组织中，CD72用作低亲和(300nM)CD 100受体(Kumanogoh等，Immunity13：621-631(2000))。B细胞和APC表达CD72，抗-CD72抗体具有与sCD100相同的许多作用，如增强CD40诱导的B细胞应答和B细胞排出CD23。认为CD72可通过征集能结合很多抑制性受体的酪氨酸磷酸酶SHP-1用作B细胞应答的负调节物。CD100与CD72的相互作用导致SHP-1的解离，从而丢失该负激活信号。已证明，CD100能在体外促进T细胞刺激以及B细胞的聚集和存活。加入表达CD100的细胞或sCD100能在体外增强CD40诱导的B细胞增殖和免疫球蛋白产量，并在体内加速抗体应答(Ishida等，Inter.Immunol.15：1027-1034(2003)；
Kumanogoh和H.Kukutani，Trends in Immunol.22：670-676(2001))。sCD100增强CD40诱导的DC成熟，包括上调共同刺激分子和增加IL-12分泌。此外，sCD100可抑制免疫细胞迁移，这种抑制作用可通过加入阻断性抗-CD100小鼠抗体得以逆转(Elhabazi等，J.Immunol.166：4341-4347(2001)；Delaire等，J.Immunol.166：4348-4354(2001))。
Kumanogoh和H.Kukutani，Trends in Immunol.22：670-676(2001))。sCD100增强CD40诱导的DC成熟，包括上调共同刺激分子和增加IL-12分泌。此外，sCD100可抑制免疫细胞迁移，这种抑制作用可通过加入阻断性抗-CD100小鼠抗体得以逆转(Elhabazi等，J.Immunol.166：4341-4347(2001)；Delaire等，J.Immunol.166：4348-4354(2001))。
[0130] Sema4D在淋巴器官和非淋巴器官中高水平表达，所述淋巴器官包括脾脏、胸腺和淋巴结，所述非淋巴器官包括例如，脑、心和肾。在淋巴器官中，Sema4D在静息T细胞上大量表达，但在静息B细胞和抗原提呈细胞(APC)，如树突细胞(DC)上表达很弱。
[0131] 细胞活化能提高CD100的表面表达，以及可溶性CD100(sCD100)的产生。CD100的表达模式提示，它在免疫系统中起到重要的生理学和病理学作用。已证明，CD100能促进B细胞活化、聚集和存活；增加CD40诱导的增殖和抗体产生；增强对T细胞依赖性抗原的抗体应答；增加T细胞增殖；增强树突细胞的成熟和刺激T细胞的能力；并且与脱髓鞘和轴突变性直接相关联(Shi等，Immunity 13：633-642(2000)；Kumanogoh等，J Immunol 169：1175-1181(2002)；和Watanabe等，J Immunol 167：4321-4328(2001))。
[0132] CD100敲除(CD100-/-小鼠已提供额外证据证明CD100在体液免疫和细胞免疫应答中均起到重要作用。尚不了解CD100-/-小鼠中非淋巴组织的任何异常。来自CD100-/-小鼠的树突细胞(DC)具有较差的同种异体刺激(allostimulatory)能力，并显示共同刺激分子的表达有缺陷，该缺陷可通过加入sCD100加以挽救。CD100缺陷小鼠(CD100-/-)无法产生髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白肽诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎，因为在不存在CD100时不产生髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白-特异性T细胞(Kumanogoh等，J Immunol169：1175-1181(2002))。还在易生自身免疫病的MRL/lpr小鼠(全身性自身免疫病如SLE的模型)的血清中检测到显著量的可溶性CD100，但在正常小鼠中检测不到。另外，sCD100水平与自身抗体水平相关，并随年龄增加(Wang等，Blood 97：3498-3504(2001))。还证明，可溶性CD100能在脱髓鞘疾病患者的脑脊液和血清中累积，而sCD100能诱导人全能神经前体(Dev细胞)凋亡，二者在体外都抑制突起延伸并诱导大鼠少突胶质细胞的凋亡(Giraudon等，JImmunol 172(2)：1246-1255(2004))。此种凋亡被抗-CD100MAb阻断。
[0133] III.抗-CD100抗体
[0134] 本领域记载了结合CD100的抗体。参见例如，美国公开号2008/0219971A1，国际专利申请WO 93/14125和Herold等，Int.Immunol.7(1)：1-8(1995)，通过引用全文纳入本文。
[0135] 本发明抗体包含结合于CD100的抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，如MAb 2503、MAb 67和MAb 76。在某些实施方式中，抗-CD100抗体结合人、鼠或者人和鼠的CD100。在其它实施方式中，抗-CD100抗体阻断CD100结合其受体如丛蛋白-B。
[0136] 在一个实施方式中，本发明提供分离的结合分子，如抗体或其抗原结合片段，它们特异性结合的CD100表位与单克隆抗体2503、67或76相同。在另一个实施方式中，本发明提供分离的结合分子，如抗体或其抗原结合片段，它们特异性结合CD100并竞争性抑制单克隆抗体2503、67或76特异性结合CD100如人、鼠或者人和鼠的CD100。
[0137] 在某些实施方式中，本发明结合分子的氨基酸序列与参比抗-CD100抗体分子的氨基酸序列的序列相同性至少约80％、约85％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％或约95％。在另一个实施方式中，所述结合分子与参比抗体的序列相同性为至少约96％、约97％、约98％、约99％或100％。
[0138] 在另一实施方式中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，它包含免疫球蛋白重链可变区(VH结构域)、基本由其组成或由其组成，其中所述VH结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO：9或10的CDR1、CDR2或CDR3至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％相同或完全相同的氨基酸序列。
[0139] 在另一实施方式中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，它包含免疫球蛋白重链可变区(VH结构域)、基本由其组成或由其组成，其中所述VH结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％相同或完全相同的氨基酸序列。
[0140] 在另一实施方式中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，它包含免疫球蛋白重链可变区(VH结构域)、基本由其组成或由其组成，其中所述VH结构域的至少一个CDR具有除1、2、3、4或5个保守氨基酸取代外，与SEQID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8相同的氨基酸序列。
[0141] 在另一实施方式中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，它包含VH结构域、基本由其组成或由其组成，该VH结构域具有与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的氨基酸序列，其中包含编码的VH结构域的抗-CD100抗体特异性或优先结合CD100。
[0142] 在另一实施方式中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，它包含免疫球蛋白轻链可变区(VL结构域)、基本由其组成或由其组成，其中所述VL结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO：17或18的CDR1、CDR2或CDR3至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％相同或完全相同的氨基酸序列。
[0143] 在另一实施方式中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，它包含免疫球蛋白轻链可变区(VL结构域)、基本由其组成或由其组成，其中所述VL结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％相同或完全相同的氨基酸序列。
[0144] 在另一实施方式中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，它包含免疫球蛋白轻链可变区(VL结构域)、基本由其组成或由其组成，其中所述VL结构域的至少一个CDR具有除1、2、3、4或5个保守氨基酸取代外，与SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16相同的氨基酸序列。
[0145] 在另一实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，它包含VL结构域、基本由其组成或由其组成，该VL结构域具有与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的氨基酸序列，其中包含编码的VL结构域的抗-CD100抗体特异性或优先结合CD100。
[0146] 本发明抗-CD100抗体的合适的生物活性变体可用于本发明方法。这种变体将保持母体抗-CD100抗体的所需结合性质。制备抗体变体的方法是本领域通常可获得的。
[0147] 诱变和改变核苷酸序列的方法是本领域众所周知的。参见例如，Walker和Gaastra编(1983)Techniques in Molecular Biology(《分子生物学技术》)(纽约麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Company))；Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)；Kunkel 等，Methods Enzymol.154：367-382(1987)；Sambrook 等 (1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y.))；美国专利号4,873,192；和其中引用的参考文献；通过引用全文纳入本文。有关不影响感兴趣多肽生物学活性的合适氨基酸取代的指南可参见下述文献中的模型：Dayhoff等(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白质序列和结构图册》)(华盛顿特区的国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.))，第345-352页，通过引用全文纳入本文。Dayhoff等的模型利用点接受突变(Point Accepted Mutation，PAM)氨基酸相似矩阵(PAM 250矩阵)来确定合适的保守性氨基酸取代。可能优选保守取代，如用具有相似特性的另一氨基酸交换某种氨基酸。Dayhoff等的模型中PAM 250矩阵教导的保守氨基酸取代的例子包括但不限于：
和
和
[0148] 在构建抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段的过程中，制得感兴趣多肽、修饰物以使变体仍具有所需特性，例如，能够特异性结合CD100，如人、鼠或者人和鼠的CD100，例如，在细胞表面表达或由细胞分泌的CD100，并具有CD100阻断活性，如本文所述。显然，编码变体多肽的DNA中出现的任何突变一定不能将序列置于阅读框外，优选不产生可产生二级mRNA结构的互补区。参见欧洲专利申请公开号75,444。
[0149] 测定抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段的结合特异性的方法包括但不限于：标准竞争结合实验、T细胞或B细胞的免疫球蛋白分泌的监测实验、T细胞增殖实验、凋亡实验、ELISA实验等。参见例如，WO 93/14125；Shi等，Immunity 13：633-642(2000)；Kumanogoh等，J Immunol 169：1175-1181(2002)；Watanabe等，J Immunol
167：4321-4328(2001)；Wang等，Blood97：3498-3504(2001)；和Giraudon等，J Immunol
172(2)：1246-1255(2004)公开的实验，通过引用将其全文纳入本文。
167：4321-4328(2001)；Wang等，Blood97：3498-3504(2001)；和Giraudon等，J Immunol
172(2)：1246-1255(2004)公开的实验，通过引用将其全文纳入本文。
[0150] 本文在讨论本文公开的任何具体多肽，包括恒定区、CDR、VH结构域或VL结构域是否与另一多肽至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或者甚至约100％相同时，相同性％可采用本领域已知的方法和计算机程序/软件测定，例如但不限于BESTFIT程序(威斯康星序列分析软件包，用于Unix系统的第8版，遗传学计算机团队(Genetics Computer Group)，大学研究园区(University Research Park)，科学大道575号(575 Science Drive)，威斯康星州麦迪逊)，53711)。BESTFIT利用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489的局部同源性算法，找到两条序列之间的最佳同源性区段。使用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定某具体序列是否与本发明参比序列(例如)95％相同时，当然要设定参数使得在参比多肽序列的全长上计算相同性百分数，并且在参比序列的氨基酸总数中允许至多有5％的同源性缺口。
[0151] 出于本发明目的，可采用史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法测定序列相同性百分数，该算法使用仿射缺口搜索，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。变体与参比抗-CD100抗体(如MAb 2503、67或76)可以相差，例如，少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个氨基酸残基，如6-10个，少至5个，少至4、3、2、或者甚至1个氨基酸残基。
[0152] 能够特异性结合CD100并保留所需CD100阻断活性的多肽的准确化学结构取决于多种因素。由于分子中存在可离子化的氨基和羧基，可获得酸盐或碱盐或中性形式的特定多肽。放入合适环境条件中保持生物学活性的所有这类制备物均落入本文所用的抗-CD100抗体的定义范围内。另外，可利用糖部分(糖基化)或其它补充分子如脂质、磷酸酯(盐)、乙酰基等衍生化，以扩充所述多肽的一级氨基酸序列。也可通过与糖偶联进行扩充。这种扩充的某些方面通过生产宿主的翻译后加工系统实现；其它这类修饰可在体外引入。在任何情况下，这类修饰均包括在本文所用抗-CD100抗体的定义范围内，只要抗-CD100抗体的所需特性不被破坏。在不同实验中，预计这类修饰可通过提高或降低多肽活性定量或定性地影响活性。而且，可通过氧化、还原或其它衍生化方法修饰链内单独氨基酸残基，可切割所述多肽以获得保留活性的片段。不破坏所需特性(如CD100的结合特异性、结合亲和力和CD100阻断活性)的这类改变不会使该多肽序列从本文所述的感兴趣的抗-CD100抗体的定义中剥离。
[0153] 本领域提供有关制备和使用多肽变体的大量指导。在制备抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体时，本领域技术人员不难确定对天然蛋白质的核苷酸或氨基酸序列进行何种修饰将产生适合用作本发明方法所用的药物组合物的治疗活性组分的变体。
[0154] 可以多种方式使抗-CD100抗体的恒定区突变以改变效应物功能。例如，参见美国专利号6,737,056B1和美国专利申请公开号2004/0132101A1，其公开了优化抗体与Fc受体结合的Fc突变。
[0155] 在某些抗-CD100抗体中，可利用本领域已知技术突变Fc部分以降低效应物功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可降低循环的修饰抗体与Fc受体的结合，从而提高肿瘤定位。在其它情况下，可能是与本发明相一致的恒定区修饰降低互补物结合，从而缩短所偶联细胞毒素的血清半衰期和非特异性结合。可利用恒定区的其它修饰来改变二硫键连接或寡糖部分，以便因抗原特异性或抗体柔性提高而加强定位。无需过多实验，即可容易地利用熟知的免疫学技术测定或定量分析修饰所得的生理学概况、生物利用度和其它生化作用，如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期。
[0156] 本发明抗-CD100抗体也包括修饰的衍生物，例如通过将任何类型的分子共价连接到抗体上，使得该共价连接不会防止抗体特异性结合其关联表位而修饰的衍生物。例如但不限于，抗体衍生物包括通过，例如糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。通过已知技术可进行多种化学修饰，包括但不限于：特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等。此外，衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。
[0157] “保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基取代。本领域已定义具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括，具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，也可沿所有或一部分编码序列随机引入突变(例如通过饱和诱变)，可筛选所得突变体的生物学活性，以鉴定保持活性(例如，结合抗-CD100多肽的能力)的突变体。
[0158] 例如，可能仅在抗体分子的构架区内或仅在CDR区内引入突变。引入的突变可能是沉默或中性错义突变，即对抗体的抗原结合能力没有影响或影响很小。可使用这些突变类型来优化密码子使用，或提高杂交瘤的抗体产量。或者，非中性错义突变可改变抗体的抗原结合能力。大部分沉默和中性错义突变的位置可能位于构架区内，而大部分非中性错义突变的位置可能在CDR内，但这不是必然的要求。本领域技术人员能够设计和检测具有所需特性，例如抗原结合活性无改变或结合活性有改变(如抗原结合活性提高或抗体特异性改变)的突变分子。诱变后，可通过常规方式表达编码蛋白，并可利用本文所述技术或本领域已知的常规修饰技术测定该编码蛋白的功能和/或生物学活性(例如，免疫特异性结合CD100多肽的至少一个表位的能力)。
