抗-FcRH5抗体和免疫缀合物以及应用方法
阅读：157发布：2021-09-19
专利汇可以提供抗-FcRH5抗体和免疫缀合物以及应用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于 治疗 哺乳动物 中造血系统 肿瘤 的物质的组合物以及使用那些物质的组合物治疗哺乳动物中造血系统肿瘤的方法。，下面是抗-FcRH5抗体和免疫缀合物以及应用方法专利的具体信息内容。
1.抗-FcRH5抗体，其包含:
(a)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含:
(i)HVR-L1，其包含序列KASQNVGSNVA(SEQ ID NO:28)；
(ii)HVR-L2，其包含序列SASYRYS(SEQ ID NO:29)；和
(iii)HVR-L3，其包含序列QQYKTWT(SEQ ID NO:30)；
(b)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：
(i)HVR-H1，其包含序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:37)或GYTFTNYGIN(SEQ ID NO:22的氨基酸残基26-35)；
(ii)HVR-H2，其包含序列NTYTGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO:38)；和
(iii)HVR-H3，其包含序列ARRSIPYYYAMDY(SEQ ID NO:39)。
2.权利要求1的抗体，其中构架序列的至少一部分是人共有构架序列。
3.权利要求1的抗体，其包含人κ亚组1共有构架序列。
4.权利要求1的抗体，其包含重链人亚组III共有构架序列。
5.人源化的根据权利要求1-4中任一项所述的抗-FcRH5抗体，其中所述人源化的抗体当缀合于细胞毒性剂时抑制肿瘤细胞生长。
6.权利要求1的抗体，其中所述重链可变结构域包含分别在SEQ ID NOs:33-36中所示的FR1-HC,FR2-HC,FR3-HC和FR4-HC序列。
7.权利要求6的抗体，其中所述抗体包含分别在SEQ ID NO:40和41中所示的CH1和Fc序列。
8.权利要求1的抗体，其中所述轻链可变结构域包含分别在SEQ ID NOs:24-27中所示的FR1-LC,FR2-LC,FR3-LC和FR4-LC序列。
9.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含在SEQ ID NO:31中所示的CL1序列。
10.权利要求1的抗体，其包含在SEQ ID NO:21中所示的序列。
11.权利要求1的抗体，其包含在SEQ ID NO:19中所示的序列。
12.通过下述方法制备的抗体:
(a)培养表达抗体的细胞，所述抗体包含权利要求1的抗体的重链可变结构域和权利要求1的抗体的轻链可变结构域；和
(b)从所述培养的细胞分离所述抗体。
13.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单价的并且包含Fc区域。
14.权利要求1的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体。
15.权利要求14的抗体，其特异性结合CD3。
16.权利要求15的抗体，其是突起-进入-空穴抗体。
17.权利要求16的抗体，其是未糖基化的。
18.权利要求17的抗体，其在大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细胞中生产。
19.权利要求17的抗体，其缺少一种或多种Fc效应子功能。
20.权利要求19的抗体，其缺少ADCC活性。
21.多核苷酸，其编码权利要求1-20中任一项的抗体。
22.载体，其包含权利要求21的多核苷酸。
23.宿主细胞，其包含权利要求22的载体。
24.制备根据权利要求1-20中任一项的抗-FcRH5抗体的方法，其中所述方法包括(a)在适合于表达编码所述抗体的多核苷酸的条件下，培养选自真核细胞的宿主细胞，和(b)分离所述抗体。
25.权利要求24所述的方法，其中所述真核细胞是CHO细胞。
26.权利要求1-20中任一项的抗体，其中所述FcRH5在细胞的表面上表达。
27.权利要求26的抗体，其中所述细胞是B细胞。
28.权利要求27的抗体，其中所述B细胞与B细胞增生性疾病相关。
29.权利要求27的抗体，其中所述B细胞与浆细胞疾病相关。
30.权利要求28的抗体，其中所述B细胞增生性疾病是癌症。
31.权利要求29的抗体，其中所述浆细胞疾病是癌症。
32.权利要求30的抗体，其中所述B细胞增生性疾病选自淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性惰性NHL、难治性NHL、难治性惰性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、多毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
33.权利要求31的抗体，其中所述浆细胞疾病选自意义未定的单克隆γ-球蛋白病(MGUS)、多发性骨髓瘤(MM)、巨球蛋白血症、重链病、系统性轻链淀粉样变性(AL)、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、多发性孤立性浆细胞瘤、浆细胞性白血病、B细胞非霍奇金淋巴瘤、B-细胞慢性淋巴细胞性白血病。
34.权利要求1-20中任一项的抗体,其中所述抗体是单克隆抗体。
35.权利要求34的抗体，其中所述抗体是选自Fab,Fab’-SH,Fv,scFv或(Fab’)2片段的抗体片段。
36.免疫缀合物，其包含与细胞毒性剂共价连接的权利要求1-20和26-35中任一项的抗体。
37.权利要求36的免疫缀合物，其中所述细胞毒性剂选自毒素、化疗剂、药物结构部分、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
38.权利要求37的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab是权利要求1-20和26-35中任一项的抗体；
(b)L是接头；
(c)D是药物结构部分。
39.权利要求38的免疫缀合物，其中L选自6-马来酰亚胺基已酰基(MC)、马来酰亚胺基丙酰基(MP)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、对氨基苄氧基羰基(PAB)、4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环已烷-1羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4-(2-吡啶基二硫代)丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)和(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIAB)。
40.权利要求38的免疫缀合物，其中D选自由美坦生类化合物、auristatin和多拉司他汀组成的组。
41.权利要求38的免疫缀合物，其中D是auristatin或多拉司他汀，并且其中D是式DE或DF的药物结构部分：
并且其中R2和R6分别是甲基，R3和R4分别是异丙基，R7是仲丁基，每个R8独立地选自CH3、O-CH3、OH,和H；R9是H；R10是芳基；Z是–O–或–NH–；R11是H、C1-C8烷基或–(CH2)2–O–(CH2)2–O–(CH2)2–O–CH3；并且R18是–C(R8)2–C(R8)2–芳基；并且
(d)p的范围为约1至8，其中所述药物选自MMAE和MMAF。
42.权利要求36的免疫缀合物，所述免疫缀合物具有式Ab-(L-MMAE)p，其中L是接头并且p的范围为2至5。
43.权利要求36的免疫缀合物，所述免疫缀合物具有式Ab-(L-MMAF)p，其中L是接头并且p的范围为2至5。
44.权利要求42或43的免疫缀合物，其中L包括val-cit、MC、PAB或MC-PAB。
45.权利要求38的免疫缀合物，其中D是美坦生类化合物。
46.权利要求45的免疫缀合物，其中D选自DM1、DM3和DM4。
47.权利要求46的免疫缀合物，其中p是2至4或3至4。
48.权利要求38的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物选自以下结构：
其中Val是缬氨酸而Cit是瓜氨酸。
49.药物组合物，其包含权利要求38的免疫缀合物和药用载体。
50.有效量的权利要求1-20和26-35中任一项的抗体在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，其中所述癌症选自B细胞淋巴瘤和骨髓瘤。
51.权利要求50的用途，其中所述癌症选自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性惰性NHL、难治性NHL、难治性惰性NHL、小淋巴细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
52.权利要求50的用途，其中所述抗体缀合于细胞毒性剂。
53.权利要求50的用途，其中所述抗体缀合于生长抑制剂。
54.权利要求50的用途，其中所述药物还包含有效量的另一种治疗剂。
55.权利要求54的用途，其中所述治疗剂选自由以下各项组成的组：抗体、化疗剂、细胞毒性剂、抗-血管生成剂、免疫抑制剂、前体药物、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、镇痛药或生长抑制剂。
56.权利要求55的用途，其中所述治疗剂选自由以下各项组成的组：velcade、revlimid、他莫昔芬、来曲唑、依西美坦、阿那曲唑、伊立替康、西妥昔单抗、氟维斯群、长春瑞滨、erlotinib、贝伐珠单抗、长春新碱、伊马替尼、索拉非尼、拉帕替尼或曲妥珠单抗、顺铂、吉西他滨、甲氨喋呤、长春碱、卡铂、紫杉醇、培美曲塞、5-氟尿嘧啶、多柔比星、硼替佐米、来那度胺、美法仑、泼尼松、地塞米松或多西他赛。
57.包含一个或多个游离半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造的抗体，其中所述半胱氨酸改造的抗体通过包括用游离半胱氨酸氨基酸替换母体抗体的一个或多个氨基酸残基的方法进行制备，其中所述母体抗体是权利要求1-24和26-35中任一项的抗体，其中所述半胱氨酸在所述轻链的Kabat位置205、在所述重链的Kabat位置114或在所述重链的EU位置
400。
58.权利要求57的抗体，其中所述一个或多个游离半胱氨酸氨基酸具有在0.6-1.0范围内的硫代反应性值。
59.权利要求57的半胱氨酸改造的抗体，其中与所述母体抗体相比，所述半胱氨酸改造的抗体与硫代-反应性试剂更具有反应性。
60.权利要求57的半胱氨酸改造的抗体，其中所述方法还包括通过使所述半胱氨酸改造的抗体与硫醇反应性试剂反应来确定所述半胱氨酸改造的抗体的硫醇反应性；其中与所述母体抗体相比，所述半胱氨酸改造的抗体与硫醇反应性试剂更具有反应性。
61.权利要求57的半胱氨酸改造的抗体，其中所述一个或多个游离半胱氨酸氨基酸残基位于轻链中。
62.权利要求57的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体共价连接到细胞毒性剂以形成抗体-药物缀合物。
63.权利要求62的半胱氨酸改造的抗体，其中所述细胞毒性剂选自毒素、化疗剂、药物结构部分、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
64.权利要求57的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体共价连接于捕获标记、检测标记或固体支持物。
65.权利要求64的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体共价连接于生物素捕获标记。
66.权利要求64的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体共价连接于荧光染料检测标记。
67.权利要求66的半胱氨酸改造的抗体，其中所述荧光染料选自荧光素类型、丹酰、丽丝胺、花青、藻红蛋白、德克萨斯红和它们的类似物。
68.权利要求66的半胱氨酸改造的抗体，其中所述荧光染料是罗丹明类型。
69.权利要求64的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体共价连接于放射性核素检测标
3 11 14 18 32 35 64 68 86 99 111 123 124 125 131 133 177
记，所述标记选自 H, C, C, F, P, S, Cu, Ga, Y, Tc, In, I, I, I, I, Xe, L
211 213
u, At和 Bi。
70.权利要求64的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体通过螯合配体共价连接于检测标记。
71.权 利要 求70 的半 胱 氨 酸改 造 的抗 体，其 中所 述 螯 合配 体 选 自DOTA,DOTP,DOTMA,DTPA和TETA。
72.权利要求1-20和26-35中任一项的抗体，所述抗体包含白蛋白结合肽。
73.权利要求72的抗体，其中所述白蛋白结合肽选自SEQ ID NOs:47-51。
74.半胱氨酸改造的抗体，其在母体抗体中，在根据Kabat编号惯例的轻链的一个或多个位置和在根据Kabat编号惯例的重链的一个或多个位置和在根据EU编号惯例的重链的一个或多个位置包含一个或多个游离半胱氨酸氨基酸，其中所述母体抗体是权利要求1-20和26-35中任一项的抗体，其中所述半胱氨酸在所述轻链的Kabat位置205、在所述重链的Kabat位置114或在所述重链的EU位置400。
75.权利要求74的抗体，其中所述抗体选自单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化的抗体。
76.权利要求74的抗体，其是抗体片段。
77.权利要求76的抗体，其中所述抗体片段是Fab片段。
78.权利要求74的抗体，其选自嵌合抗体、人抗体或人源化的抗体。
79.权利要求74的抗体，其在细菌中生产。
80.权利要求74的抗体，其在CHO细胞中生产。
81.权利要求74的抗体，其中所述抗体共价连接于auristatin或美坦生类化合物药物结构部分，由此形成抗体药物缀合物。
82.权利要求81中形成的抗体-药物缀合物，其包含抗体(Ab)和auristatin或美坦生类化合物药物结构部分(D)，其中所述半胱氨酸改造的抗体通过一个或多个游离半胱氨酸氨基酸经过接头结构部分(L)连接于D；所述化合物具有式I：
Ab-(L-D)p I
其中p是1,2,3,或4。
83.权利要求82的抗体-药物缀合物，其中p是2。
84.权利要求82的抗体-药物缀合物，其中L具有下式：
-Aa-Ww-Yy-
其中:
A是共价连接于所述半胱氨酸改造的抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇的延伸单元；
a是0或1；
每个W独立地是氨基酸单元；
W是范围在0-12的整数；
Y是共价连接于所述药物结构部分的间隔臂单元；并且
y是0,1或2。
85.权利要求84的抗体-药物缀合物，其具有下式：
其中PAB是对氨基苄基氨基甲酰基，并且R17是选自下述的二价原子团：(CH2)r,C3-C8碳环基,O-(CH2)r,亚芳基,(CH2)r-亚芳基,-亚芳基-(CH2)r-,(CH2)r-(C3-C8碳环基),(C3-C8碳环基)-(CH2)r,C3-C8杂环基,(CH2)r-(C3-C8杂环基),-(C3-C8杂环基)-(CH2)r-,-(CH2)rC(O)NRb(CH2)r-,-(CH2CH2O)r-,-(CH2CH2O)r-CH2-,-(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-,-(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-,-(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-,-(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-,和-(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r-，其中Rb是H,C1-C6烷基,苯基,或苄基；并且r独立地是范围是1-10的整数。
86.权利要求84的抗体-药物缀合物，其中Ww是缬氨酸-瓜氨酸。
87.权利要求84的抗体-药物缀合物，其中R17是(CH2)5或(CH2)2。
88.权利要求84的抗体-药物缀合物，其具有下式:
89.权利要求88的抗体-药物缀合物，其中R17是(CH2)5或(CH2)2。
90.权利要求88的抗体-药物缀合物，其具有下式：
91.权利要求82的抗体-药物缀合物，其中L是SMCC、SPP、SPDB或BMPEO。
92.权利要求82的抗体-药物缀合物，其中D是MMAE，具有下述结构：
其中波浪线指示与所述接头L的连接位点。
93.权利要求82的抗体-药物缀合物，其中D是MMAF，具有下述结构：
其中波浪线指示与所述接头L的连接位点。
94.权利要求82的抗体-药物缀合物，其中D是DM1或DM4，其具有下述结构:
其中波浪线指示与所述接头L的连接位点。
95.权利要求81中形成的抗体-药物缀合物，其中所述抗体选自：单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化的抗体和抗体片段。
96.权利要求81中形成的抗体-药物缀合物，其中所述抗体片段是Fab片段。
97.抗体-药物缀合物化合物，其选自下述结构：
其中Val是缬氨酸；Cit是瓜氨酸；p是1,2,3,或4；并且Ab是权利要求101的抗体。
98.权利要求81中形成的抗体药物缀合物，其中所述auristatin是MMAE或MMAF。
99.权利要求82中形成的抗体药物缀合物，其中L是MC-val-cit-PAB或MC。
100.确定FcRH5蛋白在怀疑包含所述蛋白的样品中存在的方法，所述方法包括使所述样品暴露于权利要求70的抗体，并且确定所述抗体与在所述样品中的所述FcRH5蛋白的结合，其中所述抗体与所述蛋白的结合指示所述蛋白在所述样品中的存在。
101.权利要求100的方法，其中所述样品包含怀疑表达所述FcRH5蛋白的细胞。
102.权利要求100的方法，其中所述细胞是B细胞。
103.权利要求100的方法，其中所述抗体共价连接于选自荧光染料、放射性同位素、生物素或金属配位配体的标记。
104.药物制剂，其包含权利要求74的抗-FcRH5抗体和药用稀释剂、载体或赋形剂。
105.确定FcRH5在怀疑包含FcRH5的生物学样品中存在的方法，所述方法包括使所述样品暴露于权利要求1-20和26-35中任一项的抗体，和确定所述抗体与所述样品中的FcRH5的结合，其中所述抗体与所述样品中FcRH5的结合指示所述蛋白在所述样品中的存在。
106.权利要求105的方法，其中所述生物学样品来自怀疑患有B细胞增生性疾病的患者。
107.权利要求106的方法，其中所述B细胞增生性疾病选自淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性惰性NHL、难治性NHL、难治性惰性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、多毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
108.使权利要求1-20和26-35中任一项的抗体与表达FcRH5的细胞结合的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1-20和26-35中任一项的抗体接触。
109.权利要求108的方法，其中所述抗体缀合于细胞毒性剂。
110.权利要求108的方法，其中所述抗体缀合于生长抑制剂。
111.用于检测B细胞的测定法，所述测定法包括：
(a)将细胞暴露于权利要求81中形成的抗体-药物缀合物；和
(b)确定所述抗体-药物缀合物化合物与所述细胞结合的程度。
112.抑制细胞增殖的方法，所述方法包括在细胞培养基中用权利要求81中形成的抗体-药物缀合物处理哺乳动物癌性B细胞，由此抑制所述癌性B细胞的增殖。
113.药物制剂，其包含权利要求81中形成的抗体药物缀合物，和药用稀释剂、载体或赋形剂。
114.权利要求113的药物制剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自由B细胞淋巴瘤和骨髓瘤组成的组。
115.权利要求114的用途，其中所述癌症选自由下列各项组成的组：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性惰性NHL、难治性NHL、难治性惰性NHL、小淋巴细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
116.权利要求51的用途，其中向所述患者施用细胞毒性剂和抗体-药物缀合物化合物的组合。
117.制品，其包括：
权利要求113的药物制剂；
容器；和
包装说明书或标记，其指示所述化合物可以用于治疗特征在于FcRH5多肽的过量表达的癌症。
118.权利要求117的制品，其中所述癌症选自由下述各项组成的组：淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性惰性NHL、难治性NHL、难治性惰性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、多毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
119.制备抗体药物缀合物化合物的方法，所述化合物包含权利要求74的抗FcRH5抗体(Ab)和auristatin或美坦生类化合物药物结构部分(D)，其中所述抗体通过一个或多个改造的半胱氨酸氨基酸经过接头结构部分(L)连接于D；所述化合物具有式I：
Ab-(L-D)p I
其中p是1,2,3,或4；所述方法包括下述步骤：
(a)使所述抗体的改造的半胱氨酸基团与接头试剂反应以形成抗体-接头中间体Ab-L；和
(b)使Ab-L与激活的药物结构部分D反应；由此形成所述抗体-药物缀合物；
或包括下述步骤：
(c)使药物结构部分的亲核性基团与接头试剂反应以形成药物-接头中间体D-L；和(d)使D-L与所述抗体的改造的半胱氨酸基团反应；由此形成所述抗体-药物缀合物。
120.权利要求119的方法，所述方法还包括在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达所述抗体的步骤。
121.权利要求119的方法，所述方法还包括用还原剂处理所述表达的抗体的步骤。
122.权利要求121的方法，其中所述还原剂选自TCEP和DTT。
123.权利要求121的方法，所述方法还包括在用所述还原剂处理之后，用氧化剂处理所述表达的抗体的步骤。
124.权利要求123的方法，其中所述氧化剂选自硫酸铜、脱氢抗坏血酸和空气。
125.组合物，其包含权利要求1-20和26-35中任一项的抗体。
126.权利要求125的组合物，其中所述组合物包含载体。
抗-FcRH5抗体和免疫缀合物以及应用方法
[0002] 本申请包含序列表，其已经通过EFS-Web提交并且由此全部内容结合在本文中作为参考。在2011年9月9日产生的所述ASCII拷贝，命名为GNE0351P.txt并且大小有
96,991字节。
96,991字节。
[0003] 技术领域
[0005] 发明背景
[0006] 恶性肿瘤(癌症)是美国仅次于心脏病的第二主要死亡原因(Boring等，CACancel J.Clin.(加拿大癌症临床杂志)43：7(1993))。癌症的特征在于来自正常组织的
异常、或赘生性细胞的数量增加(所述细胞增殖形成肿瘤块)，这些赘生性肿瘤细胞对邻近
组织的侵入，和产生最终通过血液或淋巴系统扩散到局部淋巴结和通过被称为转移的过程
扩散到远端位点的恶性细胞。在癌性状态中，细胞在其中正常细胞不会生长的条件下增殖。
癌症的表现形式多种多样，特征在于不同程度的侵袭力和侵占性。
异常、或赘生性细胞的数量增加(所述细胞增殖形成肿瘤块)，这些赘生性肿瘤细胞对邻近
组织的侵入，和产生最终通过血液或淋巴系统扩散到局部淋巴结和通过被称为转移的过程
扩散到远端位点的恶性细胞。在癌性状态中，细胞在其中正常细胞不会生长的条件下增殖。
癌症的表现形式多种多样，特征在于不同程度的侵袭力和侵占性。
[0007] 包括在血细胞生成过程(通过所述过程产生血液的细胞基本组分，如淋巴细胞、白细胞、血小板、红细胞和自然杀伤细胞)中产生的细胞的癌症被称为造血系统癌症。淋巴
细胞可以见于血液和淋巴组织中并且对于免疫应答是必需的，其被分为两个主要类别的淋
巴细胞：B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)，所述B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴
细胞(T细胞)分别介导体液和细胞介导的免疫。
细胞可以见于血液和淋巴组织中并且对于免疫应答是必需的，其被分为两个主要类别的淋
巴细胞：B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)，所述B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴
细胞(T细胞)分别介导体液和细胞介导的免疫。
[0008] B细胞在骨髓中成熟并且离开骨髓，在它们的细胞表面上表达结合抗原的抗体。当幼稚的B细胞首次遇到它的膜-结合抗体对其具有特异性的抗原时，细胞开始迅速分裂并
且其子代分化为记忆B细胞和被称为“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有较长的寿命
并且持续表达与原始母体细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不产生膜结合抗体，
而是产生这样的抗体，其以可以被分泌的形式存在。分泌的抗体是体液免疫的主要效应分
子。
且其子代分化为记忆B细胞和被称为“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有较长的寿命
并且持续表达与原始母体细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不产生膜结合抗体，
而是产生这样的抗体，其以可以被分泌的形式存在。分泌的抗体是体液免疫的主要效应分
子。
[0009] T细胞在胸腺中成熟，所述胸腺为不成熟的T细胞的增殖和分化提供环境。在T细胞成熟的过程中，T细胞经历产生T-细胞受体的基因重排以及帮助确定成熟T细胞的细胞
表面表型的阳性和阴性选择。成熟T细胞的特征性细胞表面标志是CD3：T-细胞受体复合
物和共同受体，CD4或CD8之一。
表面表型的阳性和阴性选择。成熟T细胞的特征性细胞表面标志是CD3：T-细胞受体复合
物和共同受体，CD4或CD8之一。
[0010] 在发现癌症疗法的有效细胞靶标的尝试中，研究者已经寻求鉴定这样的跨膜或另外的膜缔合性多肽，其与在一种或多种正常非癌性细胞上相比，在一种或多种特定类型的
癌细胞的表面上特异性表达。与在非癌性细胞的表面上相比，所述膜缔合性多肽通常更多
地在癌细胞的表面上表达。识别所述肿瘤-相关的细胞表面抗原多肽产生了特异性靶向癌
细胞以通过基于抗体的疗法破坏癌细胞的能力。在这方面，要注意已经证实基于抗体的疗
法在治疗某些癌症上是非常有效的。例如， 和 (都来自
Genentech Inc.，南旧金山，加利福尼亚)是分别成功地用于治疗乳腺癌和非霍奇金淋巴瘤
的抗体。更具体地， 是重组DNA来源的人源化的单克隆抗体，其选择性地
结合于人表皮生长因子受体2(HER2)原癌基因的细胞外结构域。在25-30％的原发性乳腺
癌中观察到HER2蛋白的过量表达。 是一种遗传改造的嵌合的鼠/人单克隆
抗体，其针对在正常和恶性B淋巴细胞的表面上发现的CD20抗原。这两种抗体都在CHO细
胞中重组产生。
癌细胞的表面上特异性表达。与在非癌性细胞的表面上相比，所述膜缔合性多肽通常更多
地在癌细胞的表面上表达。识别所述肿瘤-相关的细胞表面抗原多肽产生了特异性靶向癌
细胞以通过基于抗体的疗法破坏癌细胞的能力。在这方面，要注意已经证实基于抗体的疗
法在治疗某些癌症上是非常有效的。例如， 和 (都来自
Genentech Inc.，南旧金山，加利福尼亚)是分别成功地用于治疗乳腺癌和非霍奇金淋巴瘤
的抗体。更具体地， 是重组DNA来源的人源化的单克隆抗体，其选择性地
结合于人表皮生长因子受体2(HER2)原癌基因的细胞外结构域。在25-30％的原发性乳腺
癌中观察到HER2蛋白的过量表达。 是一种遗传改造的嵌合的鼠/人单克隆
抗体，其针对在正常和恶性B淋巴细胞的表面上发现的CD20抗原。这两种抗体都在CHO细
胞中重组产生。
[0011] 在发现癌症疗法的有效细胞靶标的其它尝试中，研究者已经试图去鉴定(1)非膜相关的多肽，与一种或多种特定类型的非癌性正常细胞比较，所述非膜相关的多肽特异性
地由一种或多种特定类型的癌细胞产生，(2)多肽，所述多肽以显著高于一种或多种正常非
癌性细胞的表达水平由癌细胞产生，或(3)多肽，所述多肽的表达特定地限于癌性状态和
非癌性状态(例 如正常前列腺和前列腺肿瘤组织)两者中的仅单一组织类型(或非常有
限数量的)不同组织类型。所述多肽可以保持细胞内定位或可以被癌细胞分泌。而且，所
述多肽可以不由癌细胞本身表达，而是由产生和/或分泌对癌细胞具有增强或生长-促进
效果的多肽的细胞表达。所述分泌的多肽通常是这样的蛋白，其向癌细胞提供超出正常细
胞的生长益处，并且包括这样的物质，如例如，生血管因子、细胞黏着因子、生长因子等。预期鉴定所述非膜相关的多肽的拮抗剂作为治疗所述癌症的有效治疗剂。此外，鉴定所述多
肽的表达模式将有效用于诊断哺乳动物中的特定癌症。
地由一种或多种特定类型的癌细胞产生，(2)多肽，所述多肽以显著高于一种或多种正常非
癌性细胞的表达水平由癌细胞产生，或(3)多肽，所述多肽的表达特定地限于癌性状态和
非癌性状态(例 如正常前列腺和前列腺肿瘤组织)两者中的仅单一组织类型(或非常有
限数量的)不同组织类型。所述多肽可以保持细胞内定位或可以被癌细胞分泌。而且，所
述多肽可以不由癌细胞本身表达，而是由产生和/或分泌对癌细胞具有增强或生长-促进
效果的多肽的细胞表达。所述分泌的多肽通常是这样的蛋白，其向癌细胞提供超出正常细
胞的生长益处，并且包括这样的物质，如例如，生血管因子、细胞黏着因子、生长因子等。预期鉴定所述非膜相关的多肽的拮抗剂作为治疗所述癌症的有效治疗剂。此外，鉴定所述多
肽的表达模式将有效用于诊断哺乳动物中的特定癌症。
[0012] 尽管在哺乳动物的癌症治疗中取得了上述确定的进展，仍旧存在对于另外的治疗剂的极大需要，所述另外的治疗剂分别能够检测肿瘤在哺乳动物中的存在和用于有效抑制
赘生性细胞的生长。因此，本发明的目的是鉴定这样的多肽，细胞膜相关的、分泌的或细胞
内多肽，所述多肽的表达特定地限于癌性和非癌性状态两者中的仅单一(或非常有限数量
的不同)组织类型，造血组织，以及使用那些多肽，和它们的编码核酸产生有效用于治疗性
治疗和/或检测哺乳动物中造血系统癌症的主题组合物。
赘生性细胞的生长。因此，本发明的目的是鉴定这样的多肽，细胞膜相关的、分泌的或细胞
内多肽，所述多肽的表达特定地限于癌性和非癌性状态两者中的仅单一(或非常有限数量
的不同)组织类型，造血组织，以及使用那些多肽，和它们的编码核酸产生有效用于治疗性
治疗和/或检测哺乳动物中造血系统癌症的主题组合物。
[0013] 染色体1q21中的异常在B细胞恶性肿瘤(包括B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma)和骨髓瘤(myeloma))中是常见的，但是由这些畸变靶向的基因在很大程度上是未知的。其
中包括1q21-q23带的染色体异常是B细胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)和
多发性骨髓瘤(multiple myeloma)两者中最常见的遗传病变。在非霍奇金淋巴瘤亚型中，
已经报道了在1q21-q23的易位断点(包括易位和重复)，经常作为在边缘区B细胞淋巴瘤
(marginal zone B cell lymphoma)中的滤泡型大B细胞淋巴瘤和弥漫型大B细胞淋巴瘤
(DLCL)中以及在伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)中的单一染色体异常。通过在骨髓
瘤细胞系中克隆t(1:14)(q21:q32)染色体易位的断点，鉴定了两个基因，称为免疫球蛋白
超家族受体易位相关(IRTA)1和IRTA2。IRTA2与被鉴定为BXMAS1(Nakayama等，Biochm.
Biophys.Res.Commun(生物化学生物物理研究通讯).285：830-7，2001)和FcRH5(Davis
等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)98：9772-7，2001)的序列相同。IRTA1
和IRTA2都是相关基因，IRTA家族的成员。
中包括1q21-q23带的染色体异常是B细胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)和
多发性骨髓瘤(multiple myeloma)两者中最常见的遗传病变。在非霍奇金淋巴瘤亚型中，
已经报道了在1q21-q23的易位断点(包括易位和重复)，经常作为在边缘区B细胞淋巴瘤
(marginal zone B cell lymphoma)中的滤泡型大B细胞淋巴瘤和弥漫型大B细胞淋巴瘤
(DLCL)中以及在伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)中的单一染色体异常。通过在骨髓
瘤细胞系中克隆t(1:14)(q21:q32)染色体易位的断点，鉴定了两个基因，称为免疫球蛋白
超家族受体易位相关(IRTA)1和IRTA2。IRTA2与被鉴定为BXMAS1(Nakayama等，Biochm.
Biophys.Res.Commun(生物化学生物物理研究通讯).285：830-7，2001)和FcRH5(Davis
等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)98：9772-7，2001)的序列相同。IRTA1
和IRTA2都是相关基因，IRTA家族的成员。
[0014] FcRH5(或IRTA2)是与Fc受体家族具有同源性的细胞表面受体。它通 常在成熟的B细胞中表达，并且与FcRH4(IRTA1)相比，在外周淋巴器官中具有不同的分布。IRTA1在
边缘区B细胞中表达，而IRTA2还在生发中心中心细胞和免疫母细胞中表达。IRTA2表达
在具有1q21异常的多发性骨髓瘤和伯基特淋巴瘤细胞系中失调(见Miller等，Blood(血
液)99：2662-2669，2002)。1q21结构性重排在B细胞恶性肿瘤中的高频参与提示IRTA1和
IRTA2对于这些疾病的发病机理是必需的(见公开的PCT申请号WO 01/38490；美国公开的
专利申请号20080292632)(还见Polson，等.Int Immunol.2006年9月；18(9)：1363-73)。
边缘区B细胞中表达，而IRTA2还在生发中心中心细胞和免疫母细胞中表达。IRTA2表达
在具有1q21异常的多发性骨髓瘤和伯基特淋巴瘤细胞系中失调(见Miller等，Blood(血
液)99：2662-2669，2002)。1q21结构性重排在B细胞恶性肿瘤中的高频参与提示IRTA1和
IRTA2对于这些疾病的发病机理是必需的(见公开的PCT申请号WO 01/38490；美国公开的
专利申请号20080292632)(还见Polson，等.Int Immunol.2006年9月；18(9)：1363-73)。
[0015] 如果FcRH5表达，有益的是产生针对FcRH5抗原的治疗抗体，当所述抗体施用于患者时，尤其是用于慢性治疗时，其产生最小的抗原性或没有抗原性。本发明满足这个需要和
其它需要。本发明提供抗-FcRH5抗体，其克服了目前治疗组合物的局限并且提供另外的益
处，这些通过下面详细的描述将是显而易见的。
其它需要。本发明提供抗-FcRH5抗体，其克服了目前治疗组合物的局限并且提供另外的益
处，这些通过下面详细的描述将是显而易见的。
[0016] 使用抗体-药物缀合物(ADC)，即免疫缀合物，来局部递送细胞毒性剂或细胞生长抑制剂，即在癌症的治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物(Lambert，J.(2005)Curr.
Opinion in Pharmacology 5：543-549；Wu等(2005)Nature Biotechnology(自然生物
技术)23(9)：1137-1146；Payne，G.(2003)Cancer Cell(癌症细胞)3：207-212；Syrigos
和Epenetos(1999)Anticancer Research(抗癌研究)19：605-614；Niculescu-Duvaz和
Springer(1997)Adv.Drug Del.Rev.26：151-172；US 4975278)允许药物结构部分向肿瘤
的靶向递送，以及其中的细胞内积累，其中系统施用这些未缀合的药剂则可能导致针对
正常细胞和将要被消除的肿瘤细胞的不可接受的毒性水平(Baldwin 等(1986)Lancet
pp.(1986年3 月15日)：603-05；Thorpe，(1985) ″AntibodyCarriers Of Cytotoxic
Agents In Cancer Therapy：A Review，(在癌症治疗中的细胞毒性剂的抗体载体：综
述，)″in Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications(在
单克隆抗体′84：生物学和临床应用中)，A.Pinchera等(编辑)，第475-506页)。提高
治疗指数，即ADC的最大功效和最小的毒性的尝试集中于多克隆抗体(Rowland等(1986)
Cancer Immunol.Immunother.，21：183-87)和单克隆抗体(mAbs)以及药物连接和药物释
放性质(Lambert，J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology 5：543-549)的选择性。用 于
抗体药物缀合物的药物结构部分包括细菌蛋白毒素如白喉毒素，植物蛋白毒素如蓖麻毒蛋
白、小分子如auristatins、格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等(2000)J.of the Nat.
Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：
1025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)13：786-791)，美
坦生类化合物(maytansinoids)(EP 1391213；Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美
国国家科学院学报)93：8618-8623)，加利车霉素(calicheamicin)(Lode等(1998)Cancer
Res(癌症研究).58：2928；Hinman等(1993)Cancer Res(癌症研究).53：3336-3342)，柔
红霉素(daunomycin)，多柔比星(doxorubicin)，甲氨喋呤(methotrexate)，和长春地辛
(vindesine)(Rowland等1986)见上文)。药物结构部分可以影响细胞毒性和细胞抑制机
制，包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制。当缀合于大的抗体或蛋白受体配体时，一些细胞毒性药物倾向于失活或活性减少。
Opinion in Pharmacology 5：543-549；Wu等(2005)Nature Biotechnology(自然生物
技术)23(9)：1137-1146；Payne，G.(2003)Cancer Cell(癌症细胞)3：207-212；Syrigos
和Epenetos(1999)Anticancer Research(抗癌研究)19：605-614；Niculescu-Duvaz和
Springer(1997)Adv.Drug Del.Rev.26：151-172；US 4975278)允许药物结构部分向肿瘤
的靶向递送，以及其中的细胞内积累，其中系统施用这些未缀合的药剂则可能导致针对
正常细胞和将要被消除的肿瘤细胞的不可接受的毒性水平(Baldwin 等(1986)Lancet
pp.(1986年3 月15日)：603-05；Thorpe，(1985) ″AntibodyCarriers Of Cytotoxic
Agents In Cancer Therapy：A Review，(在癌症治疗中的细胞毒性剂的抗体载体：综
述，)″in Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications(在
单克隆抗体′84：生物学和临床应用中)，A.Pinchera等(编辑)，第475-506页)。提高
治疗指数，即ADC的最大功效和最小的毒性的尝试集中于多克隆抗体(Rowland等(1986)
Cancer Immunol.Immunother.，21：183-87)和单克隆抗体(mAbs)以及药物连接和药物释
放性质(Lambert，J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology 5：543-549)的选择性。用 于
抗体药物缀合物的药物结构部分包括细菌蛋白毒素如白喉毒素，植物蛋白毒素如蓖麻毒蛋
白、小分子如auristatins、格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等(2000)J.of the Nat.
Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：
1025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)13：786-791)，美
坦生类化合物(maytansinoids)(EP 1391213；Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美
国国家科学院学报)93：8618-8623)，加利车霉素(calicheamicin)(Lode等(1998)Cancer
Res(癌症研究).58：2928；Hinman等(1993)Cancer Res(癌症研究).53：3336-3342)，柔
红霉素(daunomycin)，多柔比星(doxorubicin)，甲氨喋呤(methotrexate)，和长春地辛
(vindesine)(Rowland等1986)见上文)。药物结构部分可以影响细胞毒性和细胞抑制机
制，包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制。当缀合于大的抗体或蛋白受体配体时，一些细胞毒性药物倾向于失活或活性减少。
[0017] Auristatin肽，auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)，多拉司他汀的合成类似物(WO 02/088172)已经作为药物结构部分缀合于：(i)嵌合的单克隆抗体
cBR96(特异于癌上的Lewis Y)，(ii)cAC 10，其特异于血液恶性肿瘤上的CD30(Klussman，
等(2004)，Bioconjugate Chemistry(生物缀合物化学)15(4)：765-773；Doronina等
(2003)Nature Biotechnology(自然生物技术)21(7)：778-784；Francisco等(2003)
Blood(血 液 )102(4)：1458-1465；US2004/0018194；(iii) 抗-CD20 抗 体 如 美 罗 华
(rituxan)(WO 04/032828)，其用于治疗表达CD20的癌症和免疫疾病，(iv)抗-EphB2R抗体
2H9，其用于治疗结肠直肠癌(Mao等(2004)Cancer Research(癌症研究)64(3)：781-788)；
(v)E-选择蛋白抗体(Bhaskar等(2003)Cancer Res.(癌症研究)63：6387-6394)；(vi)曲
妥珠单抗(trastuzumab)( US2005/0238649)，和(vi)抗-CD30抗体(WO
03/043583)。auristatin E的变体在US 5767237和US 6124431中公开。缀合于单克隆抗
体的单甲基auristatin E在Senter等，Proceedings of the American Association for
Cancer Research(美国癌症研究协会会议记录)，卷45，摘要号623，2004年3月28日出品
中公开。Auristatin类似物MMAE和MMAF缀合于各种抗体(US2005/0238649)。
cBR96(特异于癌上的Lewis Y)，(ii)cAC 10，其特异于血液恶性肿瘤上的CD30(Klussman，
等(2004)，Bioconjugate Chemistry(生物缀合物化学)15(4)：765-773；Doronina等
(2003)Nature Biotechnology(自然生物技术)21(7)：778-784；Francisco等(2003)
Blood(血 液 )102(4)：1458-1465；US2004/0018194；(iii) 抗-CD20 抗 体 如 美 罗 华
(rituxan)(WO 04/032828)，其用于治疗表达CD20的癌症和免疫疾病，(iv)抗-EphB2R抗体
2H9，其用于治疗结肠直肠癌(Mao等(2004)Cancer Research(癌症研究)64(3)：781-788)；
(v)E-选择蛋白抗体(Bhaskar等(2003)Cancer Res.(癌症研究)63：6387-6394)；(vi)曲
妥珠单抗(trastuzumab)( US2005/0238649)，和(vi)抗-CD30抗体(WO
03/043583)。auristatin E的变体在US 5767237和US 6124431中公开。缀合于单克隆抗
体的单甲基auristatin E在Senter等，Proceedings of the American Association for
Cancer Research(美国癌症研究协会会议记录)，卷45，摘要号623，2004年3月28日出品
中公开。Auristatin类似物MMAE和MMAF缀合于各种抗体(US2005/0238649)。
[0018] 将药物结构部分附着于，即通过共价键连接于抗体的常规方式通常得到分子的不均匀混合物，其中药物结构部分在抗体上的许多位点附着。例如，细胞毒性药物典型地通过
抗体的最常见(often-numerous)的赖氨酸残基缀合于抗体，产生异质抗体-药物缀合物混
合物。取决于反应条件，不均匀混合物典型地包含具有0到约8个，或更多个附着的药物结
构部分的抗体的分布。此外，在具有药物结构部分与抗体的特定整数比率的缀合物的每个
子群中，存在潜在的异质混合物，其中药物结构部分附着于抗体上的不同位点。分析和制备
方法可能不足以在由缀合反应得到的不均匀混合物中分离和表征抗体-药物缀合物种类
分子。抗体是大的，复合的和结构上多样的生物分子，通常具有许多反应性官能团。它们与
接头试剂和药物-接头中间体的反应性取决于多种因素，如pH、浓度、盐浓度、和共溶剂。而且，由于在控制反应条件和表征反应物和中间体上的难度，多步缀合过程可能是不能复制
的。
抗体的最常见(often-numerous)的赖氨酸残基缀合于抗体，产生异质抗体-药物缀合物混
合物。取决于反应条件，不均匀混合物典型地包含具有0到约8个，或更多个附着的药物结
构部分的抗体的分布。此外，在具有药物结构部分与抗体的特定整数比率的缀合物的每个
子群中，存在潜在的异质混合物，其中药物结构部分附着于抗体上的不同位点。分析和制备
方法可能不足以在由缀合反应得到的不均匀混合物中分离和表征抗体-药物缀合物种类
分子。抗体是大的，复合的和结构上多样的生物分子，通常具有许多反应性官能团。它们与
接头试剂和药物-接头中间体的反应性取决于多种因素，如pH、浓度、盐浓度、和共溶剂。而且，由于在控制反应条件和表征反应物和中间体上的难度，多步缀合过程可能是不能复制
的。
[0019] 和大部分在pH接近7时被质子化并且亲核性降低的胺不同，半胱氨酸的硫醇在中性pH具有反应性。由于游离的硫醇(RSH，硫氢基)具有相对的反应性，具有半胱氨酸残基
的蛋白质通常以它们的氧化形式，作为二硫化物-连接的寡聚体存在，或它们具有内部桥
连的二硫化物基团。细胞外蛋白通常不具有游离的硫醇(Garman，1997，Non-Radioactive
Labelling：APractical Approach(非放射性标记：实践方法)，学术出版社，London，在第
55页)。抗体半胱氨酸硫醇基通常比抗体胺或羟基基团更具反应性，即针对亲电子缀合
试剂更具有亲核性。已经通过遗传改造技术将半胱氨酸残基引入蛋白从而形成与配体的
共价连接或形成新的分子内二硫键(Better等(1994)J.Biol.Chem(生物化学杂志).13：
9644-9650；Bernhard等(1994)Bioconjugate Chem(生物缀合物化学).5：126-132；
Greenwood等(1994)Therapeutic Immunology(治疗免疫学)1：247-255；Tu等(1999)
Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国国家科学院学报)96：4862-4867；Kanno等(2000)J.of
Biotechnology(生物技术杂志)，76：207-214；Chmura等(2001)Proc.Nat.Acad.Sci.
USA(美国国家科学院学报)98(15)：8480-8484；US 6248564)。然而，通过将蛋白的不同氨
基酸残基突变为半胱氨酸氨基酸来在半胱氨酸硫醇基中改造存在潜在的问题，特别是在未
配对(游离Cys)残基或相对更易 于反应或氧化的那些的情形中。在蛋白的浓缩溶液中，
不管是在大肠杆菌(E.coli)的周质、培养物上清液或部分或完全纯化的蛋白中，在蛋白的
表面上的未配对的Cys残基可以配对并且可以氧化形成分子间二硫化物，并且因此形成蛋
白二聚体或多聚体。二硫化物二聚体形成使新Cys对于与药物、配体或其它标记的缀合不
具有反应性。此外，如果蛋白在新改造的Cys和存在的Cys残基之间氧化性形成分子内二
硫键，则两个Cys硫醇基均不可用于活性位点参与和相互作用。而且，通过错误折叠或失去
三级结构，可以使蛋白失活或是非特异性的(Zhang等(2002)Anal.Biochem.311：1-9)。
的蛋白质通常以它们的氧化形式，作为二硫化物-连接的寡聚体存在，或它们具有内部桥
连的二硫化物基团。细胞外蛋白通常不具有游离的硫醇(Garman，1997，Non-Radioactive
Labelling：APractical Approach(非放射性标记：实践方法)，学术出版社，London，在第
55页)。抗体半胱氨酸硫醇基通常比抗体胺或羟基基团更具反应性，即针对亲电子缀合
试剂更具有亲核性。已经通过遗传改造技术将半胱氨酸残基引入蛋白从而形成与配体的
共价连接或形成新的分子内二硫键(Better等(1994)J.Biol.Chem(生物化学杂志).13：
9644-9650；Bernhard等(1994)Bioconjugate Chem(生物缀合物化学).5：126-132；
Greenwood等(1994)Therapeutic Immunology(治疗免疫学)1：247-255；Tu等(1999)
Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国国家科学院学报)96：4862-4867；Kanno等(2000)J.of
Biotechnology(生物技术杂志)，76：207-214；Chmura等(2001)Proc.Nat.Acad.Sci.
USA(美国国家科学院学报)98(15)：8480-8484；US 6248564)。然而，通过将蛋白的不同氨
基酸残基突变为半胱氨酸氨基酸来在半胱氨酸硫醇基中改造存在潜在的问题，特别是在未
配对(游离Cys)残基或相对更易 于反应或氧化的那些的情形中。在蛋白的浓缩溶液中，
不管是在大肠杆菌(E.coli)的周质、培养物上清液或部分或完全纯化的蛋白中，在蛋白的
表面上的未配对的Cys残基可以配对并且可以氧化形成分子间二硫化物，并且因此形成蛋
白二聚体或多聚体。二硫化物二聚体形成使新Cys对于与药物、配体或其它标记的缀合不
具有反应性。此外，如果蛋白在新改造的Cys和存在的Cys残基之间氧化性形成分子内二
硫键，则两个Cys硫醇基均不可用于活性位点参与和相互作用。而且，通过错误折叠或失去
三级结构，可以使蛋白失活或是非特异性的(Zhang等(2002)Anal.Biochem.311：1-9)。
[0020] 已经将半胱氨酸-改造的抗体设计为FAB抗体片段(硫代Fab)并且作为全长、IgG单克隆(硫代Mab)抗体表达(Junutula，J.R.等(2008)J Immunol Methods(免疫方法杂
志)332：41-52；US 2007/0092940，将其内容通过引入结合在本文中)。将硫代Fab和硫代
Mab抗体在新引入的半胱氨酸硫醇通过接头用硫醇-反应性接头试剂和药物-接头试剂进
行缀合从而制备抗体药物缀合物(硫代ADC)。
志)332：41-52；US 2007/0092940，将其内容通过引入结合在本文中)。将硫代Fab和硫代
Mab抗体在新引入的半胱氨酸硫醇通过接头用硫醇-反应性接头试剂和药物-接头试剂进
行缀合从而制备抗体药物缀合物(硫代ADC)。
[0021] 将本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物的全部内容通过引用结合在本文中。
[0022] 发明概述
[0023] 本发明提供抗-FcRH5抗体或其功能片段，以及它们用于治疗造血系统肿瘤的方法。
[0024] 在一个方面中，本发明提供这样的抗体，其结合于(优选特异性地)上述或下述任一种多肽。任选地，所述抗体是单克隆抗体，抗体片段(包括Fab，Fab′，F(ab′)2，和Fv
片段)，双抗体，单结构域抗体，嵌合抗体，人源化的抗体，单链抗体或抗体，其竞争性抑制抗-FcRH5多肽抗体与其各自的抗原表位结合。本发明的抗体可以任选地缀合于生长抑制
剂或细胞毒性剂如毒素，包括，例如auristatin，美坦生类化合物(maytansinoids)，多拉
司他汀(dolostatin)衍生物或加利车霉素(calicheamicin)，抗生素，放射性同位素，溶核
酶等。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞或细菌细胞中产生，并且优选地诱导它们结合
的细胞死亡。为了检测目的，本发明的抗体可以可检测地标记，连接于固体支持物等。
片段)，双抗体，单结构域抗体，嵌合抗体，人源化的抗体，单链抗体或抗体，其竞争性抑制抗-FcRH5多肽抗体与其各自的抗原表位结合。本发明的抗体可以任选地缀合于生长抑制
剂或细胞毒性剂如毒素，包括，例如auristatin，美坦生类化合物(maytansinoids)，多拉
司他汀(dolostatin)衍生物或加利车霉素(calicheamicin)，抗生素，放射性同位素，溶核
酶等。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞或细菌细胞中产生，并且优选地诱导它们结合
的细胞死亡。为了检测目的，本发明的抗体可以可检测地标记，连接于固体支持物等。
[0025] 在一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中单价亲和性(例如作为Fab片段的抗体与FcRH5的亲和性)或以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，
作为IgG片段的抗体与FcRH5的亲和性)分别地，基本上与鼠抗体的单价亲和性或其二价
形式的亲和性(例如，作为Fab片段或作为IgG片段的鼠抗体与FcRH5的亲和性)，或嵌合
抗体的单价亲和性或其二价形式的亲和性(例如，作为Fab片段或作为IgG片段的嵌合抗
体与FcRH5的亲和性)相同，低于其，或高于其，所述鼠抗体或嵌合抗体包含如图9(SEQ ID
NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示的轻链和重链可变结构域序列，由所述轻链和重链
可变结构域序列组成或基本由所述轻链和重链可变结构域序列组成。
作为IgG片段的抗体与FcRH5的亲和性)分别地，基本上与鼠抗体的单价亲和性或其二价
形式的亲和性(例如，作为Fab片段或作为IgG片段的鼠抗体与FcRH5的亲和性)，或嵌合
抗体的单价亲和性或其二价形式的亲和性(例如，作为Fab片段或作为IgG片段的嵌合抗
体与FcRH5的亲和性)相同，低于其，或高于其，所述鼠抗体或嵌合抗体包含如图9(SEQ ID
NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示的轻链和重链可变结构域序列，由所述轻链和重链
可变结构域序列组成或基本由所述轻链和重链可变结构域序列组成。
[0026] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.4nM，0.2nM或0.5nM。
[0027] 在一个方面中，提供结合于FcRH5的抗体，其中抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自由下列各项组成的组的HVRs：(i)HVR-L 1，其包含序列
KASQNVGSNVA(SEQ ID NO：28)(ii)HVR-L2，其包含序列SASYRYS(SEQ ID NO：29)(iii)
HVR-L3，其包含序列QQYKTWT(SEQ ID NO：30)(iv)HVR-H1，其包含序列GYTFTNYGMN(SEQ ID
NO：37)(v)HVR-H2，其包含序列NTYTGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO：38)；和(vi)HVR-H3，其包含
序列ARRSIPYYYAMDY(SEQ ID NO：39)。在一个实施方案中，在变体HVR-H1中的HVR-H1第
9位残基是I。在一个其它的实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO：38的序列的HVR-H2。
在另一个实施方案中，至少一部分构架序列是人共有构架序列。在另一个实施方案中，抗体
包含人κ亚组1共有构架序列。在一个其它实施方案中，抗体包含重链人亚组III共有
构架序列。在一个其它实施方案中，构架序列包含在位置11，12，13，18，19，20，75，78，82，8＝2a，83，和/或34的置换。在另一个实施方案中，置换是L11V，V12K，V13K，L18V，R19K，L20V，K75V， V78A，N82I，N82aS，R83K，和/或M34I。在一个其它实施方案中，构架序列包含在位置12，13，34和/或78的置换。在另一个实施方案中，置换是V12K， V13K，M34I和
/或V78A。
KASQNVGSNVA(SEQ ID NO：28)(ii)HVR-L2，其包含序列SASYRYS(SEQ ID NO：29)(iii)
HVR-L3，其包含序列QQYKTWT(SEQ ID NO：30)(iv)HVR-H1，其包含序列GYTFTNYGMN(SEQ ID
NO：37)(v)HVR-H2，其包含序列NTYTGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO：38)；和(vi)HVR-H3，其包含
序列ARRSIPYYYAMDY(SEQ ID NO：39)。在一个实施方案中，在变体HVR-H1中的HVR-H1第
9位残基是I。在一个其它的实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO：38的序列的HVR-H2。
在另一个实施方案中，至少一部分构架序列是人共有构架序列。在另一个实施方案中，抗体
包含人κ亚组1共有构架序列。在一个其它实施方案中，抗体包含重链人亚组III共有
构架序列。在一个其它实施方案中，构架序列包含在位置11，12，13，18，19，20，75，78，82，8＝2a，83，和/或34的置换。在另一个实施方案中，置换是L11V，V12K，V13K，L18V，R19K，L20V，K75V， V78A，N82I，N82aS，R83K，和/或M34I。在一个其它实施方案中，构架序列包含在位置12，13，34和/或78的置换。在另一个实施方案中，置换是V12K， V13K，M34I和
/或V78A。
[0028] 在另一个实施方案中，抗体包含这样的轻链可变结构域，其与选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，抗体包含这样的重
链可变结构域，其与选自SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。
在另一个实施方案中，抗体包含这样的轻链可变结构域，其与选自SEQ ID NO：19的氨基酸
序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。
链可变结构域，其与选自SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。
在另一个实施方案中，抗体包含这样的轻链可变结构域，其与选自SEQ ID NO：19的氨基酸
序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。
[0029] 在一个其它的实施方案中，抗体包含这样的重链可变结构域，其与选自SEQ IDNO：21的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，抗体包含
这样的重链可变结构域，其与选自SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序
列同一性。在另一个实施方案中，抗体包含这样的重链可变结构域，其与选自SEQ ID NO：
23的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。
这样的重链可变结构域，其与选自SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序
列同一性。在另一个实施方案中，抗体包含这样的重链可变结构域，其与选自SEQ ID NO：
23的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。
[0030] 在一个实施方案中，抗体包含这样的重链可变结构域，所述重链可变结构域包含一个、两个、三个或四个选自SEQ ID NOs：33，34，35和36的构架氨基酸序列。在其它实施
方案中，抗体包含这样的轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含一个、两个、三个或四
个选自SEQ ID NOs：24，25，26，27，和28的构架氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包含这样的重链可变结构域，所述重链可变结构域包含一个、两个、三个或四个这样的构架氨
基酸序列，所述构架氨基酸序列与选自SEQ ID NOs：33，34，35和36的氨基酸具有至少90％
的氨基酸序列同一性。在其它实施方案中，抗体包含这样的轻链可变结构域，所述轻链可
变结构域包含一个、两个、三个或四个构架氨基酸序列，所述构架氨基酸序列与选自SEQ ID NOs：24，25，26，27，和28的氨基酸具有至少90％的氨基酸序列同一性。
方案中，抗体包含这样的轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含一个、两个、三个或四
个选自SEQ ID NOs：24，25，26，27，和28的构架氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包含这样的重链可变结构域，所述重链可变结构域包含一个、两个、三个或四个这样的构架氨
基酸序列，所述构架氨基酸序列与选自SEQ ID NOs：33，34，35和36的氨基酸具有至少90％
的氨基酸序列同一性。在其它实施方案中，抗体包含这样的轻链可变结构域，所述轻链可
变结构域包含一个、两个、三个或四个构架氨基酸序列，所述构架氨基酸序列与选自SEQ ID NOs：24，25，26，27，和28的氨基酸具有至少90％的氨基酸序列同一性。
[0031] 在一个方面中，提供结合FcRH5的抗体，其中所述抗体包含至少一个变体HVR，其中所述变体HVR序列包含在SEQ ID NOs：28，29，30，37，38或39所示序列中的至少一个残
基的修饰。在一个其它的实施方案中，所述修饰是置换、插入或缺失。
基的修饰。在一个其它的实施方案中，所述修饰是置换、插入或缺失。
[0032] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中抗体与人FcRH5的单价亲和性与包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻链和重链可变
序列的鼠抗体的单价亲和性基本相同。
序列的鼠抗体的单价亲和性基本相同。
[0033] 在一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中抗体与人FcRH5的单价亲和性大于包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ IDNO：20)中所示轻链和重链可变序
列的鼠抗体或嵌合抗体的单价亲和性至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10倍。
列的鼠抗体或嵌合抗体的单价亲和性至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10倍。
[0034] 在一个其它方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中抗体与人FcRH5的单价亲和性低于包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQID NO：20)中所示轻链和重链可
变序列的鼠抗体或嵌合抗体的单价亲和性至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，
16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55或60倍。
变序列的鼠抗体或嵌合抗体的单价亲和性至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，
16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55或60倍。
[0035] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与人FcRH5的亲和性与鼠抗体的亲和性基本相同，所述鼠抗体以其二价形式存在并且
包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻链和重链可变序列。
包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻链和重链可变序列。
[0036] 在一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与人FcRH5的亲和性大于鼠抗体或嵌合抗体的亲和性至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10倍，所述鼠抗体或嵌合抗体以其二价形式存在并且包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ
ID NO：20)中所示轻链和重链可变序列。
ID NO：20)中所示轻链和重链可变序列。
[0037] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与人FcRH5的亲和性低于鼠抗体或嵌合抗体的亲和性至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，
11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55或60倍，所述鼠抗体或嵌合抗体以其二价形式存在并且包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻
链和重链可变序列。
11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55或60倍，所述鼠抗体或嵌合抗体以其二价形式存在并且包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻
链和重链可变序列。
[0038] 在一个其它方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与人FcRH5的亲和性是0.4nM。在一个实施方案中，以其二价形式存在的抗体与人
FcRH5的亲和性是0.4nM+/-.04。
FcRH5的亲和性是0.4nM+/-.04。
[0039] 在一个其它方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与人FcRH5的亲和性是0.2nM。在一个实施方案中， 以其二价形式存在的抗体与人
FcRH5的亲和性是0.2nM+/-.02。
FcRH5的亲和性是0.2nM+/-.02。
[0040] 在一个其它方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与人FcRH5的亲和性是0.5nM。在一个实施方案中，以其二价形式存在的抗体与人
FcRH5的亲和性是0.5nM+/-.01。
FcRH5的亲和性是0.5nM+/-.01。
[0041] 在所有的方面中，结合亲和性表示为Kd值。在另一个方面中，结合亲和性通过Biacore或放射性免疫测定法测量。
[0042] 在一个其它方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中当缀合于细胞毒性剂时，人源化的抗体抑制肿瘤细胞生长。
[0043] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中当缀合于细胞毒性剂时，人源化的抗体抑制肿瘤细胞生长。
[0044] 在一个实施方案中，人源化的抗体和嵌合抗体都是单价的或二价的。在另一个实施方案中，人源化的抗体和嵌合抗体都包含连接于Fc区域的单Fab区域。
[0045] 在另一个方面中，本发明提供包含这样的重链可变结构域的抗体，所述重链可变结构域包含如在图12中所示的HVR1-HC，HVR2-HC和/或HVR3-HC序列(SEQ ID NOs：
37-39)。在一个实施方案中，可变结构域包含如在图12中所示的FR1-HC，FR2-HC，FR3-HC
和/或FR4-HC序列(SEQID NOs：33-36)。在另一个实施方案中，抗体包含如在图12中所
示的CH1和/或Fc序列(SEQ ID NO：40和/或41)。
37-39)。在一个实施方案中，可变结构域包含如在图12中所示的FR1-HC，FR2-HC，FR3-HC
和/或FR4-HC序列(SEQID NOs：33-36)。在另一个实施方案中，抗体包含如在图12中所
示的CH1和/或Fc序列(SEQ ID NO：40和/或41)。
[0046] 在一个其它方面中，本发明提供包含这样的轻链可变结构域的抗体，所述轻链可变结构域包含如在图12中所示的HVR1-LC，HVR2-LC和/或HVR3-LC序列(SEQ ID NOs：
28-30)。在一个实施方案中，所述可变结构域包含如在图12中所示的FR1-LC，FR2-LC，
FR3-LC和/或FR4-LC序列(SEQID NOs：24-27)。在另一个实施方案中，所述抗体包含如在
图12中所示的CL1序列(SEQ ID NO：31)。
28-30)。在一个实施方案中，所述可变结构域包含如在图12中所示的FR1-LC，FR2-LC，
FR3-LC和/或FR4-LC序列(SEQID NOs：24-27)。在另一个实施方案中，所述抗体包含如在
图12中所示的CL1序列(SEQ ID NO：31)。
[0047] 在一个方面中，本发明提供包含如在图11中所示序列(SEQ ID NO：21)的多肽。在另一个方面中，本发明提供包含如在图9中所示序列(SEQ IDNO：19)的多肽。在另一个
方面中，本发明提供包含如在图11中所示序列(SEQ ID NO：22)的多肽。在另一个方面中，
本发明提供包含如在图11中所示序列(SEQ ID NO：23)的多肽。
方面中，本发明提供包含如在图11中所示序列(SEQ ID NO：22)的多肽。在另一个方面中，
本发明提供包含如在图11中所示序列(SEQ ID NO：23)的多肽。
[0048] 在另一个方面中，本发明提供通过包括下述的方法形成的抗体：(a)培养表达这样的抗体的细胞，所述抗体包含本文所述的重链可变结构域和本文所述的轻链可变结构
域；和(b)从所述培养的细胞中分离所述抗体。
域；和(b)从所述培养的细胞中分离所述抗体。
[0049] 在一个其它方面中，本发明提供包含本文所述的重链可变结构域和本文所述的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是单价的并且包含Fc区域。
[0050] 在一个方面中，本发明提供编码本文所述的抗体的多核苷酸。在一个实施方案中，本发明提供包含所述多核苷酸的载体。在另一个实施方案中，本发明提供包含所述载体的
宿主细胞。
宿主细胞。
[0051] 在一个方面中，本发明包括半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体，所述改造的抗-FcRH5抗体包含一个或多个游离半胱氨酸氨基酸和选自SEQ IDNOs：59-62的序列。所述半胱氨酸
改造的抗-FcRH5抗体可以结合FcRH5多肽。半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体可以通过包括
下述的方法进行制备：用半胱氨酸替代母体抗-FcRH5抗体的一个或多个氨基酸残基。
改造的抗-FcRH5抗体可以结合FcRH5多肽。半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体可以通过包括
下述的方法进行制备：用半胱氨酸替代母体抗-FcRH5抗体的一个或多个氨基酸残基。
[0052] 在一个方面中，本发明包括包含一个或多个游离半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体，其中所述半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体结合FcRH5多肽并且通过包括
用半胱氨酸替代母体抗-FcRH5抗体的一个或多个氨基酸残基的方法进行制备，其中所述
母体抗体包含选自下述的至少一个HVR序列：
用半胱氨酸替代母体抗-FcRH5抗体的一个或多个氨基酸残基的方法进行制备，其中所述
母体抗体包含选自下述的至少一个HVR序列：
[0053] (i)HVR-L1，其包含序列KASQNVGSNVA(SEQ ID NO：28)
[0054] (ii)HVR-L2，其包含序列SASYRYS(SEQ ID NO：29)
[0055] (iii)HVR-L3，其包含序列QQYKTWT(SEQ ID NO：30)
[0056] (iv)HVR-H1，其包含序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：37)
[0057] (v)HVR-H2，其包含序列NTYTGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO：38)；和
[0058] (vi)HVR-H3，其包含序列ARRSIPYYYAMDY(SEQ ID NO：39)。
[0059] 所述半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体可以是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化的抗体、单链抗体或抗体，其竞争性抑制抗-FcRH5多肽抗体与其各自的抗原表
位结合。本发明的抗体可以任选地缀合于生长抑制剂或细胞毒性剂如毒素，包括例如
auristatin或美坦生类化合物。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞或细菌细胞中产生，
并且优选地抑制它们 所结合的细胞的生长或增殖或诱导它们所结合的细胞的死亡。对于
诊断目的，本发明的抗体可以可检测地进行标记，附着于固体支持物等。
位结合。本发明的抗体可以任选地缀合于生长抑制剂或细胞毒性剂如毒素，包括例如
auristatin或美坦生类化合物。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞或细菌细胞中产生，
并且优选地抑制它们 所结合的细胞的生长或增殖或诱导它们所结合的细胞的死亡。对于
诊断目的，本发明的抗体可以可检测地进行标记，附着于固体支持物等。
[0060] 在一个方面中，本发明提供制备本发明的抗体的方法。例如，本发明提供制备FcRH5抗体(如本文定义，其包括全长和其片段)的方法，所述方法包括在适合的宿主细胞
中表达编码所述抗体(或其片段)的本发明的重组载体，和回收所述抗体。
中表达编码所述抗体(或其片段)的本发明的重组载体，和回收所述抗体。
[0061] 在另一个方面中，本发明提供双特异性抗体，其能够结合表达FcRH5的第一细胞和表达细胞表面靶抗原的第二细胞。在一个实施方案中，所述第二细胞是T细胞。在一个实
施方案中，所述细胞表面靶抗原是CD3。在某些实施方案中，所述双特异性抗体是突起-进
入-腔(protruberance-into-cavity)抗体。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是未
被糖基化的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体在大肠杆菌(Escherichia coli)宿主
细胞中产生。在一个实施方案中，所述双特异性抗体缺少一种或多种Fc效应子功能。在一
个实施方案中，所述双特异性抗体缺少ADCC活性。
施方案中，所述细胞表面靶抗原是CD3。在某些实施方案中，所述双特异性抗体是突起-进
入-腔(protruberance-into-cavity)抗体。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是未
被糖基化的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体在大肠杆菌(Escherichia coli)宿主
细胞中产生。在一个实施方案中，所述双特异性抗体缺少一种或多种Fc效应子功能。在一
个实施方案中，所述双特异性抗体缺少ADCC活性。
[0062] 在一个方面中，本发明是包含本发明的抗体的药物制剂或本发明的抗体-药物缀合物，和药用稀释剂、载体或赋形剂。
[0063] 在一个方面中，本发明提供制品，所述制品包括容器和包含在所述容器中的组合物，其中所述组合物包含一种或多种本发明的FcRH5抗体。
[0064] 在一个方面中，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含含有组合物的第一容器和包含缓冲液的第二容器，所述组合物包含一种或多种本发明的FcRH5抗体。
[0065] 在一个方面中，本发明提供本发明的FcRH5抗体用于制备药物的应用，所述药物用于治疗性和/或预防性治疗疾病，如癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病。
[0066] 在一个方面中，本发明提供本发明的制品用于制备药物的应用，所述药物用于治疗性和/或预防性治疗疾病，如癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病。
[0067] 在一个方面中，本发明提供本发明的试剂盒用于制备药物的应用，所述药物用于治疗性和/或预防性治疗疾病，如癌症、肿瘤和/或细胞增生性 疾病。
[0068] 在一个方面中，本发明提供抑制表达FcRH5的细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的抗体接触，由此导致对所述细胞生长的抑制。在一个实施方案中，将所
述抗体缀合于细胞毒性剂。在一个实施方案中，将所述抗体缀合于生长抑制剂。
述抗体缀合于细胞毒性剂。在一个实施方案中，将所述抗体缀合于生长抑制剂。
[0069] 在一个方面中，本发明提供治疗性治疗患有癌性肿瘤的哺乳动物的方法，所述癌性肿瘤包含表达FcRH5的细胞，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本发明的
抗体，由此有效治疗所述哺乳动物。在一个实施方案中，将所述抗体缀合于细胞毒性剂。在
一个实施方案中，将所述抗体缀合于生长抑制剂。
抗体，由此有效治疗所述哺乳动物。在一个实施方案中，将所述抗体缀合于细胞毒性剂。在
一个实施方案中，将所述抗体缀合于生长抑制剂。
[0070] 在一个方面中，本发明提供治疗或预防与FcRH5增加的表达相关的细胞增生性疾病的方法，所述方法包括向需要所述治疗的受试者施用有效量的本发明的抗体，由此有效
治疗或预防所述细胞增生性疾病。在一个实施方案中，所述增生性疾病是癌症。在一个实
施方案中，将所述抗体缀合于细胞毒性剂。在一个实施方案中，将所述抗体缀合于生长抑制
剂。
治疗或预防所述细胞增生性疾病。在一个实施方案中，所述增生性疾病是癌症。在一个实
施方案中，将所述抗体缀合于细胞毒性剂。在一个实施方案中，将所述抗体缀合于生长抑制
剂。
[0071] 在一个方面中，本发明提供用于抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生长至少部分依赖于FcRH5的生长增强作用，所述方法包括使所述细胞与有效量的本发明的抗体接
触，由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，将所述抗体缀合于细胞毒性剂。在一个
实施方案中，将所述抗体缀合于生长抑制剂。
触，由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，将所述抗体缀合于细胞毒性剂。在一个
实施方案中，将所述抗体缀合于生长抑制剂。
[0072] 在一个方面中，本发明提供治疗性治疗哺乳动物中的肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长至少部分依赖于FcRH5的生长增强作用，所述方法包括使所述细胞与有效量的本发
明的抗体接触，由此有效治疗所述肿瘤。在一个实施方案中，将所述抗体缀合于细胞毒性
剂。在一个实施方案中，将所述抗体缀合于生长抑制剂。
明的抗体接触，由此有效治疗所述肿瘤。在一个实施方案中，将所述抗体缀合于细胞毒性
剂。在一个实施方案中，将所述抗体缀合于生长抑制剂。
[0073] 在一个方面中，本发明提供治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用药物制剂，所述药物制剂包含本文所述的免疫缀合物，可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
[0074] 在一个方面中，本发明提供抑制B细胞增生的方法，所述方法包括使细胞在允许免疫缀合物结合于FcRH5的条件下暴露于包含本发明的抗体 的免疫缀合物。
[0076] 在一个方面中，本发明提供这样的方法，所述方法包括与有效量的另一种治疗剂(如抗-血管生成剂、另一种抗体、化疗剂、细胞毒性剂、免疫抑制剂、前体药物、细胞因
子、细胞毒性放射疗法、皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、镇痛药或生长抑制剂)组合施用有效量的抗-FcRH5抗体。例如，抗-FcRH5抗体或免疫缀合物与抗癌剂或抗-生血管药剂
组合用于治疗各种瘤形成疾病或非瘤形成疾病。在具体的实例中，所述抗-FcRH5抗体与
(硼替佐米(bortezomib))、 (来那度胺(lenalidomide))、他莫昔
芬(tamoxifen)、来曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、阿那曲唑(anastrozole)、
伊立替康(irinotecan)、西妥昔单抗(cetuximab)、氟维斯群(fulvestrant)、长春瑞滨
(vinorelbine)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、长春新碱(vincristine)、顺铂(cisplatin)、
吉西他滨(gemcitabine)、甲氨喋呤(methotrexate)、长春碱(vinblastine)、卡铂
(carboplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、
5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、多柔比星(doxorubicin)、硼替佐米(bortezomib)、
来那度胺(lenalidomide)、地塞米松(dexamethasone)、美法仑(melphalin)、泼尼松
(prednisone)、长春新碱(vincristine)、沙利度胺(thalidomide)组合使用。
子、细胞毒性放射疗法、皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、镇痛药或生长抑制剂)组合施用有效量的抗-FcRH5抗体。例如，抗-FcRH5抗体或免疫缀合物与抗癌剂或抗-生血管药剂
组合用于治疗各种瘤形成疾病或非瘤形成疾病。在具体的实例中，所述抗-FcRH5抗体与
(硼替佐米(bortezomib))、 (来那度胺(lenalidomide))、他莫昔
芬(tamoxifen)、来曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、阿那曲唑(anastrozole)、
伊立替康(irinotecan)、西妥昔单抗(cetuximab)、氟维斯群(fulvestrant)、长春瑞滨
(vinorelbine)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、长春新碱(vincristine)、顺铂(cisplatin)、
吉西他滨(gemcitabine)、甲氨喋呤(methotrexate)、长春碱(vinblastine)、卡铂
(carboplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、
5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、多柔比星(doxorubicin)、硼替佐米(bortezomib)、
来那度胺(lenalidomide)、地塞米松(dexamethasone)、美法仑(melphalin)、泼尼松
(prednisone)、长春新碱(vincristine)、沙利度胺(thalidomide)组合使用。
[0077] 取决于待治疗的具体的癌症适应症，本发明的组合疗法可以与另外的治疗剂，如化疗剂，或另外的疗法如放射性疗法或外科手术组合。可以将许多已知的化疗剂用在本发
明的组合疗法中。优选地，将使用那些化疗剂，所述化疗剂对于特定适应症的治疗是标准
的。在组合中使用的每种治疗剂的剂量或频率优选地与相应药剂在不与其它药剂一起使用
时的剂量或频率相同，或低于相应药剂在不与其它药剂一起使用时的剂量或频率。
明的组合疗法中。优选地，将使用那些化疗剂，所述化疗剂对于特定适应症的治疗是标准
的。在组合中使用的每种治疗剂的剂量或频率优选地与相应药剂在不与其它药剂一起使用
时的剂量或频率相同，或低于相应药剂在不与其它药剂一起使用时的剂量或频率。
[0078] 在另一个方面中，本发明提供任一种本文所述的抗-FcRH5抗体，其中所述抗-FcRH5抗体包含可检测的标记。
[0079] 在一个方面中，本发明提供在怀疑包含FcRH5的样品中确定FcRH5 的存在的方法，所述方法包括将所述样品暴露于本发明的抗体，并且确定所述抗体与所述样品中FcRH5
的结合，其中所述抗体与所述样品中FcRH5的结合指示所述蛋白在所述样品中的存在。
的结合，其中所述抗体与所述样品中FcRH5的结合指示所述蛋白在所述样品中的存在。
[0080] 在一个方面中，本发明提供诊断与表达FcRH5的细胞，如B细胞的增加相关的细胞增生性疾病的方法，所述方法包括使生物样品中的测试细胞与任一种上述抗体接触；通过
检测抗体与FcRH5的结合来确定与样品中测试细胞结合的抗体的水平；并且与对照样品中
的细胞结合的抗体的水平进行比较，其中将结合的抗体的水平针对在测试和对照样品中表
达FcRH5的细胞的数量进行标准化，并且其中与对照样品比较在测试样品中结合的抗体的
更高水平指示存在与表达FcRH5的细胞相关的细胞增生性疾病。
检测抗体与FcRH5的结合来确定与样品中测试细胞结合的抗体的水平；并且与对照样品中
的细胞结合的抗体的水平进行比较，其中将结合的抗体的水平针对在测试和对照样品中表
达FcRH5的细胞的数量进行标准化，并且其中与对照样品比较在测试样品中结合的抗体的
更高水平指示存在与表达FcRH5的细胞相关的细胞增生性疾病。
[0081] 在一个方面中，本发明提供检测血液或血清中可溶性FcRH5的方法，所述方法包括使来自被怀疑经历B细胞增生性疾病的哺乳动物的血液或血清的测试样品与本发明的
抗-FcRH5抗体接触，并且检测相对于来自正常哺乳动物的血液或血清的对照样品，在测试
样品中可溶性FcRH5的增加。
抗-FcRH5抗体接触，并且检测相对于来自正常哺乳动物的血液或血清的对照样品，在测试
样品中可溶性FcRH5的增加。
[0082] 在一个方面中，本发明提供将本发明的抗体与表达FcRH5的细胞结合的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的抗体接触。在一个实施方案中，将所述抗体与细胞毒性
剂缀合。在一个实施方案中，将所述抗体与生长抑制剂缀合。
剂缀合。在一个实施方案中，将所述抗体与生长抑制剂缀合。
[0084] 图1描述嵌合的抗-人FcRH57D11轻链(DNA)。
[0085] 图2描述嵌合的抗-人FcRH57D11轻链(氨基酸)。
[0086] 图3描述嵌合的抗-人FcRH57D11重链(DNA)。
[0087] 图4描述嵌合的抗-人FcRH57D11重链(氨基酸)。
[0088] 图5描述嵌合的抗-人FcRH5(mAb13G9)轻链(DNA)(SEQ ID NO：52)。
[0089] 图6描述嵌合的抗-人FcRH5(mAb13G9)轻链(氨基酸)(SEQ ID NO：53)。
[0090] 图7描述嵌合的抗-人FcRH5(mAb13G9)重链(DNA)(SEQ ID NO：54)。
[0091] 图8描述嵌合的抗-人FcRH5(mAb13G9)重链(氨基酸)(SEQ ID NO：55)。
[0092] 图9显示鼠13G9的可变轻链(SEQ ID NO：18)与人源化的13G9v1(SEQ IDNO：19)的比对。图9公开了“hum k1”序列，其为SEQ ID NO：56。
[0093] 图10显示鼠13G9的可变重链(SEQ ID NO：20)与人源化的13G9v1(SEQID NO：21)的比对。图10公开了″hum III″序列，其为SEQ ID NO：58。
[0094] 图11描述人源化的13G9v1的可变重链(SEQ ID NO：21)，人源化的13G9v3(SEQID NO：22)和人源化的13G9v8(SEQ ID NO：23)的比对。
[0095] 图12显示本发明的抗体的氨基酸序列(hu13G9v1)。图12以出现的顺序分别公开了SEQ ID NOS 24-42。
[0096] 图13显示本发明的硫代-Mab的半胱氨酸改造的多肽链的氨基酸序列。图13以出现的顺序分别公开了SEQ ID NOS 59和60。
[0097] 图14显示了本发明的硫代-Mab的半胱氨酸改造的多肽链的氨基酸序列。图14以出现的顺序分别公开了SEQ ID NOS 61和62。
[0098] 图15显示FcRH5抗体的交叉反应性。
[0099] 图16显示FcRH5抗体的交叉反应性。
[0100] 图17显示FcRH5抗体的交叉反应性。
[0101] 图18显示FcRH5抗体滴定。
[0102] 图19显示FcRH5抗体滴定。
[0103] 图20显示本发明的抗体对平均肿瘤体积的作用。
[0104] 图21显示本发明的抗体对平均体重的作用。
[0105] 图22显示本发明的抗体对平均肿瘤体积的作用。
[0106] 图23显示本发明的抗体对平均体重的作用。
[0107] 图24显示单一化合物剂量反应分析。
[0108] 图25显示单一化合物剂量反应分析。
[0109] 图26显示PRO820cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：63)，其中SEQ ID NO：63是本文称为“DNA56041-1416″(在本文也称为“FcRH5″)的克隆。所述核苷酸序列编码具
有起始密码子和终止密码子(以粗体和下划线表示)的FcRH5。(见Goddard等，美国专利
号7491529)。
有起始密码子和终止密码子(以粗体和下划线表示)的FcRH5。(见Goddard等，美国专利
号7491529)。
[0110] 图27显示来自在图26中显示的SEQ ID NO：63的编码序列的氨基酸序列(SEQ IDNO：64)。(见Goddard等.美国专利号7491529)。
[0111] 图28A-B显示PRO52387cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：65)，其 中SEQ ID NO：65是在本文称为“DNA257845″(在本文也称为“FcRH5″)的克隆。所述核苷酸序列编码具
有起始密码子和终止密码子(以粗体和下划线表示)的FcRH5。(见，Chang等，美国公开
的专利申请号20060251662)。
有起始密码子和终止密码子(以粗体和下划线表示)的FcRH5。(见，Chang等，美国公开
的专利申请号20060251662)。
[0112] 图29显示来自在图28A-B中显示的SEQ ID NO：65的编码序列的氨基酸序列(SEQID NO：66)。(见Chang等，美国公开的专利申请号20060251662).
[0113] 图30显示PRO314992cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：67)，其中SEQ ID NO：67是来自食蟹猴(cynomologous monkey)在本文被称为“DNA676969”的克隆(在本文也称为
“cyno FcRH5”)。
“cyno FcRH5”)。
[0114] 图31显示来自在图30中显示的SEQ ID NO：67的编码序列的氨基酸序列(SEQ IDNO：68)。
[0115] 优选实施方案的详细描述
[0116] 本发明提供用于鉴定组合物(其用于治疗哺乳动物的造血系统肿瘤)的方法、组合物、试剂盒和制品，以及使用那些主题组合物用于治疗所述造血系统肿瘤的方法。
[0117] 本文提供这些方法、组合物、试剂盒和制品的详情。
[0118] I.一般技术
[0119] 除非另外指出，本发明的实践将使用常规的分子生物学(包括重组技术)，微生物学、细胞生物学、生物化学、和免疫学技术，这些都在本领域的能力范围之内。这些技
术都在文献中进行了充分的解释，如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子
克隆：实验室手册)”，第二版(Sambrook等，1989)；“Oligonucleotide Synthesis(寡核
苷酸合成)”(M.J.Gait，编辑，1984)；“Animal Cell Culture(动物细胞培养物)”(R.
I.Freshney，编辑，1987)；“Methods in Enzymology(酶学方法)”(Academic Press，
Inc.(学术出版社公司))；“Current Protocols in Molecular Biology(目前在分子生
物学中的方法)”(F.M.Ausubel等，编辑，1987，和周期性更新)；“PCR：The Polymerase
Chain Reaction(PCR：聚合酶链式反应)”，(Mullis等，编辑，1994)；“A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆的实践指南)”(Perbal Bernard V.， 1988)；“Phage
Display：A Laboratory Manual(噬菌体展示：实验室手册)”(Barbas等，2001)。
术都在文献中进行了充分的解释，如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子
克隆：实验室手册)”，第二版(Sambrook等，1989)；“Oligonucleotide Synthesis(寡核
苷酸合成)”(M.J.Gait，编辑，1984)；“Animal Cell Culture(动物细胞培养物)”(R.