[0159] 在某些实施方式中，本发明抗-CD100抗体包含至少一个优化的互补决定区(CDR)。“优化CDR”指该CDR已被修饰，并且根据赋予包含该优化CDR的抗-CD100抗体的维持或提高的结合亲和力和/或抗-CD100活性选择优化序列。“抗-CD100活性”或“CD100阻断活性”可包括调节一种或多种与CD100相关的下述活性的活性：B细胞活化、聚集和存活；CD40-诱导的增殖和抗体生产；对T细胞依赖性抗原的抗体应答；T细胞或其它免疫细胞增殖；树突细胞成熟；脱髓鞘和轴突变性；全能神经前体和/或少突胶质细胞的凋亡；诱导内皮细胞迁移；抑制自发性单核细胞迁移；结合细胞表面丛蛋白B1；或与可溶性CD100或CD100+细胞表面上表达的CD100相关的任何其它活性。抗-CD100活性也用于解释CD100表达相关性疾病的发病率或严重程度降低，这些疾病包括但不限于：某些类型的淋巴瘤，自身免疫病，炎性疾病，包括中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)炎性疾病，移植物排斥和侵袭性血管新生。基于鼠抗-CD100 MAb BD16和BB18的优化抗体的例子可参见美国公开号2008/0219971A1，国际专利申请WO 93/14125和Herold等，Int.Immunol.7(1)：1-8(1995)，通过引用全文纳入本文。所述修饰可包括置换CDR内的氨基酸残基，以使抗-CD100抗体保持对CD100抗原的特异性并提高结合亲和力和/或提高抗-CD100活性。
[0160] IV.编码抗-CD100抗体的多核苷酸
[0161] 本发明还提供编码本发明抗-CD100抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的核酸分子。
[0162] 在一个实施方式中，本发明提供分离的多核苷酸，它包含免疫球蛋白重链可变区(VH结构域)的编码核酸、基本由其组成或由其组成，其中所述VH结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示多核苷酸序列至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％相同或完全相同的氨基酸序列。
[0163] 在其它实施方式中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含免疫球蛋白VH结构域的编码核酸、基本由其组成或由其组成，其中所述VH结构域的至少一个CDR选自：(a)包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQID NO：7所示氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的CDR3。
[0164] 在另一个实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，其包含VH结构域的编码核酸、基本由其组成或由其组成，其中所述VH结构域具有与包含SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：10的参比VH结构域多肽序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约
94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的氨基酸序列，其中包含所述编码的VH结构域的抗-CD100抗体特异性或优先结合CD100。
94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的氨基酸序列，其中包含所述编码的VH结构域的抗-CD100抗体特异性或优先结合CD100。
[0165] 在一个实施方式中，本发明提供分离的多核苷酸，它包含免疫球蛋白轻链可变区(VL结构域)的编码核酸、基本由其组成或由其组成，其中所述VL结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示多核苷酸序列至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％相同或完全相同的氨基酸序列。
[0166] 在其它实施方式中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含免疫球蛋白VL结构域的编码核酸、基本由其组成或由其组成，其中所述VL结构域的至少一个CDR选自：(a)包含SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的CDR3。
[0167] 在另一个实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，其包含VL结构域的编码核酸、基本由其组成或由其组成，其中所述VL结构域具有与包含SEQ IDNO：17或SEQ ID NO：18的参比VL结构域多肽序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约
94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的氨基酸序列，其中包含所述编码的VL结构域的抗-CD100抗体特异性或优先结合CD100。
94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的氨基酸序列，其中包含所述编码的VL结构域的抗-CD100抗体特异性或优先结合CD100。
[0168] 上述任何多核苷酸还可包含编码，例如，信号肽以指导编码多肽、本文所述抗体恒定区或本文所述其它异源多肽的分泌的额外核酸。另外，如本文另作详述，本发明包括包含一种或多种上述多核苷酸的组合物。
[0169] 在一个实施方式中，本发明包括包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的组合物，其中所述第一多核苷酸编码本文所述的VH结构域，所述第二多核苷酸编码本文所述的VL结构域。具体说，组合物包含编码VH结构域的多核苷酸和编码VL结构域的多核苷酸、基本由其组成或由其组成，其中编码VH结构域的多核苷酸如SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示，编码VL结构域的多核苷酸如SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22所示。
[0170] 如本文另述，本发明还包括本发明多核苷酸的片段。此外，本发明还考虑编码本文所述的融合多肽、Fab片段和其它衍生物的多核苷酸。
[0171] 所述多核苷酸可通过本领域已知的任何方法产生或生产。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，则可由化学合成的寡核苷酸组装编码该抗体的多核苷酸(如Kutmeier等，BioTechniques 17：242(1994)所述)，简言之，该方法包括合成含有编码该抗体的序列的某部分的重叠寡核苷酸，使这些寡核苷酸退火和连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
[0172] 或者，编码本发明抗-CD100抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由合适来源的核酸产生。如果无法获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但该抗体分子的序列已知，则可通过化学合成或利用可与该序列3′和5′端杂交的合成引物进行PCR扩增、或利用具体基因序列的特异性寡核苷酸探针进行克隆以鉴定cDNA文库中编码该抗体或其它抗-CD100抗体的cDNA克隆，由合适来源(如抗体cDNA文库，或由表达该抗体或其它抗-CD100抗体的任何组织或细胞，如选择表达抗体的杂交瘤细胞分离的核酸，优选聚A+RNA产生的cDNA文库)获得编码该抗体的核酸。然后，可利用本领域熟知的任何方法将PCR产生的扩增核酸克隆到可复制克隆载体中。
[0173] 一旦确定抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应氨基酸序列，就可利用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法，例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等操作其核苷酸序列。(参见例如，Sambrook等(1990)Molecular Cloning，A Laboratory Manual(《分子克隆，实验室手册》)(第2版；纽约州冷泉港的冷泉港实验室公司(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.))和Ausubel等编(1998)Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(纽约州的约翰韦利森公司(John Wiley&Sons，NY))所述技术，将这些文献全文纳入本文作参考)，以产生具有不同氨基酸序列以产生(例如)氨基酸取代、缺失和/或插入的抗体。
[0174] 编码抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成，可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，编码抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由单链和双链DNA、单链和双链区域混合的DNA、单链和双链RNA以及单链和双链区域混合的RNA，包含可以是单链、更常见是双链、或是单链和双链区域混合的DNA和RNA的杂交分子构成。此外，编码抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由包含RNA、DNA、或者RNA和DNA的三链区域构成。编码抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸也可含有一个或多个修饰碱基，或者因稳定性或其它原因修饰的DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括，例如三苯甲基碱基和非常见碱基如肌苷。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此“多核苷酸”涵盖化学、酶或代谢修饰形式。
[0175] 编码衍生自免疫球蛋白(如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离多核苷酸可通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列来产生，以便将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入编码蛋白。突变可通过标准技术引入，例如定点诱变和PCR介导的诱变。优选在一个或多个非必需氨基酸残基处产生保守性氨基酸取代。
[0176] V.融合蛋白和抗体偶联物
[0177] 如本文另作详述，抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可与异源多肽的N-或C-末端重组融合，或与多肽或其它组合物化学偶联(包括共价和非共价偶联)。例如，抗-CD100抗体可与用作检测实验标签和效应物分子，如异源多肽、药物、放射性核素或毒素的分子重组融合或偶联。参见例如，PCT公开WO 92/08495；WO91/14438；WO 89/12624；美国专利号5,314,995；和EP 396,387。
[0178] 本发明抗-CD100抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可包括通过将任何类型的分子与抗体共价连接使该共价连接不防止抗体结合抗-CD100，修饰的衍生物。例如但不限于，抗体衍生物包括通过，例如糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。通过已知技术可进行多种化学修饰，包括但不限于：特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等。此外，衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。
[0179] 抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可由通过肽键或修饰的肽键，即肽等构物而彼此结合的氨基酸组成，并可包含20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。例如，可通过天然方法，例如翻译后加工，或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰抗-CD100抗体。这些修饰在基础文本和更具体的专著中已有深入描述，并在大量研究文献中也有叙述。可以在抗-CD100结合分子的任何位置进行修饰，包括在肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端，或者在某部分如糖上进行修饰。应当了解相同类型的修饰可以在给定抗-CD100结合分子的多个位置以相同或不同程度出现。并且，给定的抗-CD100结合分子可包含许多类型的修饰。抗-CD100结合分子可以是分支的，例如因泛素化造成，它们可以是含有或不含分支的环状。环状的、分支的、和分支环状的抗-CD100结合分子可以由翻译后的天然加工造成也可通过合成方法产生。修饰包括乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价结合黄素、共价结合血红素部分、共价结合核苷酸或核苷酸衍生物、共价结合脂质或脂质衍生物、共价结合磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚体形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、转移RNA介导的蛋白质氨基酸加成如精氨酰化、以及泛素化。(参见例如，Proteins--Structure and Molecular Properties(《蛋白质-结构和分子特性》)，T.E.Creighton，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company)，纽约；第2版(1993)；Johnson编(1983)Posttranslational Covalent Modification of Proteins(《蛋白质的翻译后共价修饰》)(学术出版社(Academic Press)，纽约)，第1-12页；Seifter等，Meth.Enzymol.182：626-646(1990)；Rattan等，Ann.NY Acad.Sci.663：48-62(1992))。
[0180] 本发明也提供包含抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，以及异源多肽的融合蛋白。与抗体融合的异源多肽可用于产生某种功能或用于靶向表达抗-CD100多肽的细胞。
[0181] 在一个实施方式中，本发明融合蛋白包含具有本发明抗体的任何一个或多个VH结构域的氨基酸序列、本发明抗体的任何一个或多个VL结构域的氨基酸序列、或其片段或变体，以及异源多肽序列的多肽，基本由其组成或由其组成。
[0182] 在另一实施方式中，用于本文所述诊断和治疗方法的融合蛋白包含具有抗-CD100抗体的VH结构域的任何一个、两个、三个CDR的氨基酸序列或者其片段、变体或衍生物，或者抗-CD100抗体的VL结构域的任何一个、两个、三个CDR的氨基酸序列或者其片段、变体或衍生物，以及异源多肽序列的多肽，基本由其组成或由其组成。在一个实施方式中，融合蛋白包含具有本发明抗-CD100抗体的至少一个VH结构域的氨基酸序列和本发明抗-CD100抗体的至少一个VL结构域的氨基酸序列，或者其片段、衍生物或变体，以及异源多肽序列的多肽。优选地，所述融合蛋白的VH和VL结构域对应于特异性结合CD100的至少一个表位的单一来源抗体(或scFv或Fab片段)。在又一实施方式中，用于本文所述的诊断和治疗方法的融合蛋白包含具有抗-CD100抗体的VH结构域的任何一个、两个、三个或更多个CDR的氨基酸序列和抗-CD100抗体的VL结构域的任何一个、两个、三个或更多个CDR的氨基酸序列，或者其片段或变体，以及异源多肽序列的多肽。优选地，VH结构域或VL结构域的两个、三个、四个、五个、六个或更多个CDR对应于本发明单一来源抗体(或scFv或Fab片段)。本发明也涵盖编码这些融合蛋白的核酸分子。
[0183] 文献中报道的示范性融合蛋白包括T细胞受体(Gascoigne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2936-2940(1987))；CD4(Capon 等，Nature 337：525-531(1989)；Traunecker 等，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeissl 等，DNA Cell Biol.USA 9：
347-353(1990)；和Byrn等，Nature 344：667-670(1990))；L-选择素(寻靶受体)(Watson等，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和 Watson 等，Nature349：164-167(1991))；
CD44(Aruffo 等，Cell 61：1303-1313(1990))；CD28 和 B7(Linsley 等，J.Exp.Med.173：
721-730(1991))；CTLA-4(Lisley等，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic等，Cell 66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：
10535-10539(1991)；Lesslauer等，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；和Peppel等，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))；和 IgE 受 体 a(Ridgway 和 Gorman，J.Cell.Biol.Vol.115，文摘号(Abstract No.)1448(1991))的融合物。
347-353(1990)；和Byrn等，Nature 344：667-670(1990))；L-选择素(寻靶受体)(Watson等，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和 Watson 等，Nature349：164-167(1991))；
CD44(Aruffo 等，Cell 61：1303-1313(1990))；CD28 和 B7(Linsley 等，J.Exp.Med.173：
721-730(1991))；CTLA-4(Lisley等，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic等，Cell 66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：
10535-10539(1991)；Lesslauer等，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；和Peppel等，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))；和 IgE 受 体 a(Ridgway 和 Gorman，J.Cell.Biol.Vol.115，文摘号(Abstract No.)1448(1991))的融合物。
[0184] 如本文其它地方所述，抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可与异源多肽融合，以提高所述多肽的体内半衰期或用于以本领域已知方法进行的免疫实验。例如，在一个实施方式中，可将PEG偶联于本发明抗-CD100抗体，以提高其体内半衰期。参见Leong等，Cytokine16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)。
[0185] 而且，抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可融合标记物序列如肽，以利于其纯化或检测。在优选实施方式中，标记物氨基酸序列是六组氨酸肽，例如pQE载体(凯杰公司(QIAGEN，Inc.)，伊顿大街(Eton Avenue)9259号，查茨沃斯(Chatsworth)，加州91311)提供的标签等，其中许多标记可购得。如Gentz等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824所述，六-组氨酸提供了方便的融合蛋白纯化方法。用于纯化的其它肽标签包括但不限于：对应于流感血凝素蛋白衍生表位的“HA”标签(Wilson等，Cell37：767(1984))，以及“flag”标签。
[0186] 可采用本领域熟知方法制备融合蛋白(参见例如，美国专利号5,116,964和5,225,538)。可凭经验选择进行融合的准确位点，以优化融合蛋白的分泌或结合特性。然后，用编码融合蛋白的DNA转染宿主细胞进行表达。
[0187] 抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，可以非偶联形式使用，或者可偶联于各种分子的至少一种，例如，以改善该分子的治疗特性、利于靶点检测、或用于患者成像或治疗。可以在纯化前或纯化后，或者在进行纯化时标记或偶联抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。
[0188] 具体说，本发明抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可偶联于治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应修饰剂、药物或PEG。
[0189] 本领域技术人员能理解，根据所选的偶联物质，可采用各种技术组装偶联物。例如，可通过使结合多肽与生物素的活化酯如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，制备生物素偶联物。相似地，可以在偶联剂，如本文所列偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯，优选荧光素-异硫氰酸酯反应制备荧光标记偶联物。以类似方式制备本发明抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。
[0190] 本发明还包括偶联于诊断剂或治疗剂的抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。可将本发明抗-CD100抗体，包括其抗原结合片段、变体和衍生物用于诊断目的，例如，作为临床测试步骤的一部分监测疾病的发展或进展，从而(如)确定给定的治疗和/或预防方案的效果。例如，将抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物偶联于可检测物质可利于检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层显像术的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。参见例如，美国专利号4,741,900中的金属离子，可根据本发明将其与抗体偶联用于诊断。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰基胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的例子包括：伞形花内酯、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子是氨基苯二酰肼；生物发光材料的例125 131 111 90
子包括：萤光素酶、萤光素和发光蛋白；合适的放射性物质的例子包括 I、I、 In、Y或
99
Tc。
子包括：萤光素酶、萤光素和发光蛋白；合适的放射性物质的例子包括 I、I、 In、Y或
99
Tc。
[0191] 抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可偶联治疗部分，如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害的任何物质。
[0192] 抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可通过偶联于化学发光化合物进行可检测地标记。然后，通过检测化学反应过程中产生的发光，确定化学发光标记的抗-CD100结合分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是氨基苯二酰肼、异氨基苯二酰肼、热发光性(theromatic)吖啶 酯、咪唑、吖啶 盐和草酸酯。
[0193] 对抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物进行可检测标记的一种方式是将其连接于酶，并用连接产物进行酶促免疫实验(EIA)(Voller，A.，The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)(“酶联免疫吸附实验”)，微生物联合会季刊(Microbiological Associates Quarterly Publication)，马里兰州沃克斯维尔(Walkersville，Md.)；诊断 地平线(Diagnostic Horizons)2：1-7(1978)；Voller等，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；Maggio编(1980)Enzyme Immunoassay(《酶促免疫实验》)，佛罗里达州伯克莱屯的CRC出版社(CRC Press，Boca Raton，Fla.)；Ishikawa等编(1981)Enzyme Immunoassay(《酶促免疫实验》)(Kgaku Shoin，东京)。结合于抗-CD100抗体的酶与合适底物，优选发色底物发生反应，其反应方式产生可通过(例如)分光光度法、荧光测定法或目测法检测的化学部分。可用于可检测标记抗体的酶包括但不限于：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，可通过利用酶发色底物进行的比色法进行检测。也可通过目测比较底物与类似方法制备的标准品的酶反应程度进行检测。
[0194] 也可利用各种其它免疫实验进行检测。例如，通过放射性标记抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，可以使用放射性免疫实验(RIA)检测结合分子(参见例如，Weintraub(1986年3月)Principles of Radioimmunoassays(《放射性免疫实验原理》)，第七届放射性配体实验技术培训课程(Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques)(内分泌协会(The Endocrine Society))，通过引用全文纳入本文)。放射性同位素可通过各种方式检测，包括但不限于：γ计数器、闪烁计数器或放射自显影。
[0195] 也可利用荧光发射金属，如152Eu或其它镧系元素对抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物进行可检测地标记。可用诸如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)之类的金属螯合基团将这些金属连接于结合分子。
[0196] 将不同部分偶联于抗体(如抗-CD100抗体)或其抗原结合片段、变体或衍生物的技术是众所周知的，参见例如，Amon等(1985)Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy(“癌症治疗中用于药物的免疫靶向的单克隆抗体”)，收录于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(《单克隆抗体和癌症治疗》)，Reisfeld等编(ARL公司(Alan R.Liss，Inc.))，第243-56页；Hellstrom等(1987)Antibodies for Drug Delivery(“用于药物递送的抗体”)，收录于Controlled Drug Delivery(《控制药物递送》)，Robinson等编(第2版；MD公司(Marcel Dekker，Inc.))，第 623-53 页 )；Thorpe(1985)Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy：A Review(“癌症治疗中细胞毒剂的抗体运载体：综述”)，收录于Monoclonal Antibodies′84：Biological and Clinical Applications(《单克隆抗体′84：生物学和临床应用》)，Pinchera等编，第475-506页；Analysis，Results，and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy(“在癌症治疗中治疗性使用放射性标记的抗体的分析、结果和展望”)，收录于Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy(《用于检测和治疗癌症的单克隆抗体》)，Baldwin等编，学术出版社(Academic Press)，第303-16页(1985)；和Thorpe等(1982)The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates(“抗体-毒素偶联物的制备和细胞毒特性”)，Immunol.Rev.62：119-58。
[0197] VI.抗体多肽的表达
[0198] 编码抗体的轻链和重链的DNA序列可根据熟知方法利用逆转录酶和DNA聚合酶同时或单独制备。可根据公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列，用共有恒定区引物或更具特异性的引物启动PCR。如上所述，也可利用PCR分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可利用共有引物或较大的同源探针，如小鼠恒定区探针筛选文库。
[0199] DNA，通常是质粒DNA，可利用本领域已知技术从细胞中分离，按照如上述重组DNA技术相关文献中详述的标准熟知技术进行限制性作图和测序。当然，可以在分离过程或后续分析过程期间的任何时间点按照本发明合成DNA。
[0200] 操作分离的遗传物质以提供本发明抗-CD100抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物后，通常将编码该抗-CD100抗体的多核苷酸插入表达载体，以便引入可用于产生所需量抗-CD100抗体的宿主细胞中。
[0201] 重组表达抗体或其片段、衍生物或类似物，例如，结合本文所述靶分子如CD100的抗体重链或轻链，需要构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码本发明抗体分子、抗体的重链或轻链、或其一部分(优选含有重链或轻链可变区)的多核苷酸后，可使用本领域熟知方法通过重组DNA技术获得产生抗体分子的载体。因此，本文描述了通过含抗体编码核苷酸序列的多核苷酸表达制备蛋白质的方法。可利用本领域技术人员熟知的方法构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供可复制载体，其包含操作性连接于启动子的编码本发明抗体分子、或其重链或轻链、或其重链或轻链可变区的核苷酸序列。这种载体可包括，编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如，PCT公开WO86/05807；PCT公开WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)，可将抗体可变区克隆到这类载体中以便表达完整的重链或轻链。
[0202] 本文所用术语“载体”或“表达载体”指在本发明中用作运载体在宿主细胞中引入和表达所需基因的载体。正如本领域技术人员所知，这种载体可容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。通常，与本发明相容的载体包含选择性标记物、有利于克隆所需基因的合适限制性位点和进入真核或原核细胞中并在其中复制的能力。
[0203] 出于本发明目的，可采用多种表达载体系统。例如，一类载体利用衍生自动物病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其它包括使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。此外，通过引入能够选择转染的宿主细胞的一种或多种标记物，可选择将DNA整合入染色体中的细胞。该标记物可向营养缺陷型宿主提供提供原营养，以及生物杀灭剂(如抗生素)抗性或重金属抗性如铜抗性。选择性标记物基因可直接连接于待表达的DNA序列，或者通过共同转化引入同一细胞内。在mRNA的优化合成中，也可能需要其它元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
[0204] 在特别优选的实施方式中，将克隆的可变区基因和如上所述合成的重链和轻链恒定区基因(优选人)插入表达载体内。当然，能够在真核细胞中引发表达的任何表达载体均可用于本发明。合适载体的例子包括但不限于：质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可获自加州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen，San Diego，Calif.))和质粒pCI(可获自威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega，Madison，Wis.))。通常，筛选大量转化细胞以选出适当高水平表达免疫球蛋白重链和轻链的转化细胞是可通过(例如)机器人系统进行的常规实验。
[0205] 更常见地，一旦制备得到编码抗-CD100抗体的单体亚基的载体或DNA序列，就可将表达载体引入合适的宿主细胞内。可通过本领域技术人员熟知的各种技术将质粒引入宿主细胞内。这些技术包括但不限于：转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、细胞与包膜DNA融合、显微注射和用完整病毒感染。参见Ridgway(1988)Mammalian Expression Vectors(“哺乳动物表达载体”)，收录于Vectors(《载体》)，Rodriguez和Denhardt编(马萨诸塞州波士顿的巴特沃思公司(Butterworths，Boston，Mass.))，第24.2章，第470-472页。通常，通过电穿孔将质粒引入宿主。在适合产生轻链和重链的条件下培养携带表达构建物的宿主细胞，并测定重链和/或轻链蛋白的合成。示范性实验技术包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、放射性免疫实验(RIA)或荧光活化的细胞分选分析(FACS)、免疫组化等。
[0206] 通过常规技术将该表达载体转移到宿主细胞中，然后通过常规技术培养该转染细胞，产生用于本文所述方法的抗体。因此，本发明包括含有操作性连接于异源启动子的本发明抗体或其重链或轻链的编码多核苷酸的宿主细胞。在优选实施方式中，为了表达双链抗体，可以在宿主细胞中共同表达编码重链和轻链的载体，以表达整个免疫球蛋白分子，如下详述。
[0207] 本文所用“宿主细胞”指携带用重组DNA技术构建并编码至少一种异源基因的载体的细胞。在描述从重组宿主中分离抗体的方法时，除非另有明确说明，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用，指抗体来源。换言之，从“细胞”回收多肽可以指从离心的全细胞或含有培养基和悬浮细胞的培养物回收。
[0208] 可利用各种宿主-表达载体系统来表达用于本文所述方法的抗体分子。这类宿主-表达系统代表可产生并随后纯化感兴趣编码序列的载体，但也代表用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，可原位表达本发明抗体分子的细胞。它们包括但不限于微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者哺乳动物细胞系统(如COS、CHO、BLK、293和3T3细胞)，其携带含有衍生自哺乳动物细胞基因组(如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建物。重组抗体分子的表达优选利用细菌细胞如大肠杆菌(Escherichia coli)，更优选真核细胞(特别是表达完整重组抗体分子时)。例如，哺乳动物细胞如中华仓鼠卵巢细胞(CHO)与某载体如来自人巨细胞病毒的主要中间体早期基因启动子元件联用，是抗体的有效表达系统(Foecking等，Gene45：101(1986)；和Cockett等，Bio/Technology 8：2(1990))。
[0209] 用于表达蛋白质的宿主细胞系常常是哺乳动物来源的；本领域技术人员能够优先确定最适合表达所需基因产物的具体宿主细胞系。示范性宿主细胞系包括但不限于：CHO(中华仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中华仓鼠卵巢品系、DHFR-)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾品系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生品系)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、