I.Freshney，编辑，1987)；“Methods in Enzymology(酶学方法)”(Academic Press，
Inc.(学术出版社公司))；“Current Protocols in Molecular Biology(目前在分子生
物学中的方法)”(F.M.Ausubel等，编辑，1987，和周期性更新)；“PCR：The Polymerase
Chain Reaction(PCR：聚合酶链式反应)”，(Mullis等，编辑，1994)；“A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆的实践指南)”(Perbal Bernard V.， 1988)；“Phage
Display：A Laboratory Manual(噬菌体展示：实验室手册)”(Barbas等，2001)。
[0120] II.定义
[0122] “B-细胞表面标志”或“B-细胞表面抗原”在本文是在B细胞表面上表达的抗原，其可以被结合在细胞上的拮抗剂靶向，所述拮抗剂包括但不限于能够拮抗配体与天然存在
的B细胞抗原结合的针对B-细胞表面抗原或可溶形式的B细胞表面抗原。示例性B细胞表
面标志包括CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD37，CD40，CD53，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CDw78，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85和CD86白细胞表面标志(关于描述，见The Leukocyte antigen Facts Book，第2版.1997，Barclay
等编辑.Academic Press(学术出版社)，Harcourt Brace & Co.，纽约)。其它B-细胞表面
标志包括RP105，FcRH2，B-细胞CR2，CCR6，P2X5，HLA-DOB，CXCR5，FCER2，BR3，BAFF，BIyS，Btig，NAG14，SLGC16270，FcRH1，IRTA2，ATWD578，FcRH3，IRTA1，FcRH6，BCMA，和239287。与哺乳动物的其它非B-细胞组织比较，特定目的的B-细胞表面标志优先在B细胞上表达，并
且可以在前体B细胞和成熟B细胞上表达。
的B细胞抗原结合的针对B-细胞表面抗原或可溶形式的B细胞表面抗原。示例性B细胞表
面标志包括CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD37，CD40，CD53，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CDw78，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85和CD86白细胞表面标志(关于描述，见The Leukocyte antigen Facts Book，第2版.1997，Barclay
等编辑.Academic Press(学术出版社)，Harcourt Brace & Co.，纽约)。其它B-细胞表面
标志包括RP105，FcRH2，B-细胞CR2，CCR6，P2X5，HLA-DOB，CXCR5，FCER2，BR3，BAFF，BIyS，Btig，NAG14，SLGC16270，FcRH1，IRTA2，ATWD578，FcRH3，IRTA1，FcRH6，BCMA，和239287。与哺乳动物的其它非B-细胞组织比较，特定目的的B-细胞表面标志优先在B细胞上表达，并
且可以在前体B细胞和成熟B细胞上表达。
[0123] 除非另外指出，术语“FcRH5”，用于本文时，指来自任何脊椎动物来源的任何天然FcRH5，所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类动物(例如人、食蟹猴(cyno)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠))。人FcRH5在本文也称为“TAHO18”或“PRO85143”(SEQ ID NO：2)
并且由在本文也称为“DNA340394”的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)编码。食蟹猴FcRH5在本
文也称为“cyno FcRH5”。术语“FcRH5”涵盖“全长”，未加工的FcRH5以及由在细胞中加工得到的任何形式的FcRH5。术语还涵盖天然存在的FcRH5变体，例如剪接变体、等位基因变
体和同种型。本文所述的FcRH5多肽可以从多种来源(如来自人组织类型或另一种来源)
分离，或通过重组或合 成方法进行制备。″天然序列FcRH5多肽″包含与来自自然的相应
FcRH5多肽具有相同氨基酸序列的多肽。这样的天然序列FcRH5多肽可以从自然中分离或
可以通过重组或合成方式产生。术语“天然序列FcRH5多肽”具体地涵盖特定FcRH5多肽
的天然存在的截短形式或分泌形式(例如细胞外结构域序列)，多肽的天然存在的变体形
式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位基因变体。在本发明的某些实施方案中，本文
公开的天然序列FcRH5多肽是成熟或全长天然序列多肽，其包含在附图中显示的全长氨基
酸序列。起始密码子和终止密码子(如果指出)以图中的粗体和下划线显示。在附图中指
示为“N”的核酸残基是任何核酸残基。然而，尽管附图中公开的FcRH5多肽以本文指定为
图中氨基酸位置1的甲硫氨酸残基起始，将位于图中氨基酸位置1的上游或下游的其它甲
硫氨酸残基用作FcRH5多肽的起始氨基酸残基是可设想的并且是可以的。
并且由在本文也称为“DNA340394”的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)编码。食蟹猴FcRH5在本
文也称为“cyno FcRH5”。术语“FcRH5”涵盖“全长”，未加工的FcRH5以及由在细胞中加工得到的任何形式的FcRH5。术语还涵盖天然存在的FcRH5变体，例如剪接变体、等位基因变
体和同种型。本文所述的FcRH5多肽可以从多种来源(如来自人组织类型或另一种来源)
分离，或通过重组或合 成方法进行制备。″天然序列FcRH5多肽″包含与来自自然的相应
FcRH5多肽具有相同氨基酸序列的多肽。这样的天然序列FcRH5多肽可以从自然中分离或
可以通过重组或合成方式产生。术语“天然序列FcRH5多肽”具体地涵盖特定FcRH5多肽
的天然存在的截短形式或分泌形式(例如细胞外结构域序列)，多肽的天然存在的变体形
式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位基因变体。在本发明的某些实施方案中，本文
公开的天然序列FcRH5多肽是成熟或全长天然序列多肽，其包含在附图中显示的全长氨基
酸序列。起始密码子和终止密码子(如果指出)以图中的粗体和下划线显示。在附图中指
示为“N”的核酸残基是任何核酸残基。然而，尽管附图中公开的FcRH5多肽以本文指定为
图中氨基酸位置1的甲硫氨酸残基起始，将位于图中氨基酸位置1的上游或下游的其它甲
硫氨酸残基用作FcRH5多肽的起始氨基酸残基是可设想的并且是可以的。
[0124] “mu7D11”或“MA7D11”或“鼠FcRH5(7D11)抗体”或“鼠抗-FcRH5(7D11)抗体”用于本文时特别指鼠抗-FcRH5单克隆抗体，其中所述鼠抗-FcRH5单克隆抗体包含图9(SEQID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)的轻链可变结构域。鼠抗-FcRH5单克隆抗体可以购自
商业来源。
商业来源。
[0125] “ch13G9”或“chMAFcRH5(13G9)”或“嵌合的MAFcRH5(13G9)抗体”用于本文时特别指嵌合的抗-人FcRH5(13G)抗体，其中所述嵌合的抗-FcRH5抗体包含SEQ ID NO：的轻
链(图6)，所述轻链包含人IgG1的轻链恒定结构域。所述嵌合的抗-FcRH5(13G9)抗体还
包含SEQ ID NO：的重链(图8)，所述重链包含人IgG1的恒定结构域。
链(图6)，所述轻链包含人IgG1的轻链恒定结构域。所述嵌合的抗-FcRH5(13G9)抗体还
包含SEQ ID NO：的重链(图8)，所述重链包含人IgG1的恒定结构域。
[0126] “抗-cynoFcRH5”或“抗-cyno FcRH5”用于本文时指结合cyno FcRH5的抗体。
[0127] “13G9-移植物”或“13G9-移植的‘人源化’抗体”或“hu13G9移植物”用于本文时特别指通过将来自鼠13G9抗-FcRH5抗体(MA7D11)的高变区移植到受体人共有VL kappaI(huKI)和具有R71A，N73T和L78A的人亚组III共有VH(huIII)上产生的移植物。(Carter
等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，89：4285(1992))(见实施例部分1
和图9-12)。“hu13G9”或“hu13G9v1”或“hu13G9v3”或“hu13G9v8”用于本文时，特别指人源化的13G9抗体。
等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，89：4285(1992))(见实施例部分1
和图9-12)。“hu13G9”或“hu13G9v1”或“hu13G9v3”或“hu13G9v8”用于本文时，特别指人源化的13G9抗体。
[0128] 氨基酸残基/位置的“修饰”，用于本文时，指与起始氨基酸序列比较一级氨基酸序列的变化，其中所述变化由涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变导致。例如，典型的修
饰包括残基(或在所述位置)被另一种氨基酸置换(例如保守性置换或非保守性置换)，将
一个或多个(通常少于5或3个)氨基酸插入所述残基/位置邻近，和所述残基/位置的
缺失。“氨基酸置换”，或其变异指用不同的氨基酸残基替换预定(起始)氨基酸序列中的
现有氨基酸残基。通常地并且优选地，修饰导致与包含起始(或“野生型”)氨基酸序列的
多肽比较变体多肽的至少一种物理生物化学活性的改变。例如，在抗体的情形中，被改变的
物理生物化学活性可以是对于靶分子的结合亲和性、结合能力和/或结合作用。
饰包括残基(或在所述位置)被另一种氨基酸置换(例如保守性置换或非保守性置换)，将
一个或多个(通常少于5或3个)氨基酸插入所述残基/位置邻近，和所述残基/位置的
缺失。“氨基酸置换”，或其变异指用不同的氨基酸残基替换预定(起始)氨基酸序列中的
现有氨基酸残基。通常地并且优选地，修饰导致与包含起始(或“野生型”)氨基酸序列的
多肽比较变体多肽的至少一种物理生物化学活性的改变。例如，在抗体的情形中，被改变的
物理生物化学活性可以是对于靶分子的结合亲和性、结合能力和/或结合作用。
[0129] 术语“抗体”以最广义使用，具体地涵盖例如单个的抗-FcRH5单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整的单克隆抗体)，具有多表位特异性的抗-FcRH5抗
体组合物，形成自至少两种完整抗体的多克隆抗体，多价抗体，多特异性抗体(例如，双特
异性抗体，只要它们显示需要的生物学活性)，单链抗-FcRH5抗体和抗-FcRH5抗体的片段
(见下)，包括Fab，Fab”，F(ab’)2和Fv片段，双抗体，单个的结构域抗体(sdAbs)，只要它们显示需要的生物学或免疫学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文可与抗体交互使用。
抗体可以是人的、人源化的和/或亲和性成熟的抗体。
体组合物，形成自至少两种完整抗体的多克隆抗体，多价抗体，多特异性抗体(例如，双特
异性抗体，只要它们显示需要的生物学活性)，单链抗-FcRH5抗体和抗-FcRH5抗体的片段
(见下)，包括Fab，Fab”，F(ab’)2和Fv片段，双抗体，单个的结构域抗体(sdAbs)，只要它们显示需要的生物学或免疫学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文可与抗体交互使用。
抗体可以是人的、人源化的和/或亲和性成熟的抗体。
[0130] 术语“抗-FcRH5抗体”或“结合FcRH5的抗体”指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和性结合FcRH5从而使所述抗体可用作靶向FcRH5的诊断剂和/或治疗剂。优选
地，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的，抗-FcRH5抗体与不相关的，非-FcRH5蛋
白的结合程度低于抗体与FcRH5结合的约10％。在某些实施方案中，结合FcRH5的抗体具
有≤1∝M，≤100nM，≤10nM，≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，
抗-FcRH5抗体结合在来自不同物种的FcRH5中保守的FcRH5的表位。
地，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的，抗-FcRH5抗体与不相关的，非-FcRH5蛋
白的结合程度低于抗体与FcRH5结合的约10％。在某些实施方案中，结合FcRH5的抗体具
有≤1∝M，≤100nM，≤10nM，≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，
抗-FcRH5抗体结合在来自不同物种的FcRH5中保守的FcRH5的表位。
[0131] “分离的抗体”指已经鉴定且与其天然环境的成分分离和/或从其回收的抗体。抗体的天然环境的污染性成分指将会干扰其治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质
性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)如通过Lowry法测
定，超过95％重量的抗体， 和最优选地超过99％重量的抗体，(2)足以通过使用转杯式测
序仪(spinning cup sequenator)获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，
或(3)通过使用考马斯蓝或优选地银染色在还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同
质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原
位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。
性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)如通过Lowry法测
定，超过95％重量的抗体， 和最优选地超过99％重量的抗体，(2)足以通过使用转杯式测
序仪(spinning cup sequenator)获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，
或(3)通过使用考马斯蓝或优选地银染色在还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同
质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原
位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。
[0132] 基本的4-链抗体单位是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本异四聚体单位和另外的被称为J链的多肽组成，并且因
此包含10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合形成包含2-5个基本4-链单位和
J链的多价集聚物)。在IgGs的情形中，4-链单位通常是约150,000道尔顿。每条L链通
过一个共价二硫键连接于H链，而取决于H链同种型，两条H链通过一个或多个二硫键彼此
连接。每条H链和L链也具有规则间隔的链内二硫键。每条H链在N-端具有可变结构域
(VH)，其后是三个恒定结构域(CH)(对于α和γ链的每个)和四个CH结构域(对于μ和
ε同种型)。每条L链在N-端具有可变结构域(VL)，随后在其另外一端具有恒定结构域
(CL)。将VL与VH进行比对，并将CL与重链的第一恒定结构域(CH1)比对。认为特定氨基酸
残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL成对在一起形成单个的抗原结合位
点。关于不同种类的抗体的结构和性质，见例如Basic and Clinical Immunology(基本和
临床免疫学)，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G. Parslow(编辑)，
Appleton & Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。
此包含10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合形成包含2-5个基本4-链单位和
J链的多价集聚物)。在IgGs的情形中，4-链单位通常是约150,000道尔顿。每条L链通
过一个共价二硫键连接于H链，而取决于H链同种型，两条H链通过一个或多个二硫键彼此
连接。每条H链和L链也具有规则间隔的链内二硫键。每条H链在N-端具有可变结构域
(VH)，其后是三个恒定结构域(CH)(对于α和γ链的每个)和四个CH结构域(对于μ和
ε同种型)。每条L链在N-端具有可变结构域(VL)，随后在其另外一端具有恒定结构域
(CL)。将VL与VH进行比对，并将CL与重链的第一恒定结构域(CH1)比对。认为特定氨基酸
残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL成对在一起形成单个的抗原结合位
点。关于不同种类的抗体的结构和性质，见例如Basic and Clinical Immunology(基本和
临床免疫学)，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G. Parslow(编辑)，
Appleton & Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。
[0133] 基于它们恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的L链分为两种清楚区分的类型之一，称为κ和λ。取决于它们重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列，
可以将免疫球蛋白分为不同种类或同种型。存在五种免疫球蛋白类别：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，分别具有被称为α，δ，ε，γ，和μ的重链。基于CH序列和功能中的相对微小差
异，将γ和α类别进一步分为亚类，例如人表达下述亚类：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。
可以将免疫球蛋白分为不同种类或同种型。存在五种免疫球蛋白类别：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，分别具有被称为α，δ，ε，γ，和μ的重链。基于CH序列和功能中的相对微小差
异，将γ和α类别进一步分为亚类，例如人表达下述亚类：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。
[0134] 抗体的“可变区”或“可变结构域”指抗体的重链或轻链的氨基端结构 域。重链的可变结构域可以称为“VH”。轻链的可变结构域可以称为“VL”。这些结构域通常是抗体
最可变的部分并且包含抗原结合位点。
最可变的部分并且包含抗原结合位点。
[0135] 术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体间序列差异广泛的事实。V结构域介导抗原结合并且限定具体抗体关于其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布
于可变结构域的110个氨基酸跨度中。相反，V区由15-30个氨基酸的被称为构架区(FRs)
的相对不变的延伸组成，所述构架区由被称为“高变区”的最具可变性的较短区分隔，所述
高变区每个长度为9-12个氨基酸。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，它们大
多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个
高变区连接。每条链中的高变区通过FRs非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区
一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabrat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of
Proteins ofImmunological Interest)，第5版，公众健康服务(Public Health Service)，
国家健康研究所(National Institute of Health)，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域
不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞毒
性(ADCC)中的参与。
于可变结构域的110个氨基酸跨度中。相反，V区由15-30个氨基酸的被称为构架区(FRs)
的相对不变的延伸组成，所述构架区由被称为“高变区”的最具可变性的较短区分隔，所述
高变区每个长度为9-12个氨基酸。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，它们大
多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个
高变区连接。每条链中的高变区通过FRs非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区
一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabrat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of
Proteins ofImmunological Interest)，第5版，公众健康服务(Public Health Service)，
国家健康研究所(National Institute of Health)，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域
不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞毒
性(ADCC)中的参与。
[0136] “完整”抗体是这样的抗体，其包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域，CH1，CH2和CH3。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)
或其氨基酸序列变体。优选地，所述完整抗体具有一种或多种效应子功能。
或其氨基酸序列变体。优选地，所述完整抗体具有一种或多种效应子功能。
[0137] 用于本文目的的“裸抗体”是未缀合于细胞毒性结构部分或放射性标记的抗体。
[0138] ″抗体片段″包含完整抗体的一部分，优选地包含完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab′，F(ab′)2，和Fv片段；双抗体；直链抗体(见美国专
利号5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原
结合位点并由此保持结合抗原的能力。
利号5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原
结合位点并由此保持结合抗原的能力。
[0139] 抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及残余的“Fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。Fab片段由 完整的L链以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段关于抗原结合是单价
的，即其具有单一抗原结合位点。抗体的木瓜蛋白酶处理产生单一较大F(ab′)2片段，其
大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫化物连接的Fab片段并且仍旧能够交联抗
原。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基端加入几个残基，包括来自
抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文关于Fab’的名称，其中恒定结构域的
半胱氨酸残基具有游离硫醇基。F(ab’)2抗体片段最初作为在它们之间具有铰链半胱氨酸
的Fab’片段对产生。还已知抗体片段的其它化学偶联。
的，即其具有单一抗原结合位点。抗体的木瓜蛋白酶处理产生单一较大F(ab′)2片段，其
大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫化物连接的Fab片段并且仍旧能够交联抗
原。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基端加入几个残基，包括来自
抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文关于Fab’的名称，其中恒定结构域的
半胱氨酸残基具有游离硫醇基。F(ab’)2抗体片段最初作为在它们之间具有铰链半胱氨酸
的Fab’片段对产生。还已知抗体片段的其它化学偶联。
[0140] Fc片段包含通过二硫化物保持在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应子功能由在Fc区的序列确定，所述区域也是由在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别
的部分。
的部分。
[0141] “Fv”是包含完整抗原识别位点和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域以紧密的，非共价缔合的二聚体组成。在单链
Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连
接从而使轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。通过这两个结构域
的折叠，形成(emanate)六个高变环(由H链和L链各提供三个环)，其贡献用于抗原结合
的氨基酸残基并且将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变结构域(或只包含
对抗原特异的三个CDRs的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，然而亲和性低于完整结
合位点。
Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连
接从而使轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。通过这两个结构域
的折叠，形成(emanate)六个高变环(由H链和L链各提供三个环)，其贡献用于抗原结合
的氨基酸残基并且将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变结构域(或只包含
对抗原特异的三个CDRs的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，然而亲和性低于完整结
合位点。
[0142] ″单链Fv″也缩写为″sFv″或“scFv”，是这样的抗体片段，其包含连接到单一多肽链中的VH和VL抗体结构域。优选地，sFv多肽还在VH和VL结构域之间包含多肽
接头，其能够使sFv形成抗原结合所需要的结构。关于sFv的综述，见Pluckthun在The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies (单克隆抗体的药理学)中，卷113，Rosenburg
和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)；Borrebaeck 1995，见下
文。
接头，其能够使sFv形成抗原结合所需要的结构。关于sFv的综述，见Pluckthun在The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies (单克隆抗体的药理学)中，卷113，Rosenburg
和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)；Borrebaeck 1995，见下
文。
[0143] 术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段在相同的多肽链(VH-VL)中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域 (VH)。通过用在VH和VL结
构域之间的短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(见前述段落)从而获得V结构域的链
间而非链内配对，形成二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段来制备小抗体片段。双抗
体可以是二价或双特异性的。双特异性双抗体是两个“交换”sFv片段的异二聚体，其中两
个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；
WO 93/11161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等，美国国家科学院学
报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)中。三链抗体和四链抗体还在Hudson
等，Nat.Med.9：129-134(2003)中进行描述。
构域之间的短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(见前述段落)从而获得V结构域的链
间而非链内配对，形成二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段来制备小抗体片段。双抗
体可以是二价或双特异性的。双特异性双抗体是两个“交换”sFv片段的异二聚体，其中两
个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；
WO 93/11161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等，美国国家科学院学
报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)中。三链抗体和四链抗体还在Hudson
等，Nat.Med.9：129-134(2003)中进行描述。
[0144] 术语“单克隆抗体”用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在的可能天然存在突变外。单克隆抗体是高
度特异的，针对单个的抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克
隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对在抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，
单克隆抗体的有利之处还在于它们可以在不被其它抗体污染的情况下合成。不应将修饰语
“单克隆”解释为要求通过任何特定方法生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可以通
过首先由Kohler等，Nature(自然)，256：495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可以使用
重组DNA方法在细菌、真菌、动物或植物细胞中制备(见，例如美国专利号4,816,567)。所
述“单克隆抗体”还可以使用例如在Clackson等，Nature(自然)，352：624-628(1991)和
Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗
体文库中分离。
度特异的，针对单个的抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克
隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对在抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，
单克隆抗体的有利之处还在于它们可以在不被其它抗体污染的情况下合成。不应将修饰语
“单克隆”解释为要求通过任何特定方法生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可以通
过首先由Kohler等，Nature(自然)，256：495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可以使用
重组DNA方法在细菌、真菌、动物或植物细胞中制备(见，例如美国专利号4,816,567)。所
述“单克隆抗体”还可以使用例如在Clackson等，Nature(自然)，352：624-628(1991)和
Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗
体文库中分离。
[0145] 单克隆抗体在本文中包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍
生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体
的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(见，美国专利号.4,816,567和Morrison等，
美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：6851-6855(1984))。本文的目的嵌合
抗体包含“灵长类动物化(primatized)”抗体，所述“灵长类动物化”抗体包含衍生自非人
灵长类动物(例如，猕猴(old world monkey)，猿等)的可变 结构域抗原结合序列和人恒
定区序列。
生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体
的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(见，美国专利号.4,816,567和Morrison等，
美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：6851-6855(1984))。本文的目的嵌合
抗体包含“灵长类动物化(primatized)”抗体，所述“灵长类动物化”抗体包含衍生自非人
灵长类动物(例如，猕猴(old world monkey)，猿等)的可变 结构域抗原结合序列和人恒
定区序列。
[0146] 非人(例如啮齿类动物)抗体的“人源化”形式是包含衍生自非人抗体的最少序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体指这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区
残基用具有期望抗体特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔
或非人灵长类动物)的高变区残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的构架区(FR)
残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有
发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本
上全部的至少一个，和典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人
免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FRs是人免疫球蛋白序列的FRs。人源化抗体
任选地还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多
细节参见Jones等，自然(Nature)321：522-525(1986)；Riechmann等，自然(Nature)332：
323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见下面
的综述文献和其中引用的参考文献：Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma and
Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions，23：1035-1038(1995)；
Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。
残基用具有期望抗体特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔
或非人灵长类动物)的高变区残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的构架区(FR)
残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有
发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本
上全部的至少一个，和典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人
免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FRs是人免疫球蛋白序列的FRs。人源化抗体
任选地还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多
细节参见Jones等，自然(Nature)321：522-525(1986)；Riechmann等，自然(Nature)332：
323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见下面
的综述文献和其中引用的参考文献：Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma and
Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions，23：1035-1038(1995)；
Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。
[0147] “硫代”当用于本文时指涉及半胱氨酸-改造的抗体的抗体，而“hu”当用于本文时指涉及人源化抗体的抗体。
[0148] “人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除
包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括
噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，227：381(1991)；
Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，222：581(1991))。关于制备人单克隆抗体的还
可获得的方法是在Cole等，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy)，Alan R.Liss，77页(1985)；Boerner等，免疫学杂志(J.Immunol.)147(1)：
86-95(1991)中所述的方法。还见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：
368-74(2001)。人 抗体可以通过将抗原施用于已经被修饰从而响应于抗原激发产生所述
抗体，但是其内源基因座已经失能的转基因动物进行制备，所述转基因动物例如被免疫的
TM
异种小鼠。(见，例如，美国专利号6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSE 技术)。还
见，例如Li等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，103：3557-3562(2006)关
于通过人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体。
包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括
噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，227：381(1991)；
Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，222：581(1991))。关于制备人单克隆抗体的还
可获得的方法是在Cole等，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy)，Alan R.Liss，77页(1985)；Boerner等，免疫学杂志(J.Immunol.)147(1)：
86-95(1991)中所述的方法。还见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：
368-74(2001)。人 抗体可以通过将抗原施用于已经被修饰从而响应于抗原激发产生所述
抗体，但是其内源基因座已经失能的转基因动物进行制备，所述转基因动物例如被免疫的
TM
异种小鼠。(见，例如，美国专利号6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSE 技术)。还
见，例如Li等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，103：3557-3562(2006)关
于通过人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体。
[0149] 术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变结构域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个在VH中(H1、
H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补性
决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等，免疫目的蛋白序列
(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.公众健康服务(Public
Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，
MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和Lesk分子生物学杂志(J.Mol.
Biol.)196：901-917(1987))。取决于环的长度，当使用Kabat编号惯例编号时Chothia
CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化(这是因为Kabat编号系统在H35A和H35B放置
插入物(insertion)；如果35A和35B均不存在，环在32终止；如果仅35A存在，环在33终
止；如果35A和35B均存在，环在34终止)。AbM高变区代表Kabat CDRs与Chothia结构
环之间的折衷，而且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”高变区是以对
可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补性
决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等，免疫目的蛋白序列
(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.公众健康服务(Public
Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，
MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和Lesk分子生物学杂志(J.Mol.
Biol.)196：901-917(1987))。取决于环的长度，当使用Kabat编号惯例编号时Chothia
CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化(这是因为Kabat编号系统在H35A和H35B放置
插入物(insertion)；如果35A和35B均不存在，环在32终止；如果仅35A存在，环在33终
止；如果35A和35B均存在，环在34终止)。AbM高变区代表Kabat CDRs与Chothia结构
环之间的折衷，而且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”高变区是以对
可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
[0150]
[0151] 高变区可以如下包含“延伸的高变区”：在VL中的24-36或24-34(L1)，46-56或50-56(L2)和89-97(L3)和在VH中的26-35B(H1)，50-65，47-65或49-65(H2)和93-102，
94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基是依照Kabat等，见上
文编号的。
94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基是依照Kabat等，见上
文编号的。
[0152] “构架”或“FR”残基指除本文中所定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
[0153] 术语“依照Kabat的可变结构域残基编号”或“依照Kabat的氨基酸位置编号”及其变化形式指Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological
Interest)，第5版.公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National
Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991)中的用于抗体重链可变结构域或轻链可变
结构域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨
基酸，对应于可变结构域FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可包含H2残基52
后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依
照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列
与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
Interest)，第5版.公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National
Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991)中的用于抗体重链可变结构域或轻链可变
结构域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨
基酸，对应于可变结构域FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可包含H2残基52
后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依
照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列
与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
[0154] Kabat编号系统一般在提及可变结构域中的残基(大约是轻链的残基 1-107和重链的残基1-113)时使用(例如Kabat等，免疫目的序列(Sequences of Immunological
Interest).第5版.公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National
Institutes of Health)，Bethesda，Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如在Kabat等中报道的EU索引，见上文)。“如
在Kabat中所述的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。除非本文中另有说明，提及抗体
可变结构域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，
提及抗体恒定结构域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式(例如参见美国临
时申请号60/640,323，EU编号方式的图)。
Interest).第5版.公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National
Institutes of Health)，Bethesda，Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如在Kabat等中报道的EU索引，见上文)。“如
在Kabat中所述的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。除非本文中另有说明，提及抗体
可变结构域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，
提及抗体恒定结构域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式(例如参见美国临
时申请号60/640,323，EU编号方式的图)。
[0155] “亲和性成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVRs中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和性与没有这些改变的母体抗体相比有所提高的抗体。优选的亲和性成熟
的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和性。亲和性成熟的抗体可使用一些
本领域已知方法来生成。Marks等，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992)记载
了通过VH和VL结构域改组进行的亲和性成熟。以下文献记载了HVR和/或构架残基的随
机诱变：Barbas等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)91：3809-3813(1994)；
Schier等，基因(Gene)169：147-155(1995)；Yelton等，免疫学杂志(J.Immunol.)155：
1994-2004(1995)；Jackson 等，免 疫 学 杂 志(J.Immunol.)154(7)：3310-9(1995)；及
Hawkins等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)226：889-896(1992)。
的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和性。亲和性成熟的抗体可使用一些
本领域已知方法来生成。Marks等，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992)记载
了通过VH和VL结构域改组进行的亲和性成熟。以下文献记载了HVR和/或构架残基的随
机诱变：Barbas等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)91：3809-3813(1994)；
Schier等，基因(Gene)169：147-155(1995)；Yelton等，免疫学杂志(J.Immunol.)155：
1994-2004(1995)；Jackson 等，免 疫 学 杂 志(J.Immunol.)154(7)：3310-9(1995)；及
Hawkins等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)226：889-896(1992)。
[0156] “封闭”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或减少其结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的封闭抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物学活性。
[0157] “激动剂抗体，”用于本文时，是模拟目的多肽的至少一种功能活性的抗体。
[0158] “物种依赖型抗体”，例如哺乳动物抗-人IgE抗体是这样的抗体，其对于来自第一哺乳动物物种的抗原比对于来自第二哺乳动物物种的抗原的同源物(homologue)具有更
强的结合亲和性。在通常情况下，物种-依赖型抗体“特异性结合”人抗原(即，具有不超过
-7 -8
约1x 10 M的结合亲和性 (Kd)值，优选地不超过约1x 10 的结合亲和性和最优选地不超
-9
过约1x 10 M的结合亲和性)，而对于来自第二非人哺乳动物物种的抗原的同源物的结合
亲和性比其对于人抗原的结合亲和性弱至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍。
物种依赖型抗体可以是如上定义的不同类型的抗体的任一种，但是优选地是人源化的抗体
或人抗体。
强的结合亲和性。在通常情况下，物种-依赖型抗体“特异性结合”人抗原(即，具有不超过
-7 -8
约1x 10 M的结合亲和性 (Kd)值，优选地不超过约1x 10 的结合亲和性和最优选地不超
-9
过约1x 10 M的结合亲和性)，而对于来自第二非人哺乳动物物种的抗原的同源物的结合
亲和性比其对于人抗原的结合亲和性弱至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍。
物种依赖型抗体可以是如上定义的不同类型的抗体的任一种，但是优选地是人源化的抗体
或人抗体。
[0159] “结合亲和性”一般指在分子(例如抗体)的单个结合位点及其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，用于本文时，“结合亲和性”指反映在结合对成员(例如抗体和抗原)之间1∶1相互作用的固有结合亲和性。分子X关
于其配偶体Y的亲和性通常可以用解离常数(Kd)表示。可以通过本领域已知的常规方法，
包括在本文所述的那些测量亲和性。低亲和性抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易解离，
而高亲和性抗体通常更快地结合抗原并且倾向于更长时间地保持结合。测量结合亲和性的
多种方法是本领域已知的，其中任一种可以用于本发明的目的。下面描述具体的例示性实
施方案。
于其配偶体Y的亲和性通常可以用解离常数(Kd)表示。可以通过本领域已知的常规方法，
包括在本文所述的那些测量亲和性。低亲和性抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易解离，
而高亲和性抗体通常更快地结合抗原并且倾向于更长时间地保持结合。测量结合亲和性的
多种方法是本领域已知的，其中任一种可以用于本发明的目的。下面描述具体的例示性实
施方案。
[0160] “或更好”当用于本文时指涉及在分子及其结合配偶体之间的更强结合的结合亲和性。“或更好”当用于本文时，指由较小的数字Kd值代表的更强结合。例如，对于抗原具有“.6nM或更好”的亲和性的抗体，抗体对于抗原的亲和性是＜.6nM，即.59nM，.58nM，.57nM等或低于.6nM的任何值。
[0161] 在一个实施方案中，根据本发明的“Kd”或“Kd值”通过用目的抗体的Fab形式和其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量，如下述测定法所述，所述测定法
125
通过在存在滴定系列的未标记抗原时，用最小浓度的( I)-标记的抗原平衡Fab，接着用
抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原测量Fabs关于抗原的溶液结合亲和性(Chen，等，
(1999)分子生物学杂志(J.MolBiol) 293：865-881)。为了确定测定的条件，将微量滴定板
(Dynex)用5μg/ml的在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)包被
过夜，并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸
125
附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[ I]-抗原与目的Fab的系列稀释物混合(例如
与在Presta等，(1997)癌症研究(Cancer Res).57：4593-4599中的抗-VEGF抗体，Fab-12
的评估一致)。接着，将目 的Fab温育过夜；然而温育可以持续更长的阶段(例如65小
时)从而确保达到平衡。随后，将混合物转移到捕获板中来在室温进行温育(例如进行1小
时)。接着，去除溶液，并将所述板用在PBS中的0.1％Tween-20洗涤8次。当所述板已经
干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MicroScint-20；Packard)，并将所述板在Topcount γ
计数器(Packard)上计数10分钟。选择提供少于或等于20％的最大结合的每种Fab的浓
度用在竞争性结合测定法中。
125
通过在存在滴定系列的未标记抗原时，用最小浓度的( I)-标记的抗原平衡Fab，接着用
抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原测量Fabs关于抗原的溶液结合亲和性(Chen，等，
(1999)分子生物学杂志(J.MolBiol) 293：865-881)。为了确定测定的条件，将微量滴定板
(Dynex)用5μg/ml的在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)包被
过夜，并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸
125
附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[ I]-抗原与目的Fab的系列稀释物混合(例如
与在Presta等，(1997)癌症研究(Cancer Res).57：4593-4599中的抗-VEGF抗体，Fab-12
的评估一致)。接着，将目 的Fab温育过夜；然而温育可以持续更长的阶段(例如65小
时)从而确保达到平衡。随后，将混合物转移到捕获板中来在室温进行温育(例如进行1小
时)。接着，去除溶液，并将所述板用在PBS中的0.1％Tween-20洗涤8次。当所述板已经
干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MicroScint-20；Packard)，并将所述板在Topcount γ
计数器(Packard)上计数10分钟。选择提供少于或等于20％的最大结合的每种Fab的浓
度用在竞争性结合测定法中。
[0162] 根据另一个实施方案，通过使用表面等离振子共振测定法在25C用固定的抗原CM5芯片以～10反应单位(RU)来测量Kd或Kd值，所述表面等离振子共振测定法使用
TM TM
BIAcore -2000或BIAcore -3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore，Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二
亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)根据生产商的说明书进行活化。在以5μl/
分钟的流速注射之前，将抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释到5μg/ml(～0.2μM)从而获得
约10反应单位(RU)的偶联蛋白。在注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。关
于动力学测量，将Fab的两倍系列稀释物(0.78nM到500nM)在具有0.05％Tween20(PBST)
的PBS中，在25℃，以约25μl/min的流速进行注射。使用简单的一对一Langmuir结合模
型(BIAcore评估软件版本3.2)，通过同时拟合缔合和解离传感图来计算缔合速率(kon)和
解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon的比率。见，例如，Chen等，(1999)
分子生物学杂志(J.Mol Biol)293：865-881。如果缔合速率通过上述的表面等离振子共振
6 -1 -1
测定法超过10M S ，那么缔合速率可以通过使用荧光猝灭技术来确定，所述荧光猝灭技术
在25℃，在存在增加浓度的抗原时，测量20nM在PBS，pH 7.2中的抗-抗原抗体(Fab形式)
的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如使用分光光
度计，如滞流装备的分光光度计(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv仪器)，或
具有搅拌的比色杯的8000-系列的SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)进行测量
的。
TM TM
BIAcore -2000或BIAcore -3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore，Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二
亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)根据生产商的说明书进行活化。在以5μl/
分钟的流速注射之前，将抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释到5μg/ml(～0.2μM)从而获得
约10反应单位(RU)的偶联蛋白。在注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。关
于动力学测量，将Fab的两倍系列稀释物(0.78nM到500nM)在具有0.05％Tween20(PBST)
的PBS中，在25℃，以约25μl/min的流速进行注射。使用简单的一对一Langmuir结合模
型(BIAcore评估软件版本3.2)，通过同时拟合缔合和解离传感图来计算缔合速率(kon)和
解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon的比率。见，例如，Chen等，(1999)
分子生物学杂志(J.Mol Biol)293：865-881。如果缔合速率通过上述的表面等离振子共振
6 -1 -1
测定法超过10M S ，那么缔合速率可以通过使用荧光猝灭技术来确定，所述荧光猝灭技术
在25℃，在存在增加浓度的抗原时，测量20nM在PBS，pH 7.2中的抗-抗原抗体(Fab形式)
的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如使用分光光
度计，如滞流装备的分光光度计(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv仪器)，或
具有搅拌的比色杯的8000-系列的SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)进行测量
的。
[0163] 根据本发明所述的“缔合速率”(“on-rate”)或“缔合的速率”(“rate ofassociation”)或“缔合速率”(“association rate”)或“kon”也可以使用如上所 述的
TM TM
BIAcore -2000或BIAcore -3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)以与上述相同的表面
等离振子共振技术进行确定。
TM TM
BIAcore -2000或BIAcore -3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)以与上述相同的表面
等离振子共振技术进行确定。
[0164] 术语“基本类似”或“基本相同，”用于本文时，是指在两个数值(通常一个与本发明的抗体相关，而另一个与参照/比较抗体相关)之间的足够高程度的类似性，从而使本领域技术人员认为在通过所述值(例如，Kd值)测量的生物学特征的背景下，在两个值之间
的差异是极低的或无生物学和/或统计学意义。在所述两个值之间的差异作为参照/比较
抗体的值的函数优选地少于约50％，优选地少于约40％，优选地少于约30％，优选地少于
约20％，优选地少于约10％。
的差异是极低的或无生物学和/或统计学意义。在所述两个值之间的差异作为参照/比较
抗体的值的函数优选地少于约50％，优选地少于约40％，优选地少于约30％，优选地少于
约20％，优选地少于约10％。
[0165] 术语“基本减少”或“基本不同，”用于本文时，是指在两个数值(通常一个与本发明的抗体相关，而另一个与参照/比较抗体相关)之间的足够高程度的差异性，从而使本领域技术人员认为在通过所述值(例如，Kd值，HAMA反应)测量的生物学特征的背景下，在两
个值之间的差异是具有统计学意义的。在所述两个值之间的差异作为参照/比较抗体的值
的函数优选地大于约10％，优选地大于约20％，优选地大于约30％，优选地大于约40％，优
选地大于约50％。
个值之间的差异是具有统计学意义的。在所述两个值之间的差异作为参照/比较抗体的值
的函数优选地大于约10％，优选地大于约20％，优选地大于约30％，优选地大于约40％，优
选地大于约50％。
[0166] “抗原”是抗体可以选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、糖、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在或合成的化合物。优选地，所述靶抗原是多肽。
[0167] 用于本文目的的“接纳体人构架”是包含衍生自人免疫球蛋白构架或人共有构架的VL或VH构架的氨基酸序列的构架。接纳体人构架“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共
有构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含预先存在的氨基酸序列的变化。当存
在预先存在的氨基酸变化时，优选地存在不超过5个、和优选地4个以下，或3个以下的预
先存在的氨基酸变化。如果在VH中存在预先存在的氨基酸变化，优选地那些变化仅在位置
71H，73H和78H的三个，两个或一个位置存在；例如，在那些位置的氨基酸残基可以是71A，
73T和/或78A。在一个实施方案中，VL接纳体人构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列
或人共有构架序列相同。
有构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含预先存在的氨基酸序列的变化。当存
在预先存在的氨基酸变化时，优选地存在不超过5个、和优选地4个以下，或3个以下的预
先存在的氨基酸变化。如果在VH中存在预先存在的氨基酸变化，优选地那些变化仅在位置
71H，73H和78H的三个，两个或一个位置存在；例如，在那些位置的氨基酸残基可以是71A，
73T和/或78A。在一个实施方案中，VL接纳体人构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列
或人共有构架序列相同。
[0168] “人共有构架”是在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中代表 最常见的氨基酸残基的构架。一般地，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择物来自可变结构域序列的亚组。
一般地，序列的亚组是在Kabat等中的亚组。在一个实施方案中，关于VL，亚组是如在Kabat
等中的亚组κI。在一个实施方案中，关于VH，亚组是如在Kabat等中的亚组III。
一般地，序列的亚组是在Kabat等中的亚组。在一个实施方案中，关于VL，亚组是如在Kabat
等中的亚组κI。在一个实施方案中，关于VH，亚组是如在Kabat等中的亚组III。
[0169] “VH亚组III共有构架”包含获自在Kabat等的可变重链亚组III中的氨基酸序列的共有序列。在一个实施方案中，VH亚组III共有构架氨基酸序列包含下列序列的每个
的至少一部分或全部：
的至少一部分或全部：
[0170] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID No：14)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ IDNO：15)-H2-RFrISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO：l 6)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQID NO：
17).
17).
[0171] “VL亚组I共有构架”包含获自在Kabat等的可变轻链κ亚组I的氨基酸序列的共有序列。在一个实施方案中，VL亚组I共有构架氨基酸序列包含下列序列的每个的至少
一部分或全部：
一部分或全部：
[0172] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：43)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：44)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：45)-L3-FGQGTKVEIKR(SEQ ID
NO：46)).
NO：46)).
[0173] “未修饰的人构架”是这样的人构架，其与接纳体人构架具有相同的氨基酸序列，例如在接纳体人构架中缺少人到非人的氨基酸置换。
[0174] 用于本文目的的“改变的高变区”是在其中包含一个或多个(例如，1到约16个)氨基酸置换的高变区。
[0175] 用于本文目的的“未修饰的高变区”是这样的高变区，所述高变区与来自其中的非人抗体具有相同的氨基酸序列，即其中缺少一个或多个氨基酸置换的抗体。
[0176] “结合”目的抗原(例如肿瘤相关的多肽抗原靶标)的抗体，是这样的抗体，所述抗体以足够的亲和性结合抗原从而使所述抗体可以用作靶向表达抗原的细胞或组织的治
疗剂，并且不显著与其它蛋白交叉反应。在这样的实施方案中，抗体与“非靶标”蛋白的结
合程度低于抗体与其特定靶蛋白结合的约10％，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或
放射性免疫沉淀(RIA)所确定的。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异
性结合于”或“特异于”特定的多肽或特定多肽靶标上的表位意味着这 样的结合，其在可测量的程度上不同于非特异性相互作用。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合比较来
确定的分子的结合进行测量，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例
如，特异性结合可以通过与对照分子的竞争确定，所述对照分子类似于靶标，例如过量的未
标记的靶标。在该情形中，如果被标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性
抑制，那么指示特异性结合。术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异于”特定的多肽或特定多肽靶标上的表位用于本文时可以例如通过这样的分子显示，所述分子对靶标的
-4 -5 -6 -7
Kd为至少约10 M，备选地至少约10 M，备选地至少约10 M，备选地至少约10 M，备选地至
-8 -9 -10 -11
少约10 M，备选地至少约10 M，备选地至少约10 M，备选地至少约10 M，备选地至少约
-12
10 M，或更多。在一个实施方案中，术语“特异性结合”指这样的结合，其中分子结合特定多肽或在特定多肽上的表位，但是基本上不结合于任何其它多肽或多肽表位。
疗剂，并且不显著与其它蛋白交叉反应。在这样的实施方案中，抗体与“非靶标”蛋白的结
合程度低于抗体与其特定靶蛋白结合的约10％，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或
放射性免疫沉淀(RIA)所确定的。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异
性结合于”或“特异于”特定的多肽或特定多肽靶标上的表位意味着这 样的结合，其在可测量的程度上不同于非特异性相互作用。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合比较来
确定的分子的结合进行测量，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例
如，特异性结合可以通过与对照分子的竞争确定，所述对照分子类似于靶标，例如过量的未
标记的靶标。在该情形中，如果被标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性
抑制，那么指示特异性结合。术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异于”特定的多肽或特定多肽靶标上的表位用于本文时可以例如通过这样的分子显示，所述分子对靶标的
-4 -5 -6 -7
Kd为至少约10 M，备选地至少约10 M，备选地至少约10 M，备选地至少约10 M，备选地至
-8 -9 -10 -11
少约10 M，备选地至少约10 M，备选地至少约10 M，备选地至少约10 M，备选地至少约
-12
10 M，或更多。在一个实施方案中，术语“特异性结合”指这样的结合，其中分子结合特定多肽或在特定多肽上的表位，但是基本上不结合于任何其它多肽或多肽表位。
[0177] “抑制表达FcRH5多肽的肿瘤细胞生长”的抗体或“生长抑制”抗体是这样的抗体，其导致表达或过量表达适合的FcRH5多肽的癌细胞可测量的生长抑制。所述FcRH5多肽可以是在癌细胞表面上表达的跨膜多肽或可以是由癌细胞生产和分泌的多肽。与适合的对照
比较，优选的生长抑制抗-FcRH5抗体抑制表达FcRH5的肿瘤细胞的生长达超过20％，优选
地达约20％到约50％，并且甚至更优选地达超过50％(例如约50％到约100％)，所述对
照典型地是未被待测试的抗体处理的肿瘤细胞。在一个实施方案中，生长抑制可以在细胞
培养物中，在约0.1到30μg/ml或约0.5nM到200nM的抗体浓度进行测量，其中在肿瘤细
胞暴露于抗体后1-10天测定生长抑制。体内肿瘤细胞的生长抑制可以以如在下述的实验
实施例部分中所述的各种方法确定。如果施用约1μg/kg到约100mg/kg体重的抗-FcRH5
抗体导致在自第一次施用抗体的约5天到3个月内，优选地在约5到30天内肿瘤大小或肿
瘤细胞增殖的减少，则抗体是体内生长抑制性的。
比较，优选的生长抑制抗-FcRH5抗体抑制表达FcRH5的肿瘤细胞的生长达超过20％，优选
地达约20％到约50％，并且甚至更优选地达超过50％(例如约50％到约100％)，所述对
照典型地是未被待测试的抗体处理的肿瘤细胞。在一个实施方案中，生长抑制可以在细胞
培养物中，在约0.1到30μg/ml或约0.5nM到200nM的抗体浓度进行测量，其中在肿瘤细
胞暴露于抗体后1-10天测定生长抑制。体内肿瘤细胞的生长抑制可以以如在下述的实验
实施例部分中所述的各种方法确定。如果施用约1μg/kg到约100mg/kg体重的抗-FcRH5
抗体导致在自第一次施用抗体的约5天到3个月内，优选地在约5到30天内肿瘤大小或肿
瘤细胞增殖的减少，则抗体是体内生长抑制性的。
[0178] “诱导凋亡”的抗体是诱导程序性细胞死亡的抗体，如通过膜联蛋白V的结合、DNA的断裂、细胞收缩、内质网的膨胀、细胞破碎和/或膜小泡(称为凋亡小体)的形成确定的。
细胞通常是过量表达FcRH5多肽的细胞。 优选地，所述细胞是肿瘤细胞，例如造血细胞，如
B细胞、T细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、血小板或红细胞。可获得各种方法用于评估与凋亡相关的细胞事件。例如，磷脂酰丝氨酸(PS)易位可通过膜联
蛋白结合测量；DNA断裂可以通过DNA序列梯(laddering)评估；并且核/染色质凝聚以及
DNA断裂可以通过在亚二倍体细胞中的任何增加进行评估。优选地，诱导凋亡的抗体是导致
在膜联蛋白结合测定法中相对于未处理的细胞约2-50倍、优选地约5到50倍，最优选地约
10到50倍的膜联蛋白结合诱导。
细胞通常是过量表达FcRH5多肽的细胞。 优选地，所述细胞是肿瘤细胞，例如造血细胞，如
B细胞、T细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、血小板或红细胞。可获得各种方法用于评估与凋亡相关的细胞事件。例如，磷脂酰丝氨酸(PS)易位可通过膜联
蛋白结合测量；DNA断裂可以通过DNA序列梯(laddering)评估；并且核/染色质凝聚以及
DNA断裂可以通过在亚二倍体细胞中的任何增加进行评估。优选地，诱导凋亡的抗体是导致
在膜联蛋白结合测定法中相对于未处理的细胞约2-50倍、优选地约5到50倍，最优选地约
10到50倍的膜联蛋白结合诱导。
[0179] “诱导细胞死亡”的抗体是导致有生活力的细胞失去生活力的抗体。所述细胞是这样的细胞，其表达FcRH5多肽并且是特异性表达或过量表达FcRH5多肽的细胞类型。所述
细胞可以是癌细胞或特定细胞类型的正常细胞。FcRH5多肽可以是在癌细胞表面上表达的
跨膜多肽或可以是由癌细胞生产和分泌的多肽。所述细胞可以是癌细胞，例如B细胞或T
细胞。体外细胞死亡可以在不存在补体和免疫效应细胞的情况下确定从而区分由抗体依赖
性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。因此，关于
细胞死亡的测定法可以使用热灭活的血清(即，在不存在补体时)并在不存在免疫效应细
胞的情况下进行。为了确定抗体是否能够诱导细胞死亡，如通过碘化丙锭(PI)、锥虫蓝(见
Moore等. Cytotechnology 17：1-11(1995))或7AAD的摄取评估的膜完整性的丧失可以
相对于未处理的细胞进行评估。优选的诱导细胞死亡的抗体是在BT474细胞中在PI摄取
测定法中诱导PI摄取的那些抗体。
细胞可以是癌细胞或特定细胞类型的正常细胞。FcRH5多肽可以是在癌细胞表面上表达的
跨膜多肽或可以是由癌细胞生产和分泌的多肽。所述细胞可以是癌细胞，例如B细胞或T
细胞。体外细胞死亡可以在不存在补体和免疫效应细胞的情况下确定从而区分由抗体依赖
性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。因此，关于
细胞死亡的测定法可以使用热灭活的血清(即，在不存在补体时)并在不存在免疫效应细
胞的情况下进行。为了确定抗体是否能够诱导细胞死亡，如通过碘化丙锭(PI)、锥虫蓝(见
Moore等. Cytotechnology 17：1-11(1995))或7AAD的摄取评估的膜完整性的丧失可以
相对于未处理的细胞进行评估。优选的诱导细胞死亡的抗体是在BT474细胞中在PI摄取
测定法中诱导PI摄取的那些抗体。
[0180] 抗体“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补
体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细
胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细
胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
[0181] 术语“Fc区”在本文用于定义免疫球蛋白重链的C-端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为Fc
区自Cys226位置或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸
(依照EU编号系统的残基 447)可以例如在生产或纯化抗体的过程中去除，或者通过对编
码抗体重链的核酸进行重组改造而去除。因而，完整抗体的组合物可包括所有K447残基都
被去除的抗体群、无K447残基被去除的抗体群、以及具有有和无K447残基的抗体混合物的
抗体群。
区自Cys226位置或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸
(依照EU编号系统的残基 447)可以例如在生产或纯化抗体的过程中去除，或者通过对编
码抗体重链的核酸进行重组改造而去除。因而，完整抗体的组合物可包括所有K447残基都
被去除的抗体群、无K447残基被去除的抗体群、以及具有有和无K447残基的抗体混合物的
抗体群。
[0182] “功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性的“效应子功能”包括Clq结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下
调等。此类效应子功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合，而且可
使用如例如在本文的定义中公开的各种测定法中进行评估。
调等。此类效应子功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合，而且可
使用如例如在本文的定义中公开的各种测定法中进行评估。
[0183] “天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc
区；天然序列人IgG3Fc区；及天然序列人IgG4Fc区；及其天然存在的变体。
区；天然序列人IgG3Fc区；及天然序列人IgG4Fc区；及其天然存在的变体。
[0184] “变体Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰(优选地一个或多个氨基酸置换)而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选地，变体Fc区具有与天然序列Fc区或与母
体多肽的Fc区相比至少一处氨基酸置换，例如在天然序列Fc区中或在母体多肽的Fc区中
具有约1处至约10处氨基酸置换，优选约1处至约5处氨基酸置换。本文的变体Fc区优
选地将与天然序列Fc区和/或母体多肽的Fc区具有至少约80％同源性，和最优选地与其
具有至少约90％同源性，更优选地与其具有至少约95％同源性。
体多肽的Fc区相比至少一处氨基酸置换，例如在天然序列Fc区中或在母体多肽的Fc区中
具有约1处至约10处氨基酸置换，优选约1处至约5处氨基酸置换。本文的变体Fc区优
选地将与天然序列Fc区和/或母体多肽的Fc区具有至少约80％同源性，和最优选地与其
具有至少约90％同源性，更优选地与其具有至少约95％同源性。
[0185] “抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcRs)上的分
泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素
杀伤靶细胞的细胞毒性形式。所述抗体“武装”细胞毒性细胞并且是所述杀伤所绝对需要
的。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和
FcγRIII。Ravetch和Kinet，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)9：457-92(1991)第464页
表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测
定法，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细
胞包括外周血单核细胞(PBMC) 和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，可在体内评估目
的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等，(USA)95：652-656(1998)中所公
开的。
泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素
杀伤靶细胞的细胞毒性形式。所述抗体“武装”细胞毒性细胞并且是所述杀伤所绝对需要
的。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和
FcγRIII。Ravetch和Kinet，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)9：457-92(1991)第464页
表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测
定法，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细
胞包括外周血单核细胞(PBMC) 和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，可在体内评估目
的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等，(USA)95：652-656(1998)中所公
开的。
[0186] “Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。而且，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类
的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活
化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。
抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见
在 免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.).15：203-234(1997)中的综述M)。FcR的综
述参见Ravetch和Kinet，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)9：457-492(1991)；Carel等，
免疫方法(Immunomethods)4：25-34(1994)；及de Haas等，实验室临床医学杂志(J.Lab.
Clin.Med.)126：330-41(1995)。在本文中的术语“FcR”涵盖其它FcR，包括那些未来将会
鉴定的。术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgGs转移给胎儿(Guyer等，免疫学
杂志(J.Immunol.)117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志(J.Immunol.)24：249(1994))。
的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活
化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。
抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见
在 免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.).15：203-234(1997)中的综述M)。FcR的综
述参见Ravetch和Kinet，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)9：457-492(1991)；Carel等，
免疫方法(Immunomethods)4：25-34(1994)；及de Haas等，实验室临床医学杂志(J.Lab.
Clin.Med.)126：330-41(1995)。在本文中的术语“FcR”涵盖其它FcR，包括那些未来将会
鉴定的。术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgGs转移给胎儿(Guyer等，免疫学
杂志(J.Immunol.)117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志(J.Immunol.)24：249(1994))。
[0187] 可测定人FcRn高亲和性结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中，或者在施用了具有变体Fc区的多肽的灵
长类动物中。WO 2000/42072(Presta)记载了对FcRs的结合提高或降低的抗体变体。还可
参见例如Shields等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)9(2)：6591-6604(2001)。
长类动物中。WO 2000/42072(Presta)记载了对FcRs的结合提高或降低的抗体变体。还可
参见例如Shields等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)9(2)：6591-6604(2001)。
[0188] “人效应细胞”指表达一种或多种FcRs并行使效应子功能的白细胞。优选地，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血
单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中优
选PBMCs和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源，例如从血液中分离。
单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中优
选PBMCs和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源，例如从血液中分离。
[0189] “补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合抗体(适宜亚类的)起始 的，该抗体已结合
至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等，免
疫方法杂志(J.Immunol.Methods)202：163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基
酸序列(具有变体Fc区的多肽)及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如
美国专利号6,194,551B1和WO1999/51642中。还可参见例如Idusogie等，免疫学杂志
(J.Immunol.)164：4178-4184(2000)。
至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等，免
疫方法杂志(J.Immunol.Methods)202：163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基
酸序列(具有变体Fc区的多肽)及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如
美国专利号6,194,551B1和WO1999/51642中。还可参见例如Idusogie等，免疫学杂志
(J.Immunol.)164：4178-4184(2000)。
[0190] 术语“包含Fc区的抗体”是指包含Fc区的抗体。例如，在抗体纯化过程中或通过编码该抗体的核酸的重组改造过程中，可以去除Fc区的C-端赖氨酸(根据EU编号系统的
残基447)。因此，包含具有根据本发明所述的Fc区的抗体的组合物可以包含具有K447的
抗体，具有所有K447被去除的抗体，或具有和不具有K447残基的抗体的混合物。
残基447)。因此，包含具有根据本发明所述的Fc区的抗体的组合物可以包含具有K447的
抗体，具有所有K447被去除的抗体，或具有和不具有K447残基的抗体的混合物。
[0191] FcRH5多肽“细胞外结构域”或“ECD”指基本不含跨膜结构域和胞质结构域的FcRH5多肽的形式。一般情况下，FcRH5多肽ECD将具有少于1％的这样的跨膜结构域和/
或胞质结构域，并且优选地具有少于0.5％的所述结构域。要理解关于本发明的FcRH5多
肽鉴定的任何跨膜结构域是依据本领域中用于鉴定该类型的疏水结构域的常用标准进行
鉴定的。跨膜结构域的确切边界可以在如本文开始鉴定的结构域的任一端变化，但是变化
很可能不超过约5个氨基酸。因此，任选地，FcRH5多肽的细胞外结构域可以在跨膜结构域
/细胞外结构域边界的任一侧包含约5个以下的氨基酸，如在实施例或说明书所鉴定的，并
且本发明预期具有或不具有相关信号肽的所述多肽，和编码它们的核酸。
或胞质结构域，并且优选地具有少于0.5％的所述结构域。要理解关于本发明的FcRH5多
肽鉴定的任何跨膜结构域是依据本领域中用于鉴定该类型的疏水结构域的常用标准进行
鉴定的。跨膜结构域的确切边界可以在如本文开始鉴定的结构域的任一端变化，但是变化
很可能不超过约5个氨基酸。因此，任选地，FcRH5多肽的细胞外结构域可以在跨膜结构域
/细胞外结构域边界的任一侧包含约5个以下的氨基酸，如在实施例或说明书所鉴定的，并
且本发明预期具有或不具有相关信号肽的所述多肽，和编码它们的核酸。
[0192] 本文公开的FcRH5多肽的“信号肽”的适合的定位可以在本发明的说明书和/或附图中显示。然而，要注意信号肽的C-端边界可以在如本文开始鉴定的信号肽C-端边
界的任一侧上变化，但是变化很可能不超过约5个氨基酸，其中信号肽的C-端边界可以
依据本领域用于鉴定该类型的氨基酸序列组件的常用标准进行鉴定的(例如，Nielsen
等，Prot.Eng.10：1-6(1997) 和 von Heinje 等，Nucl.Acids.Res.( 核 酸 研 究 )14：
4683-4690(1986))。而且，在一些情形中，还要理解信号序列从分泌的多肽的切割不是完全
一致的，由此得到不只一种的分泌的种类。本发明预期这些成熟的多肽，其中信号肽在如本
文鉴定的信号肽的C-端边界的任一侧上不超过约5个氨 基酸内被切割，以及编码所述多
肽的多核苷酸。
界的任一侧上变化，但是变化很可能不超过约5个氨基酸，其中信号肽的C-端边界可以
依据本领域用于鉴定该类型的氨基酸序列组件的常用标准进行鉴定的(例如，Nielsen
等，Prot.Eng.10：1-6(1997) 和 von Heinje 等，Nucl.Acids.Res.( 核 酸 研 究 )14：
4683-4690(1986))。而且，在一些情形中，还要理解信号序列从分泌的多肽的切割不是完全
一致的，由此得到不只一种的分泌的种类。本发明预期这些成熟的多肽，其中信号肽在如本
文鉴定的信号肽的C-端边界的任一侧上不超过约5个氨 基酸内被切割，以及编码所述多
肽的多核苷酸。
[0193] ″FcRH5多肽变体″如本文定义意为这样的FcRH5多肽，优选地这样的活性FcRH5多肽，其与本文公开的全长天然序列FcRH5多肽序列，如本文公开的缺少信号肽的FcRH5多
肽序列，如本文公开的具有或不具有信号肽的FcRH5多肽的细胞外结构域或如本文公开的
全长FcRH5多肽序列的任何其它片段(如由仅代表全长FcRH5多肽的完整编码序列的一部
分的核酸编码的那些)具有至少约80％氨基酸序列同一性。所述FcRH5多肽变体包括，例
如这样的FcRH5多肽，其中在全长天然氨基酸序列的N-端或C-端添加或缺失一个或多个
氨基酸残基。在一般情况下，FcRH5多肽变体与本文公开的全长天然序列FcRH5多肽序列，
如本文公开的缺少信号肽的FcRH5多肽序列，如本文公开的具有或不具有信号肽的FcRH5
多肽的细胞外结构域或如本文公开的全长FcRH5多肽序列的任何其它具体限定的片段具
有至少约80％氨基酸序列同一性，备选地至少约81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，
88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％氨基酸序列同一性。在一般情况下，FcRH5变体多肽的长度是至少约10个氨基酸，备选地长度为至少约20，
30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，
240，250，260，270，280，290，300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，
430，440，450，460，470，480，490，500，510，520，530，540，550，560，570，580，590，600个氨基酸或更多。任选地，FcRH5变体多肽与天然FcRH5多肽序列比较具有不超过一个保守氨基
酸置换，备选地与天然FcRH5多肽序列比较具有不超过2，3，4，5，6，7，8，9，或10个保守氨基酸置换。
肽序列，如本文公开的具有或不具有信号肽的FcRH5多肽的细胞外结构域或如本文公开的
全长FcRH5多肽序列的任何其它片段(如由仅代表全长FcRH5多肽的完整编码序列的一部
分的核酸编码的那些)具有至少约80％氨基酸序列同一性。所述FcRH5多肽变体包括，例
如这样的FcRH5多肽，其中在全长天然氨基酸序列的N-端或C-端添加或缺失一个或多个
氨基酸残基。在一般情况下，FcRH5多肽变体与本文公开的全长天然序列FcRH5多肽序列，
如本文公开的缺少信号肽的FcRH5多肽序列，如本文公开的具有或不具有信号肽的FcRH5
多肽的细胞外结构域或如本文公开的全长FcRH5多肽序列的任何其它具体限定的片段具
有至少约80％氨基酸序列同一性，备选地至少约81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，
88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％氨基酸序列同一性。在一般情况下，FcRH5变体多肽的长度是至少约10个氨基酸，备选地长度为至少约20，
30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，
240，250，260，270，280，290，300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，
430，440，450，460，470，480，490，500，510，520，530，540，550，560，570，580，590，600个氨基酸或更多。任选地，FcRH5变体多肽与天然FcRH5多肽序列比较具有不超过一个保守氨基
酸置换，备选地与天然FcRH5多肽序列比较具有不超过2，3，4，5，6，7，8，9，或10个保守氨基酸置换。
[0194] 将关于肽或多肽序列，即本文鉴定的FcRH5多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”，定义为将候选序列与特定肽或多肽序列即，FcRH5多肽序列在进行序列比对(并
在必要时导入空隙以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的
部分)之后，候选序列中的氨基酸残基与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的百分
数。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公
众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技
术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何
算法。然而，为此目的，氨基酸序列同一性％值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生，其
中关于ALIGN-2程序的全部源代码在下面的表1中提供。ALIGN-2序列比较计算机程序的
作者是Genentech，Inc.，在下面的表1中显示的源代码已经随用户文档提交至美国版权局
(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559，其美国版权注册登记号为TXU510087。
公众可通过Genentech，Inc.，South San Francisco，加利福尼亚得到ALIGN-2程序，或者
可以从下面的表1中提供的源代码进行编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统，优选
在数字UNIX V4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比较参数并且不变。
在必要时导入空隙以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的
部分)之后，候选序列中的氨基酸残基与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的百分
数。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公
众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技
术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何
算法。然而，为此目的，氨基酸序列同一性％值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生，其
中关于ALIGN-2程序的全部源代码在下面的表1中提供。ALIGN-2序列比较计算机程序的
作者是Genentech，Inc.，在下面的表1中显示的源代码已经随用户文档提交至美国版权局
(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559，其美国版权注册登记号为TXU510087。
公众可通过Genentech，Inc.，South San Francisco，加利福尼亚得到ALIGN-2程序，或者
可以从下面的表1中提供的源代码进行编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统，优选
在数字UNIX V4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比较参数并且不变。
[0195] 在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者可以这样说：给
定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一
性)如下计算：
定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一
性)如下计算：
[0196] X/Y比值乘以100
[0197] 其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列
B的长度不相等时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同
一性％。
B的长度不相等时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同
一性％。
[0198] ″FcRH5变体多核苷酸″或“FcRH5变体核酸序列”意为如本文定义编码FcRH5多肽，优选地活性FcRH5多肽的核酸分子，所述核酸分子与编码下述的核苷酸序列具有至少
约80％的核酸序列同一性：如本文公开的全长天然序列FcRH5多肽序列，本文公开的缺少
信号肽的全长天然序列FcRH5多肽序列，本文公开的具有或不具有信号肽的FcRH5多肽的
细胞外结构域或本文公开的全长FcRH5多肽序列的任何其它片段(如由代表全长FcRH5多
肽的全部编码序列的仅一部分的核酸编码的那些)。在一般情况下，FcRH5变体多核苷酸与
编码下述的核酸序列具有至少约80％的核酸序列同一性，备选地至少约81％，82％，83％，
84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或
99％核酸序列同 一性：如本文公开的全长天然序列FcRH5多肽序列，如本文公开的缺少信
号肽的全长天然序列FcRH5多肽序列，如本文公开的具有或不具有信号序列的FcRH5多肽
的细胞外结构域，或如本文公开的全长FcRH5多肽序列的任何其它片段。变体不包括天然
核苷酸序列。
约80％的核酸序列同一性：如本文公开的全长天然序列FcRH5多肽序列，本文公开的缺少
信号肽的全长天然序列FcRH5多肽序列，本文公开的具有或不具有信号肽的FcRH5多肽的
细胞外结构域或本文公开的全长FcRH5多肽序列的任何其它片段(如由代表全长FcRH5多
肽的全部编码序列的仅一部分的核酸编码的那些)。在一般情况下，FcRH5变体多核苷酸与
编码下述的核酸序列具有至少约80％的核酸序列同一性，备选地至少约81％，82％，83％，
84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或
99％核酸序列同 一性：如本文公开的全长天然序列FcRH5多肽序列，如本文公开的缺少信
号肽的全长天然序列FcRH5多肽序列，如本文公开的具有或不具有信号序列的FcRH5多肽
的细胞外结构域，或如本文公开的全长FcRH5多肽序列的任何其它片段。变体不包括天然
核苷酸序列。
[0199] 一般地，FcRH5变体多核苷酸的长度为至少约5个核苷酸，备选地长度为至少约6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，
45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，
155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，
300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，430，440，450，460，470，480，
490，500，510，520，530，540，550，560，570，580，590，600，610，620，630，640，650，660，670，
680，690，700，710，720，730，740，750，760，770，780，790，800，810，820，830，840，850，860，
870，880，890，900，910，920，930，940，950，960，970，980，990，1000，1010，1020，1030，1040，