293、WI38、R1610(中华仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾品系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3.times.63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。宿主细胞系通常可从商业服务来源如美国组织培养物保藏中心或公开文献获得。
293、WI38、R1610(中华仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾品系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3.times.63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。宿主细胞系通常可从商业服务来源如美国组织培养物保藏中心或公开文献获得。
[0210] 此外，可选择以所需的特定方式调节插入序列表达、或修饰和加工该基因产物的宿主细胞系。对蛋白质产物的这种修饰(如糖基化)和加工(如切割)可能对蛋白质功能至关重要。不同宿主细胞对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特定的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统，以保证对所表达的外来蛋白进行正确的修饰和加工。为此，可采用具有能适当地加工初始转录物、对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。
[0211] 为了长期、高产率地生产重组蛋白，优选稳定的表达。例如，可工程改造稳定表达抗体分子的细胞系。与其使用含有病毒复制起点的表达载体，不如用合适表达控制元件(如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择性标记来转化宿主细胞。引入外来DNA后，使工程改造细胞在富营养培养基中生长1-2天，然后换到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记提供对选择压的抗性，使得细胞能够将该质粒稳定整合入染色体，生长形成细胞灶，进而可克隆并扩增成细胞系。可有益地利用这种方法工程改造稳定表达该抗体分子的细胞系。
[0212] 可采用许多选择系统，包括但不限于可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，Cell 22：817(1980))基因。另外，抗代谢剂抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，产生甲氨蝶呤抗性(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA，77：357；O’Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：1527)；gpt，产生霉酚酸抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072)；neo，产生氨基糖苷G-418抗性(Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu 和 Wu，1991，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，1993，Science 260：926-932；和Morgan和 Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；TIB TECH11(5)：155-215(1993 年 5月))；和hygro，产生潮霉素抗性(Santerre等，1984，Gene，30：147)。本领域已知可用于重组DNA技术的方法参见如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，纽约州的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，NY)(1993)；
Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual(“基因转移和表达，实验室手册”)，纽约的斯托克顿出版社(Stockton Press)(1990)；Dracopoli等(编)(1994)Current Protocols in Human Genetics(《新编人类基因组学实验指南》)(纽约州的约翰韦利父子公司)，第12和13章；Colberre-Garapin等(1981)J.Mol.Biol.150：1，通过引用全文纳入本文。
Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual(“基因转移和表达，实验室手册”)，纽约的斯托克顿出版社(Stockton Press)(1990)；Dracopoli等(编)(1994)Current Protocols in Human Genetics(《新编人类基因组学实验指南》)(纽约州的约翰韦利父子公司)，第12和13章；Colberre-Garapin等(1981)J.Mol.Biol.150：1，通过引用全文纳入本文。
[0213] 可通过载体扩增提高抗体分子的表达水平(综述参见Bebbington和Hentschel，“The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning”(在DNA克隆中使用基于基因扩增的载体在哺乳动物细胞中表达克隆的基因)，(纽约州的学术出版社(Academic Press)))，第3卷。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，提高宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平会增加标记基因的拷贝数。由于扩增区域与抗体基因相连，所以抗体产量也会提高(Crouse等，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
[0214] 体外生产允许放大规模产生大量所需多肽。本领域已知在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术，包括均一悬浮培养，例如在气升式反应器或在连续搅拌反应器中培养，或者固定或捕获式细胞培养，例如在中空纤维中、微囊中、琼脂糖微珠上或陶瓷筒上培养。如果必要和/或需要，多肽溶液可通过常规色谱法进行纯化，例如，在优先生物合成合成绞链区多肽之后或者在本文所述的HIC色谱步骤之前或之后，进行如凝胶过滤、离子交换色谱、DEAE-纤维素色谱或(免疫-)亲和力色谱。
[0215] 编码本发明抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因也可在非哺乳动物细胞，如昆虫细胞、细菌细胞、酵母细胞或植物细胞中表达。易于摄入核酸的细菌包括肠杆菌科成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门菌属(Salmonella)菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株；肺炎球菌(Pneumococcus)菌株；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的菌株。还应理解，在细菌中表达时，异源多肽通常是包含体的一部分。异源多肽必须被分离、纯化、然后组装成功能分子。需要抗体的四价形式时，亚基会自组装成四价抗体(WO 02/096948A2)。
[0216] 在细菌系统中，可根据所表达抗体分子的指定应用对许多表达载体进行有利地选择。例如，准备产生大量这类蛋白质时，为了产生抗体分子的药物组合物，可能需要能够介导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这类载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.2：1791(1983))，其中抗体编码序列可单独连接到载体内，与lacZ编码区位于同一读框内，以产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.，24：5503-5509(1989))；等等。也可采用pGEX载体表达外来多肽与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这类融合蛋白可溶，并可从裂解细胞容易地通过吸附和结合于基质谷胱甘肽琼脂糖珠后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱而纯化。设计pGEX载体，使其包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，以便由GST部分释放克隆的靶基因产物。
[0217] 除原核生物外，还可使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是最常使用的真核微生物，但也可使用许多其它菌株，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
[0218] 为了在酵母(Saccharomyces)中表达，常常使用质粒YRp7，例如(Stinchcomb等，Nature 282：39(1979)；Kingsman 等，Gene 7：141(1979)；Tschemper 等，Gene 10：157(1980))。这种质粒已经含有TRP1基因，其为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株如ATCC编号44076或PEP4-1(Jones，Genetics 85：12(1977))提供选择性标记物。然后，酵母宿主细胞基因组特征性trp1损伤的存在提供了用于通过在无色氨酸环境下生长来检测转化的有效环境。
[0219] 在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多面体病病毒(AcNPV)通常用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将抗体编码序列单独克隆到病毒的非必需区(如多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(如多角体蛋白启动子)的控制下。
[0220] 本发明抗体分子一旦重组表达后，可通过本领域已知的任何免疫球蛋白分子纯化方法进行纯化，例如，通过层析(如离子交换层析，亲和力层析，特别是在蛋白A之后对特定抗原的亲和力层析，以及大小筛分柱层析)、离心、差异溶解度或任何其它蛋白质纯化标准技术来纯化。或者，提高本发明抗体亲和力的优选方法可参见美国专利申请公开号20020123057A1。
[0221] VII.使用治疗性抗-CD100抗体的治疗方法
[0222] 本发明方法涉及使用抗-CD100结合分子，如抗体，包括其抗原结合片段、变体和衍生物治疗患者，该患者患有与表达CD100的细胞分泌或表达的可溶性CD100相关的疾病。“表达CD100的细胞”指表达CD100抗原的正常和恶性细胞。本领域熟知检测细胞内CD100表达的方法，包括但不限于：PCR技术、免疫组化、流式细胞术、Western印迹、ELISA等。
[0223] 虽然下述讨论涉及与本发明抗-CD100抗体有关的各种疾病和失调的诊断和治疗方法，但本文所述方法也可应用于保持本发明抗-CD100抗体的所需特性，例如能够特异性结合CD100，如人、小鼠或者人和小鼠的CD100，并具有CD100中和活性的抗-CD100抗体的抗原结合片段、变体和衍生物。
[0224] 在一个实施方式中，治疗包括将本发明抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段应用于或给予患者，或将抗-CD100结合分子应用于或给予由患者分离的组织或细胞系，其中所述患者患有疾病、出现疾病症状或具有疾病倾向。在另一实施方式中，治疗还应包括将包含抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段应用于或给予患者，或将包含抗-CD100结合分子的药物组合物应用于或给予由患者分离的组织或细胞系，其中所述患者患有疾病、出现疾病症状或具有疾病倾向。
[0225] 所述抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其结合片段可用于治疗各种恶性和非恶性肿瘤。“抗肿瘤活性”指表达CD100的恶性细胞增殖或累积速率降低，因此已有肿瘤或在治疗期间出现的肿瘤的生长速率降低，和/或已有的成瘤(肿瘤)细胞或新形成的成瘤细胞被破坏，因而治疗期间肿瘤总体缩小。例如，用至少一种抗-CD100抗体进行治疗引起生理响应，例如，血管新生减少，这对人体中CD100表达细胞相关性疾病状态的治疗有益。
[0226] 在一个实施方式中，本发明涉及用作药物，具体是用于治疗或预防癌症或用于癌前病症或病损的抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其结合片段。在某些实施方式中，用抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其结合片段治疗过度表达CD100的癌症。在某些实施方式中，用抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其结合片段治疗过度表达CD100的头颈癌或结肠癌。
[0227] 另外，抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其结合片段还可用于抑制血管新生，以治疗依赖于新血管形成的病理状况，包括肿瘤发生和黄斑变性。血管新生是复杂多步形态发生事件，在该期间血管重塑的主要决定因素刺激内皮细胞动态改变其细胞-细胞和细胞-基质接触，并定向移动以重排成成熟的血管树(Bussolino等，Trends Biochem Sci.22：251-256(1997)；Risau，Nature386：671-674(1997)；Jain，Nat.Med.9：685-693(2003))。新血管形成是胚胎发育期间的关键步骤，但它也在生理学和病理学状况中出现，如视网膜病、类风湿性关节炎、缺血，特别是肿瘤生长和转移(Carmeliet，Nat.Med.9：653-660(2003))。新血管的这种病理形成过程在本文中称为“侵袭性血管新生”。
Basile等，PNAS 103(24)：9017-9022(2006))证明，从HNSCC细胞中排出时，CD100刺激内皮细胞迁移，这一过程被CD100-阻断抗体和CD100敲减阻断。CD100过度表达也出现在前列腺癌、结肠癌、乳腺癌和肺癌中，提示CD100表达可能是各种癌促进血管新生的常用策略。
Basile等，PNAS 103(24)：9017-9022(2006))证明，从HNSCC细胞中排出时，CD100刺激内皮细胞迁移，这一过程被CD100-阻断抗体和CD100敲减阻断。CD100过度表达也出现在前列腺癌、结肠癌、乳腺癌和肺癌中，提示CD100表达可能是各种癌促进血管新生的常用策略。
[0228] 按照本发明方法，对于恶性人细胞，利用至少一种抗-CD100结合分子，如本文另述的抗体或其抗原结合片段提高阳性治疗响应。癌症治疗的“阳性治疗响应”指与这些结合分子，如抗体或其片段的抗肿瘤活性有关的疾病改善，和/或与疾病相关症状的改善。也就是说，可观察到抗增殖作用、防止肿瘤进一步生长、肿瘤缩小、肿瘤血管减少、癌细胞数量减少和/或一种或多种疾病相关症状减轻。因此，例如，疾病改善的特征可以是完全响应。“完全响应”指归一化至任何之前异常的射线照片研究、骨髓和脑脊液(CSF)时，不存在临床上可检测的疾病。这种响应必须在本发明方法治疗后，持续至少一个月。或者，疾病改善可归为部分响应。“部分响应”指不存在新病损的情况下，所有可检测的肿瘤负担(即，对象中存在的肿瘤细胞数量)降低至少约50％，并持续至少一个月。这种响应仅适用于可检测的肿瘤。
[0229] 可采用筛选技术如生物发光成像，例如，荧光素酶成像、骨扫描成像和肿瘤生物活检采样包括吸取骨髓(BMA)，通过肿瘤形态改变(即总体肿瘤负担、肿瘤细胞计数等)评估肿瘤响应。除这些阳性治疗响应外，用抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段治疗对象可产生疾病相关症状改善的有益效果。例如，所述对象可出现所谓的B症状，如夜汗、发热、体重降低和/或荨麻疹减轻。
[0230] 抗-CD100结合分子，如本文所述抗体或其抗原结合片段也可用于治疗与CD100表达细胞有关的炎性疾病和免疫系统的缺陷或失调。炎性疾病的特征是炎症和组织破坏，或其组合。“抗炎活性”指炎症减轻或阻断。“炎性疾病”包括任何免疫介导的炎性过程，其中免疫应答的启动事件或靶点包括非自身抗原，包括例如，同种异体抗原、异种抗原、病毒抗原、细菌抗原、未知抗原或变应原。在一个实施方式中，炎性疾病是外周或中枢神经系统的炎性疾病。在另一实施方式中，炎性疾病是关节的炎性疾病。
[0231] 另外，出于本发明目的，术语“炎性疾病”包括“自身免疫病”。本文所用术语“自身免疫病”通常应包括涉及“自身抗原”的免疫介导的炎性过程。在自身免疫病中，自身抗原引发宿主免疫应答。自身免疫病可能由针对自身抗原(自体抗原)的不当免疫应答产生，这偏离了自身耐受的正常状态。通常，用作细胞毒性分子或免疫复合物的抗体(具体是但不限于IgG抗体)是各种自身免疫病的主要介导物，其中许多自身免疫病可能造成失能或威胁生命。
[0232] 在一个实施方式中，利用抗-CD100结合分子，如本发明抗体或抗原结合片段治疗多发性硬化(MS)。MS也称为弥散性硬化症或弥散性脑脊髓炎，是免疫系统攻击中枢神经系统，导致脱髓鞘的自身免疫病症。多发性硬化这个名称指神经系统中形成的疤痕(硬化，也被称为斑块或病损)。MS病损通常包括接近小脑脑室、脑干、基底神经节和脊髓以及视神经的白质区域。MS导致少突胶质细胞破坏，该细胞负责产生和维持髓鞘。MS导致髓磷脂减少或完全消失，随着疾病进展，还导致神经元横断。
[0233] 神经病学症状可随着MS改变，该疾病常常发展到身体和认知失能。MS有多种形式，新症状独立发作(复发形式)或随时间缓慢累积(渐进形式)。在发作之间，症状可能完全消失，但常常产生永久的神经损伤，特别是随着疾病进展。
[0234] 可采用本发明抗-CD100单克隆抗体，如MAb 2503、MAb 67或MAb 76中和CD100，以通过几种不同机制降低MS严重程度，例如，抗-CD100单克隆抗体可阻断CD100的免疫成熟和活化，以通过降低对CNS抗原的次级免疫应答降低复发率，抗-CD100单克隆抗体可阻断可溶性CD100在介导CNS中的少突胶质细胞凋亡中的作用，可通过减少脱髓鞘减轻疾病严重程度。
[0235] 在一个实施方式中，利用抗-CD100结合分子，如本发明抗体或抗原结合片段治疗关节炎。关节炎是关节的炎性疾病，它可能由免疫系统攻击关节的自身免疫病症引起。在某些实施方式中，关节炎选自骨关节炎、痛风性关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎、活动性关节炎、类风湿性关节炎、青少年发病类风湿性关节炎、感染性关节炎、炎性关节炎、脓毒性关节炎、变性关节炎、破坏性关节炎(arthritis mutilans)和莱姆关节炎。在一个实施方式中，关节炎是类风湿性关节炎(RA)。
[0236] 本发明包括通过将本发明抗-CD100结合分子，如MAb 2503、MAb 67或MAb 76给予对象，治疗或预防关节炎的方法。本发明方法可减轻与关节炎，如类风湿性关节炎相关联的疼痛、肿胀或僵硬。本发明还涉及改善关节性能、功能和健康状况的方法。在本发明的一些实施方式中，治疗导致关节炎严重性评分降低、关节炎严重性/曲线下面积降低、与关节炎有关的组织病理参数(炎症、血管翳、软骨损伤和骨损伤)降低、血清花生四烯酸水平降低、或抗-胶原抗体减少。在某些实施方式中，有益或所需的临床结果包括但不限于：关节炎相关症状减轻；预防关节炎；关节炎发病推迟；人群中关节炎发病率降低；关节炎相关病症的严重程度下降；与关节炎相关的病症、失调或疾病状态稳定化(即不恶化)；与关节炎相关的病症、失调或疾病发病推迟或减缓；与关节炎相关的病症、失调或疾病改善；与关节炎相关的病症、失调或疾病在可检测或不可检测水平的消退(部分或完全)；或者与关节炎相关的病症、失调或疾病增强或改善。
[0237] 本发明方法可给予患有关节炎的个体或处于关节炎发病风险中的个体。因此，在一些实施方式中，本发明涉及一种治疗具有正常关节、处于临界关节炎的关节或真正有关节炎的关节的对象的方法，该方法包括如本文所述将本发明抗-CD100结合分子，如MAb2503、MAb 67或MAb 76给予对象。在一些实施方式中，本发明方法可用于在对象余生中治疗慢性关节炎。
[0238] 按照本发明方法，利用至少一种抗-CD100结合分子，如本文另述的抗体或其抗原结合片段提高对自身免疫病症和/或炎性疾病的治疗或预防的阳性治疗响应。提及自身免疫病和/或炎性疾病时，“阳性治疗响应”指与这些抗体的抗炎活性、抗血管新生活性、抗凋亡活性等相关的疾病改善，和/或疾病相关症状的改善。也就是说，可观察到抗增殖作用、防止CD100表达细胞的进一步增殖、减轻炎症反应，包括但不限于：炎性细胞因子、粘着分子、蛋白酶、免疫球蛋白(在携带CD100的细胞是B细胞的情况下)、它们的组合等的分泌减少，抗炎蛋白产量增加，自身反应性细胞数量减少，免疫耐受提高，自身反应性细胞存活被抑制，凋亡减少，内皮细胞迁移减少，自发性单核细胞迁移增加，刺激sCD100或CD100表达细胞介导的一种或多种症状减轻和/或降低。这种阳性治疗响应不仅限于给药途径，可包括给予供体、供体组织(如器官灌注)、宿主或其任何组合等。
[0239] 可利用筛选技术评估临床响应，如磁共振成象(MRI)扫描、x-射线成像、计算机断层成像(CT)扫描、流式细胞术或荧光活化的细胞分选(FACS)分析、组织学分析、宏观病理学分析和血液化学分析，包括但不限于可通过ELISA、RIA、色谱等检测到的改变。除这些阳性治疗响应外，用抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段治疗对象可产生疾病相关症状改善的有益效果。
[0240] 抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段可与至少一种其它癌症治疗联合使用，包括但不限于：手术或外科程序(如脾切除术、肝切除术、淋巴结切除术、白细胞透入(leukophoresis)、骨髓移植等)；放疗；化疗，任选与自体骨髓移植或其它癌症治疗联用；其中在抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段的治疗之前、期间或之后给予额外癌症治疗。因此，联合治疗包括给予抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段以及给予另一治疗剂，如化疗、放疗、其它抗癌抗体治疗、小分子癌症治疗或基于疫苗/免疫治疗的癌症治疗时，本发明方法包括采用单独制剂或单一药物制剂共同给予，和/或以任一顺序连续给予。
[0241] 本发明的抗-CD100结合分子，如抗体或其结合片段可与自身免疫病和炎性疾病的任何已知治疗联合使用，这些已知治疗包括本领域已知可用于治疗自身免疫病和炎性疾病，或者已经用于或正在用于治疗自身免疫病和炎性疾病的任何药剂或药剂组合。因此，当联合治疗包括给予抗-CD100结合分子和给予另一治疗剂时，本发明方法包括采用单独制剂或单一药物制剂共同给予，和/或以任一顺序连续给予。在本发明的一些实施方式中，本文所述的抗-CD100抗体与免疫抑制药物或消炎药联合给予，其中所述抗体和治疗剂可以任何顺序依次给予，或同时给予(即，同时或在同一时间框内)。
[0242] 在一些其它实施方式中，本发明的抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段可单独使用或与免疫抑制药物联合使用，以治疗和/或预防类风湿性关节炎。因此，在一些实施方式中，当本发明抗-CD100抗体用于治疗类风湿性关节炎时，所述抗体可与合适的免疫抑制药物联合使用。如上所述，可采用任何方式评估治疗有效性，包括但不限于，通过美国风湿病学院标准、欧洲风湿病联盟标准或任何其它标准定义的临床响应衡量有效性。参见例如，Felson等，Arthritis.Rheum.38：727-35(1995)和van Gestel等，Arthritis.Rheum.39：34-40(1996)。
[0243] 在其它实施方式中，本发明抗-CD100抗体可单独使用或与免疫抑制药物联合使用以治疗和/或预防多发性硬化。因此，在一些实施方式中，当本发明抗-CD100抗体用于治疗多发性硬化时，所述抗体可与合适的免疫抑制药物联合使用。
[0244] 本发明的另一实施方式是使用抗-CD100结合分子如抗体或其抗原结合片段诊断性监测组织中的蛋白质水平作为临床测试步骤的一部分，例如，以确定给定治疗方案的功效。例如，将抗体与可检测物质偶联可利于探测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的例子包括：伞形花内酯、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子是氨基苯二酰肼；生物125
发光材料的例子包括：萤光素酶、萤光素和发光蛋白；合适的放射性物质的例子包括 I、
131 35 3
I、S或 H。
发光材料的例子包括：萤光素酶、萤光素和发光蛋白；合适的放射性物质的例子包括 I、
131 35 3
I、S或 H。
[0245] VIII.药物组合物和给药方法
[0246] 本领域技术人员熟知或不难确定制备和给予本发明抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的方法。抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的给药途径可以是(例如)，口服、胃肠道外、吸入或外用。本文所用术语“胃肠道外”包括例如，静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给药。虽然所有这些给药形式均明确落入本发明范围，但给药形式的例子是注射液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注。通常，合适的注射用药物组合物可包含缓冲剂(如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(如聚山梨酯)，以及任选的稳定剂(如人白蛋白)等。然而，在与本文内容相容的其它方法中，本发明抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可直接递送到不良细胞群的部位，从而提高患病组织与治疗剂的接触。
[0247] 如本文所用，本发明抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以药学有效量给予，用于在体内治疗CD100表达细胞介导的疾病，如某些类型的癌症、自身免疫病、炎性疾病包括中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)炎性疾病，以及侵袭性血管新生。在这方面，应理解，将配制本发明公开的结合分子，以利于给药并提高活性物质的稳定性。优选地，本发明药物组合物包含药学上可接受的无毒无菌运载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。出于本申请目的，偶联或未偶联的抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药学有效量应被认为是足以实现有效靶点结合或足以实现(例如)改善疾病或失调的症状等益处，或足以监测物质或细胞的量。
[0248] 本发明所用的药物组合物包含药学上可接受的运载体，包括例如，离子交换物质、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂，血清蛋白质如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
[0249] 胃肠道外给药制剂包括无菌的水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括例如，水、醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，药学上可接受的运载体包括但不限于：0.01-0.1M并优选0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常见的胃肠道外载体包括磷酸钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液或不挥发油。静脉内运载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格右旋糖的那些物质等。也可包含防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
[0250] 更具体说，适用于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时)或分散体，以及用于临用前配制无菌注射液或分散体的无菌粉末。在这种情况下，该组合物必须无菌，并应该是存在注射容易性(easy syringability)的流体。它应该在制造和储存条件下稳定，并且优选在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可通过使用涂覆材料如卵磷脂、如果是分散体则保持所需粒度以及使用表面活性剂，来维持合适的流动性。适用于本文所述治疗方法的制剂可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)(马克出版公司(Mack Publishing Co.))第16版(1980)。
[0251] 也可通过各种抗菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现防止微生物的作用。在许多情况下，组合物中优选包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。组合物中可包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶以延长可注射组合物的吸收。
[0252] 在任何情况下，可按照需要，将所需量的活性化合物(如抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，本身或与其它活性剂联合)掺入含有本文所列的一种成分或多种成分的组合的合适溶剂，然后进行过滤除菌制得无菌注射溶液。通常，将活性活化物掺入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载体中制备分散体。当制备无菌注射液制备所需的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，由之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。注射制剂在无菌条件下按照本领域已知方法加工，装入容器，如安瓿、袋、瓶、注射器或小管中，并密封。另外，可包装该制剂，并以药盒形式出售，如美国专利申请系列号09/259,337所述。这类制品优选具有标签或标贴，表明相关组合物可用于治疗患有或倾向于患有疾病或失调的对象。
[0253] 胃肠道外制剂可以是单一推注剂量，输注或起始推注剂量，随后给予维持剂量。这些组合物可以特定的固定间隔或可变间隔给予，例如每天一次，或“按需”给予。
[0254] 本发明的某些药物组合物可以用可接受的剂型口服给予，包括例如，胶囊、片剂、水性悬液或溶液。某些药物组合物也可通过鼻喷雾或吸入方式给予。这类组合物可制备成盐水溶液，其中采用苄醇或其它合适的防腐剂、吸收促进剂以提高生物利用度，和/或采用其它常规的增溶剂或分散剂。
[0255] 可与载体材料组合后得到单一剂量形式的抗-CD100结合分子，如抗体或其片段、变体或衍生物的量可以根据治疗时宿主以及具体的给药模式而变化。该组合物可作为单一剂量、多个剂量或在确定时间段通过输注给予。也可调整给药方案，以提供最优所需响应(例如，治疗或预防响应)。
[0256] 在本发明范围内，本发明抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可按照上述治疗方法给予人或其它动物，其给予量足以产生疗效。本发明抗-CD100抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可以常规剂型给予所述人或其它动物，该剂型是通过已知技术将本发明抗体与常规的药学上可接受的运载体或稀释剂混合制备的。本领域技术人员应认识到，药学上可接受的运载体或稀释剂的形式和特点是由混合的活性成分含量、给药途径和其它熟知变量决定的。本领域技术人员还应理解，包含一种或多种抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的混合物可能被证明特别有效。
[0257] “治疗有效剂量或治疗有效量”或者“有效量”指给予时，在患有待治疗疾病患者的治疗中带来阳性治疗响应的抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段的用量。
[0258] 用于治疗CD100表达细胞介导的疾病，例如某些类型的癌症，如头颈癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌和肺癌；自身免疫病，如关节炎、多发性硬化、炎性疾病包括中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)炎性疾病；和侵袭性血管新生时，本发明组合物的治疗有效剂量取决于多种不同因素，包括给药方式、目标部位、患者生理状态、患者是人或是动物、给予的其它药物和该治疗是预防性治疗或是治疗性治疗。通常，患者是人，但也可治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。可采用本领域技术人员已知的常规方法确定治疗剂量，以优化安全性和效能。
[0259] 在给出本发明公开内容的情况下，本领域普通技术人员无需过多实验即可确定至少一种抗-CD100结合分子，如抗体或其结合片段的给予量。影响给药方式以及至少一种抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物各自用量的因素包括但不限于：接受治疗的个体的疾病严重程度、病史、年龄、身高、体重、健康状况和身体状况。类似地，抗-CD100结合分子，如抗体或其片段、变体或衍生物的给予量取决于给药方式、对象是否接受单一剂量或多剂量的此种药剂。
[0260] 本发明还提供抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备治疗自身免疫病和/或炎性疾病的药物中的应用，所述疾病包括例如，关节炎、多发性硬化、CNS和PNS炎性疾病或癌症。
[0261] 本发明还提供抗-CD100结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备治疗对象的自身免疫病和/或炎性疾病或癌症的药物中的应用，其中所述药物用于已用至少一种其它治疗预先治疗的对象。“预先治疗”或“预治疗”指该对象在接受包含抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物之前，接受过一种或多种其它治疗(例如，已用至少一种其它癌症疗法治疗)。“预先治疗”或“预治疗”包括在用包含抗-CD100结合分子，例如，本文所述的单克隆抗体2503或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物开始治疗前2年内、18个月内、1年内、6个月内、2个月内、6周内、1个月内、4周内、3周内、2周内、1周内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内、或者甚至1天内，用至少一种其它疗法治疗对象。对象不一定是一种或多种在先疗法预治疗的响应者。因此，接受包含抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物的对象可以对在先疗法的预治疗或者对一种或多种在先疗法(预治疗包括多种疗法时)有响应或无响应(例如，癌症为难治性癌症)。在接受包含抗-CD100结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物之前，对象可能已接受预治疗的其它癌症疗法的例子包括但不限于：手术；放疗；化疗，任选与自体骨髓移植联用，其中合适的化疗药包括但不限于前述药物；其它抗癌单克隆抗体疗法；小分子癌症治疗，包括但不限于：本文前述小分子；基于疫苗/免疫治疗的癌症治疗；类固醇疗法；其它癌症疗法；或其任何组合。
[0262] IX.诊断
[0263] 本发明还提供可用于诊断CD100表达细胞介导的疾病的诊断方法，所述疾病包括例如某些类型的癌症、自身免疫病、炎性疾病，包括例如关节炎、多发性硬化、中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)炎性疾病以及侵袭性血管新生，所述方法包括测定来自个体的组织或其它细胞或体液中CD100蛋白或转录物的表达水平，并将测定的表达水平与正常组织或体液中的标准CD100表达水平作比较，与标准水平相比表达水平上升表明存在疾病。
[0264] 通过本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法，可利用本发明抗-CD100抗体及其抗原结合片段、变体和衍生物测定生物样品中的CD100蛋白水平(参见例如 Jalkanen 等，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen 等，J.Cell Biol.105：3087-3096(1987))。用于检测CD100蛋白表达的其它基于抗体的方法包括免疫实验，如酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫沉淀或蛋白质印迹。合适的实验在本文中另有详述。