1050，1060，1070，1080，1090，1100，1110，1120，1130，1140，1150，1160，1170，1180，1190，
1200，1210，1220，1230，1240，1250，1260，1270，1280，1290，或1300个核苷酸，其中在该背景下，术语“约”意为该参照核苷酸序列长度加或减该参照长度的10％。
45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，
155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，
300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，430，440，450，460，470，480，
490，500，510，520，530，540，550，560，570，580，590，600，610，620，630，640，650，660，670，
680，690，700，710，720，730，740，750，760，770，780，790，800，810，820，830，840，850，860，
870，880，890，900，910，920，930，940，950，960，970，980，990，1000，1010，1020，1030，1040，
1050，1060，1070，1080，1090，1100，1110，1120，1130，1140，1150，1160，1170，1180，1190，
1200，1210，1220，1230，1240，1250，1260，1270，1280，1290，或1300个核苷酸，其中在该背景下，术语“约”意为该参照核苷酸序列长度加或减该参照长度的10％。
[0200] 将关于本文鉴定的编码FcRH5的核酸序列的“百分比(％)核酸序列同一性”，定义为在将候选序列与目的FcRH5核酸序列进行比对(并在必要时导入空隙)以获取最大百分
比序列同一性后，候选序列中的核苷酸与目的FcRH5核酸序列中的核苷酸相同的百分数。
可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定核酸序列同一性百分比，例如，使用公众可
得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。然而，为此目的，
核酸序列同一性％值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生，其中关于ALIGN-2程序的全
部源代码在下面的表1中提供。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，Inc.，在
下面的表1中显示的源代码已经随用户文档提交至美国版权局，Washington D.C.，20559，
其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.，South San Francisco，加利福尼亚得到ALIGN-2程序，或者可以从下面的表1中提供的源代码进行编译。ALIGN-2
程序应当为在UNIX操作系统，优选在数字 UNIX V4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序
设定了所有序列比较参数并且不变。
比序列同一性后，候选序列中的核苷酸与目的FcRH5核酸序列中的核苷酸相同的百分数。
可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定核酸序列同一性百分比，例如，使用公众可
得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。然而，为此目的，
核酸序列同一性％值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生，其中关于ALIGN-2程序的全
部源代码在下面的表1中提供。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，Inc.，在
下面的表1中显示的源代码已经随用户文档提交至美国版权局，Washington D.C.，20559，
其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.，South San Francisco，加利福尼亚得到ALIGN-2程序，或者可以从下面的表1中提供的源代码进行编译。ALIGN-2
程序应当为在UNIX操作系统，优选在数字 UNIX V4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序
设定了所有序列比较参数并且不变。
[0201] 在ALIGN-2应用于核酸序列比较的情况中，给定核酸序列C相对于、与、或针对给定核酸序列D的核酸序列同一性％(或者可以这样说：给定核酸序列C具有或含有相对于、
与或针对给定核酸序列D的某一％核酸序列同一性)如下计算：
与或针对给定核酸序列D的某一％核酸序列同一性)如下计算：
[0202] W/Z比值乘以100
[0203] 其中W是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的C和D比对中评分为相同匹配的核苷酸数，且其中Z是D中的核苷酸总数。可以理解，当核酸序列C的长度与核酸序列D的长
度不相等时，C相对于D的核酸序列同一性％将不等于D相对于C的核酸序列同一性％。除
非另外特别指出，如在紧前面的段落中所述，使用ALIGN-2计算机程序获得在本文中所用
的所有的％核酸序列同一性的值。
度不相等时，C相对于D的核酸序列同一性％将不等于D相对于C的核酸序列同一性％。除
非另外特别指出，如在紧前面的段落中所述，使用ALIGN-2计算机程序获得在本文中所用
的所有的％核酸序列同一性的值。
[0204] 在其它实施方案中，FcRH5变体多核苷酸是编码FcRH5多肽的核酸分子，其能够与编码本文公开的全长FcRH5多肽和核苷酸序列杂交(优选地在严格杂交和洗涤条件下)。
FcRH5变体多肽可以是由FcRH5变体多核苷酸编码的那些。
FcRH5变体多肽可以是由FcRH5变体多核苷酸编码的那些。
[0205] 术语“全长编码区”当关于编码FcRH5多肽的核酸使用时，指编码本发明的全长FcRH5多肽的核苷酸序列(其在附图中通常在起始密码子和终止密码子之间显示，包含起
始密码子和终止密码子)。术语“全长编码区”当关于ATCC保藏的核酸使用时指被插入到
ATCC保藏的载体中的cDNA的编码FcRH5多肽的部分(其在附图中通常在起始密码子和终
止密码子之间显示，包含起始密码子和终止密码子(起始密码子和终止密码子在图中以粗
体和下划线表示))。
始密码子和终止密码子)。术语“全长编码区”当关于ATCC保藏的核酸使用时指被插入到
ATCC保藏的载体中的cDNA的编码FcRH5多肽的部分(其在附图中通常在起始密码子和终
止密码子之间显示，包含起始密码子和终止密码子(起始密码子和终止密码子在图中以粗
体和下划线表示))。
[0206] “分离的”当用于描述本文公开的各种FcRH5多肽时，意为已经鉴定且与其天然环境的成分分离和/或从其回收的多肽。多肽的天然环境的污染性成分指将典型地会干扰其
治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实
施方案中，将多肽纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或
内部氨基酸序列的程度，或(2)通过使用考马斯蓝或优选地银染色在非还原性或还原性条
件下的SDS-PAGE，达到同质。既然所述FcRH5多肽的天然环境的至少一种成分不会存在，那
么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤
来制备。
治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实
施方案中，将多肽纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或
内部氨基酸序列的程度，或(2)通过使用考马斯蓝或优选地银染色在非还原性或还原性条
件下的SDS-PAGE，达到同质。既然所述FcRH5多肽的天然环境的至少一种成分不会存在，那
么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤
来制备。
[0207] “分离的”编码FcRH5多肽的核酸或编码其它多肽的核酸是这样的核酸分子，其被鉴定并且与至少一种污染的核酸分子分离，所述核酸分子通常在编码多肽的核酸的天然来
源中与所述至少一种污染的核酸分子缔合。分离的编码多肽的核酸分子与其天然发现存在
的形式或设置不同。因此，编码分离的多肽的核酸分子与在天然细胞中存在的编码特定多
肽的核酸分子区分开来。然而，编码分离的多肽的核酸分子包括被包含在通常表达所述多
肽的细胞中的编码多肽的核酸分子，其中，例如核酸分子在不同于天然细胞的染色体定位
中。
源中与所述至少一种污染的核酸分子缔合。分离的编码多肽的核酸分子与其天然发现存在
的形式或设置不同。因此，编码分离的多肽的核酸分子与在天然细胞中存在的编码特定多
肽的核酸分子区分开来。然而，编码分离的多肽的核酸分子包括被包含在通常表达所述多
肽的细胞中的编码多肽的核酸分子，其中，例如核酸分子在不同于天然细胞的染色体定位
中。
[0208] 术语“控制序列”指在特定的宿主生物中表达可操作连接的编码序列所需要的DNA序列。适合原核生物的控制序列例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。
已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
[0209] 当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖
体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连
接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读框
(reading phase)中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性酶切位点处
的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或接头根据常规实践使用。
体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连
接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读框
(reading phase)中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性酶切位点处
的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或接头根据常规实践使用。
[0210] 杂交反应的“严格性”可容易地由本领域技术人员确定，并且通常是凭经验根据探针长度、洗涤温度和盐浓度来计算。通常，较长的探针需要较高的温度进行适当的退火，
而较短的探针则需要较低的温度。当互补链存在于低于它们的解链温度的环境中时，杂交
通常取决于变性的DNA重退火的能力。在探针和可杂交的序列之间所需要的同源性程度
越高，可以使用的相对温度也越高。因而可以认为较高的相对温度倾向于使反应条 件更
严格，而较低的温度则使反应条件没那么严格。对于杂交反应的严格性的其它细节和解释
见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案)，
Wiley Interscience Publishers，(1995)。
而较短的探针则需要较低的温度。当互补链存在于低于它们的解链温度的环境中时，杂交
通常取决于变性的DNA重退火的能力。在探针和可杂交的序列之间所需要的同源性程度
越高，可以使用的相对温度也越高。因而可以认为较高的相对温度倾向于使反应条 件更
严格，而较低的温度则使反应条件没那么严格。对于杂交反应的严格性的其它细节和解释
见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案)，
Wiley Interscience Publishers，(1995)。
[0211] 本文定义的“严格条件”或“高的严格条件”，可以通过下述确定，即(1)利用低离子强度和高温度(例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，在
50EC)进行洗涤的那些；(2)在杂交过程中使用变性剂，如甲酰胺，例如含有0.1％牛血清
白蛋白/0.1％Ficol1/0.1％聚乙烯吡咯烷酮的50％(v/v)甲酰胺/含有750mM氯化钠，
75mM柠檬酸钠的在pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液，在42EC的那些；或(3)在采用50％甲
酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x
Denhardt’s杂交溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖的
溶液中在42EC的过夜杂交，在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中在42EC进行10分钟的洗
涤，随后在55EC进行由包含EDTA的0.1x SSC组成的10分钟高严格性洗涤。
50EC)进行洗涤的那些；(2)在杂交过程中使用变性剂，如甲酰胺，例如含有0.1％牛血清
白蛋白/0.1％Ficol1/0.1％聚乙烯吡咯烷酮的50％(v/v)甲酰胺/含有750mM氯化钠，
75mM柠檬酸钠的在pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液，在42EC的那些；或(3)在采用50％甲
酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x
Denhardt’s杂交溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖的
溶液中在42EC的过夜杂交，在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中在42EC进行10分钟的洗
涤，随后在55EC进行由包含EDTA的0.1x SSC组成的10分钟高严格性洗涤。
[0212] “中度严格的条件”可以如Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，纽约：冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，1989
所述确定，并且包括使用比上述那些严格性更低的洗涤溶液和杂交条件(例如温度，离子
强度和％SDS)。中度严格条件的实例是在包含下述的溶液中在37EC过夜温育：20％甲酰
胺，5x SSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5x Denhardt’s杂交溶
液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性的剪切鲑鱼精DNA，随后在1x SSC在约37-50EC洗涤滤
器。技术人员将认识到怎样根据需要调节温度、离子强度等以适应诸如探针长度等的因素。
所述确定，并且包括使用比上述那些严格性更低的洗涤溶液和杂交条件(例如温度，离子
强度和％SDS)。中度严格条件的实例是在包含下述的溶液中在37EC过夜温育：20％甲酰
胺，5x SSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5x Denhardt’s杂交溶
液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性的剪切鲑鱼精DNA，随后在1x SSC在约37-50EC洗涤滤
器。技术人员将认识到怎样根据需要调节温度、离子强度等以适应诸如探针长度等的因素。
[0213] 术语“表位标记的”当用于本文时指包含融合于″标记多肽″的FcRH5多肽或抗-FcRH5抗体的嵌合多肽。所述标记多肽具有足够的残基以提供针对其可以产生抗体的
表位，并且其足够短从而不干扰其所融合的多肽的活性。标记多肽优选地还是相当独特的
从而使所述抗体基本上不与其它表位交叉反应。适合的标记多肽通常具有至少6个氨基
酸残基，并且通常在约8到50个氨基酸残基之间(优选地，在约10到20个氨基酸残基之
间)。
表位，并且其足够短从而不干扰其所融合的多肽的活性。标记多肽优选地还是相当独特的
从而使所述抗体基本上不与其它表位交叉反应。适合的标记多肽通常具有至少6个氨基
酸残基，并且通常在约8到50个氨基酸残基之间(优选地，在约10到20个氨基酸残基之
间)。
[0214] 用于本文目的的“活性的”或“活性”指保持天然的或天然存在的 FcRH5的生物学活性和/或免疫活性的FcRH5多肽的形式，其中“生物学”活性指除了针对天然的或天然存
在的FcRH5具有的抗原性表位诱导产生抗体的能力之外由天然的或天然存在的FcRH5导致
的生物学功能(抑制性或刺激性的)，“免疫”活性指诱导针对天然的或天然存在的FcRH5
具有的抗原性表位产生抗体的能力。
在的FcRH5具有的抗原性表位诱导产生抗体的能力之外由天然的或天然存在的FcRH5导致
的生物学功能(抑制性或刺激性的)，“免疫”活性指诱导针对天然的或天然存在的FcRH5
具有的抗原性表位产生抗体的能力。
[0215] 术语“拮抗剂”以最广泛的含义使用，并且包括部分或完全阻断、抑制或中和天然FcRH5多肽的生物学活性的任何分子。以类似的方式，术语“激动剂”以最广泛的含义使用，并且包括模拟天然FcRH5多肽的生物学活性的任何分子。适合的激动剂或拮抗剂分子具
体地包括激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段，天然FcRH5多肽的片段或氨基酸序列变体，肽，
反义寡核苷酸，小有机分子等。用于鉴定FcRH5多肽的激动剂或拮抗剂的方法可以包括使
FcRH5多肽与候选激动剂或拮抗剂分子接触，并且测量通常与FcRH5多肽相关的一种或多
种生物学活性的可检测的变化。
体地包括激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段，天然FcRH5多肽的片段或氨基酸序列变体，肽，
反义寡核苷酸，小有机分子等。用于鉴定FcRH5多肽的激动剂或拮抗剂的方法可以包括使
FcRH5多肽与候选激动剂或拮抗剂分子接触，并且测量通常与FcRH5多肽相关的一种或多
种生物学活性的可检测的变化。
[0216] “纯化的”意为分子在样品中以包含所述分子的样品的至少95重量％或至少98重量％的浓度存在。
[0217] “分离的”核酸分子是这样的核酸分子，其与至少一种其它核酸分子分离，所述核酸分子通常(例如在其自然环境中)与所述其它核酸分子缔合。分离的核酸分子还包括包
含在通常表达所述核酸分子的细胞中的核酸分子，但是所述核酸分子在染色体外存在或位
于不同于其天然染色体定位的染色体定位。
含在通常表达所述核酸分子的细胞中的核酸分子，但是所述核酸分子在染色体外存在或位
于不同于其天然染色体定位的染色体定位。
[0218] 术语“载体”用于本文时，意欲指能够转运其已经连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒指另外的DNA区段可以连接到其中的环状双链DNA环。
另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可
以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入其中的宿主细胞(例如，具有细菌复
制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)中自主复制。其它载体(例如非附加型哺乳动
物载体)在引入宿主细胞中后，可以整合到宿主细胞的基因组中，并且由此能够与宿主的
基因组一起复制。而且，某些载体能够定向表达它们可操作地连接的基因。所述载体在本
文称为“重组表达载体”(或类似地，“重组载体”)。一般地，在重组DNA技术中应用的表达载体通常以质粒 形式存在。在本发明的说明书中，“质粒”和“载体”可以可交互地使用，因为质粒是最常用的载体形式。
另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可
以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入其中的宿主细胞(例如，具有细菌复
制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)中自主复制。其它载体(例如非附加型哺乳动
物载体)在引入宿主细胞中后，可以整合到宿主细胞的基因组中，并且由此能够与宿主的
基因组一起复制。而且，某些载体能够定向表达它们可操作地连接的基因。所述载体在本
文称为“重组表达载体”(或类似地，“重组载体”)。一般地，在重组DNA技术中应用的表达载体通常以质粒 形式存在。在本发明的说明书中，“质粒”和“载体”可以可交互地使用，因为质粒是最常用的载体形式。
[0219] ″多核苷酸″或″核酸″在本文可交互使用，指任何长度的核苷酸的聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或
它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应结合到聚合物中的任何底物。
多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和它们的类似物。如果存在，可以在
所述聚合物的装配之前或之后，对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸成分
中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，如通过与标记的缀合进行修饰。其它类型的修
饰包括，例如“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸之间的修饰如例如具有不带电荷的连接的那些(例如膦酸甲酯，磷酸三酯，亚磷酰胺(phosphoamidate)，氨基
甲酸酯等)，和具有带电连接的那些(例如，硫代磷酸酯，二硫代硫酸酯等)，包含侧结构部
分(pendant moieties)的那些，如例如蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)，具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些，包含螯合剂(例如，金属、放射性金
属、硼、氧化金属等)的那些，包含烷化剂的那些，具有修饰的连接(例如，α异头核酸等)
的那些，以及多核苷酸的未修饰形式。此外，任何通常存在于糖中的羟基基团可以被例如膦
酸酯基团(phosphonate groups)、磷酸酯基团(phosphate group)取代，被标准的保护基
保护，或被激活以制备与另外的核苷酸的另外的连接物，或可以缀合于固体或半固体支持
物。5’和3’末端OH可以被磷酸化，或被1-20个碳原子的胺或有机加帽基团结构部分取
代。还可以将其它的羟基衍生为标准的保护基。多核苷酸还可以包含核糖或脱氧核糖的
类似形式，其通常是本领域中已知的，包括例如2’-O-甲基-，2’-O-烯丙基-，2’-氟-或
2’-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构的糖如阿拉伯糖、木糖、或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物，和无碱基核苷类似物如甲基核苷。一个或多个
磷酸二酯连接可以被备选的连接基团取代。这些备选的连接基团包括，但不限于：其中磷
酸酯被P(O)S(“硫酯(thioate)”)，P(S)S(“二硫酯(dithioate)”)，(O)NR2(“酰胺化物
(amidate)”)，P(O)R，P(O)OR’，CO，或CH2(“formacetal”)取代的实施方案，其中每个R或R’独立地是H 或是任选包含醚(-O-)连接的取代或未取代的烷基(1-20C)、芳基、烯基、环
烷基、环烯基或araldyl。在多核苷酸中不是所有的连接都需要是相同的。前面的描述可应
用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应结合到聚合物中的任何底物。
多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和它们的类似物。如果存在，可以在
所述聚合物的装配之前或之后，对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸成分
中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，如通过与标记的缀合进行修饰。其它类型的修
饰包括，例如“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸之间的修饰如例如具有不带电荷的连接的那些(例如膦酸甲酯，磷酸三酯，亚磷酰胺(phosphoamidate)，氨基
甲酸酯等)，和具有带电连接的那些(例如，硫代磷酸酯，二硫代硫酸酯等)，包含侧结构部
分(pendant moieties)的那些，如例如蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)，具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些，包含螯合剂(例如，金属、放射性金
属、硼、氧化金属等)的那些，包含烷化剂的那些，具有修饰的连接(例如，α异头核酸等)
的那些，以及多核苷酸的未修饰形式。此外，任何通常存在于糖中的羟基基团可以被例如膦
酸酯基团(phosphonate groups)、磷酸酯基团(phosphate group)取代，被标准的保护基
保护，或被激活以制备与另外的核苷酸的另外的连接物，或可以缀合于固体或半固体支持
物。5’和3’末端OH可以被磷酸化，或被1-20个碳原子的胺或有机加帽基团结构部分取
代。还可以将其它的羟基衍生为标准的保护基。多核苷酸还可以包含核糖或脱氧核糖的
类似形式，其通常是本领域中已知的，包括例如2’-O-甲基-，2’-O-烯丙基-，2’-氟-或
2’-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构的糖如阿拉伯糖、木糖、或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物，和无碱基核苷类似物如甲基核苷。一个或多个
磷酸二酯连接可以被备选的连接基团取代。这些备选的连接基团包括，但不限于：其中磷
酸酯被P(O)S(“硫酯(thioate)”)，P(S)S(“二硫酯(dithioate)”)，(O)NR2(“酰胺化物
(amidate)”)，P(O)R，P(O)OR’，CO，或CH2(“formacetal”)取代的实施方案，其中每个R或R’独立地是H 或是任选包含醚(-O-)连接的取代或未取代的烷基(1-20C)、芳基、烯基、环
烷基、环烯基或araldyl。在多核苷酸中不是所有的连接都需要是相同的。前面的描述可应
用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
[0220] “寡核苷酸，”用于本文时，一般指短的、一般为单链的，一般为合成的多核苷酸，其一般，但不是必需地少于约200个核苷酸的长度。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不相互排斥。上面关于多核苷酸的描述等同地并且完全可应用于寡核苷酸。
[0221] 术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征典型地为细胞生长不受调节的生理情况。癌症的实例包括但不限于造血系统癌症或血液相关的癌症，如淋巴瘤(lymphoma)，
白血病(leukemia)，骨髓瘤(myeloma)或淋巴样恶性肿瘤(lymphoid malignancies)，
以及脾的癌症和淋巴结的癌症，以及癌瘤(carcinoma)，母细胞瘤(blastoma)和肉瘤
(sarcoma)。癌症的更具体的实例包括B-细胞相关的癌症，包括例如，高级、中级和低级
淋巴瘤(high，intermediate and low grade lymphomas)(包括B细胞淋巴瘤如，例如粘
膜相关的淋巴组织B细胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma(NHL)，套细
胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)，伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)，小淋巴细胞
性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，边缘区淋巴瘤(marginal zone lymphoma)，
弥漫型大细胞性淋巴瘤(diffuse large cell lymphoma)，滤泡型淋巴瘤(follicular
lymphoma)，和霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)和T细胞淋巴瘤(T cell lymphomas))
和白血病(包括继发性白血病(secondary leukemia)，慢性淋巴细胞性白血病(chronic
lymphocytic leukemia)(CLL)，如B细胞白血病(CD5+B淋巴细胞)，髓性白血病(myeloid
leukemia)，如急性髓性白血病(acute myeloid leukemia)，慢性髓性白血病(chronic
myeloid leukemia)，淋巴细胞白血病(lymphoid leukemia)，如急性淋巴母细胞性白血
病(acute lymphoblastic leukemias)(ALL)和脊髓发育不良(myelodysplasia))，和其
它血液学癌症和/或B细胞相关的癌症或T细胞相关的癌症。还包括另外的造血细胞的
癌症，所述造血细胞包括多形核白细胞，如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和
单核细胞、树突细胞、血小板、红细胞和自然杀伤细胞。还包括癌性B细胞增生性疾病，其
选自下述：淋巴瘤(lymphoma)，非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkins lymphoma)(NHL)，侵袭
性NHL(aggressive NHL)，复发性侵袭性NHL(relapsed aggressive NHL)，复发性惰性
NHL(relapsed indolent NHL)，难治性NHL(refractory NHL)，难治性惰性NHL(refractory
indolent NHL)，慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)，小淋
巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，白血病，多毛细胞白血病(Hairy cell
leukemia)(HCL)，急性淋巴细胞性白血病(acutelymphocytic leukemia)(ALL)，和套细
胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。B-细胞癌症的发源如下：边缘区B-细胞淋巴瘤在
边缘区中的记忆性B-细胞发源，滤泡型淋巴瘤和弥漫型大B-细胞淋巴瘤在生发中心的
浅区(light zone)的中心细胞中发源，慢性淋巴细胞性白血病和小淋巴细胞性白血病
在B1细胞(CD5+)中发源，套细胞淋巴瘤在套区中的幼稚B细胞中发源并且伯基特淋巴
瘤在生发中心的暗区中的中心胚体(centroblast)中发源。包括造血细胞的组织在本文
称为“造血细胞组织”，其包括胸腺和骨髓和外周淋巴组织，如脾、淋巴结、与粘膜相关的
淋巴组织，如消化道相关的淋巴组织、扁桃体、淋巴集结和底枝和与其它粘膜相关的淋巴
组织，例如支气管被覆(bronchial linings)。所述癌症的另外的具体实例包括鳞状细
胞癌(squamous cell cancer)，小细胞肺癌(small-cell lung cancer)，非小细胞肺癌
(non-small cell lung cancer)，肺的腺癌(adenocarcinoma of the lung)，肺的鳞状细
胞癌(squamous carcinoma of the lung)，腹膜癌(cancer of the peritoneum)，肝细胞
癌(hepatocellular cancer)，胃肠癌(gastrointestinal cancer)，胰腺癌(pancreatic
cancer)，神经胶质瘤(glioma)，宫颈癌(cervical cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，
肝癌(liver cancer)，膀胱癌(bladder cancer)，肝癌(hepatoma)，乳腺癌(breast
cancer)，结肠癌(colon cancer)，结肠直肠癌(colorectal cancer)，子宫内膜癌或子宫
癌(endometrial or uterine carcinoma)，唾液腺癌(salivary gland carcinoma)，肾癌
(kidney cancer)，肝癌(liver cancer)，前列腺癌(prostate cancer)，外阴癌(vulval
cancer)，甲状腺癌(thyroid cancer)，肝癌(hepatic carcinoma)，白血病和其它淋巴组织
增生性疾病，和各种类型的头颈癌。
白血病(leukemia)，骨髓瘤(myeloma)或淋巴样恶性肿瘤(lymphoid malignancies)，
以及脾的癌症和淋巴结的癌症，以及癌瘤(carcinoma)，母细胞瘤(blastoma)和肉瘤
(sarcoma)。癌症的更具体的实例包括B-细胞相关的癌症，包括例如，高级、中级和低级
淋巴瘤(high，intermediate and low grade lymphomas)(包括B细胞淋巴瘤如，例如粘
膜相关的淋巴组织B细胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma(NHL)，套细
胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)，伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)，小淋巴细胞
性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，边缘区淋巴瘤(marginal zone lymphoma)，
弥漫型大细胞性淋巴瘤(diffuse large cell lymphoma)，滤泡型淋巴瘤(follicular
lymphoma)，和霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)和T细胞淋巴瘤(T cell lymphomas))
和白血病(包括继发性白血病(secondary leukemia)，慢性淋巴细胞性白血病(chronic
lymphocytic leukemia)(CLL)，如B细胞白血病(CD5+B淋巴细胞)，髓性白血病(myeloid
leukemia)，如急性髓性白血病(acute myeloid leukemia)，慢性髓性白血病(chronic
myeloid leukemia)，淋巴细胞白血病(lymphoid leukemia)，如急性淋巴母细胞性白血
病(acute lymphoblastic leukemias)(ALL)和脊髓发育不良(myelodysplasia))，和其
它血液学癌症和/或B细胞相关的癌症或T细胞相关的癌症。还包括另外的造血细胞的
癌症，所述造血细胞包括多形核白细胞，如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和
单核细胞、树突细胞、血小板、红细胞和自然杀伤细胞。还包括癌性B细胞增生性疾病，其
选自下述：淋巴瘤(lymphoma)，非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkins lymphoma)(NHL)，侵袭
性NHL(aggressive NHL)，复发性侵袭性NHL(relapsed aggressive NHL)，复发性惰性
NHL(relapsed indolent NHL)，难治性NHL(refractory NHL)，难治性惰性NHL(refractory
indolent NHL)，慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)，小淋
巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，白血病，多毛细胞白血病(Hairy cell
leukemia)(HCL)，急性淋巴细胞性白血病(acutelymphocytic leukemia)(ALL)，和套细
胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。B-细胞癌症的发源如下：边缘区B-细胞淋巴瘤在
边缘区中的记忆性B-细胞发源，滤泡型淋巴瘤和弥漫型大B-细胞淋巴瘤在生发中心的
浅区(light zone)的中心细胞中发源，慢性淋巴细胞性白血病和小淋巴细胞性白血病
在B1细胞(CD5+)中发源，套细胞淋巴瘤在套区中的幼稚B细胞中发源并且伯基特淋巴
瘤在生发中心的暗区中的中心胚体(centroblast)中发源。包括造血细胞的组织在本文
称为“造血细胞组织”，其包括胸腺和骨髓和外周淋巴组织，如脾、淋巴结、与粘膜相关的
淋巴组织，如消化道相关的淋巴组织、扁桃体、淋巴集结和底枝和与其它粘膜相关的淋巴
组织，例如支气管被覆(bronchial linings)。所述癌症的另外的具体实例包括鳞状细
胞癌(squamous cell cancer)，小细胞肺癌(small-cell lung cancer)，非小细胞肺癌
(non-small cell lung cancer)，肺的腺癌(adenocarcinoma of the lung)，肺的鳞状细
胞癌(squamous carcinoma of the lung)，腹膜癌(cancer of the peritoneum)，肝细胞
癌(hepatocellular cancer)，胃肠癌(gastrointestinal cancer)，胰腺癌(pancreatic
cancer)，神经胶质瘤(glioma)，宫颈癌(cervical cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，
肝癌(liver cancer)，膀胱癌(bladder cancer)，肝癌(hepatoma)，乳腺癌(breast
cancer)，结肠癌(colon cancer)，结肠直肠癌(colorectal cancer)，子宫内膜癌或子宫
癌(endometrial or uterine carcinoma)，唾液腺癌(salivary gland carcinoma)，肾癌
(kidney cancer)，肝癌(liver cancer)，前列腺癌(prostate cancer)，外阴癌(vulval
cancer)，甲状腺癌(thyroid cancer)，肝癌(hepatic carcinoma)，白血病和其它淋巴组织
增生性疾病，和各种类型的头颈癌。
[0222] 在本文中的“B-细胞恶性肿瘤”包括非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)(NHL)；包括低级/滤泡型NHL，小淋巴细胞(SL)NHL，中级/滤 泡型NHL，中级弥漫
型NHL，高级成免疫细胞NHL，高级淋巴母细胞NHL，高级小无核裂细胞性NHL(small
non-cleaved cell NHL)，肿块性病变NHL(bulky disease NHL)，套细胞淋巴瘤(mantle
cell lymphoma)，AIDS相关的淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)，和瓦尔登斯特伦氏巨
球蛋白血症(Waldenstrom′s Macroglobulinemia)，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s
lymphoma)(NHL)，淋巴细胞为主的霍奇金氏病(lymphocyte predominant Hodgkin’s
disease(LPHD))，小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocyticlymphoma)(SLL)，慢性
淋 巴 细 胞性 白 血 病 (chronic lymphocytic lymphoma)(CLL)，惰 性 NHL(indolent
NHL)，包括复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)和利妥昔单抗-难治性惰性
NHL(rituximab-refractory indolent NHL)；白血病，包括急性淋巴母细胞性白血病
(acute lymphoblastic leukemias)(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic
leukemia)(CLL)，多毛细胞白血病(Hairy cell leukemia)，慢性成髓细胞性白血病
(chronic myeloblastic leukemia)；套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；和其它血液
学恶性肿瘤。所述恶性肿瘤可以用针对B-细胞表面标记，如FcRH5的抗体进行治疗。本文预
期通过施用针对B细胞表面标记，如FcRH5的抗体治疗这些疾病，并且包括施用本文公开的
未缀合(“裸”)抗体或与细胞毒性剂缀合的抗体。本文还预期通过组合疗法治疗这些疾病，
所述组合疗法包括本发明的抗-FcRH5抗体或抗-FcRH5抗体药物缀合物与另一种抗体或抗
体药物缀合物、另一种细胞毒性剂、辐射或同时或系列施用的其它治疗组合。在本发明的示
例性治疗方法中，本发明的抗-FcRH5抗体与抗-CD20抗体、免疫球蛋白或其CD20结合片段
一起或连续地组合施用。所述抗-CD20抗体可以是裸抗体或抗体药物缀合物。在组合疗法
的实施方案中，所述抗-FcRH5抗体是本发明的抗体并且所述抗-CD20抗体是
(利妥昔单抗)。
型NHL，高级成免疫细胞NHL，高级淋巴母细胞NHL，高级小无核裂细胞性NHL(small
non-cleaved cell NHL)，肿块性病变NHL(bulky disease NHL)，套细胞淋巴瘤(mantle
cell lymphoma)，AIDS相关的淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)，和瓦尔登斯特伦氏巨
球蛋白血症(Waldenstrom′s Macroglobulinemia)，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s
lymphoma)(NHL)，淋巴细胞为主的霍奇金氏病(lymphocyte predominant Hodgkin’s
disease(LPHD))，小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocyticlymphoma)(SLL)，慢性
淋 巴 细 胞性 白 血 病 (chronic lymphocytic lymphoma)(CLL)，惰 性 NHL(indolent
NHL)，包括复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)和利妥昔单抗-难治性惰性
NHL(rituximab-refractory indolent NHL)；白血病，包括急性淋巴母细胞性白血病
(acute lymphoblastic leukemias)(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic
leukemia)(CLL)，多毛细胞白血病(Hairy cell leukemia)，慢性成髓细胞性白血病
(chronic myeloblastic leukemia)；套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；和其它血液
学恶性肿瘤。所述恶性肿瘤可以用针对B-细胞表面标记，如FcRH5的抗体进行治疗。本文预
期通过施用针对B细胞表面标记，如FcRH5的抗体治疗这些疾病，并且包括施用本文公开的
未缀合(“裸”)抗体或与细胞毒性剂缀合的抗体。本文还预期通过组合疗法治疗这些疾病，
所述组合疗法包括本发明的抗-FcRH5抗体或抗-FcRH5抗体药物缀合物与另一种抗体或抗
体药物缀合物、另一种细胞毒性剂、辐射或同时或系列施用的其它治疗组合。在本发明的示
例性治疗方法中，本发明的抗-FcRH5抗体与抗-CD20抗体、免疫球蛋白或其CD20结合片段
一起或连续地组合施用。所述抗-CD20抗体可以是裸抗体或抗体药物缀合物。在组合疗法
的实施方案中，所述抗-FcRH5抗体是本发明的抗体并且所述抗-CD20抗体是
(利妥昔单抗)。
[0223] 用于本文时，术语“非霍奇金淋巴瘤”或“NHL”，指除了霍奇金淋巴瘤之外的淋巴系统的癌症。霍奇金淋巴瘤通常可以与非霍奇金淋巴瘤区分开，所述区分在于在霍奇
金淋巴瘤中存在里-施细胞(Reed-Sternberg cell)，而在非霍奇金淋巴瘤中缺乏所述
里-施细胞。用于本文时，由该术语涵盖的非霍奇金淋巴瘤的实例包括本领域技术人
员(例如肿瘤学专家或病理学家) 根据本领域已知的分类方案鉴定的任何淋巴瘤，所述
分类方案如Color Atlas of Clinical Hematology(第3版)，A.Victor Hoffbrand和
John E.Pettit(编辑)(Harcourt Publishers Ltd.，2000)描述的修订的欧洲-美国淋
巴瘤(REAL)分类方案(Revised European-American Lymphoma(REAL)scheme)。见，具
体地在图11.57，11.58和11.59中例举的。更具体的实例包括，但不限于，复发或难治
性NHL(relapsed or refractory NHL)，第一线低级NHL(front line low grade NHL)，
III/IV期NHL(Stage III/IV NHL)，化疗抵抗的NHL，前体B-淋巴母细胞性白血病和/
或淋巴瘤(precursor Blymphoblastic leukemia and/or lymphoma)，小淋巴细胞性淋
巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B cell chronic
lymphocytic leukemia)和/或幼淋巴细胞性白血病(prolymphocytic leukemia)和/或
小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，B细胞幼淋巴细胞性淋巴瘤(B-cell
prolymphocytic lymphoma)，免疫细胞瘤(immunocytoma)和/或淋巴质浆细胞淋巴瘤
(lymphoplasmacytic lymphoma)，淋巴质浆细胞淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)，
边缘区B细胞淋巴瘤(marginal zone B cell lymphoma)，脾边缘区淋巴瘤(marginal zone
lymphoma)，结节外边缘区-MALT淋巴瘤(extranodal marginal zone-MALT lymphoma)，
结节性边缘区淋巴瘤(nodal marginal zone lymphoma)，多毛细胞白血病(hairy cell
leukemia)，浆细胞瘤(plasmacytoma)和/或浆细胞性骨髓瘤(plasma cell myeloma)，
低级/滤泡型淋巴瘤(low grade/follicular lymphoma)，中级滤泡型NHL(intermediate
grade/follicular NHL)，套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)，滤泡中心细胞性淋
巴瘤(follicle center lymphoma)(滤泡型)，中级弥漫型NHL(intermediate grade
diffuse NHL)，弥漫型大B-细胞性淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma)，侵袭性
NHL(aggressive NHL)(包括侵袭性第一线NHL(aggressive front-line NHL)和侵袭性
复发性NHL(aggressive relapsed NHL))，在自体干细胞移植后复发的NHL或自体干细
胞移植难治的NHL，原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤(primary mediastinal large B-cell
lymphoma)，原发性渗出物淋巴瘤(primary effusion lymphoma)，高级免疫母细胞性
NHL(high grade immunoblastic NHL)，高级淋巴母细胞性NHL(high grade lymphoblastic
NHL)，高级小无核裂细胞性NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)，肿块性病变
NHL(bulky disease NHL)，伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)，前体(外周性)大颗粒
型淋巴细胞性白血病(large granular lymphocytic leukemia)，蕈样肉芽肿病(mycosis
fungoides)和/或赛塞利综合征(Sezary syndrome)，皮肤(皮的)淋巴瘤，间变性大
细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma)，血管中心性淋巴瘤(angiocentric
lymphoma)。
金淋巴瘤中存在里-施细胞(Reed-Sternberg cell)，而在非霍奇金淋巴瘤中缺乏所述
里-施细胞。用于本文时，由该术语涵盖的非霍奇金淋巴瘤的实例包括本领域技术人
员(例如肿瘤学专家或病理学家) 根据本领域已知的分类方案鉴定的任何淋巴瘤，所述
分类方案如Color Atlas of Clinical Hematology(第3版)，A.Victor Hoffbrand和
John E.Pettit(编辑)(Harcourt Publishers Ltd.，2000)描述的修订的欧洲-美国淋
巴瘤(REAL)分类方案(Revised European-American Lymphoma(REAL)scheme)。见，具
体地在图11.57，11.58和11.59中例举的。更具体的实例包括，但不限于，复发或难治
性NHL(relapsed or refractory NHL)，第一线低级NHL(front line low grade NHL)，
III/IV期NHL(Stage III/IV NHL)，化疗抵抗的NHL，前体B-淋巴母细胞性白血病和/
或淋巴瘤(precursor Blymphoblastic leukemia and/or lymphoma)，小淋巴细胞性淋
巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B cell chronic
lymphocytic leukemia)和/或幼淋巴细胞性白血病(prolymphocytic leukemia)和/或
小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，B细胞幼淋巴细胞性淋巴瘤(B-cell
prolymphocytic lymphoma)，免疫细胞瘤(immunocytoma)和/或淋巴质浆细胞淋巴瘤
(lymphoplasmacytic lymphoma)，淋巴质浆细胞淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)，
边缘区B细胞淋巴瘤(marginal zone B cell lymphoma)，脾边缘区淋巴瘤(marginal zone
lymphoma)，结节外边缘区-MALT淋巴瘤(extranodal marginal zone-MALT lymphoma)，
结节性边缘区淋巴瘤(nodal marginal zone lymphoma)，多毛细胞白血病(hairy cell
leukemia)，浆细胞瘤(plasmacytoma)和/或浆细胞性骨髓瘤(plasma cell myeloma)，
低级/滤泡型淋巴瘤(low grade/follicular lymphoma)，中级滤泡型NHL(intermediate
grade/follicular NHL)，套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)，滤泡中心细胞性淋
巴瘤(follicle center lymphoma)(滤泡型)，中级弥漫型NHL(intermediate grade
diffuse NHL)，弥漫型大B-细胞性淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma)，侵袭性
NHL(aggressive NHL)(包括侵袭性第一线NHL(aggressive front-line NHL)和侵袭性
复发性NHL(aggressive relapsed NHL))，在自体干细胞移植后复发的NHL或自体干细
胞移植难治的NHL，原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤(primary mediastinal large B-cell
lymphoma)，原发性渗出物淋巴瘤(primary effusion lymphoma)，高级免疫母细胞性
NHL(high grade immunoblastic NHL)，高级淋巴母细胞性NHL(high grade lymphoblastic
NHL)，高级小无核裂细胞性NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)，肿块性病变
NHL(bulky disease NHL)，伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)，前体(外周性)大颗粒
型淋巴细胞性白血病(large granular lymphocytic leukemia)，蕈样肉芽肿病(mycosis
fungoides)和/或赛塞利综合征(Sezary syndrome)，皮肤(皮的)淋巴瘤，间变性大
细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma)，血管中心性淋巴瘤(angiocentric
lymphoma)。
[0224] 浆细胞疾病由浆细胞克隆的不受控制的分裂或增殖导致。浆细胞形成自激活的B淋巴细胞(即B细胞)。每种B细胞产生独特的受体，其已知为B细胞受体，排列在其细胞
表面上，所述受体特异于外源物质，即抗原。当B细胞受体结合其相关抗原时，表达所述受
体的细胞被激活以重新进入细胞周期，产生其许多的克隆拷贝。所述克隆成熟为浆细胞，
其主要位于骨髓中，并且专门产生B细胞受体的拷贝，所述B细胞受体被释放到血流中作
为抗体。在浆细胞疾病中，浆细胞或母体B细胞遭受基因损伤，导致对细胞分裂和/或活
性的正常抑制物的抑制或对细胞分裂和/或活性的正常抑制物的不敏感。衍生自所述细
胞的子代浆细胞是恶性的因为它们可以不受控制的分裂和/或产生过量的相同免疫球蛋
白(抗体)。通常，产生的免疫球蛋白是不完全的或具有不正确的构象，这会导致蛋白(根
据具体的疾病也称为单克隆蛋白、M蛋白、副蛋白或淀粉状蛋白)在血清、组织或器官(尤
其是肾中)的聚集，由此导致器官功能障碍和/或衰竭。浆细胞疾病包括意义未定的单克
隆γ-球蛋白病(monoclonal gammopathies of undetermined significance)(MGUS)，
多发性骨髓瘤(multiple myeloma)(MM)，巨球蛋白血症(macroglobulinemia)，重链病
(heavy chain disease)，和系统性轻链淀粉样变性(systemic light-chain amyloidosis)
(AL)，其基于克隆的增殖性质、骨髓受侵的程度和表达的M蛋白的类型区分。另外的浆细
胞疾病是孤立性浆细胞瘤(solitary plasmacytoma)，髓外浆细胞瘤(extramedullary
plasmacytoma)，多发性孤立性浆细胞瘤(multiple solitary plasmacytomas)，浆细胞
性白血病(plasma cell leukaemia)，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s
macroglobulinaemia)，B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin lymphomas)，B-细胞
慢性淋巴细胞性白血病(B-cell chronic lymphocytic leukaemia)。尽管新的免疫疗法
如利妥昔单抗和阿仑珠单抗 (alemtuzumab)已经在一些B-细胞恶性肿瘤中提高了无病的
(disease-free)存活率和总的存活率，但并未证实所述疗法在浆细胞疾病的治疗中是有效
的，这部分是因为靶抗原、CD20和CD52各自都没有被恶性的克隆浆细胞充分表达。因此，
需要鉴定和开发对于浆细胞疾病的提高的疗法。(见美国公开的申请号20080166742和
20080317745，将其全部内容通过引用结合在本文中)。
表面上，所述受体特异于外源物质，即抗原。当B细胞受体结合其相关抗原时，表达所述受
体的细胞被激活以重新进入细胞周期，产生其许多的克隆拷贝。所述克隆成熟为浆细胞，
其主要位于骨髓中，并且专门产生B细胞受体的拷贝，所述B细胞受体被释放到血流中作
为抗体。在浆细胞疾病中，浆细胞或母体B细胞遭受基因损伤，导致对细胞分裂和/或活
性的正常抑制物的抑制或对细胞分裂和/或活性的正常抑制物的不敏感。衍生自所述细
胞的子代浆细胞是恶性的因为它们可以不受控制的分裂和/或产生过量的相同免疫球蛋
白(抗体)。通常，产生的免疫球蛋白是不完全的或具有不正确的构象，这会导致蛋白(根
据具体的疾病也称为单克隆蛋白、M蛋白、副蛋白或淀粉状蛋白)在血清、组织或器官(尤
其是肾中)的聚集，由此导致器官功能障碍和/或衰竭。浆细胞疾病包括意义未定的单克
隆γ-球蛋白病(monoclonal gammopathies of undetermined significance)(MGUS)，
多发性骨髓瘤(multiple myeloma)(MM)，巨球蛋白血症(macroglobulinemia)，重链病
(heavy chain disease)，和系统性轻链淀粉样变性(systemic light-chain amyloidosis)
(AL)，其基于克隆的增殖性质、骨髓受侵的程度和表达的M蛋白的类型区分。另外的浆细
胞疾病是孤立性浆细胞瘤(solitary plasmacytoma)，髓外浆细胞瘤(extramedullary
plasmacytoma)，多发性孤立性浆细胞瘤(multiple solitary plasmacytomas)，浆细胞
性白血病(plasma cell leukaemia)，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s
macroglobulinaemia)，B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin lymphomas)，B-细胞
慢性淋巴细胞性白血病(B-cell chronic lymphocytic leukaemia)。尽管新的免疫疗法
如利妥昔单抗和阿仑珠单抗 (alemtuzumab)已经在一些B-细胞恶性肿瘤中提高了无病的
(disease-free)存活率和总的存活率，但并未证实所述疗法在浆细胞疾病的治疗中是有效
的，这部分是因为靶抗原、CD20和CD52各自都没有被恶性的克隆浆细胞充分表达。因此，
需要鉴定和开发对于浆细胞疾病的提高的疗法。(见美国公开的申请号20080166742和
20080317745，将其全部内容通过引用结合在本文中)。
[0225] 以前已经显示了FcRH5(IRTA2)在B细胞、浆细胞和多发性骨髓瘤细胞(包括来自MM患者样品的细胞)上的表达(见美国公开的申请号20060251662，将其全部内容通过引
用结合在本文)。因此，鉴于在多发性骨髓瘤样品中的FcRH5表达模式，该分子是在哺乳动
物中用于肿瘤治疗的优良靶标，所述肿瘤包括浆细胞疾病，如在本文中所述的那些(即，多
发性骨髓瘤)和与抗体分泌相关的疾病，如变态反应或自身免疫疾病。
用结合在本文)。因此，鉴于在多发性骨髓瘤样品中的FcRH5表达模式，该分子是在哺乳动
物中用于肿瘤治疗的优良靶标，所述肿瘤包括浆细胞疾病，如在本文中所述的那些(即，多
发性骨髓瘤)和与抗体分泌相关的疾病，如变态反应或自身免疫疾病。
[0226] “病症”指任何会受益于用本发明的物质/分子或方法进行的治疗的疾病。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物易于患所讨论病症的病理状况。本文中待
治疗的病症的非限制性实例包括癌性病症如恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿
瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症；及炎性、免疫学和其它血管发生相关病症。病症还包括癌性病症如B细胞增生性病症
和/或B细胞肿瘤，例如淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，侵袭性NHL(aggressive NHL)，复
发性侵袭性NHL(relapsed aggressive NHL)，复发性惰性(relapsed indolent NHL)，难治
性NHL(refractory NHL)，难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)，慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)，小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)，白血病(leukemia)，多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)，急性淋
巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell
lymphoma)。
治疗的病症的非限制性实例包括癌性病症如恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿
瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症；及炎性、免疫学和其它血管发生相关病症。病症还包括癌性病症如B细胞增生性病症
和/或B细胞肿瘤，例如淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，侵袭性NHL(aggressive NHL)，复
发性侵袭性NHL(relapsed aggressive NHL)，复发性惰性(relapsed indolent NHL)，难治
性NHL(refractory NHL)，难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)，慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)，小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)，白血病(leukemia)，多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)，急性淋
巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell
lymphoma)。
[0227] 术语“细胞增生性疾病”和“增生性疾病”指与一定程度的异常细胞增生相关的疾病。在一个实施方案中，所述细胞增生性疾病是癌症。
[0228] ″肿瘤″，用于本文时，指所有的赘生性细胞生长和增殖(不管是恶性的还是良性的)，以及所有的癌前和癌性细胞和组织。
[0229] 在本文中“自身免疫病”是由个体本身的组织或器官导致的疾病或病症和针对个体本身的组织或器官的疾病或病症，或其共分离物(co-segregate)或其表现形式或由其
导致的病况。在许多所述自身免疫疾病和炎性疾病中，可存在许多临床和实验室标志，所述
标志包括，但不限于血丙种球蛋白过多，高水平的自体抗体，在组织中的抗原-抗体复合物
沉积物，受益于糖皮质激素或免疫抑制治疗，和在受影响的组织中的淋巴样细胞聚集物。不
限于任一种关于B-细胞介导的自身免疫病的理论，认为B细胞通过许多机理途径在人自身
免疫病中显示致病作用，所述机理途径包括自体抗体产生、免疫复合物形成、树突细胞和T
细胞激活、细胞因子合成、直接的趋化因子释放，和提供关于异位新-淋巴生成的病灶。这
些途径的每一个可以在不同的程度上参与自身免疫病的病理学。
导致的病况。在许多所述自身免疫疾病和炎性疾病中，可存在许多临床和实验室标志，所述
标志包括，但不限于血丙种球蛋白过多，高水平的自体抗体，在组织中的抗原-抗体复合物
沉积物，受益于糖皮质激素或免疫抑制治疗，和在受影响的组织中的淋巴样细胞聚集物。不
限于任一种关于B-细胞介导的自身免疫病的理论，认为B细胞通过许多机理途径在人自身
免疫病中显示致病作用，所述机理途径包括自体抗体产生、免疫复合物形成、树突细胞和T
细胞激活、细胞因子合成、直接的趋化因子释放，和提供关于异位新-淋巴生成的病灶。这
些途径的每一个可以在不同的程度上参与自身免疫病的病理学。
[0230] “自身免疫病(autoimmune disease)”可以为器官特异性疾病(即免疫应答特异性针对一种器官系统，诸如内分泌系统、造血系统、皮肤、心肺系统、胃肠和肝系
统、肾系统、甲状腺、耳、神经肌肉系统、中枢神经系统等)或可以影响多器官系统的
系统性疾病(例如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus(SLE))、类风湿
性关节炎(rheumatoid arthritis)、多肌炎(polymyositis)等)。优选的此类疾病
包括自身免疫性风湿病(autoimmune rheumatologic disorders)(如，例如，类风湿
性关节炎(rheumatoid arthritis)、舍格伦综合征( )、硬皮
病(scleroderma)、狼疮(lupus)诸如SLE 和狼疮性肾炎(lupus nephritis)、多肌
炎/皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis)、冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)、
抗磷脂抗体综合征(anti-phospholipid antibody syndrome)和银屑病关节炎
(psoriatic arthritis))、自身免疫性胃肠和肝病(autoimmune gastrointestinal
and liver disorders)(如例如炎性肠病(inflammatory bowel diseases)(例如溃
疡性结肠炎(ulcerative colitis)和局限性回肠炎(Crohn′s disease))、自身免疫
性胃炎(autoimmune gastritis)和恶性贫血(pernicious anemia)、自身免疫性肝炎
(autoimmune hepatitis)、原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)、原发性硬
化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis)和乳糜泻(celiac disease))、血管炎
(vasculitis)(如例如ANCA-阴性血管炎(ANCA-negative vasculitis)和ANCA-相关血
管炎(ANCA-associated vasculitis)，包括丘-施血管炎 (Churg-Strauss vasculitis)、
韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)和微观多血管炎(microscopic
polyangiitis))、自身免疫性神经病(autoimmune neurological disorders)(如例如
多发性硬化(multiple sclerosis)、视性眼阵挛肌阵挛综合征(opsoclonus myoclonus
syndrome)、重症肌无力(myasthenia gravis)、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)、
帕金森病(Parkinson’s disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)和自身免
疫性多神经病(autoimmune polyneuropathies))、肾病症(renal disorders)(如例如
肾小球肾炎(glomerulonephritis)、古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)
和贝格尔病(Berger’s disease))、自身免疫性皮肤病(autoimmune dermatologic
disorders)(如例如银屑病(psoriasis)、隐疹(urticaria)、荨麻疹(hives)、寻常型
天疱疮(pemphigus vulgaris)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)和皮肤红斑狼
疮(cutaneous lupus erythematosus))、血液病(hematologic disorders)(如例如血
小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic
thrombocytopenic purpura)、输血后紫癜(post-transfusion purpura)和自身免疫性
溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia))、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、葡
萄膜炎(uveitis)、自身免疫性听力病(autoimmune hearing diseases)(如例如内耳病
(inner ear disease)和听力丧失(hearing loss))、贝切特病(Behcet′s disease)、雷
诺综合征(Raynaud′s syndrome)、器官移植(organ transplant)和自身免疫性内分泌病
(autoimmune endocrine disorders)(如例如糖尿病相关自身免疫病(diabetic-related
autoimmune diseases)诸如胰岛素依赖性糖尿病(insulin-dependent diabetes
mellitus(IDDM)、艾迪生病(Addison’s disease)和自身免疫性甲状腺病(autoimmune
thyroid disease)(例如格雷夫斯病(Graves’disease)和甲状腺炎(thyroiditis))。
更优选的此类疾病包括，例如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、溃疡性结肠炎
(ulcerative colitis)、ANCA-相关血管炎(ANCA-associated vasculitis)、狼疮(lupus)、
多发性硬化(multiple sclerosis)、舍格伦综合征( )、格雷夫斯病
(Graves’disease)、IDDM、恶性贫血(pernicious anemia)、甲状腺炎(thyroiditis)和肾
小球肾炎(glomerulonephritis)。
统、肾系统、甲状腺、耳、神经肌肉系统、中枢神经系统等)或可以影响多器官系统的
系统性疾病(例如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus(SLE))、类风湿
性关节炎(rheumatoid arthritis)、多肌炎(polymyositis)等)。优选的此类疾病
包括自身免疫性风湿病(autoimmune rheumatologic disorders)(如，例如，类风湿
性关节炎(rheumatoid arthritis)、舍格伦综合征( )、硬皮
病(scleroderma)、狼疮(lupus)诸如SLE 和狼疮性肾炎(lupus nephritis)、多肌
炎/皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis)、冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)、
抗磷脂抗体综合征(anti-phospholipid antibody syndrome)和银屑病关节炎
(psoriatic arthritis))、自身免疫性胃肠和肝病(autoimmune gastrointestinal
and liver disorders)(如例如炎性肠病(inflammatory bowel diseases)(例如溃
疡性结肠炎(ulcerative colitis)和局限性回肠炎(Crohn′s disease))、自身免疫
性胃炎(autoimmune gastritis)和恶性贫血(pernicious anemia)、自身免疫性肝炎
(autoimmune hepatitis)、原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)、原发性硬
化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis)和乳糜泻(celiac disease))、血管炎
(vasculitis)(如例如ANCA-阴性血管炎(ANCA-negative vasculitis)和ANCA-相关血
管炎(ANCA-associated vasculitis)，包括丘-施血管炎 (Churg-Strauss vasculitis)、
韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)和微观多血管炎(microscopic
polyangiitis))、自身免疫性神经病(autoimmune neurological disorders)(如例如
多发性硬化(multiple sclerosis)、视性眼阵挛肌阵挛综合征(opsoclonus myoclonus
syndrome)、重症肌无力(myasthenia gravis)、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)、
帕金森病(Parkinson’s disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)和自身免
疫性多神经病(autoimmune polyneuropathies))、肾病症(renal disorders)(如例如
肾小球肾炎(glomerulonephritis)、古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)
和贝格尔病(Berger’s disease))、自身免疫性皮肤病(autoimmune dermatologic
disorders)(如例如银屑病(psoriasis)、隐疹(urticaria)、荨麻疹(hives)、寻常型
天疱疮(pemphigus vulgaris)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)和皮肤红斑狼
疮(cutaneous lupus erythematosus))、血液病(hematologic disorders)(如例如血
小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic
thrombocytopenic purpura)、输血后紫癜(post-transfusion purpura)和自身免疫性
溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia))、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、葡
萄膜炎(uveitis)、自身免疫性听力病(autoimmune hearing diseases)(如例如内耳病
(inner ear disease)和听力丧失(hearing loss))、贝切特病(Behcet′s disease)、雷
诺综合征(Raynaud′s syndrome)、器官移植(organ transplant)和自身免疫性内分泌病
(autoimmune endocrine disorders)(如例如糖尿病相关自身免疫病(diabetic-related
autoimmune diseases)诸如胰岛素依赖性糖尿病(insulin-dependent diabetes
mellitus(IDDM)、艾迪生病(Addison’s disease)和自身免疫性甲状腺病(autoimmune
thyroid disease)(例如格雷夫斯病(Graves’disease)和甲状腺炎(thyroiditis))。
更优选的此类疾病包括，例如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、溃疡性结肠炎
(ulcerative colitis)、ANCA-相关血管炎(ANCA-associated vasculitis)、狼疮(lupus)、
多发性硬化(multiple sclerosis)、舍格伦综合征( )、格雷夫斯病
(Graves’disease)、IDDM、恶性贫血(pernicious anemia)、甲状腺炎(thyroiditis)和肾
小球肾炎(glomerulonephritis)。
[0231] 本文定义的其它自身免疫病的具体实例(在一些情形中涵盖上述列举的那些)，包括，但不限于：关节炎(arthritis)(急性和慢性关节炎，类风湿 性关节炎(rheumatoid
arthritis)，包括青少年发作的类风湿性关节炎(juvenile-onset rheumatoid
arthritis)和疾病分期(stages)如类风湿性滑膜炎(rheumatoid synovitis)，痛风或痛
风性关节炎(gout or gouty arthritis)，急性免疫性关节炎(acute immunological
arthritis)，慢性炎性关节炎(chronic inflammatory arthritis)，退行性关节炎
(degenerative arthritis)，II型胶原蛋白-诱导的关节炎(type II collagen-induced
arthritis)，感染性关节炎(infectious arthritis)，莱姆关节炎(Lyme arthritis)，增生
性关节炎(proliferative arthritis)，银屑病关节炎(psoriatic arthritis)，斯蒂尔病
(Still′s disease)，脊椎关节炎(vertebral arthritis)，骨关节炎(osteoarthritis)，
慢性进展性关节炎(arthritis chronica progrediente)，畸形关节炎(arthritis
deformans)，慢性原发性多关节炎(polyarthritis chronica primaria)，反应性关节炎
(reactive arthritis)，绝经期关节炎(menopausal arthritis)，雌激素消耗关节炎
(estrogen-depletion arthritis)，和强直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)/类风湿
性脊柱炎(rheumatoid spondylitis))，自身免疫淋巴组织增生病(autoimmune
lymphoproliferative disease)， 炎 性 过 增 生 性 皮 肤 病 (inflammatory
hyperproliferative skin diseases)，银屑病(psoriasis)如斑块状银屑病(plaque
psoriasis)，滴状银屑病(gutatte psoriasis)，脓疮性银屑病(pustular psoriasis)和
指甲银屑病(psoriasis of the nails)，特应性包括特应性疾病如花粉热(hay fever)和
约伯综合征(Job′s syndrome)，皮炎(dermatitis)，其包括接触性皮炎(contact
dermatitis)，慢性接触性皮炎(chronic contact dermatitis)，剥脱性皮炎(exfoliative
dermatitis)，变应性皮炎(allergic dermatitis)，变应性接触性皮炎(allergic contact
dermatitis)，荨麻疹(hives)，疱疹性皮炎(dermatitis herpetiformis)，钱币状皮炎
(nummular dermatitis)，脂 溢性皮 炎(seborrheic dermatitis)，非 特异 性皮 炎
(non-specific dermatitis)，原发性刺激性接触性皮炎(primary irritant contact
dermatitis)和特应性皮炎(atopic dermatitis)，x-连锁的高IgM综合征(x-linked
hyper IgM syndrome)，变应性眼内炎性疾病(allergic intraocular inflammatory
diseases)，荨麻疹(urticaria)，如慢性变应性荨麻疹(chronic allergic urticaria)和
慢性特发性荨麻疹(chronic idiopathic urticaria)，其包括慢性自身免疫性荨麻疹
(chronic autoimmune urticaria)，肌炎(myositis)，多肌炎(polymyositis)/皮肌炎
(dermatomyositis)，青少年型皮 肌炎(juvenile dermatomyositis)，中毒性表皮坏死松
解症(toxic epidermal necrolysis)，硬皮病(scleroderma)(包括系统性硬皮病
(systemic scleroderma))，硬化病(sclerosis)如系统性硬化病(systemic sclerosis)，
多发性硬化病(multiple sclerosis)(MS)如脊髓-视觉(spino-optical)MS，原发性进行
性MS(primary progressive MS)(PPMS)，和复发性缓和性MS(relapsing remitting MS)
(RRMS)，进行性系统性硬化病(progressive systemic sclerosis)，动脉粥样硬化
(atherosclerosis)，动 脉 硬 化(arteriosclerosis)，多 发 性 硬 化 (sclerosis
disseminata)，共济失调硬化病(ataxic sclerosis)，视神经脊髓炎(neuromyelitis
optica)(NMO)，炎性肠病(inflammatory bowel disease)(IBD)(例如，局限性回肠炎
(Crohn′s disease)，自身免疫介导的胃肠病(autoimmune-mediated gastrointestinal
diseases)，胃肠道炎症(gastrointestinal inflammation)，结肠炎(colitis)如溃疡性
结肠炎(ulcerative colitis)，溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)，微观结肠炎
(microscopic colitis)，胶原性结肠炎(collagenous colitis)，息肉状结肠炎(colitis
polyposa)，坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis)，和透壁性结肠炎
(transmural colitis)，和自身免疫性炎性肠病(autoimmune inflammatory bowel
disease))，肠炎(bowel inflammation)，坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenosum)，结节性
红斑(erythema nodosum)，原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis)，呼
吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome)，其包括成人或急性呼吸窘迫综合征
(adult or acute respiratory distress syndrome)(ARDS)，脑膜炎(meningitis)，全部
或部分葡萄膜炎症(inflammation of all or part of the uvea)，虹膜炎(iritis)，脉
络膜炎(choroiditis)，自身免疫性血液病症(an autoimmune hematological disorder)，
移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)，血管性水肿(angioedema)如遗传性血管
性水肿(hereditary angioedema)，颅神经损伤(cranial nerve damage)诸如在脑膜炎中
的神经损伤，生殖器疱疹(herpes gestationis)，妊娠性类天疱疮(pemphigoid
gestationis)，睾丸瘙痒症(pruritis scroti)，自身免疫性早熟性卵巢衰竭(autoimmune
premature ovarian failure)，由于自身免疫病症的突发性听力丧失(sudden hearing
loss due to an autoimmune condition)，IgE-介导的疾病(IgE-mediated diseases)如
过敏反应(anaphylaxis)和变应性和特异性鼻炎(allergic and atopic rhinitis)， 脑
炎(encephalitis)如Rasmussen′s脑炎(Rasmussen′s encephalitis)和边缘叶和/
或脑干脑炎(limbic and/or brainstem encephalitis)，葡萄膜炎(uveitis)，如前葡萄
膜炎(anterior uveitis)，急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis)，肉芽肿性葡萄膜
炎(granulomatous uveitis)，非肉芽肿性葡萄膜炎(nongranulomatous uveitis)，晶状体
抗原性葡萄膜炎(phacoantigenic uveitis)，后葡萄膜炎(posterior uveitis)，或自身免
疫性葡萄糖膜炎(autoimmune uveitis)，具有和不具有肾病综合征(nephrotic syndrome)
的肾小球肾炎(glomerulonephritis)(GN)如慢性或急性肾小球肾炎(chronic or acute
glomerulonephritis)如原发性GN(primary GN)，免疫介导的GN(immune-mediated GN)，
膜 性 GN(membranous GN)(膜 性 肾 病 (membranous nephropathy))，特 发 性 膜 性
GN(idiopathic membranous GN) 或 特 发 性 膜 性 肾 病 (idiopathic membranous
nephropathy)，膜或膜性增生性GN(membrano-or membranous proliferative GN)(MPGN)，
包括I型和II型，和迅速进行性GN(rapidly progressive GN)(RPGN)，增生性肾炎
(proliferative nephritis)，自身免疫性多内分泌腺衰竭(autoimmune polyglandular
endocrine failure)，阴茎头炎(balanitis)包括浆细胞性局限性龟头炎(balanitis
circumscripta plasmacellularis)，阴茎头包皮炎(balanoposthitis)，离心性环状红斑
(erythema annulare centrifugum)，持久性色素异常性红斑(erythema dyschromicum
perstans)，多形性红斑(eythema multiform)，环形肉芽肿(granuloma annulare)，光泽苔
藓(lichen nitidus)，硬化萎缩性苔藓(lichen sclerosus et atrophicus)，慢性单纯性
苔癣(lichen simplex chronicus)，小棘苔藓(lichen spinulosus)，扁平苔藓(lichen
planus)，板层状鳞癣(lamellar ichthyosisl，表皮松解角化过度症(epidermolytic
hyperkeratosis)，恶化前的角质症(premalignant keratosis)，坏疽性脓皮病(pyoderma
gangrenosum)，过敏性病症和反应(allergic conditions and responses)，食物变态反应
(food allergies)，药物变态反应(drug allergies)，昆虫变态反应(insect allergies)，
罕见的变应性疾病如肥大细胞增生(mastocytosis)，变应性反应(allergic reaction)，湿
疹(eczema)，其包括变应性湿疹或特应性湿疹(allergic or atopic eczema)，干性湿疹
(asteatotic eczema)，汗疱湿疹(dyshidrotic eczema)，和水疱样掌跖湿疹 (vesicular
palmoplantar eczema)，哮喘如支气管哮喘(asthma bronchiale)，支气管哮喘(bronchial
asthma)和自身免疫性哮喘(auto-immune asthma)，涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病
症 (conditions involving infiltration of T cells and chronic inflammatory
responses)，在妊娠过程中针对外源抗原如胎儿A-B-O血型的免疫反应(immune reactions
against foreign antigens such as fetal A-B-O blood groups during pregancy)，慢
性肺 炎性病(chronic pulmonary inflammatory disease)，自身 免疫性 心肌 炎
(autoimmune myocarditis)，白细胞黏附不足(leukocyte adhesion deficiency)，狼疮
(lupus)，其包括狼疮性肾炎(lupus nephritis)，狼疮性脑炎(lupus cerebritis)，儿童
(pediatric)狼疮，非肾(non-renal)狼疮，肾外(extra-renal)狼疮，盘状(discoid)狼疮
和盘状红斑性狼疮(discoid lupus erythematosus)，脱发(alopecia)狼疮，SLE，如皮肤
SLE或亚急性皮肤SLE(subacute cutaneous SLE)，新生儿狼疮综合征(neonatal lupus
syndrome)(NLE)，和播散性红斑狼疮(lupus erythematosus disseminatus)，青少年发作
型(I型)糖尿病(juvenile onset(Type I)diabetes mellitus)，包括儿童IDDM，成年型
糖尿病(II型糖尿病)，自身免疫性糖尿病(autoimmune diabetes)，特发性尿崩症
(idiopathic diabetes insipidus)，糖尿病视网膜病(diabetic retinopathy)，糖尿病肾
病(diabetic nephropathy)，糖尿病性大肠炎(diabetic colitis)，糖尿病大动脉病症
(diabetic large-artery disorder)，与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超
敏 反 应(acute and delayed hypersensitivity) 相 关 的 免 疫 应 答，肺 结 核
(tuberculosis)，结节病(sarcoidosis)，肉芽肿病(granulomatosis)，其包括淋巴瘤样肉
芽肿病(lymphomatoid granulomatosis)，粒细胞缺乏(agranulocytosis)，血管炎病
(vasculitides)(包括大血管血管炎(large vessel vasculitis)如风湿性多肌痛
(polymyalgia rheumatica)和巨大细胞(高安)动脉炎(giant-cell(Takayasu’s)
arteritis)，中血 管血 管炎(medium-vessel vasculitis)如 川崎病(Kawasaki’s
disease)和结节性多发性动脉炎(polyarteritis nodosa)/结节性动脉周围炎
(periarteritis nodosa))，免疫血管炎(immunovasculitis)，CNS血管炎(vasculitis)，
皮肤血管炎(cutaneous vasculitis)，超敏性血管炎(hypersensitivity vasculitis)，坏
死性血管炎(necrotizing vasculitis)，如纤维蛋白样坏死性血管炎(fibrinoid
necrotizing vasculitis)和 全 身 性 坏 死 性 血 管 炎 (systemic necrotizing
vasculitis)，ANCA阴性血管炎(ANCA-negative vasculitis)，和ANCA-相关性血管炎
(ANCA-associated vasculitis)如丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome)(CSS)，韦格
纳 肉 芽 肿 病(Wegener ′s granulomatosis) 和 微 观 多 血 管 炎 (microscopic
polyangiitis))，颞动脉炎(temporal arteritis)，再生障碍性贫血(aplastic anemia)，
自身免疫性再生障碍性贫血(autoimmune aplastic anemia)，Coombs阳性贫血(Coombs
positive anemia)，戴-布贫血(Diamond Blackfan anemia)，溶血性贫血(hemolytic
anemia)或免疫性溶血性贫血(immune hemolytic anemia)，其包括自身免疫性溶血性贫
血(autoimmune hemolytic anemia)(AIHA)，恶 性 贫 血 (pernicious anemia(anemia
perniciosa))，艾迪生病(Addison′s disease)，单纯红细胞性贫血或发育不良(pure red
cell anemia or aplasia)(PRCA)，因子VIII缺乏(Factor VIII deficiency)，血友病
A(hemophilia A)，自身免疫性中性粒细胞减少(autoimmune neutropenia(s))，血细胞减
少症(cytopenias)如全血细胞减少(pancytopenia)，白细胞减少(leukopenia)，涉及白细
胞血细胞渗出的疾病(diseases involving leukocyte diapedesis)，CNS炎性病症(CNS
inflammatory disorders)，阿 尔 茨海 默病(Alzheimer ′s disease)，帕金 森 病
(Parkinson′s disease)，多器官损伤综合征(multiple organ injury syndrome)诸如继
发败血病(septicemia)、外伤(trauma)或出血(hemorrhage)的那些，抗原-抗体复合物介
导的疾病(antigen-antibody complex-mediated diseases)，抗肾小球基底膜病
(anti-glomerular basement membrane disease)， 抗 磷 脂 抗 体 综 合 征
(anti-phospholipid abtibody syndrome)，运动神经炎(motoneuritis)，变应性神经炎
(allergic neuritis)，Behcet′s病/综合征，卡斯尔曼综合征(Castleman’s syndrome)，
古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)，Reynaud′s综合征，舍格伦综合征
(sjogren′s syndrome)，斯-约二氏综合征(Stevens-Johnson syndrome)，类天疱疮
(pemphigoid)或天疱疮(pemphigus)如大疱性类天疱疮(pemphigoid bullous)，瘢痕性
(粘膜性)类天疱疮(cicatricial(mucous membrane)pemphigoid)，皮肤类天疱疮(skin
pemphigoid)，增生型天疱疮(pemphigus vulgaris)，副肿瘤类天疱疮(paraneoplastic
pemphigus)，落叶型天疱疮(pemphigus foliaceus)，天疱疮粘膜性类天疱疮(pemphigus
mucus-membrane pemphigoid)，和红斑性天疱疮(pemphigus erythematosus)，获得性大疱
性表皮松解症(epidermolysis bullosa acquisita)，眼睛的炎症(ocular infammation)，
优选地变应性眼睛炎症如变应性结膜炎(allergic conjunctivis)，线性IgA大疱性疾病
(linear IgA bullous disease)，自身免疫-诱导的结膜炎症(autoimmune-induced
coniunctival inflammation)，自 身 免 疫 性 多 内 分 泌 腺 病 (autoimmune
polyendocrinopathies)，莱特尔病或综合征(Reiter′s disease or syndrome)，由于自
身免疫疾病导致的热伤(thermal injury due to an autoimmune condition)，先兆子痫
(preeclampsia)，免疫复合物疾病如免疫复合物肾炎(immune complex nephritis)，抗体
介 导 的 肾 炎 (antibody-mediated nephritis)，神 经 炎 症 (neuroinflammatory
disorders)，多神经病(polyneuropathies)，慢性神经病(chronic neuropathy)诸如IgM
多神经病(IgM polyneuropathies)或IgM-介导的神经病(IgM-mediated neuropathy)，血
小板减少症(thrombocytopenia)(如例如由心肌梗死患者发展的)，其包括血栓性血小板
减 少 性 紫 癜 (thrombotic thrombocytopenic purpura)(TTP)，输 血 后 紫 癜
(post-transfusion purpura)(PTP)，肝素诱导的血小板减少症(heparin-induced
thrombocytopenia)，和自身免疫性或免疫介导的血小板减少症(autoimmune or
immune-mediated thrombocytopenia)，其包括例如，特发性血小板减少症性紫癜
(idiopathic thrombocytopenic purpura)(ITP)，其包括慢性或急性ITP(chronic or
acute ITP)，巩 膜 炎 (scleritis) 如 特 发 性 角 膜 - 巩 膜 炎 (idiopathic
cerato-scleritis)，巩膜外层炎(episcleritis)，自身免疫性睾丸和卵巢疾病
(autoimmune disease of the testis and ovary)，其包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎
(autoimmune orchitis and oophoritis)，原 发 性 甲 状腺 机 能 减 退症 (primary
hypothyroidism)，甲状旁腺功能减退症(hypoparathyroidism)，自身免疫性内分泌病
(autoimmune endocrine diseases)，包括甲状腺炎(thyroiditis)如自身免疫性甲状腺炎
(autoimmune thyroiditis)，桥本甲状腺炎(Hashimoto′s disease)，慢性甲状腺炎
(chronic thyroiditis)(桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis))，或亚急性甲状腺炎
(subacute thyroiditis)，自身免疫性甲状腺病(autoimmune thyroid disease)，特发性
甲状腺机能减退症(idiopathic hypothyroidism)，格雷夫斯病(Grave′s disease)，格
雷夫斯眼病(Grave′s eye disease)(眼病(ophthalmopathy)或 甲状腺相关的眼病
(thyroid-associated ophthalmopathy))，多腺体综合征(polyglandular syndromes)如
自身免疫性多腺体综合征(autoimmune polyglandular syndromes)，例如，I型(或多腺体
内 分 泌 综 合 征 (polyglandular endocrinopathy syndromes))，副 肿 瘤 综 合 征
(paraneoplastic syndromes)，其包括神经学副肿瘤综合征(neurologic paraneoplastic
syndromes)如兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)或伊顿-兰伯
特综 合征 (Eaton-Lambert syndrome)，僵 人综 合 征(stiff-man or stiff-person
syndrome)，脑 脊 髓 炎 (encephalomyelitis) 如 变 应 性 脑 脊 髓 炎 (allergic
encephalomyelitis)或变应性脑脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和实验性变应
性 脑 脊 髓 炎(experimental allergic encephalomyelitis)(EAE)，重 症 肌 无 力
(myasthenia gravis)如胸腺瘤相关的重症肌无力(thymoma-associated myasthenia
gravis)，小脑变性(cerebellar degeneration)，神经性肌强直(neuromyotonia)，视性眼
阵挛(opsoclonus)或视性眼阵挛肌阵挛(opsoclonus myoclonus syndrome)(OMS)，和感
觉神经病(sensory neuropathy)，多病灶运动神经病(multifocal motor neuropathy)，希
恩综合征(Sheehan′s syndrome)，自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)，慢性肝炎
(chronic hepatitis)，狼疮状肝炎(lupoid hepatitis)，巨细胞肝炎(giant cell
hepatitis)，慢性活动性肝炎(chronic active hepatitis)或自身免疫性慢性活动性肝
炎(autoimmune chronic active hepatitis)，肺炎(pneumonitis)如淋巴样间质性肺炎
(lymphoid interstitial pneumonitis)(LIP)，相对NSIP的闭塞性细支气管炎(非移植
性)(bronchiolitis obliterans(non-transplant)vs NSIP)，吉 兰 - 巴 雷 综 合 征
(Guillain-Barrésyndrome)，贝格尔病(Berger′s disease)(IgA肾病)，特发性IgA肾病
(idiopathic IgA nephropathy)，线性IgA皮肤病(linear IgA dermatosis)，急性发热性
嗜中性皮肤病(acute febrile neutrophilic dermatosis)，角质层下脓疱皮肤病
(subcorneal pustular dermatosis)，暂 时 性 棘 层 松 解 性 皮 肤 病 (transient
acantholytic dermatosis)，肝硬化(cirrhosis)如原发性胆汁性肝硬变(primary
biliary cirrhosis)和肺硬变(pneumonocirrhosis)，自身免疫性肠病综合征(autoimmune
enteropathy syndrome)，乳糜泻或腹腔病(Celiac or Coeliac disease)，口炎性腹泻
(celiac sprue)(麸质性肠病(gluten enteropathy))，难治性口炎性腹泻(refractory
sprue)，特发性口炎性腹泻 (idiopathic sprue)，冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)如
混合型冷球蛋白血症(mixed cryoglobulinemia)，肌萎缩性侧索硬化(amylotrophic
lateral sclerosis)(ALS；卢·盖里格病(Lou Gehrig′s disease))，冠状动脉病
(coronary artery disease)，自身免疫性耳病(autoimmune ear disease)如自身免疫性
内耳病(autoimmune inner ear disease)(AIED)，自身免疫性听力丧失(autoimmune
hearing loss)，多软骨炎(polychondritis)如难治性或复发的或复发性多软骨炎
(refractory or relapsed or relapsing polychondritis)，肺泡蛋白沉积症(pulmonary
alveolar proteinosis)，角膜炎(keratitis)如科根综合征(Cogan′s syndrome)/非梅
毒性间质性角膜炎(nonsyphilitic interstitial keratitis)，贝尔麻痹(Bell′s
palsy)，斯威特疾病/综合征(Sweet′s disease/syndrome)，自身免疫性红斑痤疮
(rosacea autoimmune)，带状疱疹相关的疼痛(zoster-associated pain)，淀粉样变性
(amyloidosis)，非癌性淋巴细胞增多症(a non-cancerous lymphocytosis)，原发性淋巴
细胞增多症(a primary lymphocytosis)，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症
(monoclonal B cell lymphocytosis)(例如良性单克隆丙球蛋白病(benign monoclonal
gammopathy)和意 义未定 的单 克隆γ-球 蛋白 病(monoclonal garnmopathy of
undetermined significance，MGUS)，周围神经病(peripheral neuropathy)，副肿瘤综合
征(paraneoplastic syndrome)，通道病变(channelopathies)如癫痫症(epilepsy)，偏头
痛(migraine)，心 律 不 齐 (arrhythmia)，肌 肉 病 症 (musculardisorders)，耳 聋
(deafness)，失明(blindness)，周期性瘫痪(periodic paralysis)，和CNS通道病变
(channelopathies of the CNS)，孤 独 症(autism)，炎 症 性 肌 病 (inflammatory