[0265] “测定CD100多肽表达水平”指对第一生物样品中的CD100多肽水平以直接(例如，通过测定或估计绝对蛋白质水平)或相对(例如，通过与第二生物样品中的疾病相关多肽水平作比较)方式进行定性或定量测定或估计。优选地，测定或估计第一生物样品中的CD100多肽表达水平，并与标准CD100多肽水平作比较，该标准水平取自未患该疾病的个体所得的第二生物样品或通过未患该疾病的群体的平均水平确定。本领域技术人员应理解，一旦“标准”CD100多肽水平已知，可以重复地用作比较标准。
[0266] “生物样品”指由可能表达CD100的个体、细胞系、组织培养物或其它细胞来源获得的任何生物样品。从哺乳动物获得组织活检样品和体液的方法是本领域熟知的。
[0267] X.免疫实验
[0268] 可通过本领域的任何已知方法测定本发明抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的免疫特异性结合。可使用的免疫实验包括但不限于，使用如下技术的竞争和非竞争实验系统，如蛋白质印迹、放射性免疫实验、ELISA(酶联免疫吸附实验)、“夹心”免疫实验、免疫沉淀实验、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散实验、凝集实验、补体结合实验、免疫放射实验、荧光免疫实验、蛋白A免疫实验等等。这类实验是本领域公知的常规实验(参见例如，Ausubel等编，(1994)，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，纽约约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.，NY)，第1卷，通过引用全文纳入本文)。下面简述示范性免疫测定(但不限于此)。
[0269] 免疫沉淀方案通常包括用补充有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(如EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的裂解缓冲液如RIPA缓冲液(1％NP-40或曲通X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸钠pH 7.2，1％特斯乐(Trasylol))裂解细胞群，将感兴趣的抗体加入该细胞裂解物，4℃培育一段时间(如1-4小时)，将蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠加入该细胞裂解物，4℃培育约一小时或更久，用裂解缓冲液洗珠，并将珠子重悬于SDS/样品缓冲液。可通过，例如蛋白质印迹分析评估感兴趣抗体免疫沉淀特定抗原的能力。本领域技术人员应认识到，可改变参数以提高抗体抗原的结合和降低背景(如，用琼脂糖珠预先清洁细胞裂解物)。有关免疫沉淀方案的进一步讨论参见例如，Ausubel等编，(1994)，(Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，纽约约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.，NY)，第1卷，10.16.1。
[0270] 蛋白质印迹分析通常包括：制备蛋白质样品，用聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质样品(如，根据抗原分子量采用8％-20％SDS-PAGE)，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶中转移到膜如硝酸纤维、PVDF或尼龙膜上，在封闭缓冲液(如，含有3％BSA或脱脂奶粉的PBS)中封闭该膜，用洗涤缓冲液(如PBS-吐温20)洗涤该膜，用稀释于封闭缓冲液的第一抗体(感兴趣抗体)封闭该膜，用洗涤缓冲液洗涤该膜，用稀释于封闭缓冲液的偶联有酶底物(如辣32 125
根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(如 P或 I)的第二抗体(识别第一抗体，如抗人抗体)封闭该膜，用洗涤缓冲液洗涤该膜，和检测抗原的存在。本领域技术人员了解可改变参数以提高检测到的信号和降低背景噪声。有关蛋白质印迹方案的进一步讨论参见例如，Ausubel等编，(1994)，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，纽约约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.，NY)，第1卷，10.8.1。
根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(如 P或 I)的第二抗体(识别第一抗体，如抗人抗体)封闭该膜，用洗涤缓冲液洗涤该膜，和检测抗原的存在。本领域技术人员了解可改变参数以提高检测到的信号和降低背景噪声。有关蛋白质印迹方案的进一步讨论参见例如，Ausubel等编，(1994)，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，纽约约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.，NY)，第1卷，10.8.1。
[0271] ELISA包括制备抗原，用该抗原包被96孔微量滴定板的孔，将偶联于可检测化合物如酶底物(如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的感兴趣抗体加入孔中，培育一段时间并检测抗原的存在。在ELISA中，感兴趣抗体不必偶联于可检测化合物；而可将偶联于可检测化合物的第二抗体(识别感兴趣抗体)加入孔中。另外，除了用抗原包被孔外，还可用抗体包被孔。在这种情况下，可加入偶联于可检测化合物的第二抗体，然后向包被孔中加入感兴趣抗原。本领域熟练技术人员了解可对参数进行修改以提高检测信号并了解本领域所知的其它对ELISA的改变。有关ELISA的进一步讨论参见例如，Ausubel等编，(1994)，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，纽约约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.，NY)，第1卷，11.2.1。
[0272] 可通过竞争性结合实验测定抗体与抗原的结合亲和力和抗体-抗原相互作用的解离速率。竞争性结合实验的一个例子是放射性免疫实验，包括在含量递增的未标记抗原3 125
存在下用感兴趣抗体培育标记抗原(如 H或 I)和检测结合于标记抗原的抗体。可通过Scatchard作图分析的数据确定感兴趣的抗体与特定抗原的亲和力和结合解离速率。也可利用放射性免疫实验确定与第二抗体的竞争。在这种情况下，在含量递增的未标记第二抗
3 125
体存在下，将抗原与偶联于标记化合物(如 H或 I)的感兴趣抗体一起培育。
存在下用感兴趣抗体培育标记抗原(如 H或 I)和检测结合于标记抗原的抗体。可通过Scatchard作图分析的数据确定感兴趣的抗体与特定抗原的亲和力和结合解离速率。也可利用放射性免疫实验确定与第二抗体的竞争。在这种情况下，在含量递增的未标记第二抗
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体存在下，将抗原与偶联于标记化合物(如 H或 I)的感兴趣抗体一起培育。
[0273] 此外，本发明抗-CD100抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可通过组织学方法使用，例如用于免疫荧光、免疫电子显微术或非免疫实验，用于原位检测CD100蛋白或者其保守变体或肽片段。原位检测可通过以下步骤进行：从患者中取出组织学样品，向其施加标记的抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，优选通过将标记抗体(或片段)覆盖在生物样品上施加。通过使用这一方法，可能不仅确定CD100蛋白或者其保守变体或肽片段的存在，还可确定其在所检测组织中的分布。使用本发明时，本领域普通技术人员不难构想到，可改变各种组织学方法中的任何方法(如染色步骤)，以实现这种原位检测。
[0274] CD100基因产物或其保守变体或肽片段的免疫实验和非免疫实验通常包括：在能够结合CD100或其保守变体或肽片段的可检测标记的抗体存在下培育样品，例如生物学液体、组织提取物、新收获的细胞或细胞培养物中培育细胞的裂解物，和通过本领域熟知的任何技术检测结合抗体。
[0275] 生物样品可接触或固定于能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的固相支持物或运载体如硝基纤维素或其它固体支持物。然后，可用合适的缓冲液洗涤该支持物，然后用可检测标记的抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物进行处理。然后，第二次用缓冲液洗涤固相支持物，以去除未结合的抗体。任选地，随后标记抗体。然后，可通过常规方式检测固体支持物上结合的标记的量。
[0276] “固相支持物或运载体”指能够结合抗原或抗体的任何支持物。熟知的支持物或运载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。出于本发明目的，运载体的性质可以是某种程度上可溶或不溶。支持物材料可具有基本上任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。因此，支持物构型可以是如珠的球形或如试管内表面或杆状物外表面的圆柱形。或者，该表面可以是平坦表面，例如片层、测试条等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员了解或能够用常规实验确定许多适合结合抗体或抗原的其它运载体。
[0277] 可以按照熟知方法确定给定批次的抗-CD100抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的结合活性。本领域技术人员能够利用常规实验确定每次测定的操作和优化实验条件。
[0278] 有各种方法可用于测定抗体-抗原相互作用的亲和力，但测定速率常数的较少。大部分方法依赖于标记抗体或抗原，其不可避免地使常规测定复杂化并在测定量中引入不确定性。
[0279] 与测定抗体-抗原相互作用亲和力的常规方法相比，用 进行的表面等离振子共振(SPR)提供若干优点：(i)无需标记抗体或抗原；(ii)抗体不需要事先纯化，细胞培养物上清液可直接使用；(iii)实时测定，能够快速半定量地比较不同单克隆抗体的相互作用，能够和足以用于许多评价目的；(iv)生物特异性表面可再生，使得可以容易地在相同条件下比较一系列不同单克隆抗体；(v)分析步骤完全自动化，大量测定可以在没有操作人员干预的情况下进行。BIAapplications Handbook(《BIA应用手册》)，AB版(1998再版)， 编号BR-1001-86；BIAtechnology Handbook(《BIA技术手册》)，AB版(1998再版)， 编号BR-1001-84。基于SPR的结合研究需要将结合对的一
个成员固定到传感器表面上。固定的结合伙伴称为配体。溶液中的结合伙伴称为分析物。
在某些情况下，配体通过结合于被称为捕获分子的另一固定分子间接地连接于表面。SPR响应反映出随着分析物的结合或解离，检测器表面上质量浓度的改变。
个成员固定到传感器表面上。固定的结合伙伴称为配体。溶液中的结合伙伴称为分析物。
在某些情况下，配体通过结合于被称为捕获分子的另一固定分子间接地连接于表面。SPR响应反映出随着分析物的结合或解离，检测器表面上质量浓度的改变。
[0280] 根据SPR，实时 测定直接监测正在发生的相互作用。该技术非常适合测定动力学参数。比较亲和力排序简单易行，动力学和亲和力常数都可获自传感图数据。
[0281] 以独立脉冲在配体表面上注射分析物时，所得的传感器图可分成三个基本相：(i)样品注射期间分析物与配体的结合；(ii)样品注射期间平衡或稳态，其中分析物结合速率与从复合物解离的速率达到平衡；(iii)缓冲液流动期间分析物与表面解离。
[0282] 结合和解离相提供有关分析物-配体相互作用的动力学的信息(ka和kd是复合物形成和解离的速率，kd/ka＝KD)。平衡相提供有关分析物-配体相互作用亲和力(KD)的信息。
[0283] BIA评估软件是综合的曲线拟合工具，其采用数值积分和全局拟合算法。通过对数据进行适当的分析，可由简单 研究获得相互作用的分离速率和亲和力常数。可通过此种技术测定的亲和力范围非常宽泛，从mM级到pM级。
[0284] 表位特异性是单克隆抗体的重要特征。与采用放射性免疫实验、ELISA或其它表面吸附方法的常规技术不同，用 进行表位作图不需要标记或纯化的抗体，并允许用若干单克隆抗体的序列进行多位点特异性测试。此外，大量分析可自动进行。
[0285] 逐对结合实验测试两种MAb同时结合同一抗原的能力。针对单独表位的MAb将单独结合，而针对相同或紧密相关表位的MAb将互相干扰结合。采用 进行的这些结合实验简单易行。
[0286] 例如，可使用捕获分子结合第一种Mab，随后依次加入抗原和第二种MAb。传感器图将揭示：(1)多少抗原结合第一Mab，(2)第二MAb结合表面连接抗原的程度，(3)如果第二MAb不结合，逆转逐对测试的顺序是否会改变结果。
[0287] 肽抑制是用于表位作图的另一项技术。抗原的一级序列已知时，这种方法可补充逐对抗体结合研究，并可将功能表位与结构特征相关联。测定肽或抗原片段对不同MAb与固定抗原的结合的抑制作用。假定干扰给定MAb的结合的肽与该MAb限定的表位结构相关。
[0288] 除非另有说明，本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，Sambrook等编(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第2版；冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))；Sambrook 等 编 (1992)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》()，(纽约州的冷泉港实验室出版社(Cold Springs Harbor Laboratory，NY))；D.N.Glover编，(1985)DNA Cloning(《DNA克隆》)，第I和II卷；Gait编(1984)Oligonucleotide Synthesis(《寡核苷酸合成》)；Mullis等，美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编(1984)Nucleic Acid Hybridization(《核酸杂交》)；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation(《转录和翻译》)；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(《动物细胞培养》)(ARL公司(Alan R.Liss，Inc.))；Immobilized Cells And Enzymes(《固定的细胞和酶》)(IRL出版社)(1986)；
Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning(《分子克隆实践指南》)；论文，Methods In Enzymology(《酶学方法》)(学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，纽约州)；Miller和Calos编(1987)Gene Transfer Vectors For MammalianCells(《哺乳动物细胞的基因转移载体》)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory))；Wu等编，Methods In Enzymology(《酶学方法》)，第154和155卷；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》)(伦敦的学术出版社(Academic Press，London))；Weir和Blackwell编(1986)Handbook Of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo(《小鼠胚胎操作》)，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，(1986)；和Ausubel等(1989)Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(马里兰州巴尔的摩的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，Baltimore，Md.))。
Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning(《分子克隆实践指南》)；论文，Methods In Enzymology(《酶学方法》)(学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，纽约州)；Miller和Calos编(1987)Gene Transfer Vectors For MammalianCells(《哺乳动物细胞的基因转移载体》)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory))；Wu等编，Methods In Enzymology(《酶学方法》)，第154和155卷；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》)(伦敦的学术出版社(Academic Press，London))；Weir和Blackwell编(1986)Handbook Of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo(《小鼠胚胎操作》)，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，(1986)；和Ausubel等(1989)Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(马里兰州巴尔的摩的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，Baltimore，Md.))。
[0289] 抗体工程的通用方法可参见Borrebaeck编辑(1995)Antibody Engineering(《抗体工程》)(第2版；牛津大学出版社(Oxford Univ.Press))。蛋白质工程的通用方法可参见Rickwood等编(1995)Protein Engineering，A Practical Approach(《蛋白质工程，实践方法》)，(英国牛津的牛津大学出版社的IRL出版公司(IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.))。抗体和抗体-半抗原结合的总体方法可参见：Nisonoff(1984)Molecular Immunology(《分子免疫学》)(第2版；马萨诸塞州桑德兰的辛奥尔联合公司(Sinauer Associates，Sunderland，Mass.))；和Steward(1984)Antibodies，Their Structure and Function(《抗体的结构和功能》)(Chapman和Hall，纽约州纽约市)。此外，本领域已知且没有具体描述的免疫学标准方法通常按照下述文献所述进行：Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》)，纽约州的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)；Stites等编(1994)，Basic and Clinical Immunology(《基础和临床免疫学》)(第8版；
Appleton和Lange，康涅狄格州诺沃克(Norwalk，Conn.))和Mishell和Shiigi(编)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(《细胞免疫学中的所选方法》)(纽约州的W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Co.，NY))。
Appleton和Lange，康涅狄格州诺沃克(Norwalk，Conn.))和Mishell和Shiigi(编)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(《细胞免疫学中的所选方法》)(纽约州的W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Co.，NY))。
[0290] 列出免疫学通用原理的标 准参考文献包括：Current Protocols inImmunology(《新编免疫学实验指南》)，纽约州的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)；
Klein(1982)J.，Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination(《免 疫学：自身-非自身区别的科学》)(纽约州的约翰韦利父子公司)；Kennett等编(1980)Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses(《单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新领域》)(纽约州普莱努公司(Plenum Press，NY))；
Campbell(1984)″Monoclonal Antibody Technology″in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology″(《生化和分子生物学实验室技术》中的“单克隆抗体技术”)，Burden等编(阿姆斯特丹的埃尔斯威尔公司(Elsevere，Amsterdam))；
Goldsby等编(2000)Kuby Immunnology(《酷比免疫学》)(第4版；H.弗里曼公司(H.Freemand&Co.))；Roitt等(2001)Immunology(《免疫学》)(第6版；伦敦：摩兹比公司(Mosby))；Abbas等(2005)Cellular and Molecular Immunology(《细胞和分子免疫学》)(第5版；埃尔斯威尔健康科学分公司(Elsevier Health Sciences Division))；
Kontermann和Dubel(2001)Antibody Engineering(《抗体工程》)(施普林格公司(Springer Verlan))；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))；Lewin(2003)Gene VIII(《基因VIII》)(普伦蒂斯霍尔出版社(Prentice Hall)2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)(冷泉港出版社)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCRPrimer(《PCR引物》)(冷泉港出版社)。
Klein(1982)J.，Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination(《免 疫学：自身-非自身区别的科学》)(纽约州的约翰韦利父子公司)；Kennett等编(1980)Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses(《单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新领域》)(纽约州普莱努公司(Plenum Press，NY))；
Campbell(1984)″Monoclonal Antibody Technology″in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology″(《生化和分子生物学实验室技术》中的“单克隆抗体技术”)，Burden等编(阿姆斯特丹的埃尔斯威尔公司(Elsevere，Amsterdam))；
Goldsby等编(2000)Kuby Immunnology(《酷比免疫学》)(第4版；H.弗里曼公司(H.Freemand&Co.))；Roitt等(2001)Immunology(《免疫学》)(第6版；伦敦：摩兹比公司(Mosby))；Abbas等(2005)Cellular and Molecular Immunology(《细胞和分子免疫学》)(第5版；埃尔斯威尔健康科学分公司(Elsevier Health Sciences Division))；
Kontermann和Dubel(2001)Antibody Engineering(《抗体工程》)(施普林格公司(Springer Verlan))；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))；Lewin(2003)Gene VIII(《基因VIII》)(普伦蒂斯霍尔出版社(Prentice Hall)2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)(冷泉港出版社)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCRPrimer(《PCR引物》)(冷泉港出版社)。
[0291] 将上文中引用的所有参考文献以及其中引用的参考文献全文纳入本文作参考。
[0292] 通过说明的方式、而非限制的方式提供以下实施例。实施例
[0293] 实施例1
[0294] CD100特异性抗体的选择和表征
[0295] 利用下述方法产生识别人、猴和鼠CD100的小鼠抗-CD100抗体。
[0296] “品系1”细胞系衍生自BALB/c小鼠的自发肺肿瘤。本发明人以前证明，用转染外源cDNA的活的品系1细胞注射BALB/c小鼠是诱导免疫应答的有效途径(数据未公开)。用编码全长人CD100 cDNA(SEQ ID NO：23)的表达质粒转染品系1细胞系。由转染细胞系分离表达人CD100的稳定细胞系(品系1.CD100)。用完全弗氏佐剂(CFA)乳化的纯化的小鼠CD100-组氨酸(具有用于纯化的C-末端6X组氨酸标记的小鼠CD100的胞外结构域)初免CD100缺陷小鼠(BALB/c背景，参见Kumanogoh等，J.Immunol.169：1175-1181(2002))。
进行该免疫后一周，该小鼠肌肉内(i.m.)注射200,000个活的品系1.CD100细胞。注射品系1.CD1009天后，处死小鼠，收集脾脏，按照标准程序与P3X63Ag8.653融合伙伴(ATCC# CRL-1580)融合产生杂交瘤。通过ELISA筛选结合人和小鼠CD100的杂交瘤克隆。具体说，用杂交瘤技术制备MAb 67特异性的杂交瘤细胞系。(Kohler等，Nature 256：495(1975)；
Kohler 等，Eur.J.Immunol.6：511(1976)；Kohler 等，Eur.J.Immunol.6：292(1976)；
Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(《单克隆抗体和T细胞杂交瘤》)，纽约州埃尔斯威尔公司(Elsevier，N.Y.)，第571-681页(1981))。产生一大类小鼠CD100特异性抗体。这些抗体中，大多数以高亲和力结合人CD100。两种杂交瘤，即克隆67-2和76-1，产生对小鼠和人CD100均显示出高亲和力的单克隆抗体(分别称为MAb 67和MAb 76)(见表2)。
进行该免疫后一周，该小鼠肌肉内(i.m.)注射200,000个活的品系1.CD100细胞。注射品系1.CD1009天后，处死小鼠，收集脾脏，按照标准程序与P3X63Ag8.653融合伙伴(ATCC# CRL-1580)融合产生杂交瘤。通过ELISA筛选结合人和小鼠CD100的杂交瘤克隆。具体说，用杂交瘤技术制备MAb 67特异性的杂交瘤细胞系。(Kohler等，Nature 256：495(1975)；
Kohler 等，Eur.J.Immunol.6：511(1976)；Kohler 等，Eur.J.Immunol.6：292(1976)；
Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(《单克隆抗体和T细胞杂交瘤》)，纽约州埃尔斯威尔公司(Elsevier，N.Y.)，第571-681页(1981))。产生一大类小鼠CD100特异性抗体。这些抗体中，大多数以高亲和力结合人CD100。两种杂交瘤，即克隆67-2和76-1，产生对小鼠和人CD100均显示出高亲和力的单克隆抗体(分别称为MAb 67和MAb 76)(见表2)。
[0297] 表2.小鼠抗-CD100MAb的亲和力测定
[0298]
[0299] *用 表面等离振子共振技术测定亲和力。
[0300] 抗体交叉阻断ELISA显示出，MAb 67和MAb 76识别CD100上的不同表位。此外，MAb 67和76识别的表位与单独产生的鼠抗-人CD100抗体BD16识别的表位不同(如US2008/0219971A1所述)。因此，产生两种单独的小鼠抗-CD100抗体MAb 76(参见SEQ ID NO：25-40)和MAb 67(参见SEQ ID NO：3-8；10；11-16；18；20和22)。
[0301] 实施例2
[0302] MAb 67和76阻断小鼠和人CD100的体外活性
[0303] 在荧光阻断实验中，筛选CD100特异性抗体抑制CD100结合的能力。用于检测CD100特异性抗体是否阻断CD100与丛蛋白B1结合的方法见图1。用编码CD100受体：丛蛋白B1的cDNA转染人293细胞。选择表达丛蛋白B1的稳定细胞系(293/丛蛋白)。利用生物素偶联的组氨酸标签特异性单克隆抗体和链霉亲和素-APC，通过流式细胞术检测结合细胞表面上丛蛋白B1的CD100-组氨酸。检测的抗-CD100MAb能够阻断CD100与丛蛋白B1结合时，在细胞上检测到较少的CD100-组氨酸，导致荧光较弱。
[0304] 40纳克(ng)人或小鼠CD100-组氨酸(C-末端组氨酸标签)单独培育，或与不同浓度的抗-CD100MAb一起于4℃培育过夜。第二天早晨，将(1)仅CD100或(2)用抗-CD100 MAb(67或76)预孵育的CD100与293/丛蛋白细胞混合，冰上孵育30分钟。通过丛蛋白B1结合细胞的CD100用生物素化多克隆兔抗-组氨酸MAb、然后是链霉亲和素-APC进行检测，通过流式细胞术分析细胞。结果表明，中和CD100导致荧光较弱。具体说，与只有CD100相比，用MAb 67或MAb 76预孵育CD100导致荧光较弱(图2)。抗-CD100 MAb 67或76的浓度从0.156μg/ml提高到0.625μg/ml导致荧光进一步减弱。也观察到对人CD100的类似阻断(数据未显示)。因此，这些结果显示，MAb 67和MAb 76均能够阻断人和小鼠CD100与丛蛋白B1结合。
[0305] 已证明，CD100/丛蛋白B1信号转导能通过诱导肌动蛋白丝重组织诱导细胞从胞外基质脱附和细胞破坏(参见Kruger等，Nature Reviews Molecular Cell Biology 6：789-800(2005))。利用在结合于胞外基质后测定细胞脱附的异源实验确定抗-CD100抗体是否可阻断CD100诱导的293/丛蛋白细胞从纤连蛋白包被平板上脱附。
[0306] 在细胞脱附实验中，将293/丛蛋白细胞(通常培养为悬浮细胞系)以40,000个细胞/孔的密度接种于纤连蛋白包被的96孔板中，使其贴壁过夜。2μg/ml小鼠CD100-组氨酸(C-末端组氨酸标签)单独或与不同浓度的抗-CD100 MAb(67或76)一起于4℃培育6小时。然后，使CD100样品回复至室温，然后加入293/丛蛋白细胞。利用CD100或已用抗体在37℃预孵育30分钟的CD100处理细胞，用PBS洗涤两次，用结晶紫染色15分钟。然后，用PBS洗涤细胞两次并干燥。在扫描仪上获得图像作记录。然后，在室温下用100μl
33％冰醋酸溶解结晶紫，将其吸移到新平板中。在570nm读出吸光度。CD100引起平板贴附细胞的数量减少，因此吸光度降低，而中和CD100导致吸光度增加。
33％冰醋酸溶解结晶紫，将其吸移到新平板中。在570nm读出吸光度。CD100引起平板贴附细胞的数量减少，因此吸光度降低，而中和CD100导致吸光度增加。
[0307] 如图3所示，与同种型对照相比，MAb 67和MAb 76均能够阻断小鼠CD100介导的细胞脱附并提高吸光度。类似地，两种MAb均能够阻断人CD100介导的细胞脱附(数据未显示)。
[0308] MAb 67和76阻断CD100与细胞表面丛蛋白B1结合，并诱导293/丛蛋白细胞从纤连蛋白包被平板上脱附。上述体外功能实验的结果证明，MAb 67和MAb 76均能够在体外阻断小鼠和人CD100的功能。
[0309] 实施例3
[0310] 在小鼠疾病模型中评价抗-CD100单克隆抗体
[0311] 在SJL EAE动物模型中体内检测抗-CD100中和性单克隆抗体(76和67)。复发性实验性自身免疫脑脊髓炎(R-EAE)是CD4+T细胞-介导的疾病，其特征是中枢神经系统内的炎症和脱髓鞘。在SJL小鼠中，用蛋白脂质蛋白质的肽表位(PLP139-151)(HSLGKWLGHPDKF；SEQ ID NO：24)免疫可诱导R-EAE。这一模型的特征是中度至重度的急性瘫痪期，随后是消退和后续复发。用表3所列的评分方法对疾病严重程度进行评分。
[0312] 表3.EAE临床体征的评价
[0313]
[0314] 用CFA配制的100μg PLP139-151免疫SJL小鼠。在第0天给予百日咳毒素，48小时后再次给予。用30mg/kg MAb 76、67或同种型对照抗体治疗小鼠，从第0天开始每周两次，或从第7天开始每周一次。从EAE诱导后从第10天开始对EAE临床体征进行评分。
[0315] 如图4A所示，与小鼠IgG对照相比，在SJL小鼠中用MAb 76或MAb 67治疗能降低EAE严重程度。在第21天和研究结束之间，MAb 76和67、1X/周和2x/周的组平均评分(GMS)的降低百分数见图4B。如图4B所示，MAb 76(1X/周)对GMS的抑制百分数为35-40％；MAb 67(1X/周)对GMS的抑制百分数为65-70％；MAb 76(2X/周)对GMS的抑制百分数为40-50％；和MAb 67(2X/周)对GMS的抑制百分数为45-50％。这些结果说明，在SJL小鼠中MAb 67和MAb 76均能减轻复发缓解型EAE。
[0316] 用MAb 76以30mg/kg剂量和1X/周的给药方案重复SJL EAE研究。结果进一步证明，与小鼠IgG相比，在SJL小鼠中MAb 76能够降低EAE的严重程度(数据未显示)。在第21天和研究结束之间，组平均评分(GMS)的降低百分数为50-60％。而且，利用MAb 76或MAb 67以30mg/kg、1X/周的给药方案重复SJL EAE研究。用MAb 67或MAb 76治疗导致在第21天和研究结束之间，GMS降低百分数为30-40％。图5A和5B的结果进一步证明，在SJL小鼠中MAb 76和MAb 67能够降低EAE的严重程度。
[0317] 利用MAb 67以30mg/kg、1X/周的给药方案重复SJL EAE研究，其中治疗从免疫后第7天开始。从第7天开始用MAb 67治疗导致在第21天和研究结束之间，GMS降低百分数约为50％。结果见图6。
[0318] 这些体内研究的结果证明，在不同的鼠EAE实验中，用MAb 76或MAb67中和CD100能减轻EAE的临床体征。在这些实验中，MAb 76和MAb 67的结果类似。
[0319] 这些结果表明，MAb 76和MAb 67能够在体外阻断CD100活性，更重要的是，能够在小鼠EAE模型上进行的不同给药实验中减轻EAE严重程度。
[0320] 实施例4
[0321] 嵌合和人源化抗-CD100单克隆抗体的制备
[0322] 上述鼠单克隆抗体克隆67显示能够在体外中和人和小鼠CD100并在鼠模型体内改善EAE。
[0323] 从克隆67杂交瘤克隆重链可变区(VH)和轻链可变区(VK)基因，并测定其序列。MAb 67VH和VK基因的氨基酸序列见下，其中CDR1、CDR2和CDR3区域用下划线表示。
[0324] MAb 67 VH：
[0325] QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFSDYYMHWVKQSPENSLEWIGQINPTTGGASYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEESAVYYCTRYYYGRHFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：10)
[0326] MAb 67VK：
[0327] DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：18)
[0328] 将MAb 67VH基因克隆到含有人γ4重链恒定区编码序列的哺乳动物表达载体中，产生全长嵌合重链。将MAb 67VK克隆到具有人κ恒定区编码序列的哺乳动物表达载体中，产生全长嵌合轻链。为了制备嵌合抗体，将含有嵌合重链和嵌合轻链的表达载体共转染到CHO-S细胞内。产生的单克隆抗体由细胞分泌，3-6天表达期过后收获。利用蛋白质A色谱纯化所得MAb并进行表征。通过流式细胞术和ELISA证明所得的嵌合MAb(MAb 2368)对CD100有特异性，并显示能够与鼠MAb 67竞争结合CD100。总之，这些数据证明，分离到编码所述67MAb的正确的VH和VK基因。
[0329] 利用MAb 67可变CDR区产生人源化单克隆抗体。将人源化VH和VK基因分别克隆到含有人γ4和人κ恒定区的载体中。成对的人源化VH和人源化VK产生IgG4/κMAb2503。人源化MAb 67VH(H2160)和VK(L553)的氨基酸序列如下所示，其中CDR1、CDR2和CDR3区域用下划线表示。
[0330] H2160的序列：
[0331] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFSDYYMHWVRQAPGQGLEWMGQINPTTGGASYNQKFKGKATITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYYGRHFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：9)