myopathy)，局灶性或节段性或局灶节段性肾小球硬化症(focal or segmental or focal
segmental glomerulosclerosis)(FSGS)，内分泌性眼病(endocrine ophthalmopathy)，葡
萄膜视网膜炎(uveoretinitis)，脉络膜视网膜炎(chorioretinitis)，自身免疫性肝病
(autoimmune hepatological disorder)，纤维肌痛(fibromyalgia)，多发性内分泌衰竭
(multiple endocrine failure)，施密特综合征(Schmidt′s syndrome)，肾上腺炎
(adrenalitis)，胃萎缩(gastric atrophy)，早老性痴呆(presenile dementia)，脱髓鞘疾
病(demyelinating diseases)如自身免疫性脱髓鞘疾病(autoimmune demyelinating
diseases)和慢性炎性脱髓鞘多神经病(chronic inflammatory demyelinating
polyneuropathy)，心肌梗死后综合征(Dressler′s syndrome)，斑秃(alopecia
areata)，全秃(alopecia totalis)，CREST综合征(钙质沉着(calcinosis)，雷诺现象
(Raynaud′s phenomenon)，食管活动不良(esophageal dysmotility)，指端硬化
(sclerodactyly)，和毛细管扩张(telangiectasia))，例如由抗-精子抗体导致的抗-男性
和女性自身免疫性不育(male and female autoimmune infertility)，混合的结缔组织病
(mixed connective tissue disease)，恰加斯病(Chagas′disease)，风湿热(rheumatic
fever)，复发性流产(recurrentabortion)，农民肺(farmer′s lung)，多形性红斑
(erythema multiforme)，心脏切开后综合(post-cardiotomy syndrome)，库欣综合征
(Cushing′s syndrome)，鸟爱好者肺(bird-fancier′s lung)，变应性肉芽肿性血管炎
(allergic granulomatous angiitis)，良性淋巴细胞血管炎(benign lymphocytic
angiitis)，奥尔波特综合征(Alport′s syndrome)，肺泡炎(alveolitis)如变应性肺泡
炎(allergic alveolitis)和纤维化肺泡炎(fibrosing alveolitis)，间质性肺病
(interstitial lung disease)，输血反应(transfusion reaction)，麻疯病(leprosy)，疟
疾(malaria)，寄 生 虫 病(parasitic diseases) 如 利 什 曼 病(leishmaniasis)，
kypanosomiasis，血吸 虫病(schistosomiasis)，蛔虫 病(ascariasis)，曲 霉菌 病
(aspergillosis)，Sampter′s综合征(Sampter′s syndrome)，卡布兰综合征(Caplan′s
syndrome)，登革热(dengue)，心内膜炎(endocarditis)，心内膜心肌纤维化症
(endomyocardial fibrosis)，弥散性间质性肺纤维化(diffuse interstitial pulmonary
fibrosis)，间质性肺纤维化(interstitial lung fibrosis)，纤维性纵隔炎(fibrosing
mediastinitis)，肺纤维化(pulmonary fibrosis)，特发性肺纤维化(idiopathic
pulmonary fibrosis)，囊性纤维化(cystic fibrosis)，眼内炎(endophthalmitis)，持久
性 隆 起 性 红 斑 (erythema elevatum et diutinum)，胎 儿 成 红 细 胞 增 多 症
(erythroblastosis fetalis)，嗜酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)，舒尔曼综合征
(Shulman′s syndrome)，费尔蒂综合征(Felty′s syndrome)，丝虫病(flariasis)，睫状
体炎(cyclitis)如慢性睫状体炎(chronic cyclitis)，异色性睫状体炎(heterochronic
cyclitis)，虹膜睫状体炎(iridocyclitis)(急性或慢性)，或富克斯睫状体炎(Fuch′s
cyclitis)，亨诺赫-舍恩莱茵紫癜(Henoch-Schonlein purpura)，人免疫缺陷病毒(HIV)
感染(immunodeficiency virus(HIV)infection)，SCID，获 得性免 疫缺 陷综合 征
(acquired immune deficiency syndrome)(AIDS)，艾 柯 病 毒 感 染 (echovirus
infection)，脓毒症(sepsis)(系统炎性反应综合征(systemic inflammatory response
syndrome)(SIRS))，内毒素血症(endotoxemia)，胰腺炎(pancreatitis)，甲状腺毒症
(thyroxicosis)，细小病毒感染(parvovirus infection)，风疹病毒感染(rubella virus
infection)，接种后综合征(post-vaccination syndromes)，先天性风疹感染(congenital
rubella infection)，埃巴病毒感染(Epstein-Barr virus infection)，流行性腮腺炎
(mumps)，埃文斯综合征(Evan′s syndrome)，自身免疫性性腺衰竭(autoimmune gonadal
failure)，小舞蹈病(Sydenham′s chorea)，链球菌感染后肾炎(post-streptococcal
nephritis)，血 栓 闭 塞 性 脉 管 炎 (thromboangitis ubiterans)，甲 状 腺 毒 症
(thyrotoxicosis)，脊髓痨(tabes dorsalis)，脉络膜炎(chorioiditis)，巨细胞多肌痛
(giant cell polymyalgia)，慢 性 过 敏 性 肺 炎 (chronic hypersensitivity
pneumonitis)，结膜炎(conjunctivitis)，如春季结膜炎(vernal catarrh)，干燥性角结膜
炎 (keratoconjunctivitis sicca)， 和 流 行 性 角 结 膜 炎 (epidemic
keratoconjunctivitis)，特发性肾病综合征(idiopathic nephritic syndrome)，微小病
变肾病(minimal change nephropathy)，良性家族性和缺血再灌损伤(benign familial
and ischemia-reperfusion injury)，移 植 器 官 再 灌 注 (transplant organ
reperfusion)，视网 膜 自 身 免 疫 性(retinal autoimmunity)，关 节炎 症 (joint
inflammation)，支气管炎(bronchitis)，慢性闭塞性呼吸道/肺病(chronic obstructive
airway/pulmonary disease)，硅肺(silicosis)，口疮(aphthae)，口疮性口炎(aphthous
stomatitis)，动脉硬化病(arteriosclerotic disorders)(脑血管功能不全(cerebral
vascular insufficiency))如动脉硬化性脑病(arteriosclerotic encephalopathy)和动
脉硬化性视网膜病(arteriosclerotic retinopathy)，aspermiogenese，自身免疫性溶血
(autoimmune hemolysis)，结 节 病 (Boeck ′ s disease)，冷 球 蛋 白 血 症
(cryoglobulinemia)，迪皮特朗挛缩(Dupuytren′s contracture)，眼内炎phacoanaphy
lactica(endophthalmia phacoanaphylactica)，过敏性肠炎(enteritis allergica)，麻
风结节性红斑(erythema nodosum leprosum)，自发性面神经麻痹(idiopathic facial
paralysis)，慢 性 疲 劳 综 合 征(chronic fatigue syndrome)，风 湿 热(febris
rheumatica)，哈 -里 综合 征(Hamman-Rich ′s disease)，感 觉 神经 听 力 丧失
(sensoneural hearing loss)， 血 红 蛋 白 尿 paroxysmatica(haemoglobinuria
paroxysmatica)，性腺机能减退(hypogonadism)，地域性回肠炎(ileitis regionalis)，白
细胞减少症(leucopenia)，传染性单核细胞增多症(mononucleosis infectiosa)，横断性
脊髓炎(traverse myelitis)，原发性特发性粘液性水肿(primary idiopathic
myxedema)，肾病(nephrosis)，眼炎symphatica(ophthalmia symphatica)(交感性眼炎
(sympathetic ophthalmitis))，新生儿眼炎(neonatal ophthalmitis)，视神经炎(optic
neuritis)，肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa)，胰腺炎(pancreatitis)，急性多
神经根炎(polyradiculitis acuta)，坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenosum)，凯文甲状腺
炎(Quervain′s thyreoiditis)，获得性spenic萎缩(acquired spenic atrophy)，非恶
性胸腺瘤(non-malignant thymoma)，淋巴滤泡型胸腺炎(lymphofollicular thymitis)，
白斑(vitiligo)，中毒性休克综合征(toxic-shock syndrome)，食物中毒(food
poisoning)，涉及T细胞浸润的病症(conditions involving infiltration of T cells)，
白细胞粘附缺陷(leukocyte-adhesion deficiency)，与由细胞因子和T-淋巴细胞介导的
急性和迟发型超敏反应(acute and delayed hypersensitivity)相关的免疫应答，涉及
白细胞血细胞渗出的疾病(diseases involving leukocyte diapedesis)，多器官损伤综
合征(multiple organ injury syndrome)，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底
膜病(antiglomerular basement membrane disease)，自身免疫性多内分泌腺疾病
(autoimmune polyendocrinopathies)，卵巢炎(oophoritis)，原发性黏液性水肿(primary
myxedema)，自身免疫性萎缩性胃炎(autoimmune atrophic gastritis)，风湿性疾病
(rheumatic diseases)，混合性结缔组织病(mixed connective tissue disease)，肾病综
合征(nephrotic syndrome)，胰岛炎(insulitis)，多内分泌腺衰竭(polyendocrine
failure)，自身免疫性多腺体综合征(autoimmune polyglandular syndromes)，其包括I
型多内分泌腺综合征(polyglandular syndrome type I)，成人型特发性甲状旁腺功能减
退(adult-onset idiopathic hypoparathyroidism)(AOIH)，心肌病(cardiomyopathy)如
扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy)，获得性大疱性表皮松解症(epidermolisis
bullosa acquisita)(EBA)，血色素沉着病(hemochromatosis)，心肌炎(myocarditis)，肾
病综合征(nephrotic syndrome)， 原发性硬化性胆 管炎(primary sclerosing
cholangitis)，化脓性或非化脓性窦炎(purulent or nonpurulent sinusitis)，急性或慢
性窦炎(acute or chronic sinusitis)，筛窦、额窦、上颌窦或蝶窦的窦炎(ethmoid，
frontal，maxillary，or sphenoid sinusitis)，变应性窦炎(allergic sinusitis)，嗜酸
性粒细胞相关的疾病(eosinophil-related disorder)如嗜酸性细 胞增多症
(eosinophilia)，肺嗜酸细胞增多性浸润(pulmonary infiltration eosinophilia)，嗜酸
性细胞增多性肌痛综合征(eosinophilia-myalgia syndrome)，Loffler′s综合征，慢性
嗜酸细胞性肺炎(chronic eosinophilic pneumonia)，热带性肺嗜酸细胞浸润症
(tropical pulmonary eosinophilia)，支 气 管 肺 曲 霉 病 (bronchopneumonic
aspergillosis)，曲霉肿(aspergilloma)，或含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿(granulomas
containing eosinophils)，过 敏 性 反 应 (anaphylaxis)， 脊 椎 关 节 病
(spondyloarthropathie)，血清阴性脊椎关节炎(seronegative spondyloarthritides)，
多内分泌自身免疫病(polyendocrine autoimmune disease)，硬化性胆管炎(sclerosing
cholangitis)，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤念珠菌病(sclera，episclera，chronic
mucocutaneous candidiasis)，Bruton′s综合征，婴儿一过性低丙种球蛋白血症
(transient hypogammaglobulinemia of infancy)，Wiskott-Aldrich综合征，运动失调性
毛细血管扩张综合征(ataxia telangiectasia syndrome)，血管扩张(angiectasis)，与
胶原病相关的自身免疫病症(autoimmune disorders associated with collagen
disease)，风湿病(rheumatism)如慢性关节风湿病(chronic arthrorheumatism)，淋巴结
炎(lymphadenitis)，血压反应减少(reduction in blood pressure response)，血管功能
障碍(vascular dysfunction)，组织损伤(tissue injury)，心血管缺血(cardiovascular
ischemia)，痛觉过敏(hyperalgesia)，肾缺血(renal ischemia)，脑缺血(cerebral
ischemia)，和伴有血管生成的疾病(disease accompanying vascularization)，变应性超
敏 感 性 病 症 (allergic hypersensitivity disorders)， 肾 小 球 肾 炎
(glomerulonephritides)，再灌注损伤(reperfusion injury)，缺血-再灌病症(ischemic
re-perfusion disorder)，心肌或其它组织的再灌注损伤(reperfusion injury of
myocardial or other tissues)，淋 巴 瘤 性 气 管 支 气 管 炎 (lymphomatous
tracheobronchitis)，炎性皮肤病(inflammatory dermatoses)，具有急性炎症成分的皮肤
病(dermatoses with acute inflammatory components)，多器官功能衰竭(multiple
organ failure)，大疱性疾病(bullous diseases)，肾脏皮质坏死(renal cortical
necrosis)，急性化脓性脑膜炎(acute purulent meningitis)或其它中枢神经系统炎性
病症(other central nervous system inflammatory disorders)，眼和眼窝炎性病症
(ocular and orbital inflammatory disorders)，粒 细 胞 输 血 相 关 的 综 合 征
(granulocyte transfusion-associated syndromes)，细 胞 因 子 诱 导 的 毒 性
(cytokine-induced toxicity)，发作性睡病(narcolepsy)，急性严重炎症(acute serious
inflammation)，慢性 顽固性炎 症(chronic intractable inflammation)，肾盂 炎
(pyelitis)，动脉内增生(endarterial hyperplasia)，消化性溃疡(peptic ulcer)，瓣膜
炎(valvulitis)，和子宫内膜异位症((endometriosis)。本文预期通过施用与B细胞表面
标志如FcRH5结合的抗体来治疗这些疾病，并且包括施用本文公开的未缀合(“裸”)抗体
或与细胞毒性剂缀合的抗体。本文还预期通过组合疗法治疗这些疾病，所述组合疗法包括
同时或连续施用的本发明的抗-FcRH5抗体或抗-FcRH5抗体药物缀合物与另一种抗体或抗
体药物缀合物、另一种细胞毒性剂、辐射或其它治疗。
arthritis)，包括青少年发作的类风湿性关节炎(juvenile-onset rheumatoid
arthritis)和疾病分期(stages)如类风湿性滑膜炎(rheumatoid synovitis)，痛风或痛
风性关节炎(gout or gouty arthritis)，急性免疫性关节炎(acute immunological
arthritis)，慢性炎性关节炎(chronic inflammatory arthritis)，退行性关节炎
(degenerative arthritis)，II型胶原蛋白-诱导的关节炎(type II collagen-induced
arthritis)，感染性关节炎(infectious arthritis)，莱姆关节炎(Lyme arthritis)，增生
性关节炎(proliferative arthritis)，银屑病关节炎(psoriatic arthritis)，斯蒂尔病
(Still′s disease)，脊椎关节炎(vertebral arthritis)，骨关节炎(osteoarthritis)，
慢性进展性关节炎(arthritis chronica progrediente)，畸形关节炎(arthritis
deformans)，慢性原发性多关节炎(polyarthritis chronica primaria)，反应性关节炎
(reactive arthritis)，绝经期关节炎(menopausal arthritis)，雌激素消耗关节炎
(estrogen-depletion arthritis)，和强直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)/类风湿
性脊柱炎(rheumatoid spondylitis))，自身免疫淋巴组织增生病(autoimmune
lymphoproliferative disease)， 炎 性 过 增 生 性 皮 肤 病 (inflammatory
hyperproliferative skin diseases)，银屑病(psoriasis)如斑块状银屑病(plaque
psoriasis)，滴状银屑病(gutatte psoriasis)，脓疮性银屑病(pustular psoriasis)和
指甲银屑病(psoriasis of the nails)，特应性包括特应性疾病如花粉热(hay fever)和
约伯综合征(Job′s syndrome)，皮炎(dermatitis)，其包括接触性皮炎(contact
dermatitis)，慢性接触性皮炎(chronic contact dermatitis)，剥脱性皮炎(exfoliative
dermatitis)，变应性皮炎(allergic dermatitis)，变应性接触性皮炎(allergic contact
dermatitis)，荨麻疹(hives)，疱疹性皮炎(dermatitis herpetiformis)，钱币状皮炎
(nummular dermatitis)，脂 溢性皮 炎(seborrheic dermatitis)，非 特异 性皮 炎
(non-specific dermatitis)，原发性刺激性接触性皮炎(primary irritant contact
dermatitis)和特应性皮炎(atopic dermatitis)，x-连锁的高IgM综合征(x-linked
hyper IgM syndrome)，变应性眼内炎性疾病(allergic intraocular inflammatory
diseases)，荨麻疹(urticaria)，如慢性变应性荨麻疹(chronic allergic urticaria)和
慢性特发性荨麻疹(chronic idiopathic urticaria)，其包括慢性自身免疫性荨麻疹
(chronic autoimmune urticaria)，肌炎(myositis)，多肌炎(polymyositis)/皮肌炎
(dermatomyositis)，青少年型皮 肌炎(juvenile dermatomyositis)，中毒性表皮坏死松
解症(toxic epidermal necrolysis)，硬皮病(scleroderma)(包括系统性硬皮病
(systemic scleroderma))，硬化病(sclerosis)如系统性硬化病(systemic sclerosis)，
多发性硬化病(multiple sclerosis)(MS)如脊髓-视觉(spino-optical)MS，原发性进行
性MS(primary progressive MS)(PPMS)，和复发性缓和性MS(relapsing remitting MS)
(RRMS)，进行性系统性硬化病(progressive systemic sclerosis)，动脉粥样硬化
(atherosclerosis)，动 脉 硬 化(arteriosclerosis)，多 发 性 硬 化 (sclerosis
disseminata)，共济失调硬化病(ataxic sclerosis)，视神经脊髓炎(neuromyelitis
optica)(NMO)，炎性肠病(inflammatory bowel disease)(IBD)(例如，局限性回肠炎
(Crohn′s disease)，自身免疫介导的胃肠病(autoimmune-mediated gastrointestinal
diseases)，胃肠道炎症(gastrointestinal inflammation)，结肠炎(colitis)如溃疡性
结肠炎(ulcerative colitis)，溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)，微观结肠炎
(microscopic colitis)，胶原性结肠炎(collagenous colitis)，息肉状结肠炎(colitis
polyposa)，坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis)，和透壁性结肠炎
(transmural colitis)，和自身免疫性炎性肠病(autoimmune inflammatory bowel
disease))，肠炎(bowel inflammation)，坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenosum)，结节性
红斑(erythema nodosum)，原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis)，呼
吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome)，其包括成人或急性呼吸窘迫综合征
(adult or acute respiratory distress syndrome)(ARDS)，脑膜炎(meningitis)，全部
或部分葡萄膜炎症(inflammation of all or part of the uvea)，虹膜炎(iritis)，脉
络膜炎(choroiditis)，自身免疫性血液病症(an autoimmune hematological disorder)，
移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)，血管性水肿(angioedema)如遗传性血管
性水肿(hereditary angioedema)，颅神经损伤(cranial nerve damage)诸如在脑膜炎中
的神经损伤，生殖器疱疹(herpes gestationis)，妊娠性类天疱疮(pemphigoid
gestationis)，睾丸瘙痒症(pruritis scroti)，自身免疫性早熟性卵巢衰竭(autoimmune
premature ovarian failure)，由于自身免疫病症的突发性听力丧失(sudden hearing
loss due to an autoimmune condition)，IgE-介导的疾病(IgE-mediated diseases)如
过敏反应(anaphylaxis)和变应性和特异性鼻炎(allergic and atopic rhinitis)， 脑
炎(encephalitis)如Rasmussen′s脑炎(Rasmussen′s encephalitis)和边缘叶和/
或脑干脑炎(limbic and/or brainstem encephalitis)，葡萄膜炎(uveitis)，如前葡萄
膜炎(anterior uveitis)，急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis)，肉芽肿性葡萄膜
炎(granulomatous uveitis)，非肉芽肿性葡萄膜炎(nongranulomatous uveitis)，晶状体
抗原性葡萄膜炎(phacoantigenic uveitis)，后葡萄膜炎(posterior uveitis)，或自身免
疫性葡萄糖膜炎(autoimmune uveitis)，具有和不具有肾病综合征(nephrotic syndrome)
的肾小球肾炎(glomerulonephritis)(GN)如慢性或急性肾小球肾炎(chronic or acute
glomerulonephritis)如原发性GN(primary GN)，免疫介导的GN(immune-mediated GN)，
膜 性 GN(membranous GN)(膜 性 肾 病 (membranous nephropathy))，特 发 性 膜 性
GN(idiopathic membranous GN) 或 特 发 性 膜 性 肾 病 (idiopathic membranous
nephropathy)，膜或膜性增生性GN(membrano-or membranous proliferative GN)(MPGN)，
包括I型和II型，和迅速进行性GN(rapidly progressive GN)(RPGN)，增生性肾炎
(proliferative nephritis)，自身免疫性多内分泌腺衰竭(autoimmune polyglandular
endocrine failure)，阴茎头炎(balanitis)包括浆细胞性局限性龟头炎(balanitis
circumscripta plasmacellularis)，阴茎头包皮炎(balanoposthitis)，离心性环状红斑
(erythema annulare centrifugum)，持久性色素异常性红斑(erythema dyschromicum
perstans)，多形性红斑(eythema multiform)，环形肉芽肿(granuloma annulare)，光泽苔
藓(lichen nitidus)，硬化萎缩性苔藓(lichen sclerosus et atrophicus)，慢性单纯性
苔癣(lichen simplex chronicus)，小棘苔藓(lichen spinulosus)，扁平苔藓(lichen
planus)，板层状鳞癣(lamellar ichthyosisl，表皮松解角化过度症(epidermolytic
hyperkeratosis)，恶化前的角质症(premalignant keratosis)，坏疽性脓皮病(pyoderma
gangrenosum)，过敏性病症和反应(allergic conditions and responses)，食物变态反应
(food allergies)，药物变态反应(drug allergies)，昆虫变态反应(insect allergies)，
罕见的变应性疾病如肥大细胞增生(mastocytosis)，变应性反应(allergic reaction)，湿
疹(eczema)，其包括变应性湿疹或特应性湿疹(allergic or atopic eczema)，干性湿疹
(asteatotic eczema)，汗疱湿疹(dyshidrotic eczema)，和水疱样掌跖湿疹 (vesicular
palmoplantar eczema)，哮喘如支气管哮喘(asthma bronchiale)，支气管哮喘(bronchial
asthma)和自身免疫性哮喘(auto-immune asthma)，涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病
症 (conditions involving infiltration of T cells and chronic inflammatory
responses)，在妊娠过程中针对外源抗原如胎儿A-B-O血型的免疫反应(immune reactions
against foreign antigens such as fetal A-B-O blood groups during pregancy)，慢
性肺 炎性病(chronic pulmonary inflammatory disease)，自身 免疫性 心肌 炎
(autoimmune myocarditis)，白细胞黏附不足(leukocyte adhesion deficiency)，狼疮
(lupus)，其包括狼疮性肾炎(lupus nephritis)，狼疮性脑炎(lupus cerebritis)，儿童
(pediatric)狼疮，非肾(non-renal)狼疮，肾外(extra-renal)狼疮，盘状(discoid)狼疮
和盘状红斑性狼疮(discoid lupus erythematosus)，脱发(alopecia)狼疮，SLE，如皮肤
SLE或亚急性皮肤SLE(subacute cutaneous SLE)，新生儿狼疮综合征(neonatal lupus
syndrome)(NLE)，和播散性红斑狼疮(lupus erythematosus disseminatus)，青少年发作
型(I型)糖尿病(juvenile onset(Type I)diabetes mellitus)，包括儿童IDDM，成年型
糖尿病(II型糖尿病)，自身免疫性糖尿病(autoimmune diabetes)，特发性尿崩症
(idiopathic diabetes insipidus)，糖尿病视网膜病(diabetic retinopathy)，糖尿病肾
病(diabetic nephropathy)，糖尿病性大肠炎(diabetic colitis)，糖尿病大动脉病症
(diabetic large-artery disorder)，与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超
敏 反 应(acute and delayed hypersensitivity) 相 关 的 免 疫 应 答，肺 结 核
(tuberculosis)，结节病(sarcoidosis)，肉芽肿病(granulomatosis)，其包括淋巴瘤样肉
芽肿病(lymphomatoid granulomatosis)，粒细胞缺乏(agranulocytosis)，血管炎病
(vasculitides)(包括大血管血管炎(large vessel vasculitis)如风湿性多肌痛
(polymyalgia rheumatica)和巨大细胞(高安)动脉炎(giant-cell(Takayasu’s)
arteritis)，中血 管血 管炎(medium-vessel vasculitis)如 川崎病(Kawasaki’s
disease)和结节性多发性动脉炎(polyarteritis nodosa)/结节性动脉周围炎
(periarteritis nodosa))，免疫血管炎(immunovasculitis)，CNS血管炎(vasculitis)，
皮肤血管炎(cutaneous vasculitis)，超敏性血管炎(hypersensitivity vasculitis)，坏
死性血管炎(necrotizing vasculitis)，如纤维蛋白样坏死性血管炎(fibrinoid
necrotizing vasculitis)和 全 身 性 坏 死 性 血 管 炎 (systemic necrotizing
vasculitis)，ANCA阴性血管炎(ANCA-negative vasculitis)，和ANCA-相关性血管炎
(ANCA-associated vasculitis)如丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome)(CSS)，韦格
纳 肉 芽 肿 病(Wegener ′s granulomatosis) 和 微 观 多 血 管 炎 (microscopic
polyangiitis))，颞动脉炎(temporal arteritis)，再生障碍性贫血(aplastic anemia)，
自身免疫性再生障碍性贫血(autoimmune aplastic anemia)，Coombs阳性贫血(Coombs
positive anemia)，戴-布贫血(Diamond Blackfan anemia)，溶血性贫血(hemolytic
anemia)或免疫性溶血性贫血(immune hemolytic anemia)，其包括自身免疫性溶血性贫
血(autoimmune hemolytic anemia)(AIHA)，恶 性 贫 血 (pernicious anemia(anemia
perniciosa))，艾迪生病(Addison′s disease)，单纯红细胞性贫血或发育不良(pure red
cell anemia or aplasia)(PRCA)，因子VIII缺乏(Factor VIII deficiency)，血友病
A(hemophilia A)，自身免疫性中性粒细胞减少(autoimmune neutropenia(s))，血细胞减
少症(cytopenias)如全血细胞减少(pancytopenia)，白细胞减少(leukopenia)，涉及白细
胞血细胞渗出的疾病(diseases involving leukocyte diapedesis)，CNS炎性病症(CNS
inflammatory disorders)，阿 尔 茨海 默病(Alzheimer ′s disease)，帕金 森 病
(Parkinson′s disease)，多器官损伤综合征(multiple organ injury syndrome)诸如继
发败血病(septicemia)、外伤(trauma)或出血(hemorrhage)的那些，抗原-抗体复合物介
导的疾病(antigen-antibody complex-mediated diseases)，抗肾小球基底膜病
(anti-glomerular basement membrane disease)， 抗 磷 脂 抗 体 综 合 征
(anti-phospholipid abtibody syndrome)，运动神经炎(motoneuritis)，变应性神经炎
(allergic neuritis)，Behcet′s病/综合征，卡斯尔曼综合征(Castleman’s syndrome)，
古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)，Reynaud′s综合征，舍格伦综合征
(sjogren′s syndrome)，斯-约二氏综合征(Stevens-Johnson syndrome)，类天疱疮
(pemphigoid)或天疱疮(pemphigus)如大疱性类天疱疮(pemphigoid bullous)，瘢痕性
(粘膜性)类天疱疮(cicatricial(mucous membrane)pemphigoid)，皮肤类天疱疮(skin
pemphigoid)，增生型天疱疮(pemphigus vulgaris)，副肿瘤类天疱疮(paraneoplastic
pemphigus)，落叶型天疱疮(pemphigus foliaceus)，天疱疮粘膜性类天疱疮(pemphigus
mucus-membrane pemphigoid)，和红斑性天疱疮(pemphigus erythematosus)，获得性大疱
性表皮松解症(epidermolysis bullosa acquisita)，眼睛的炎症(ocular infammation)，
优选地变应性眼睛炎症如变应性结膜炎(allergic conjunctivis)，线性IgA大疱性疾病
(linear IgA bullous disease)，自身免疫-诱导的结膜炎症(autoimmune-induced
coniunctival inflammation)，自 身 免 疫 性 多 内 分 泌 腺 病 (autoimmune
polyendocrinopathies)，莱特尔病或综合征(Reiter′s disease or syndrome)，由于自
身免疫疾病导致的热伤(thermal injury due to an autoimmune condition)，先兆子痫
(preeclampsia)，免疫复合物疾病如免疫复合物肾炎(immune complex nephritis)，抗体
介 导 的 肾 炎 (antibody-mediated nephritis)，神 经 炎 症 (neuroinflammatory
disorders)，多神经病(polyneuropathies)，慢性神经病(chronic neuropathy)诸如IgM
多神经病(IgM polyneuropathies)或IgM-介导的神经病(IgM-mediated neuropathy)，血
小板减少症(thrombocytopenia)(如例如由心肌梗死患者发展的)，其包括血栓性血小板
减 少 性 紫 癜 (thrombotic thrombocytopenic purpura)(TTP)，输 血 后 紫 癜
(post-transfusion purpura)(PTP)，肝素诱导的血小板减少症(heparin-induced
thrombocytopenia)，和自身免疫性或免疫介导的血小板减少症(autoimmune or
immune-mediated thrombocytopenia)，其包括例如，特发性血小板减少症性紫癜
(idiopathic thrombocytopenic purpura)(ITP)，其包括慢性或急性ITP(chronic or
acute ITP)，巩 膜 炎 (scleritis) 如 特 发 性 角 膜 - 巩 膜 炎 (idiopathic
cerato-scleritis)，巩膜外层炎(episcleritis)，自身免疫性睾丸和卵巢疾病
(autoimmune disease of the testis and ovary)，其包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎
(autoimmune orchitis and oophoritis)，原 发 性 甲 状腺 机 能 减 退症 (primary
hypothyroidism)，甲状旁腺功能减退症(hypoparathyroidism)，自身免疫性内分泌病
(autoimmune endocrine diseases)，包括甲状腺炎(thyroiditis)如自身免疫性甲状腺炎
(autoimmune thyroiditis)，桥本甲状腺炎(Hashimoto′s disease)，慢性甲状腺炎
(chronic thyroiditis)(桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis))，或亚急性甲状腺炎
(subacute thyroiditis)，自身免疫性甲状腺病(autoimmune thyroid disease)，特发性
甲状腺机能减退症(idiopathic hypothyroidism)，格雷夫斯病(Grave′s disease)，格
雷夫斯眼病(Grave′s eye disease)(眼病(ophthalmopathy)或 甲状腺相关的眼病
(thyroid-associated ophthalmopathy))，多腺体综合征(polyglandular syndromes)如
自身免疫性多腺体综合征(autoimmune polyglandular syndromes)，例如，I型(或多腺体
内 分 泌 综 合 征 (polyglandular endocrinopathy syndromes))，副 肿 瘤 综 合 征
(paraneoplastic syndromes)，其包括神经学副肿瘤综合征(neurologic paraneoplastic
syndromes)如兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)或伊顿-兰伯
特综 合征 (Eaton-Lambert syndrome)，僵 人综 合 征(stiff-man or stiff-person
syndrome)，脑 脊 髓 炎 (encephalomyelitis) 如 变 应 性 脑 脊 髓 炎 (allergic
encephalomyelitis)或变应性脑脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和实验性变应
性 脑 脊 髓 炎(experimental allergic encephalomyelitis)(EAE)，重 症 肌 无 力
(myasthenia gravis)如胸腺瘤相关的重症肌无力(thymoma-associated myasthenia
gravis)，小脑变性(cerebellar degeneration)，神经性肌强直(neuromyotonia)，视性眼
阵挛(opsoclonus)或视性眼阵挛肌阵挛(opsoclonus myoclonus syndrome)(OMS)，和感
觉神经病(sensory neuropathy)，多病灶运动神经病(multifocal motor neuropathy)，希
恩综合征(Sheehan′s syndrome)，自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)，慢性肝炎
(chronic hepatitis)，狼疮状肝炎(lupoid hepatitis)，巨细胞肝炎(giant cell
hepatitis)，慢性活动性肝炎(chronic active hepatitis)或自身免疫性慢性活动性肝
炎(autoimmune chronic active hepatitis)，肺炎(pneumonitis)如淋巴样间质性肺炎
(lymphoid interstitial pneumonitis)(LIP)，相对NSIP的闭塞性细支气管炎(非移植
性)(bronchiolitis obliterans(non-transplant)vs NSIP)，吉 兰 - 巴 雷 综 合 征
(Guillain-Barrésyndrome)，贝格尔病(Berger′s disease)(IgA肾病)，特发性IgA肾病
(idiopathic IgA nephropathy)，线性IgA皮肤病(linear IgA dermatosis)，急性发热性
嗜中性皮肤病(acute febrile neutrophilic dermatosis)，角质层下脓疱皮肤病
(subcorneal pustular dermatosis)，暂 时 性 棘 层 松 解 性 皮 肤 病 (transient
acantholytic dermatosis)，肝硬化(cirrhosis)如原发性胆汁性肝硬变(primary
biliary cirrhosis)和肺硬变(pneumonocirrhosis)，自身免疫性肠病综合征(autoimmune
enteropathy syndrome)，乳糜泻或腹腔病(Celiac or Coeliac disease)，口炎性腹泻
(celiac sprue)(麸质性肠病(gluten enteropathy))，难治性口炎性腹泻(refractory
sprue)，特发性口炎性腹泻 (idiopathic sprue)，冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)如
混合型冷球蛋白血症(mixed cryoglobulinemia)，肌萎缩性侧索硬化(amylotrophic
lateral sclerosis)(ALS；卢·盖里格病(Lou Gehrig′s disease))，冠状动脉病
(coronary artery disease)，自身免疫性耳病(autoimmune ear disease)如自身免疫性
内耳病(autoimmune inner ear disease)(AIED)，自身免疫性听力丧失(autoimmune
hearing loss)，多软骨炎(polychondritis)如难治性或复发的或复发性多软骨炎
(refractory or relapsed or relapsing polychondritis)，肺泡蛋白沉积症(pulmonary
alveolar proteinosis)，角膜炎(keratitis)如科根综合征(Cogan′s syndrome)/非梅
毒性间质性角膜炎(nonsyphilitic interstitial keratitis)，贝尔麻痹(Bell′s
palsy)，斯威特疾病/综合征(Sweet′s disease/syndrome)，自身免疫性红斑痤疮
(rosacea autoimmune)，带状疱疹相关的疼痛(zoster-associated pain)，淀粉样变性
(amyloidosis)，非癌性淋巴细胞增多症(a non-cancerous lymphocytosis)，原发性淋巴
细胞增多症(a primary lymphocytosis)，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症
(monoclonal B cell lymphocytosis)(例如良性单克隆丙球蛋白病(benign monoclonal
gammopathy)和意 义未定 的单 克隆γ-球 蛋白 病(monoclonal garnmopathy of
undetermined significance，MGUS)，周围神经病(peripheral neuropathy)，副肿瘤综合
征(paraneoplastic syndrome)，通道病变(channelopathies)如癫痫症(epilepsy)，偏头
痛(migraine)，心 律 不 齐 (arrhythmia)，肌 肉 病 症 (musculardisorders)，耳 聋
(deafness)，失明(blindness)，周期性瘫痪(periodic paralysis)，和CNS通道病变
(channelopathies of the CNS)，孤 独 症(autism)，炎 症 性 肌 病 (inflammatory
myopathy)，局灶性或节段性或局灶节段性肾小球硬化症(focal or segmental or focal
segmental glomerulosclerosis)(FSGS)，内分泌性眼病(endocrine ophthalmopathy)，葡
萄膜视网膜炎(uveoretinitis)，脉络膜视网膜炎(chorioretinitis)，自身免疫性肝病
(autoimmune hepatological disorder)，纤维肌痛(fibromyalgia)，多发性内分泌衰竭
(multiple endocrine failure)，施密特综合征(Schmidt′s syndrome)，肾上腺炎
(adrenalitis)，胃萎缩(gastric atrophy)，早老性痴呆(presenile dementia)，脱髓鞘疾
病(demyelinating diseases)如自身免疫性脱髓鞘疾病(autoimmune demyelinating
diseases)和慢性炎性脱髓鞘多神经病(chronic inflammatory demyelinating
polyneuropathy)，心肌梗死后综合征(Dressler′s syndrome)，斑秃(alopecia
areata)，全秃(alopecia totalis)，CREST综合征(钙质沉着(calcinosis)，雷诺现象
(Raynaud′s phenomenon)，食管活动不良(esophageal dysmotility)，指端硬化
(sclerodactyly)，和毛细管扩张(telangiectasia))，例如由抗-精子抗体导致的抗-男性
和女性自身免疫性不育(male and female autoimmune infertility)，混合的结缔组织病
(mixed connective tissue disease)，恰加斯病(Chagas′disease)，风湿热(rheumatic
fever)，复发性流产(recurrentabortion)，农民肺(farmer′s lung)，多形性红斑
(erythema multiforme)，心脏切开后综合(post-cardiotomy syndrome)，库欣综合征
(Cushing′s syndrome)，鸟爱好者肺(bird-fancier′s lung)，变应性肉芽肿性血管炎
(allergic granulomatous angiitis)，良性淋巴细胞血管炎(benign lymphocytic
angiitis)，奥尔波特综合征(Alport′s syndrome)，肺泡炎(alveolitis)如变应性肺泡
炎(allergic alveolitis)和纤维化肺泡炎(fibrosing alveolitis)，间质性肺病
(interstitial lung disease)，输血反应(transfusion reaction)，麻疯病(leprosy)，疟
疾(malaria)，寄 生 虫 病(parasitic diseases) 如 利 什 曼 病(leishmaniasis)，
kypanosomiasis，血吸 虫病(schistosomiasis)，蛔虫 病(ascariasis)，曲 霉菌 病
(aspergillosis)，Sampter′s综合征(Sampter′s syndrome)，卡布兰综合征(Caplan′s
syndrome)，登革热(dengue)，心内膜炎(endocarditis)，心内膜心肌纤维化症
(endomyocardial fibrosis)，弥散性间质性肺纤维化(diffuse interstitial pulmonary
fibrosis)，间质性肺纤维化(interstitial lung fibrosis)，纤维性纵隔炎(fibrosing
mediastinitis)，肺纤维化(pulmonary fibrosis)，特发性肺纤维化(idiopathic
pulmonary fibrosis)，囊性纤维化(cystic fibrosis)，眼内炎(endophthalmitis)，持久
性 隆 起 性 红 斑 (erythema elevatum et diutinum)，胎 儿 成 红 细 胞 增 多 症
(erythroblastosis fetalis)，嗜酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)，舒尔曼综合征
(Shulman′s syndrome)，费尔蒂综合征(Felty′s syndrome)，丝虫病(flariasis)，睫状
体炎(cyclitis)如慢性睫状体炎(chronic cyclitis)，异色性睫状体炎(heterochronic
cyclitis)，虹膜睫状体炎(iridocyclitis)(急性或慢性)，或富克斯睫状体炎(Fuch′s
cyclitis)，亨诺赫-舍恩莱茵紫癜(Henoch-Schonlein purpura)，人免疫缺陷病毒(HIV)
感染(immunodeficiency virus(HIV)infection)，SCID，获 得性免 疫缺 陷综合 征
(acquired immune deficiency syndrome)(AIDS)，艾 柯 病 毒 感 染 (echovirus
infection)，脓毒症(sepsis)(系统炎性反应综合征(systemic inflammatory response
syndrome)(SIRS))，内毒素血症(endotoxemia)，胰腺炎(pancreatitis)，甲状腺毒症
(thyroxicosis)，细小病毒感染(parvovirus infection)，风疹病毒感染(rubella virus
infection)，接种后综合征(post-vaccination syndromes)，先天性风疹感染(congenital
rubella infection)，埃巴病毒感染(Epstein-Barr virus infection)，流行性腮腺炎
(mumps)，埃文斯综合征(Evan′s syndrome)，自身免疫性性腺衰竭(autoimmune gonadal
failure)，小舞蹈病(Sydenham′s chorea)，链球菌感染后肾炎(post-streptococcal
nephritis)，血 栓 闭 塞 性 脉 管 炎 (thromboangitis ubiterans)，甲 状 腺 毒 症
(thyrotoxicosis)，脊髓痨(tabes dorsalis)，脉络膜炎(chorioiditis)，巨细胞多肌痛
(giant cell polymyalgia)，慢 性 过 敏 性 肺 炎 (chronic hypersensitivity
pneumonitis)，结膜炎(conjunctivitis)，如春季结膜炎(vernal catarrh)，干燥性角结膜
炎 (keratoconjunctivitis sicca)， 和 流 行 性 角 结 膜 炎 (epidemic
keratoconjunctivitis)，特发性肾病综合征(idiopathic nephritic syndrome)，微小病
变肾病(minimal change nephropathy)，良性家族性和缺血再灌损伤(benign familial
and ischemia-reperfusion injury)，移 植 器 官 再 灌 注 (transplant organ
reperfusion)，视网 膜 自 身 免 疫 性(retinal autoimmunity)，关 节炎 症 (joint
inflammation)，支气管炎(bronchitis)，慢性闭塞性呼吸道/肺病(chronic obstructive
airway/pulmonary disease)，硅肺(silicosis)，口疮(aphthae)，口疮性口炎(aphthous
stomatitis)，动脉硬化病(arteriosclerotic disorders)(脑血管功能不全(cerebral
vascular insufficiency))如动脉硬化性脑病(arteriosclerotic encephalopathy)和动
脉硬化性视网膜病(arteriosclerotic retinopathy)，aspermiogenese，自身免疫性溶血
(autoimmune hemolysis)，结 节 病 (Boeck ′ s disease)，冷 球 蛋 白 血 症
(cryoglobulinemia)，迪皮特朗挛缩(Dupuytren′s contracture)，眼内炎phacoanaphy
lactica(endophthalmia phacoanaphylactica)，过敏性肠炎(enteritis allergica)，麻
风结节性红斑(erythema nodosum leprosum)，自发性面神经麻痹(idiopathic facial
paralysis)，慢 性 疲 劳 综 合 征(chronic fatigue syndrome)，风 湿 热(febris
rheumatica)，哈 -里 综合 征(Hamman-Rich ′s disease)，感 觉 神经 听 力 丧失
(sensoneural hearing loss)， 血 红 蛋 白 尿 paroxysmatica(haemoglobinuria
paroxysmatica)，性腺机能减退(hypogonadism)，地域性回肠炎(ileitis regionalis)，白
细胞减少症(leucopenia)，传染性单核细胞增多症(mononucleosis infectiosa)，横断性
脊髓炎(traverse myelitis)，原发性特发性粘液性水肿(primary idiopathic
myxedema)，肾病(nephrosis)，眼炎symphatica(ophthalmia symphatica)(交感性眼炎
(sympathetic ophthalmitis))，新生儿眼炎(neonatal ophthalmitis)，视神经炎(optic
neuritis)，肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa)，胰腺炎(pancreatitis)，急性多
神经根炎(polyradiculitis acuta)，坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenosum)，凯文甲状腺
炎(Quervain′s thyreoiditis)，获得性spenic萎缩(acquired spenic atrophy)，非恶
性胸腺瘤(non-malignant thymoma)，淋巴滤泡型胸腺炎(lymphofollicular thymitis)，
白斑(vitiligo)，中毒性休克综合征(toxic-shock syndrome)，食物中毒(food
poisoning)，涉及T细胞浸润的病症(conditions involving infiltration of T cells)，
白细胞粘附缺陷(leukocyte-adhesion deficiency)，与由细胞因子和T-淋巴细胞介导的
急性和迟发型超敏反应(acute and delayed hypersensitivity)相关的免疫应答，涉及
白细胞血细胞渗出的疾病(diseases involving leukocyte diapedesis)，多器官损伤综
合征(multiple organ injury syndrome)，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底
膜病(antiglomerular basement membrane disease)，自身免疫性多内分泌腺疾病
(autoimmune polyendocrinopathies)，卵巢炎(oophoritis)，原发性黏液性水肿(primary
myxedema)，自身免疫性萎缩性胃炎(autoimmune atrophic gastritis)，风湿性疾病
(rheumatic diseases)，混合性结缔组织病(mixed connective tissue disease)，肾病综
合征(nephrotic syndrome)，胰岛炎(insulitis)，多内分泌腺衰竭(polyendocrine
failure)，自身免疫性多腺体综合征(autoimmune polyglandular syndromes)，其包括I
型多内分泌腺综合征(polyglandular syndrome type I)，成人型特发性甲状旁腺功能减
退(adult-onset idiopathic hypoparathyroidism)(AOIH)，心肌病(cardiomyopathy)如
扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy)，获得性大疱性表皮松解症(epidermolisis
bullosa acquisita)(EBA)，血色素沉着病(hemochromatosis)，心肌炎(myocarditis)，肾
病综合征(nephrotic syndrome)， 原发性硬化性胆 管炎(primary sclerosing
cholangitis)，化脓性或非化脓性窦炎(purulent or nonpurulent sinusitis)，急性或慢
性窦炎(acute or chronic sinusitis)，筛窦、额窦、上颌窦或蝶窦的窦炎(ethmoid，
frontal，maxillary，or sphenoid sinusitis)，变应性窦炎(allergic sinusitis)，嗜酸
性粒细胞相关的疾病(eosinophil-related disorder)如嗜酸性细 胞增多症
(eosinophilia)，肺嗜酸细胞增多性浸润(pulmonary infiltration eosinophilia)，嗜酸
性细胞增多性肌痛综合征(eosinophilia-myalgia syndrome)，Loffler′s综合征，慢性
嗜酸细胞性肺炎(chronic eosinophilic pneumonia)，热带性肺嗜酸细胞浸润症
(tropical pulmonary eosinophilia)，支 气 管 肺 曲 霉 病 (bronchopneumonic
aspergillosis)，曲霉肿(aspergilloma)，或含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿(granulomas
containing eosinophils)，过 敏 性 反 应 (anaphylaxis)， 脊 椎 关 节 病
(spondyloarthropathie)，血清阴性脊椎关节炎(seronegative spondyloarthritides)，
多内分泌自身免疫病(polyendocrine autoimmune disease)，硬化性胆管炎(sclerosing
cholangitis)，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤念珠菌病(sclera，episclera，chronic
mucocutaneous candidiasis)，Bruton′s综合征，婴儿一过性低丙种球蛋白血症
(transient hypogammaglobulinemia of infancy)，Wiskott-Aldrich综合征，运动失调性
毛细血管扩张综合征(ataxia telangiectasia syndrome)，血管扩张(angiectasis)，与
胶原病相关的自身免疫病症(autoimmune disorders associated with collagen
disease)，风湿病(rheumatism)如慢性关节风湿病(chronic arthrorheumatism)，淋巴结
炎(lymphadenitis)，血压反应减少(reduction in blood pressure response)，血管功能
障碍(vascular dysfunction)，组织损伤(tissue injury)，心血管缺血(cardiovascular
ischemia)，痛觉过敏(hyperalgesia)，肾缺血(renal ischemia)，脑缺血(cerebral
ischemia)，和伴有血管生成的疾病(disease accompanying vascularization)，变应性超
敏 感 性 病 症 (allergic hypersensitivity disorders)， 肾 小 球 肾 炎
(glomerulonephritides)，再灌注损伤(reperfusion injury)，缺血-再灌病症(ischemic
re-perfusion disorder)，心肌或其它组织的再灌注损伤(reperfusion injury of
myocardial or other tissues)，淋 巴 瘤 性 气 管 支 气 管 炎 (lymphomatous
tracheobronchitis)，炎性皮肤病(inflammatory dermatoses)，具有急性炎症成分的皮肤
病(dermatoses with acute inflammatory components)，多器官功能衰竭(multiple
organ failure)，大疱性疾病(bullous diseases)，肾脏皮质坏死(renal cortical
necrosis)，急性化脓性脑膜炎(acute purulent meningitis)或其它中枢神经系统炎性
病症(other central nervous system inflammatory disorders)，眼和眼窝炎性病症
(ocular and orbital inflammatory disorders)，粒 细 胞 输 血 相 关 的 综 合 征
(granulocyte transfusion-associated syndromes)，细 胞 因 子 诱 导 的 毒 性
(cytokine-induced toxicity)，发作性睡病(narcolepsy)，急性严重炎症(acute serious
inflammation)，慢性 顽固性炎 症(chronic intractable inflammation)，肾盂 炎
(pyelitis)，动脉内增生(endarterial hyperplasia)，消化性溃疡(peptic ulcer)，瓣膜
炎(valvulitis)，和子宫内膜异位症((endometriosis)。本文预期通过施用与B细胞表面
标志如FcRH5结合的抗体来治疗这些疾病，并且包括施用本文公开的未缀合(“裸”)抗体
或与细胞毒性剂缀合的抗体。本文还预期通过组合疗法治疗这些疾病，所述组合疗法包括
同时或连续施用的本发明的抗-FcRH5抗体或抗-FcRH5抗体药物缀合物与另一种抗体或抗
体药物缀合物、另一种细胞毒性剂、辐射或其它治疗。
[0232] ″治疗(treating)″或“治疗(treatment)”或“缓和(alleviation)”指治疗性治疗和预防性或防止性措施二者，其中目的是预防或减缓(减轻)靶向的病理疾病或病症。
需要治疗的那些包括已经患有疾病的那些以及易于患有疾病的那些或其中疾病有待预防
的那些。如果在接受治疗量的根据本发明的方法的抗-FcRH5抗体后，所述患者在下述的一
种或多种显示可观察的和/或可测量的减少或消失：癌细胞数量的减少或癌细胞不存在；
肿瘤大小的减少；抑制(即，在某种程度上减慢并且优选地阻止)癌细胞浸润到外周器官中
(包括将癌症扩散到软组织和骨中)；抑制(即，在某种程度上减慢并且优选地阻止)肿瘤
转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻与特定癌症相关的一种或多
种症状；减少发病率和致死率，和提高生活质量，则对受试者或哺乳动物关于表达FcRH5多
肽的癌症成功地进行了“治疗”。到所述抗-FcRH5抗体可以防止生长和/或杀死现存的癌
细胞的程度，其可以是细胞抑制性和/或细胞毒性的。这些迹象或症状的减少也可以由患
者感觉。
需要治疗的那些包括已经患有疾病的那些以及易于患有疾病的那些或其中疾病有待预防
的那些。如果在接受治疗量的根据本发明的方法的抗-FcRH5抗体后，所述患者在下述的一
种或多种显示可观察的和/或可测量的减少或消失：癌细胞数量的减少或癌细胞不存在；
肿瘤大小的减少；抑制(即，在某种程度上减慢并且优选地阻止)癌细胞浸润到外周器官中
(包括将癌症扩散到软组织和骨中)；抑制(即，在某种程度上减慢并且优选地阻止)肿瘤
转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻与特定癌症相关的一种或多
种症状；减少发病率和致死率，和提高生活质量，则对受试者或哺乳动物关于表达FcRH5多
肽的癌症成功地进行了“治疗”。到所述抗-FcRH5抗体可以防止生长和/或杀死现存的癌
细胞的程度，其可以是细胞抑制性和/或细胞毒性的。这些迹象或症状的减少也可以由患
者感觉。
[0233] 用于评估成功治疗和改善疾病的上述参数可容易地通过医师所熟悉 的常规方法测量。对于癌症疗法，可以例如通过评估疾病进展的时间(time to disease progression)
(TTP)和/或确定应答率(RR)测量功效。可以通过疾病分期测试和通过骨扫描和关于钙水
平以及其它确定扩散到骨的酶的测试来确定转移。还可以进行CT扫描来寻找向骨盆和在
该区域中的淋巴结的扩散。将胸部X-射线以及通过已知方法测量的肝的酶水平用于发现
分别向肺和肝的转移。用于监测疾病的其它常规方法包括经直肠超声检查(transrectal
ultrasonography)(TRUS)和经直肠活组织检查(transrectal needle biopsy)(TRNB)。
(TTP)和/或确定应答率(RR)测量功效。可以通过疾病分期测试和通过骨扫描和关于钙水
平以及其它确定扩散到骨的酶的测试来确定转移。还可以进行CT扫描来寻找向骨盆和在
该区域中的淋巴结的扩散。将胸部X-射线以及通过已知方法测量的肝的酶水平用于发现
分别向肺和肝的转移。用于监测疾病的其它常规方法包括经直肠超声检查(transrectal
ultrasonography)(TRUS)和经直肠活组织检查(transrectal needle biopsy)(TRNB)。
[0234] 关于膀胱癌，其是更局限性的癌症，确定疾病进展的方法包括通过膀胱镜检查来进行泌尿细胞学评估，监测尿中血液的存在，通过声图描记法或静脉内肾盂造影图、计算机
化断层显象(CT)和磁共振成像(MRI)来使尿道显影。远端转移灶的存在可以通过腹部的
CT、胸部x-射线，或骨骼的放射性核素成像进行评估。
化断层显象(CT)和磁共振成像(MRI)来使尿道显影。远端转移灶的存在可以通过腹部的
CT、胸部x-射线，或骨骼的放射性核素成像进行评估。
[0235] ″长期″施用指以连续的方式施用药剂(这与急性方式相对)，从而维持起始的治疗效果(活性)达延长的时间阶段。“周期性”施用是这样的治疗，其不是无间断的连续
进行的，而实际上是周期性的。
进行的，而实际上是周期性的。
[0236] “个体”是脊椎动物。在某些实施方案中，所述脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于：农畜(如母牛)，竞技动物(sport animals)，宠物(如猫，狗，和马)，灵长类动物，小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
[0237] 用于减轻癌症症状的治疗目的的“哺乳动物”指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农畜，和动物园动物，竞技动物或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。优选地，所述哺乳动物是人。
[0238] 与一种或多种另外的治疗剂“组合”施用包括以任何顺序同时(同时发生)施用和连续的施用。
[0239] ″载体″用于本文时包括这样的药用载体、赋形剂或稳定剂，当细胞或哺乳动物暴露于其所用剂量和浓度时，所述药用载体、赋形剂或稳定剂对于该细胞或哺乳动物是无
毒的。生理可接受的载体通常是pH缓冲水溶液。生理可接受的载体的实例包括缓冲液如
磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)
多肽；蛋白质如血清 白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基
酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；盐-形成平衡离子如钠；和/或
非离子表面活性剂如 聚乙二醇(PEG)，和
毒的。生理可接受的载体通常是pH缓冲水溶液。生理可接受的载体的实例包括缓冲液如
磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)
多肽；蛋白质如血清 白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基
酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；盐-形成平衡离子如钠；和/或
非离子表面活性剂如 聚乙二醇(PEG)，和
[0240] 所谓″固相″或“固体支持物”意为本发明的抗体可以附着或连接的非水性基质。本文所涵盖的固相的实例包括部分或完全由玻璃(例如，可控孔度玻璃)、多糖(例如琼脂
糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮形成的那些。在某些实施方案中，根据背景，固相可以包括测定板的孔；在其它实施方案中，固相是纯化柱(例如亲和层析柱)。该术语还
包括离散颗粒的不连续固相，如在美国专利号4,275,149中所述的那些。
糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮形成的那些。在某些实施方案中，根据背景，固相可以包括测定板的孔；在其它实施方案中，固相是纯化柱(例如亲和层析柱)。该术语还
包括离散颗粒的不连续固相，如在美国专利号4,275,149中所述的那些。
[0241] ″脂质体″是由用于将药物(如FcRH5抗体)递送到哺乳动物的各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小泡。脂质体的成分通常以双分子层结构排列，类似于生
物膜的脂质排列。
物膜的脂质排列。
[0242] “小”分子或“小”有机分子如本文定义，具有低于约500道尔顿的分子量。
[0243] “个体”“受试者，”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，所述脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，农畜(如母牛)、竞技动物、宠物(如猫、狗和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
[0244] 术语″药物制剂″指这样的制剂，其以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对待施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。所述制剂
可以是无菌的。
可以是无菌的。
[0245] “无菌”制剂是灭菌的，不含任何活的微生物以及它们的孢子。
[0246] 如本文公开的抗体的“有效量”是足以进行特别指定目的的量。″有效量″可以关于指定的目的根据经验和常规方法进行确定。
[0247] 术语“治疗有效量”指抗体或其它药物有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的量。在癌症的情形中，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减少肿瘤大小；抑制
(即，在一定程度上减慢并且优选地阻止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在一定程
度上减慢并且优选地阻止) 肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上
缓解与癌症相关的一种或多种症状。见本文关于“治疗”的定义。到药物可以阻止生长和/
或杀死现存的癌细胞的程度，其可以是细胞生长抑制性和/或细胞毒性的。“预防有效量”
指在获得需要的预防效果所需要的剂量和时间阶段有效的量。典型地，但不是必需地，由于
预防剂量在疾病的早期阶段前或在疾病的早期阶段用于受试者，因此预防有效量将少于治
疗有效量。
(即，在一定程度上减慢并且优选地阻止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在一定程
度上减慢并且优选地阻止) 肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上
缓解与癌症相关的一种或多种症状。见本文关于“治疗”的定义。到药物可以阻止生长和/
或杀死现存的癌细胞的程度，其可以是细胞生长抑制性和/或细胞毒性的。“预防有效量”
指在获得需要的预防效果所需要的剂量和时间阶段有效的量。典型地，但不是必需地，由于
预防剂量在疾病的早期阶段前或在疾病的早期阶段用于受试者，因此预防有效量将少于治
疗有效量。
[0248] 抗-FcRH5抗体的“生长抑制量”是能够在体外或体内抑制细胞，尤其是肿瘤，例如癌细胞的生长的量。用于抑制赘生性细胞生长目的的抗-FcRH5抗体的“生长抑制量”可以
根据经验和以常规方式确定。
根据经验和以常规方式确定。
[0249] 抗-FcRH5抗体的“细胞毒性量”是能够在体外或体内导致细胞，尤其是肿瘤，例如癌细胞的破坏的量。用于抑制赘生性细胞生长目的的抗-FcRH5抗体的“细胞毒性量”可以
根据经验并以常规方式确定。
根据经验并以常规方式确定。
[0250] “表达FcRH5的细胞”是这样的细胞，其在细胞表面或以分泌形式表达内源或转染的FcRH5多肽。“表达FcRH5的癌症”是包含这样细胞的癌症，所述细胞在细胞表面上存在
FcRH5多肽或产生并且分泌FcRH5多肽。“表达FcRH5的癌症”任选地在其细胞表面上产生充
足水平的FcRH5多肽，从而使抗-FcRH5抗体可以结合于其上，并且对于癌症具有治疗效果。
在另一个实施方案中，“表达FcRH5的癌症”任选地产生并且分泌充足水平的FcRH5多肽从
而使抗-FcRH5抗体拮抗剂可以结合于其上，并且对于所述癌症具有治疗效果。关于后者，
所述拮抗剂可以是反义寡核苷酸，其减少、抑制或阻止肿瘤细胞对分泌的FcRH5多肽的产
生和分泌。“过量表达”FcRH5多肽的癌症是这样的癌症，所述癌症与相同组织类型的非癌性细胞相比，在其细胞表面具有显著更高水平的FcRH5多肽，或产生并且分泌显著更高水平
的FcRH5多肽。所述过量表达可以通过基因扩增或通过增加的转录或翻译导致。FcRH5多肽
过量表达可以在检测或诊断测定法中，通过评估细胞表面上存在的，或由细胞分泌的FcRH5
蛋白的增加的水平进行确定(例如，通过使用针对分离的FcRH5多肽制备的抗-FcRH5抗
体的免疫组化测定法，所述分离的FcRH5多肽可以使用重组DNA技术从编码FcRH5多肽的
分离的核酸制备；通过FACS分析等)。备选地，或另外地，技术人员可以测量细胞中编码
FcRH5多肽的核酸或mRNA的水平，例如 通过使用基于核酸的探针的荧光原位杂交，所述探
针对应于编码FcRH5的核酸或其补体；(FISH；见1998年10月公开的WO98/45479)，DNA印
迹法，RNA印迹法，或聚合酶链式(PCR)技术，如实时定量PCR(RT-PCR)。技术人员还可以
通过测量在生物流体(如血清)中的释放的抗原来研究FcRH5多肽的过量表达，例如使用
基于抗体的测定法进行(还见，例如1990年6月12日提交的美国专利号4,933,294；1991
年4月18日公开的WO91/05264；1995年3月28日提交的美国专利5,401,638；和Sias
等，J.Immunol.Methods(免疫方法杂志)132：73-80(1990))。除了上述测定法之外，技术人
员可以获得各种体内测定法。例如，可以将患者体内的细胞暴露于任选地用可检测的标记
(例如放射性同位素)标记的抗体，并且可以，例如通过在外部扫描放射性或通过分析取自
以前暴露于抗体的患者的活组织检查来评估抗体与患者中的细胞的结合。
FcRH5多肽或产生并且分泌FcRH5多肽。“表达FcRH5的癌症”任选地在其细胞表面上产生充
足水平的FcRH5多肽，从而使抗-FcRH5抗体可以结合于其上，并且对于癌症具有治疗效果。
在另一个实施方案中，“表达FcRH5的癌症”任选地产生并且分泌充足水平的FcRH5多肽从
而使抗-FcRH5抗体拮抗剂可以结合于其上，并且对于所述癌症具有治疗效果。关于后者，
所述拮抗剂可以是反义寡核苷酸，其减少、抑制或阻止肿瘤细胞对分泌的FcRH5多肽的产
生和分泌。“过量表达”FcRH5多肽的癌症是这样的癌症，所述癌症与相同组织类型的非癌性细胞相比，在其细胞表面具有显著更高水平的FcRH5多肽，或产生并且分泌显著更高水平
的FcRH5多肽。所述过量表达可以通过基因扩增或通过增加的转录或翻译导致。FcRH5多肽
过量表达可以在检测或诊断测定法中，通过评估细胞表面上存在的，或由细胞分泌的FcRH5
蛋白的增加的水平进行确定(例如，通过使用针对分离的FcRH5多肽制备的抗-FcRH5抗
体的免疫组化测定法，所述分离的FcRH5多肽可以使用重组DNA技术从编码FcRH5多肽的
分离的核酸制备；通过FACS分析等)。备选地，或另外地，技术人员可以测量细胞中编码
FcRH5多肽的核酸或mRNA的水平，例如 通过使用基于核酸的探针的荧光原位杂交，所述探
针对应于编码FcRH5的核酸或其补体；(FISH；见1998年10月公开的WO98/45479)，DNA印
迹法，RNA印迹法，或聚合酶链式(PCR)技术，如实时定量PCR(RT-PCR)。技术人员还可以
通过测量在生物流体(如血清)中的释放的抗原来研究FcRH5多肽的过量表达，例如使用
基于抗体的测定法进行(还见，例如1990年6月12日提交的美国专利号4,933,294；1991
年4月18日公开的WO91/05264；1995年3月28日提交的美国专利5,401,638；和Sias
等，J.Immunol.Methods(免疫方法杂志)132：73-80(1990))。除了上述测定法之外，技术人
员可以获得各种体内测定法。例如，可以将患者体内的细胞暴露于任选地用可检测的标记
(例如放射性同位素)标记的抗体，并且可以，例如通过在外部扫描放射性或通过分析取自
以前暴露于抗体的患者的活组织检查来评估抗体与患者中的细胞的结合。
[0251] 用于本文时，术语“免疫黏附素”指这样的抗体样分子，其将异源蛋白(黏附素)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能结合在一起。在结构上，所述免疫黏附
素包含具有需要的结合特异性的氨基酸序列(不同于抗体的抗原识别和结合位点(即，是
“异源的”))和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合体。免疫黏附素分子的黏附素部分典型
地是至少包含受体或配体的结合位点的连续的氨基酸序列。在免疫黏附素中的免疫球蛋白
恒定结构域序列可以获自任何免疫球蛋白，如IgG-1，IgG-2，IgG-3或IgG-4亚型，IgA(包
括IgA-1和IgA-2)，IgE，IgD或IgM。
素包含具有需要的结合特异性的氨基酸序列(不同于抗体的抗原识别和结合位点(即，是
“异源的”))和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合体。免疫黏附素分子的黏附素部分典型
地是至少包含受体或配体的结合位点的连续的氨基酸序列。在免疫黏附素中的免疫球蛋白
恒定结构域序列可以获自任何免疫球蛋白，如IgG-1，IgG-2，IgG-3或IgG-4亚型，IgA(包
括IgA-1和IgA-2)，IgE，IgD或IgM。
[0252] 措词″标记″当用于本文时，指可检测的化合物或组合物，其直接或间接缀合于抗体从而产生“标记的”抗体。标记本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光
标记)，或在酶促标记的情形中，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
标记)，或在酶促标记的情形中，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
[0253] 术语“细胞毒性剂”用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物211 131 125 90 186 188 153 212 32
质。该术语意图包括放射性同位素(例如At 、I 、I 、Y 、Re 、Re 、Sm 、Bi 、p 和
Lu的放射性同位素)、化疗剂，例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷
(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯
丁酸氮 芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂，酶及其片段如溶核
酶，抗生素和毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片
段和/或变体，和下面公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。在下面描述其它的细胞毒性剂。杀肿
瘤药剂导致肿瘤细胞的破坏。
质。该术语意图包括放射性同位素(例如At 、I 、I 、Y 、Re 、Re 、Sm 、Bi 、p 和
Lu的放射性同位素)、化疗剂，例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷
(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯
丁酸氮 芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂，酶及其片段如溶核
酶，抗生素和毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片
段和/或变体，和下面公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。在下面描述其它的细胞毒性剂。杀肿
瘤药剂导致肿瘤细胞的破坏。
[0254] “毒素”是对于细胞的生长或增殖能够具有有害效应的任何物质。
[0255] “化疗剂”是不管其作用机制有效用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的种类包括，但不限于：烷化剂类，抗代谢物类，纺锤体毒素植物生物碱类，细胞毒性/抗肿瘤
抗生素，拓扑异构酶抑制剂，抗体，光敏剂和激酶抑制剂。化疗剂包括用在“靶向疗法”
和常规化疗中的化合物。化疗剂的实例包括：erlotinib( Genentech/
OSI Pharm.)，多西 他 塞(docetaxel)( Sanofi-Aventis)，5-FU( 氟
尿嘧啶(fluorouracil)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，CAS No.51-21-8)，吉西他滨
(gemcitabine)( Lilly)，PD-0325901(CAS No.391210-10-9，Pfizer)，
顺铂(cisplatin)(顺式-二胺，二氯铂(II)(cis-diamine，dichloroplatinum(II))，
CAS No.15663-27-1)，卡铂(carboplatin)(CAS No.41575-94-4)，紫杉醇(paclitaxel)
( Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)，曲 妥 珠 单 抗
(trastuzumab)( Genentech)，替 莫 唑 胺 (temozolomide)(4- 甲
基-5-氧-2，3，4，6，8-五氮杂双环4.3.0]壬-2，7，9-三烯-9-羧酰胺(carboxamide)，
CAS No.85622-93-1， Schering Plough)，他 莫 昔
芬(tamoxifen)((Z)-2-[4-(1，2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N，N-二甲基-乙
胺， 和 多柔比 星(doxorubicin)
Akti-1/2，HPPD，和雷帕霉素(rapamycin)。
抗生素，拓扑异构酶抑制剂，抗体，光敏剂和激酶抑制剂。化疗剂包括用在“靶向疗法”
和常规化疗中的化合物。化疗剂的实例包括：erlotinib( Genentech/
OSI Pharm.)，多西 他 塞(docetaxel)( Sanofi-Aventis)，5-FU( 氟
尿嘧啶(fluorouracil)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，CAS No.51-21-8)，吉西他滨
(gemcitabine)( Lilly)，PD-0325901(CAS No.391210-10-9，Pfizer)，
顺铂(cisplatin)(顺式-二胺，二氯铂(II)(cis-diamine，dichloroplatinum(II))，
CAS No.15663-27-1)，卡铂(carboplatin)(CAS No.41575-94-4)，紫杉醇(paclitaxel)
( Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)，曲 妥 珠 单 抗
(trastuzumab)( Genentech)，替 莫 唑 胺 (temozolomide)(4- 甲
基-5-氧-2，3，4，6，8-五氮杂双环4.3.0]壬-2，7，9-三烯-9-羧酰胺(carboxamide)，
CAS No.85622-93-1， Schering Plough)，他 莫 昔
芬(tamoxifen)((Z)-2-[4-(1，2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N，N-二甲基-乙
胺， 和 多柔比 星(doxorubicin)
Akti-1/2，HPPD，和雷帕霉素(rapamycin)。
[0256] 化疗剂的更多实例包括：奥沙利铂(oxaliplatin)( Sanofi)，硼替佐米(bortezomib)( Millennium Pharm.)，sutent(
SU 11248，Pfizer)，来曲唑(letrozole)( Novartis)，甲磺酸伊马替
尼(imatinib mesylate)( Novartis)，XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，
WO 2007/044515)，ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，Array BioPharma，Astra Zeneca)，
SF-1126(PI3K抑制剂，Semafore Pharmaceuticals)，BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)，
XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)，PTK787/ZK 222584(Novartis)，氟维斯群(fulvestrant)
( AstraZeneca)，亚叶酸(leucovorin)(亚叶酸(folinic acid))，
雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(Sirolimus)， Wyeth)，拉帕替尼
(lapatinib)( GSK572016，Glaxo Smith Kline)，氯那法尼(lonafarnib)
TM
(SARASAR ，SCH 66336，Schering Plough)，索拉非尼(sorafenib)(
BAY43-9006，Bayer Labs)，吉非替尼(gefitinib)( AstraZeneca)，伊立
替康 (irinotecan)( CPT-11，Pfizer)，替 匹 法尼 (tipifarnib)
(ZARNESTRATM，Johnson & Johnson)，ABRAXANETM(无克列莫佛(Cremophor-free))，紫杉
醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，
Il)，凡德他尼(vandetanib)(rINN，ZD6474， AstraZeneca)，苯丁酸氮
芥(chloranmbucil)，AG1478，AG1571(SU 5271；Sugen)，坦 罗 莫 司 (temsirolimus)(
Wyeth)，雷佐生(pazopanib)(GlaxoSmithKline)，坎磷酰胺(canfosfamide)
( Telik)，塞 替 哌(thiotepa)和 环 磷 酰 胺 (cyclosphosphamide)
( )；烷 基 磺 酸 酯(alkyl sulfonates) 如 白 消 安
(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶类(aziridines)
如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)，和乌瑞
替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)
包括六甲蜜胺(altretamine)，曲他胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺
(triethylenephosphoramide)，三乙烯硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramide)和三
羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；acetogenins(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他
辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)；
苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折
来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)
(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包
括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；pancratistatin；匍枝珊
瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁
酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫
司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮 芥
(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、
苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿
嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、
氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司
汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素类，(例
如，加利车霉素(calicheamicin)，加利车霉素γlI和加利车霉素ωIl(Angew Chem.
Intl.Ed.Engl.(1994)33：183-186)；烯二炔蒽环类抗生素(dynemicin)，烯二炔蒽环类
抗生素A(dynemicin A)；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；
埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋
白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、
安曲霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素
C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、
色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、
地 托比 星 (detorubicin)、6-重 氮 基-5-氧-L-正 亮 氨 酸、吗 啉 代 多 柔 比星
(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡
咯啉代多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、
表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素
(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolic
acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、
紫菜霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比
星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素
(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；
抗代谢物类，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，
诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三
甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤
(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类 似物，
诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡
莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿
苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸
如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇
(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药，诸如氨
鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，
诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；aldophosphamide glycoside；
5-氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；
bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺
(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；
epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟脲(hydroxyurea)；
香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美坦生类化合物(maytansinoids)，
诸如美坦生(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；
米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷
司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌
(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；
丙卡巴肼(procarbazine)； 多糖复合物(JHS天然产物，Eugene，OR)；雷佐生
(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细
交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺
(2，2’，2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)(尤其
是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；
长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二
溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；
gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；
塞替哌(thiotepa)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨
蝶呤(methotrexate)；铂类似物如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱
(vinblastine)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌
(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨 (vinorelbine)(
)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉
素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；卡培他滨(capecitabine)(
Roche)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨
酸(difluoromehtylornithine)(DMFO)；维甲类(retinoids)如视黄酸(retinoic acid)；
和上述任一种的药用盐，酸和衍生物。
SU 11248，Pfizer)，来曲唑(letrozole)( Novartis)，甲磺酸伊马替
尼(imatinib mesylate)( Novartis)，XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，
WO 2007/044515)，ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，Array BioPharma，Astra Zeneca)，
SF-1126(PI3K抑制剂，Semafore Pharmaceuticals)，BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)，
XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)，PTK787/ZK 222584(Novartis)，氟维斯群(fulvestrant)
( AstraZeneca)，亚叶酸(leucovorin)(亚叶酸(folinic acid))，
雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(Sirolimus)， Wyeth)，拉帕替尼
(lapatinib)( GSK572016，Glaxo Smith Kline)，氯那法尼(lonafarnib)
TM
(SARASAR ，SCH 66336，Schering Plough)，索拉非尼(sorafenib)(
BAY43-9006，Bayer Labs)，吉非替尼(gefitinib)( AstraZeneca)，伊立
替康 (irinotecan)( CPT-11，Pfizer)，替 匹 法尼 (tipifarnib)
(ZARNESTRATM，Johnson & Johnson)，ABRAXANETM(无克列莫佛(Cremophor-free))，紫杉
醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，
Il)，凡德他尼(vandetanib)(rINN，ZD6474， AstraZeneca)，苯丁酸氮
芥(chloranmbucil)，AG1478，AG1571(SU 5271；Sugen)，坦 罗 莫 司 (temsirolimus)(
Wyeth)，雷佐生(pazopanib)(GlaxoSmithKline)，坎磷酰胺(canfosfamide)
( Telik)，塞 替 哌(thiotepa)和 环 磷 酰 胺 (cyclosphosphamide)
( )；烷 基 磺 酸 酯(alkyl sulfonates) 如 白 消 安
(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶类(aziridines)
如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)，和乌瑞
替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)
包括六甲蜜胺(altretamine)，曲他胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺
(triethylenephosphoramide)，三乙烯硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramide)和三
羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；acetogenins(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他
辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)；
苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折
来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)
(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包
括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；pancratistatin；匍枝珊
瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁
酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫
司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮 芥
(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、
苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿
嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、
氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司
汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素类，(例
如，加利车霉素(calicheamicin)，加利车霉素γlI和加利车霉素ωIl(Angew Chem.
Intl.Ed.Engl.(1994)33：183-186)；烯二炔蒽环类抗生素(dynemicin)，烯二炔蒽环类
抗生素A(dynemicin A)；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；
埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋
白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、
安曲霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素
C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、
色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、
地 托比 星 (detorubicin)、6-重 氮 基-5-氧-L-正 亮 氨 酸、吗 啉 代 多 柔 比星
(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡
咯啉代多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、
表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素
(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolic
acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、
紫菜霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比
星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素
(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；
抗代谢物类，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，
诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三
甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤
(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类 似物，
诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡
莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿
苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸
如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇
(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药，诸如氨
鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，
诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；aldophosphamide glycoside；
5-氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；
bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺
(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；
epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟脲(hydroxyurea)；
香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美坦生类化合物(maytansinoids)，
诸如美坦生(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；
米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷
司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌
(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；
丙卡巴肼(procarbazine)； 多糖复合物(JHS天然产物，Eugene，OR)；雷佐生
(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细
交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺
(2，2’，2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)(尤其
是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；
长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二
溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；
gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；
塞替哌(thiotepa)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨
蝶呤(methotrexate)；铂类似物如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱
(vinblastine)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌
(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨 (vinorelbine)(
)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉
素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；卡培他滨(capecitabine)(
Roche)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨
酸(difluoromehtylornithine)(DMFO)；维甲类(retinoids)如视黄酸(retinoic acid)；
和上述任一种的药用盐，酸和衍生物。
[0257] 下述也包括在“化疗剂”的定义中：(i)抗激素剂，其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用如抗-雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，包括，例如他莫昔芬
(tamoxifen)(包括 枸橼酸他莫昔芬(tamoxifen citrate))、雷洛昔
芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、
keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和 (枸橼酸托瑞米
芬(toremifene))；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中的雌激素产生，
如例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、 (醋酸甲地孕酮
(megestrol acetate))、 (依西美坦(exemestane)；Pfizer)、福美坦
(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、 (伏氯唑(vorozole))、
(来 曲唑 (letrozole)，Novartis)和 (阿 那 曲唑 (anastrozole)；
AstraZeneca)；(iii)抗-雄激素如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡
鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他
滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂如MEK
抑制剂(WO2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制在涉
及异常细胞增殖的信号传导途径中基因的表达的那些，例如PKC-α，Raf和H-Ras，如奥
利美生(oblimersen)( Genta Inc.)；(vii)核酶如VEGF表达抑制
剂(例如， )和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗如基因治疗疫苗，例如
和 拓扑异构酶
1抑制剂如 (ix)抗生血管药剂如贝伐珠单抗
(bevacizumab)( Genentech)和上述任一种的药用盐、酸或衍生物。
(tamoxifen)(包括 枸橼酸他莫昔芬(tamoxifen citrate))、雷洛昔
芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、
keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和 (枸橼酸托瑞米
芬(toremifene))；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中的雌激素产生，
如例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、 (醋酸甲地孕酮
(megestrol acetate))、 (依西美坦(exemestane)；Pfizer)、福美坦
(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、 (伏氯唑(vorozole))、
(来 曲唑 (letrozole)，Novartis)和 (阿 那 曲唑 (anastrozole)；
AstraZeneca)；(iii)抗-雄激素如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡
鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他
滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂如MEK
抑制剂(WO2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制在涉
及异常细胞增殖的信号传导途径中基因的表达的那些，例如PKC-α，Raf和H-Ras，如奥
利美生(oblimersen)( Genta Inc.)；(vii)核酶如VEGF表达抑制
剂(例如， )和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗如基因治疗疫苗，例如
和 拓扑异构酶
1抑制剂如 (ix)抗生血管药剂如贝伐珠单抗
(bevacizumab)( Genentech)和上述任一种的药用盐、酸或衍生物。
[0258] 下述也包括在“化疗剂”的定义中：治疗性抗体如阿伦珠单抗(alemtuzumab)(Campath)，贝伐珠单抗(bevacizumab)( Genentech)；西妥昔单抗
(cetuximab)( Imclone)；帕尼 单抗(panitumumab)(
Amgen)，利妥昔单抗(rituximab)( Genentech/Biogen Idec)，培妥
珠 单 抗 (pertuzumab)(OMNITARGTM，2C4，Genentech)，曲 妥 珠 单 抗 (trastuzumab)( Genentech)，托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar，Corixia)，和抗体药物
缀合物，吉妥珠单抗奥佐米星( Wyeth)。
(cetuximab)( Imclone)；帕尼 单抗(panitumumab)(
Amgen)，利妥昔单抗(rituximab)( Genentech/Biogen Idec)，培妥
珠 单 抗 (pertuzumab)(OMNITARGTM，2C4，Genentech)，曲 妥 珠 单 抗 (trastuzumab)( Genentech)，托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar，Corixia)，和抗体药物
缀合物，吉妥珠单抗奥佐米星( Wyeth)。
[0259] “生长抑制剂”在用于本文时是指在体外或在体内抑制细胞生长，尤其是抑制表达FcRH5的癌细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期表达
FcRH5细胞百分数的化合物或组合物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进展(在除
S期以外的阶段)的药剂，诸如，诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括
长春花类(vincas)(例如，长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类
(taxanes)和拓扑异构酶II抑制剂如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、
柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些使G1
停滞的药剂还连带使S-期停滞，例如，DNA烷化剂诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松
(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲
氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。进一步的信息可以见
Murakami等，The Molecular Basis of Cancer(癌症的分子基础)，Mendelsohn和Israel，
编，第1章，题目为″Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs(细
胞周期调控、癌基因和抗肿瘤药物)″(WB Saunders：Philadelphia，1995)、特别是见第13
页。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)均是来源于紫杉树(yew tree)的抗癌药。来源于欧
洲紫杉的多西他赛( Rhone-Poulenc Rorer)，是紫杉醇(
Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体到微
管的组装，并且通过防止解聚而稳定微管，这导致对细胞中有丝分裂的抑制。
FcRH5细胞百分数的化合物或组合物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进展(在除
S期以外的阶段)的药剂，诸如，诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括
长春花类(vincas)(例如，长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类
(taxanes)和拓扑异构酶II抑制剂如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、
柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些使G1
停滞的药剂还连带使S-期停滞，例如，DNA烷化剂诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松
(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲
氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。进一步的信息可以见
Murakami等，The Molecular Basis of Cancer(癌症的分子基础)，Mendelsohn和Israel，
编，第1章，题目为″Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs(细
胞周期调控、癌基因和抗肿瘤药物)″(WB Saunders：Philadelphia，1995)、特别是见第13
页。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)均是来源于紫杉树(yew tree)的抗癌药。来源于欧
洲紫杉的多西他赛( Rhone-Poulenc Rorer)，是紫杉醇(
Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体到微
管的组装，并且通过防止解聚而稳定微管，这导致对细胞中有丝分裂的抑制。
[0260] “多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环霉素抗生素。多柔比星的化学全称是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏糖-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四
氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮(naphthacenedione)。
氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮(naphthacenedione)。
[0261] 术语“细胞因子”是一般性术语，指由一个细胞群释放的对另一个细胞起细胞间调节剂作用的蛋白。此种细胞因子的实例是淋巴细胞因子(1ymphokines)、单核细胞因子
(monokines)和传统的多肽激素。细胞因子中包括的是生长激素如人生长激素、N-甲硫氨
酰基人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝细胞生
长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒氏管抑
制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素(inhibin)；
激活蛋白(activin)；血管内皮生长因子；整联蛋白(integrin)；血小板生成素(TPO)；神
经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)如TGF-α和TGF-β；胰岛素
样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干
扰素如干扰素-α、-β和-γ，集落刺激因子(CSFs)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨
噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(ILs)如IL-1、IL-1α、IL-2、
IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；
和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。当用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来
源或来自重组细胞培养物的蛋白，以及天然序列细胞因子的生物活性等价物
(monokines)和传统的多肽激素。细胞因子中包括的是生长激素如人生长激素、N-甲硫氨
酰基人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝细胞生
长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒氏管抑
制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素(inhibin)；
激活蛋白(activin)；血管内皮生长因子；整联蛋白(integrin)；血小板生成素(TPO)；神
经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)如TGF-α和TGF-β；胰岛素
样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干
扰素如干扰素-α、-β和-γ，集落刺激因子(CSFs)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨
噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(ILs)如IL-1、IL-1α、IL-2、
IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；
和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。当用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来
源或来自重组细胞培养物的蛋白，以及天然序列细胞因子的生物活性等价物
[0263] 术语“细胞内代谢物”指在细胞内由关于抗体-药物缀合物(ADC)的代谢过程或反应得到的化合物。代谢过程或反应可以是酶促过程，如ADC的肽接头的蛋白水解分解，或
官能团(如腙、酯或酰胺)的水解。细胞内代谢物包括，但不限于，在进入、扩散入、摄取入
或转运入细胞后经历了细胞内分解的抗体和游离药物。
官能团(如腙、酯或酰胺)的水解。细胞内代谢物包括，但不限于，在进入、扩散入、摄取入
或转运入细胞后经历了细胞内分解的抗体和游离药物。
[0264] 术语“细胞内分解的”和“细胞内分解”指在细胞内关于抗体-药物缀合物(ADC)的代谢过程或反应，其中在药物结构部分(D)和抗体(Ab)之间的共价连接，即接头断裂，导
致在细胞内的游离药物与抗体解离。由此，ADC分解的结构部分成为细胞内代谢物。
致在细胞内的游离药物与抗体解离。由此，ADC分解的结构部分成为细胞内代谢物。
[0265] 术语″生物利用度″指施用于患者的给定量的药物的身体利用度(即，血液/血浆水平)。生物利用度是一种绝对术语，指对药物从施用的剂型达到全身循环的时间(速
率)和总量(程度)二者的测量。
率)和总量(程度)二者的测量。
[0266] 术语“细胞毒性活性”指ADC或ADC的细胞内代谢物的细胞杀伤、细胞生长抑制或生长抑制作用。细胞毒性活性可以表示为IC50值，这是一半细胞存活的每单位体积的浓度
(摩尔或质量)。
(摩尔或质量)。
[0267] 术语″烷基″用于本文时指1-12个碳原子(C1-C12)的饱和直链或支链单价烃原子团，其中所述烷基原子团可以任选地独立地被一个或多个下述取代基取代。在另一个实
施方案中，烷基原子团是1-8个碳原子(C1-C8)，或1-6个碳原子(C1-C6)。烷基的实例包括，
但不限于：甲基(Me，-CH3)，乙基(Et，-CH2CH3)，1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH2CH2CH3)，2-丙基(i-Pr，异丙基，-CH(CH3)2)，1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH2CH2CH2CH3)，2-甲基-1-丙基(i-Bu，异丁基，-CH2CH(CH3)2)，2-丁基(s-Bu，仲丁基，-CH(CH3)CH2CH3)，2-甲基-2-丙基(t-Bu，叔丁基，-C(CH3)3)，1-戊基(正戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)，2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)，3-戊基(-CH(CH2CH3)2)，2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)，3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)，
3-甲 基 -1-丁 基(-CH2CH2CH(CH3)2)，2- 甲 基-1- 丁 基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)，1-己 基
(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)，3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))，
2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)，3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)，4-甲
基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)，3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)，2-甲基-3-戊
基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)，2，3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)，3，3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3，1-庚基，1-辛基，等。
施方案中，烷基原子团是1-8个碳原子(C1-C8)，或1-6个碳原子(C1-C6)。烷基的实例包括，
但不限于：甲基(Me，-CH3)，乙基(Et，-CH2CH3)，1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH2CH2CH3)，2-丙基(i-Pr，异丙基，-CH(CH3)2)，1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH2CH2CH2CH3)，2-甲基-1-丙基(i-Bu，异丁基，-CH2CH(CH3)2)，2-丁基(s-Bu，仲丁基，-CH(CH3)CH2CH3)，2-甲基-2-丙基(t-Bu，叔丁基，-C(CH3)3)，1-戊基(正戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)，2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)，3-戊基(-CH(CH2CH3)2)，2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)，3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)，
3-甲 基 -1-丁 基(-CH2CH2CH(CH3)2)，2- 甲 基-1- 丁 基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)，1-己 基
(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)，3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))，
2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)，3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)，4-甲
基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)，3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)，2-甲基-3-戊
基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)，2，3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)，3，3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3，1-庚基，1-辛基，等。
[0268] 术语″烯基″指具有至少一个不饱和位点(即碳-碳，sp2双键)的2-8个碳原子(C2-C8)的直链或支链单价烃原子团，其中烯基原子团可以任选地独立地被一个或多个本文
所述的取代基取代，并且包括具有“顺式”和“反式”取向，或备选地，“E”和“Z”取向的原子团。实例包括，但不限于，乙烯基(ethylenyl)或“乙烯基(vinyl)”(-CH＝CH2)，烯丙基
(-CH2CH＝CH2)等。
所述的取代基取代，并且包括具有“顺式”和“反式”取向，或备选地，“E”和“Z”取向的原子团。实例包括，但不限于，乙烯基(ethylenyl)或“乙烯基(vinyl)”(-CH＝CH2)，烯丙基
(-CH2CH＝CH2)等。
[0269] 术语“炔基”指具有至少一个不饱和位点(即碳-碳，sp三键)的2-8个碳原子(C2-C8)的直链或支链单价烃原子团，其中所述炔基原子团可以任选 地独立地被一个
或多个本文所述的取代基取代。实例包括，但不限于，乙炔基(-C≡CH)，丙炔基(炔丙
基，-CH2C≡CH)等。
或多个本文所述的取代基取代。实例包括，但不限于，乙炔基(-C≡CH)，丙炔基(炔丙
基，-CH2C≡CH)等。
[0270] 术语″碳环(carbocycle)″，″碳环基″，″碳环(carbocyclic ring)″和″环烷基″指单价非芳香的，饱和的或部分不饱和的环，其作为单环具有3-12个碳原子
(C3-C12)或作为双环具有7-12个碳原子。具有7-12个碳原子的二环碳环可以例如作为二
环[4，5]，[5，5]，[5，6]或[6，6]系统排列，并且具有9或10个环原子的二环碳环可以作为二环[5，6]或[6，6]系统排列，或作为桥连系统排列，如二环[2.2.1]庚烷，二环[2.2.2]
辛烷和二环[3.2.2]壬烷。单环碳环的实例包括，但不限于，环丙基，环丁基，环戊基，1-环戊-1-烯基，1-环戊-2-烯基，1-环戊-3-烯基，环己基，1-环己-1-烯基，1-环己-2-烯
基，1-环己-3-烯基，环己二烯基，环庚基，环辛基，环壬基，环癸基，环十一烷基，环十二烷基等。
(C3-C12)或作为双环具有7-12个碳原子。具有7-12个碳原子的二环碳环可以例如作为二
环[4，5]，[5，5]，[5，6]或[6，6]系统排列，并且具有9或10个环原子的二环碳环可以作为二环[5，6]或[6，6]系统排列，或作为桥连系统排列，如二环[2.2.1]庚烷，二环[2.2.2]
辛烷和二环[3.2.2]壬烷。单环碳环的实例包括，但不限于，环丙基，环丁基，环戊基，1-环戊-1-烯基，1-环戊-2-烯基，1-环戊-3-烯基，环己基，1-环己-1-烯基，1-环己-2-烯
基，1-环己-3-烯基，环己二烯基，环庚基，环辛基，环壬基，环癸基，环十一烷基，环十二烷基等。
[0271] ″芳基″意为通过从母体芳香环系统的一个碳原子去除一个氢原子衍生的6-20个碳原子(C6-C20)的单价芳香烃原子团。一些芳基在示例性结构中以″Ar″表示。芳基
包括二环原子团，所述二环原子团包括与饱和的，部分不饱和的环，或芳香碳环稠合的芳香
环。典型的芳基包括，但不限于，衍生自下述的原子团：苯(苯基)，取代的苯，萘，蒽，联苯基，茚基，茚满基，1，2-二氢萘，1，2，3，4-四氢萘基等。芳基任选地独立地被一个或多个本文所述的取代基取代。
包括二环原子团，所述二环原子团包括与饱和的，部分不饱和的环，或芳香碳环稠合的芳香
环。典型的芳基包括，但不限于，衍生自下述的原子团：苯(苯基)，取代的苯，萘，蒽，联苯基，茚基，茚满基，1，2-二氢萘，1，2，3，4-四氢萘基等。芳基任选地独立地被一个或多个本文所述的取代基取代。
[0272] 术语″杂环，″″杂环基″和″杂环″在本文可交互的使用，并且指饱和的或部分不饱和的(即在环中具有一个或多个双键和/或三键)的3-20个环原子的碳环原子团，
其中至少一个环原子是选自氮、氧、磷和硫的杂原子，余下的环原子是C，其中一个或多个环原子任选地独立地被一个或多个下述取代基取代。杂环可以是具有3-7个环成员的单环
(2-6碳原子和1-4个选自N，O，P，和S的杂原子)或具有7-10个环成员的二环(4-9个碳原
子和1-6个选自N，O，P，和S的杂原子)，例如二环[4，5]，[5，5]，[5，6]，或[6，6]系统。杂环在Paquette，Leo A.；″Principles of Modern Heterocyclic Chemistry(现代杂环化学
原理)″(W.A.Benjamin，New York，1968)，具体地第1，3，4，6，7，和9章；″The Chemistry of Heterocyclic Compounds，A series of Monographs(杂环化合物的化学原理，一系列
专题文章)″(John Wiley & Sons，New York， 1950至今)，具体地卷13，14，16，19，和28；
和J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566中描述。“杂环基”还包括这样的原子团，其中杂环原子
团与饱和的、部分不饱和的环，或芳香碳环或杂环稠合。杂环的实例包括，但不限于：吡咯
烷基，四氢呋喃基，二氢呋喃基，四氢噻吩基，四氢吡喃基，二氢吡喃基，四氢硫代吡喃基，哌啶子基，吗啉代，硫代吗啉代，噻噁烷基，哌嗪基，高哌嗪基(homopiperazinyl)，氮杂环丁烷基，氧杂环丁烷基，thietanyl，高哌啶基(homopiperidinyl)，氧杂环庚烷基(oxepanyl)，
thiepanyl，oxazepinyl，二氮杂 基(diazepinyl)，thiazepinyl，2-吡咯啉基，3-吡咯
啉基，二氢吲哚基，2H-吡喃基，4H-吡喃基，二噁烷基，1，3-二氧戊环基，吡唑啉基，二噻烷基(dithianyl)，二硫戊环基，二氢吡喃基，二氢噻吩基，二氢呋喃基，吡唑烷基咪唑啉基，咪唑烷基，3-氮杂二环[3.1.0]己烷基，3-氮杂二环[4.1.0]庚烷基，氮杂二环[2.2.2]己烷
基，3H-吲哚基喹嗪基和N-吡啶基尿素。螺结构部分也包括在该定义的范围内。其中2个
环碳原子被氧(＝O)结构部分取代的杂环基团的实例是嘧啶酮基和1，1-二氧代-硫代吗
啉基。本文的杂环基团任选地独立地被一个或多个本文所述的基团取代。
其中至少一个环原子是选自氮、氧、磷和硫的杂原子，余下的环原子是C，其中一个或多个环原子任选地独立地被一个或多个下述取代基取代。杂环可以是具有3-7个环成员的单环
(2-6碳原子和1-4个选自N，O，P，和S的杂原子)或具有7-10个环成员的二环(4-9个碳原
子和1-6个选自N，O，P，和S的杂原子)，例如二环[4，5]，[5，5]，[5，6]，或[6，6]系统。杂环在Paquette，Leo A.；″Principles of Modern Heterocyclic Chemistry(现代杂环化学
原理)″(W.A.Benjamin，New York，1968)，具体地第1，3，4，6，7，和9章；″The Chemistry of Heterocyclic Compounds，A series of Monographs(杂环化合物的化学原理，一系列
专题文章)″(John Wiley & Sons，New York， 1950至今)，具体地卷13，14，16，19，和28；
和J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566中描述。“杂环基”还包括这样的原子团，其中杂环原子
团与饱和的、部分不饱和的环，或芳香碳环或杂环稠合。杂环的实例包括，但不限于：吡咯
烷基，四氢呋喃基，二氢呋喃基，四氢噻吩基，四氢吡喃基，二氢吡喃基，四氢硫代吡喃基，哌啶子基，吗啉代，硫代吗啉代，噻噁烷基，哌嗪基，高哌嗪基(homopiperazinyl)，氮杂环丁烷基，氧杂环丁烷基，thietanyl，高哌啶基(homopiperidinyl)，氧杂环庚烷基(oxepanyl)，
thiepanyl，oxazepinyl，二氮杂 基(diazepinyl)，thiazepinyl，2-吡咯啉基，3-吡咯
啉基，二氢吲哚基，2H-吡喃基，4H-吡喃基，二噁烷基，1，3-二氧戊环基，吡唑啉基，二噻烷基(dithianyl)，二硫戊环基，二氢吡喃基，二氢噻吩基，二氢呋喃基，吡唑烷基咪唑啉基，咪唑烷基，3-氮杂二环[3.1.0]己烷基，3-氮杂二环[4.1.0]庚烷基，氮杂二环[2.2.2]己烷
基，3H-吲哚基喹嗪基和N-吡啶基尿素。螺结构部分也包括在该定义的范围内。其中2个
环碳原子被氧(＝O)结构部分取代的杂环基团的实例是嘧啶酮基和1，1-二氧代-硫代吗
啉基。本文的杂环基团任选地独立地被一个或多个本文所述的基团取代。
[0273] 术语″杂芳基″指5-，6-，或7-元环的单价芳香原子团，并且包括5-20个原子的稠合的环系统(其中至少一个是芳香环系统)，包含一个或多个独立地选自氮、氧和硫
的杂原子。杂芳基的实例是吡啶基(包括，例如，2-羟基吡啶基)，咪唑基，咪唑吡啶基，嘧
啶基(包括，例如4-羟基嘧啶基)，吡唑基，三唑基，吡嗪基，四唑基，呋喃基，噻吩基，异噁唑基，噻唑基，噁唑基，异噻唑基，吡咯基，喹啉基，异喹啉基，吲哚基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，噌啉基(cinnolinyl)，吲唑基(indazolyl)，吲嗪基(indolizinyl)，2，3-二氮杂萘基
(phthalazinyl)，哒嗪基(pyridazinyl)，三嗪基(triazinyl)，异吲哚基(isoindolyl)，
蝶啶基(pteridinyl)，嘌呤基(purinyl)，噁二唑基(oxadiazolyl)，三唑基(triazolyl)，
噻二唑基(thiadiazolyl)，噻二唑基(thiadiazolyl)，呋咱基(furazanyl)，苯并呋咱基
(benzofurazanyl)，苯丙噻吩基(benzothiophenyl)，苯丙噻唑基(benzothiazolyl)，苯丙
噁唑基(benzoxazolyl)，喹唑啉基(quinazolinyl)，喹噁啉基(quinoxalinyl)，1，5-二氮
杂萘基(naphthyridinyl)和呋喃基吡啶基(furopyridinyl)。杂芳基任选地独立地被一个
或多个本文所述的取代基取代。
的杂原子。杂芳基的实例是吡啶基(包括，例如，2-羟基吡啶基)，咪唑基，咪唑吡啶基，嘧
啶基(包括，例如4-羟基嘧啶基)，吡唑基，三唑基，吡嗪基，四唑基，呋喃基，噻吩基，异噁唑基，噻唑基，噁唑基，异噻唑基，吡咯基，喹啉基，异喹啉基，吲哚基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，噌啉基(cinnolinyl)，吲唑基(indazolyl)，吲嗪基(indolizinyl)，2，3-二氮杂萘基
(phthalazinyl)，哒嗪基(pyridazinyl)，三嗪基(triazinyl)，异吲哚基(isoindolyl)，
蝶啶基(pteridinyl)，嘌呤基(purinyl)，噁二唑基(oxadiazolyl)，三唑基(triazolyl)，
噻二唑基(thiadiazolyl)，噻二唑基(thiadiazolyl)，呋咱基(furazanyl)，苯并呋咱基
(benzofurazanyl)，苯丙噻吩基(benzothiophenyl)，苯丙噻唑基(benzothiazolyl)，苯丙
噁唑基(benzoxazolyl)，喹唑啉基(quinazolinyl)，喹噁啉基(quinoxalinyl)，1，5-二氮
杂萘基(naphthyridinyl)和呋喃基吡啶基(furopyridinyl)。杂芳基任选地独立地被一个
或多个本文所述的取代基取代。
[0274] 杂环或杂芳基可以是碳(碳-连接的)，或氮(氮连接)结合的，如果这是可能的话。例如，但不限于，碳结合的杂环或杂芳基在吡啶的2，3，4，5或6位置，在哒嗪的3，4，
5或6位置，在嘧啶的2，4，5或6位置，在吡嗪的2，3，5或6位置，在呋喃、四氢呋喃、噻吩
(thiofuran)、噻吩(thiophene)、吡咯或四氢吡咯的2，3，4或5位置，在噁唑、咪唑或噻唑的
2，4或5位置，在异噁唑、吡唑或异噻唑的3，4或5位置，在氮丙啶的2或3位置，在氮杂环
丁烷的2，3或4位置，在喹啉的2，3，4，5，6，7或8位置或在异喹啉的1，3，4，5，6，7或8位置结合。
5或6位置，在嘧啶的2，4，5或6位置，在吡嗪的2，3，5或6位置，在呋喃、四氢呋喃、噻吩
(thiofuran)、噻吩(thiophene)、吡咯或四氢吡咯的2，3，4或5位置，在噁唑、咪唑或噻唑的
2，4或5位置，在异噁唑、吡唑或异噻唑的3，4或5位置，在氮丙啶的2或3位置，在氮杂环
丁烷的2，3或4位置，在喹啉的2，3，4，5，6，7或8位置或在异喹啉的1，3，4，5，6，7或8位置结合。
[0275] 例如，但不限于，氮结合的杂环或杂芳基在氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位置，异吲哚或异二氢吲哚的2位置，吗啉的4位置，和咔唑或β-咔啉的9位置结合。
[0276] ″亚烷基”指1-18个碳原子的饱和的、支链或直链或环状烃原子团，并且其具有两个通过从母体烷烃的相同或两个不同的碳原子去除两个氢原子得到的单价原子团中
心。典型的亚烷基原子团包括，但不限于：亚甲基(-CH2-)1，2-乙基(-CH2CH2-)，1，3-丙基(-CH2CH2CH2-)，1，4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。
心。典型的亚烷基原子团包括，但不限于：亚甲基(-CH2-)1，2-乙基(-CH2CH2-)，1，3-丙基(-CH2CH2CH2-)，1，4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。
[0277] “C1-C10亚烷基”是式-(CH2)1-10-的直链、饱和的烃基团。C1-C10亚烷基的实例包括亚甲基、亚乙基、1，2-亚丙基、亚丁基、戊二烯亚戊基、亚己基、亚庚基(heptylene)、亚辛基(ocytylene)、亚壬基(nonylene)和亚癸基(decalene)。
[0278] “亚烯基”指2-18个碳原子的不饱和、支链或直链或环状烃原子团，并且其具有两个通过从母体烯烃的相同的或两个不同的碳原子去除两个氢原子得到的单价原子团中心。
典型的亚烯基原子团包括，但不限于：1，2-亚乙基(-CH＝CH-)。
典型的亚烯基原子团包括，但不限于：1，2-亚乙基(-CH＝CH-)。
[0279] “亚炔基(alkynylene)”指2-18个碳原子的不饱和、支链或直链或环状烃原子团，并且其具有两个通过从母体炔烃的相同的或两个不同的碳原子去除两个氢原子得到的单
价原子团中心。典型的亚炔基原子团包括，但不限于：乙炔(-C≡C-)，炔丙基(-CH2C≡C-)
和4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
价原子团中心。典型的亚炔基原子团包括，但不限于：乙炔(-C≡C-)，炔丙基(-CH2C≡C-)
和4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
[0280] “亚芳基”是具有两个共价键的芳基，并且可以以邻位、间位或对位构型存在，如在下述结构中所显示的：
[0281]
[0282] 其中苯基可以未被取代或被至多4个基团取代，所述基团包括，但不限于：-C1-C8烷基，-O-(C1-C8烷基)，-芳基，-C(O)R’，-OC(O)R’，-C(O)OR’，-C(O)NH2，-C(O)NHR’，-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)R’，-OH，-卤素，-N3，-NH2，-NH(R’)，-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立地选自H，-C1-C8烷基和芳基。
[0283] ″芳烷基″指这样的无环烷基原子团，其中结合于碳原子(典型地是末端的碳原3
子或sp 碳原子)的一个氢原子被芳基原子团取代。典型的芳烷基包括，但不限于：苄基、
2-苯基乙烷-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙烷-1-基，2-萘基乙烯-1-基、
萘并苄基、2-萘并苯基乙烷-1-基等。芳烷基包含6-20个碳原子，例如芳烷基的烷基结构
部分(包括烷基、烯基或炔基)是1-6个碳原子并且芳基结构部分是5-14个碳原子。
子或sp 碳原子)的一个氢原子被芳基原子团取代。典型的芳烷基包括，但不限于：苄基、
2-苯基乙烷-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙烷-1-基，2-萘基乙烯-1-基、
萘并苄基、2-萘并苯基乙烷-1-基等。芳烷基包含6-20个碳原子，例如芳烷基的烷基结构
部分(包括烷基、烯基或炔基)是1-6个碳原子并且芳基结构部分是5-14个碳原子。
[0284] ″杂芳基烷基″指这样的无环烷基原子团，其中结合于碳原子(典型地末端碳原3
子或sp 碳原子)的一个氢原子被杂芳基原子团取代。典型的杂芳基烷基包括，但不限于：
2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基等。杂芳基烷基包含6-20个碳原子和1-3个选自N，O，
P和S的杂原子，例如杂芳基烷基的烷基结构部分(包括烷基、烯基或炔基)是1-6个碳原
子，并且杂芳基结构部分是5-14个碳原子。杂芳基烷基的杂芳基结构部分可以是具有3-7
个环成员的单环(2-6个碳原子)或具有7-10个环成员的双环(4-9个碳原子，和1-3个选
自N，O，P和S的杂原子)，例如二环[4，5]，[5，5]，[5，6]或[6，6]系统。
子或sp 碳原子)的一个氢原子被杂芳基原子团取代。典型的杂芳基烷基包括，但不限于：
2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基等。杂芳基烷基包含6-20个碳原子和1-3个选自N，O，
P和S的杂原子，例如杂芳基烷基的烷基结构部分(包括烷基、烯基或炔基)是1-6个碳原
子，并且杂芳基结构部分是5-14个碳原子。杂芳基烷基的杂芳基结构部分可以是具有3-7
个环成员的单环(2-6个碳原子)或具有7-10个环成员的双环(4-9个碳原子，和1-3个选
自N，O，P和S的杂原子)，例如二环[4，5]，[5，5]，[5，6]或[6，6]系统。
[0285] 术语“前体药物”用在本申请中是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其较母体药物对肿瘤细胞的细胞毒性更小并且能够被酶活化或转化为更具活性的母体形
式。参见，例如，Wilman，″Prodrugs in Cancer Chemotherapy(癌症化疗中的前体药
物)″Biochemical Society Transactions(生物化学学会学报)，14，第375-382页，615th
Meeting Belfast(1986)和 Stella等，″Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted
Drug Delivery(前体药物：靶向药物递送的化学方法)″Directed Drug Delivery(定向
药物递送)，Borchardt等，(编辑)，第247-267页，Humana Press(1985)。本发明的前体药
物包括，但不限于，含磷酸酯(盐)的前体药物，含硫代磷酸酯(盐)的前体药物，含硫酸酯
(盐)的前体药物，含肽的前体药物，D-氨基酸修饰的前体药物，糖基化前体药物，含β-内
酰胺的前体药物，含任选取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代的苯基乙酰胺的前
体药物，5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物，其可以被转化为更具活性的无细胞毒性的
药物。可以被衍生成用于本发明的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括，但不限于，上
述那些化疗剂。
式。参见，例如，Wilman，″Prodrugs in Cancer Chemotherapy(癌症化疗中的前体药
物)″Biochemical Society Transactions(生物化学学会学报)，14，第375-382页，615th
Meeting Belfast(1986)和 Stella等，″Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted
Drug Delivery(前体药物：靶向药物递送的化学方法)″Directed Drug Delivery(定向
药物递送)，Borchardt等，(编辑)，第247-267页，Humana Press(1985)。本发明的前体药
物包括，但不限于，含磷酸酯(盐)的前体药物，含硫代磷酸酯(盐)的前体药物，含硫酸酯
(盐)的前体药物，含肽的前体药物，D-氨基酸修饰的前体药物，糖基化前体药物，含β-内
酰胺的前体药物，含任选取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代的苯基乙酰胺的前
体药物，5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物，其可以被转化为更具活性的无细胞毒性的
药物。可以被衍生成用于本发明的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括，但不限于，上
述那些化疗剂。
[0286] “代谢物”是通过特定化合物或其盐在体内的代谢产生的产物。化合物的代谢物可以使用本领域已知的常规技术鉴定并且它们的活性可以使用如本文所述的那些的测试确
定。所述产物可以例如由所施用化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺作用、酯化作用、脱酯化作用(deesterification)、酶促分解等产生。因此，本发明包括本发明化合物的代谢
物，包括通过这样的方法产生的化合物，所述方法包括使本发明的化合物与哺乳动物接触
足以产生其代谢产物的时间阶段。
定。所述产物可以例如由所施用化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺作用、酯化作用、脱酯化作用(deesterification)、酶促分解等产生。因此，本发明包括本发明化合物的代谢
物，包括通过这样的方法产生的化合物，所述方法包括使本发明的化合物与哺乳动物接触
足以产生其代谢产物的时间阶段。
[0287] “脂质体”是由用于将药物递送到哺乳动物的各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小泡。脂质体的成分通常以双分子层结构排列，类似于生物膜的脂质排列。
[0288] “接头”指包含将抗体共价连接于药物结构部分的共价键或原子链的化学结构部分。在多种实施方案中，接头包括二价原子团如烷基二基(alkyldiyl)、芳基二
基(aryldiyl)、杂芳基二基(heteroaryldiyl)，结构部分如-(CR2)nO(CR2)n-，烷氧基
(alkyloxy)(例如，聚亚乙基氧基，PEG，聚亚甲基氧基)和烷基氨基(例如，聚亚乙基氨
TM
基，Jeffamine )的重复单元；和二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯
(diglycolate)、丙二酸酯和正己酰胺。
基(aryldiyl)、杂芳基二基(heteroaryldiyl)，结构部分如-(CR2)nO(CR2)n-，烷氧基
(alkyloxy)(例如，聚亚乙基氧基，PEG，聚亚甲基氧基)和烷基氨基(例如，聚亚乙基氨
TM
基，Jeffamine )的重复单元；和二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯
(diglycolate)、丙二酸酯和正己酰胺。
[0290] 术语″立体异构体″指具有相同的化学构造，但是关于原子或基团的空 间排列不同的化合物。
[0291] ″非对映异构体″指具有两个以上手性中心并且其分子彼此不是镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质、和反应性。非对映异构体的混合物可以在高分辨率分析方法如电泳和色谱法下分离。
[0292] ″对映异构体″指彼此是不可叠加的镜像的化合物的两种立体异构体。
[0293] 本文使用的立体化学定义和规定通常遵循S.P.Parker，编辑，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(McGraw-Hill化学术语词典)(1984)McGraw-Hill Book
Company，New York；和Eliel，E.和Wilen，S.，Stereochemistry of Organic Compounds(有机化合物的立体化学)(1994)John Wiley & Sons，Inc.，New York。许多有机化合物以光学
活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光(plane-polarized light)的平面的能力。在
描述光学活性化合物时，前缀D和L，或R和S用于指分子关于其手性中心的绝对构型。前
缀d和l或(+)和(-)用于标明化合物的平面偏振光的旋转符号，其中(-)或1意为化合
物是左旋的。前缀是(+)或d的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体
是相同的，除了它们彼此是镜像的。具体的立体异构体也可以被称为对映异构体，并且所述
异构体的混合物通常被称为对映异构体混合物。对映异构体的50∶50的混合物被称为外
消旋混合物或外消旋物，如果在化学反应或过程中不存在立体选择或立体特异性，这是可
能存在的。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”指没有光学活性的两种对映异构体种类的
等摩尔混合物。
Company，New York；和Eliel，E.和Wilen，S.，Stereochemistry of Organic Compounds(有机化合物的立体化学)(1994)John Wiley & Sons，Inc.，New York。许多有机化合物以光学
活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光(plane-polarized light)的平面的能力。在
描述光学活性化合物时，前缀D和L，或R和S用于指分子关于其手性中心的绝对构型。前
缀d和l或(+)和(-)用于标明化合物的平面偏振光的旋转符号，其中(-)或1意为化合
物是左旋的。前缀是(+)或d的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体
是相同的，除了它们彼此是镜像的。具体的立体异构体也可以被称为对映异构体，并且所述
异构体的混合物通常被称为对映异构体混合物。对映异构体的50∶50的混合物被称为外
消旋混合物或外消旋物，如果在化学反应或过程中不存在立体选择或立体特异性，这是可
能存在的。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”指没有光学活性的两种对映异构体种类的
等摩尔混合物。
[0294] “互变异构体”或“互变异构体形式”指不同能量的结构异构体，其通过低能量屏障即可互变。例如，质子互变异构体(也称为质子移变互变异构体)包括通过质子迁移的互变，如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。价互变异构体包括通过一些成键电子的重组的互变。
[0295] 术语″药用盐″用于本文时，指本发明的化合物的药用有机或无机盐。示例性的盐包括，但不限于：硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐(isonicotinate)、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙 胆酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐“甲磺酰”、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和pamoate(即，1，1′-亚甲基-双
(2-羟基-3-萘甲酸盐))盐。药用盐可以涉及包含另外的分子，如乙酸盐离子、琥珀酸盐离
子或其它平衡离子。平衡离子可以是稳定母体化合物的电荷的任何有机或无机结构部分。
另外，药用盐可以在其结构中具有超过一个带电荷的原子。如果多个带电荷的原子是药用
盐的部分，则所述药用盐可以具有多个平衡离子。因此，药用盐可以具有一个或多个带电荷
的原子和/或一个或多个平衡离子。
(2-羟基-3-萘甲酸盐))盐。药用盐可以涉及包含另外的分子，如乙酸盐离子、琥珀酸盐离
子或其它平衡离子。平衡离子可以是稳定母体化合物的电荷的任何有机或无机结构部分。
另外，药用盐可以在其结构中具有超过一个带电荷的原子。如果多个带电荷的原子是药用
盐的部分，则所述药用盐可以具有多个平衡离子。因此，药用盐可以具有一个或多个带电荷
的原子和/或一个或多个平衡离子。
[0296] 如果本发明的化合物是碱，则所需要的药用盐可以通过本领域可获得的任何适当的方法进行制备，例如用无机酸或有机酸处理游离碱，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸等，所述有机酸如乙酸、三氟乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸、α羟酸如柠檬酸或酒石酸、氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸、芳香酸如苯甲酸或肉桂酸、磺酸如对甲苯磺酸或乙
磺酸等。
磺酸等。
[0297] 如果本发明的化合物是酸，需要的药用盐可以通过任何适合的方法，例如用无机碱或有机碱处理游离酸来进行制备，所述碱如胺(伯胺、仲胺或叔胺)，碱金属氢氧化物或
碱土金属氢氧化物等。适合的盐的举例性实例包括，但不限于：衍生自下述的有机盐：氨基
酸如甘氨酸和精氨酸，氨水，伯胺、仲胺和叔胺，和环状胺如哌啶、吗啉和哌嗪，和衍生自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂的无机盐。
碱土金属氢氧化物等。适合的盐的举例性实例包括，但不限于：衍生自下述的有机盐：氨基
酸如甘氨酸和精氨酸，氨水，伯胺、仲胺和叔胺，和环状胺如哌啶、吗啉和哌嗪，和衍生自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂的无机盐。
[0298] 术语“药用”指物质或组合物必须在化学性质上和/或毒理学上与包含制剂的其它成分和/或与用其治疗的哺乳动物相容。
[0299] ″溶剂合物″指一种或多种溶剂分子和本发明的化合物的缔合或复合。形成溶剂合物的溶剂的实例包括，但不限于：水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
术语″水合物″指其中溶剂分子是水的复合物。
术语″水合物″指其中溶剂分子是水的复合物。
[0300] 术语“保护基”指通常用于封闭或保护特定官能度，同时使化合物上的其它官能团反应的取代基。例如，“氨基-保护基”是与氨基连接封闭或保护化合物中的氨基官能
度的取代基。适合的氨基保护基包括乙酰基、三 氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苄氧基羰
基(CBZ)和9-芴基甲氧基羰基(9-fluorenylmethylenoxycarbonyl)(Fmoc)。类似地，“羟
基-保护基”指封闭或保护羟基官能度的羟基的取代基。适当的保护基包括乙酰基和甲硅
烷基。“羧基-保护基”指封闭或保护羧基官能度的羧基的取代基。常规羧基保护基包括
苯基磺酰基乙基、氰基乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲
基，2-(对甲苯磺酰基)乙基，2-(对硝基苯基亚磺酰基)乙基，2-(联苯基膦基)-乙基，硝
基乙基等。对于保护基的一般描述和它们的应用，见T.W.Greene，Protective Groups in
Organic Synthesis(有机合成中的保护基)，John Wiley & Sons，New York，1991。
度的取代基。适合的氨基保护基包括乙酰基、三 氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苄氧基羰
基(CBZ)和9-芴基甲氧基羰基(9-fluorenylmethylenoxycarbonyl)(Fmoc)。类似地，“羟
基-保护基”指封闭或保护羟基官能度的羟基的取代基。适当的保护基包括乙酰基和甲硅
烷基。“羧基-保护基”指封闭或保护羧基官能度的羧基的取代基。常规羧基保护基包括
苯基磺酰基乙基、氰基乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲
基，2-(对甲苯磺酰基)乙基，2-(对硝基苯基亚磺酰基)乙基，2-(联苯基膦基)-乙基，硝
基乙基等。对于保护基的一般描述和它们的应用，见T.W.Greene，Protective Groups in
Organic Synthesis(有机合成中的保护基)，John Wiley & Sons，New York，1991。
[0301] “离去基团”指可以被另外的官能团取代的官能团。某些离去基团是本领域公知的，并且实例包括，但不限于，卤化物(例如，氯化物、溴化物、碘化物)、甲磺酰基(甲磺
酰)、对甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)、三氟甲基甲磺酰基(三氟甲磺酸盐(triflate))和三
氟甲基磺酸酯。
酰)、对甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)、三氟甲基甲磺酰基(三氟甲磺酸盐(triflate))和三
氟甲基磺酸酯。
[0302] 缩写
[0303] 接头组分：
[0304] MC＝6-马来酰亚胺基己酰基
[0305] Val-Cit或“vc”＝缬氨酸-瓜氨酸(在蛋白酶可裂解的接头中的示例性二肽)
[0306] 瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸
[0307] PAB＝对氨基苄氧基羰基(“自分解(self immolative)”接头组分的实例)
[0308] Me-Val-Cit＝N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(其中接头肽键已经被修饰从而防止其被组织蛋白酶B裂解)
[0309] MC(PEG)6-OH＝马来酰亚胺基己酰基-聚乙二醇(可以连接于抗体半胱氨酸)。
[0310] 细胞毒性药物：
[0311] MMAE＝单甲基auristatin E(MW 718)
[0312] MMAF＝auristatin E(MMAE)的变体，在所述药物的C-端具有苯丙氨酸(MW731.5)
[0313] MMAF-DMAEA＝具有以酰胺连接连接于C端苯丙氨酸的DMAEA(二甲基氨基乙胺)的MMAF(MW 801.5)
[0314] MMAF-TEG＝具有与苯丙氨酸酯化的四甘醇的MMAF
[0315] MMAF-NtBu＝N-叔丁基，以酰胺连接于MMAF的C-端
[0316] DM1＝N(2′)-脱乙酰基-N(2′)-(3-巯基-1-氧代丙基)-美坦生(maytansine)
[0317] DM3＝N(2′)-脱乙酰基-N2-(4-巯基-1-氧代戊基)-美坦生
[0318] DM4＝N(2′)-脱乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美坦生
[0319] 另外的缩写如下：AE是auristatin E，Boc是N-(叔丁氧基羰基)，cit是瓜氨酸，dap是罗汉脯氨酸(dolaproine)，DCC是1，3-二环己基碳二亚胺，DCM是二
氯甲烷，DEA是二乙胺，DEAD是二乙基偶氮二羧酸酯，DEPC是二乙基磷酰基氰酸酯
(diethylphosphorylcyanidate)，DIAD是二异丙基偶氮二羧酸酯，DIEA是N，N-二异丙基乙
胺，dil是罗汉异亮氨酸(dolaisoleucine)，DMA是二甲基乙酰胺，DMAP是4-二甲基氨基
吡啶，DME是乙二醇二甲醚(或1，2-二甲氧基乙烷)，DMF是N，N-二甲基甲酰胺，DMSO是
二甲亚砜，doe是dolaphenine，dov是N，N-二甲基缬氨酸，DTNB是5，5’-二硫代双(2-硝
基苯甲酸)，DTPA是二乙烯三胺五乙酸，DTT是二硫苏糖醇，EDCI是1-(3-二甲基氨基丙
基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，EEDQ是2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉，ES-MS是
电雾化质谱法(electrospray mass spectrometry)，EtOAc是乙酸乙酯，Fmoc是N-(9-芴
基甲氧基羰基)，gly是甘氨酸，HATU是O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基
脲鎓六氟磷酸酯，HOBt是1-羟基苯并三唑，HPLC是高压液相色谱(high pressure liquid
chromatography)，ile是异亮氨酸，lys是赖氨酸，MeCN(CH3CN)是乙腈，MeOH是甲醇，Mtr
是4-茴香基联苯基甲基(或4-甲氧基三苯甲基)，nor是(1S，2R)-(+)-降麻黄碱，PBS是
磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)，PEG是聚乙二醇，Ph是苯基，Pnp是对硝基苯基，MC是6-马来
酰亚胺基己酰基，phe是L-苯丙氨酸，PyBrop是溴代tris-吡咯烷磷鎓六氟磷酸酯，SEC是
大小排阻层析法，Su是琥珀酰亚胺，TFA是三氟乙酸，TLC是薄层层析法，UV是紫外线，并且
val是缬氨酸。
氯甲烷，DEA是二乙胺，DEAD是二乙基偶氮二羧酸酯，DEPC是二乙基磷酰基氰酸酯
(diethylphosphorylcyanidate)，DIAD是二异丙基偶氮二羧酸酯，DIEA是N，N-二异丙基乙
胺，dil是罗汉异亮氨酸(dolaisoleucine)，DMA是二甲基乙酰胺，DMAP是4-二甲基氨基
吡啶，DME是乙二醇二甲醚(或1，2-二甲氧基乙烷)，DMF是N，N-二甲基甲酰胺，DMSO是
二甲亚砜，doe是dolaphenine，dov是N，N-二甲基缬氨酸，DTNB是5，5’-二硫代双(2-硝
基苯甲酸)，DTPA是二乙烯三胺五乙酸，DTT是二硫苏糖醇，EDCI是1-(3-二甲基氨基丙
基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，EEDQ是2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉，ES-MS是
电雾化质谱法(electrospray mass spectrometry)，EtOAc是乙酸乙酯，Fmoc是N-(9-芴
基甲氧基羰基)，gly是甘氨酸，HATU是O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基
脲鎓六氟磷酸酯，HOBt是1-羟基苯并三唑，HPLC是高压液相色谱(high pressure liquid
chromatography)，ile是异亮氨酸，lys是赖氨酸，MeCN(CH3CN)是乙腈，MeOH是甲醇，Mtr
是4-茴香基联苯基甲基(或4-甲氧基三苯甲基)，nor是(1S，2R)-(+)-降麻黄碱，PBS是
磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)，PEG是聚乙二醇，Ph是苯基，Pnp是对硝基苯基，MC是6-马来
酰亚胺基己酰基，phe是L-苯丙氨酸，PyBrop是溴代tris-吡咯烷磷鎓六氟磷酸酯，SEC是
大小排阻层析法，Su是琥珀酰亚胺，TFA是三氟乙酸，TLC是薄层层析法，UV是紫外线，并且
val是缬氨酸。
[0320] “游离半胱氨酸氨基酸”指已经被改造到母体抗体中的半胱氨酸氨基酸残基，其具有硫醇官能团(-SH)，并且没有以分子内或分子间二硫化物桥的方式配对。
[0321] 术语“硫醇反应性值”是游离半胱氨酸氨基酸的反应性的定量特征。硫醇反应性值是在半胱氨酸改造的抗体中与硫醇反应性试剂反应的游离半胱氨酸氨基酸的百分比，并
且被转化至最大值为1。例如，在半胱氨酸改造的抗体上的游离半胱氨酸氨基酸以100％的
得率(yield)与硫醇反应性试剂，如生物素-马来酰亚胺试剂反应以形成生物素-标记的
抗体，则其硫醇反应性值为1.0。被改造到相同或不同的母体抗体中的另外的半胱氨酸氨基
酸以80％得率与硫醇反应性试剂反应，则其具有0.8的硫醇反应性值。完全不能与硫醇反
应性试剂反应的被改造到相同或不同母体抗体中的另外的半胱氨酸氨基酸的硫醇反应性
值为0。确定特定半胱氨酸的硫醇反应性值可以通过ELISA测定法、质谱法、液相色谱法、放
射自显影法或另外的定量分析测试法进行。
且被转化至最大值为1。例如，在半胱氨酸改造的抗体上的游离半胱氨酸氨基酸以100％的
得率(yield)与硫醇反应性试剂，如生物素-马来酰亚胺试剂反应以形成生物素-标记的
抗体，则其硫醇反应性值为1.0。被改造到相同或不同的母体抗体中的另外的半胱氨酸氨基
酸以80％得率与硫醇反应性试剂反应，则其具有0.8的硫醇反应性值。完全不能与硫醇反
应性试剂反应的被改造到相同或不同母体抗体中的另外的半胱氨酸氨基酸的硫醇反应性
值为0。确定特定半胱氨酸的硫醇反应性值可以通过ELISA测定法、质谱法、液相色谱法、放
射自显影法或另外的定量分析测试法进行。
[0322] “母体抗体”是包含这样的氨基酸序列的抗体，从所述氨基酸序列一个或多个氨基酸残基被一个或多个半胱氨酸残基取代。母体抗体可以包含天然或野生型序列。母体抗体
可以具有相对于抗体的其它天然形式、野生型形式或修饰形式预先存在的氨基酸序列修饰
(如添加、缺失和/或置换)。母体抗体可以针对目的靶抗原，例如生物学上重要的多肽。还
预期针对非多肽抗原(如肿瘤相关的糖脂抗原，见US 5091178)的抗体。
可以具有相对于抗体的其它天然形式、野生型形式或修饰形式预先存在的氨基酸序列修饰
(如添加、缺失和/或置换)。母体抗体可以针对目的靶抗原，例如生物学上重要的多肽。还
预期针对非多肽抗原(如肿瘤相关的糖脂抗原，见US 5091178)的抗体。
[0323] 表1
[0324]
[0325] 表1(续)
[0326]
[0327] 表1(续)
[0328]
[0329] 表1(续)
[0330]
[0331] 表1(续)
[0332]
[0333] 表1(续)
[0334]
[0335] 表1(续)
[0336]
[0337] 表1(续)
[0338]
[0339] 表1(续)
[0340]
[0341] 表1(续)
[0342]
[0343] 表1(续)
[0344]
[0345] 表1(续)
[0346]
[0347] 表1(续)
[0348]
[0349] 表1(续)
[0350]
[0351] 表1(续)
[0352]
[0353] 表1(续)
[0354]
[0355] 表1(续)
[0356]
[0357] III.本发明的组合物和方法
[0358] 本发明提供抗-FcRH5抗体或其功能片段，和它们用于治疗造血系统肿瘤的方法。
[0359] 在一个方面中，本发明提供结合(优选地特异性地)结合于上述或下述任一种多肽的抗体。任选地，所述抗体是这样的单克隆抗体、抗体片段(包括Fab，Fab′，F(ab′)2，和Fv片段)、双抗体、单结构域抗体、嵌合抗体、人源化的抗体、单链抗体或抗体，其竞争性抑制抗-FcRH5多肽抗体与其各自的抗原表位结合。本发明的抗体可以任选地缀合于生长
抑制剂或细胞毒性剂，如毒素(包括例如auristatin、美坦生类化合物(maytansinoid))、
多拉司他汀衍生物或加利车霉素(Calicheamicin)、抗生素、放射性同位素、溶核酶等。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞或细菌细胞中产生并且优选地诱导与它们结合的细胞的
死亡。对于检测目的，本发明的抗体可以可检测地标记、附着于固体支持物等。
抑制剂或细胞毒性剂，如毒素(包括例如auristatin、美坦生类化合物(maytansinoid))、
多拉司他汀衍生物或加利车霉素(Calicheamicin)、抗生素、放射性同位素、溶核酶等。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞或细菌细胞中产生并且优选地诱导与它们结合的细胞的
死亡。对于检测目的，本发明的抗体可以可检测地标记、附着于固体支持物等。
[0360] 在一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中所述抗体 对FcRH5的单价亲和性(例如，抗体作为Fab片段与FcRH5的亲和性)与鼠抗体的单价亲和性(例如作
为Fab片段的鼠抗体与FcRH5的亲和性)或嵌合抗体的单价亲和性(例如作为Fab片段
的嵌合抗体与FcRH5的亲和性)基本相同，所述鼠抗体或嵌合抗体包含在图9(SEQ ID NO：
18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示的轻链和重链可变结构域序列，或由其组成或基本由其
组成。
为Fab片段的鼠抗体与FcRH5的亲和性)或嵌合抗体的单价亲和性(例如作为Fab片段
的嵌合抗体与FcRH5的亲和性)基本相同，所述鼠抗体或嵌合抗体包含在图9(SEQ ID NO：
18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示的轻链和重链可变结构域序列，或由其组成或基本由其
组成。
[0361] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中所述抗体与FcRH的单价亲和性(例如作为Fab片段的抗体与FcRH5的亲和性)比鼠抗体的单价亲和性(例如作
为Fab片段的鼠抗体与FcRH5的亲和性)或嵌合抗体的单价亲和性(例如作为Fab片段
的嵌合抗体与FcRH5的亲和性)低例如至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，
17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55或60倍，所述鼠抗体或嵌合抗体包含如在图9(SEQ IDNO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻链和重链可变结构域序列，或由其组成或基本
由其组成。
为Fab片段的鼠抗体与FcRH5的亲和性)或嵌合抗体的单价亲和性(例如作为Fab片段
的嵌合抗体与FcRH5的亲和性)低例如至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，
17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55或60倍，所述鼠抗体或嵌合抗体包含如在图9(SEQ IDNO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻链和重链可变结构域序列，或由其组成或基本
由其组成。
[0362] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中所述抗体与FcRH5的单价亲和性(例如作为Fab片段的抗体与FcRH5的亲和性)比鼠抗体的单价亲和性(例如
作为Fab片段的鼠抗体与FcRH5的亲和性)或嵌合抗体的单价亲和性(例如作为Fab片段
的嵌合抗体与FcRH5的亲和性)大例如至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10倍，所述鼠抗体或嵌合抗体包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻链和重链可变结构
域序列，或由其组成或基本由其组成。
作为Fab片段的鼠抗体与FcRH5的亲和性)或嵌合抗体的单价亲和性(例如作为Fab片段
的嵌合抗体与FcRH5的亲和性)大例如至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10倍，所述鼠抗体或嵌合抗体包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻链和重链可变结构
域序列，或由其组成或基本由其组成。
[0363] 在一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体对FcRH5的亲和性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)与以其二价形式存在的鼠
抗体的亲和性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)或以其二价形式存在的嵌合抗体
的亲和性(例如作为Fab片段的嵌合抗体与FcRH5的亲和性)基本相同，所述鼠抗体或嵌
合抗体包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻链和重链可变结构
域序列，或由其组成或基本由其组成。
抗体的亲和性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)或以其二价形式存在的嵌合抗体
的亲和性(例如作为Fab片段的嵌合抗体与FcRH5的亲和性)基本相同，所述鼠抗体或嵌
合抗体包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻链和重链可变结构
域序列，或由其组成或基本由其组成。
[0364] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲 和性)比以其二价形式存在
的鼠抗体的亲和性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)或以其二价形式存在的嵌合
抗体的亲和性(例如作为IgG片段的嵌合抗体与FcRH5的亲和性)低例如至少1，2，3，4，5，
6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55或60倍，所述鼠抗体或嵌合抗体包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻链和重链可
变结构域序列，或由其组成或基本由其组成。
的鼠抗体的亲和性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)或以其二价形式存在的嵌合
抗体的亲和性(例如作为IgG片段的嵌合抗体与FcRH5的亲和性)低例如至少1，2，3，4，5，
6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55或60倍，所述鼠抗体或嵌合抗体包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)中所示轻链和重链可
变结构域序列，或由其组成或基本由其组成。
[0365] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)比以其二价形式存在的
鼠抗体的亲和性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)或以其二价形式存在的嵌合抗
体的亲和性(例如作为IgG片段的嵌合抗体与FcRH5的亲和性)大例如至少1，2，3，4，5，
6，7，8，9或10倍，所述鼠抗体或嵌合抗体包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ IDNO：
20)中所示轻链和重链可变结构域序列，或由其组成或基本由其组成。
鼠抗体的亲和性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)或以其二价形式存在的嵌合抗
体的亲和性(例如作为IgG片段的嵌合抗体与FcRH5的亲和性)大例如至少1，2，3，4，5，
6，7，8，9或10倍，所述鼠抗体或嵌合抗体包含如在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ IDNO：
20)中所示轻链和重链可变结构域序列，或由其组成或基本由其组成。
[0366] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.4Nm。在另一个方
面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和
性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.4nM+/-0.04。
面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和
性(例如作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.4nM+/-0.04。
[0367] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.3nM或更好。在另
一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5
的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.32nM或更好。在另一个方面
中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性
(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.36nM或更好。在另一个方面中，本发明提
供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为
IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.4nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的
抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体
与FcRH5的亲和性)是0.44nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人 源化的抗-FcRH5
抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的
亲和性)是0.48nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以
其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是
0.5nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存
在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)在0.3nM和0.5nM
之间。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗
体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)在0.32nM和0.48nM之
间。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体
与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)在0.36nM和0.44nM之间。
一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5
的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.32nM或更好。在另一个方面
中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性
(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.36nM或更好。在另一个方面中，本发明提
供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为
IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.4nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的
抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体
与FcRH5的亲和性)是0.44nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人 源化的抗-FcRH5
抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的
亲和性)是0.48nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以
其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是
0.5nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存
在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)在0.3nM和0.5nM
之间。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗
体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)在0.32nM和0.48nM之
间。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体
与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)在0.36nM和0.44nM之间。
[0368] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.2nM。在另一个方
面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和
性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.2nM+/-0.02。
面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和
性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.2nM+/-0.02。
[0369] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.1nM或更好。在另
一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5
的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.12nM或更好。在另一个方面
中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性
(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.14nM或更好。在另一个方面中，本发明提
供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为
IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.16nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的
抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体
与FcRH5的亲和性)是0.18nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5
抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲 和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5
的亲和性)是0.2nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中
以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)
是0.22nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形
式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.24nM或
更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗
体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.26nM或更好。在另
一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5
的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.28nM或更好。在另一个方面
中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性
(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.30nM或更好。在另一个方面中，本发明
提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作
为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)在0.1nM和0.3nM之间。在另一个方面中，本发明提供
人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG
的抗体与FcRH5的亲和性)在0.12nM和0.28nM之间。在另一个方面中，本发明提供人源
化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的
抗体与FcRH5的亲和性)在0.14nM和0.26nM之间。在另一个方面中，本发明提供人源化
的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗
体与FcRH5的亲和性)在0.16nM和0.24nM之间。在另一个方面中，本发明提供人源化的
抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体
与FcRH5的亲和性)在0.18nM和0.22nM之间。
一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5
的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.12nM或更好。在另一个方面
中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性
(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.14nM或更好。在另一个方面中，本发明提
供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为
IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.16nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的
抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体
与FcRH5的亲和性)是0.18nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5
抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲 和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5
的亲和性)是0.2nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中
以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)
是0.22nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形
式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.24nM或
更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗
体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.26nM或更好。在另
一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5
的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.28nM或更好。在另一个方面
中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性
(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.30nM或更好。在另一个方面中，本发明
提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作
为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)在0.1nM和0.3nM之间。在另一个方面中，本发明提供
人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG
的抗体与FcRH5的亲和性)在0.12nM和0.28nM之间。在另一个方面中，本发明提供人源
化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的
抗体与FcRH5的亲和性)在0.14nM和0.26nM之间。在另一个方面中，本发明提供人源化
的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗
体与FcRH5的亲和性)在0.16nM和0.24nM之间。在另一个方面中，本发明提供人源化的
抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体
与FcRH5的亲和性)在0.18nM和0.22nM之间。
[0370] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.5nM。在另一个方
面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和
性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.5nM+/-0.1。
面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和
性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.5nM+/-0.1。
[0371] 在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.4nM或更好。在另
一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5
的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.5nM或更好。在另一个方面中，
本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例
如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.6nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人
源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的
抗体与FcRH5的亲和性)是0.7nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5
抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的
亲和性)在0.3nM和0.7nM之间。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，
其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和
性)在0.4nM和0.6nM之间。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中
以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)
在0.5nM和0.55nM之间。
一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5
的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.5nM或更好。在另一个方面中，
本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例
如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)是0.6nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人
源化的抗-FcRH5抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的
抗体与FcRH5的亲和性)是0.7nM或更好。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5
抗体，其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的
亲和性)在0.3nM和0.7nM之间。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，
其中以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和
性)在0.4nM和0.6nM之间。在另一个方面中，本发明提供人源化的抗-FcRH5抗体，其中
以其二价形式存在的抗体与FcRH5的亲和性(例如，作为IgG的抗体与FcRH5的亲和性)
在0.5nM和0.55nM之间。
[0372] 在一个方面中，鼠抗体与FcRH5的单价亲和性与包含图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)的可变结构域序列的Fab片段的结合亲和性基本相同。
[0373] 如本领域中充分确定的，配体与其受体的结合亲和性可以使用各种测定法中的任一种来确定，并且以多种定量值表示。因此，在一个实施方案中，将结合亲和性表示为Kd
值，并且其反映固有的结合亲和性(例如，具有最小化的亲和性作用)。一般地并优选地，结
合亲和性在体外(不管是在无细胞的设置或细胞-相关性设置)测量。如在本文更详细地
描述的，结合亲和性的倍数差异可以根据人源化抗体(例如，以Fab形式存在)单价结合亲
和性值与参照/比较抗体(例如，以Fab形式存在)(例如具有供体高变区序列的鼠抗体)
的单价结合亲和性值的比率进行量化，其中结合亲和性值在类似的测定条件下确定。因此，
在一个实施方案中，结合亲和性的倍数差异作为Fab形式的人源化的抗体的Kd值与所述参
照/比较Fab抗体的Kd值 的比率确定。例如，在一个实施方案中，如果本发明的抗体(A)
的亲和性比参照抗体(M)的亲和性“低3倍”，那么如果A的Kd值是3x，M的Kd值是1x，则
A的Kd与M的Kd的比率将是3∶1。相反地，在一个实施方案中，如果本发明的抗体(C)
的亲和性比参照抗体(R)的亲和性“大3倍”，则如果C的Kd值是1x，R的Kd值是3x，那么
C的Kd与R的Kd的比率将是1∶3。可以将本领域已知的许多测定法(包括本文所述的
那些)用于获得结合亲和性测量，包括，例如，Biacore、放射性免疫测定法(RIA)和ELISA。
值，并且其反映固有的结合亲和性(例如，具有最小化的亲和性作用)。一般地并优选地，结
合亲和性在体外(不管是在无细胞的设置或细胞-相关性设置)测量。如在本文更详细地
描述的，结合亲和性的倍数差异可以根据人源化抗体(例如，以Fab形式存在)单价结合亲
和性值与参照/比较抗体(例如，以Fab形式存在)(例如具有供体高变区序列的鼠抗体)
的单价结合亲和性值的比率进行量化，其中结合亲和性值在类似的测定条件下确定。因此，
在一个实施方案中，结合亲和性的倍数差异作为Fab形式的人源化的抗体的Kd值与所述参
照/比较Fab抗体的Kd值 的比率确定。例如，在一个实施方案中，如果本发明的抗体(A)
的亲和性比参照抗体(M)的亲和性“低3倍”，那么如果A的Kd值是3x，M的Kd值是1x，则
A的Kd与M的Kd的比率将是3∶1。相反地，在一个实施方案中，如果本发明的抗体(C)
的亲和性比参照抗体(R)的亲和性“大3倍”，则如果C的Kd值是1x，R的Kd值是3x，那么
C的Kd与R的Kd的比率将是1∶3。可以将本领域已知的许多测定法(包括本文所述的
那些)用于获得结合亲和性测量，包括，例如，Biacore、放射性免疫测定法(RIA)和ELISA。
[0374] 在一个方面中，提供结合FcRH5的抗体，其中所述抗体包含：
[0375] (a)至少一个，两个，三个，四个，五个或六个选自由下述各项组成的组的HVRs：
[0376] (i)HVR-L 1，其包含序列KASQNVGSNVA(SEQ ID NO：28)
[0377] (ii)HVR-L2，其包含序列SASYRYS(SEQ ID NO：29)
[0378] (iii)HVR-L3，其包含序列QQYKTWT(SEQ ID NO：30)
[0379] (iv)HVR-H1，其包含序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：37)
[0380] (v)HVR-H2，其包含序列NTYTGEPTYTDDFKG(SEQ IDNO：38)
[0381] (vi)HVR-H3，其包含序列ARRSIPYYYAMDY(SEQ ID NO：39)。
[0382] 在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-L1包含SEQ ID NO：28的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-L2包含SEQ ID NO：29的序列。在一个实施方案中，本发明
的抗体的HVR-L3包含SEQ ID NO：30的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-H1
包含SEQ ID NO：37的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-H2包含SEQ ID NO：
38的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-H3包含SEQ ID NO：39的序列。在一
个实施方案中，包含这些序列(如本文所述的组合)的本发明的抗体是人源化的或人的抗
体。
的抗体的HVR-L3包含SEQ ID NO：30的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-H1
包含SEQ ID NO：37的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-H2包含SEQ ID NO：
38的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-H3包含SEQ ID NO：39的序列。在一
个实施方案中，包含这些序列(如本文所述的组合)的本发明的抗体是人源化的或人的抗
体。
[0383] 在一个方面中，提供结合FcRH5的抗体，其中所述抗体包含
[0384] (a)至少一个，两个，三个，四个，五个或六个选自由下述各项组成的组的HVRs：
[0385] (i)HVR-L1，其包含序列KASQNVGSNVA(SEQ ID NO：28)
[0386] (ii)HVR-L2，其包含序列SASYRYS(SEQ ID NO：29)
[0387] (iii)HVR-L3，其包含序列QQYKTWT(SEQ ID NO：30)
[0388] (iv)HVR-H1，其包含序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：37)
[0389] (v)HVR-H2，其包含序列NTYTGEPTYTDDFKG (SEQ IDNO：38)
[0390] (vi)HVR-H3，其包含序列ARRSIPYYYAMDY(SEQ ID NO：39)；和
[0391] (b)至少一个变体HVR，其中所述变体HVR序列包含在SEQ ID NOs：28，29，30，37，38或39中所示序列的至少一个残基的修饰。在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-L1
包含SEQ ID NO：28的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-L2包含SEQ ID NO：
29的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-L3包含SEQ ID NO：30的序列。在一
个实施方案中，本发明的抗体的HVR-H1包含SEQ ID NO：37的序列。在一个实施方案中，
本发明的抗体的HVR-H2包含SEQ ID NO：38的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的
HVR-H3包含SEQ ID NO：39的序列。在一个实施方案中，包含这些序列(如本文所述的组
合)的本发明的抗体是人源化的或人的抗体。在一个实施方案中，包含这些序列(如本文
所述的组合)的本发明的抗体是人源化的或人的抗体。
包含SEQ ID NO：28的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-L2包含SEQ ID NO：
29的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的HVR-L3包含SEQ ID NO：30的序列。在一
个实施方案中，本发明的抗体的HVR-H1包含SEQ ID NO：37的序列。在一个实施方案中，
本发明的抗体的HVR-H2包含SEQ ID NO：38的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体的
HVR-H3包含SEQ ID NO：39的序列。在一个实施方案中，包含这些序列(如本文所述的组
合)的本发明的抗体是人源化的或人的抗体。在一个实施方案中，包含这些序列(如本文
所述的组合)的本发明的抗体是人源化的或人的抗体。
[0392] 在一个方面中，本发明提供包含一个，两个，三个，四个，五个或六个HVRs的抗体，其中每个HVR包含选自由SEQ ID NOs：28，29，30，37，38或39组成的组的序列，由其组成或基本由其组成。
[0393] 在本发明的抗体中的变体HVRs可以在HVR中具有一个或多个残基的修饰。
[0394] 在一个方面中，本发明提供包含在图9-12中所示的HVR序列的一个，两个，三个，四个，五个或全部。
[0395] 用于宿主受试者的治疗剂优选地在所述受试者中几乎不激发或不激发针对该药剂的免疫原反应。在一个实施方案中，本发明提供这样的药剂。例如，在一个实施方案中，
本发明提供这样的人源化抗体，其在宿主受试者中激发和/或预期激发与包含SEQ ID NO：
18和20的序列的抗体相比实 质上减少水平的人抗-小鼠抗体反应(HAMA)。在另一个实
例中，本发明提供这样的人源化抗体，其激发和/或预期激发最小的人抗-小鼠抗体反应
(HAMA)或不激发人抗-小鼠抗体反应(HAMA)。在一个实例中，本发明的抗体激发在临床可
接受水平或低于临床可接受水平的抗-小鼠抗体反应。
本发明提供这样的人源化抗体，其在宿主受试者中激发和/或预期激发与包含SEQ ID NO：
18和20的序列的抗体相比实 质上减少水平的人抗-小鼠抗体反应(HAMA)。在另一个实
例中，本发明提供这样的人源化抗体，其激发和/或预期激发最小的人抗-小鼠抗体反应
(HAMA)或不激发人抗-小鼠抗体反应(HAMA)。在一个实例中，本发明的抗体激发在临床可
接受水平或低于临床可接受水平的抗-小鼠抗体反应。
[0396] 本发明的人源化的抗体可以在其重链可变结构域和/或轻链可变结构域中包含一个或多个人和/或人共有非高变区(例如构架)序列。在一些实施方案中，在人和/或
人共有非高变区序列中存在一个或多个另外的修饰。在一个实施方案中，本发明的抗体的
重链可变结构域包含人共有构架序列，其在一个实施方案中是亚组III共有构架序列。在
一个实施方案中，本发明的抗体包含在至少一个氨基酸位置修饰的变体亚组III共有构架
序列。例如，在一个实施方案中，变体亚组III共有构架序列可以包含在位置71，73和/或
78的一个或多个位置的取代。在一个实施方案中，本发明的抗体的轻链可变结构域包含人
共有构架序列，其在一个实施方案中是κI共有构架序列。在一个实施方案中，本发明的抗
体包含在至少一个氨基酸位置修饰的变体κI共有构架序列。
人共有非高变区序列中存在一个或多个另外的修饰。在一个实施方案中，本发明的抗体的
重链可变结构域包含人共有构架序列，其在一个实施方案中是亚组III共有构架序列。在
一个实施方案中，本发明的抗体包含在至少一个氨基酸位置修饰的变体亚组III共有构架
序列。例如，在一个实施方案中，变体亚组III共有构架序列可以包含在位置71，73和/或
78的一个或多个位置的取代。在一个实施方案中，本发明的抗体的轻链可变结构域包含人
共有构架序列，其在一个实施方案中是κI共有构架序列。在一个实施方案中，本发明的抗
体包含在至少一个氨基酸位置修饰的变体κI共有构架序列。
[0397] 如本领域中公知的，并且如在本文下面更详细描述的，描述抗体的高变区的氨基酸位置/边界可以根据上下文和本领域已知的各种定义(如下述)变化。可以将在可变结
构域中的一些位置视为混合型(hybrid)高变位置，因为这些位置在一组标准下可以被视
为在高变区中，而在不同的一组标准下可以被视为在高变区之外。这些位置的一个或多个
也可以见于延伸的高变区(如本文下面进一步所述)中。本发明提供在这些混合型高变位
置的修饰的抗体。在一个实施方案中，这些高变位置在重链可变结构域中包含一个或多个
位置26-30，33-35B，47-49，57-65，93，94和101-102。在一个实施方案中，这些混合型高变位置在轻链可变结构域中包含一个或多个位置24-29，35-36，46-49，56和97。在一个实施
方案中，本发明的抗体包含在一个或多个混合型高变位置修饰的人变体人亚组共有构架序
列。
构域中的一些位置视为混合型(hybrid)高变位置，因为这些位置在一组标准下可以被视
为在高变区中，而在不同的一组标准下可以被视为在高变区之外。这些位置的一个或多个
也可以见于延伸的高变区(如本文下面进一步所述)中。本发明提供在这些混合型高变位
置的修饰的抗体。在一个实施方案中，这些高变位置在重链可变结构域中包含一个或多个
位置26-30，33-35B，47-49，57-65，93，94和101-102。在一个实施方案中，这些混合型高变位置在轻链可变结构域中包含一个或多个位置24-29，35-36，46-49，56和97。在一个实施
方案中，本发明的抗体包含在一个或多个混合型高变位置修饰的人变体人亚组共有构架序
列。
[0398] 本发明的抗体可以包含任何适合的人或人共有轻链构架序列，条件是所述抗体显示合乎需要的生物学特征(例如合乎需要的结合亲和性)。在一个实施方案中，本发明的抗
体包含人κ轻链的构架序列的至少一部分(或全部)。在一个实施方案中，本发明的抗体
包含人κ亚组I构架共有序列的至 少一部分(或全部)。
体包含人κ轻链的构架序列的至少一部分(或全部)。在一个实施方案中，本发明的抗体
包含人κ亚组I构架共有序列的至 少一部分(或全部)。
[0399] 在一个方面中，本发明的抗体是缀合于细胞毒性剂的人源化的抗-FcRH5抗体。在一个方面中，所述缀合于细胞毒性剂的人源化的抗-FcRH5抗体在异种移植中抑制肿瘤进
展。
展。
[0400] 在一个方面中，人源化的抗体和嵌合的抗体二者都是单价的。在一个实施方案中，人源化抗体和嵌合的抗体二者都包含与Fc区域连接的单Fab区域。在一个实施方案中，参
照的嵌合抗体包含在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20))中所示的可变结构域序
列，其与人Fc区域连接。在一个实施方案中，所述人Fc区域是IgG(例如，IgG1，2，3或4)
的Fc区域。
照的嵌合抗体包含在图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20))中所示的可变结构域序
列，其与人Fc区域连接。在一个实施方案中，所述人Fc区域是IgG(例如，IgG1，2，3或4)
的Fc区域。
[0401] 在一个方面中，本发明的抗体包括半胱氨酸改造的抗体，其中母体抗体的一个或多个氨基酸被游离半胱氨酸氨基酸替换，如在WO2006/034488；US 2007/0092940中公
开(全部内容通过引用结合在本文)。抗-FcRH5抗体的任何形式可以是这样的改造的，
即突变的。例如，母体Fab抗体片段可以被改造从而形成半胱氨酸改造的Fab，其被在
本文被称为“硫代Fab(ThioFab)”。类似地，母体单克隆抗体可以被改造从而形成“硫代
Mab(ThioMab)”。应该注意，单位点突变在硫代Fab中产生单一改造的半胱氨酸残基，而单
位点突变在硫代Mab中产生两个改造的半胱氨酸残基，这是由于IgG抗体的二聚体性质造
成的。本发明的半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体包括优先结合细胞相关的FcRH5多肽的单克
隆抗体、人源化的或嵌合的单克隆抗体、和抗体的抗原结合片段、融合多肽和类似物。半胱
氨酸改造的抗体可以备选地包括在抗体或Fab中在本文公开的位置包含半胱氨酸的抗体，
所述抗体得自抗体的序列设计和/或选择，不需要改变母体抗体，所述序列设计和选择如
通过噬菌体展示抗体设计和选择或通过对轻链和/或重链构架序列和恒定区的重新设计。
半胱氨酸改造的抗体包含一个或多个其硫醇反应性值在0.6-1.0范围内；0.7-1.0范围内
或0.8-1.0范围内的游离半胱氨酸氨基酸。游离半胱氨酸氨基酸是已经被改造到母体抗体
中并且不是二硫化物桥的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸改造的抗体用于通过例如马来
酰亚胺或卤代乙酰基在改造的半胱氨酸的位点连接于细胞毒性化合物和/或成像化合物
(imaging compound)。Cys残基对马来酰亚胺基团 的硫醇官能度的亲核反应性是在蛋白中
的任何其它氨基酸(如赖氨酸残基的氨基基团或N-端氨基基团)官能度的约1000倍。在
碘代乙酰基和马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性官能度可以与胺基团反应，但是需要更高的
pH(＞9.0)和更长的反应时间(Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical
Approach(非放射性标记：实践方法)，Academic Press，London)。
开(全部内容通过引用结合在本文)。抗-FcRH5抗体的任何形式可以是这样的改造的，
即突变的。例如，母体Fab抗体片段可以被改造从而形成半胱氨酸改造的Fab，其被在
本文被称为“硫代Fab(ThioFab)”。类似地，母体单克隆抗体可以被改造从而形成“硫代
Mab(ThioMab)”。应该注意，单位点突变在硫代Fab中产生单一改造的半胱氨酸残基，而单
位点突变在硫代Mab中产生两个改造的半胱氨酸残基，这是由于IgG抗体的二聚体性质造
成的。本发明的半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体包括优先结合细胞相关的FcRH5多肽的单克
隆抗体、人源化的或嵌合的单克隆抗体、和抗体的抗原结合片段、融合多肽和类似物。半胱
氨酸改造的抗体可以备选地包括在抗体或Fab中在本文公开的位置包含半胱氨酸的抗体，
所述抗体得自抗体的序列设计和/或选择，不需要改变母体抗体，所述序列设计和选择如
通过噬菌体展示抗体设计和选择或通过对轻链和/或重链构架序列和恒定区的重新设计。
半胱氨酸改造的抗体包含一个或多个其硫醇反应性值在0.6-1.0范围内；0.7-1.0范围内
或0.8-1.0范围内的游离半胱氨酸氨基酸。游离半胱氨酸氨基酸是已经被改造到母体抗体
中并且不是二硫化物桥的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸改造的抗体用于通过例如马来
酰亚胺或卤代乙酰基在改造的半胱氨酸的位点连接于细胞毒性化合物和/或成像化合物
(imaging compound)。Cys残基对马来酰亚胺基团 的硫醇官能度的亲核反应性是在蛋白中
的任何其它氨基酸(如赖氨酸残基的氨基基团或N-端氨基基团)官能度的约1000倍。在
碘代乙酰基和马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性官能度可以与胺基团反应，但是需要更高的
pH(＞9.0)和更长的反应时间(Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical
Approach(非放射性标记：实践方法)，Academic Press，London)。
[0402] 在一个方面中，本发明的半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体在任何适合的位置包含改造的半胱氨酸，其中所述位置在轻链中根据Kabat等编号(见，Kabat等(1991)Sequences
of Proteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白序列)，第5版Public Health
Service(公众健康服务)，National Institutes of Health(国家健康研究所)，Bethesda，
MD)并且在重链(包含Fc区域)中根据EU编号编号(见Kabat等(1991)，见上文)。
of Proteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白序列)，第5版Public Health
Service(公众健康服务)，National Institutes of Health(国家健康研究所)，Bethesda，
MD)并且在重链(包含Fc区域)中根据EU编号编号(见Kabat等(1991)，见上文)。
[0403] 在一个方面中，本发明涉及半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体，其包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与具有本文公开的全长氨基酸序列的半胱氨酸改造的抗体，或本文
公开的缺少信号肽的半胱氨酸改造的抗体氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列同一性，
备选地具有至少约81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，
93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的氨基酸序列同一性。
公开的缺少信号肽的半胱氨酸改造的抗体氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列同一性，
备选地具有至少约81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，
93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的氨基酸序列同一性。
[0404] 在又一个方面中，本发明涉及分离的半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体，其包含由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码下述的DNA分子的互补物杂
交：(a)具有本文公开的全长氨基酸序列的半胱氨酸改造的抗体，(b)本文公开的缺少信号
肽的半胱氨酸改造的抗体氨基酸序列，(c)本文公开的，具有或不具有信号肽的跨膜半胱氨
酸改造的抗体蛋白的细胞外结构域，(d)由本文公开的任一种核酸序列编码的氨基酸序列，
或(e)本文公开的全长半胱氨酸改造的抗体氨基酸序列的任意其它具体限定的片段。
交：(a)具有本文公开的全长氨基酸序列的半胱氨酸改造的抗体，(b)本文公开的缺少信号
肽的半胱氨酸改造的抗体氨基酸序列，(c)本文公开的，具有或不具有信号肽的跨膜半胱氨
酸改造的抗体蛋白的细胞外结构域，(d)由本文公开的任一种核酸序列编码的氨基酸序列，
或(e)本文公开的全长半胱氨酸改造的抗体氨基酸序列的任意其它具体限定的片段。
[0405] 在一个具体的方面中，本发明提供不具有N-端信号序列和/或不具有起始甲硫氨酸的分离的半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体，其由编码如本文所述的这些氨基酸序列的核
苷酸序列编码。用于产生所述抗体的方法也如本文所述，其中那些方法包括在适合表达所
述半胱氨酸改造的抗体的条件 下培养包含载体(其包含适合的编码核酸分子)的宿主细
胞并且从所述细胞培养物回收所述半胱氨酸改造的抗体。
苷酸序列编码。用于产生所述抗体的方法也如本文所述，其中那些方法包括在适合表达所
述半胱氨酸改造的抗体的条件 下培养包含载体(其包含适合的编码核酸分子)的宿主细
胞并且从所述细胞培养物回收所述半胱氨酸改造的抗体。
[0406] 本发明的另一个方面提供分离的半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体，其是跨膜结构域-缺失的，或是跨膜结构域-失活的。用于产生所述抗体的方法也如本文所述，其中那些
方法包括在适合表达所述半胱氨酸改造的抗体的条件下培养包含载体(其包含适合的编
码核酸分子)的宿主细胞并且从所述细胞培养物回收所述半胱氨酸改造的抗体。
方法包括在适合表达所述半胱氨酸改造的抗体的条件下培养包含载体(其包含适合的编
码核酸分子)的宿主细胞并且从所述细胞培养物回收所述半胱氨酸改造的抗体。
[0407] 在其它方面中，本发明提供分离的抗-FcRH5嵌合半胱氨酸改造的抗体，其包含与异源(非FcRH5)多肽融合的任一种本文所述的半胱氨酸改造的抗体。所述嵌合分子的实
例包括与异源多肽(如，例如免疫球蛋白的表位标记序列或Fc区域)融合的任一种本文所
述的半胱氨酸改造的抗体。
例包括与异源多肽(如，例如免疫球蛋白的表位标记序列或Fc区域)融合的任一种本文所
述的半胱氨酸改造的抗体。
[0408] 半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体可以是这样的单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化的抗体、单链抗体或抗体，其竞争性抑制抗-FcRH5多肽抗体与其各自的抗原
表位结合。本发明的抗体可以任选地缀合于生长抑制剂或细胞毒性剂，如毒素(包括
例如auristatin、美坦生类化合物(maytansinoid))、多拉司他汀衍生物或加利车霉素
(calicheamicin)、抗生素、放射性同位素、溶核酶等。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞
或细菌细胞中产生并且优选地抑制与它们结合的细胞的生长或增殖或诱导与它们结合的
细胞的死亡。对于诊断目的，本发明的抗体可以可检测地标记、附着于固体支持物等。
表位结合。本发明的抗体可以任选地缀合于生长抑制剂或细胞毒性剂，如毒素(包括
例如auristatin、美坦生类化合物(maytansinoid))、多拉司他汀衍生物或加利车霉素
(calicheamicin)、抗生素、放射性同位素、溶核酶等。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞
或细菌细胞中产生并且优选地抑制与它们结合的细胞的生长或增殖或诱导与它们结合的
细胞的死亡。对于诊断目的，本发明的抗体可以可检测地标记、附着于固体支持物等。
[0409] 在本发明的其它方面中，本发明提供这样的载体，其包含编码本文所述的任一种抗-FcRH5抗体和抗-FcRH5半胱氨酸改造的抗体的DNA。还提供包含任一种所述载体的宿
主细胞。例如，所述宿主细胞可以是CHO细胞，大肠杆菌细胞或酵母细胞。还提供用于生产
本文所述的任一种多肽的方法，所述方法包括在适合表达合乎需要的多肽的条件下培养宿
主细胞和从所述细胞培养物中回收合乎需要的多肽。
主细胞。例如，所述宿主细胞可以是CHO细胞，大肠杆菌细胞或酵母细胞。还提供用于生产
本文所述的任一种多肽的方法，所述方法包括在适合表达合乎需要的多肽的条件下培养宿
主细胞和从所述细胞培养物中回收合乎需要的多肽。
[0410] 半胱氨酸改造的抗体可以用于治疗癌症并且包括特异于细胞表面和跨膜受体和肿瘤相关的抗原(TAA)的抗体。所述抗体可以用作裸抗体(未与药物或标记结构部分缀
合)或作为抗体-药物缀合物(ADC)。本发明的半胱氨酸改造的抗体可以与硫醇反应性
试剂位点特异性地和有效地偶联。硫醇 反应性试剂可以是多官能接头试剂，捕获标记试
剂，荧光团试剂，或药物-接头中间体。所述半胱氨酸改造的抗体可以用可检测的标记标
记，固定在固相支持物上和/或与药物结构部分缀合。硫醇反应性可以适用到这样的任一
种抗体，其中在选自氨基酸范围：L10-L20，L105-L115，L109-L119，L116-L126，L122-L132，L163-L173，L200-L210的轻链范围内和在选自氨基酸范围：H1-H10，H18-H28，H79-H89，
H107-H117，H109-H119，H111-H121的重链的范围内，和在选白H270-H280，H366-H376，
H391-401的范围内的Fc区域中用反应性半胱氨酸氨基酸取代氨基酸，其中氨基酸位置
的编号在Kabat编号系统的位置1起始(Kabat等(1991)Sequences of Proteins of
Immunological Interest(目的免疫蛋白序列)，第5版.Public Health Service(公众健
康服务)，National Institutes of Health(国家健康研究所)，Bethesda，MD)并且随后
按顺序继续，如在WO2006034488；US 2007/0092940中公开。硫醇反应性还可以适用于抗体
的某些结构域，如轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域，CH1，CH2和CH3。可以在完整抗
体：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM(包括IgG亚类：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，和IgA2)的重链恒定结构域α，δ，ε，γ，和μ中分别进行半胱氨酸替换，所述替换导致0.6以上的硫
醇反应性值。所述抗体及其应用在WO2006/034488；US 2007/0092940中公开。
合)或作为抗体-药物缀合物(ADC)。本发明的半胱氨酸改造的抗体可以与硫醇反应性
试剂位点特异性地和有效地偶联。硫醇 反应性试剂可以是多官能接头试剂，捕获标记试
剂，荧光团试剂，或药物-接头中间体。所述半胱氨酸改造的抗体可以用可检测的标记标
记，固定在固相支持物上和/或与药物结构部分缀合。硫醇反应性可以适用到这样的任一
种抗体，其中在选自氨基酸范围：L10-L20，L105-L115，L109-L119，L116-L126，L122-L132，L163-L173，L200-L210的轻链范围内和在选自氨基酸范围：H1-H10，H18-H28，H79-H89，
H107-H117，H109-H119，H111-H121的重链的范围内，和在选白H270-H280，H366-H376，
H391-401的范围内的Fc区域中用反应性半胱氨酸氨基酸取代氨基酸，其中氨基酸位置
的编号在Kabat编号系统的位置1起始(Kabat等(1991)Sequences of Proteins of
Immunological Interest(目的免疫蛋白序列)，第5版.Public Health Service(公众健
康服务)，National Institutes of Health(国家健康研究所)，Bethesda，MD)并且随后
按顺序继续，如在WO2006034488；US 2007/0092940中公开。硫醇反应性还可以适用于抗体
的某些结构域，如轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域，CH1，CH2和CH3。可以在完整抗
体：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM(包括IgG亚类：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，和IgA2)的重链恒定结构域α，δ，ε，γ，和μ中分别进行半胱氨酸替换，所述替换导致0.6以上的硫
醇反应性值。所述抗体及其应用在WO2006/034488；US 2007/0092940中公开。
[0411] 本发明的半胱氨酸改造的抗体优选地保留它们的野生型、母体抗体对应物的抗原结合能力。因此，半胱氨酸改造的抗体能够结合(优选地特异性地)于抗原。所述抗原包
括，例如肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白和其它细胞表面分子、跨膜蛋白、信号传导蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发展或分化相关(例如已知或怀疑在
功能上有助于组织发展或分化)的分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调节的分子、
涉及血管发生的分子和与血管发生相关(例如已知或怀疑在功能上有助于血管发生)的分
子。所述肿瘤相关的抗原可以是集簇分化因子(cluster differentiation factor)(即
CD蛋白，包括但不限于FcRH5)。本发明的半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体保留它们的母体
抗-FcRH5抗体对应物的抗原结合能力。因此，本发明的半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体能
够结合(优选地特异性地)FcRH5抗原，所述FcRH5抗原包括人抗-FcRH5同种型β和/或
α，包括当所述抗原在细胞(包括但不限于，B细胞)表面上表达时。
括，例如肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白和其它细胞表面分子、跨膜蛋白、信号传导蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发展或分化相关(例如已知或怀疑在
功能上有助于组织发展或分化)的分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调节的分子、
涉及血管发生的分子和与血管发生相关(例如已知或怀疑在功能上有助于血管发生)的分
子。所述肿瘤相关的抗原可以是集簇分化因子(cluster differentiation factor)(即
CD蛋白，包括但不限于FcRH5)。本发明的半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体保留它们的母体
抗-FcRH5抗体对应物的抗原结合能力。因此，本发明的半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体能
够结合(优选地特异性地)FcRH5抗原，所述FcRH5抗原包括人抗-FcRH5同种型β和/或
α，包括当所述抗原在细胞(包括但不限于，B细胞)表面上表达时。
[0412] 在一个方面中，本发明的抗体可以与任何标记结构部分缀合，所述标记结构部分可以通过反应性结构部分、激活的结构部分或反应性半胱氨酸硫醇基共价连接
于 抗 体 (Singh 等 (2002)Anal.Biochem.304：147-15；Harlow E. 和 Lane，D.(1999)
Using Antibodies：A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)，Cold Springs
Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor，NY；Lundblad
R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification(用于蛋白修饰的化学试剂)，
第2版.CRC Press，Boca Raton，FL)。连接的标记可以发挥功能以(i)提供可检测的信
号，(ii)与第二标记相互作用以修饰由第一或第二标记提供的可检测信号，例如以提供
FRET(荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer))；(iii)稳定相互
作用或增加与抗原或配体结合的亲和性，(iv)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响
迁移率，例如电泳迁移率，或细胞渗透性，或(v)提供捕获结构部分，以调节配体亲和性、抗体/抗原结合或离子络合。
于 抗 体 (Singh 等 (2002)Anal.Biochem.304：147-15；Harlow E. 和 Lane，D.(1999)
Using Antibodies：A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)，Cold Springs
Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor，NY；Lundblad
R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification(用于蛋白修饰的化学试剂)，
第2版.CRC Press，Boca Raton，FL)。连接的标记可以发挥功能以(i)提供可检测的信
号，(ii)与第二标记相互作用以修饰由第一或第二标记提供的可检测信号，例如以提供
FRET(荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer))；(iii)稳定相互
作用或增加与抗原或配体结合的亲和性，(iv)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响
迁移率，例如电泳迁移率，或细胞渗透性，或(v)提供捕获结构部分，以调节配体亲和性、抗体/抗原结合或离子络合。
[0413] 可以将标记的半胱氨酸改造的抗体用于诊断测定法中，例如用于检测目的抗原在特定的细胞、组织或血清中的表达。对于诊断应用，所述抗体将典型地用可检测结构部分标
记。可获得许多标记，其一般可分组为下述类别：
记。可获得许多标记，其一般可分组为下述类别：
[0414] 放射性同位素(放射性核素)，如3H，11C，14C，18F，32P，35S，64Cu，68Ga，86Y， 99Tc，111In，123 124 125 131 133 177 211 213
I， I，I， I，Xe， Lu，At，或 Bi。放射性同位素标记的抗体用于受体靶向的成
像实验。所述抗体可以用配体试剂标记，所述配体试剂结合、螯合或以别的方式络合放射
性同位素金属，其中所述试剂具有与抗体的改造的半胱氨酸硫醇的反应性，所述标记使用
在Current Protocols in Immunology(现代免疫学方法)，卷1和2，Coligen等，编辑
Wiley-Interscience，New York，NY，Pubs.(1991)中所述的技术进行。可以络合金属离子的螯合的配体包括DOTA，DOTP，DOTMA，DTPA和TETA(Macrocyclics，Dallas，TX)。放射性核素通过与本发明的抗体-药物缀合物复合而被靶向(Wu等(2005)Nature Biotechnology(自
然生物技术)23(9)：1137-1146)。
I， I，I， I，Xe， Lu，At，或 Bi。放射性同位素标记的抗体用于受体靶向的成
像实验。所述抗体可以用配体试剂标记，所述配体试剂结合、螯合或以别的方式络合放射
性同位素金属，其中所述试剂具有与抗体的改造的半胱氨酸硫醇的反应性，所述标记使用
在Current Protocols in Immunology(现代免疫学方法)，卷1和2，Coligen等，编辑
Wiley-Interscience，New York，NY，Pubs.(1991)中所述的技术进行。可以络合金属离子的螯合的配体包括DOTA，DOTP，DOTMA，DTPA和TETA(Macrocyclics，Dallas，TX)。放射性核素通过与本发明的抗体-药物缀合物复合而被靶向(Wu等(2005)Nature Biotechnology(自
然生物技术)23(9)：1137-1146)。
[0415] 接头试剂如DOTA-马来酰亚胺(4-马来酰亚胺基丁酰胺苄基-DOTA)可 以通过下述制备：按照Axworthy等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)97(4)：
1802-1807)所述的方法，使氨基苄基-DOTA与用氯甲酸异丙酯(Aldrich)激活的4-马来
酰亚胺基丁酸(Fluka)反应。DOTA-马来酰亚胺试剂与半胱氨酸改造的抗体的游离半胱氨
酸氨基酸反应并且在抗体上提供金属络合配体(Lewis等(1998)Bioconj.Chem.9：72-86)。
螯合接头标记试剂如DOTA-NHS(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)可商购(Macrocyclics，Dallas，TX)。关于放射性核素标记的抗体的受体
靶标成像可以通过在肿瘤组织中检测和量化抗体的逐渐累积提供途径激活的标志(Albert
等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8：1207-1210)。缀合的放射性金属可以在溶酶体降解后
保留在细胞内。
1802-1807)所述的方法，使氨基苄基-DOTA与用氯甲酸异丙酯(Aldrich)激活的4-马来
酰亚胺基丁酸(Fluka)反应。DOTA-马来酰亚胺试剂与半胱氨酸改造的抗体的游离半胱氨
酸氨基酸反应并且在抗体上提供金属络合配体(Lewis等(1998)Bioconj.Chem.9：72-86)。
螯合接头标记试剂如DOTA-NHS(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)可商购(Macrocyclics，Dallas，TX)。关于放射性核素标记的抗体的受体
靶标成像可以通过在肿瘤组织中检测和量化抗体的逐渐累积提供途径激活的标志(Albert
等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8：1207-1210)。缀合的放射性金属可以在溶酶体降解后
保留在细胞内。
[0416] 适合作为用于成像实验的抗体标记的金属-螯合络合物在下述中公开US5342606；US 5428155；US 5316757；US 5480990；US 5462725；US5428139；US 5385893；
US 5739294；US 5750660；US 5834456；Hnatowich等(1983)J.Immunol.Methods(免疫方
法 杂 志)65：147-157；Meares等 (1984)Anal.Biochem.142：68-78；Mirzadeh等(1990)
Bioconjugate Chem.1：59-65；Meares等(1990)J.Cancer(癌症杂志)1990，增刊10：
21-26；Izard等(1992)Bioconjugate Chem(生物缀合物化学).3：346-350；Nikula等
(1995)Nucl.Med.Biol.22：387-90；Camera等(1993)Nucl.Med.Biol.20：955-62；Kukis等
(1998)J.Nucl.Med.39：2105-2110；Verel 等 (2003)J.Nucl.Med.44：1663-1670；Camera
等(1994)J.Nucl.Med.21：640-646；Ruegg等(1990)Cancer Res.50：4221-4226；Verel等
(2003)J.Nucl.Med.44：1663-1670；Lee等(2001)Cancer Res(癌症研究).61：4474-4482；
Mitchell，等(2003)J.Nucl.Med.44：1105-1112；Kobayashi等(1999)Bioconjugate Chem.
(生物缀合物混合物)10：103-111；Miederer等(2004)J.Nucl.Med.45：129-137；DeNardo
等(1998)Clinical Cancer Research(化 学癌 症研 究)4：2483-90；Blend等 (2003)
Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals(癌症生物疗法和放射性药物)18：355-363；
Nikula 等 (1999)J.Nucl.Med.40：166-76；Kobayashi 等 (1998)J.Nucl.Med.39：829-36；
Mardirossian等(1993)Nucl.Med.Biol.20：65-74；Roselli等(1999)Cancer Biotherapy
& Radiopharmaceuticals(癌症生物疗法和放射性药物)，14：209-20。
US 5739294；US 5750660；US 5834456；Hnatowich等(1983)J.Immunol.Methods(免疫方
法 杂 志)65：147-157；Meares等 (1984)Anal.Biochem.142：68-78；Mirzadeh等(1990)
Bioconjugate Chem.1：59-65；Meares等(1990)J.Cancer(癌症杂志)1990，增刊10：
21-26；Izard等(1992)Bioconjugate Chem(生物缀合物化学).3：346-350；Nikula等
(1995)Nucl.Med.Biol.22：387-90；Camera等(1993)Nucl.Med.Biol.20：955-62；Kukis等
(1998)J.Nucl.Med.39：2105-2110；Verel 等 (2003)J.Nucl.Med.44：1663-1670；Camera
等(1994)J.Nucl.Med.21：640-646；Ruegg等(1990)Cancer Res.50：4221-4226；Verel等
(2003)J.Nucl.Med.44：1663-1670；Lee等(2001)Cancer Res(癌症研究).61：4474-4482；
Mitchell，等(2003)J.Nucl.Med.44：1105-1112；Kobayashi等(1999)Bioconjugate Chem.