[0332] L553的序列：
[0333] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：17)
[0334] 将编码MAb 2503抗体的VH(具有人γ的人免疫球蛋白基因；H2160)和VK(具有人κ的人免疫球蛋白基因；L553)区的多核苷酸克隆到pCMV-Script(司查塔基公司(Stratagene))载体内，并于2009年5月7日保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，获得的ATCC保藏号分别为PTA-10004和PTA-10005。ATCC位于美国弗吉尼亚州玛纳萨斯(20110-2209)的大学大道10801号(10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，USA)。按照布达佩斯条约有关国际认可的微生物保藏机构的条款，出于专利程序目的，在ATCC进行保藏。
[0335] 实施例5
[0336] 人源化抗-CD100单克隆抗体2503的表征
[0337] 通过ELISA和流式细胞术鉴定MAb 2503的特异性。在采用MAb 67的表位竞争实验中和采用 表面等离振子共振技术的亲和力测定实验中检测MAb 2503。
[0338] 通过竞争ELISA测定MAb 2503和MAb 67的表位特异性。在ELISA方案中，用CD100-Fc包被ELISA平板。滴定小鼠67或人源化2503MAb。让抗体结合CD100，并洗去未结合的抗体。加入生物素化MAb 67。让抗体结合CD100，并洗去未结合的抗体。用链霉亲和素-HRP检测结合CD100的生物素化MAb 67。用ELISA分析MAb 2503或MAb 67阻断生物素化67与人CD100(图7A)和小鼠CD100(图7B)结合的能力。
[0339] 用 表面等离振子共振技术测定抗-CD100MAb的结合亲和力。MAb2503只能结合CD100(人、小鼠和狨)和CD100表达细胞系，表明MAb 2503对CD100有特异性。与MAb 67相比，MAb 2503对人和小鼠CD100的亲和力较高。有关MAb 2503和MAb
67的亲和力特征的小结见表4。
67的亲和力特征的小结见表4。
[0340] 表4.抗-CD100MAb对人、狨和小鼠CD100的亲和力
[0341]
[0342] *用 表面等离振子共振技术测定亲和力。
[0343] 这些实验表明，MAb 2503对CD100有特异性，并且与小鼠MAb 67结合相同的表位。MAb 2503显示能结合小鼠和人的CD100，因此MAb 2503的优势是可以在小鼠和人中测定其安全性和功效。而且，已证明MAb 2305能结合人、猴和小鼠的CD100。
[0344] 实施例6
[0345] MAb 2503阻断小鼠和人CD100的体外活性
[0346] 利用上述实施例2所述的实验，包括(1)流式细胞术阻断实验和(2)细胞脱附实验，测定MAb 2503阻断CD100功能的能力。
[0347] 在荧光阻断实验中，筛选CD100特异性抗体MAb 67和MAb 2503抑制CD100与丛蛋白B1结合的能力。用于检测CD100特异性抗体是否阻断CD100与丛蛋白B1结合的方法见图1(实施例2)。与只有CD100相比，用MAb 67或MAb 2503预孵育CD 100导致荧光较弱。MAb 2503能够在体外阻断人(见图8A)、狨(见图8B)和小鼠(见图8C)CD100的结合。因此，这些结果显示，MAb67和MAb 2503均能够阻断人、猴和小鼠CD100与丛蛋白B1结合。
[0348] 利用如实施例2所述的细胞脱附实验测定抗-CD100MAb阻断人和猴CD100介导的293/丛蛋白细胞从纤连蛋白包被平板上脱附的能力。CD100引起平板贴附细胞数量减少，因此吸光度降低。用MAb2503或MAb 67中和人CD100和狨CD100导致吸光度增加，分别如图9A和9B所示。该实验中，MAb 2503和MAb 67也中和小鼠CD100(数据未显示)。
[0349] MAb 2503阻断人、小鼠和猴CD100与细胞表面丛蛋白B1结合，并诱导293/丛蛋白细胞从纤连蛋白包被平板上脱附。因此，这些结果表明，MAb 2503能够在功能上中和人、小鼠和猴CD100。
[0350] 实施例7
[0351] 抗-CD100抗体在体内抑制血管新生
[0352] CD100是强效的促血管新生分子，通过CD100结合活化丛蛋白B1能反式激活c-Met，提高肿瘤细胞的侵袭能力并促进血管新生。
[0353] 为了证明缺乏CD100对肿瘤生长的体内影响，将CT26肿瘤细胞注射到野生型Balb/c或CD100-/-小鼠的腿部肌肉内，测定所得的肿瘤生长。如图10所示，在本研究中，与野生型Balb/c小鼠相比，CD100-/-小鼠的肿瘤体积缩小。这些结果证明，在缺少CD100的环境中小鼠结肠癌细胞系(CT26)的生长受损。
[0354] 接下来，在野生型Balb/c小鼠中测定MAb 67降低CT26肿瘤细胞生长的能力。将CT26肿瘤细胞注射到野生型Balb/c(n＝48)或CD100-/-(n＝9)小鼠的腿部肌肉内。注射后，将野生型小鼠分成两组，每组24只小鼠。一组通过从第1天开始腹膜内注射1mg MAb67进行治疗，另一组通过腹膜内注射1mg小鼠IgG进行治疗。每7天重复治疗一次。分析小鼠的肿瘤生长。如图11所示，在Balb/c小鼠中，与小鼠IgG对照组相比，用MAb 67治疗能降低CT26肿瘤的生长。
[0355] 因此，这些结果表明，具有MAb 67的结构和功能特征的抗体能在体内降低肿瘤生长。
[0356] 实施例8
[0357] 抗-CD100抗体在体内抑制胶原诱导性关节炎
[0358] 在胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型中检测MAb 67减轻关节炎的能力。胶原诱导性关节炎(CIA)模型是广泛用于解释疾病病理和验证治疗性RA靶点的类风湿性关节炎(RA)的临床前动物炎症模型(Brand等，Nat.Protoc.2(5)：1269-75(2007))。CIA总程序如图12所示(对该总程序的任何改动如下所述)。简要说，在第0天，通过皮内尾部注射含有胶原和完全弗氏佐剂(CFA)的乳液诱导关节炎。然后，从第20天开始每周两次通过皮下(s.c.)或腹膜内(i.p.)注射给予对照和测试治疗。研究1的测试组如表5所示。
[0359] 表5.胶原诱导性关节炎(CIA)研究1测试组
[0360]
[0361] 用表6所列的评分方法对疾病严重程度进行评分。对各小鼠的爪进行评分(每周三次评价关节炎的宏观体征)。通过加入单独的爪评分计算关节炎指数(AI)(AI最大值＝16)。通常，在免疫后21-28天，CIA模型中第一次出现关节炎体征。
[0362] 表6.CIA评分方法
[0363]评分 说明
0 没有观察到关节炎效应
1 1个指头出现水肿和/或红斑
2 2个指头出现水肿和/或红斑
3 多于2个指头出现水肿和/或红斑
4 整个爪和全部指头出现严重关节炎
0 没有观察到关节炎效应
1 1个指头出现水肿和/或红斑
2 2个指头出现水肿和/或红斑
3 多于2个指头出现水肿和/或红斑
4 整个爪和全部指头出现严重关节炎
[0364] 研究1的结果证明，600μg MAb 67治疗组的CIA模型中关节炎疾病进展减缓。在第20天开始治疗时，600μg MAb 67治疗的小鼠的关节炎指数(AI)与600μg阴性对照(IgG1)和600μg阳性对照(依那西普)治疗的小鼠的AI作比较。结果见图13A。这些结果表明，在减缓CIA模型的关节炎疾病进展方面，MAb67与依那西普同样好，甚至优于依那西普。
[0365] 第二项研究(研究2)包括MAb 67和阳性对照治疗，其中治疗推迟，即从关节炎指数≥3时开始治疗。研究2的测试组如表7所示。
[0366] 表7.胶原诱导性关节炎(CIA)研究2测试组
[0367]
[0368] 在研究2中，将MAb 67治疗的AI结果(治疗从第20天或AI≥3时开始)与阴性对照(IgG1)和阳性对照(依那西普；治疗从AI≥3时开始)治疗结果作比较。结果见图13B。这些结果说明，在减缓CIA模型的关节炎疾病进展方面，治疗从第20天或推迟至AI≥3时开始时，MAb 67与依那西普同样好，甚至优于依那西普。因此，在CIA模型中，在AI≥3时开始给药时，MAb 67能防止关节炎疾病进展并治疗关节炎疾病。
[0369] 实施例9
[0370] 抗-CD100抗体在体内阻断原发和记忆B细胞应答
[0371] 用明矾(氢氧化铝/氢氧化镁)沉淀的(4-羟基-3-硝基苯基)乙酰基偶联的鸡γ球蛋白(″NP-CGG″)免疫Balb/c和CD100-/-小鼠，然后用对照IgG1(Balb/c和CD100-/-)或MAb 67(仅Balb/c)治疗。测试组如下表8所示。
[0372] 表8.测试组的原发和记忆B细胞应答
[0373]
[0374] 如上表8所述，从第-7天开始治疗小鼠，并在第0天用NP-CGG免疫。在第10天，每组处死三只小鼠，分析脾脏和淋巴结的生发中心(GC)B细胞(“B220+CD38低PNA+”)。各脾脏进行单独分析，将所有三只小鼠的淋巴结合并成一个样品进行分析。如表8所示，继续对其余小鼠进行治疗。在第21天，用含有明矾的相同NP-CGG对小鼠进行加强免疫。在第31天，将其余小鼠处死，分析脾脏和淋巴结的生发中心(GC)B细胞(“B220+CD38低PNA+”)。各脾脏进行单独分析，将所有三只小鼠的淋巴结合并成一个样品中进行分析。图14A和B的结果表明，首次免疫(14A)和第二次免疫(14B)后，用600μg MAb67治疗能减少脾脏(SP)和淋巴结(LN)中的GC B细胞数量。因此，MAb 67能在体内阻断首次和记忆B细胞应答。
[0375] 实施例10
[0376] 抗-CD100抗体在体内减缓肿瘤生长
[0377] 在CT26和BCA34小鼠异种移植瘤模型中检测MAb 67对肿瘤生长的抑制作用。在这些研究中，将肿瘤细胞肌肉内注射至Balb/c小鼠腿部。从植入后1天开始，以1X/周的频率腹膜内(i.p.)注射0.2ml体积的1mg MAb 67抗体或阴性对照(IgG)，以治疗小鼠。测3 3
定肿瘤体积(mm)和/或大腿体积(mm)的改变，以确定肿瘤生长速率。利用与阴性对照小鼠的肿瘤生长速率相比MAb 67治疗小鼠的肿瘤生长速率计算肿瘤生长延迟(TGD)。
定肿瘤体积(mm)和/或大腿体积(mm)的改变，以确定肿瘤生长速率。利用与阴性对照小鼠的肿瘤生长速率相比MAb 67治疗小鼠的肿瘤生长速率计算肿瘤生长延迟(TGD)。
[0378] 还检测BCA34和EMT6肿瘤细胞在缺乏CD100的环境中生长的能力。在这些研究中，将肿瘤细胞注射到Balb/c和CD100-/-(SEMA4D-/-)小鼠腿内，测定肿瘤生长。
[0379] CT26结肠肿瘤细胞
[0380] CT26肿瘤细胞衍生自鼠结肠肿瘤，其CD100表达水平非常低。用50,000个CT26结肠肿瘤细胞s.c注射野生型Balb/c小鼠(20只小鼠/治疗组)。与注射IgG对照的小鼠3
相比，测定从植入后第1天开始每周用1mg MAb 67治疗的小鼠的肿瘤体积改变(mm)。结果(随时间变化的平均肿瘤体积)见图15。MAb 67治疗小鼠的TGD为17％(p＝0.0317)。
这些结果表明，MAb 67治疗的小鼠中CT26肿瘤生长降低。
相比，测定从植入后第1天开始每周用1mg MAb 67治疗的小鼠的肿瘤体积改变(mm)。结果(随时间变化的平均肿瘤体积)见图15。MAb 67治疗小鼠的TGD为17％(p＝0.0317)。
这些结果表明，MAb 67治疗的小鼠中CT26肿瘤生长降低。
[0381] BCA34成纤维细胞肿瘤细胞
[0382] BCA34肿瘤细胞中CD100表达水平较低。首先，将50,000个BCA34肿瘤细胞皮下注射到野生型Balb/c小鼠或CD100-/-(“SEMA4D-/-”)小鼠的腹部区域内。测定这些小3
鼠的肿瘤体积改变(mm)，结果如图16A所示。这些结果表明，BCA34肿瘤细胞在缺少CD100的环境中生长受损。
鼠的肿瘤体积改变(mm)，结果如图16A所示。这些结果表明，BCA34肿瘤细胞在缺少CD100的环境中生长受损。
[0383] 在单独实验中，将50,000个BCA34肿瘤细胞注射到野生型Balb/c小鼠的腿部肌肉内(21只小鼠/治疗组)。与注射IgG对照的小鼠相比，测定从植入后第1天开始每周用3
1mg MAb 67治疗的小鼠的肿瘤体积改变(mm)。结果(随时间变化的平均大腿体积)见图
16B。MAb 67治疗小鼠的TGD为18％(p＝0.009)。这些结果表明，MAb 67治疗的小鼠中BCA34肿瘤生长降低。
1mg MAb 67治疗的小鼠的肿瘤体积改变(mm)。结果(随时间变化的平均大腿体积)见图
16B。MAb 67治疗小鼠的TGD为18％(p＝0.009)。这些结果表明，MAb 67治疗的小鼠中BCA34肿瘤生长降低。
[0384] EMT6乳腺癌肿瘤细胞
[0385] EMT6肿瘤细胞衍生自鼠乳腺癌肿瘤，其CD100表达水平中等。将50,000个EMT6肿瘤细胞注射到野生型Balb/c小鼠或CD100-/-(“SEMA4D-/-”)小鼠的腿部肌肉内。测定这3
些小鼠的肿瘤体积改变(mm)，结果如图17所示。显示了野生型Balb/c小鼠和CD100-/-小
3
鼠(“SEMA4D-/-”)的肿瘤体积改变(mm)。这些结果表明，EMT6肿瘤细胞在缺少CD100的环境中生长受损。
些小鼠的肿瘤体积改变(mm)，结果如图17所示。显示了野生型Balb/c小鼠和CD100-/-小
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鼠(“SEMA4D-/-”)的肿瘤体积改变(mm)。这些结果表明，EMT6肿瘤细胞在缺少CD100的环境中生长受损。
[0386] 实施例11
[0387] 抗-CD100抗体在体内减缓人肿瘤生长
[0388] 在HN12和HN6 HIF1a mODD人异种移植瘤模型中检测MAb 2503对肿瘤生长的抑制作用。HN12和HN6 HIF1a mODD衍生人头颈肿瘤，这两种异种移植瘤均高水平表达HIF1a和CD100。HN6 HIF-1a mODD异种移植瘤模型可参见Sun等，J Biol Chem 284(46)：32066-74(2009)。在这些实验中，将2个肿瘤/小鼠皮下注射到无胸腺裸小鼠内(10只小鼠/治疗组)。从植入后1天开始，以1X/周的频率i.p.注射0.2ml体积的1mg MAb 2503
3
抗体或阴性对照(IgG4)，以治疗小鼠。测定肿瘤体积改变(mm)。利用与阴性对照小鼠的生长速率相比MAb 2503治疗的HN6 HIF-1a mODD小鼠的肿瘤生长速率计算肿瘤生长延迟(TGD)。
3
抗体或阴性对照(IgG4)，以治疗小鼠。测定肿瘤体积改变(mm)。利用与阴性对照小鼠的生长速率相比MAb 2503治疗的HN6 HIF-1a mODD小鼠的肿瘤生长速率计算肿瘤生长延迟(TGD)。
[0389] 该实验的终点是TGD。HN12和HN6 HIF-1a mODD异种移植瘤模型中MAb 2503治疗的肿瘤生长结果分别参见图18和19A。用MAb 2503治疗的HN6 HIF-1a mODD异种移植瘤小鼠的TGD为13％(p＝0.0008)。而且，IgG4对照和MAb 2505治疗的HN6 HIF-1a mODD异种移植瘤小鼠的代表性肿瘤照片见图19B。这些结果表明，用MAb 2503治疗能在体内降低人头颈肿瘤的生长。
[0390] 实施例12
[0391] 表达高滴度MAb 2503的稳定的CHO-S细胞系
[0392] 获得表达高滴度MAb 2503的稳定的CHO-S细胞系。利用人源化抗-CD100单克隆TM抗体2503的重链和轻链的互补DNA(cDNA)，利用GPEx 技术(威斯康星州麦迪逊的卡塔兰药物解决方案公司(Catalent Pharma Solutions，Madison，Wisconsin))和祖细胞CHO-S细胞(参见Bleck等，An Alternative Method for the Rapid Generation of Stable，High-Expressing Mammalian Cell Lines(“快速产生稳定的高表达哺乳动物细胞系的替代方法”)，BioProcessing Journal(2005年9/10月))构建产生若干中华仓鼠卵巢(CHO-S)表达细胞系。
[0393] 单细胞克隆后，根据在培养物中的生长和抗体产量选择一个表达克隆，产生装瓶的表达细胞研究库。利用体外和体内功能实验(如，流动阻断和脱附实验)鉴定该克隆产生的表达抗体的功效和特异性。随后，培养扩增来自所选CHO表达克隆的细胞，制备和冷冻第二个库(亲代种子储库(Parental Seed Stock))。随后，培养扩增来自亲代种子储库中一瓶的细胞，并用于cGMP产生主细胞库(Master Cell Bank，MCB)。
[0394] 实施例13
[0395] 在大鼠和猕猴中进行抗-CD100抗体剂量和PK研究
[0396] 在大鼠和猕猴中进行MAb 2503的单次静脉内注射饱和分析。
[0397] 大鼠研究：向36只SD(Sprague-Dawley)大鼠单次静脉内注射给予0.01至100mg/kg的MAb 2503(3只/性别/组)。在对不同时间点的裂解全血进行基于流式细胞术的饱和实验，以确定用MAb 2503饱和的细胞靶点(SEMA4D)的百分数。与血清中检测到的MAb含量的良好数据相关性提示，饱和依赖于血清中游离药物的含量，在血清中检测到大约1-5μg/ml游离药物时细胞被饱和。在雄性和雌性大鼠中，MAb 2503剂量为0、0.01、0.1、1.0、10和100mg/kg时SEMA4D的饱和百分数分别如图20A和20B所示。
[0398] 灵长动物研究：向28只猕猴单次静脉内注射给予0.01至100mg/kg的MAb 2503(2只/性别/组；4只/性别/对照组)。对不同时间点的裂解全血进行基于流式细胞术的饱和实验，以确定用MAb 2503饱和的细胞靶点(SEMA4D)的百分数。与血清中检测到的MAb含量的良好数据相关性提示，饱和依赖于血清中游离药物的含量，在血清中检测到大约1-5ìg/ml游离药物时细胞被饱和。在雄性和雌性大鼠(合并)中，MAb 2503剂量为0、0.01、0.1、1.0、10和100mg/kg时SEMA4D的饱和百分数如图21所示。大鼠和灵长动物饱和结果非常类似。
[0399] 在大鼠和灵长动物中单次静脉内注射0.01、0.1、1.0、10或100mg/kg MAb2503后，药代动力学(PK)结果包括生物学半衰期(小时(天))、在注射后时间0点的血浆抗体浓度(C0)和从时间0点到t时间点的血浆浓度曲线的曲线下面积(AUC0-t)如表9所示。
[0400] 表9.在大鼠和灵长动物(猕猴)中2503抗体的PK值
[0401]
[0402] 发现MAb 2503在大鼠和猕猴中的清除半衰期相似，以剂量依赖方式从约6小时至约10天。饱和与PK结果看来是剂量依赖性的，这提示大鼠和猕猴的情况明显类似。而且，MAb 2503剂量范围从0.01到100mg/kg时，在大鼠或猕猴中未见明显毒性。
[0403] 以上具体实施方式的描述完全揭示了本发明的一般性质，可以通过应用本领域技术人员的知识，他人无需过多的试验很容易对这些具体实施方式进行修改和/或调试以用于各种应用而不背离本发明总体理念。因此，基于本文所列出的教导和指导，这些修改和改良包括在所揭示的实施方式的含义和等价内容范围之内。应当理解本文中的措词和术语仅仅是描述性的而非限制性的，因此本说明书的术语或措词可由本领域技术人员根据所述教导和指导解读。
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