(生物缀合物混合物)10：103-111；Miederer等(2004)J.Nucl.Med.45：129-137；DeNardo
等(1998)Clinical Cancer Research(化 学癌 症研 究)4：2483-90；Blend等 (2003)
Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals(癌症生物疗法和放射性药物)18：355-363；
Nikula 等 (1999)J.Nucl.Med.40：166-76；Kobayashi 等 (1998)J.Nucl.Med.39：829-36；
Mardirossian等(1993)Nucl.Med.Biol.20：65-74；Roselli等(1999)Cancer Biotherapy
& Radiopharmaceuticals(癌症生物疗法和放射性药物)，14：209-20。
[0417] 荧光标记如稀土螯合物(铕螯合物)、荧光素类型包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素，罗丹明类型包括TAMRA、丹酰、丽丝胺、花青、藻红蛋白、德克萨斯红；及其类似物。例如，可以使用在Current Protocols in Immunology(现代免疫学方法)，上文中
公开的技术将荧光标记缀合于抗体。荧光染料和荧光标记试剂包括可以从Invitrogen/
Molecular Probes(Eugene，OR)和Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，IL)商购的那
些。
公开的技术将荧光标记缀合于抗体。荧光染料和荧光标记试剂包括可以从Invitrogen/
Molecular Probes(Eugene，OR)和Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，IL)商购的那
些。
[0418] 各种酶-底物标记可以获得或被公开(US 4275149)。酶通常催化可以使用各种技术测量的生色底物的化学变化。例如，酶可以催化底物的颜色变化，这可以通过分光光度
计测量。备选地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于量化荧光变化的技术如上所述。
化学发光的底物通过化学反应被电激发，接着可以发射可测量(例如使用化学发光计)的
光，或给荧光受体提供能量。酶促标记的实例包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌
萤光素酶，美国专利号4737456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、
糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如
尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶缀合于抗体的技术在
O′Sullivan等(1981)，制备用于酶免疫测定法中的酶-抗体缀合物的方法(Mehods for
the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay)，
酶学方法(Method in Enzym)中.(J.Langone & H.Van Vunakis编辑)，学术出版社，纽约，
73：147-166记载。
计测量。备选地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于量化荧光变化的技术如上所述。
化学发光的底物通过化学反应被电激发，接着可以发射可测量(例如使用化学发光计)的
光，或给荧光受体提供能量。酶促标记的实例包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌
萤光素酶，美国专利号4737456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、
糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如
尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶缀合于抗体的技术在
O′Sullivan等(1981)，制备用于酶免疫测定法中的酶-抗体缀合物的方法(Mehods for
the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay)，
酶学方法(Method in Enzym)中.(J.Langone & H.Van Vunakis编辑)，学术出版社，纽约，
73：147-166记载。
[0419] 酶-底物组合的实例包括，例如：
[0420] (i)辣根过氧化物酶(HRP)，以过氧化氢酶作为底物，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(orthophenylene diamine)(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸
盐(TMB))；
盐(TMB))；
[0421] (ii)碱性磷酸酶(AP)，以对-硝基苯基磷酸酯作为生色底物；和
[0422] (iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如，对-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-methylumbelliferyl-β-D-半乳糖苷酶。
[0423] 许多其它的酶-底物组合是本领域技术人员可获得的。关于一般综述见US4275149和US 4318980。
[0424] 标记可以间接与氨基酸侧链、激活的氨基酸侧链、半胱氨酸改造的抗体等缀合。例如，抗体可以与生物素缀合并且上述三种广泛种类的标记的任一种可以与抗生物素蛋白或
链霉抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性地结合链霉抗生物素蛋白，并且因此，
所述标记可以以这种间接的方式与抗体缀合。备选地，为了获得标记与多肽变体的间接
缀合，所述多肽变体与小的半抗原(例如地高辛)缀合，并且上述不同类型的标记之一与
抗-半抗原多肽变体(例如，抗-地高辛抗体)缀合。由此，可以实现标记与多肽变体的间接
缀合(Hermanson，G.(1996)in Bioconjugate Techniques(在生物缀合物技术中)Academic
Press，San Diego)。
链霉抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性地结合链霉抗生物素蛋白，并且因此，
所述标记可以以这种间接的方式与抗体缀合。备选地，为了获得标记与多肽变体的间接
缀合，所述多肽变体与小的半抗原(例如地高辛)缀合，并且上述不同类型的标记之一与
抗-半抗原多肽变体(例如，抗-地高辛抗体)缀合。由此，可以实现标记与多肽变体的间接
缀合(Hermanson，G.(1996)in Bioconjugate Techniques(在生物缀合物技术中)Academic
Press，San Diego)。
[0425] 本发明的抗体可以用于任一种已知的测定法中，如ELISA、竞争性结合测定法、直接和间接夹心式测定法和免疫沉淀测定法(Zola，(1987)Moloclonal Antibodies：A
Manual of Techniques(单克隆抗体：技术手册)，第147-158页，CRC Press，Inc.)。
Manual of Techniques(单克隆抗体：技术手册)，第147-158页，CRC Press，Inc.)。
[0426] 检测标记可以用于定位、显现和量化结合或识别事件。本发明的标记的抗体可以检测细胞-表面受体。用于可检测标记的抗体的另一种应用是基于珠的免疫捕获的方法，
所述方法包括使珠与荧光标记的抗体缀合，并且在结合配体后检测荧光信号。类似的结合
检测方法使用表面等离振子共振(SPR)作用来测量和检测抗体-抗原相互作用。
所述方法包括使珠与荧光标记的抗体缀合，并且在结合配体后检测荧光信号。类似的结合
检测方法使用表面等离振子共振(SPR)作用来测量和检测抗体-抗原相互作用。
[0427] 检测标记如荧光染料和化学发光染料(Briggs等(1997)″Synthesis ofFunctionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and amino acids(官
能化的荧光染料的合成和它们与胺和氨基酸的偶联)，″J.Chem.Soc.，Perkin-Trans.1：
1051-1058)提供可检测的信号并且通常可应用于标记抗体，优选地具有下述性质：(i)标
记的抗体应该产生具有低背景的非常高的信号从而使小量的抗体在无细胞和基于细胞的
测定中都可以灵敏地进行检测；和(ii)标记的抗体应该是光稳定的从而使荧光信号可以
在无明显的光漂白的情况下被观察、监测和记录。对于涉及标记的抗体与膜或细胞表面的
细胞表面结合的应用，所述细胞尤其是活细胞，所述标记优选地(iii)具有良好的水溶性
以获得有效的缀合物浓度和检测灵敏性和(iv)对于活细胞是无毒的从而不破坏细胞的正
常代谢过程，或导致过早的细胞死亡。可以在系统( 8100HTS System，Applied
Biosystems(应用生物 系统)，Foster City，Calif.)上进行细胞荧光强度的直接量化和
荧光标记事件(例如肽-染料缀合物的细胞表面结合)的计数，所述系统自动进行关于
活细胞或珠的混合-和-读取，非放射性测定法(Miraglia，″Homogeneous cell-and
bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume
assay technology(用于使用荧光微量容积测定技术高通量筛选的基于均相细胞和珠的测
定法)″，(1999)J.of Biomolecular Screening(生物分子筛选杂志)4：193-204)。标记
的抗体的应用还包括细胞表面受体结合测定法，免疫捕获测定法，荧光连接的免疫吸附测
定法(FLISA)，胱天蛋白酶裂解(Zheng，″Caspase-3 controls both cytoplasmic and
nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo(胱天蛋白酶-3体
内控制与Fas介导的凋亡相关的细胞质和细胞核事件)″，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA(美国国家科学院学报)95：618-23；US 6372907)，凋亡(Vermes，″A novel assay
for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on
early apoptotic cell using fluorescein labelled Annexin V(一种用于凋亡的新测定
法。使用荧光素标记的膜联蛋白V用流式细胞术检测在早期凋亡细胞上的磷脂酰丝氨酸表
达)″(1995)J.Immunol.Methods(免疫方法杂志)184：39-51)和细胞毒性测定法。可以将
荧光微量容量测定技术用于鉴定被靶向到细胞表面的分子的上调或下调(Swartzman，″A
homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using
fluorometric microvolume assay technology(用于使用荧光微量容量测定技术的高通
量筛选的均相和多元免疫测定法)″，(1999)Anal.Biochem.271：143-51)。
能化的荧光染料的合成和它们与胺和氨基酸的偶联)，″J.Chem.Soc.，Perkin-Trans.1：
1051-1058)提供可检测的信号并且通常可应用于标记抗体，优选地具有下述性质：(i)标
记的抗体应该产生具有低背景的非常高的信号从而使小量的抗体在无细胞和基于细胞的
测定中都可以灵敏地进行检测；和(ii)标记的抗体应该是光稳定的从而使荧光信号可以
在无明显的光漂白的情况下被观察、监测和记录。对于涉及标记的抗体与膜或细胞表面的
细胞表面结合的应用，所述细胞尤其是活细胞，所述标记优选地(iii)具有良好的水溶性
以获得有效的缀合物浓度和检测灵敏性和(iv)对于活细胞是无毒的从而不破坏细胞的正
常代谢过程，或导致过早的细胞死亡。可以在系统( 8100HTS System，Applied
Biosystems(应用生物 系统)，Foster City，Calif.)上进行细胞荧光强度的直接量化和
荧光标记事件(例如肽-染料缀合物的细胞表面结合)的计数，所述系统自动进行关于
活细胞或珠的混合-和-读取，非放射性测定法(Miraglia，″Homogeneous cell-and
bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume
assay technology(用于使用荧光微量容积测定技术高通量筛选的基于均相细胞和珠的测
定法)″，(1999)J.of Biomolecular Screening(生物分子筛选杂志)4：193-204)。标记
的抗体的应用还包括细胞表面受体结合测定法，免疫捕获测定法，荧光连接的免疫吸附测
定法(FLISA)，胱天蛋白酶裂解(Zheng，″Caspase-3 controls both cytoplasmic and
nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo(胱天蛋白酶-3体
内控制与Fas介导的凋亡相关的细胞质和细胞核事件)″，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA(美国国家科学院学报)95：618-23；US 6372907)，凋亡(Vermes，″A novel assay
for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on
early apoptotic cell using fluorescein labelled Annexin V(一种用于凋亡的新测定
法。使用荧光素标记的膜联蛋白V用流式细胞术检测在早期凋亡细胞上的磷脂酰丝氨酸表
达)″(1995)J.Immunol.Methods(免疫方法杂志)184：39-51)和细胞毒性测定法。可以将
荧光微量容量测定技术用于鉴定被靶向到细胞表面的分子的上调或下调(Swartzman，″A
homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using
fluorometric microvolume assay technology(用于使用荧光微量容量测定技术的高通
量筛选的均相和多元免疫测定法)″，(1999)Anal.Biochem.271：143-51)。
[0428] 本发明的标记的抗体用作通过各种生物医学和分子成像方法和技术的成像生物标志和探针，所述生物医学和分子成像方法如(i)MRI(磁共振成像(magnetic
resonance imaging))；(ii)MicroCT(计算机化断层显像(computerized tomography))；
(iii)SPECT(单光子发射计算机化断层显像(single photon emission computed
tomography))；(iv)PET(正电子发射断层扫描(positron emission tomography))Chen
等(2004)Bioconjugate Chem(生物缀合物化学).15：41-49；(v)生物发光；(vi)荧光；和
(vii)超声。免疫闪烁成像是一种成像方法，其中将用放射性物质标记的抗体施用于动物
或 人患者并且在抗体定位的体内位点摄取照片(US 6528624)。成像的生物标志可以客观
地进行测量并且作为正常生理过程、病理过程或对于治疗干预的药理学反应的指示物进行
评估。生物标志可以是数种类型的：0型是疾病的自然历史标志并且在纵向上与已知的临
床指标相关，例如在类风湿性关节炎中滑液炎症的MRI评估；I型标志根据作用机制捕获干
预的效果，即使机制可能不与临床后果相关；II型标志作为替代终点发挥功能，其中在所
述生物标志中的变化或来自其的信号预测临床益处以“确认”靶向反应，如在类风湿性关节
炎中通过CT测量的骨质侵蚀。因此，成像生物标志可以提供关于下述的药效(PD)治疗信
息：(i)靶蛋白的表达，(ii)治疗剂与靶蛋白的结合，即选择性，和(iii)清除率和半衰期
药物代谢动力学数据。体内成像生物标志相对于基于实验室的生物标志的益处包括：非侵
入性处理、可量化、全体评估、重复给药和评估，即多个时间点，和从临床前(小动物)到临
床(人)结果的潜在可转移的效果。对于某些应用，生物成像在临床前研究中取代动物实
验或使动物实验的数量最少化。
resonance imaging))；(ii)MicroCT(计算机化断层显像(computerized tomography))；
(iii)SPECT(单光子发射计算机化断层显像(single photon emission computed
tomography))；(iv)PET(正电子发射断层扫描(positron emission tomography))Chen
等(2004)Bioconjugate Chem(生物缀合物化学).15：41-49；(v)生物发光；(vi)荧光；和
(vii)超声。免疫闪烁成像是一种成像方法，其中将用放射性物质标记的抗体施用于动物
或 人患者并且在抗体定位的体内位点摄取照片(US 6528624)。成像的生物标志可以客观
地进行测量并且作为正常生理过程、病理过程或对于治疗干预的药理学反应的指示物进行
评估。生物标志可以是数种类型的：0型是疾病的自然历史标志并且在纵向上与已知的临
床指标相关，例如在类风湿性关节炎中滑液炎症的MRI评估；I型标志根据作用机制捕获干
预的效果，即使机制可能不与临床后果相关；II型标志作为替代终点发挥功能，其中在所
述生物标志中的变化或来自其的信号预测临床益处以“确认”靶向反应，如在类风湿性关节
炎中通过CT测量的骨质侵蚀。因此，成像生物标志可以提供关于下述的药效(PD)治疗信
息：(i)靶蛋白的表达，(ii)治疗剂与靶蛋白的结合，即选择性，和(iii)清除率和半衰期
药物代谢动力学数据。体内成像生物标志相对于基于实验室的生物标志的益处包括：非侵
入性处理、可量化、全体评估、重复给药和评估，即多个时间点，和从临床前(小动物)到临
床(人)结果的潜在可转移的效果。对于某些应用，生物成像在临床前研究中取代动物实
验或使动物实验的数量最少化。
[0429] 肽标记方法是公知的。见Haugland，2003，Molecular Probes Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals(荧光探针和研究化学品的Molecular
Probes手册)，Molecular Probes，Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem(生物缀合
物化学).3：2；Garman，(1997)Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach(非
放射性标记：实践方法)，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.(生
物缀合物化学)1：2；Glazer等(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(蛋白的化学修饰。生物化学和
分子生物学的实验室技术)(T.S.Work和E.Work，编辑)American Elsevier Publishing
Co.，New York；Lundblad，R.L.和 Noyes，C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein
Modification(用于蛋白修饰的化学试剂)，卷I和II，CRC Press，New York；Pfleiderer，
G.(1985)“Chemical Modification of Proteins(蛋白的化学修饰)”，Modern Methods in Protein Chemistry(现代蛋白化学的方法)，H.Tschesche，Ed.，Walter DeGryter，Berlin
和New York；和Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking(蛋
白缀合和交联的化学)，CRC Press，Boca Raton，Fla.)；De Leon-Rodriguez等(2004)
Chem.Eur.J.10：1149-1155； Lewis等(2001)Bioconjugate Chem(生物缀合物化学).12：
320-324；Li等(2002)Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)13：110-115；Mier等(2005)
Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)16：240-237。
Probes手册)，Molecular Probes，Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem(生物缀合
物化学).3：2；Garman，(1997)Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach(非
放射性标记：实践方法)，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.(生
物缀合物化学)1：2；Glazer等(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(蛋白的化学修饰。生物化学和
分子生物学的实验室技术)(T.S.Work和E.Work，编辑)American Elsevier Publishing
Co.，New York；Lundblad，R.L.和 Noyes，C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein
Modification(用于蛋白修饰的化学试剂)，卷I和II，CRC Press，New York；Pfleiderer，
G.(1985)“Chemical Modification of Proteins(蛋白的化学修饰)”，Modern Methods in Protein Chemistry(现代蛋白化学的方法)，H.Tschesche，Ed.，Walter DeGryter，Berlin
和New York；和Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking(蛋
白缀合和交联的化学)，CRC Press，Boca Raton，Fla.)；De Leon-Rodriguez等(2004)
Chem.Eur.J.10：1149-1155； Lewis等(2001)Bioconjugate Chem(生物缀合物化学).12：
320-324；Li等(2002)Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)13：110-115；Mier等(2005)
Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)16：240-237。
[0430] 用足够接近的两个结构部分，即荧光报道分子和猝灭剂标记的肽和蛋白经历荧光共振能量转移(FRET)。报道基团典型地是这样的荧光染料，其由在特定波长的光激发，并且
将能量转移到接纳体，或猝灭剂基团，具有适合的斯托克斯位移以在最大的亮光发射。荧光
染料包括具有延伸的芳香性的分子，如荧光素和罗丹明，和它们的衍生物。荧光报道分子可
以部分或显著地由完整肽中的猝灭剂结构部分猝灭。在由肽酶或蛋白酶裂解所述肽后，可
以测量荧光的可检测的增加(Knight，C.(1995)“Fluorimetric Assays of Proteolytic
Enzymes(蛋白水解酶的荧光测定)”，Methods in Enzymology(酶学方法)，Academic
Press，248：18-34)。
将能量转移到接纳体，或猝灭剂基团，具有适合的斯托克斯位移以在最大的亮光发射。荧光
染料包括具有延伸的芳香性的分子，如荧光素和罗丹明，和它们的衍生物。荧光报道分子可
以部分或显著地由完整肽中的猝灭剂结构部分猝灭。在由肽酶或蛋白酶裂解所述肽后，可
以测量荧光的可检测的增加(Knight，C.(1995)“Fluorimetric Assays of Proteolytic
Enzymes(蛋白水解酶的荧光测定)”，Methods in Enzymology(酶学方法)，Academic
Press，248：18-34)。
[0431] 还可以将本发明的标记的抗体用作亲和性纯化试剂。在该方法中，使用本领域公知的方法将标记的抗体固定在固相如Sephadex树脂或滤纸上。使固定的抗体与包含待纯
化的抗原的样品接触，并且随后用适合的溶剂洗涤所述支持物，所述溶剂将基本上去除除
了待纯化的结合于固定的多肽变体的抗原之外的样品中的全部物质。最终，用另一种适合
的溶剂，如甘氨酸缓冲液，pH 5.0洗涤所述支持物，所述溶剂从多肽变体释放抗原。
化的抗原的样品接触，并且随后用适合的溶剂洗涤所述支持物，所述溶剂将基本上去除除
了待纯化的结合于固定的多肽变体的抗原之外的样品中的全部物质。最终，用另一种适合
的溶剂，如甘氨酸缓冲液，pH 5.0洗涤所述支持物，所述溶剂从多肽变体释放抗原。
[0432] 标记的试剂典型地具有反应性官能度，其可以(i)直接与半胱氨酸改造的抗体的半胱氨酸硫醇反应以形成标记的抗体，(ii)与接头试剂反应以形成接头-标记中间体，或
(iii)与接头抗体反应以形成标记的抗体。标记的试剂的反应性官能度包括：马来酰亚胺、
卤代乙酰基、碘代乙酰胺琥珀酰亚胺酯(例如，NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸盐、磺酰氯、2，6-二氯三嗪基、五氟苯基酯和亚磷酰胺，尽管也可以使用其它的官能团。
(iii)与接头抗体反应以形成标记的抗体。标记的试剂的反应性官能度包括：马来酰亚胺、
卤代乙酰基、碘代乙酰胺琥珀酰亚胺酯(例如，NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸盐、磺酰氯、2，6-二氯三嗪基、五氟苯基酯和亚磷酰胺，尽管也可以使用其它的官能团。
[0433] 示例性的反应性官能团是可检测的标记(例如生物素或荧光染料)的羧基取代基的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)。所述标记的NHS酯可以预先形成、分离、纯化和/或表征，
或其可以原位形成并且与抗体的亲核基团反应。典型地，所述标记的羧基形式通过与碳二
亚胺试剂(例如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺)，或脲鎓试剂(例如TSTU(O-(N-琥
珀酰亚胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸酯，HBTU(O-苯并三唑-1- 基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟硫酸酯)，或HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基
脲鎓六氟硫酸酯))，激活剂(如1-羟基苯并三唑(HOBt))和N-羟基琥珀酰亚胺的一些组
合反应以得到标记的NHS酯而被激活。在一些情形中，所述标记和抗体可以通过在一个步
骤中原位激活标记并且与抗体反应形成标记-抗体缀合物进行偶联。其它的激活和偶联试
剂包括TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1-1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯)，TFFH(N，N’，
N”，N’”-四甲基脲鎓2-氟-六氟磷酸酯)，PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基-tris-吡咯烷
基-磷鎓六氟磷酸酯，EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢-喹啉)，DCC(二环己基
碳二亚胺)；DIPCDI(二异丙基碳二亚胺)，MSNT(1-(均三甲苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，
2，4-三唑，和芳基磺酰基卤化物，例如三异丙基苯磺酰氯。
或其可以原位形成并且与抗体的亲核基团反应。典型地，所述标记的羧基形式通过与碳二
亚胺试剂(例如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺)，或脲鎓试剂(例如TSTU(O-(N-琥
珀酰亚胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸酯，HBTU(O-苯并三唑-1- 基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟硫酸酯)，或HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基
脲鎓六氟硫酸酯))，激活剂(如1-羟基苯并三唑(HOBt))和N-羟基琥珀酰亚胺的一些组
合反应以得到标记的NHS酯而被激活。在一些情形中，所述标记和抗体可以通过在一个步
骤中原位激活标记并且与抗体反应形成标记-抗体缀合物进行偶联。其它的激活和偶联试
剂包括TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1-1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯)，TFFH(N，N’，
N”，N’”-四甲基脲鎓2-氟-六氟磷酸酯)，PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基-tris-吡咯烷
基-磷鎓六氟磷酸酯，EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢-喹啉)，DCC(二环己基
碳二亚胺)；DIPCDI(二异丙基碳二亚胺)，MSNT(1-(均三甲苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，
2，4-三唑，和芳基磺酰基卤化物，例如三异丙基苯磺酰氯。
[0434] 本发明的白蛋白结合肽-Fab化合物
[0435] 在一个方面中，本发明的抗体融合于白蛋白结合蛋白。血浆-蛋白结合可以是提高寿命短的分子的药物动力学性质的有效手段。白蛋白是血浆中最丰富的蛋白。血
清白蛋白结合肽(ABP)可以改变融合的活性结构域蛋白的药效动力学，包括改变组织
摄取、渗透和扩散。这些药效动力学参数可以通过具体的选择适合的血清白蛋白结合
肽序列进行调节(US20040001827)。通过噬菌体展示筛选鉴定一系列白蛋白结合肽
(Dennis 等 .(2002)“Albumin Binding As A General Strategy For Improving The
Pharmacokinetics Of Proteins(白蛋白结合作为用于改善蛋白的药物动力学的一般策
略)”J Biol Chem.277：35035-35043；WO 01/45746)。本发明的化合物包括由下述教导
的ABP序列：(i)Dennis等(2002)J Biol Chem(生物化学杂志).277：35035-35043在表
III和IV，第35038页上；(ii)US20040001827，在[0076]SEQ ID NOS：9-22中；和(iii)WO
01/45746，在12-13页上，将其全部都通过引用结合在本文。白蛋白结合(ABP)-Fabs通过将
白蛋白结合肽以1∶1化学计算比率(1ABP/1Fab)融合于Fab重链的C-端而被改造。在
兔和小鼠中显示这些ABP-Fabs与白蛋白的缔合增加抗体半衰期达超过25倍。因此，上述
反应性Cys残基可以被引入这些ABP-Fabs中，并且用于与细胞毒性药物位点特异性缀合，
随后进行体内 动物研究。
清白蛋白结合肽(ABP)可以改变融合的活性结构域蛋白的药效动力学，包括改变组织
摄取、渗透和扩散。这些药效动力学参数可以通过具体的选择适合的血清白蛋白结合
肽序列进行调节(US20040001827)。通过噬菌体展示筛选鉴定一系列白蛋白结合肽
(Dennis 等 .(2002)“Albumin Binding As A General Strategy For Improving The
Pharmacokinetics Of Proteins(白蛋白结合作为用于改善蛋白的药物动力学的一般策
略)”J Biol Chem.277：35035-35043；WO 01/45746)。本发明的化合物包括由下述教导
的ABP序列：(i)Dennis等(2002)J Biol Chem(生物化学杂志).277：35035-35043在表
III和IV，第35038页上；(ii)US20040001827，在[0076]SEQ ID NOS：9-22中；和(iii)WO
01/45746，在12-13页上，将其全部都通过引用结合在本文。白蛋白结合(ABP)-Fabs通过将
白蛋白结合肽以1∶1化学计算比率(1ABP/1Fab)融合于Fab重链的C-端而被改造。在
兔和小鼠中显示这些ABP-Fabs与白蛋白的缔合增加抗体半衰期达超过25倍。因此，上述
反应性Cys残基可以被引入这些ABP-Fabs中，并且用于与细胞毒性药物位点特异性缀合，
随后进行体内 动物研究。
[0436] 示例性的白蛋白结合肽序列包括，但不限于在SEQ ID NOS：47-51中例举的氨基酸序列：
[0437]
[0438] 抗体-药物缀合物
[0439] 在另一个方面中，本发明提供免疫缀合物，或抗体-药物缀合物(ADC)，其包含与细胞毒性剂缀合的抗体，所述细胞毒性剂如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素或其片段)，或放射性同位素(即放射性缀合物)。在
另一个方面中，本发明还提供使用该免疫缀合物的方法。在一个方面中，免疫缀合物包含与
细胞毒性剂或可检测试剂共价连接的任一种上述抗-FcRH5抗体。
另一个方面中，本发明还提供使用该免疫缀合物的方法。在一个方面中，免疫缀合物包含与
细胞毒性剂或可检测试剂共价连接的任一种上述抗-FcRH5抗体。
[0440] 在一个方面中，本发明的FcRH5抗体结合这样的表位，所述表位与FcRH5上由另一种FcRH5抗体结合的表位相同。在另一个实施方案中，本发明的FcRH5抗体结合这样的表
位，所述表位与FcRH5上由另一种FcRH5抗体(即商购的抗-FcRH5抗体)结合的表位相同。
位，所述表位与FcRH5上由另一种FcRH5抗体(即商购的抗-FcRH5抗体)结合的表位相同。
[0441] 在另一个方面中，本发明的FcRH5抗体结合于FcRH5上这样的表位，所述表位与由另一种FcRH5抗体结合的表位不同。在另一个实施方案中，本发明的FcRH5抗体结合FcRH5
上这样的表位，所述表位与FcRH5上由另一种FcRH5抗体(即商购的抗-FcRH5抗体)结合
的表位不同。
上这样的表位，所述表位与FcRH5上由另一种FcRH5抗体(即商购的抗-FcRH5抗体)结合
的表位不同。
[0442] 在一个方面中，本发明的抗体特异性结合第一动物物种的FcRH5，并且不特异性结合第二动物物种的FcRH5。在一个实施方案中，所述第一动物物种是人和/或灵长类动物
(例如食蟹猴)，并且所述第二动物物种是鼠 (例如，小鼠)和/或犬。在一个实施方案中，
第一动物物种是人。在一个实施方案中，所述第一动物物种是灵长类动物，例如食蟹猴。在
一个实施方案中，所述第二动物物种是鼠，例如小鼠。在一个实施方案中，所述第二动物物
种是犬。
(例如食蟹猴)，并且所述第二动物物种是鼠 (例如，小鼠)和/或犬。在一个实施方案中，
第一动物物种是人。在一个实施方案中，所述第一动物物种是灵长类动物，例如食蟹猴。在
一个实施方案中，所述第二动物物种是鼠，例如小鼠。在一个实施方案中，所述第二动物物
种是犬。
[0443] 在一个方面中，本发明提供包含一种或多种本发明的抗体和载体的组合物。在一个实施方案中，所述载体是药用的。
[0444] 在一个方面中，本发明提供编码本发明的FcRH5抗体的核酸。
[0445] 在一个方面中，本发明提供包含本发明的核酸的载体。
[0446] 在一个方面中，本发明提供包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。载体可以是任一种类型的，例如重组载体如表达载体。可以使用多种宿主细胞中的任一种。在一个实施
方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
[0447] 在一个方面中，本发明提供制备本发明的抗体的方法。例如，本发明提供制备FcRH5抗体(其，如本文定义包括全长和其片段)的方法，所述方法包括在适合的宿主细胞
中表达编码所述抗体(或其片段)的本发明的重组载体，和回收所述抗体。
中表达编码所述抗体(或其片段)的本发明的重组载体，和回收所述抗体。
[0448] 在一个方面中，本发明提供包括容器和包含在所述容器中的组合物的制品，其中所述组合物包含一种或多种本发明的FcRH5抗体。在一个实施方案中，所述组合物包含本
发明的核酸。在一个实施方案中，包含抗体的组合物还包含载体，其在一些实施方案中是药
用的。在一个实施方案中，本发明的制品还包含用于将所述组合物(例如抗体)施用于受
试者的说明书。
发明的核酸。在一个实施方案中，包含抗体的组合物还包含载体，其在一些实施方案中是药
用的。在一个实施方案中，本发明的制品还包含用于将所述组合物(例如抗体)施用于受
试者的说明书。
[0449] 在一个方面中，本发明提供试剂盒，其包括第一容器，所述第一容器包含含有一种或多种本发明的FcRH5抗体的组合物；和第二容器，所述第二容器含有缓冲剂(buffer)。
在一个实施方案中，所述缓冲剂是药用的。在一个实施方案中，包含拮抗剂抗体的组合物还
包含载体，其在一些实施方案中是药用的。在一个实施方案中，试剂盒还包含用于将组合物
(例如抗体)施用于受试者的说明书。
在一个实施方案中，所述缓冲剂是药用的。在一个实施方案中，包含拮抗剂抗体的组合物还
包含载体，其在一些实施方案中是药用的。在一个实施方案中，试剂盒还包含用于将组合物
(例如抗体)施用于受试者的说明书。
[0450] 在一个方面中，本发明提供本发明的FcRH5抗体在制备用于治疗性 治疗和/或预防性治疗疾病的药物中的应用，所述疾病如癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病。在
一个实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金
淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭
性NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
一个实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金
淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭
性NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
[0451] 在一个方面中，本发明提供本发明的核酸在制备用于治疗性治疗和/或预防性治疗疾病的药物中的应用，所述疾病如癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病。在一个
实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金淋
巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭性
NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金淋
巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭性
NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
[0452] 在一个方面中，本发明提供本发明的表达载体在制备用于治疗性治疗和/或预防性治疗疾病的药物中的应用，所述疾病如癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病。在
一个实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金
淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭
性NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋 巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
一个实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金
淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭
性NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋 巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
[0453] 在一个方面中，本发明提供本发明的宿主细胞在制备用于治疗性治疗和/或预防性治疗疾病的药物中的应用，所述疾病如癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病。在
一个实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金
淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭
性NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
一个实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金
淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭
性NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
[0454] 在一个方面中，本发明提供本发明的制品在制备用于治疗性治疗和/或预防性治疗疾病的药物中的应用，所述疾病如癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病。在一个
实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金淋
巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭性
NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金淋
巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭性
NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
[0455] 在一个方面中，本发明提供本发明的试剂盒在制备用于治疗性治疗和/或预防性治疗疾病的药物中的应用，所述疾病如癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病。在一
个实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金淋
巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭性
NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治 性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
个实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增生性疾病选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金淋
巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭性
NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治 性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
[0456] 在一个方面中，本发明提供抑制表达FcRH5的细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞接触本发明的抗体由此导致所述细胞的生长的抑制。在一个实施方案中，该抗体
与细胞毒性剂缀合。在一个实施方案中，该抗体与生长抑制剂缀合。
与细胞毒性剂缀合。在一个实施方案中，该抗体与生长抑制剂缀合。
[0457] 在一个方面中，本发明提供治疗性治疗患有包含表达FcRH5的细胞的癌性肿瘤的哺乳动物的方法，所述方法包括向该哺乳动物施用治疗有效量的本发明的抗体，由此有效
治疗所述哺乳动物。在一个实施方案中，所述抗体缀合于细胞毒性剂。在一个实施方案中，
所述抗体缀合于生长抑制剂。
治疗所述哺乳动物。在一个实施方案中，所述抗体缀合于细胞毒性剂。在一个实施方案中，
所述抗体缀合于生长抑制剂。
[0458] 在一个方面中，本发明提供治疗或预防与FcRH5的增加的表达相关的细胞增生性疾病的方法，所述方法包括向需要所述治疗的受试者施用有效量的本发明的抗体，由此有
效治疗或预防所述细胞增生性疾病。在一个实施方案中，所述增生性疾病是癌症。在一个实
施方案中，所述抗体缀合于细胞毒性剂。在一个实施方案中，所述抗体缀合于生长抑制剂。
效治疗或预防所述细胞增生性疾病。在一个实施方案中，所述增生性疾病是癌症。在一个实
施方案中，所述抗体缀合于细胞毒性剂。在一个实施方案中，所述抗体缀合于生长抑制剂。
[0459] 在一个方面中，本发明提供抑制细胞的生长的方法，其中所述细胞的生长至少部分依赖于FcRH的生长增强作用，所述方法包括使所述细胞与有效量的本发明的抗体接触，
由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，所述抗体缀合于细胞毒性剂。在一个实施
方案中，所述抗体缀合于生长抑制剂。
由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，所述抗体缀合于细胞毒性剂。在一个实施
方案中，所述抗体缀合于生长抑制剂。
[0460] 在一个方面中，本发明提供治疗性处理哺乳动物中的肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长至少部分依赖于FcRH5的生长增强作用，所述方法包括使所述细胞与有效量的本发
明的抗体接触，由此有效治疗所述肿瘤。在一个实施方案中，所述抗体缀合于细胞毒性剂。
在一个实施方案中，所述抗体缀合于生长抑制剂。
明的抗体接触，由此有效治疗所述肿瘤。在一个实施方案中，所述抗体缀合于细胞毒性剂。
在一个实施方案中，所述抗体缀合于生长抑制剂。
[0461] 在一个方面中，本发明提供治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施 用包含本文所述的免疫缀合物、可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物制剂。在一个实施方案中，
所述癌症选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵
袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭性NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性
NHL(relapsed indolent NHL)、难治性NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory
indolentNHL)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴
细胞性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell
leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞
淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。在一个实施方案中，向患者施用与抗体-药物缀合物化
合物组合的细胞毒性剂。
所述癌症选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵
袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭性NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性
NHL(relapsed indolent NHL)、难治性NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory
indolentNHL)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴
细胞性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell
leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞
淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。在一个实施方案中，向患者施用与抗体-药物缀合物化
合物组合的细胞毒性剂。
[0462] 在一个方面中，本发明提供抑制B细胞增殖的方法，所述方法包括将细胞在允许免疫缀合物与FcRH5结合的条件下暴露于包含本发明的抗体的免疫缀合物。在一个
实施方案中，所述B细胞增殖选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins
lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭性NHL(relapsed aggressive
NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性NHL(refractory NHL)、难治性
惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic
leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)、白血病、多毛细
胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic
leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。在一个实施方案中，所述B细
胞是异种移植物。在一个实施方案中，该暴露在体外发生。在一个实施方案中，该暴露在体
内发生。
实施方案中，所述B细胞增殖选自淋巴瘤(lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins
lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭性NHL(relapsed aggressive
NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性NHL(refractory NHL)、难治性
惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic
leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)、白血病、多毛细
胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic
leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。在一个实施方案中，所述B细
胞是异种移植物。在一个实施方案中，该暴露在体外发生。在一个实施方案中，该暴露在体
内发生。
[0463] 在一个方面中，本发明提供在怀疑包含FcRH5的样品中确定FcRH5的存在的方法，所述方法包括使所述样品暴露于本发明的抗体，并且确定所述抗体与所述样品中的FcRH5
的结合，其中所述抗体与所述样品中的FcRH5的结合指示所述蛋白在所述样品中的存在。
在一个实施方案中，该样品是生物学样品。在另一个实施方案中，该生物学样品包含B细
胞。在一个实施方案中，该生物学样品来自经历或怀疑经历B细胞疾病和/或B细胞增
生性疾病的哺乳动物，所述B细胞增生性疾病包括，但不限于：淋 巴瘤(lymphoma)、非霍
奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭
性NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
的结合，其中所述抗体与所述样品中的FcRH5的结合指示所述蛋白在所述样品中的存在。
在一个实施方案中，该样品是生物学样品。在另一个实施方案中，该生物学样品包含B细
胞。在一个实施方案中，该生物学样品来自经历或怀疑经历B细胞疾病和/或B细胞增
生性疾病的哺乳动物，所述B细胞增生性疾病包括，但不限于：淋 巴瘤(lymphoma)、非霍
奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、侵袭性NHL(aggressive NHL)、复发性侵袭
性NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)、难治性
NHL(refractory NHL)、难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白
血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)、白血病、多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
[0464] 在一个方面中，提供诊断与表达FcRH5的细胞(如B细胞)增加相关的细胞增生性疾病的方法，所述方法包括使生物样品中的测试细胞与任一种上述抗体接触；通过检测抗
体与FcRH5的结合确定与样品中的测试细胞结合的抗体的水平；并且与结合对照样品中细
胞的抗体的水平进行比较，其中将测试样品和对照样品中结合的抗体水平针对表达FcRH5
的细胞的数量进行标准化，并且其中与对照样品比较在测试样品中结合的抗体的更高水平
指示存在与表达FcRH5的细胞相关的细胞增生性疾病。
体与FcRH5的结合确定与样品中的测试细胞结合的抗体的水平；并且与结合对照样品中细
胞的抗体的水平进行比较，其中将测试样品和对照样品中结合的抗体水平针对表达FcRH5
的细胞的数量进行标准化，并且其中与对照样品比较在测试样品中结合的抗体的更高水平
指示存在与表达FcRH5的细胞相关的细胞增生性疾病。
[0465] 在一个方面中，提供检测血液或血清中的可溶性FcRH5的方法，所述方法包括使来自怀疑经历B细胞增生性疾病的哺乳动物的血液或血清的测试样品与本发明的
抗-FcRH5抗体接触，并且检测相对于来自正常哺乳动物的血液或血清的对照样品在测试
样品中的可溶性FcRH5的增加。在一个实施方案中，将检测方法用作诊断与哺乳动物的血
液或血清中可溶性FcRH5的增加相关的B细胞增生性疾病的方法。
抗-FcRH5抗体接触，并且检测相对于来自正常哺乳动物的血液或血清的对照样品在测试
样品中的可溶性FcRH5的增加。在一个实施方案中，将检测方法用作诊断与哺乳动物的血
液或血清中可溶性FcRH5的增加相关的B细胞增生性疾病的方法。
[0466] 在一个方面中，提供将本发明的抗体与表达FcRH5的细胞结合的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的抗体接触。在一个实施方案中，所述抗体与细胞毒性剂缀合。在
一个实施方案中，所述抗体与生长抑制剂缀合。
一个实施方案中，所述抗体与生长抑制剂缀合。
[0467] 本发明的方法可以用于影响任何适合的病理状态，例如与FcRH5的表达相关的细胞和/或组织。在一个实施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是造血细胞。例如，造
血细胞可以是选自由下列各项组成的组的造血细胞：淋巴细胞、白细胞、血小板、红细胞和
自然杀伤细胞。在一个实施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是B细胞或T细胞。在
一个实 施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是癌细胞。例如，癌细胞可以是选自由
淋巴瘤细胞、白血病细胞或骨髓瘤细胞组成的组中的癌细胞。
血细胞可以是选自由下列各项组成的组的造血细胞：淋巴细胞、白细胞、血小板、红细胞和
自然杀伤细胞。在一个实施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是B细胞或T细胞。在
一个实 施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是癌细胞。例如，癌细胞可以是选自由
淋巴瘤细胞、白血病细胞或骨髓瘤细胞组成的组中的癌细胞。
[0468] 本发明的方法还可以包括另外的治疗步骤。例如，在一个实施方案中，方法还包括其中被靶向的细胞和/或组织(例如，癌细胞)暴露于放射治疗或化疗剂的步骤。
[0469] 在一个方面中，本发明提供这样的方法，所述方法包括与有效量的另一种治疗剂(如抗-血管生成剂、另一种抗体、化疗剂、细胞毒性剂、免疫抑制剂、前体药物、细胞因
子、细胞毒性放射治疗、皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、镇痛药或生长抑制剂)组合施用有效量的抗-FcRH5抗体。例如，抗-FcRH5抗体或免疫缀合物与抗癌剂或抗-生血管药剂
组合用于治疗各种瘤形成疾病或非瘤形成疾病。在具体的实例中，所述抗-FcRH5抗体与
(硼替佐米(bortezomib))、 (来那度胺(lenalidomide))、他莫昔
芬(tamoxifen)、来曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、阿那曲唑(anastrozole)、
伊立替康(irinotecan)、西妥昔单抗(cetuximab)、氟维斯群(fulvestrant)、长春瑞滨
(vinorelbine)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、长春新碱(vincristine)、顺铂(cisplatin)、
吉西他滨(gemcitabine)、甲氨喋呤(methotrexate)、长春碱(vinblastine)、卡铂
(carboplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、
5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、多柔比星(doxorubicin)、硼替佐米(bortezomib)、
来那度胺(lenalidomide)、地塞米松(dexamethasone)、美法仑(melphalin)、泼尼松
(prednisone)、长春新碱(vincristine)、沙利度胺(thalidomide)组合使用。
子、细胞毒性放射治疗、皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、镇痛药或生长抑制剂)组合施用有效量的抗-FcRH5抗体。例如，抗-FcRH5抗体或免疫缀合物与抗癌剂或抗-生血管药剂
组合用于治疗各种瘤形成疾病或非瘤形成疾病。在具体的实例中，所述抗-FcRH5抗体与
(硼替佐米(bortezomib))、 (来那度胺(lenalidomide))、他莫昔
芬(tamoxifen)、来曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、阿那曲唑(anastrozole)、
伊立替康(irinotecan)、西妥昔单抗(cetuximab)、氟维斯群(fulvestrant)、长春瑞滨
(vinorelbine)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、长春新碱(vincristine)、顺铂(cisplatin)、
吉西他滨(gemcitabine)、甲氨喋呤(methotrexate)、长春碱(vinblastine)、卡铂
(carboplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、
5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、多柔比星(doxorubicin)、硼替佐米(bortezomib)、
来那度胺(lenalidomide)、地塞米松(dexamethasone)、美法仑(melphalin)、泼尼松
(prednisone)、长春新碱(vincristine)、沙利度胺(thalidomide)组合使用。
[0470] 取决于待治疗的具体的癌症适应症，本发明的组合疗法可以与另外的治疗剂，如化疗剂，或另外的疗法如放射性疗法或外科手术组合。可以将许多已知的化疗剂用在本发
明的组合疗法中。优选地，将使用那些化疗剂，所述化疗剂对于特定适应症的治疗是标准
的。在组合中使用的每种治疗剂的剂量或频率优选地与相应药剂在不与其它药剂一起使用
时的剂量或频率相同，或低于相应药剂在不与其它药剂一起使用时的剂量或频率。
明的组合疗法中。优选地，将使用那些化疗剂，所述化疗剂对于特定适应症的治疗是标准
的。在组合中使用的每种治疗剂的剂量或频率优选地与相应药剂在不与其它药剂一起使用
时的剂量或频率相同，或低于相应药剂在不与其它药剂一起使用时的剂量或频率。
[0471] 如本文所述，已经观察到FcRH5(或IRTA2)的表达在多发性骨髓瘤和伯基特淋巴瘤细胞系中失调。因此，在本发明的方法的一个实施方案中，被靶向的细胞(例如，癌细胞)
是其中与不表达FcRH5的细胞比较表达 FcRH5的细胞。在另一个实施方案中，被靶向的细
胞是癌细胞，其中与相同组织类型的正常非癌细胞比较，FcRH5的表达增加。在一个实施方
案中，本发明的方法导致被靶向的细胞死亡。
是其中与不表达FcRH5的细胞比较表达 FcRH5的细胞。在另一个实施方案中，被靶向的细
胞是癌细胞，其中与相同组织类型的正常非癌细胞比较，FcRH5的表达增加。在一个实施方
案中，本发明的方法导致被靶向的细胞死亡。
[0472] 在本发明的另一个方面中，本发明提供包含编码任一种本文所述的抗体的DNA的载体。还提供包含任一种所述载体的宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是CHO细胞，大肠
杆菌细胞，或酵母细胞。还提供生产任一种本文所述的抗体的方法，并且所述方法包括在适
合表达所需要的抗体的条件下培养宿主细胞和从所述细胞培养物中回收所需要的抗体。
杆菌细胞，或酵母细胞。还提供生产任一种本文所述的抗体的方法，并且所述方法包括在适
合表达所需要的抗体的条件下培养宿主细胞和从所述细胞培养物中回收所需要的抗体。
[0473] 在又一个方面中，本发明涉及主题组合物，所述组合物包含与载体组合的本文所述的抗-FcRH5抗体。任选地，所述载体是药用载体。
[0474] 本发明的另一个方面涉及本文所述的抗-FcRH5多肽抗体用于制备药物的应用，所述药物用于治疗对于抗-FcRH5多肽抗体具有反应性的病症。
[0475] 本发明的另一个方面是包含式I的抗体-药物化合物的混合物的组合物，其中每个抗体平均药物负载是约2到约5，或约3到约4。
[0476] 本发明的另一个方面是药物组合物，其包含式I的ADC化合物，式I的ADC化合物的混合物，或其药用盐或溶剂合物，和药用稀释剂、载体或赋形剂。
[0477] 另一个方面提供包含式IADC化合物和具有抗癌性质或其它治疗效果的第二化合物的药物组合。
[0478] 另一个方面是用于杀伤或抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖的方法，所述方法包括用一定量的式I的抗体-药物缀合物，或其药用盐或溶剂合物处理细胞，所述式I的抗体-药
物缀合物，或其药用盐或溶剂合物有效杀伤或抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖。
物缀合物，或其药用盐或溶剂合物有效杀伤或抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖。
[0479] 另一个方面是治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的包含式IADC的药物组合物。
[0480] 另一个方面包括制品，即试剂盒，其包含抗体-药物缀合物，容器，和指示治疗的包装说明书或标记。
[0481] 本发明的方面是用于制备式I抗体药物缀合物化合物的方法，所述方法包括下述步骤：(a)使半胱氨酸改造的抗体的改造的半胱氨酸基团与接头试剂反应以形成抗体-接
头中间体Ab-L；和(b)使Ab-L与激活的药物结 构部分D反应，由此形成抗体-药物缀合
物，或包括下述步骤：(c)使药物结构部分的亲核基团与接头试剂反应以形成药物-接头中
间体D-L；和(d)使D-L与半胱氨酸改造的抗体的改造的半胱氨酸基团反应，由此形成抗
体-药物缀合物。
头中间体Ab-L；和(b)使Ab-L与激活的药物结 构部分D反应，由此形成抗体-药物缀合
物，或包括下述步骤：(c)使药物结构部分的亲核基团与接头试剂反应以形成药物-接头中
间体D-L；和(d)使D-L与半胱氨酸改造的抗体的改造的半胱氨酸基团反应，由此形成抗
体-药物缀合物。
[0482] 本发明的方面是用于检测癌细胞的测定法，其包括：(a)使细胞暴露于半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体-药物缀合物；和(b)确定半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体-药物缀
合物化合物与细胞的结合程度。
合物化合物与细胞的结合程度。
[0483] A.抗-FcRH5抗体
[0484] 在一个实施方案中，本发明提供可以在本文用作治疗剂的抗-FcRH5抗体。示例性抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化的抗体、双特异性抗体和杂缀合物
(heteroconjugate)抗体。
(heteroconjugate)抗体。
[0485] 1.多克隆抗体
[0486] 多克隆抗体优选地在动物中通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来产生。将相关抗原(尤其是当使用合成肽时)与在待免疫的物种中是免疫原性的蛋白
缀合可以是有用的。例如，使用双官能或衍生化试剂(例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰
亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀
1 1
酸酐、SOCl2、或RN＝C＝NR(其中R和R 是不同的烷基))，所述抗原可以缀合于匙孔血蓝
蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
缀合可以是有用的。例如，使用双官能或衍生化试剂(例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰
亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀
1 1
酸酐、SOCl2、或RN＝C＝NR(其中R和R 是不同的烷基))，所述抗原可以缀合于匙孔血蓝
蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
[0487] 通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原、免疫原性缀合物或
衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10
的肽或缀合物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。
对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。缀合物还可在重组细胞培养物中作为
蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂(诸如明矾)来增强免疫应答。
衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10
的肽或缀合物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。
对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。缀合物还可在重组细胞培养物中作为
蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂(诸如明矾)来增强免疫应答。
[0488] 2.单克隆抗体
[0489] 单克隆抗体可以使用最初由Kohler等，自然(Nature)256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)来制备。
[0490] 在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物(诸如仓鼠)以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，
可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后，使用合适的融合剂(诸如聚乙二
醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：原理和实
践(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，第59-103页，(学术出版社，
1986))。
可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后，使用合适的融合剂(诸如聚乙二
醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：原理和实
践(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，第59-103页，(学术出版社，
1986))。
[0491] 将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的母体骨髓瘤细胞(也称为融合配偶体)生长或存活的物质。例
如，若母体骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂
交瘤的选择性培养基典型地将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻
止HGPRT缺陷细胞的生长。
如，若母体骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂
交瘤的选择性培养基典型地将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻
止HGPRT缺陷细胞的生长。
[0492] 优选的融合配偶体骨髓瘤细胞是那些有效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对针对未融合的母体细胞选择的选择性培养基敏感的细胞。优选的骨
髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell
Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿
瘤衍生的那些及可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，
Manassas，Virginia，USA获得的SP-2和衍生物，例如X63-Ag8-653细胞衍生的那些。人骨
髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor，免疫学杂志
(J.Immunol.)133：3001(1984)；和Brodeur等，单克隆抗体产生技术和应用(Monoclonal
Antibody Production Techniques and Applications)，第51-63页，(Marcel Dekker，
Inc.，纽约，1987)。
髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell
Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿
瘤衍生的那些及可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，
Manassas，Virginia，USA获得的SP-2和衍生物，例如X63-Ag8-653细胞衍生的那些。人骨
髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor，免疫学杂志
(J.Immunol.)133：3001(1984)；和Brodeur等，单克隆抗体产生技术和应用(Monoclonal
Antibody Production Techniques and Applications)，第51-63页，(Marcel Dekker，
Inc.，纽约，1987)。
[0493] 对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的 生成。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法(诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测
定法(ELISA))测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
定法(ELISA))测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
[0494] 单克隆抗体的结合亲和性可通过例如Munson等，Anal.Biochem.107：220(1980)所述的斯卡查德分析(Scatchard analysis)来确定。
[0495] 一旦鉴定到生成具有期望特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，该克隆可通过有限稀释方法进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding，单克隆抗体：原理
和实践(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，第59-103页(学术出版社，
1986))。适于这一目的的适合培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，例如通
过将细胞i.p.注射到小鼠中，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
和实践(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，第59-103页(学术出版社，
1986))。适于这一目的的适合培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，例如通
过将细胞i.p.注射到小鼠中，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
[0496] 通过常规抗体纯化方法，诸如例如亲和层析法(例如，使用蛋白A或蛋白G-Sepharose)或离子交换层析法、羟磷灰石层析法、凝胶电泳、透析等，将亚克隆分泌的单
克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
[0497] 编码单克隆抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可充当此类DNA
的优选来源。一旦分离，可将DNA置入表达载体，然后将该表达载体转染入不另外生成
抗体蛋白质的宿主细胞(诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢
(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体
的DNA在细菌中的重组表达的综述文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5：
256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。在另一个实施方案中，
可以从使用McCafferty等，自然(Nature)348：552-554(1990)所记载的技术构建的噬菌
体抗体库分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，自然(Nature)352：624-628(1991)
和Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597(1991)分别记载了使用噬菌
体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks等，生物/技术(Bio/
Technology)10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库
的策略(Waterhouse等，核酸研究(Nuc.Acids Res.)21：2265-2266(1993))，生成高亲和性
(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是 用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技
术的可行替代方法。
的优选来源。一旦分离，可将DNA置入表达载体，然后将该表达载体转染入不另外生成
抗体蛋白质的宿主细胞(诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢
(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体
的DNA在细菌中的重组表达的综述文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5：
256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。在另一个实施方案中，
可以从使用McCafferty等，自然(Nature)348：552-554(1990)所记载的技术构建的噬菌
体抗体库分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，自然(Nature)352：624-628(1991)
和Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597(1991)分别记载了使用噬菌
体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks等，生物/技术(Bio/
Technology)10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库
的策略(Waterhouse等，核酸研究(Nuc.Acids Res.)21：2265-2266(1993))，生成高亲和性
(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是 用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技
术的可行替代方法。
[0498] 还可以修饰编码抗体的DNA，例如通过用人重链和轻链恒定结构域(CH和CL)序列置换同源鼠序列(美国专利号4,816,567；和Morrison等，美国国家科学院学报(Proc.
Natl.Acad.Sci.USA)81：6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽
(异源多肽)编码序列的全部或部分融合来产生嵌合或融合抗体多肽。非免疫球蛋白多
肽序列可以置换抗体的恒定结构域，或者它们被抗体的一个抗原结合位点的可变结构域置
换，以产生嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗
原具有特异性的另一个抗原结合位点。
Natl.Acad.Sci.USA)81：6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽
(异源多肽)编码序列的全部或部分融合来产生嵌合或融合抗体多肽。非免疫球蛋白多
肽序列可以置换抗体的恒定结构域，或者它们被抗体的一个抗原结合位点的可变结构域置
换，以产生嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗
原具有特异性的另一个抗原结合位点。
[0499] 3.人和人源化的抗体
[0500] 本发明的抗-FcRH5抗体还可以包括人源化的抗体或人抗体。非人(例如，鼠)抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv，Fab，Fab′，
F(ab′)2或抗体的其它抗原结合亚序列)，其包含来自非人免疫球蛋白的最小的序列。人
源化的抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被
来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基(其具有所需要的特异性、亲和
性和能力)取代。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人残基替换。人
源化的抗体还可以包括既没有在受体抗体中也没有在输入的CDR或构架序列中发现的残
基。一般地，所述人源化的抗体包含基本上全部的至少一种可变结构域，和典型地两种可变
结构域，其中全部或基本上全部CDR区对应于非-人免疫球蛋白的那些并且全部或基本上
全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。该人源化的抗体最优地还包含免疫球蛋白
恒定区(Fc)(典型地人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分[Jones等，Nature(自然)，
321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature(自然)，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)]。
F(ab′)2或抗体的其它抗原结合亚序列)，其包含来自非人免疫球蛋白的最小的序列。人
源化的抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被
来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基(其具有所需要的特异性、亲和
性和能力)取代。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人残基替换。人
源化的抗体还可以包括既没有在受体抗体中也没有在输入的CDR或构架序列中发现的残
基。一般地，所述人源化的抗体包含基本上全部的至少一种可变结构域，和典型地两种可变
结构域，其中全部或基本上全部CDR区对应于非-人免疫球蛋白的那些并且全部或基本上
全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。该人源化的抗体最优地还包含免疫球蛋白
恒定区(Fc)(典型地人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分[Jones等，Nature(自然)，
321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature(自然)，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)]。
[0501] 用于人源化非人抗体的方法是本领域公知的。一般地，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们典
型地取自“输入”可变结构域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法[Jones等，
自然(Nature)321：522-525(1986)； Riechmann等，自然(Nature)332：323-327(1988)；
Verhoeyen等，科学(Science)239：1534-1536(1988))，通过用啮齿类动物CDR或CDR
序列置换人抗体的相应序列进行。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号
4,816,567)，其中基本上少于整个人可变结构域用来自非人物种的相应序列置换。在实践
中，人源化抗体典型地是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类动物抗体中
类似位点的残基置换的人抗体。
型地取自“输入”可变结构域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法[Jones等，
自然(Nature)321：522-525(1986)； Riechmann等，自然(Nature)332：323-327(1988)；
Verhoeyen等，科学(Science)239：1534-1536(1988))，通过用啮齿类动物CDR或CDR
序列置换人抗体的相应序列进行。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号
4,816,567)，其中基本上少于整个人可变结构域用来自非人物种的相应序列置换。在实践
中，人源化抗体典型地是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类动物抗体中
类似位点的残基置换的人抗体。
[0502] 当抗体意欲用于人治疗应用时，用于构建人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选择对于降低抗原性和HAMA反应(人抗-小鼠抗体)非常重要。HAMA反应
的减少或消除是适合的治疗剂的临床开发的重要方面。见，例如，Khaxzaeli等，J.Natl.
Cancer Inst.(1988)，80：937；Jaffers 等，Transplantation( 移 植 )(1986)，41：572；
Shawler等，J.Immunol.(免疫学杂志)(1985)，135：1530；Sears等，J.Biol.Response
Mod.(1984)，3：138；Miller等，Blood(血液)(1983)，62：988；Hakimi等，J.Immunol(免
疫学杂志).(1991)，147：1352；Reichmann等，Nature(自然)(1988)，332：323；Junghans
等，CancerRes(癌症研究).(1990)，50：1495。如本文所述，本发明提供被人源化从而使
HAMA反应被减少或消除的抗体。这些抗体的变体还可以使用本领域已知的常规方法获得，
其中一些方法在下文进一步描述。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类动物抗
体的可变结构域序列对已知的人可变结构域序列的整个文库进行筛选。鉴定与啮齿类动
物最接近的人V结构域序列并且接受其中的人构架区(FR)用于人源化的抗体(Sims等，
J.Immunol.(免疫学杂志)151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，
196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生
的特定构架区。同一构架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，美国国家科学院学
报(Proc.Natl.Acad Sci.USA)89：4285(1992)；Presta等，免疫学杂志(J.Immunol.)151：
2623(1993))。
的减少或消除是适合的治疗剂的临床开发的重要方面。见，例如，Khaxzaeli等，J.Natl.
Cancer Inst.(1988)，80：937；Jaffers 等，Transplantation( 移 植 )(1986)，41：572；
Shawler等，J.Immunol.(免疫学杂志)(1985)，135：1530；Sears等，J.Biol.Response
Mod.(1984)，3：138；Miller等，Blood(血液)(1983)，62：988；Hakimi等，J.Immunol(免
疫学杂志).(1991)，147：1352；Reichmann等，Nature(自然)(1988)，332：323；Junghans
等，CancerRes(癌症研究).(1990)，50：1495。如本文所述，本发明提供被人源化从而使
HAMA反应被减少或消除的抗体。这些抗体的变体还可以使用本领域已知的常规方法获得，
其中一些方法在下文进一步描述。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类动物抗
体的可变结构域序列对已知的人可变结构域序列的整个文库进行筛选。鉴定与啮齿类动
物最接近的人V结构域序列并且接受其中的人构架区(FR)用于人源化的抗体(Sims等，
J.Immunol.(免疫学杂志)151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，
196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生
的特定构架区。同一构架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，美国国家科学院学
报(Proc.Natl.Acad Sci.USA)89：4285(1992)；Presta等，免疫学杂志(J.Immunol.)151：
2623(1993))。
[0503] 例如，来自本文所述的抗体的氨基酸序列可以充当起始(母体)序列用于构架和/或高变序列的多样化。起始高变序列所连接的选定的构架序列在本文被称为接纳体人构
架。尽管接纳体人构架可以来自，或衍生自人免疫球蛋白(其VL和/或VH区)，优选地所
述接纳体人构架来自，或衍生自人共有构架序列，因为已经证实这样的构架在人患者中具
有最少的免疫原 性，或无免疫原性。
架。尽管接纳体人构架可以来自，或衍生自人免疫球蛋白(其VL和/或VH区)，优选地所
述接纳体人构架来自，或衍生自人共有构架序列，因为已经证实这样的构架在人患者中具
有最少的免疫原 性，或无免疫原性。
[0504] 如果接纳体衍生自人免疫球蛋白，可以任选地选择这样的人构架序列，所述构架序列基于其与供体构架序列的同源性进行选择，这是通过将供体构架序列与人构架序列的
集合中的各种人构架序列进行比对，并且选择同源性最高的构架序列作为接纳体进行的。
集合中的各种人构架序列进行比对，并且选择同源性最高的构架序列作为接纳体进行的。
[0505] 在一个实施方案中，本文的人共有构架来自，或衍生自VH亚组III和/或VLκ亚组I共有构架序列。
[0506] 尽管不论是来自人免疫球蛋白还是人共有构架，接纳体的序列可以与选定的人构架序列相同，本发明预期接纳体序列可以包含相对于人免疫球蛋白序列或人共有构架序列
的预先存在的氨基酸置换。这些预先存在的置换相对于人免疫球蛋白序列或共有构架序列
优选最少的，通常仅四个、三个、两个或一个氨基酸差异。
的预先存在的氨基酸置换。这些预先存在的置换相对于人免疫球蛋白序列或共有构架序列
优选最少的，通常仅四个、三个、两个或一个氨基酸差异。
[0507] 将非人抗体的高变区残基引入到VL和/或VH接纳体人构架中。例如，可以引入对应于Kabat CDR残基、Chothia高变环残基、Abm残基和/或接触残基的残基。任选地，引入
如下的延伸的高变区残基：24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，26-35B(H1)，50-65，47-65或49-65(H2)和93-102，94-102，或95-102(H3)。
如下的延伸的高变区残基：24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，26-35B(H1)，50-65，47-65或49-65(H2)和93-102，94-102，或95-102(H3)。
[0508] 当在本文讨论高变区残基的“引入”时，要理解这可以通过各种方法实现，例如编码需要的氨基酸序列的核酸可以通过诱变编码小鼠可变结构域序列的核酸从而使其构架
残基改变为接纳体人构架残基，或通过诱变编码人可变结构域序列的核酸从而使所述高变
结构域残基被改变为非人残基，或通过合成编码所需要的序列的核酸等来产生。
残基改变为接纳体人构架残基，或通过诱变编码人可变结构域序列的核酸从而使所述高变
结构域残基被改变为非人残基，或通过合成编码所需要的序列的核酸等来产生。
[0509] 在本文的实例中，使用对每个高变区单独的寡核苷酸，通过编码人接纳体序列的核酸的Kunkel诱变来产生高变区-移植的变体。Kunkel等，Methods Enzymol.(酶学方
法)154：367-382(1987)。使用常规技术，可以将适合的变化引入构架和/或高变区中，从
而校正并且重新建立适合的高变区-抗原相互作用。
法)154：367-382(1987)。使用常规技术，可以将适合的变化引入构架和/或高变区中，从
而校正并且重新建立适合的高变区-抗原相互作用。
[0510] 可以将噬菌体(粒)展示(在本文的一些背景下也称为噬菌体展示)用作在由序列随机化产生的文库中产生和筛选许多不同的潜在变体抗体的方便和快速的方法。然而，
技术人员可以获得用于制备和筛选改变的抗体的 其它方法。
技术人员可以获得用于制备和筛选改变的抗体的 其它方法。
[0511] 噬菌体(粒)展示技术已经提供了产生和选择结合配体(如抗原)的新型蛋白的有利工具。使用噬菌体(粒)展示的技术允许产生蛋白变体的大文库，其可以快速分选以
高亲和性结合靶分子的那些序列。编码变体多肽的核酸通常与编码病毒外壳蛋白的核酸序
列融合，所述病毒外壳蛋白如基因III蛋白或基因VIII蛋白。还已经开发了这样的单价噬
菌粒展示系统，其中将编码蛋白或多肽的核酸序列融合于编码基因III蛋白的一部分的核
酸序列。(Bass，S.，Proteins，8：309(1990)；Lowman和Wells，Methods：A Companion to Methods in Enzymology(方法：酶学方法的手册)，3：205(1991))。在单价噬菌粒展示系统
中，低水平表达基因融合物，并且还表达野生型基因III蛋白从而保持颗粒的感染性。已经
在许多专利(例如，美国专利号5,723,286，美国专利号5,432,018，美国专利号5,580,717，
美国专利号5,427,908和美国专利号5,498,530)中公开了产生肽文库和筛选那些文库的
方法。
高亲和性结合靶分子的那些序列。编码变体多肽的核酸通常与编码病毒外壳蛋白的核酸序
列融合，所述病毒外壳蛋白如基因III蛋白或基因VIII蛋白。还已经开发了这样的单价噬
菌粒展示系统，其中将编码蛋白或多肽的核酸序列融合于编码基因III蛋白的一部分的核
酸序列。(Bass，S.，Proteins，8：309(1990)；Lowman和Wells，Methods：A Companion to Methods in Enzymology(方法：酶学方法的手册)，3：205(1991))。在单价噬菌粒展示系统
中，低水平表达基因融合物，并且还表达野生型基因III蛋白从而保持颗粒的感染性。已经
在许多专利(例如，美国专利号5,723,286，美国专利号5,432,018，美国专利号5,580,717，
美国专利号5,427,908和美国专利号5,498,530)中公开了产生肽文库和筛选那些文库的
方法。
[0512] 已经用多种方法制备了抗体或抗原结合多肽的文库，所述方法包括通过经过插入随机DNA序列改变单基因或通过克隆相关基因的家族。已经在美国专利号5,750,373，
5,733,743，5,837,242，5,969,108，6,172,197，5,580,717，和5,658,727中描述了用于使
用噬菌体(粒)展示来展示抗体或抗原结合片段的方法。接着，筛选所述文库，用于获得具
有需要的特征的抗体或抗原结合蛋白的表达。
5,733,743，5,837,242，5,969,108，6,172,197，5,580,717，和5,658,727中描述了用于使
用噬菌体(粒)展示来展示抗体或抗原结合片段的方法。接着，筛选所述文库，用于获得具
有需要的特征的抗体或抗原结合蛋白的表达。
[0513] 将选择的氨基酸取代到模板核酸中的方法是本领域中充分建立的，其中一些在本文进行了描述。例如，可以使用Kunkel法取代高变区残基。见，例如，Kunkel等.，Methods Enzymol(酶学方法).154：367-382(1987)。
[0514] 寡核苷酸序列包含一个或多个用于待改变的高变区残基的设计的密码子组。密码子组是一组用于编码需要的变体氨基酸的不同核苷酸三联体序列。可以使用指定特定核苷
酸或核苷酸的等摩尔混合物的符号来表示密码子组，如在下面根据IUB编码所显示的。
酸或核苷酸的等摩尔混合物的符号来表示密码子组，如在下面根据IUB编码所显示的。
[0515] IUB编码
[0516] G鸟嘌呤
[0517] A腺嘌呤
[0518] T胸腺嘧啶
[0519] C胞嘧啶
[0520] R(A或G)
[0521] Y(C或T)
[0522] M(A或C)
[0523] K(G或T)
[0524] S(C或G)
[0525] W(A或T)
[0526] H(A或C或T)
[0527] B(C或G或T)
[0528] V(A或C或G)
[0529] D(A或G或T)H
[0530] N(A或C或G或T)
[0531] 例如，在密码子组DVK中，D可以是核苷酸A或G或T，V可以是A或G或C，并且K可以是G或T。该密码子组可以代表18个不同的密码子并且可以编码氨基酸Ala，Trp，
Tyr，Lys，Thr，Asn，Lys，Ser，Arg，Asp，Glu，Gly和Cys。
Tyr，Lys，Thr，Asn，Lys，Ser，Arg，Asp，Glu，Gly和Cys。
[0532] 寡核苷酸或引物组可以使用标准方法合成。可以例如通过固相合成来合成一组寡核苷酸，其包含这样的序列，所述序列代表由密码子组提供的核苷酸三联体的所有可能组
合，并且将编码需要的氨基酸组。合成在某些位置具有选择的核苷酸“简并性”的寡核苷酸
是本领域中众所周知的。这些具有特定密码子组的核苷酸组可以使用商购的核酸合成仪
(获自，例如，Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA)来合成，或其可以
商购获得(例如，来自Life Technologies，Rockville，MD)。因此，具有特定的密码子组的
一组合成的寡核苷酸典型地包括具有不同序列的多种寡核苷酸，所述差异由在全部序列中
的密码子组确定。根据本发明使用的寡核苷酸具有这样的序列，所述序列允许与可变结构
域核酸模板杂交并且还可以包括用于克隆目的的限制性酶切位点。
合，并且将编码需要的氨基酸组。合成在某些位置具有选择的核苷酸“简并性”的寡核苷酸
是本领域中众所周知的。这些具有特定密码子组的核苷酸组可以使用商购的核酸合成仪
(获自，例如，Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA)来合成，或其可以
商购获得(例如，来自Life Technologies，Rockville，MD)。因此，具有特定的密码子组的
一组合成的寡核苷酸典型地包括具有不同序列的多种寡核苷酸，所述差异由在全部序列中
的密码子组确定。根据本发明使用的寡核苷酸具有这样的序列，所述序列允许与可变结构
域核酸模板杂交并且还可以包括用于克隆目的的限制性酶切位点。
[0533] 在一种方法中，编码变体氨基酸的核酸序列可以通过寡核苷酸介导的诱变产生。该技术是本领域中众所周知的，如通过Zoller等.Nucleic Acids Res.(核酸研究)10：
6487-6504(1987)所述。简言之，编码变体氨基酸的核酸序列通过将编码需要的密码子组的
寡核苷酸组与DNA模板杂交来产生，其中所述模板是包含可变区核酸模板序列的质粒的单
链形式。杂交后，将DNA聚合酶用于合成完整的模板的第二互补链，其因此将结合寡核苷酸
引物，并且将包含由寡核苷酸组提供的密码子组。
6487-6504(1987)所述。简言之，编码变体氨基酸的核酸序列通过将编码需要的密码子组的
寡核苷酸组与DNA模板杂交来产生，其中所述模板是包含可变区核酸模板序列的质粒的单
链形式。杂交后，将DNA聚合酶用于合成完整的模板的第二互补链，其因此将结合寡核苷酸
引物，并且将包含由寡核苷酸组提供的密码子组。
[0534] 一般地，使用长度为至少25个核苷酸的寡核苷酸。优化的寡核苷酸具有12-15个核苷酸，其与编码突变的核苷酸的任一侧上的模板完全互补。这确保寡核苷酸将与单链
DNA模板分子适当杂交。使用本领域已知的技术容易地合成寡核苷酸，如由Crea等，Proc.
Nat′l.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，75：5765(1978)所述。
DNA模板分子适当杂交。使用本领域已知的技术容易地合成寡核苷酸，如由Crea等，Proc.
Nat′l.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，75：5765(1978)所述。
[0535] DNA模板由那些载体产生，所述载体由噬菌体M13载体衍生(商购的M13mp18和M13mp19载体是适合的)，或由那些载体产生，所述载体包含单链噬菌体复制起点，如由
Viera等，Meth.Enzymol(酶学方法)，153：3(1987)所述。因此，可以将待突变的DNA插入这
些载体的一个中从而产生单链模板。单链模板的产生如在上述Sambrook等的第4.21-4.41
小节中所述。
Viera等，Meth.Enzymol(酶学方法)，153：3(1987)所述。因此，可以将待突变的DNA插入这
些载体的一个中从而产生单链模板。单链模板的产生如在上述Sambrook等的第4.21-4.41
小节中所述。
[0536] 为了改变天然DNA序列，在适合的杂交条件下将寡核苷酸与单链模板杂交。接着，加入DNA聚合酶，通常是T7DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow片段以合成模板的互补链，
其中使用寡核苷酸作为引物来进行合成。由此形成异源双链体分子，从而使DNA的一条链
编码基因1的突变形式，并且另一条链(起始模板)编码基因1的天然的，未改变的序列。
接着，将该异源双链体分子转化到适合的宿主细胞中，所述宿主细胞通常是原核生物如大
肠杆菌JM101。在培养细胞后，将它们接种到琼脂糖板上并且使用用32-磷酸放射性标记的
寡核苷酸引物筛选以鉴定包含突变的DNA的细菌集落。
其中使用寡核苷酸作为引物来进行合成。由此形成异源双链体分子，从而使DNA的一条链
编码基因1的突变形式，并且另一条链(起始模板)编码基因1的天然的，未改变的序列。
接着，将该异源双链体分子转化到适合的宿主细胞中，所述宿主细胞通常是原核生物如大
肠杆菌JM101。在培养细胞后，将它们接种到琼脂糖板上并且使用用32-磷酸放射性标记的
寡核苷酸引物筛选以鉴定包含突变的DNA的细菌集落。
[0537] 可以改进紧接的上面描述的方法从而可以产生同源双链体分子，其中质粒的两条链都包含突变。修饰如下：如上述，将单链寡核苷酸与单链模板退火。将三种脱氧核糖核苷
酸，即脱氧核糖腺苷(dATP)、脱氧核糖鸟苷(dGTP)和脱氧核糖胸苷(dTT)的混合物与被称
为dCTP-(aS)的修饰的硫代脱氧核糖胞嘧啶(其可以获自Amersham)组合。将该混合物加
入模板-寡核 苷酸复合物。在将DNA聚合酶加入该混合物后，产生除了突变的碱基外与模
板相同的DNA链。此外，DNA的这一新链包含dCTP的dCTP-(aS)替代物，其作用于保护其免
于限制性核酸内切酶消化。在用适合的限制性酶使双链异源双链体的模板链具有切口后，
可以将模板链用ExoIII核酸酶或经过包含待诱变的位点的区域的另一种适合的核酸酶消
化。接着终止该反应，以得到仅部分单链的分子。接着在存在所有四种脱氧核糖核苷三磷
酸，ATP和DNA连接酶的情况下，使用DNA聚合酶形成完整的双链DNA同源双链体。接着可
以将该同源双链体分子转化到适合的宿主细胞中。
酸，即脱氧核糖腺苷(dATP)、脱氧核糖鸟苷(dGTP)和脱氧核糖胸苷(dTT)的混合物与被称
为dCTP-(aS)的修饰的硫代脱氧核糖胞嘧啶(其可以获自Amersham)组合。将该混合物加
入模板-寡核 苷酸复合物。在将DNA聚合酶加入该混合物后，产生除了突变的碱基外与模
板相同的DNA链。此外，DNA的这一新链包含dCTP的dCTP-(aS)替代物，其作用于保护其免
于限制性核酸内切酶消化。在用适合的限制性酶使双链异源双链体的模板链具有切口后，
可以将模板链用ExoIII核酸酶或经过包含待诱变的位点的区域的另一种适合的核酸酶消
化。接着终止该反应，以得到仅部分单链的分子。接着在存在所有四种脱氧核糖核苷三磷
酸，ATP和DNA连接酶的情况下，使用DNA聚合酶形成完整的双链DNA同源双链体。接着可
以将该同源双链体分子转化到适合的宿主细胞中。
[0538] 如以前所述，寡核苷酸组的序列的长度足以与模板核酸杂交并且也可以，但不是必需地，包含限制酶切位点。该DNA模板可以由那些载体产生，所述载体衍生自噬菌体M13
载体，或由包含单链噬菌体复制起点的载体产生，如由Viera等.Meth.Enzymol.(酶学方
法)，153：3(1987)所述。由此，必需将待突变的DNA插入这些载体中的一个从而产生单链
模板。单链模板的产生如在上述Sambrook等的第4.21-4.41小节中所述。
载体，或由包含单链噬菌体复制起点的载体产生，如由Viera等.Meth.Enzymol.(酶学方
法)，153：3(1987)所述。由此，必需将待突变的DNA插入这些载体中的一个从而产生单链
模板。单链模板的产生如在上述Sambrook等的第4.21-4.41小节中所述。
[0539] 根据另一种方法，可以在抗体人源化的过程中，通过选择修复的高变区来恢复抗原结合(见申请号11/061,841，2005年2月18日提交)。该方法包括将非人高变区结合到
接纳体构架上，并且进一步将一个或多个氨基酸置换引入一个或多个高变区中，而不改变
接纳体构架序列。备选地，引入一个或多个氨基酸置换可以伴随在接纳体构架序列中的修
饰。
接纳体构架上，并且进一步将一个或多个氨基酸置换引入一个或多个高变区中，而不改变
接纳体构架序列。备选地，引入一个或多个氨基酸置换可以伴随在接纳体构架序列中的修
饰。
[0540] 根据另一种方法，可以通过提供上游和下游寡核苷酸组来产生文库，每个组具有多种具有不同序列的寡核苷酸，所述不同的序列由寡核苷酸序列中提供的密码子组确定。
上游和下游寡核苷酸组以及可变结构域模板核酸序列可以用于聚合酶链式反应以产生PCR
产物的“文库”。可以将PCR产物称为“核酸盒”，因为使用确定的分子生物学技术，它们可以与其它相关或不相关的核酸序列，例如病毒外壳蛋白和二聚化结构域融合。
上游和下游寡核苷酸组以及可变结构域模板核酸序列可以用于聚合酶链式反应以产生PCR
产物的“文库”。可以将PCR产物称为“核酸盒”，因为使用确定的分子生物学技术，它们可以与其它相关或不相关的核酸序列，例如病毒外壳蛋白和二聚化结构域融合。
[0541] PCR引物的序列包括一个或多个用于高变区中溶剂可接近(solvent accessible)位置和高度多变位置的设计的密码子组。如上所述，密码子组是一组用于编码需要的变体
氨基酸的不同的核苷酸三联体序列。
氨基酸的不同的核苷酸三联体序列。
[0542] 可以分离和使用标准的重组技术克隆当通过适合的筛选/选择步骤选择时，符合需要的标准的抗体选择物。
[0543] 抗体被人源化，同时保留对于抗原的高结合亲和性和其它有利的生物学性质是更为重要的。为了实现这一目的，根据优选的方法，通过下述过程制备人源化的抗体：使用母
体和人源化序列的三维模型来分析母体序列和各种概念上的人源化产物。通常可获得三维
免疫球蛋白模型并且其对于本领域技术人员是熟悉的。可获得这样的计算机程序，其举例
说明并且展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些展示允许分析
残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结
合的能力的残基。以这种方法，可以选择并组合来自受体和输入序列的FR残基从而实现需
要的抗体特征，如关于靶抗原的增加的亲和性。一般地，高变区残基直接并且最实质地涉及
影响抗原结合。
体和人源化序列的三维模型来分析母体序列和各种概念上的人源化产物。通常可获得三维
免疫球蛋白模型并且其对于本领域技术人员是熟悉的。可获得这样的计算机程序，其举例
说明并且展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些展示允许分析
残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结
合的能力的残基。以这种方法，可以选择并组合来自受体和输入序列的FR残基从而实现需
要的抗体特征，如关于靶抗原的增加的亲和性。一般地，高变区残基直接并且最实质地涉及
影响抗原结合。
[0544] 预期人源化的抗-FcRH5抗体的各种形式。例如，该人源化的抗体可以是抗体片段，如Fab，其任选地与一种或多种细胞毒性剂缀合从而产生免疫缀合物。备选地，所述人源化的抗体可以是完整的抗体，如完整的IgG1抗体。
[0545] 作为人源化的备选方式，可以产生人抗体。例如，现在可以产生转基因动物(例如小鼠)，其在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下，能够在免疫后产生人抗体的完整全集。例
如，已经描述在嵌合的和种系突变体小鼠中纯合缺失抗体重链连接区(JH)基因导致完全抑
制内源抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变体小鼠中导致在抗原
攻击后产生人抗体。见，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院
学报)，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature(自然)，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利号5,545,806，5,569,825，5,591,669(GenPharm的全部)；5,545,807；和WO97/17852。
如，已经描述在嵌合的和种系突变体小鼠中纯合缺失抗体重链连接区(JH)基因导致完全抑
制内源抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变体小鼠中导致在抗原
攻击后产生人抗体。见，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院
学报)，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature(自然)，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利号5,545,806，5,569,825，5,591,669(GenPharm的全部)；5,545,807；和WO97/17852。
[0546] 备选地，可以将噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature (自然)348：552-553[1990])用于体外从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因全集来
生产人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆入
丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为
功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功
能特性为基 础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。由此，噬菌体
模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行，综述参见例如Johnson，Kevin
S.和Chiswell，David J.，结构生物学的当前观点(Current Opinion in Structural
Biology)3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等，自然
(Nature)352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到
大量不同的抗噁唑酮抗体。通过基本上遵循Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：
581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)记载的技术，可以自未免疫人供
体构建V基因全集和可以分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国
专利号5,565,332和5,573,905。
生产人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆入
丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为
功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功
能特性为基 础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。由此，噬菌体
模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行，综述参见例如Johnson，Kevin
S.和Chiswell，David J.，结构生物学的当前观点(Current Opinion in Structural
Biology)3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等，自然
(Nature)352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到
大量不同的抗噁唑酮抗体。通过基本上遵循Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：
581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)记载的技术，可以自未免疫人供
体构建V基因全集和可以分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国
专利号5,565,332和5,573,905。
[0547] 如上所讨论的，还可以由体外激活的B细胞来生成人抗体(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。
[0548] 4.抗体片段
[0549] 在某些情形中，使用抗体片段，而非完整的抗体具有益处。片段的更小的大小允许快速清除。并且可以导致对于实体瘤的改善的接近。
[0550] 已经开发了用于生产抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，生物化学和生物物理方法杂志(Journal
of Biochemical and Biophysical Methods)24：107-117(1992)；和Brennan 等，科 学
(Science)229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab，Fv和
ScFv抗体片段可以都在大肠杆菌中表达并且分泌，由此可容易地产生大量的这些片段。可
从上文讨论的噬菌体抗体文库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab’-SH
片段并化学偶联以形成F(ab’)2片段(Cafter等，生物/技术(Bio/Technology)10：
163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab’)2片段。包
含补救受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段在美国专利
号5,869,046中记载。用于产生抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见
的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利
号5,571,894；及美国专利号5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺 少恒定区的
唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以产生
效应器蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合。参见抗体改造(Antibody Engineering)，
Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利5,641,870中所
记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
of Biochemical and Biophysical Methods)24：107-117(1992)；和Brennan 等，科 学
(Science)229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab，Fv和
ScFv抗体片段可以都在大肠杆菌中表达并且分泌，由此可容易地产生大量的这些片段。可
从上文讨论的噬菌体抗体文库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab’-SH
片段并化学偶联以形成F(ab’)2片段(Cafter等，生物/技术(Bio/Technology)10：
163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab’)2片段。包
含补救受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段在美国专利
号5,869,046中记载。用于产生抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见
的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利
号5,571,894；及美国专利号5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺 少恒定区的
唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以产生
效应器蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合。参见抗体改造(Antibody Engineering)，
Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利5,641,870中所
记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
[0551] 5.双特异性抗体
[0552] 双特异性抗体是对至少两个不同的表位具有结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可以结合如本文所述的FcRH5蛋白的两个不同的表位。其它此类抗体可以组合
FcRH5结合位点与关于另一种蛋白的结合位点。备选地，抗-FcRH5臂可以与结合白细胞上
的触发分子如T细胞受体分子(例如，CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)，
FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，从而将细胞防御机制集中和定位到表达
FcRH5的细胞。还可以将双特异性抗体用于将细胞毒性剂定位到表达FcRH5的细胞。这些抗
体具有FcRH5-结合臂和结合细胞毒性剂(例如，肥皂草毒蛋白(saporin)、抗-干扰素-α、
长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可以将双特异性
抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。
FcRH5结合位点与关于另一种蛋白的结合位点。备选地，抗-FcRH5臂可以与结合白细胞上
的触发分子如T细胞受体分子(例如，CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)，
FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，从而将细胞防御机制集中和定位到表达
FcRH5的细胞。还可以将双特异性抗体用于将细胞毒性剂定位到表达FcRH5的细胞。这些抗
体具有FcRH5-结合臂和结合细胞毒性剂(例如，肥皂草毒蛋白(saporin)、抗-干扰素-α、
长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可以将双特异性
抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。
[0553] WO 96/16673记载了双特异性抗-ErbB2/抗-FcyRIII抗体，美国专利号5,837,234公开了双特异性抗-ErbB2/抗-FcγRI抗体。双特异性抗-ErbB2/Fcα抗体显示
在WO98/02463中。美国专利号5,821,337和6,407,213教导双特异性抗-ErbB2/抗-CD3
抗体。已经记载了结合CD3抗原的表位和第二表位的另外的双特异性抗体。参见，例如，
美国专利号5,078,998(抗-CD3/肿瘤细胞抗原)；5,601,819(抗-CD3/IL-2R；抗-CD3/
CD28；抗-CD3/CD45)；6,129,914(抗-CD3/恶性B细胞抗原)；7,112,324(抗-CD3/CD19)；
6,723,538(抗-CD3/CCR5)；7,235,641(抗-CD3/EpCAM)；7,262,276(抗-CD3/卵巢肿瘤抗
原)；和5,731,168(抗-CD3/CD4IgG)。
在WO98/02463中。美国专利号5,821,337和6,407,213教导双特异性抗-ErbB2/抗-CD3
抗体。已经记载了结合CD3抗原的表位和第二表位的另外的双特异性抗体。参见，例如，
美国专利号5,078,998(抗-CD3/肿瘤细胞抗原)；5,601,819(抗-CD3/IL-2R；抗-CD3/
CD28；抗-CD3/CD45)；6,129,914(抗-CD3/恶性B细胞抗原)；7,112,324(抗-CD3/CD19)；
6,723,538(抗-CD3/CCR5)；7,235,641(抗-CD3/EpCAM)；7,262,276(抗-CD3/卵巢肿瘤抗
原)；和5,731,168(抗-CD3/CD4IgG)。
[0554] 用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的 特异性(Millstein等，
自然(Nature)305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤
(四源杂交瘤(quadroma))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确
的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。
类似的方法披露于WO93/08829及Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659(1991)。
自然(Nature)305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤
(四源杂交瘤(quadroma))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确
的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。
类似的方法披露于WO93/08829及Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659(1991)。
[0555] 依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链部、CH2和CH3
区的Ig重链恒定结构域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的
位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和需要时的免疫球蛋白轻链
的DNA插入不同的表达载体，并共转染入合适的宿主细胞。在用于构建的三种多肽链比例
不等时提供需要的双特异性抗体的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互
比例提供了更大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该
比例对需要的链组合的产量没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列
插入一个单表达载体。
区的Ig重链恒定结构域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的
位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和需要时的免疫球蛋白轻链
的DNA插入不同的表达载体，并共转染入合适的宿主细胞。在用于构建的三种多肽链比例
不等时提供需要的双特异性抗体的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互
比例提供了更大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该
比例对需要的链组合的产量没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列
插入一个单表达载体。
[0556] 在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特
异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途
径，因此发现这种不对称结构便于将想要的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合
分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh
等，酶学方法(Methods in Enzymology)121：210(1986)。
异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途
径，因此发现这种不对称结构便于将想要的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合
分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh
等，酶学方法(Methods in Enzymology)121：210(1986)。
[0557] 依照美国专利号5,731,168中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含CH3结构域
的至少一部分。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链
(例如酪氨酸或色氨酸)置换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏
氨酸)置换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿性“空腔”。这
提供了较之其它不想要的终产物，诸如同源二聚体提高异二聚体产量的机制。根据该方法
产生的双特异性抗体在本文中称为“突起-进入-空穴 (protuberance-into-cavity)抗
体”。[0001]双特异性抗体包括交联的或“异源偶联(heteroconjugate)”抗体。例如，在
异源偶联物(heteroconjugate)中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联，而另一种与生物
素偶联。例如，已经建议将此类抗体用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号
4,676,980)，并且用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373，和EP03089)。可以使用
任何方便的交联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交
联技术一起披露于美国专利号4,676,980。
的至少一部分。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链
(例如酪氨酸或色氨酸)置换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏
氨酸)置换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿性“空腔”。这
提供了较之其它不想要的终产物，诸如同源二聚体提高异二聚体产量的机制。根据该方法
产生的双特异性抗体在本文中称为“突起-进入-空穴 (protuberance-into-cavity)抗
体”。[0001]双特异性抗体包括交联的或“异源偶联(heteroconjugate)”抗体。例如，在
异源偶联物(heteroconjugate)中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联，而另一种与生物
素偶联。例如，已经建议将此类抗体用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号
4,676,980)，并且用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373，和EP03089)。可以使用
任何方便的交联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交
联技术一起披露于美国专利号4,676,980。
[0558] 文献中还记载了由抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，科学(Science)229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割
完整抗体以产生F(ab’)2片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠时还原，
以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab′片段转变为硫代硝
基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成
Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生
的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
完整抗体以产生F(ab’)2片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠时还原，
以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab′片段转变为硫代硝
基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成
Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生
的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
[0559] 最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992)记载了完全人源化的双特异
性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分别分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化
学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞
和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳瘤靶标的溶解活性。
性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分别分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化
学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞
和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳瘤靶标的溶解活性。
[0560] 还记载了从重组细胞培养物直接产生和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，免疫学杂志(J.Immunol.)148(5)：
1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体
的Fab′部分连接。抗体同源二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体
异源二聚体。这种方法也可用于生成抗体同源二聚体。Hollinger等，美国国家科学院学
报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了生成双特
异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的VH和 VL，所述接头太短使得同一条
链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上
的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)
二聚体生成双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，免疫学杂志(J.Immunol.)，
152：5368(1994)。
1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体
的Fab′部分连接。抗体同源二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体
异源二聚体。这种方法也可用于生成抗体同源二聚体。Hollinger等，美国国家科学院学
报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了生成双特
异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的VH和 VL，所述接头太短使得同一条
链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上
的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)
二聚体生成双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，免疫学杂志(J.Immunol.)，
152：5368(1994)。
[0561] 预期具有超过两种效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志(J.Immunol.)147：60(1991)。
[0562] 6.异源偶联抗体
[0563] 异源偶联抗体也在本发明的范围内。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体组成。例如，已经提议将此类抗体用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞[美国专利号
4,676,980]，并且用于治疗HIV感染[WO 91/00360；WO92/200373；EP 03089]。预期所述抗
体可以使用在合成蛋白化学中的已知方法进行制备，所述方法包括涉及交联剂的那些。例
如，免疫毒素可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建。用于该目的的适合的
试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯(butyrimidate)和在例如美
国专利号4,676,980中公开的那些。
4,676,980]，并且用于治疗HIV感染[WO 91/00360；WO92/200373；EP 03089]。预期所述抗
体可以使用在合成蛋白化学中的已知方法进行制备，所述方法包括涉及交联剂的那些。例
如，免疫毒素可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建。用于该目的的适合的
试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯(butyrimidate)和在例如美
国专利号4,676,980中公开的那些。
[0564] 7.多价抗体
[0565] 多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化(catabolized))。本发明的抗体可以是可容易的通过重组表达编码抗体多肽
链的核酸而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别
以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构
域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端
的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个
但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(和优选两条多肽链)，其中所
述多肽链包含两个或更多可变结构域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中
VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨
基酸或多肽，而n是 0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或
VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(和优选四条)轻链
可变结构域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变结构域多肽。本
文涵盖的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，且任选进一步包含CL结构域。
链的核酸而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别
以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构
域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端
的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个
但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(和优选两条多肽链)，其中所
述多肽链包含两个或更多可变结构域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中
VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨
基酸或多肽，而n是 0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或
VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(和优选四条)轻链
可变结构域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变结构域多肽。本
文涵盖的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，且任选进一步包含CL结构域。
[0566] 8.效应子功能工程改造
[0567] 可能希望在效应子功能方面修饰本发明的抗体，从而增强例如抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体
的Fc区引入一个或多个氨基酸置换来实现。备选地或另外地，可向Fc区中引入半胱氨酸
残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同源二聚体抗体可具有改善的内
在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见
Caron等，J.Exp.Med 176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，免疫学杂志(J.Immunol.)148：
2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体还可使用如Wolff等，癌症研
究(Cancer Research)53：2560-2565(1993)中记载的异双官能交联剂来制备。或者，抗体
可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等，抗
癌药物设计(Anti-Cancer Drug Design)3：219-230(1989)。为了延长抗体的血清半衰期，
可如例如美国专利5,739,277中记载的将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。
在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc
区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。
的Fc区引入一个或多个氨基酸置换来实现。备选地或另外地，可向Fc区中引入半胱氨酸
残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同源二聚体抗体可具有改善的内
在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见
Caron等，J.Exp.Med 176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，免疫学杂志(J.Immunol.)148：
2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体还可使用如Wolff等，癌症研
究(Cancer Research)53：2560-2565(1993)中记载的异双官能交联剂来制备。或者，抗体
可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等，抗
癌药物设计(Anti-Cancer Drug Design)3：219-230(1989)。为了延长抗体的血清半衰期，
可如例如美国专利5,739,277中记载的将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。
在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc
区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。
[0568] 9.免疫缀合物
[0569] 本发明还涉及包含缀合至细胞毒性剂的抗体的免疫缀合物(在本文交互地称为“抗体-药物缀合物”或“ADCs”)，所述细胞毒性剂诸如化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)。
[0570] 在某些实施方案中，免疫缀合物包含抗体和化疗剂或其它毒素。用于 产生所述免疫缀合物的化疗剂已经在上面进行了描述。可以使用的酶促活性毒素和其片段包括白喉
毒素A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas
aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白
(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白
(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦
瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂
草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、
局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、新霉素(enomycin)和单端孢菌素
212 131
(tricothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射性缀合的抗体。实例包括 Bi， I，
131 90 186
In，Y和 Re。可使用多种双官能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，诸
如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(iminothiolane)
(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺
基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重
氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰
酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双官能衍生物。例如，可以
如Vitetta等，科学(Science)238：1098(1987)中所记载的制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14
标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷
酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。
毒素A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas
aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白
(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白
(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦
瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂
草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、
局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、新霉素(enomycin)和单端孢菌素
212 131
(tricothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射性缀合的抗体。实例包括 Bi， I，
131 90 186
In，Y和 Re。可使用多种双官能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，诸
如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(iminothiolane)
(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺
基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重
氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰
酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双官能衍生物。例如，可以
如Vitetta等，科学(Science)238：1098(1987)中所记载的制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14
标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷
酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。
[0571] 在本文还预期抗体与一种或多种小分子毒素，如加利车霉素(calicheamicin)、auristatin肽，如单甲基auristatin(MMAE)(多拉司他汀的合成类似物)、美坦生类化合
物，如DM1、trichothene和CC1065，以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。
物，如DM1、trichothene和CC1065，以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。
[0572] 示例性的免疫缀合物-抗体-药物缀合物
[0573] 本发明的免疫缀合物(或“抗体-药物缀合物”(“ADC”))可以是下述式I的免疫缀合物，其中抗体通过任选的接头(L)缀合(即共价连接)于一个或多个药物结构部分
(D)。ADCs可以包括硫代MAb药物缀合物(“TDC”)。
(D)。ADCs可以包括硫代MAb药物缀合物(“TDC”)。
[0574] Ab-(L-D)p I
[0575] 因此，所述抗体可以直接或通过接头缀合于药物。在式I中，p是每个抗体的药物结构部分的平均数，其范围例如可以从每个抗体约1个药物结构部分到每个抗体约20个药
物结构部分，并且在某些实施方案中，从每个抗体1个药物结构部分到约8个药物结构部
分。本发明包括包含式I的抗体-药物化合物的混合物的组合物，其中每个抗体的平均药
物负载是约2到约5，或约3到约4。
物结构部分，并且在某些实施方案中，从每个抗体1个药物结构部分到约8个药物结构部
分。本发明包括包含式I的抗体-药物化合物的混合物的组合物，其中每个抗体的平均药
物负载是约2到约5，或约3到约4。
[0576] a.示例性接头
[0577] 接头可以包含一个或多个接头组分。示例性的接头组分包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)，马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)，缬氨酸-瓜氨酸(citrulline)(“val-cit”
或“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)，对-氨基苄氧基羰基(“PAB”)，和由与接头
试剂缀合形成的那些：形成N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯的接头结构部分
4-巯基戊酸(“SPP”)、形成4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸N-琥珀酰亚胺酯的
接头结构部分4-((2，5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基)环己烷羧酸(“SMCC”，在本文也称为
“MCC”)，形成2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯的接头结构部
分4-巯基丁酸(″SPDB″)，(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(“SIAB”)，
作为一个或多个重复单元(″EO″或″PEO″)的乙烯氧基-CH2CH2O-。本领域中已知另外
的接头组分并且在本文描述了一些。本领域中已知不同的接头组分，其中一些在下面进行
了描述。
或“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)，对-氨基苄氧基羰基(“PAB”)，和由与接头
试剂缀合形成的那些：形成N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯的接头结构部分
4-巯基戊酸(“SPP”)、形成4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸N-琥珀酰亚胺酯的
接头结构部分4-((2，5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基)环己烷羧酸(“SMCC”，在本文也称为
“MCC”)，形成2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯的接头结构部
分4-巯基丁酸(″SPDB″)，(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(“SIAB”)，
作为一个或多个重复单元(″EO″或″PEO″)的乙烯氧基-CH2CH2O-。本领域中已知另外
的接头组分并且在本文描述了一些。本领域中已知不同的接头组分，其中一些在下面进行
了描述。
[0578] 接头可以是有利于在细胞中释放药物的“可裂解接头”。例如，可以使用酸不稳定接头(例如，腙)、蛋白酶敏感(例如，肽酶-敏感)的接头、光不稳定的接头、二甲基接头或
含二硫化物的接头(Chari等，癌症研究(Cancer Research)52：127-131(1992)；美国专利
号5,208,020)。
含二硫化物的接头(Chari等，癌症研究(Cancer Research)52：127-131(1992)；美国专利
号5,208,020)。
[0579] 在某些实施方案中，接头如下式II所显示：
[0580] -Aa-Ww-Yy- II
[0581] 其中A是延伸单元(stretcher unit)，a是0-1的整数，W是氨基酸 单元，w是0-12的整数，Y是间隔臂单元，y是0，1，或2；并且Ab，D，和p如上述关于式I的定义。所
述接头的示例性实施方案在US2005-0238649A1中进行了描述，将其通过引用明确结合在
本文中。
述接头的示例性实施方案在US2005-0238649A1中进行了描述，将其通过引用明确结合在
本文中。
[0582] 在一些实施方案中，接头组分可以包含“延伸单元”，其将抗体连接于另一个接头组分或药物结构部分。示例性的延伸单元在下面显示(其中波浪线指示抗体共价连接的位
点)：
点)：
[0583]
[0584] 在一些实施方案中，所述接头组分可以包含氨基酸单元。在一个此类实施方案中，氨基酸单元允许通过蛋白酶裂解接头，由此在暴露于细胞内蛋白酶(如溶菌酶)后促进药
物从免疫缀合物释放。见，例如，Doronina等.(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784。示例性氨基酸单元，包括，但不限于： 二肽、三肽、四肽和五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)，丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)，苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)，
或N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸
(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可以包括天然存
在的氨基酸残基，以及稀有氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。可以关于它们
对被特定酶酶促裂解的选择性设计氨基酸单元并优化，所述酶例如肿瘤相关的蛋白酶，组
织蛋白酶B、C和D或纤维蛋白溶酶蛋白酶。
物从免疫缀合物释放。见，例如，Doronina等.(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784。示例性氨基酸单元，包括，但不限于： 二肽、三肽、四肽和五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)，丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)，苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)，
或N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸
(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可以包括天然存
在的氨基酸残基，以及稀有氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。可以关于它们
对被特定酶酶促裂解的选择性设计氨基酸单元并优化，所述酶例如肿瘤相关的蛋白酶，组
织蛋白酶B、C和D或纤维蛋白溶酶蛋白酶。
[0585] 在一些实施方案中，接头组分可以包含“间隔臂(spacer)”单元，其直接或通过延伸单元和/或氨基酸单元的方式，将抗体连接于药物结构部分。间隔臂单元可以是“自分
解”或“非自分解”的。“非自分解”的间隔臂单元是其中部分或所有的间隔臂单元在酶促
(例如蛋白水解)裂解ADC后保持与药物结构部分的结合的间隔臂单元。非自分解间隔臂
单元的实例包括，但不限于：甘氨酸间隔臂单元和甘氨酸-甘氨酸间隔臂单元。还预期对
序列-特异性的酶促裂解敏感的肽间隔臂的其它组合。例如，通过肿瘤细胞相关蛋白酶酶
促裂解包含甘氨酸-甘氨酸间隔臂单元的ADC导致从ADC的余下部分释放甘氨酸-甘氨
酸-药物结构部分。在一个此类实施方案中，接着可以在肿瘤细胞中对甘氨酸-甘氨酸-药
物结构部分进行单独的水解步骤，由此从药物结构部分裂解甘氨酸-甘氨酸间隔臂单元。
解”或“非自分解”的。“非自分解”的间隔臂单元是其中部分或所有的间隔臂单元在酶促
(例如蛋白水解)裂解ADC后保持与药物结构部分的结合的间隔臂单元。非自分解间隔臂
单元的实例包括，但不限于：甘氨酸间隔臂单元和甘氨酸-甘氨酸间隔臂单元。还预期对
序列-特异性的酶促裂解敏感的肽间隔臂的其它组合。例如，通过肿瘤细胞相关蛋白酶酶
促裂解包含甘氨酸-甘氨酸间隔臂单元的ADC导致从ADC的余下部分释放甘氨酸-甘氨
酸-药物结构部分。在一个此类实施方案中，接着可以在肿瘤细胞中对甘氨酸-甘氨酸-药
物结构部分进行单独的水解步骤，由此从药物结构部分裂解甘氨酸-甘氨酸间隔臂单元。
[0586] “自分解”间隔臂单元允许在无单独的水解步骤情况下释放药物结构部分。在某些实施方案中，接头的间隔臂单元包含对氨基苄基单元。在一个此类实施方案中，对氨基苯
甲醇通过酰胺键连接于氨基酸单元，并且在苯甲醇和细胞毒性剂之间形成氨基甲酸酯、氨
基甲酸甲酯或碳酸酯。见，例如，Hamann等.(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：
1087-1103。在一个实施方案中，所述间隔臂单元是对氨基苄氧基羰基(PAB)。在某些实施方
案中，对氨基苄基单元的亚苯基部分被Qm取代，其中Q是-C1-C8烷基，-O-(C1-C8烷基)，-卤
素，-硝基或-氰基；并且m是0-4范围内的整数。自分解间隔臂单元的实例还包括，但不限
于：电子地类似于对氨基苯甲醇的芳香族化合物(见，例如，US 2005/0256030A1)，如2-氨
基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)和邻位或对位氨基
苄基乙缩醛。可以使用的间隔臂在酰胺键水解后经历环化，如取代和未被取代的4-氨基丁
酸酰胺(Rodrigues等.，Chemistry Biology (化学生物学)，1995，2，223)；适当取代的二
环[2.2.1]和二环[2.2.2]环系统(Storm，等，J.Amer.Chem.Soc.，1972，94，5815)；和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry，等，J.Org.Chem.，1990，55，5867)。在甘氨酸的a-位置被取代的包含胺的药物的消除(Kingsbury，等，J.Med.Chem.，1984，27，1447)也是在ADCs中使用
的自分解的间隔臂的实例。
甲醇通过酰胺键连接于氨基酸单元，并且在苯甲醇和细胞毒性剂之间形成氨基甲酸酯、氨
基甲酸甲酯或碳酸酯。见，例如，Hamann等.(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：
1087-1103。在一个实施方案中，所述间隔臂单元是对氨基苄氧基羰基(PAB)。在某些实施方
案中，对氨基苄基单元的亚苯基部分被Qm取代，其中Q是-C1-C8烷基，-O-(C1-C8烷基)，-卤
素，-硝基或-氰基；并且m是0-4范围内的整数。自分解间隔臂单元的实例还包括，但不限
于：电子地类似于对氨基苯甲醇的芳香族化合物(见，例如，US 2005/0256030A1)，如2-氨
基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)和邻位或对位氨基
苄基乙缩醛。可以使用的间隔臂在酰胺键水解后经历环化，如取代和未被取代的4-氨基丁
酸酰胺(Rodrigues等.，Chemistry Biology (化学生物学)，1995，2，223)；适当取代的二
环[2.2.1]和二环[2.2.2]环系统(Storm，等，J.Amer.Chem.Soc.，1972，94，5815)；和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry，等，J.Org.Chem.，1990，55，5867)。在甘氨酸的a-位置被取代的包含胺的药物的消除(Kingsbury，等，J.Med.Chem.，1984，27，1447)也是在ADCs中使用
的自分解的间隔臂的实例。
[0587] 在一个实施方案中，间隔臂单元是如下述的支链双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)单元，其可以用于结合和释放多种药物。
[0588]
[0589] 其中Q是-C1-C8烷基，-O-(C1-C8烷基)，-卤素，-硝基或-氰基；m是0-4范围内的整数；n是0或1；并且p范围是1到约20。
[0590] 在另一个实施方案中，接头L可以是树突型接头，其用于将一种以上的药物结构部分通过分支、多官能的接头结构部分共价连接于抗体(Sun等(2002)Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters(生物有机和医学化学通讯)12：2213-2215；Sun等(2003)
Bioorganic & Medicinal Chemistry(生物有机和医学化学通讯)11：1761-1768)。树突型
接头可以增加药物与抗体的摩尔比率，即负载，其与ADC的功效相关。因此，如果半胱氨酸
改造的抗体仅具有一个反应性半胱氨酸硫醇基，可以通过树突型接头连接许多药物结构部
分。
Medicinal Chemistry Letters(生物有机和医学化学通讯)12：2213-2215；Sun等(2003)
Bioorganic & Medicinal Chemistry(生物有机和医学化学通讯)11：1761-1768)。树突型
接头可以增加药物与抗体的摩尔比率，即负载，其与ADC的功效相关。因此，如果半胱氨酸
改造的抗体仅具有一个反应性半胱氨酸硫醇基，可以通过树突型接头连接许多药物结构部
分。
[0591] 示例性接头组分及其组合在式II的ADCs的背景下显示在下面：
[0592]
[0593] 可以通过本领域已知的方法，如在US 2005-0238649A1中所述的那些合成接头组分，包括延伸单元、间隔臂单元和氨基酸单元。
[0594] b.示例性药物结构部分
[0595] (1)美坦生和美坦生类药物
[0596] 在一些实施方案中，免疫缀合物包含与一种或多种美坦生类化合物分子缀合的抗体。美坦生类化合物是通过抑制微管蛋白聚合来起作用的有丝分裂抑制剂。美坦生最初从
东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离到 (美国专利号3896111)。随后发现某些
微生物也产生美坦生类化合物，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。合成
的美登醇及其衍生物和类似物披露于例如美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；
4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；
4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；
4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中。
东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离到 (美国专利号3896111)。随后发现某些
微生物也产生美坦生类化合物，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。合成
的美登醇及其衍生物和类似物披露于例如美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；
4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；
4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；
4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中。
[0597] 美坦生类化合物药物结构部分是在抗体药物缀合物中有吸引力的药物结构部分，因为它们(i)相对容易地通过发酵或化学修饰或发酵产物的衍生作用制备，(ii)易于通过
用适合通过二硫键和非二硫键接头缀合于抗体的官能团进行衍生化，(iii)在血浆中稳定，
和(iv)针对多种肿瘤细胞系是有效的。
用适合通过二硫键和非二硫键接头缀合于抗体的官能团进行衍生化，(iii)在血浆中稳定，
和(iv)针对多种肿瘤细胞系是有效的。
[0598] 适合用作美坦生类化合物药物结构部分的美坦生化合物是本领域公知的，并且可以根据已知方法从天然来源分离或使用遗传改造和发酵技术生产(US 6790952；US
2005/0170475；Yu等(2002)PNAS 99：7968-7973)。还可以根据已知方法合成制备美登醇和
美登醇类似物。
2005/0170475；Yu等(2002)PNAS 99：7968-7973)。还可以根据已知方法合成制备美登醇和
美登醇类似物。
[0599] 示例性的美坦生类化合物药物结构部分包括具有修饰的芳香环的那些，如C-19-脱氯(美国专利号4256746)(通过安丝菌素P2的氢化铝锂还原制备)；C-20-羟基
(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利号4361650和4307016)(通过使用链霉菌属
(Streptomyces)或放线菌属(Actinomyces)的脱甲基作用或使用LAH的脱氯作用制备)；
和C-20-脱甲氧，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-脱氯(美国专利号4,294,757)(通过使用酰
基氯酰化制备)和在其它位置具有修饰的那些。
(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利号4361650和4307016)(通过使用链霉菌属
(Streptomyces)或放线菌属(Actinomyces)的脱甲基作用或使用LAH的脱氯作用制备)；
和C-20-脱甲氧，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-脱氯(美国专利号4,294,757)(通过使用酰
基氯酰化制备)和在其它位置具有修饰的那些。
[0600] 示例性的美坦生类化合物药物结构部分还包括具有修饰的那些，如：C-9-SH(美国专利号4424219)(通过美登醇与H2S或P2S5反应制备)，C-14-烷氧基甲基(脱甲氧/
CH2OR)(US 4331598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利号4450254)
(制备自诺卡氏菌属(Nocardia))；C-15-羟基/酰氧基(US 4364866)(通过链霉菌转化美
登醇制备)；C-15-甲氧基(美国专利号4313946和4315929)(分离自Trewia nudlflora)；
C-18-N-脱甲基(美国专利号4362663和4322348)(通过链霉菌对美登醇进行脱甲基化作
用制备)，和4，5-脱氧(US 4371533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原制 备)。
CH2OR)(US 4331598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利号4450254)
(制备自诺卡氏菌属(Nocardia))；C-15-羟基/酰氧基(US 4364866)(通过链霉菌转化美
登醇制备)；C-15-甲氧基(美国专利号4313946和4315929)(分离自Trewia nudlflora)；
C-18-N-脱甲基(美国专利号4362663和4322348)(通过链霉菌对美登醇进行脱甲基化作
用制备)，和4，5-脱氧(US 4371533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原制 备)。
[0601] 取决于连接的类型，美坦生化合物上的许多位置可用作连接位置。例如，为了形成酯连接，具有羟基的C-3位置，用羟甲基修饰的C-14位置，用羟基修饰的C-15位置和具
有羟基的C-20位置都是适合的(US 5208020；US RE39151；US 6913748；US 7368565；US
2006/0167245；US2007/0037972)。
有羟基的C-20位置都是适合的(US 5208020；US RE39151；US 6913748；US 7368565；US
2006/0167245；US2007/0037972)。
[0602] 美坦生类化合物药物结构部分包括具有下述结构的那些：
[0603]
[0604] 其中波浪线指示美坦生类化合物药物结构部分的硫原子与ADC的接头的共价连接。R可以独立地是H或C1-C6烷基。将酰胺基团连接于硫原子的亚烷基链可以是甲烷基、乙
烷基或丙基，即m是1，2，或3(US 633410；US 5208020；US 7276497；Chari等(1992)Cancer Res(癌症研究).52：127-131；Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国国家科学院学
报)93：8618-8623)。
烷基或丙基，即m是1，2，或3(US 633410；US 5208020；US 7276497；Chari等(1992)Cancer Res(癌症研究).52：127-131；Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国国家科学院学
报)93：8618-8623)。
[0605] 关于本发明的化合物预期美坦生类化合物药物结构部分的所有立体异构体，即在D的手性碳的R和S构型的任何组合。在一个实施方案中，美坦生类化合物药物结构部分具
有下述立体化学结构：
有下述立体化学结构：
[0606]
[0607] 美坦生类化合物药物结构部分的示例性实施方案包括：DM1；DM3；和DM4，其具有下述结构：
[0608]
[0609]
[0610] 其中波浪线指示药物的硫原子与抗体-药物缀合物的接头(L)共价连接。(WO2005/037992；US 2005/0276812A1)。
[0611] 其它示例性美坦生类化合物抗体-药物缀合物具有下述结构和缩写，(其中Ab是抗体并且p是1到约8)：
[0612]
[0613]
[0614] 在一个实施方案中，形成这样的抗体-药物缀合物，其中DM4通过SPDB接头连接于抗体的硫醇基(见美国专利号6913748和7276497，全部内容通过引用结合在本文)。
[0615] 其中DM1通过BMPEO接头连接于抗体的硫醇基的示例性抗体-药物缀合物具有下述结构和缩写：
[0616]
[0617] 其中Ab是抗体；n是0，1，或2；并且p是1，2，3，或4。
[0618] 包含美坦生类化合物的免疫缀合物，制备其的方法，和它们的治疗应用在例如Erickson，等(2006)Cancer Res(癌症研究).66(8)：4426-4433；美国专利号5,208,020，
5,416,064，US 2005/0276812A1，和欧洲专利EP 0425235B1中公开，将其公开内容通过引
用明确结合在本文中。
5,416,064，US 2005/0276812A1，和欧洲专利EP 0425235B1中公开，将其公开内容通过引
用明确结合在本文中。
[0619] 抗体-美坦生类化合物缀合物通过将抗体化学连接于美坦生类化合物分子而制备，并且未显著削弱抗体或美坦生类化合物分子的生物学活性。见，例如，美国专利号
5,208,020(将其公开内容通过引用明确地结合在本 文中)。美坦生类化合物可通过已知
技术合成或从天然来源分离。例如美国专利号5,208,020及上文提及的其它专利和非专利
出版物中披露了合适的美坦生类化合物，如美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过
修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
5,208,020(将其公开内容通过引用明确地结合在本 文中)。美坦生类化合物可通过已知
技术合成或从天然来源分离。例如美国专利号5,208,020及上文提及的其它专利和非专利
出版物中披露了合适的美坦生类化合物，如美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过
修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
[0620] 本领域知道许多连接基团可用于生成抗体-美坦生类化合物缀合物，包括例如美国专利号5208020或欧洲专利0425235B1；Chari等，癌症研究(Cancer Research)52：
127-131(1992)和US 2005/016993A1中所披露的那些，将其公开内容通过引用明确结合
在本文中。可以如在US2005/0276812A1，“Antibody-drug conjugates and Methods.(抗
体-药物缀合物和方法)”中所述制备包含接头组分SMCC的抗体-美坦生类化合物缀合
物。接头包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，正如上述专利中所披露的。在本文中描述和例示其它接头。
127-131(1992)和US 2005/016993A1中所披露的那些，将其公开内容通过引用明确结合
在本文中。可以如在US2005/0276812A1，“Antibody-drug conjugates and Methods.(抗
体-药物缀合物和方法)”中所述制备包含接头组分SMCC的抗体-美坦生类化合物缀合
物。接头包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，正如上述专利中所披露的。在本文中描述和例示其它接头。
[0621] 可使用多种双官能蛋白质偶联剂来制备抗体与美坦生类化合物的缀合物，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚
胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚氨酸酯(诸
如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如
戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如
双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活
性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双官能衍生物。在某些实施方案中，偶联
剂是N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，生物化学杂志
(Biochem.J.)173：723-737(1978))或N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，
以提供二硫键。
胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚氨酸酯(诸
如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如
戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如
双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活
性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双官能衍生物。在某些实施方案中，偶联
剂是N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，生物化学杂志
(Biochem.J.)173：723-737(1978))或N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，
以提供二硫键。
[0622] 根据连接的类型，可将接头连接于美坦生类化合物分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯连接。反应可发生在具有羟基的C-3位置、用羟
甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置。在一个实施方案
中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。
甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置。在一个实施方案
中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。
[0623] (2).Auristatins和多拉司他汀(dolastatins)
[0624] 在一些实施方案中，免疫缀合物包含抗体，其缀合于多拉司他汀或多拉司他汀(dolostatin)肽类似物或衍生物，例如，auristatin(美国专利号5635483；5780588)。已
经显示多拉司他汀和auristatins干扰微管动力学，GTP水解，和核和细胞分裂(Woyke等
(2001)抗微生物剂和化学治疗(Antimicrob.Agents and Chemother.)45(12)：3580-3584)
并且具有抗癌(美国专利号5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)抗微生物剂和
化学治疗(Antimicrob.Agents and Chemother.)42：2961-2965)。可以将多拉司他汀或
auristatin药物结构部分通过肽药物结构部分的N(氨基)端或C(羧基)端连接于抗体
(WO 02/088172)。
经显示多拉司他汀和auristatins干扰微管动力学，GTP水解，和核和细胞分裂(Woyke等
(2001)抗微生物剂和化学治疗(Antimicrob.Agents and Chemother.)45(12)：3580-3584)
并且具有抗癌(美国专利号5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)抗微生物剂和
化学治疗(Antimicrob.Agents and Chemother.)42：2961-2965)。可以将多拉司他汀或
auristatin药物结构部分通过肽药物结构部分的N(氨基)端或C(羧基)端连接于抗体
(WO 02/088172)。
[0625] 示例性auristatin实施方案包括N-端连接的单甲基auristatin药物结构部分DE和DF(US 2005/0238649，在Senter等，Proceedings of the American Association for
Cancer Research(美国癌症研究协会会议录)，卷45，摘要号623，2004年3月28日出版中
公开，将其公开内容全部通过引用结合在本文中)。
Cancer Research(美国癌症研究协会会议录)，卷45，摘要号623，2004年3月28日出版中
公开，将其公开内容全部通过引用结合在本文中)。
[0626] 肽药物结构部分可以选自下述的式DE和DF：
[0627]
[0628] 其中DE和DF的波浪线指示与抗体或抗体-接头组分的共价连接位点，并且在每个位置，独立地：
[0629] R2选自H和C1-C8烷基；
[0630] R3选自H，C1-C8烷基，C3-C8碳环，芳基，C1-C8烷基-芳基，C1-C8烷基-(C3-C8碳环)，C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
[0631] R4选自H，C1-C8烷基，C3-C8碳环，芳基，C1-C8烷基-芳基，C1-C8烷基-(C3-C8碳环)，C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
[0632] R5选自H和甲基；
[0633] 或R4和R5共同形成碳环并且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb独立地选自H，C1-C8烷基和C3-C8碳环并且n选自2，3，4，5和6；
[0634] R6选自H和C1-C8烷基；
[0635] R7选自H，C1-C8烷基，C3-C8碳环，芳基，C1-C8烷基-芳基，C1-C8烷基-(C3-C8碳环)，C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
[0636] 每个R8独立地选自H，OH，C1-C8烷基，C3-C8碳环和O-(C1-C8烷基)；
[0637] R9选自H和C1-C8烷基；
[0638] R10选自芳基或C3-C8杂环；
[0639] Z是O，S，NH，或NR12，其中R12是C1-C8烷基；
[0640] R11选自H，C1-C20烷基，芳基，C3-C8杂环，-(R13O)m-R14，或-(R13O)m-CH(R15)2；
[0641] m是范围在1-1000的整数；
[0642] R13是C2-C8烷基；
[0643] R14是H或C1-C8烷基；
[0644] R15的每个存在独立地是H，COOH，-(CH2)n-N(R16)2，-(CH2)n-SO3H，或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；
[0645] R16的每个存在独立地是H，C1-C8烷基，或-(CH2)n-COOH；
[0646] R18 选 自 -C(R8)2-C(R8)2- 芳 基，-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 杂 环 )，8 8
和-C(R)2-C(R)2-(C3-C8碳环)；并且
和-C(R)2-C(R)2-(C3-C8碳环)；并且
[0647] n是范围在0-6的整数。
[0648] 在一个实施方案中，R3，R4和R7独立地是异丙基或仲丁基并且R5是-H或甲基。在3 4 5 7
示例性的实施方案中，R 和R 分别是异丙基，R 是-H，并且R 是仲丁基。
示例性的实施方案中，R 和R 分别是异丙基，R 是-H，并且R 是仲丁基。
[0649] 在又一个实施方案中，R2和R6分别是甲基，并且R9是-H。
[0650] 在又一个实施方案中，R8的每个存在是-OCH3。
[0651] 在示例性的实施方案中，R3和R4分别是异丙基，R2和R6分别是甲基，R5是-H，R78 9
是仲丁基，R 的每个存在是-OCH3，并且R 是-H。
是仲丁基，R 的每个存在是-OCH3，并且R 是-H。
[0652] 在一个实施方案中，Z是-O-或-NH-。
[0653] 在一个实施方案中，R10是芳基。
[0654] 在一个示例性实施方案中，R10是-苯基。
[0655] 在一个示例性实施方案中，当Z是-O-时，R11是-H，甲基或叔丁基。
[0656] 在一个实施方案中，当Z是-NH时，R11是-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-N(R16)2，并16
且R 是-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
且R 是-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
[0657] 在另一个实施方案中，当Z是-NH时，R11是-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-SO3H。
[0658] 式DE的示例性auristatin实施方案是MMAE，其中波浪线指示与抗体-药物缀合物的接头(L)的共价连接：
[0659]
[0660] 式DF的示例性auristatin实施方案是MMAF，其中波浪线指示与抗体-药物缀合物的接头(L)的共价连接(见US 2005/0238649和Doronina等(2006)Bioconjugate Chem(生
物缀合物化学).17：114-124)：
物缀合物化学).17：114-124)：
[0661]
[0662] 其它示例性实施方案包括在五肽auristatin药物结构部分的C端具有苯丙氨酸羧基修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008848)和在五肽auristatin药物结构部分的
C-端具有苯丙氨酸侧链修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008603)。
C-端具有苯丙氨酸侧链修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008603)。
[0663] 其它药物结构部分包括下述MMAF衍生物，其中波浪线指示与抗体-药物缀合物的接头(L)的共价连接：
[0664]
[0665]
[0666] 在一个方面中，亲水性基团(包括，但不限于，三甘醇酯(TEG))，如上显示，可以在11
R 连接于药物结构部分。不受任何具体理论束缚，亲水性基团辅助药物结构部分的内在化
和非团聚作用。
R 连接于药物结构部分。不受任何具体理论束缚，亲水性基团辅助药物结构部分的内在化
和非团聚作用。
[0667] 包含auristatin/多拉司他汀或其衍生物的式I的ADCs的示例性实施方案在US2005-0238649和Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124中描述，将其通过引
用明确地结合在本文中。包含MMAE或MMAF和其各种接头组分的式I的ADCs的示例性实
施方案具有下述结构和缩写(其中“Ab”是抗体；p是1到约8，“Val-Cit”或“vc”是缬氨
酸-瓜氨酸二肽；并且“S”是硫原子。要注意在本文的硫连接的ADC的某些结构描述中，将
抗体表示为“Ab-S”，以仅指示硫连接特征，而并不指示具体的硫原子具有多个接头-药物
结构部分。下述结构左边的括号也可以被置于硫原子的左侧，在Ab和S之间，这是贯穿本
文描述的本发明的ADC的等价描述。
用明确地结合在本文中。包含MMAE或MMAF和其各种接头组分的式I的ADCs的示例性实
施方案具有下述结构和缩写(其中“Ab”是抗体；p是1到约8，“Val-Cit”或“vc”是缬氨
酸-瓜氨酸二肽；并且“S”是硫原子。要注意在本文的硫连接的ADC的某些结构描述中，将
抗体表示为“Ab-S”，以仅指示硫连接特征，而并不指示具体的硫原子具有多个接头-药物
结构部分。下述结构左边的括号也可以被置于硫原子的左侧，在Ab和S之间，这是贯穿本
文描述的本发明的ADC的等价描述。
[0668]
[0669]
[0670] 包含MMAF和各种接头组分的式I的ADCs的示例性实施方案还包括Ab-MC-PAB-MMAF和Ab-PAB-MMAF。有趣的是，显示包含通过不可蛋白水解裂解的接头连接
于抗体的MMAF的免疫缀合物与包含通过可蛋白水解裂解的接头连接于抗体的MMAF的免疫
缀合物具有相当的活性。见，Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124。在这样
的情形中，认为药物释放被细胞中的抗体降解影响。同处。
于抗体的MMAF的免疫缀合物与包含通过可蛋白水解裂解的接头连接于抗体的MMAF的免疫
缀合物具有相当的活性。见，Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124。在这样
的情形中，认为药物释放被细胞中的抗体降解影响。同处。
[0671] 典型地，基于肽的药物结构部分可以通过在两种以上的氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。所述肽键可以例如根据在肽化学领域中公知的液相合成方法制备
(见E. 和K.Lübke，“肽(The Peptides)”，卷1，第76-136页，1965，学术出版
社)。所述auristatin/多拉司他汀药物结构部分可以根据下列所述的方法进行制备：US
2005-0238649A1；美国专利号5635483；美国专利号5780588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.
Soc.111：5463-5465；Pettit等(1998)抗癌药物设计(Anti-Cancer Drug Design)13：
243-277；Pettit，G R.，等合成(Synthesis)，1996，719-725；Pettit等(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15：859-863；和Doronina(2003)自然生物技术(Nat Biotechnol)21(7)：
778-784。
(见E. 和K.Lübke，“肽(The Peptides)”，卷1，第76-136页，1965，学术出版
社)。所述auristatin/多拉司他汀药物结构部分可以根据下列所述的方法进行制备：US
2005-0238649A1；美国专利号5635483；美国专利号5780588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.
Soc.111：5463-5465；Pettit等(1998)抗癌药物设计(Anti-Cancer Drug Design)13：
243-277；Pettit，G R.，等合成(Synthesis)，1996，719-725；Pettit等(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15：859-863；和Doronina(2003)自然生物技术(Nat Biotechnol)21(7)：
778-784。
[0672] 具体地，式DF的auristatin/多拉司他汀药物结构部分，如MMAF和其衍生物可以使用在US 2005-0238649A1和Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124中
所述的方法进行制备。式DE的Auristatin/多拉司他汀药物结构部分，如MMAE及其衍生
物可以使用在Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784中描述的方法进行制备。药
物-接头结构部分MC-MMAF，MC-MMAE，MC-vc-PAB-MMAF，和MC-vc-PAB-MMAE可以方便地通
过常规方法(例如如在Doronina等.(2003)Nat.Biotech.21：778-784，和专利申请公开号
US 2005/0238649A1中所述)进行合成，接 着可以缀合于目的抗体。
所述的方法进行制备。式DE的Auristatin/多拉司他汀药物结构部分，如MMAE及其衍生
物可以使用在Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784中描述的方法进行制备。药
物-接头结构部分MC-MMAF，MC-MMAE，MC-vc-PAB-MMAF，和MC-vc-PAB-MMAE可以方便地通
过常规方法(例如如在Doronina等.(2003)Nat.Biotech.21：778-784，和专利申请公开号
US 2005/0238649A1中所述)进行合成，接 着可以缀合于目的抗体。
[0673] (3)加利车霉素(Calicheamicin)
[0674] 在其它实施方案中，免疫缀合物包含与一个或多个加利车霉素分子缀合的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族缀
合物的制备参见美国专利号5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；
5,770,710；5,773,001；5,877,296(都属于美国Cyanamid公司)。可使用的加利车霉素
I I I I I
结构类似物包括，但不限于γ1、α2、α3、N-乙酰基-γ1、PSAG和θ1(Hinman等，癌症
研究(Cancer Research)53：3336-3342(1993)；Lode等，癌症研究(Cancer Research)58：
2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可以与抗体偶联的另一
种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不
易穿过质膜。因此，这些药剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒
性效果。
合物的制备参见美国专利号5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；
5,770,710；5,773,001；5,877,296(都属于美国Cyanamid公司)。可使用的加利车霉素
I I I I I
结构类似物包括，但不限于γ1、α2、α3、N-乙酰基-γ1、PSAG和θ1(Hinman等，癌症
研究(Cancer Research)53：3336-3342(1993)；Lode等，癌症研究(Cancer Research)58：
2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可以与抗体偶联的另一
种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不
易穿过质膜。因此，这些药剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒
性效果。
[0675] c.其它细胞毒性药剂
[0676] 可以缀合于抗体的其它抗肿瘤药剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)和5-氟尿嘧啶，在美国专利号5,053,394，5,770,710中所述的统称为
LL-E33288复合物的药剂家族以及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利号5,877,296)
等。
LL-E33288复合物的药剂家族以及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利号5,877,296)
等。
[0677] 可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A
链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油
桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolacca
americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯
树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、
白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素
(phenomycin)、新霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10
月28日公布的WO 93/21232。
链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油
桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolacca
americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯
树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、
白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素
(phenomycin)、新霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10
月28日公布的WO 93/21232。
[0678] 本发明还预期在抗体和具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫缀合物。
[0679] 在某些实施方案中，免疫缀合物可以包含高度的放射性原子。可以将多种放射性211 131 125 90 186 188 153 212
同位素用于生产放射性缀合的抗体。实例包括At ，I ，I ，Y ，Re ，Re ，Sm ，Bi ，
32 212
P ，Pb 和Lu的放射性同位素。当将所述免疫缀合物用于检测时，其可以包含用于闪烁照
99m 123
相研究的放射性原子，例如tc 或I ，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，
mri)的自旋标记，如碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
同位素用于生产放射性缀合的抗体。实例包括At ，I ，I ，Y ，Re ，Re ，Sm ，Bi ，
32 212
P ，Pb 和Lu的放射性同位素。当将所述免疫缀合物用于检测时，其可以包含用于闪烁照
99m 123
相研究的放射性原子，例如tc 或I ，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，
mri)的自旋标记，如碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
[0680] 可以将放射性或其它标记以已知方式结合在所述免疫缀合物中。例如，肽可以生物合成，或可以通过使用适合的氨基酸前体的化学氨基酸合成进行合成，所述氨基酸前
99m 123 186 188
体包括，例如用氟-19取代氢。可以通过半胱氨酸残基将标记如tc 或I ，Re ，Re
111
和In 连接在肽中。钇-90可以通过赖氨酸残基连接。可以将IODOGEN方法(Fraker
等(1978)生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun).80：49-57)用
于结合碘-123，″在免疫闪烁照相法中的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies in
Immunoscintigraphy)″(Chatal，CRC Press 1989)详细描述了其他方法。
99m 123 186 188
体包括，例如用氟-19取代氢。可以通过半胱氨酸残基将标记如tc 或I ，Re ，Re
111
和In 连接在肽中。钇-90可以通过赖氨酸残基连接。可以将IODOGEN方法(Fraker
等(1978)生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun).80：49-57)用
于结合碘-123，″在免疫闪烁照相法中的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies in
Immunoscintigraphy)″(Chatal，CRC Press 1989)详细描述了其他方法。
[0681] 在某些实施方案中，免疫缀合物可以包含缀合于前体药物-激活的酶的抗体，所述前体药物-激活的酶将前体药物(例如，肽基化疗剂，见WO81/01145)转化为活性药物，
如抗癌药。可以将所述免疫缀合物用于抗体-依赖性酶介导的前体药物治疗(“ADEPT”)。
可以缀合于抗体的酶包括，但不限于：碱性磷酸酶，其用于将包含磷酸的前体药物转化为游
离药物；芳基硫酸酯酶，其用于将包含硫酸酯的前体药物转化为游离药物；胞嘧啶脱脒基
酶，其用于将非毒性的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物，即5-氟尿嘧啶；蛋白酶，如沙雷菌蛋白
酶(serratia protease)、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织
蛋白酶B和L)，其用于将包含肽的前体药物转化为游离药物；D-丙氨酰羧肽酶，其用于转化
包含D-氨基酸取代基的前体药物；糖-裂解酶如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，其用于将
糖基化的前体药物转化为游离药物；β-内酰胺酶，其用于将被β-内酰胺衍生化的药物转
化为游离药物；和青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶，其用于将这样的药
物转化为游离药物，所述药物的胺氮分别用苯 氧基乙酰基或苯基乙酰基基团衍生化。酶可
以通过本领域公知的重组DNA技术共价结合于抗体。见，例如，Neuberger等.，Nature(自
然)312：604-608(1984)。
如抗癌药。可以将所述免疫缀合物用于抗体-依赖性酶介导的前体药物治疗(“ADEPT”)。
可以缀合于抗体的酶包括，但不限于：碱性磷酸酶，其用于将包含磷酸的前体药物转化为游
离药物；芳基硫酸酯酶，其用于将包含硫酸酯的前体药物转化为游离药物；胞嘧啶脱脒基
酶，其用于将非毒性的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物，即5-氟尿嘧啶；蛋白酶，如沙雷菌蛋白
酶(serratia protease)、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织
蛋白酶B和L)，其用于将包含肽的前体药物转化为游离药物；D-丙氨酰羧肽酶，其用于转化
包含D-氨基酸取代基的前体药物；糖-裂解酶如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，其用于将
糖基化的前体药物转化为游离药物；β-内酰胺酶，其用于将被β-内酰胺衍生化的药物转
化为游离药物；和青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶，其用于将这样的药
物转化为游离药物，所述药物的胺氮分别用苯 氧基乙酰基或苯基乙酰基基团衍生化。酶可
以通过本领域公知的重组DNA技术共价结合于抗体。见，例如，Neuberger等.，Nature(自
然)312：604-608(1984)。
[0682] d.药物负载
[0683] 药物负载由p表示，p即在式I的分子中，每个抗体的药物结构部分的平均数。药物负载的范围可以是每个抗体1-20个药物结构部分(D)。式I的ADCs包括与1-20范围
的药物结构部分缀合的抗体集合。在通过缀合反应制备ADC中，每个抗体的平均数目的药
物结构部分可以通过常规方式如质谱、ELISA测定法和HPLC进行表征。还可以确定ADC关
于p的的定量分布。在一些情形中，其中p是来自具有其它药物负载的ADC的特定值的均
相ADC的分离、纯化和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳的方式来实现。式I抗体-药物
缀合物的药物制剂可以因此是具有与1，2，3，4，或更多个药物结构部分连接的抗体的这些
缀合物的异源混合物。
的药物结构部分缀合的抗体集合。在通过缀合反应制备ADC中，每个抗体的平均数目的药
物结构部分可以通过常规方式如质谱、ELISA测定法和HPLC进行表征。还可以确定ADC关
于p的的定量分布。在一些情形中，其中p是来自具有其它药物负载的ADC的特定值的均
相ADC的分离、纯化和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳的方式来实现。式I抗体-药物
缀合物的药物制剂可以因此是具有与1，2，3，4，或更多个药物结构部分连接的抗体的这些
缀合物的异源混合物。
[0684] 对于一些抗体-药物缀合物，p可能受到抗体上的连接位点数目的限制。例如，如在上述示例性实施方案中，如果连接是半胱氨酸的硫醇，抗体可以仅具有一个或多个半胱
氨酸硫醇基，或可以仅具有一个或多个具有充分反应性的硫醇基，通过所述硫醇基可以连
接接头。在某些实施方案中，更高的药物负载，例如p＞5，可导致某些抗体-药物缀合物的
聚集、不溶解性、毒性或细胞渗透性的损失。在某些实施方案中，关于本发明的ADC的药物
负载范围是1到约8，约2到约6，或约3到约5。事实上，已经显示关于某些ADC，药物结构
部分/抗体的最优比率可以是少于8，并且可以是约2到约5。见US 2005-0238649A1。
氨酸硫醇基，或可以仅具有一个或多个具有充分反应性的硫醇基，通过所述硫醇基可以连
接接头。在某些实施方案中，更高的药物负载，例如p＞5，可导致某些抗体-药物缀合物的
聚集、不溶解性、毒性或细胞渗透性的损失。在某些实施方案中，关于本发明的ADC的药物
负载范围是1到约8，约2到约6，或约3到约5。事实上，已经显示关于某些ADC，药物结构
部分/抗体的最优比率可以是少于8，并且可以是约2到约5。见US 2005-0238649A1。
[0685] 在某些实施方案中，少于理论最大值的药物结构部分在缀合反应中与抗体缀合。如下讨论，抗体可以包含，例如赖氨酸残基，其不与药物-接头中间体或接头试剂反应。一
般地，抗体不包含许多可以与药物结构部分连接的游离和反应性半胱氨酸硫醇基，实际上，
在抗体中大多数半胱氨酸硫醇残基作为二硫化物桥的方式存在。在某些实施方案中，抗体
可以在部分或完全还原条件下，用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还
原，以产生反应性的半胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中，抗体经历变性条件以暴露反应性
亲核基团，如赖氨酸或半胱氨酸。
般地，抗体不包含许多可以与药物结构部分连接的游离和反应性半胱氨酸硫醇基，实际上，
在抗体中大多数半胱氨酸硫醇残基作为二硫化物桥的方式存在。在某些实施方案中，抗体
可以在部分或完全还原条件下，用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还
原，以产生反应性的半胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中，抗体经历变性条件以暴露反应性
亲核基团，如赖氨酸或半胱氨酸。
[0686] ADC的负载(药物/抗体比率)可以以不同的方式受到控制，例如通过(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，和
(iii)关于半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件。
(iii)关于半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件。
[0687] 要理解，如果一个以上的亲核性基团与药物-接头中间体或接头试剂，随后与药物结构部分试剂反应，那么得到的产物是具有一个或多个与抗体连接的药物结构部分的分
布的ADC化合物的混合物。每个抗体的药物的平均数可以通过双重ELISA抗体测定法从
混合物进行计算，所述双重ELISA抗体测定法是特异于抗体并且特异于药物的。单独的
ADC分子可以通过质谱法在混合物中鉴定，并且通过HPLC，例如疏水性相互作用色谱法进
行分离(见，例如，McDonagh等(2006)Prot.Engr.Design & Selection19(7)：299-307；
Hamblett等(2004)Clin.Cancer Res(临床癌症研究).10：7063-7070；Hamblett，K.J.，等
“Effect of drug loading on the pharmacology，pharmacokinetics，and toxicity of
an anti-CD30 antibody-drug conjugate(药物负载对于抗-CD30抗体-药物缀合物的药
理学、药物代谢动力学和毒性的作用)，”摘要号624，American Association for Cancer
Research(美国癌症研究协会)，2004年会，2004年3月27-31日，Proceedings of the
AACR(AACR会议录)，卷45，2004年3月；Alley，S.C.，等“Controlling the location of
drug attachment in antibody-drug conjugates(控制药物连接在抗体-药物缀合物中
的定位)，”摘要号627，American Association for Cancer Research(美国癌症研究协
会)，2004年会，2004年3月27-31，Proceedings ofthe AACR(AACR会议录)，卷45，2004
年3月)。在某些实施方案中，可以通过电泳或色谱法从缀合混合物中分离具有单负载值的
均相ADC。
布的ADC化合物的混合物。每个抗体的药物的平均数可以通过双重ELISA抗体测定法从
混合物进行计算，所述双重ELISA抗体测定法是特异于抗体并且特异于药物的。单独的
ADC分子可以通过质谱法在混合物中鉴定，并且通过HPLC，例如疏水性相互作用色谱法进
行分离(见，例如，McDonagh等(2006)Prot.Engr.Design & Selection19(7)：299-307；
Hamblett等(2004)Clin.Cancer Res(临床癌症研究).10：7063-7070；Hamblett，K.J.，等
“Effect of drug loading on the pharmacology，pharmacokinetics，and toxicity of
an anti-CD30 antibody-drug conjugate(药物负载对于抗-CD30抗体-药物缀合物的药
理学、药物代谢动力学和毒性的作用)，”摘要号624，American Association for Cancer
Research(美国癌症研究协会)，2004年会，2004年3月27-31日，Proceedings of the
AACR(AACR会议录)，卷45，2004年3月；Alley，S.C.，等“Controlling the location of
drug attachment in antibody-drug conjugates(控制药物连接在抗体-药物缀合物中
的定位)，”摘要号627，American Association for Cancer Research(美国癌症研究协
会)，2004年会，2004年3月27-31，Proceedings ofthe AACR(AACR会议录)，卷45，2004
年3月)。在某些实施方案中，可以通过电泳或色谱法从缀合混合物中分离具有单负载值的
均相ADC。
[0688] e.制备免疫缀合物的某些方法
[0689] 式I的ADC可以通过数种途径进行制备，所述途径利用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂，包括(1)使抗体的亲核基团与二价接头试剂反应以通过共价键
形成Ab-L，随后进行与药物结构部分D的反应；和(2)使药物结构部分的亲核基团与二价
接头试剂反应，以通过共价键形成D-L，随后进行与抗体的亲核基团的反应。用于通过后一
种途径 制备式I的ADC的示例性方法在US 2005-0238649A1中进行描述，将其通过引用明
确地结合在本文中。
形成Ab-L，随后进行与药物结构部分D的反应；和(2)使药物结构部分的亲核基团与二价
接头试剂反应，以通过共价键形成D-L，随后进行与抗体的亲核基团的反应。用于通过后一
种途径 制备式I的ADC的示例性方法在US 2005-0238649A1中进行描述，将其通过引用明
确地结合在本文中。
[0690] 在抗体上的亲核基团包括，但不限于：(i)N-端胺基团，(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸和(iv)糖羟基或氨基，其中抗体被糖基化。胺、硫醇和羟基是亲核的并且能够反应以与接头结构部分和接头试剂上的亲电子基团形成共价键，
所述亲电子基团包括：(i)活性酯如NHS酯，HOBt酯，卤甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基和苄基
卤化物如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基。某些抗体具有可还原的链
间二硫键，即半胱氨酸桥键。通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)
处理从而使抗体被充分或部分还原，抗体可以形成对于与接头试剂缀合的反应性。理论上
每个半胱氨酸桥由此形成两个反应性硫醇亲核基团。可以将另外的亲核基团通过赖氨酸残
基的修饰，例如通过赖氨酸残基与2-亚氨基硫烷(Traut’s试剂)的反应引入抗体，导致胺
向硫醇的转化。可以将反应性硫醇基通过引入一个、两个、三个、四个或更多半胱氨酸残基
引入抗体(例如，通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)。
所述亲电子基团包括：(i)活性酯如NHS酯，HOBt酯，卤甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基和苄基
卤化物如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基。某些抗体具有可还原的链
间二硫键，即半胱氨酸桥键。通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)
处理从而使抗体被充分或部分还原，抗体可以形成对于与接头试剂缀合的反应性。理论上
每个半胱氨酸桥由此形成两个反应性硫醇亲核基团。可以将另外的亲核基团通过赖氨酸残
基的修饰，例如通过赖氨酸残基与2-亚氨基硫烷(Traut’s试剂)的反应引入抗体，导致胺
向硫醇的转化。可以将反应性硫醇基通过引入一个、两个、三个、四个或更多半胱氨酸残基
引入抗体(例如，通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)。
[0691] 本发明的抗体-药物缀合物也可以通过在抗体上的亲电子基团，如醛或酮羰基基团与接头试剂或药物上的亲核基团反应来产生。在接头试剂上的有效亲核基团包括，但不
限于，酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。在一个实施方案中，修饰抗体以引入亲电子结构部分，所述亲电子结构部分能够与接头试剂或药物上的亲核取代基反
应。在另一个实施方案中，可以用例如高碘酸氧化剂氧化糖基化抗体的糖，以形成醛或酮基
团，其可以与接头试剂或药物结构部分的胺基团反应。得到的亚胺席夫碱基团可以形成稳
定的连接，或可以被例如硼氢化物试剂还原从而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，
糖基化的抗体的糖部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以产生抗体中的羰基(醛
和酮)基团，其可以与药物上的适合的基团反应(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。
在另一个实施方案中，包含N-端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致
产生取代第一个氨基酸的醛(Geoghegan和Stroh，(1992)生物缀合物化学(Bioconjugate
Chem).3：138-146；US 5362852)。所述醛可以与药物 结构部分或接头亲核基团反应。
限于，酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。在一个实施方案中，修饰抗体以引入亲电子结构部分，所述亲电子结构部分能够与接头试剂或药物上的亲核取代基反
应。在另一个实施方案中，可以用例如高碘酸氧化剂氧化糖基化抗体的糖，以形成醛或酮基
团，其可以与接头试剂或药物结构部分的胺基团反应。得到的亚胺席夫碱基团可以形成稳
定的连接，或可以被例如硼氢化物试剂还原从而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，
糖基化的抗体的糖部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以产生抗体中的羰基(醛
和酮)基团，其可以与药物上的适合的基团反应(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。
在另一个实施方案中，包含N-端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致
产生取代第一个氨基酸的醛(Geoghegan和Stroh，(1992)生物缀合物化学(Bioconjugate
Chem).3：138-146；US 5362852)。所述醛可以与药物 结构部分或接头亲核基团反应。
[0692] 在药物结构部分上的亲核基团包括，但不限于，能够反应以与在接头结构部分和接头试剂上的亲电子基团形成共价键的胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，所述亲电子基团包括(i)活性酯如NHS酯，HOBt酯，卤甲酸酯，和酰基卤；
(ii)烷基和苄基卤化物如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。
(ii)烷基和苄基卤化物如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。
[0693] 本发明的化合物清楚地涵盖，但不限于：用下述交联剂制备的ADC：BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，磺基-EMCS，磺基-GMBS，磺基-KMUS，磺基-MBS，磺基-SIAB，磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙
烯砜)苯甲酸酯)，其是商购的(例如，来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，
U.S.A；见第467-498页，2003-2004申请手册和目录。
烯砜)苯甲酸酯)，其是商购的(例如，来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，
U.S.A；见第467-498页，2003-2004申请手册和目录。
[0694] 包含抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物也可以使用多种双官能蛋白偶联剂制备，所述双官能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、
琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷
(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二
酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)
己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸
如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双官能
衍生物。例如，可以如Vitetta等，科学(Science)238：1098(1987)中所记载的制备蓖麻毒
素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)
是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。
琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷
(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二
酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)
己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸
如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双官能
衍生物。例如，可以如Vitetta等，科学(Science)238：1098(1987)中所记载的制备蓖麻毒
素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)
是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。
[0695] 备选地，可以例如通过重组技术或肽合成制备包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白。重组DNA分子可以包含编码抗体的区域和缀合物的细胞毒性部分，其彼此邻近或由编
码接头肽的区域分开，所述接头肽不破坏所述缀合物的需要的性质。
码接头肽的区域分开，所述接头肽不破坏所述缀合物的需要的性质。
[0696] 在又一个实施方案中，抗体可以缀合于“受体”(如链霉抗生物素蛋白)以用于肿瘤预先靶向，其中将抗体-受体缀合物施用于患者，随后使用清除 剂从循环中去除未结合
的缀合物，接着施用缀合于细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)的“配体”(例如，抗生物素
蛋白)。
的缀合物，接着施用缀合于细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)的“配体”(例如，抗生物素
蛋白)。
[0697] 示例性免疫缀合物-硫代-抗体药物缀合物
[0698] a.制备半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体
[0699] 本发明的编码半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体的氨基酸序列变体和母体抗-FcRH5抗体的DNA通过多种方法进行制备，所述方法包括，但不限于：从天然来源分离(在天然存
在的氨基酸序列变体的情形中)，通过早期制备的编码所述多肽的DNA的位点定向(或寡
核苷酸介导的)诱变(Carter(1985)等Nucleic Acids Res(核酸研究).13：4431-4443；
Ho 等 (1989)Gene( 基 因 )(Amst.)77：51-59；Kunkel 等 (1987)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA(美国国家科学院学报)82：488；Liu等(1998)J.Biol.Chem(生物化学杂志).273：
20252-20260)、PCR诱变(Higuchi，(1990)在PCR手册(PCRProtocols)，第177-183页中，
Academic Press；Ito等(1991)Gene(基因)102：67-70；Bernhard等(1994)Bioconjugate
Chem(生物缀合物化学).5：126-132；和Vallette等(1989)Nuc.Acids Res(核酸研
究).17：723-733)，和盒式诱变(Wells等(1985)Gene(基因)34：315-323)进行制备。诱
变流程(Mutagenesis protocols)、试剂盒和试剂是商购的，例如 Multi
Site-Direct Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA)。也可以通过使用双链质
粒DNA作为模板的寡核苷酸定向诱变或通过基于PCR的诱变，产生单突变(Sambrook和
Russel，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第3
版；Zoller等(1983)Methods Enzymol(酶学方法).100：468-500；Zoller，M.J.和Smith，
M.(1982)Nucl.Acids Res(核酸研究).10：6487-6500)。还可以通过限制性片段操作或通
过用合成寡核苷酸进行的重叠序列延伸聚合酶链反应来构建重组抗体的变体。诱变引物编
码半胱氨酸密码子替换。标准的诱变技术可以用于产生编码所述突变的半胱氨酸改造的
抗体的DNA(Sambrook等Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手
册)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，N.Y.，1989；
和 Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学方法)，Greene
Publishing and Wiley-Interscience，New York，N.Y.，1993)。
在的氨基酸序列变体的情形中)，通过早期制备的编码所述多肽的DNA的位点定向(或寡
核苷酸介导的)诱变(Carter(1985)等Nucleic Acids Res(核酸研究).13：4431-4443；
Ho 等 (1989)Gene( 基 因 )(Amst.)77：51-59；Kunkel 等 (1987)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA(美国国家科学院学报)82：488；Liu等(1998)J.Biol.Chem(生物化学杂志).273：
20252-20260)、PCR诱变(Higuchi，(1990)在PCR手册(PCRProtocols)，第177-183页中，
Academic Press；Ito等(1991)Gene(基因)102：67-70；Bernhard等(1994)Bioconjugate
Chem(生物缀合物化学).5：126-132；和Vallette等(1989)Nuc.Acids Res(核酸研
究).17：723-733)，和盒式诱变(Wells等(1985)Gene(基因)34：315-323)进行制备。诱
变流程(Mutagenesis protocols)、试剂盒和试剂是商购的，例如 Multi
Site-Direct Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA)。也可以通过使用双链质
粒DNA作为模板的寡核苷酸定向诱变或通过基于PCR的诱变，产生单突变(Sambrook和
Russel，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第3
版；Zoller等(1983)Methods Enzymol(酶学方法).100：468-500；Zoller，M.J.和Smith，
M.(1982)Nucl.Acids Res(核酸研究).10：6487-6500)。还可以通过限制性片段操作或通
过用合成寡核苷酸进行的重叠序列延伸聚合酶链反应来构建重组抗体的变体。诱变引物编
码半胱氨酸密码子替换。标准的诱变技术可以用于产生编码所述突变的半胱氨酸改造的
抗体的DNA(Sambrook等Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手
册)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，N.Y.，1989；
和 Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学方法)，Greene
Publishing and Wiley-Interscience，New York，N.Y.，1993)。
[0700] 可以将噬菌体展示技术(McCafferty等(1990)Nature(自然)348：552-553)用于在体外从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因全集产生抗-FcRH5人抗
体和抗体片段。根据该技术，将抗体V结构域基因符合读码框地克隆入丝状噬菌体(诸
如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片
段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础
进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。由此，噬菌体模拟B细胞的
一些特性(Johnson等(1993)Current Opinion in Structural Biology(现代结构生物
学评论)3：564-571；Clackson等(1991)Nature(自然)，352：624-628；Marks等(1991)
J.Mol.Biol(分子生物学杂志).222：581-597；Griffith等(1993)EMBO J.12：725-734；US
5565332；US5573905；US 5567610；US 5229275)。
体和抗体片段。根据该技术，将抗体V结构域基因符合读码框地克隆入丝状噬菌体(诸
如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片
段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础
进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。由此，噬菌体模拟B细胞的
一些特性(Johnson等(1993)Current Opinion in Structural Biology(现代结构生物
学评论)3：564-571；Clackson等(1991)Nature(自然)，352：624-628；Marks等(1991)
J.Mol.Biol(分子生物学杂志).222：581-597；Griffith等(1993)EMBO J.12：725-734；US
5565332；US5573905；US 5567610；US 5229275)。
[0701] 抗-FcRH5抗体可以使用已知的寡肽合成方法来化学合成或可以使用重组技术进行制备和纯化。适合的氨基酸序列或其部分可以通过使用固相技术的直接肽合成来产生
(Stewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，(1969)W.H.Freeman Co.，
San Francisco，CA；Merrifield，(1963)J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154)。体外蛋白合成可以使用手动技术或通过自动化操作进行。自动的固相合成可以例如使用t-BOC或Fmoc
保护的氨基酸并使用制造商的说明书使用应用生物系统肽合成仪(Applied Biosystems
Peptide Synthesizer)(Foster City，CA)实现。抗-FcRH5抗体或FcRH5多肽的各种部分
可以单独化学合成和使用化学或酶促方法组合以产生需要的抗-FcRH5抗体或FcRH5多肽。
(Stewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，(1969)W.H.Freeman Co.，
San Francisco，CA；Merrifield，(1963)J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154)。体外蛋白合成可以使用手动技术或通过自动化操作进行。自动的固相合成可以例如使用t-BOC或Fmoc
保护的氨基酸并使用制造商的说明书使用应用生物系统肽合成仪(Applied Biosystems
Peptide Synthesizer)(Foster City，CA)实现。抗-FcRH5抗体或FcRH5多肽的各种部分
可以单独化学合成和使用化学或酶促方法组合以产生需要的抗-FcRH5抗体或FcRH5多肽。
[0702] 已经开发了多种技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化衍生(Morimoto等(1992)Journal of Biochemical and Biophysical
Methods(生物化学和生物物理方法杂志)24：107-117；和Brennan等(1985)Science(科
学)，229：81)，或通过重组宿主细胞直接产生。Fab，Fv和ScFv抗-FcRH5抗体片段都可
以在大肠杆菌中表达并且从大肠杆菌分泌，由此容易生产大量的这些片段。抗体片段可
以分离自本文讨论 的抗体噬菌体文库。备选地，Fab’-SH片段可以直接从大肠杆菌回收
并且化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等(1992)Bio/Technology(生物/技术)10：
163-167)，或直接从重组宿主细胞培养物分离。该抗-FcRH5抗体可以是(scFv)单链Fv
片段(WO 93/16185；US 5571894；US.5587458)。该抗-FcRH5抗体片段也可以是“线性抗
体”(US 5641870)。所述线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
Methods(生物化学和生物物理方法杂志)24：107-117；和Brennan等(1985)Science(科
学)，229：81)，或通过重组宿主细胞直接产生。Fab，Fv和ScFv抗-FcRH5抗体片段都可
以在大肠杆菌中表达并且从大肠杆菌分泌，由此容易生产大量的这些片段。抗体片段可
以分离自本文讨论 的抗体噬菌体文库。备选地，Fab’-SH片段可以直接从大肠杆菌回收
并且化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等(1992)Bio/Technology(生物/技术)10：
163-167)，或直接从重组宿主细胞培养物分离。该抗-FcRH5抗体可以是(scFv)单链Fv
片段(WO 93/16185；US 5571894；US.5587458)。该抗-FcRH5抗体片段也可以是“线性抗
体”(US 5641870)。所述线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
[0703] 下述描述主要涉及通过培养用包含编码抗-FcRH5抗体的核酸的载体转化或转染的细胞来生产抗-FcRH5抗体。编码抗-FcRH5抗体的DNA可以获自cDNA文库，所述cDNA
文库从被认为具有抗-FcRH5抗体mRNA并且以可检测水平表达它的组织制备。因此，人
抗-FcRH5抗体或FcRH5多肽DNA可以方便地获自由人组织制备的cDNA文库。编码抗-FcRH5
抗体的基因也可以获自基因组文库或通过已知的合成方法获得(例如，自动核酸合成)。
文库从被认为具有抗-FcRH5抗体mRNA并且以可检测水平表达它的组织制备。因此，人
抗-FcRH5抗体或FcRH5多肽DNA可以方便地获自由人组织制备的cDNA文库。编码抗-FcRH5
抗体的基因也可以获自基因组文库或通过已知的合成方法获得(例如，自动核酸合成)。
[0704] 本发明的设计、选择和制备方法能够提供半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体，其能够与亲电子官能度具有反应性。这些方法还能够提供抗体缀合物化合物，如在指定、设计、选
择性位点具有药物分子的抗体-药物缀合物(ADC)化合物。在抗体表面上的反应性半胱
氨酸残基允许药物结构部分通过硫醇反应基，如马来酰亚胺或卤代乙酰基特异性的缀合。
Cys残基的硫醇官能度与马来酰亚胺基团的亲核反应性比蛋白中的任何其它氨基酸官能度
(如赖氨酸残基的氨基或N端的氨基)更高约1000倍。在碘代乙酰基和马来酰亚胺试剂
中的硫醇特异性官能度可以与胺基团反应，但是需要更高的pH(＞9.0)和更长的反应时间
(Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach(非放射性标记：实践方法)，Academic Press，London)。可以通过标准的Ellman’s测定法来估计蛋白中的游离
硫醇的量。免疫球蛋白M是二硫化物连接的五聚体的实例，而免疫球蛋白G是具有将亚基
结合在一起的内部二硫化物桥的蛋白的实例。在诸如此类的蛋白中，需要用诸如二硫苏糖
醇(DTT)或硒醇还原二硫键(Singh等(2002)Anal.Biochem.304：147-156)以产生反应性
游离硫醇。这种方法可导致抗体三级结构和抗原结合特异性的损失。
择性位点具有药物分子的抗体-药物缀合物(ADC)化合物。在抗体表面上的反应性半胱
氨酸残基允许药物结构部分通过硫醇反应基，如马来酰亚胺或卤代乙酰基特异性的缀合。
Cys残基的硫醇官能度与马来酰亚胺基团的亲核反应性比蛋白中的任何其它氨基酸官能度
(如赖氨酸残基的氨基或N端的氨基)更高约1000倍。在碘代乙酰基和马来酰亚胺试剂
中的硫醇特异性官能度可以与胺基团反应，但是需要更高的pH(＞9.0)和更长的反应时间
(Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach(非放射性标记：实践方法)，Academic Press，London)。可以通过标准的Ellman’s测定法来估计蛋白中的游离
硫醇的量。免疫球蛋白M是二硫化物连接的五聚体的实例，而免疫球蛋白G是具有将亚基
结合在一起的内部二硫化物桥的蛋白的实例。在诸如此类的蛋白中，需要用诸如二硫苏糖
醇(DTT)或硒醇还原二硫键(Singh等(2002)Anal.Biochem.304：147-156)以产生反应性
游离硫醇。这种方法可导致抗体三级结构和抗原结合特异性的损失。
[0705] PHESELECTOR(关于反应性硫醇选择的噬菌体ELISA)测定法允许在ELISA噬菌体形式中检测抗体中的反应性半胱氨酸基团，由此辅助设计半胱氨酸改造的抗体(Junutula，
J.R.等(2008)J Immunol Methods(免疫方法杂志)332：41-52；WO 2006/034488；US
2007/0092940)。半胱氨酸改造的抗体包被在孔的表面上，随后用噬菌体颗粒温育，加入HRP
标记的次级抗体，并且进行吸光度检测。在噬菌体上展示的突变体蛋白可以以快速、有效和
高通量方式进行筛选。可以产生半胱氨酸改造的抗体的文库，并且使用相同的方法进行结
合选择以从抗体或其它蛋白的随机蛋白-噬菌体文库鉴定游离Cys结合的适当的反应性位
点。该技术包括使在噬菌体上展示的半胱氨酸突变体蛋白与也是硫醇反应性的亲和性试剂
或报道基团反应。
J.R.等(2008)J Immunol Methods(免疫方法杂志)332：41-52；WO 2006/034488；US
2007/0092940)。半胱氨酸改造的抗体包被在孔的表面上，随后用噬菌体颗粒温育，加入HRP
标记的次级抗体，并且进行吸光度检测。在噬菌体上展示的突变体蛋白可以以快速、有效和
高通量方式进行筛选。可以产生半胱氨酸改造的抗体的文库，并且使用相同的方法进行结
合选择以从抗体或其它蛋白的随机蛋白-噬菌体文库鉴定游离Cys结合的适当的反应性位
点。该技术包括使在噬菌体上展示的半胱氨酸突变体蛋白与也是硫醇反应性的亲和性试剂
或报道基团反应。
[0706] PHESELECTOR测定法允许筛选抗体中的反应性硫醇基。通过该方法鉴定A121C变体是示例性的。可以有效地搜索完整的Fab分子以鉴定更多的具有反应性硫醇基的
硫代Fab变体。将参数、分数表面可及性(fractional surface accessibility)用于
鉴定并量化溶剂对于多肽中氨基酸残基的可及性。表面可及性可以表示为可以与溶剂
分子，例如水接触的表面积 水的占据空间大致象一个 半径的球体。软件是
可作为CCP4结晶学程序组自由获得或许可的(Secretary to CCP4，Daresbury实验室，
Warrington，WA44AD，United Kingdom，Fax：(+44)1925 603825，或通过网络：www.ccp4.
ac.uk/dist/html/INDEX.html)，所述结晶学程序使用算法来计算具有已知x-射线结晶学
衍生的坐标的蛋白的每个氨基酸的表面可及性(“The CCP4 Suite：Programs for Protein
Crystallography(CCP4组：关于蛋白结晶学的程序)”(1994)Acta.Cryst.D50：760-763)。
进行表面可及性计算的两个示例性软件模块是“AREAIMOL”和“SURFACE”，其基于B.Lee和
F.M.Richards(1971)J.Mol.Biol(分子生物学杂志).55：379-400的算法。AREAIMOL将蛋白
的溶剂可及性表面定义为当探测球体(代表溶剂分子)在蛋白的范德瓦尔斯表面滚动时，
所述探测球体中心的轨迹。AREAIMOL通过在关于每个原子的延伸球体上产生表面点(距原
子中心的距离等于原子和探测物半径的总和)并且去除位于与邻近原子相关的等价球体
内的那些来计算溶剂可及性表面积。AREAIMOL发现了在PDB坐标文件中的原子的溶剂可及
性区域，并且总结了关于残基、链和完整分子的可及性区域。 可以将关于每个原子的可及
性区域(或区域差异)写到pseudo-PDB输出文件中。AREAIMOL假定关于每个元件的单一
半径，并且仅识别有限数量的不同元件。
硫代Fab变体。将参数、分数表面可及性(fractional surface accessibility)用于
鉴定并量化溶剂对于多肽中氨基酸残基的可及性。表面可及性可以表示为可以与溶剂
分子，例如水接触的表面积 水的占据空间大致象一个 半径的球体。软件是
可作为CCP4结晶学程序组自由获得或许可的(Secretary to CCP4，Daresbury实验室，
Warrington，WA44AD，United Kingdom，Fax：(+44)1925 603825，或通过网络：www.ccp4.
ac.uk/dist/html/INDEX.html)，所述结晶学程序使用算法来计算具有已知x-射线结晶学
衍生的坐标的蛋白的每个氨基酸的表面可及性(“The CCP4 Suite：Programs for Protein
Crystallography(CCP4组：关于蛋白结晶学的程序)”(1994)Acta.Cryst.D50：760-763)。
进行表面可及性计算的两个示例性软件模块是“AREAIMOL”和“SURFACE”，其基于B.Lee和
F.M.Richards(1971)J.Mol.Biol(分子生物学杂志).55：379-400的算法。AREAIMOL将蛋白
的溶剂可及性表面定义为当探测球体(代表溶剂分子)在蛋白的范德瓦尔斯表面滚动时，
所述探测球体中心的轨迹。AREAIMOL通过在关于每个原子的延伸球体上产生表面点(距原
子中心的距离等于原子和探测物半径的总和)并且去除位于与邻近原子相关的等价球体
内的那些来计算溶剂可及性表面积。AREAIMOL发现了在PDB坐标文件中的原子的溶剂可及
性区域，并且总结了关于残基、链和完整分子的可及性区域。 可以将关于每个原子的可及
性区域(或区域差异)写到pseudo-PDB输出文件中。AREAIMOL假定关于每个元件的单一
半径，并且仅识别有限数量的不同元件。
[0707] AREAIMOL和SURFACE报道了绝对可及性，即平方埃 的数量。分数表面可及性通过参照与多肽中的氨基酸相关的标准状态来计算。参照状态是三肽Gly-X-Gly，其中X
是目的氨基酸，并且参照状态应该是“延伸的”构象，即象在β链中的那些。延伸的构象使
X的可及性最大化。将计算的可及性区域除以在Gly-X-Gly三肽参照状态中的可及性区域
并报道商数，这即是分数可及性。可及性百分数是分数可及性乘以100。计算表面可及性
的另一种示例性算法基于xsae程序(Broger，C.，F.Hoffman-LaRoche，Basel)的SOLV模
块，其基于多肽的X-射线坐标计算氨基酸残基与水球体的分数可及性。关于抗体中每个氨
基酸的分数表面可及性可以使用可获得的晶体结构构象计算(Eigenbrot等.(1993)J Mol
Biol(分子生物学杂志).229：969-995)。
是目的氨基酸，并且参照状态应该是“延伸的”构象，即象在β链中的那些。延伸的构象使
X的可及性最大化。将计算的可及性区域除以在Gly-X-Gly三肽参照状态中的可及性区域
并报道商数，这即是分数可及性。可及性百分数是分数可及性乘以100。计算表面可及性
的另一种示例性算法基于xsae程序(Broger，C.，F.Hoffman-LaRoche，Basel)的SOLV模
块，其基于多肽的X-射线坐标计算氨基酸残基与水球体的分数可及性。关于抗体中每个氨
基酸的分数表面可及性可以使用可获得的晶体结构构象计算(Eigenbrot等.(1993)J Mol
Biol(分子生物学杂志).229：969-995)。
[0708] 容易使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离编码半胱氨酸改造的抗体的DNA并对其进行测序。杂交瘤细
胞可以作为所述DNA的来源。一旦分离，DNA可以被置于表达载体中，接着将所述表达载体
转染到否则不会产生抗体蛋白的宿主细胞中，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵
巢(CHO)细胞，或其它哺乳动物宿主细胞如骨髓瘤细胞(US 5807715；US2005/0048572；US
2004/0229310)，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。
胞可以作为所述DNA的来源。一旦分离，DNA可以被置于表达载体中，接着将所述表达载体
转染到否则不会产生抗体蛋白的宿主细胞中，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵
巢(CHO)细胞，或其它哺乳动物宿主细胞如骨髓瘤细胞(US 5807715；US2005/0048572；US
2004/0229310)，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。
[0709] 在设计和选择后，具有改造的高度反应性的未配对Cys残基(“游离半胱氨酸氨基酸”)的半胱氨酸改造的抗体，例如硫代Fabs可以通过下述产生：(i)在细菌，例如大肠杆
菌系统中表达(Skerra等(1993)Curr.Opinion in Immunol.5：256-262；Plückthun(1992)
Immunol.Revs.130：151-188)或在哺乳动物细胞培养系统(WO 01/00245)，例如中国仓鼠
卵巢细胞(CHO)中表达；和(ii)使用常规蛋白纯化技术纯化(Lowman等(1991)J.Biol.
Chem(生物化学杂志).266(17)：10982-10988)。
菌系统中表达(Skerra等(1993)Curr.Opinion in Immunol.5：256-262；Plückthun(1992)
Immunol.Revs.130：151-188)或在哺乳动物细胞培养系统(WO 01/00245)，例如中国仓鼠
卵巢细胞(CHO)中表达；和(ii)使用常规蛋白纯化技术纯化(Lowman等(1991)J.Biol.
Chem(生物化学杂志).266(17)：10982-10988)。
[0710] 改造的Cys硫醇基与亲电子接头试剂和药物-接头中间体反应以形成 半胱氨酸改造的抗体药物缀合物和其它标记的半胱氨酸改造的抗体。半胱氨酸改造的抗体的Cys残
基，和存在于母体抗体中的Cys残基是配对的，并且形成链间和链内二硫键，其不具有任何
反应性硫醇基(除非用还原剂处理)并且不与亲电子接头试剂或药物-接头中间体反应。
新改造的Cys残基可以仍旧保持未配对，并且能够与亲电子接头试剂或药物-接头中间体，
如药物-马来酰亚胺反应，即与其缀合。示例性药物-接头中间体包括：MC-MMAE，MC-MMAF，
MC-vc-PAB-MMAE和MC-vc-PAB-MMAF。根据连续的编号系统对重链和轻链的改造的Cys残基
的结构位置进行编号。这种顺序的编号系统与在N-端起始的Kabat编号系统(Kabat等，
(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白的序列)，第5
版.Public Health Service(公众健康服务)，National Institutes of Health(国家健
康研究所)，Bethesda，MD)相关，与通过以a，b，c表示的插入的Kabat编号方案(底排)不
同。使用Kabat编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含对应于可变结构域的FR或CDR
的缩短或插入其中的减少的氨基酸或加入的氨基酸。半胱氨酸改造的重链变体位点通过顺
序编号和Kabat编号方案确定。
基，和存在于母体抗体中的Cys残基是配对的，并且形成链间和链内二硫键，其不具有任何
反应性硫醇基(除非用还原剂处理)并且不与亲电子接头试剂或药物-接头中间体反应。
新改造的Cys残基可以仍旧保持未配对，并且能够与亲电子接头试剂或药物-接头中间体，
如药物-马来酰亚胺反应，即与其缀合。示例性药物-接头中间体包括：MC-MMAE，MC-MMAF，
MC-vc-PAB-MMAE和MC-vc-PAB-MMAF。根据连续的编号系统对重链和轻链的改造的Cys残基
的结构位置进行编号。这种顺序的编号系统与在N-端起始的Kabat编号系统(Kabat等，
(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白的序列)，第5
版.Public Health Service(公众健康服务)，National Institutes of Health(国家健
康研究所)，Bethesda，MD)相关，与通过以a，b，c表示的插入的Kabat编号方案(底排)不
同。使用Kabat编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含对应于可变结构域的FR或CDR
的缩短或插入其中的减少的氨基酸或加入的氨基酸。半胱氨酸改造的重链变体位点通过顺
序编号和Kabat编号方案确定。
[0711] 在一个实施方案中，半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体通过包含下述的方法制备：
[0712] (a)用半胱氨酸替换母体抗-FcRH5抗体的一个或多个氨基酸残基；和
[0713] (b)通过使半胱氨酸改造的抗体与硫醇反应性试剂反应来确定半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体的硫醇反应性。
[0714] 该半胱氨酸改造的抗体与母体抗体相比，对硫醇反应性试剂可以更具反应性。
[0715] 游离半胱氨酸氨基酸残基可以位于重链或轻链中，或位于恒定结构域或可变结构域中。还可以通过用一个或多个半胱氨酸氨基酸替换抗体片段的氨基酸来改造所述抗体片
段，例如Fab，以形成半胱氨酸改造的抗体片段。
段，例如Fab，以形成半胱氨酸改造的抗体片段。
[0716] 本发明的另一个实施方案提供制备(形成)半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体的方法，所述方法包括：
[0717] (a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸引入母体抗-FcRH5抗体中从而产生 半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体；和
[0718] (b)确定所述半胱氨酸改造的抗体与硫醇反应性试剂的硫醇反应性；
[0719] 其中所述半胱氨酸改造的抗体与母体抗体相比，对于硫醇反应性试剂更具反应性。
[0720] 制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(a)可以包括：
[0721] (i)诱变编码所述半胱氨酸改造的抗体的核酸序列；
[0722] (ii)表达所述半胱氨酸改造的抗体；和
[0723] (iii)分离并纯化所述半胱氨酸改造的抗体。
[0724] 制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)可以包括在选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上表达所述半胱氨酸改造的抗体。
[0725] 制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)还可以包括：
[0726] (i)使所述半胱氨酸改造的抗体与硫醇反应性亲和性试剂反应以产生亲和性标记的、半胱氨酸改造的抗体；和
[0727] (ii)测量所述亲和性标记的，半胱氨酸改造的抗体与捕获介质的结合。
[0728] 本发明的另一个实施方案是关于硫醇反应性筛选具有高度反应性、未配对的半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造的抗体的方法，所述方法包括：
[0729] (a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸引入母体抗体中以产生半胱氨酸改造的抗体；
[0730] (b)使所述半胱氨酸改造的抗体与硫醇反应性亲和性试剂反应以产生亲和性标记的，半胱氨酸改造的抗体；和
[0731] (c)测量亲和性标记的，半胱氨酸改造的抗体与捕获介质的结合；和
[0732] (d)确定所述半胱氨酸改造的抗体与硫醇反应性试剂的硫醇反应性。筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(a)可以包括：
[0733] (i)诱变编码所述半胱氨酸改造的抗体的核酸序列；
[0734] (ii)表达所述半胱氨酸改造的抗体；和
[0735] (iii)分离和纯化所述半胱氨酸改造的抗体。
[0736] 筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)可以包括在选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上表达所述半胱氨酸改造的抗体。
[0737] 筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)还可以包括：
[0738] (i)使所述半胱氨酸改造的抗体与硫醇反应性亲和性试剂反应以产生 亲和性标记的，半胱氨酸改造的抗体；和
[0739] (ii)测量所述亲和性标记的，半胱氨酸改造的抗体与捕获介质的结合。
[0740] b.抗-FcRH5IgG变体的半胱氨酸改造
[0741] 通过本文所述的半胱氨酸改造方法，将半胱氨酸在重链118(EU编号)(等价于重链位置118，顺序编号)(如在图13中所显示)位点引入全长、嵌合的母体单克隆抗-FcRH5
抗体或在轻链205(Kabat编号)(如在图14中显示)位点引入全长、嵌合的母体单克隆
抗-FcRH5抗体。
抗体或在轻链205(Kabat编号)(如在图14中显示)位点引入全长、嵌合的母体单克隆
抗-FcRH5抗体。
[0742] 产生的在重链118(EU编号)具有半胱氨酸的半胱氨酸改造的抗体是：(a)具有重链序列(SEQ ID NO：60)和轻链序列(SEQ ID NO：59)的硫代-hu13G9-HC-A118C，图13。
[0743] 产生的在轻链205(Kabat编号)具有半胱氨酸的半胱氨酸改造的抗体是：(a)具有重链序列(SEQ ID NO：62)和轻链序列(SEQ ID NO：61)的硫代-hu13G9-LC-V205C，图
14。
14。
[0744] c.标记的半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体
[0745] 半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体可以位点特异性地并且有效地与硫醇反应性试剂偶联。硫醇反应性试剂可以是多官能的接头试剂，捕获，即亲和性标记试剂(例如，生物
TM
素-接头试剂)、检测标记(例如荧光团试剂)、固相固定试剂(例如，SEPHAROSE 、聚苯乙烯
或玻璃)或药物-接头中间体。硫醇反应性试剂的一个实例是N-乙基马来酰亚胺(NEM)。
在一个示例性实施方案中，硫代Fab与生物素-接头试剂的反应提供生物素化的硫代Fab，
通过所述硫代Fab可以检测并测量改造的半胱氨酸残基的存在和反应性。硫代Fab与多官
能接头试剂的反应提供具有官能化的接头的硫代Fab，其可以进一步与药物结构部分试剂
或其它标记反应。硫代Fab与药物-接头中间体的反应提供硫代Fab药物缀合物。
TM
素-接头试剂)、检测标记(例如荧光团试剂)、固相固定试剂(例如，SEPHAROSE 、聚苯乙烯
或玻璃)或药物-接头中间体。硫醇反应性试剂的一个实例是N-乙基马来酰亚胺(NEM)。
在一个示例性实施方案中，硫代Fab与生物素-接头试剂的反应提供生物素化的硫代Fab，
通过所述硫代Fab可以检测并测量改造的半胱氨酸残基的存在和反应性。硫代Fab与多官
能接头试剂的反应提供具有官能化的接头的硫代Fab，其可以进一步与药物结构部分试剂
或其它标记反应。硫代Fab与药物-接头中间体的反应提供硫代Fab药物缀合物。
[0746] 本文描述的示例性方法可以通常应用于鉴定和生产抗体，并且更通常地，通过应用本文描述的设计和筛选步骤应用于其它的蛋白。
[0747] 所述方法可以用于其它硫醇反应性试剂的缀合，其中所述反应基是例如，马来酰亚胺、碘代乙酰胺、吡啶基二硫化物或其它硫醇反应性缀合配 偶体(Haugland，2003，
Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals( 荧
光探针和研究化学品的分子探针手册)，Molecular Probes，Inc.；Brinkley，1992，
Bioconjugate Chem(缀合物化学).3：2；Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：
A Practical Approach(非 放 射 性 标 记：实 践 方 法 )，Academic Press，London；
Means(1990)Bioconjugate Chem(生物缀合物化学).1：2；Hermanson，G.in Bioconjugate
Techniques(在生物缀合物技术中)(1996)学术出版社，San Diego，第40-55，643-671
页)。硫醇反应性试剂可以是药物结构部分、荧光团如荧光染料如荧光素或罗丹明、
用于成像的螯合剂或放射治疗金属、肽基或非肽基标记或检测标记、或清除率调节剂
(clearance-modifying agent)如聚乙二醇的各种异构体、结合第三成分的肽，或另一种糖
或亲脂性试剂。
Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals( 荧
光探针和研究化学品的分子探针手册)，Molecular Probes，Inc.；Brinkley，1992，
Bioconjugate Chem(缀合物化学).3：2；Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：
A Practical Approach(非 放 射 性 标 记：实 践 方 法 )，Academic Press，London；
Means(1990)Bioconjugate Chem(生物缀合物化学).1：2；Hermanson，G.in Bioconjugate
Techniques(在生物缀合物技术中)(1996)学术出版社，San Diego，第40-55，643-671
页)。硫醇反应性试剂可以是药物结构部分、荧光团如荧光染料如荧光素或罗丹明、
用于成像的螯合剂或放射治疗金属、肽基或非肽基标记或检测标记、或清除率调节剂
(clearance-modifying agent)如聚乙二醇的各种异构体、结合第三成分的肽，或另一种糖
或亲脂性试剂。
[0748] d.半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体的应用
[0749] 半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体及其缀合物可以用作治疗剂和/或诊断剂。本发明还提供预防、处理、治疗或改善与B-细胞相关疾病相关的一个或多个症状的方法。具体
地，本发明提供预防、处理、治疗或改善与细胞增生性疾病相关的一个或多个症状的方法，
所述细胞增生性疾病如癌症，例如淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭
性NHL、复发性惰性NHL、难治性NHL、难治性惰性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、多毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋
巴瘤。本发明还提供用于诊断FcRH5相关疾病或发展所述疾病的倾向的方法，以及用于鉴
定优先结合B-细胞相关的FcRH5多肽的抗体和抗体的抗原结合片段。
地，本发明提供预防、处理、治疗或改善与细胞增生性疾病相关的一个或多个症状的方法，
所述细胞增生性疾病如癌症，例如淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭
性NHL、复发性惰性NHL、难治性NHL、难治性惰性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、多毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋
巴瘤。本发明还提供用于诊断FcRH5相关疾病或发展所述疾病的倾向的方法，以及用于鉴
定优先结合B-细胞相关的FcRH5多肽的抗体和抗体的抗原结合片段。
[0750] 本发明的另一个实施方案涉及将半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体用于制备药物的应用，所述药物用于治疗对B细胞相关疾病具有反应性的病症。
[0751] e.半胱氨酸改造的抗体药物缀合物(硫代抗体药物缀合物(TDCs))
[0752] 本发明的另一个方面是抗体-药物缀合物化合物，其包含半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体(Ab)和auristatin药物结构部分(D)，其中所述半胱氨酸改 造的抗体通过
接头结构部分(L)，通过一个或多个游离半胱氨酸氨基酸连接于D，所述化合物具有式I：
接头结构部分(L)，通过一个或多个游离半胱氨酸氨基酸连接于D，所述化合物具有式I：
[0753] Ab-(L-D)p I
[0754] 其中p是1，2，3，或4；并且其中所述半胱氨酸改造的抗体通过包括用一个或多个游离半胱氨酸氨基酸替换母体抗-FcRH5抗体的一个或多个氨基酸残基的方法进行制备。
[0755] 本发明的另一个方面是包含式I的抗体-药物化合物的混合物的组合物，其中每个抗体的平均药物负载是约2到约5，或约3到约4。
[0756] 半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体药物缀合物的潜在优势包括提高的安全性(更大的治疗指数)，提高的PK参数，能够稳定缀合物并且保持其活性结合构象的抗体链间二硫
键仍旧保留，药物缀合的位点被限定，并且通过半胱氨酸改造的抗体与药物-接头试剂的
缀合制备半胱氨酸改造的抗体药物缀合物导致更均一的产物。
键仍旧保留，药物缀合的位点被限定，并且通过半胱氨酸改造的抗体与药物-接头试剂的
缀合制备半胱氨酸改造的抗体药物缀合物导致更均一的产物。
[0757] 接头
[0758] “接头”、“接头单元”或“连接”是指包含将抗体共价连接于药物结构部分的共价键或原子链的化学结构部分。在各种实施方案中，接头具体为L。“接头”(L)是双官能或多官能结构部分，其可以用于连接一个或多个药物结构部分(D)和抗体单元(Ab)以形成式I的
抗体-药物缀合物(ADC)。抗体-药物缀合物(ADC)可以使用接头方便地制备，所述接头具
有与药物结合和与抗体结合的反应性官能度。半胱氨酸改造的抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇
可以与接头试剂、药物结构部分或药物-接头中间体的亲电子官能团形成键。
抗体-药物缀合物(ADC)。抗体-药物缀合物(ADC)可以使用接头方便地制备，所述接头具
有与药物结合和与抗体结合的反应性官能度。半胱氨酸改造的抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇
可以与接头试剂、药物结构部分或药物-接头中间体的亲电子官能团形成键。
[0759] 在一个方面中，接头具有反应性位点，所述反应性位点具有对于抗体上存在的亲核性半胱氨酸具有反应性的亲电子基团。抗体的半胱氨酸硫醇具有与接头上的亲电子基团
的反应性并且与接头形成共价键。有用的亲电子基团包括，但不限于：马来酰亚胺和卤代乙
酰胺基团。
的反应性并且与接头形成共价键。有用的亲电子基团包括，但不限于：马来酰亚胺和卤代乙
酰胺基团。
[0760] 接头包括二价原子团，如烷基二基、亚芳基、亚杂芳基，结构部分如-(CR2)nO(CR2)n-，烷氧基(例如，聚亚乙基氧基，PEG，聚亚甲基氧基)和烷基氨基(例如，聚亚乙基氨TM
基，Jeffamine )的重复单元；和二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯
(diglycolate)、丙二酸酯和正己酰胺。
基，Jeffamine )的重复单元；和二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯
(diglycolate)、丙二酸酯和正己酰胺。
[0761] 根据在Klussman，等(2004)，Bioconjugate Chemistry(生物缀合物化学)15(4)：765-773的第766页上所述的缀合方法，使半胱氨酸改造的抗体与接头试剂或药物-接头中
间体反应，所述接头试剂或药物-接头中间体具有亲电子官能团如马来酰亚胺或α-卤代
羰基。
间体反应，所述接头试剂或药物-接头中间体具有亲电子官能团如马来酰亚胺或α-卤代
羰基。
[0762] 所述接头可以由一个或多个接头组分组成。示例性的接头组分包括：6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)，马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)，缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或
“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”或“af”)，对-氨基苄氧基羰基(“PAB”)，N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸
N-琥珀酰亚胺酯(“SMCC”)，(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(“SIAB”)，
作为一个或多个重复单元(″EO″或″PEO″)的乙烯氧基-CH2CH2O-。本领域中已知另外
的接头组分并且在本文描述了一些。
“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”或“af”)，对-氨基苄氧基羰基(“PAB”)，N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸
N-琥珀酰亚胺酯(“SMCC”)，(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(“SIAB”)，
作为一个或多个重复单元(″EO″或″PEO″)的乙烯氧基-CH2CH2O-。本领域中已知另外
的接头组分并且在本文描述了一些。
[0763] 在一个实施方案中，ADC的接头L具有下式：
[0764] -Aa-Ww-Yy-
[0765] 其中
[0766] -A-是延伸单元，其共价连接于抗体(Ab)的半胱氨酸巯基；
[0767] a是0或1；
[0768] 每个-W-独立地是氨基酸单元；
[0769] w独立地是范围在0-12的整数；
[0770] -Y-是共价连接于药物结构部分的间隔臂单元；和
[0771] y是0，1或2。
[0772] 延伸单元
[0773] 延伸单元(-A-)，当存在时，能够将抗体单元连接于氨基酸单元(-W-)。在这方面，抗体(Ab)具有可以与延伸剂(Stretcher)的官能团形成键的官能团。可以天然地或通过
化学操作存在与抗体上的有用官能团包括，但不限于：巯基(-SH)、氨基、羟基、羧基、糖的异头羟基、和羧基。在一个方面中，抗体官能团是巯基或氨基。巯基可以通过抗体的分子
内二硫键的还原产生。备选地，可以使用2-亚氨基硫烷(Traut’s试剂)或另一种产生巯
基的 试剂通过抗体的赖氨酸结构部分的氨基的反应产生巯基。在一个实施方案中，抗体
(Ab)具有游离的半胱氨酸硫醇基，其可以与延伸单元的亲电子官能团形成键。在式I缀合
物中的示例性延伸单元由式II和III显示，其中Ab-，-W-，-Y-，-D，w和y如上定义，并且
17
R 是选自(CH2)r、C3-C8碳环基、O-(CH2)r、亚芳基、(CH2)r-亚芳基、-亚芳基-(CH2)r-、(CH2)r-(C3-C8碳环基)、(C3-C8碳环基)-(CH2)r、C3-C8杂环基、(CH2)r-(C3-C8杂环基)、-(C3-C8b
杂 环 基 )-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NR(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-，-(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2)rC(O)b b b
NR(CH2CH2O)r-，-(CH2)rC(O)NR(CH2CH2O)r-CH2-，-(CH2CH2O)rC(O)NR(CH2CH2O)r-，-(CH2CH2O)b b b
rC(O)NR(CH2CH2O)r-CH2-，和-(CH2CH2O)rC(O)NR(CH2)r-的二价原子团；其中R 是H、C1-C6烷基、苯基或苄基，并且r独立地是范围是1-10的整数。
化学操作存在与抗体上的有用官能团包括，但不限于：巯基(-SH)、氨基、羟基、羧基、糖的异头羟基、和羧基。在一个方面中，抗体官能团是巯基或氨基。巯基可以通过抗体的分子
内二硫键的还原产生。备选地，可以使用2-亚氨基硫烷(Traut’s试剂)或另一种产生巯
基的 试剂通过抗体的赖氨酸结构部分的氨基的反应产生巯基。在一个实施方案中，抗体
(Ab)具有游离的半胱氨酸硫醇基，其可以与延伸单元的亲电子官能团形成键。在式I缀合
物中的示例性延伸单元由式II和III显示，其中Ab-，-W-，-Y-，-D，w和y如上定义，并且
17
R 是选自(CH2)r、C3-C8碳环基、O-(CH2)r、亚芳基、(CH2)r-亚芳基、-亚芳基-(CH2)r-、(CH2)r-(C3-C8碳环基)、(C3-C8碳环基)-(CH2)r、C3-C8杂环基、(CH2)r-(C3-C8杂环基)、-(C3-C8b
杂 环 基 )-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NR(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-，-(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2)rC(O)b b b
NR(CH2CH2O)r-，-(CH2)rC(O)NR(CH2CH2O)r-CH2-，-(CH2CH2O)rC(O)NR(CH2CH2O)r-，-(CH2CH2O)b b b
rC(O)NR(CH2CH2O)r-CH2-，和-(CH2CH2O)rC(O)NR(CH2)r-的二价原子团；其中R 是H、C1-C6烷基、苯基或苄基，并且r独立地是范围是1-10的整数。
[0774] 亚芳基包括通过从芳香环系统去除两个氢原子衍生的6-20个碳原子的二价芳香烃原子团。典型的亚芳基包括，但不限于：衍生自下述的原子团：苯、取代的苯、萘、蒽、联苯基等。
[0775] 杂环基包括其中一个或多个环原子是杂原子，例如氮、氧和硫的环原子的环系统。所述杂环原子团包含1-20个碳原子和1-3个选自N，O，P和S的杂原子。杂环可以是具有
3-7个环成员的单环(2-6碳原子和1-3个选自N，O，P，和S的杂原子)或具有7-10个环成
员的二环(4-9个碳原子和1-3个选自N，O，P，和S的杂原子)，例如二环[4，5]，[5，5]，[5，
6]，或[6，6]系统。杂环在Paquette，Leo A.；″Principles of Modern Heterocyclic
Chemistry(现代杂环化学原理)″(W.A.Benjamin，New York，1968)，具体地第1，3，4，6，7，和9章；″The Chemistry of Heterocyclic Compounds，A series of Monographs(杂环
化合物的化学原理，一系列专题文章)″(John Wiley & Sons，New York，1950至今)，具体
地卷13，14，16，19，和28；和J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566中描述。
3-7个环成员的单环(2-6碳原子和1-3个选自N，O，P，和S的杂原子)或具有7-10个环成
员的二环(4-9个碳原子和1-3个选自N，O，P，和S的杂原子)，例如二环[4，5]，[5，5]，[5，
6]，或[6，6]系统。杂环在Paquette，Leo A.；″Principles of Modern Heterocyclic
Chemistry(现代杂环化学原理)″(W.A.Benjamin，New York，1968)，具体地第1，3，4，6，7，和9章；″The Chemistry of Heterocyclic Compounds，A series of Monographs(杂环
化合物的化学原理，一系列专题文章)″(John Wiley & Sons，New York，1950至今)，具体
地卷13，14，16，19，和28；和J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566中描述。
[0776] 杂环的实例包括，例如但不限于：吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氢噻吩基、硫氧化的四氢噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫茚基(thianaphthalenyl)、吲哚基、二氢吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、 哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉
基、十氢异喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基(thianthrenyl)、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、酚黄素基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、
3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、1，5-二氮杂萘基、喹噁啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4Ah-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩噁嗪基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基和靛红基(isatinoyl)。
基、十氢异喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基(thianthrenyl)、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、酚黄素基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、
3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、1，5-二氮杂萘基、喹噁啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4Ah-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩噁嗪基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基和靛红基(isatinoyl)。
[0777] 碳环基包括饱和或不饱和的环，其作为单环时具有3-7个碳原子，或作为二环时具有7-12个碳原子。单环碳环具有3-6个环原子，更典型地具有5或6个环原子。二环碳
环具有7-12个环原子，例如作为二环[4，5]，[5，5]，[5，6]或[6，6]系统排列，或具有9或
10个环原子，作为二环[5，6]或[6，6]系统排列。单环碳环的实例包括环丙基、环丁基、环
戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环
己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环庚基和环辛烷基。
环具有7-12个环原子，例如作为二环[4，5]，[5，5]，[5，6]或[6，6]系统排列，或具有9或
10个环原子，作为二环[5，6]或[6，6]系统排列。单环碳环的实例包括环丙基、环丁基、环
戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环
己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环庚基和环辛烷基。
[0778] 要理解，在式I ADC的所有示例性实施方案，如II-VI中，即使没有清楚指出，取决于改造的半胱氨酸残基的数量，1-4个药物结构部分连接于抗体(p＝1-4)，
[0779]17
[0780] 举例说明的式II延伸单元衍生自马来酰亚胺基-己酰基(MC)，其中R是-(CH2)5-：
[0781]
[0782] 举例说明的式II延伸单元衍生自马来酰亚胺基-丙酰基(MP)，其中R17是-(CH2)2-：
[0783]17
[0784] 另一个举例说明性式II的延伸单元，其中R 是-(CH2CH2O)r-CH2-，并且r是2：
[0785]17 b
[0786] 另一个举例说明性式II的延伸单元，其中R 是-(CH2)rC(O)NR(CH2CH2O)r-CH2-，b
其中R 是H并且每个r是2：
其中R 是H并且每个r是2：
[0787]17
[0788] 举例说明性的式III的延伸单元，其中R 是-(CH2)5-：
[0789]
[0790] 在另一个实施方案中，延伸单元通过在抗体的改造的半胱氨酸硫原子和延伸单元的硫原子之间的二硫键连接于半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体。该实施方案的代表性延伸
单元由式IV表示，其中R17，Ab-，-W-，-Y-，-D，w和y如上定义：
单元由式IV表示，其中R17，Ab-，-W-，-Y-，-D，w和y如上定义：
[0791]
[0792] 在又一个实施方案中，延伸剂的反应基包含可以与抗体的游离半胱氨酸硫醇形成键的硫醇反应性官能团。硫醇反应官能团的实例包括，但不限于：马来酰亚胺、α-卤代乙
酰基、活化的酯如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰基氯、磺
17
酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。该实施方案的代表性延伸单元由式Va和Vb表示，其中-R -，
Ab-，-W-，-Y-，-D，w和y如上定义：
酰基、活化的酯如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰基氯、磺
17
酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。该实施方案的代表性延伸单元由式Va和Vb表示，其中-R -，
Ab-，-W-，-Y-，-D，w和y如上定义：
[0793]
[0794] 在另一个实施方案中，接头可以是树突型接头，其用于将一种以上的药物结构部分通过分支、多官能的接头结构部分共价连接于抗体(Sun等(2002)Bioorganic
& Medicinal Chemistry Letters(生物有机和医学化学通讯)12：2213-2215；Sun等
(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry(生物有机和医学化学通讯)11：1761-1768；
King(2002)Tetrahedron Letters(四面体通讯)43：1987-1990)。树突型接头可以增加药
物与抗体的摩尔比率，即负载，其与ADC的功效相关。因此，如果半胱氨酸改造的抗体仅具
有一个反应性半胱氨酸硫醇基，可以通过树突型接头连接许多药物结构部分。
& Medicinal Chemistry Letters(生物有机和医学化学通讯)12：2213-2215；Sun等
(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry(生物有机和医学化学通讯)11：1761-1768；
King(2002)Tetrahedron Letters(四面体通讯)43：1987-1990)。树突型接头可以增加药
物与抗体的摩尔比率，即负载，其与ADC的功效相关。因此，如果半胱氨酸改造的抗体仅具
有一个反应性半胱氨酸硫醇基，可以通过树突型接头连接许多药物结构部分。
[0795] 氨基酸单元
[0796] 接头可以包含氨基酸残基。氨基酸单元(-Ww-)，当存在时，将抗体(Ab)连接于本发明的半胱氨酸改造的抗体-药物缀合物(ADC)的药物结构部分(D)。
[0797] -Ww-是二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。包含氨基酸单元的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及稀有氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。每个-W-单元独立地具有下面在方括号里所显示的式，并且w是
范围是0-12的整数：
范围是0-12的整数：
[0798]
[0799] 其中R19是氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH，-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基，
[0800]
[0801] 当R19不是氢时，与R19连接的碳原子是手性的。与R19连接的每个碳原子独立地是(S)或(R)构型的，或外消旋混合物。因此，氨基酸单元可以是对映体纯的、外消旋的、或非
对映异构体的。
对映异构体的。
[0802] 示例性-Ww-氨基酸单元包括：二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括：甘氨
酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包括氨
基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及稀有氨基酸和非天然存在的氨基酸
类似物，如瓜氨酸。
酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包括氨
基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及稀有氨基酸和非天然存在的氨基酸
类似物，如瓜氨酸。
[0803] 氨基酸单元可以被一种或多种酶(包括肿瘤相关的蛋白酶)酶促裂解，以释放药物结构部分(-D)，其在一个实施方案中在释放后被体内质子化以提供药物(D)。可以设计
并且优化氨基酸接头组分的关于被特定酶酶促裂解的选择性，例如肿瘤相关的蛋白酶、组
织蛋白酶B、C和D或纤维蛋白溶酶蛋白酶。
并且优化氨基酸接头组分的关于被特定酶酶促裂解的选择性，例如肿瘤相关的蛋白酶、组
织蛋白酶B、C和D或纤维蛋白溶酶蛋白酶。
[0804] 间隔臂单元
[0805] 间隔臂单元(-Yy-)，当存在时(y＝1或2)，当氨基酸单元存在时(w＝1-12)，将氨基酸单元(-Ww-)连接于药物结构部分(D)。备选地，当氨基酸单元不存在时，间隔臂单元
将延伸单元连接于药物结构部分。当氨基酸单元和延伸单元都不存在时(w，y＝0)，间隔
臂单元还将药物结构部分连接于 抗体单元。间隔臂单元具有两种通用类型：自分解的和非
自分解的。非自分解的间隔臂单元是其中部分或所有的间隔臂单元在从抗体-药物缀合物
或药物结构部分-接头裂解(具体地酶促裂解)氨基酸单元后，仍旧与药物结构部分保持
结合的间隔臂单元。当包含甘氨酸-甘氨酸间隔臂单元或甘氨酸间隔臂单元的ADC通过肿
瘤-细胞相关的蛋白酶(癌细胞相关的蛋白酶或淋巴细胞相关的蛋白酶)酶促裂解后，甘
氨酸-甘氨酸-药物结构部分或甘氨酸-药物结构部分从Ab-Aa-Ww-裂解。在一个实施方
案中，在靶细胞中发生独立的水解反应，裂解甘氨酸-药物结构部分的结合并且释放所述
药物。
将延伸单元连接于药物结构部分。当氨基酸单元和延伸单元都不存在时(w，y＝0)，间隔
臂单元还将药物结构部分连接于 抗体单元。间隔臂单元具有两种通用类型：自分解的和非
自分解的。非自分解的间隔臂单元是其中部分或所有的间隔臂单元在从抗体-药物缀合物
或药物结构部分-接头裂解(具体地酶促裂解)氨基酸单元后，仍旧与药物结构部分保持
结合的间隔臂单元。当包含甘氨酸-甘氨酸间隔臂单元或甘氨酸间隔臂单元的ADC通过肿
瘤-细胞相关的蛋白酶(癌细胞相关的蛋白酶或淋巴细胞相关的蛋白酶)酶促裂解后，甘
氨酸-甘氨酸-药物结构部分或甘氨酸-药物结构部分从Ab-Aa-Ww-裂解。在一个实施方
案中，在靶细胞中发生独立的水解反应，裂解甘氨酸-药物结构部分的结合并且释放所述
药物。
[0806] 在另一个实施方案中，-Yy-是对氨基苄基氨基甲酰基(PAB)单元，其亚苯基部分被Qm取代，其中Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基或-氰基；并且m是范围是
0-4的整数。
0-4的整数。
[0807] 非自分解的间隔臂单元(-Y-)的示例性实施方案是-Gly-Gly-；-Gly-；-Ala-Phe-；-Val-Cit-。
[0808] 在一个实施方案中，提供其中间隔臂单元不存在(y＝0)的药物结构部分-接头或ADC，或其药用盐或溶剂合物。
[0809] 备选地，包含自分解间隔臂单元的ADC可以释放-D。在一个实施方案中，-Y-是PAB基团，其通过PAB基团的氨基氮原子连接于-Ww-，通过碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基团直
接连接于-D，其中ADC具有示例性结构：
接连接于-D，其中ADC具有示例性结构：
[0810]
[0811] 其中Q是-C1-C8烷基，-O-(C1-C8烷基)，-卤素，-硝基或-氰基；m是范围是0-4的整数；并且p的范围是1-4。
[0812] 自分解间隔臂的其它实例包括，但不限于：电子地类似于PAB基团的芳香族化合物如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)、杂环
PAB类似物(US 2005/0256030)、β-葡糖苷酸(WO2007/011968)和邻位或对位氨基苄基
乙缩醛。可以使用的间隔臂在酰胺键 水解后经历环化，如取代和未被取代的4-氨基丁酸
酰胺(Rodrigues等(1995)，Chemistry Biology(化学生物学)，2，223)；适当取代的二环
[2.2.1]和二环[2.2.2]环系统(Storm，等(1972)，J.Amer.Chem.Soc.，94，5815)和2-氨
基苯基丙酸酰胺(Amsberry，等(1990)J.Org.Chem.，55，5867)。在甘氨酸被取代的包含胺
的药物的消除(Kingsbury，等(1984)，J.Med.Chem.，27，1447)也是在ADCs中使用的自分
解的间隔臂的实例。
PAB类似物(US 2005/0256030)、β-葡糖苷酸(WO2007/011968)和邻位或对位氨基苄基
乙缩醛。可以使用的间隔臂在酰胺键 水解后经历环化，如取代和未被取代的4-氨基丁酸
酰胺(Rodrigues等(1995)，Chemistry Biology(化学生物学)，2，223)；适当取代的二环
[2.2.1]和二环[2.2.2]环系统(Storm，等(1972)，J.Amer.Chem.Soc.，94，5815)和2-氨
基苯基丙酸酰胺(Amsberry，等(1990)J.Org.Chem.，55，5867)。在甘氨酸被取代的包含胺
的药物的消除(Kingsbury，等(1984)，J.Med.Chem.，27，1447)也是在ADCs中使用的自分
解的间隔臂的实例。
[0813] 示例性的间隔臂单元(-Yy-)由式X-XII表示：
[0814]
[0815] 树突型接头
[0816] 在另一个实施方案中，接头L可以是树突型接头，其用于将一种以上的药物结构部分通过分支、多官能的接头结构部分共价连接于抗体(Sun等(2002)Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters(生物有机和医学化学通讯)12：2213-2215；Sun等(2003)
Bioorganic & Medicinal Chemistry(生物有机和医学化学通讯)11：1761-1768)。树突
型接头可以增加药物与抗体的摩尔比率，即负载，其与ADC的功效相关。因此，如果半胱氨
酸改造的抗体仅具有一个反应性半胱氨酸硫醇基，可以通过树突型接头连接许多药物结构
部分。分支的，树突型接头的示例性实施方案包括2，6-双(羟甲基)-对甲酚和2，4，6-三
(羟甲基)-酚树状聚体单元(WO 2004/01993；Szalai等(2003)J.Amer.Chem.Soc.125：
15688-15689；Shamis等(2004)J.Amer.Chem.Soc.126：1726-1731；Amir等(2003)Angew.
Chem.Int.Ed.42：4494-4499)。
Medicinal Chemistry Letters(生物有机和医学化学通讯)12：2213-2215；Sun等(2003)
Bioorganic & Medicinal Chemistry(生物有机和医学化学通讯)11：1761-1768)。树突
型接头可以增加药物与抗体的摩尔比率，即负载，其与ADC的功效相关。因此，如果半胱氨
酸改造的抗体仅具有一个反应性半胱氨酸硫醇基，可以通过树突型接头连接许多药物结构
部分。分支的，树突型接头的示例性实施方案包括2，6-双(羟甲基)-对甲酚和2，4，6-三
(羟甲基)-酚树状聚体单元(WO 2004/01993；Szalai等(2003)J.Amer.Chem.Soc.125：
15688-15689；Shamis等(2004)J.Amer.Chem.Soc.126：1726-1731；Amir等(2003)Angew.
Chem.Int.Ed.42：4494-4499)。
[0817] 在一个实施方案中，间隔臂单元是分支的双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)，其可以用于结合并且释放多种药物，具有下述结构：
[0818]
[0819] 其包含2-(4-氨基亚苄基)丙烷-1，3-二醇树状聚体单元(WO 2004/043493；deGroot等(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42：4490-4494)，其中Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷
基)、-卤素、-硝基或-氰基；m是范围是0-4的整数；n是0或1；并且p的范围是1-4。
基)、-卤素、-硝基或-氰基；m是范围是0-4的整数；n是0或1；并且p的范围是1-4。
[0820] 式I抗体-药物缀合物化合物的示例性实施方案包 括XIIIa(MC)，XIIIb(val-cit)，XIIIc(MC-val-cit)和XIIId(MC-val-cit-PAB)：
[0821]
[0822] 式Ia抗体-药物缀合物化合物的其它示例性实施方案包括XIVa-e：
[0823]
[0824] 其中X是：
[0825]
[0826] Y是：
[0827]
[0828] 并且R独立地是H或C1-C6烷基；并且n是1-12。
[0829] 在另一个实施方案中，接头具有反应性官能团，所述反应性官能团具有亲核基团，其对于在抗体上存在的亲电子基团具有反应性。在抗体上的有用亲电子基团包括，但不限
于：醛和酮羰基基团。接头的亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电子基团反应并且与抗
体单元形成共价键。接头上的有用的亲核基团包括，但不限于：酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。抗体上的亲电子基团提供用于与接头连接的方便的位点。
于：醛和酮羰基基团。接头的亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电子基团反应并且与抗
体单元形成共价键。接头上的有用的亲核基团包括，但不限于：酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。抗体上的亲电子基团提供用于与接头连接的方便的位点。
[0830] 典型地，肽型接头可以通过在两种以上的氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。所述肽键可以例如根据在肽化学领域中公知的液相合成方法制备(E. 和
K.Lübke(1965)，“肽(The Peptides)”，卷1，第76-136页，学术出版社)。接头中间体可以用包括间隔臂单元、延伸单元和氨基酸单元的任何组合或反应顺序来组装。所述间隔臂单
元、延伸单元和氨基酸单元可以使用亲电子、亲核或游离原子团性质的反应性官能团。反应
性官能团包括，但不限于：羧基、羟基、对硝基苯基羧酸酯、异硫氰酸酯和离去基团，如O-甲磺酰基，O-甲苯磺酰基，-Cl，-Br，-I；或马来酰亚胺。
K.Lübke(1965)，“肽(The Peptides)”，卷1，第76-136页，学术出版社)。接头中间体可以用包括间隔臂单元、延伸单元和氨基酸单元的任何组合或反应顺序来组装。所述间隔臂单
元、延伸单元和氨基酸单元可以使用亲电子、亲核或游离原子团性质的反应性官能团。反应
性官能团包括，但不限于：羧基、羟基、对硝基苯基羧酸酯、异硫氰酸酯和离去基团，如O-甲磺酰基，O-甲苯磺酰基，-Cl，-Br，-I；或马来酰亚胺。
[0831] 例如，带电的取代基如磺酸盐(-SO3-)或铵可以增加试剂的水溶解性并且有利于接头试剂与抗体或药物结构部分的偶联反应，或有利于Ab-L(抗体-接头中间体)与D的
偶联反应，或D-L(药物-接头中间体)与Ab的偶联反应，这取决于用于制备ADC的合成路
径。
偶联反应，或D-L(药物-接头中间体)与Ab的偶联反应，这取决于用于制备ADC的合成路
径。
[0832] 接头试剂
[0833] 抗体和auristatin的缀合物可以使用多种双官能接头试剂制备，所述双官能接头试剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺
基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸
如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如
戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双
(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二 异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性
氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双官能衍生物。
基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸
如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如
戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双
(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二 异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性
氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双官能衍生物。
[0834] 抗体药物缀合物还可以用接头试剂：BMPEO，BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMPB，SMPH，磺基-EMCS，磺基-GMBS，磺基-KMUS，磺基-MBS，磺基-SIAB，磺基-SMCC，和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，
包括双-马来酰亚胺试剂：DTME，BMB，BMDB，BMH，BMOE，1，8-双-马来酰亚胺基二乙二醇
(BM(PEO)2)，和1，11-双-马来酰亚胺基三乙二醇(BM(PEO)3)进行制备，这些试剂可商购自
Pierce Biotechnology，Inc.，ThermoScientific，Rockford，IL，和其它试剂供应商。双-马来酰亚胺试剂允许将半胱氨酸改造的抗体的硫醇基以顺序或并发的方式连接于包含硫醇
的药物结构部分、标记或接头中间体。与半胱氨酸改造的抗体、药物结构部分、标记或接头
中间体的硫醇基具有反应性的除了马来酰亚胺之外的其它官能团包括碘代乙酰胺、溴代乙
酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
包括双-马来酰亚胺试剂：DTME，BMB，BMDB，BMH，BMOE，1，8-双-马来酰亚胺基二乙二醇
(BM(PEO)2)，和1，11-双-马来酰亚胺基三乙二醇(BM(PEO)3)进行制备，这些试剂可商购自
Pierce Biotechnology，Inc.，ThermoScientific，Rockford，IL，和其它试剂供应商。双-马来酰亚胺试剂允许将半胱氨酸改造的抗体的硫醇基以顺序或并发的方式连接于包含硫醇
的药物结构部分、标记或接头中间体。与半胱氨酸改造的抗体、药物结构部分、标记或接头
中间体的硫醇基具有反应性的除了马来酰亚胺之外的其它官能团包括碘代乙酰胺、溴代乙
酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
[0835]
[0836] 有用的接头试剂还可以通过其它商业来源获得，如Molecular Biosciences Inc.(Boulder，CO)，或根据在Toki等(2002)J.Org.Chem(有机化学杂志).67：1866-1872；
Walker，M.A.(1995)J.Org.Chem(有 机 化 学 杂 志).60：5352-5355；Frisch等 (1996)
Bioconjugate Chem(生物缀合物化 学).7：180-186；US 6214345；WO 02/088172；US
2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；和WO 04/032828中所述的方
法进行合成。
Walker，M.A.(1995)J.Org.Chem(有 机 化 学 杂 志).60：5352-5355；Frisch等 (1996)
Bioconjugate Chem(生物缀合物化 学).7：180-186；US 6214345；WO 02/088172；US
2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；和WO 04/032828中所述的方
法进行合成。
[0837] 可以通过使下述接头试剂与氨基酸单元的N-端反应而将式(IIIa)的延伸剂引入接头：
[0838]
[0839] 其中n是范围是1-10的整数，并且T是-H或-SO3Na；
[0840]
[0841] 其中n是范围是0-3的整数；
[0842]
[0843] 可以通过使下述双官能试剂与氨基酸单元的N-端反应而将延伸剂单元引入接头：
[0844]
[0845] 其中X是Br或I。
[0846] 也可以通过使下述双官能试剂与氨基酸单元的N-端反应，而将式的延伸剂单元引入接头：
[0847]
[0848] 具有马来酰亚胺延伸剂和对氨基苄基氨基甲酰基(PAB)自分解间隔臂的示例性缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂具有下述结构：
[0849]
[0850] 具有马来酰亚胺延伸剂单元和PAB自分解间隔臂单元的示例性phe-lys(Mtr，单-4甲氧基三苯甲基)二肽接头试剂可以根据Dubowchik，等.(1997)Tetrahedron
Letters(四面体通讯)，38：5257-60进行制备，并且具有下述结构：
Letters(四面体通讯)，38：5257-60进行制备，并且具有下述结构：
[0851]
[0852] 制备半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体-药物缀合物
[0853] 式I的ADC可以通过一些途径进行制备，所述途径使用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂，包括：(1)使半胱氨酸改造的抗体的半胱氨酸基团与接头试剂反
应从而通过共价键形成抗体-接头中间体Ab-L，随后与活化的药物结构部分D反应；和(2)
使药物结构部分的亲核基团与接头试剂反应从而通过共价键形成药物-接头中间体D-L，
随后进行与半胱氨酸改造的抗体的半胱氨酸基团的反应。可以利用使用多种半胱氨酸改造
的抗体、药物结构部分和接头进行缀合方法(1)和(2)从而制备式I的抗体-药物缀合物。
应从而通过共价键形成抗体-接头中间体Ab-L，随后与活化的药物结构部分D反应；和(2)
使药物结构部分的亲核基团与接头试剂反应从而通过共价键形成药物-接头中间体D-L，
随后进行与半胱氨酸改造的抗体的半胱氨酸基团的反应。可以利用使用多种半胱氨酸改造
的抗体、药物结构部分和接头进行缀合方法(1)和(2)从而制备式I的抗体-药物缀合物。
[0854] 抗体半胱氨酸硫醇基是亲核的并且能够反应以与接头试剂和药物-接头中间体上的亲电子基团形成共价键，所述亲电子基团包括：(i)活性酯类，如NHS酯、HOBt酯、卤
代甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基和苄基卤，如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺
基团；和(iv)二硫化物，包括通过二硫化物交换的吡啶基二硫化物。在药物结构部分上的
亲核基团包括，但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，所述亲核基团能够与接头结构部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键。
代甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基和苄基卤，如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺
基团；和(iv)二硫化物，包括通过二硫化物交换的吡啶基二硫化物。在药物结构部分上的
亲核基团包括，但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，所述亲核基团能够与接头结构部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键。
[0855] 可以使半胱氨酸改造的抗体具有反应性以通过用还原剂如DTT(Cleland′s试剂，二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐；Getz等 (1999)Anal.Biochem.卷
273：73-80；Soltec Ventures，Beverly，MA)处理，随后再氧化以再形成链间和链内二硫键(实施例5)而与接头试剂缀合。例如，在CHO细胞中表达的全长、半胱氨酸改造的单克隆
抗体(硫代Mabs)用约50倍摩尔过量的TCEP在37℃还原3小时以还原半胱氨酸加合物
中的二硫键，所述二硫键可以在新引入的半胱氨酸残基和在培养基中存在的半胱氨酸之间
形成。将被还原的硫代Mab稀释并且加载到在10mM乙酸钠，pH5中的HiTrap S柱上，并用
包含0.3M氯化钠的PBS洗脱。在母体Mab中存在的半胱氨酸残基与稀释的(200nM)硫酸
铜(CuSO4)水溶液在室温过夜来重新形成二硫键。备选地，脱氢抗坏血酸(DHAA)是在半胱
氨酸加合物还原性裂解后重新形成半胱氨酸改造的抗体的链内二硫化物基团的有效氧化
剂。可以使用本领域已知的其它氧化剂，即氧化试剂和氧化条件。环境空气氧化也是有效
的。这种温和的，部分再氧化步骤有效地并且高保真地形成链内二硫化物，并且保留新引入
的半胱氨酸残基的硫醇基。加入约10倍过量的药物-接头中间体，例如MC-vc-PAB-MMAE，
混合并且在室温放置大约1小时以影响缀合并且形成抗-FcRH5抗体-药物缀合物。缀合
混合物是凝胶过滤的并且通过HiTrap S柱加载和洗脱以去除过量的药物-接头中间体和
其它杂质。
273：73-80；Soltec Ventures，Beverly，MA)处理，随后再氧化以再形成链间和链内二硫键(实施例5)而与接头试剂缀合。例如，在CHO细胞中表达的全长、半胱氨酸改造的单克隆
抗体(硫代Mabs)用约50倍摩尔过量的TCEP在37℃还原3小时以还原半胱氨酸加合物
中的二硫键，所述二硫键可以在新引入的半胱氨酸残基和在培养基中存在的半胱氨酸之间
形成。将被还原的硫代Mab稀释并且加载到在10mM乙酸钠，pH5中的HiTrap S柱上，并用
包含0.3M氯化钠的PBS洗脱。在母体Mab中存在的半胱氨酸残基与稀释的(200nM)硫酸
铜(CuSO4)水溶液在室温过夜来重新形成二硫键。备选地，脱氢抗坏血酸(DHAA)是在半胱
氨酸加合物还原性裂解后重新形成半胱氨酸改造的抗体的链内二硫化物基团的有效氧化
剂。可以使用本领域已知的其它氧化剂，即氧化试剂和氧化条件。环境空气氧化也是有效
的。这种温和的，部分再氧化步骤有效地并且高保真地形成链内二硫化物，并且保留新引入
的半胱氨酸残基的硫醇基。加入约10倍过量的药物-接头中间体，例如MC-vc-PAB-MMAE，
混合并且在室温放置大约1小时以影响缀合并且形成抗-FcRH5抗体-药物缀合物。缀合
混合物是凝胶过滤的并且通过HiTrap S柱加载和洗脱以去除过量的药物-接头中间体和
其它杂质。
[0856] 制备用于缀合的从细胞培养物中表达的半胱氨酸改造的抗体的一般方法如下。当细胞培养基包含半胱氨酸时，二硫化物加合物可以在新引入的半胱氨酸氨基酸和来自介质
的半胱氨酸之间形成。如在图23的示例性硫代Mab(左)中以圆圈显示的这些半胱氨酸加
合物必须被还原以产生对于缀合具有反应性的半胱氨酸改造的抗体。半胱氨酸加合物，可
能连同不同的链间二硫键用还原剂如TCEP进行还原性裂解以提供抗体的还原形式。在配
对的半胱氨酸残基之间的链间二硫键在部分氧化条件下再形成，所述部分氧化条件使用硫
酸铜、DHAA或暴露于环境空气。新引入的、改造的和未配对的半胱氨酸残基仍旧可用于与
接头试剂或药物-接头中间体反应以形成本发明的抗体缀合物。在哺乳动物细胞系中表达
的硫代Mabs通过-S-S-键形成导致与改造的Cys的外部缀合的Cys加合物。因此，将纯化
的硫代Mabs用还原和再氧化方法处理以产生反应性硫代Mabs。将这些硫代Mabs用于与包
含细胞毒性药物、荧光团和其它标记的马来酰亚胺 缀合。
的半胱氨酸之间形成。如在图23的示例性硫代Mab(左)中以圆圈显示的这些半胱氨酸加
合物必须被还原以产生对于缀合具有反应性的半胱氨酸改造的抗体。半胱氨酸加合物，可
能连同不同的链间二硫键用还原剂如TCEP进行还原性裂解以提供抗体的还原形式。在配
对的半胱氨酸残基之间的链间二硫键在部分氧化条件下再形成，所述部分氧化条件使用硫
酸铜、DHAA或暴露于环境空气。新引入的、改造的和未配对的半胱氨酸残基仍旧可用于与
接头试剂或药物-接头中间体反应以形成本发明的抗体缀合物。在哺乳动物细胞系中表达
的硫代Mabs通过-S-S-键形成导致与改造的Cys的外部缀合的Cys加合物。因此，将纯化
的硫代Mabs用还原和再氧化方法处理以产生反应性硫代Mabs。将这些硫代Mabs用于与包
含细胞毒性药物、荧光团和其它标记的马来酰亚胺 缀合。
[0857] 10.免疫脂质体(Immunoliposomes)
[0858] 还可以将本文公开的抗-FcRH5抗体配制为免疫脂质体。″脂质体″是由多种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小泡，其用于将药物递送给哺乳动物。脂质
体成分通常以双分子层结构形成，类似于生物膜的脂质排列。包含所述抗体的脂质体通
过本领域已知的方法进行制备，如在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家
科学院学报)82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA(美国国家科学院学
报)77：4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；和在1997年10月23日公开的
WO97/38731中所述。具有增加的循环时间的脂质体在美国专利号5,013,556中公开。
体成分通常以双分子层结构形成，类似于生物膜的脂质排列。包含所述抗体的脂质体通
过本领域已知的方法进行制备，如在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家
科学院学报)82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA(美国国家科学院学
报)77：4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；和在1997年10月23日公开的
WO97/38731中所述。具有增加的循环时间的脂质体在美国专利号5,013,556中公开。
[0859] 特别有用的脂质体可以用脂质组合物通过反相蒸发法来产生，所述脂质组合物包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。脂质体通过限定孔径
大小的滤器被挤出以产生具有需要的直径的脂质体。本发明的抗体的Fab′片段可以通
过二硫化物交换反应缀合于脂质体，如在Martin等，J.Biol.Chem(生物化学杂志).257：
286-288(1982)中所述。化疗剂任选地包含在脂质体中。见Gabizon等，J.National Cancer
Inst.81(19)：1484(1989)。
大小的滤器被挤出以产生具有需要的直径的脂质体。本发明的抗体的Fab′片段可以通
过二硫化物交换反应缀合于脂质体，如在Martin等，J.Biol.Chem(生物化学杂志).257：
286-288(1982)中所述。化疗剂任选地包含在脂质体中。见Gabizon等，J.National Cancer
Inst.81(19)：1484(1989)。
[0860] B.一些制备抗体的方法
[0861] 1.筛选具有所需性质的抗-FcRH5抗体
[0862] 上文已经描述了用于生成结合FcRH5多肽的抗体的技术。如果需要，人们可以进一步选择具有某些生物学特征的抗体。
[0863] 本发明的抗-FcRH5抗体的生长抑制作用可以通过本领域中已知的方法，例如，利用内源地或在用FcRH5基因转染后表达FcRH5多肽的细胞来评估。例如，合适的肿瘤细胞
系和FcRH5-转染的细胞可以使用本发明的抗-FcRH5单克隆抗体，以不同的浓度处理数日
(例如，2-7日)并用结晶紫或MTT来染色，或通过一些其他比色测定来分析。测量增殖的
另一种方法是通过比较在存在或不存在本发明的抗-FcRH5抗体的条件下处理的细胞引起
3
的 H-胸苷吸收。处理后，收获细胞并在闪烁计数器中量化结 合到DNA中的放射性量。合
适的阳性对照包括用生长抑制抗体处理所选择的细胞系，已知所述生长抑制抗体抑制该细
胞系的生长。肿瘤细胞体内生长抑制可以以本领域中已知的多种方式来确定。肿瘤细胞可
以是过表达FcRH5多肽的细胞。在一个实施方案中，与未处理的肿瘤细胞相比，抗-FcRH5
抗体以约0.5-30μg/ml的抗体浓度，体外地或体内地抑制FcRH5-表达肿瘤细胞的细胞增
殖约25-100％，更优选约30-100％，和甚至更优选约50-100％或70-100％。生长抑制可
以在细胞培养物中，以约0.5-30μg/ml或约0.5nM-200nM的抗体浓度来测量，其中生长抑
制在肿瘤细胞暴露于抗体1-10天后确定。该抗体是体内生长抑制性的，条件是以约1μg/
kg-约100mg/kg体重施用抗-FcRH5抗体在首次施用该抗体后约5天-3个月内，优选在约
5-30天内，导致肿瘤大小减小或肿瘤细胞增殖减少。
系和FcRH5-转染的细胞可以使用本发明的抗-FcRH5单克隆抗体，以不同的浓度处理数日
(例如，2-7日)并用结晶紫或MTT来染色，或通过一些其他比色测定来分析。测量增殖的
另一种方法是通过比较在存在或不存在本发明的抗-FcRH5抗体的条件下处理的细胞引起
3
的 H-胸苷吸收。处理后，收获细胞并在闪烁计数器中量化结 合到DNA中的放射性量。合
适的阳性对照包括用生长抑制抗体处理所选择的细胞系，已知所述生长抑制抗体抑制该细
胞系的生长。肿瘤细胞体内生长抑制可以以本领域中已知的多种方式来确定。肿瘤细胞可
以是过表达FcRH5多肽的细胞。在一个实施方案中，与未处理的肿瘤细胞相比，抗-FcRH5
抗体以约0.5-30μg/ml的抗体浓度，体外地或体内地抑制FcRH5-表达肿瘤细胞的细胞增
殖约25-100％，更优选约30-100％，和甚至更优选约50-100％或70-100％。生长抑制可
以在细胞培养物中，以约0.5-30μg/ml或约0.5nM-200nM的抗体浓度来测量，其中生长抑
制在肿瘤细胞暴露于抗体1-10天后确定。该抗体是体内生长抑制性的，条件是以约1μg/
kg-约100mg/kg体重施用抗-FcRH5抗体在首次施用该抗体后约5天-3个月内，优选在约
5-30天内，导致肿瘤大小减小或肿瘤细胞增殖减少。
[0864] 为了选择诱导细胞死亡的抗-FcRH5抗体，如通过例如碘化丙锭(PI)、台盼蓝或7AAD吸收所示的膜完整性缺失可以相对于对照来评估。PI吸收测定可以在不存在互补和
没有效应细胞的条件下进行。单独使用培养基或使用含有合适抗-FcRH5抗体(例如，处于
约10μg/ml)的培养基来温育表达FcRH5多肽的肿瘤细胞。该细胞温育3天的时期。各
处理后，洗涤细胞并等分到35mm滤网加盖的12x 75管(1ml/管，3管/处理组)以去除
细胞团块。然后，管接受PI(10μg/ml)。样品可以利用 流式细胞计数器
和 CellQuest软件(Becton Dickinson)来分析。如通过PI吸收所
确定的诱导统计学显著水平的细胞死亡的那些抗-FcRH5抗体可以选择作为细胞死亡诱导
抗-FcRH5抗体。
没有效应细胞的条件下进行。单独使用培养基或使用含有合适抗-FcRH5抗体(例如，处于
约10μg/ml)的培养基来温育表达FcRH5多肽的肿瘤细胞。该细胞温育3天的时期。各
处理后，洗涤细胞并等分到35mm滤网加盖的12x 75管(1ml/管，3管/处理组)以去除
细胞团块。然后，管接受PI(10μg/ml)。样品可以利用 流式细胞计数器
和 CellQuest软件(Becton Dickinson)来分析。如通过PI吸收所
确定的诱导统计学显著水平的细胞死亡的那些抗-FcRH5抗体可以选择作为细胞死亡诱导
抗-FcRH5抗体。
[0865] 为了筛选结合与目标抗体结合的FcRH5多肽上的表位的抗体，可以进行常规交叉阻断测定，诸如Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring
Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Harlow和David Lane编(1988)中所述的那种测定。
该测定可以用于确定测试抗体是否与已知抗-FcRH5抗体结合相同的位点或表位。备选地，
或另外地，可以通过本领域中已知的方法进行表位作图。例如，抗体序列可以诸如通过丙氨
酸扫描来诱变，以鉴定接触残基。最初测定突变抗体与多克隆抗体的结合，以确保适当的折
叠。在不同的方法中，与FcRH5多肽不同区域相对应的肽可以在竞争测定中与多种测试抗
体或与一种测试抗体和具有特 定或已知表位的抗体一起使用。
Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Harlow和David Lane编(1988)中所述的那种测定。
该测定可以用于确定测试抗体是否与已知抗-FcRH5抗体结合相同的位点或表位。备选地，
或另外地，可以通过本领域中已知的方法进行表位作图。例如，抗体序列可以诸如通过丙氨
酸扫描来诱变，以鉴定接触残基。最初测定突变抗体与多克隆抗体的结合，以确保适当的折
叠。在不同的方法中，与FcRH5多肽不同区域相对应的肽可以在竞争测定中与多种测试抗
体或与一种测试抗体和具有特 定或已知表位的抗体一起使用。
[0866] 2.一些文库筛选方法
[0867] 本发明的抗-FcRH5抗体可以通过使用筛选具有所需活性的抗体的组合文库来制备。例如，本领域中已知多种方法来生成噬菌体展示文库和筛选所述文库以获得具有所需
结合特征的抗体。这样的方法普遍记述在Hoogenboom等(2001)，Methods in Molecular
Biology(分子生物学方法)178：1-37(O’Brien等，编，Human Press(人类出版社)，Totowa，NJ)中，和在某些实施方案中，在Lee等(2004)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340：
1073-1093中。
结合特征的抗体。这样的方法普遍记述在Hoogenboom等(2001)，Methods in Molecular
Biology(分子生物学方法)178：1-37(O’Brien等，编，Human Press(人类出版社)，Totowa，NJ)中，和在某些实施方案中，在Lee等(2004)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340：
1073-1093中。
[0868] 原则上，合成抗体克隆通过筛选噬菌体文库来选择，所述文库包含展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的不同片段。这样的噬菌体文库通过针对所需抗原的
亲合层析法淘选。能够结合所需抗原的克隆表达Fv片段吸附到抗原并由此与文库中的
非结合克隆分开。结合克隆然后由抗原中洗脱，并可以进一步通过另外的抗原吸附/洗
脱循环来富集。任何本发明的抗-FcRH5抗体可以通过一些过程来获得：设计合适的抗原
筛选程序以选择目标噬菌体克隆及随后利用来自目标噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等，
Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，第5版，
NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，卷1-3中所述的合适恒定区(Fc)序列构
建全长抗-FcRH5抗体克隆。
亲合层析法淘选。能够结合所需抗原的克隆表达Fv片段吸附到抗原并由此与文库中的
非结合克隆分开。结合克隆然后由抗原中洗脱，并可以进一步通过另外的抗原吸附/洗
脱循环来富集。任何本发明的抗-FcRH5抗体可以通过一些过程来获得：设计合适的抗原
筛选程序以选择目标噬菌体克隆及随后利用来自目标噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等，
Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，第5版，
NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，卷1-3中所述的合适恒定区(Fc)序列构
建全长抗-FcRH5抗体克隆。
[0869] 在某些实施方案中，抗体的抗原结合结构域由约110个氨基酸的两个可变(V)区形成，各来自轻(VL)和重(VH)链，二者均存在3个超变环(HVRs)或互补决定区(CDRs)。
可变结构域可以功能性展示在噬菌体上，作为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短的
柔性肽共价相连，或作为Fab片段，其中它们各自融合恒定结构域并非共价相互作用，如在
Winter等，Ann.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)，12：433-455(1994)中所述。用于本文中
时，scFv编码噬菌体克隆和Fab编码噬菌体克隆总称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
可变结构域可以功能性展示在噬菌体上，作为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短的
柔性肽共价相连，或作为Fab片段，其中它们各自融合恒定结构域并非共价相互作用，如在
Winter等，Ann.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)，12：433-455(1994)中所述。用于本文中
时，scFv编码噬菌体克隆和Fab编码噬菌体克隆总称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
[0870] VH和VL基因的所有组成成分可以通过聚合酶链式反应(PCR)来分别克隆，并在噬菌体文库中随机重组，其可以随后进行搜索，以获得抗原结 合克隆，如Winter等，Ann.
Rev.Immunol.(免疫学年度综述)，12：433-455(1994)中所述。来自免疫来源的文库在无
需构建杂交瘤的条件下，向免疫原提供高亲和性抗体。备选地，可以克隆天然的所有组成
成分，从而向广泛范围的非自体和自体抗体提供人类抗体的单一来源，其无需如Griffiths
等，EMBO J(EMBO杂志)，12：725-734(1993)所述的任何免疫作用。最后，还可以通过以下
过程来合成地制备天然文库：克隆来自干细胞的未再重排V-基因区段和利用含有随机序
列的PCR引物以编码高度可变CDR3区和完成体外重排，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.
Biol.(分子生物学杂志)，227：381-388(1992)所述。
Rev.Immunol.(免疫学年度综述)，12：433-455(1994)中所述。来自免疫来源的文库在无
需构建杂交瘤的条件下，向免疫原提供高亲和性抗体。备选地，可以克隆天然的所有组成
成分，从而向广泛范围的非自体和自体抗体提供人类抗体的单一来源，其无需如Griffiths
等，EMBO J(EMBO杂志)，12：725-734(1993)所述的任何免疫作用。最后，还可以通过以下
过程来合成地制备天然文库：克隆来自干细胞的未再重排V-基因区段和利用含有随机序
列的PCR引物以编码高度可变CDR3区和完成体外重排，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.
Biol.(分子生物学杂志)，227：381-388(1992)所述。
[0871] 在某些实施方案中，丝状噬菌体通过融合小外壳蛋白pIII，用于展示抗体片段。抗体片段可以展示作为单链Fv片段，其中VH和VL结构域通过柔性多肽间隔区连接在相同的
多肽链上，例如，如Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)所述，
或作为Fab片段，其中一条链融合pIII且另一条链分泌到细菌宿主细胞周质中，其中集合
通过取代一些野生型外壳蛋白而变为在噬菌体表面上展示的Fab-外壳蛋白结构，例如，如
Hoogenboom等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，19：4133-4137(1991)中所述。
多肽链上，例如，如Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)所述，
或作为Fab片段，其中一条链融合pIII且另一条链分泌到细菌宿主细胞周质中，其中集合
通过取代一些野生型外壳蛋白而变为在噬菌体表面上展示的Fab-外壳蛋白结构，例如，如
Hoogenboom等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，19：4133-4137(1991)中所述。
[0872] 一般地，编码抗体基因片段的核酸由收获自人或动物的免疫细胞获得。如果需要偏好于抗-FcRH5克隆的文库，则使用FcRH5来免疫受试者，以产生抗体应答，并回收脾细胞
和/或循环B细胞其他外周血淋巴细胞(PBLs)，以进行文库构建。在优选的实施方案中，
偏好于抗-FcRH5克隆的人抗体基因片段文库通过在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列
(并缺乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗-FcRH5抗体应答来获得，由此
FcRH5免疫作用产生生成针对FcRH5的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的产生
在下文中记述。
和/或循环B细胞其他外周血淋巴细胞(PBLs)，以进行文库构建。在优选的实施方案中，
偏好于抗-FcRH5克隆的人抗体基因片段文库通过在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列
(并缺乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗-FcRH5抗体应答来获得，由此
FcRH5免疫作用产生生成针对FcRH5的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的产生
在下文中记述。
[0873] 关于抗-FcRH5反应性细胞群的另外的富集可以通过使用合适的筛选程序来分离表达FcRH5特异性膜结合抗体，例如，通过利用FcRH5亲合层析法或细胞吸附到荧光染
料-标记的FcRH5及随后进行流式活化细胞分选(FACS)来获得。
料-标记的FcRH5及随后进行流式活化细胞分选(FACS)来获得。
[0874] 备选地，脾细胞和/或B细胞或来自未免疫供体的其他PBL的使用提 供可能的抗体所有组成成分的更好的表示，并还允许利用其中FcRH5不是抗原性的任何动物(人或非
人)物种构建抗体文库。关于引入体外抗体基因构建的文库，由受试者收获干细胞，以提供
编码未重排抗体基因区段的核酸。目标免疫细胞可以获自多种动物物种，诸如人、小鼠、大
鼠、兔、狼(luprine)、犬、猫、猪、牛、马、和鸟类物种，等。
人)物种构建抗体文库。关于引入体外抗体基因构建的文库，由受试者收获干细胞，以提供
编码未重排抗体基因区段的核酸。目标免疫细胞可以获自多种动物物种，诸如人、小鼠、大
鼠、兔、狼(luprine)、犬、猫、猪、牛、马、和鸟类物种，等。
[0875] 编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸由目标细胞回收并扩增。在重排的VH和VL基因文库的情形中，所需的DNA可以通过由淋巴细胞分离基因组DNA
或mRNA及随后使用与重排的VH和VL基因的5’和3’末端匹配的引物进行聚合酶链式
反应(PCR)来获得，如Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(美国国家科学院学报)，
86：3833-3837(1989)中所述，由此制备用于表达的不同V基因所有组成成分。V基因可
以由cDNA和基因组DNA，使用处于编码成熟V结构域的外显子的5’末端的反向引物和基
于J-区段内的正向引物来扩增，如在Orlandi等(1989)和Ward等，Nature(自然)，341：
544-546(1989)中所述。然而，为了由cDNA扩增，反向引物还可以基于前导外显子中，如在
Jones等，Biotechnol.(生物技术)，9：88-89(1991)中所述，且正向引物基于恒定区内，如
在Sastry等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(美国国家科学院学报)，86：5728-5732(1989)
中所述。为了最大化互补性，可以将简并引入引物中，如在Orlandi等(1989)或Sastry等
(1989)中所述。在某些实施方案中，文库多样性通过使用靶向各V-基因家族的PCR引物最
大化，从而扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的VH和VL排列，例如，如Marks等，
J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)的方法中所述或如Orum等，Nucleic
Acids Res.(核酸研究)，21：4491-4498(1993)的方法中所述。为了将扩增的DNA克隆到表
达载体中，罕见限制性位点可以在PCR引物内在作为标记物一个末端处引入，如Orlandi等
(1989)中所述，或通过使用标记的引物进一步PCR扩增引入，如在Clackson等，Nature(自
然)，352：624-628(1991)中所述。
或mRNA及随后使用与重排的VH和VL基因的5’和3’末端匹配的引物进行聚合酶链式
反应(PCR)来获得，如Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(美国国家科学院学报)，
86：3833-3837(1989)中所述，由此制备用于表达的不同V基因所有组成成分。V基因可
以由cDNA和基因组DNA，使用处于编码成熟V结构域的外显子的5’末端的反向引物和基
于J-区段内的正向引物来扩增，如在Orlandi等(1989)和Ward等，Nature(自然)，341：
544-546(1989)中所述。然而，为了由cDNA扩增，反向引物还可以基于前导外显子中，如在
Jones等，Biotechnol.(生物技术)，9：88-89(1991)中所述，且正向引物基于恒定区内，如
在Sastry等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(美国国家科学院学报)，86：5728-5732(1989)
中所述。为了最大化互补性，可以将简并引入引物中，如在Orlandi等(1989)或Sastry等
(1989)中所述。在某些实施方案中，文库多样性通过使用靶向各V-基因家族的PCR引物最
大化，从而扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的VH和VL排列，例如，如Marks等，
J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)的方法中所述或如Orum等，Nucleic
Acids Res.(核酸研究)，21：4491-4498(1993)的方法中所述。为了将扩增的DNA克隆到表
达载体中，罕见限制性位点可以在PCR引物内在作为标记物一个末端处引入，如Orlandi等
(1989)中所述，或通过使用标记的引物进一步PCR扩增引入，如在Clackson等，Nature(自
然)，352：624-628(1991)中所述。
[0876] 合成地重排的V基因的所有组成成分可以体外地源自V基因区段。已经克隆并测序了大部分的人VH基于区段(在Tomlinson等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，
227：776-798(1992)中报告)，并对其进行了绘图(在 Matsuda等，Nature Genet.(自然
遗传学)，3：88-94(1993)中报告)；这些克隆的区段(包括H1和H2环的全部主要构象)
可以用于产生不同的VH基因所有组成成分，PCR引物编码不同序列和长度的H3环，如在
Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，227：381-388(1992)中所述。VH
所有组成成分还可以使用聚集在单一长度的长H3环的所有序列多样性来制备，如Barbas
等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，89：4457-4461(1992)中所述。已经
克隆并测序了人Vκ和Vλ区段(在Williams和Winter，Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂
志)，23：1456-1461(1993)中报告)，并且其可以用于制备合成的轻链所有组成成分。合成
的V基因所有组成成分，基于VH和VL折叠的程度，和L3和H3长度，应该编码相当大结构
域多样性的抗体。在扩增编码V基因的DNAs后，可以根据Hoogenboom和Winter，J.Mol.
Biol.(分子生物学杂志)，227：381-388(1992)的方法体外重排种系V基因区段。
227：776-798(1992)中报告)，并对其进行了绘图(在 Matsuda等，Nature Genet.(自然
遗传学)，3：88-94(1993)中报告)；这些克隆的区段(包括H1和H2环的全部主要构象)
可以用于产生不同的VH基因所有组成成分，PCR引物编码不同序列和长度的H3环，如在
Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，227：381-388(1992)中所述。VH
所有组成成分还可以使用聚集在单一长度的长H3环的所有序列多样性来制备，如Barbas
等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，89：4457-4461(1992)中所述。已经
克隆并测序了人Vκ和Vλ区段(在Williams和Winter，Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂
志)，23：1456-1461(1993)中报告)，并且其可以用于制备合成的轻链所有组成成分。合成
的V基因所有组成成分，基于VH和VL折叠的程度，和L3和H3长度，应该编码相当大结构
域多样性的抗体。在扩增编码V基因的DNAs后，可以根据Hoogenboom和Winter，J.Mol.
Biol.(分子生物学杂志)，227：381-388(1992)的方法体外重排种系V基因区段。
[0877] 抗体片段的所有组成成分可以通过以若干方式将VH和VL基因所有组成成分组合在一起来构建。各种的所有组成成分可以在不同载体中产生，并且所述载体体外地，例如
如Hogrefe等，Gene(基因)，128：119-126(1993)中所述，或体内地通过组合感染，例如，
Waterhouse等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)，21：2265-2266(1993)中所述的loxP系统来
重组。体内重组方法使用Fab片段的双链天性来克服由大肠杆菌(E.coli)转化效率导致
的文库大小的限制。分别克隆天然VH和VL所有组成成分，一个克隆到噬菌粒中且另一个
克隆到噬菌体载体中。这两个文库然后通过含有噬菌粒的细菌的噬菌体感染组合，以使得
12
各细胞含有不同的组合且文库大小仅由细胞存在的数量(约10 个克隆)限制。两种载
体均包含体内重组信号，以使得VH和VL重组到单一复制子上并共包装到噬菌体病毒体中。
-8 -1
这些巨大的文库提供大量良好亲和性的不同抗体(约10 M的Kd )。
如Hogrefe等，Gene(基因)，128：119-126(1993)中所述，或体内地通过组合感染，例如，
Waterhouse等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)，21：2265-2266(1993)中所述的loxP系统来
重组。体内重组方法使用Fab片段的双链天性来克服由大肠杆菌(E.coli)转化效率导致
的文库大小的限制。分别克隆天然VH和VL所有组成成分，一个克隆到噬菌粒中且另一个
克隆到噬菌体载体中。这两个文库然后通过含有噬菌粒的细菌的噬菌体感染组合，以使得
12
各细胞含有不同的组合且文库大小仅由细胞存在的数量(约10 个克隆)限制。两种载
体均包含体内重组信号，以使得VH和VL重组到单一复制子上并共包装到噬菌体病毒体中。
-8 -1
这些巨大的文库提供大量良好亲和性的不同抗体(约10 M的Kd )。
[0878] 备选地，所述所有组成成分可以顺序克隆到相同载体中，例如，如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，88：7978-7982(1991)中所述，或通过
PCR装配在一起并然后克隆，例如，如Clackson等，Nature(自然)，352：624-628(1991)中
所述。PCR装配也可以用于使VH和VL DNAs与编码柔性肽间隔区的DNA连接，以形成单链
Fv(scFv) 所有组成成分。在另一种技术中，“在细胞PCR装配中”用于通过PCR在淋巴细胞
内组合VH和VL基因并然后克隆连接的基因的所有组成成分，如Embleton等，Nucl.Acids
Res.(核酸研究)，20：3831-3837(1992)中所述。
PCR装配在一起并然后克隆，例如，如Clackson等，Nature(自然)，352：624-628(1991)中
所述。PCR装配也可以用于使VH和VL DNAs与编码柔性肽间隔区的DNA连接，以形成单链
Fv(scFv) 所有组成成分。在另一种技术中，“在细胞PCR装配中”用于通过PCR在淋巴细胞
内组合VH和VL基因并然后克隆连接的基因的所有组成成分，如Embleton等，Nucl.Acids
Res.(核酸研究)，20：3831-3837(1992)中所述。
[0879] 由天然文库产生的抗体(天然的或合成的)可以具有中等亲和性(Kd-1为6 7 -1
约10-10M )，但是亲和力成熟也可以通过由第二文库构建和再选择而在体外模拟，如
Winter等(1994)，见上中所述。例如，突变可以通过在Hawkins等，J.Mol.Biol.(分子生
物学杂志)，226：889-896(1992)的方法中或在Gram等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国国
家科学院学报)，89：3576-3580(1992)的方法中，利用易错聚合酶，体外随机引入。另外，亲合力成熟可以通过在所选个体Fv克隆中使用携带跨越目标CDR的随机序列的引物的PCR
来随机突变一个或多个CDRs和筛选较高亲和性克隆来进行。WO 9607754(1996年3月14
日公开)描述用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导突变以创建轻链基因文库的方
法。另一种有效的方法是使通过噬菌体展示选择的VH或VL结构域与获自未免疫的供体的
天然存在V结构域变体重组的所有组成成分和在若干轮链重改组中筛选较高的亲和性，如
-9
Marks等，Biotechnol.(生物技术)，10：779-783(1992)中所述。该技术容许具有约10 M
以下的亲和性的抗体和抗体片段的产生。
约10-10M )，但是亲和力成熟也可以通过由第二文库构建和再选择而在体外模拟，如
Winter等(1994)，见上中所述。例如，突变可以通过在Hawkins等，J.Mol.Biol.(分子生
物学杂志)，226：889-896(1992)的方法中或在Gram等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国国
家科学院学报)，89：3576-3580(1992)的方法中，利用易错聚合酶，体外随机引入。另外，亲合力成熟可以通过在所选个体Fv克隆中使用携带跨越目标CDR的随机序列的引物的PCR
来随机突变一个或多个CDRs和筛选较高亲和性克隆来进行。WO 9607754(1996年3月14
日公开)描述用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导突变以创建轻链基因文库的方
法。另一种有效的方法是使通过噬菌体展示选择的VH或VL结构域与获自未免疫的供体的
天然存在V结构域变体重组的所有组成成分和在若干轮链重改组中筛选较高的亲和性，如
-9
Marks等，Biotechnol.(生物技术)，10：779-783(1992)中所述。该技术容许具有约10 M
以下的亲和性的抗体和抗体片段的产生。
[0880] 文库的筛选可以通过本领域中已知的不同技术来完成。例如，FcRH5可以用于包被吸附板的孔，在固定在吸附板上的宿主细胞上表达或在细胞分选中使用，或与生物素缀
合从而使用链霉抗生物素蛋白包被的珠捕获，或在用于淘选噬菌体展示文库的任何其他方
法中使用。
合从而使用链霉抗生物素蛋白包被的珠捕获，或在用于淘选噬菌体展示文库的任何其他方
法中使用。
[0881] 噬菌体文库样品在适合于结合具有吸附性的噬菌体颗粒的至少一部分的条件下与固定的FcRH5相接触。通常地，选择条件，包括pH、离子强度、温度等来模拟生理
学条件。洗涤并然后例如如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国国家科学院学
报)，88：7978-7982(1991)所述通过酸，或例如如Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂
志)，222：581-597(1991)所述通过碱，或例如，在与Clackson等，Nature(自然)，352：
624-628(1991)的抗原竞争方法类似的程序中通过FcRH5抗原竞争，来洗脱与固相结合的
噬菌体。噬菌体可以在第一轮选择中富集20-1,000倍。而且，富集的噬菌体可以在细菌培
养物中生长并进行更多轮选择。
学条件。洗涤并然后例如如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国国家科学院学
报)，88：7978-7982(1991)所述通过酸，或例如如Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂
志)，222：581-597(1991)所述通过碱，或例如，在与Clackson等，Nature(自然)，352：
624-628(1991)的抗原竞争方法类似的程序中通过FcRH5抗原竞争，来洗脱与固相结合的
噬菌体。噬菌体可以在第一轮选择中富集20-1,000倍。而且，富集的噬菌体可以在细菌培
养物中生长并进行更多轮选择。
[0882] 选择的效率取决于许多因素，包括洗涤过程中的解离动力学，和单噬菌体上的多抗体片段是否可以与抗原同时结合。具有快速解离动力学(和弱结合亲和性)的抗体通过
使用短洗涤、多价噬菌体展示和固相中抗原的高包被密度来保持。高密度不仅通过多价相
互作用稳定噬菌体，而且有利于已经解离的噬菌体的重新结合。具有慢解离动力学(和良
好结合亲和性)的抗体的选择可以通过使用长洗涤和如Bass等，Proteins(蛋白质)，8：
309-314(1990)和WO 92/09690中所述的单价噬菌体展示，和如Marks等，Biotechnol.(生
物技术)，10：779-783(1992)中所述的抗原低包被密度来促进。
使用短洗涤、多价噬菌体展示和固相中抗原的高包被密度来保持。高密度不仅通过多价相
互作用稳定噬菌体，而且有利于已经解离的噬菌体的重新结合。具有慢解离动力学(和良
好结合亲和性)的抗体的选择可以通过使用长洗涤和如Bass等，Proteins(蛋白质)，8：
309-314(1990)和WO 92/09690中所述的单价噬菌体展示，和如Marks等，Biotechnol.(生
物技术)，10：779-783(1992)中所述的抗原低包被密度来促进。
[0883] 可能在关于FcRH5具有不同亲和性，甚至具有稍微不同的亲和性的噬菌体抗体之间进行选择。然而，所选抗体的随机突变(例如，如在一些亲和力成熟技术中进行地)可能
产生许多突变体，大部分结合抗原，且少数具有较高的亲和性。在限制FcRH5的条件下，可
以竞争出很少的高亲和性噬菌体。为了保持所有较高的亲和性突变体，噬菌体可以使用过
量生物素化的FcRH5来温育，但是生物素化的FcRH5处于比关于FcRH5的靶摩尔亲和性常
数更低的体积摩尔浓度的浓度。高亲和性结合噬菌体可以然后通过链霉抗生物素蛋白包被
的顺磁性珠来捕获。这样的“平衡捕获”容许根据其结合亲和性来选择抗体，其具有允许从
大量过量的具有较低亲和性的噬菌体中分离具有最低2倍更高亲和性的突变体克隆。也可
以操作在洗涤与固相结合的噬菌体中使用的条件，从而基于解离动力学来区分。
产生许多突变体，大部分结合抗原，且少数具有较高的亲和性。在限制FcRH5的条件下，可
以竞争出很少的高亲和性噬菌体。为了保持所有较高的亲和性突变体，噬菌体可以使用过
量生物素化的FcRH5来温育，但是生物素化的FcRH5处于比关于FcRH5的靶摩尔亲和性常
数更低的体积摩尔浓度的浓度。高亲和性结合噬菌体可以然后通过链霉抗生物素蛋白包被
的顺磁性珠来捕获。这样的“平衡捕获”容许根据其结合亲和性来选择抗体，其具有允许从
大量过量的具有较低亲和性的噬菌体中分离具有最低2倍更高亲和性的突变体克隆。也可
以操作在洗涤与固相结合的噬菌体中使用的条件，从而基于解离动力学来区分。
[0884] 抗FcRH5克隆可以基于活性来选择。在某些实施方案中，本发明提供与天然表达FcRH5的活细胞结合的抗FcRH5抗体。在一个实施方案中，本发明提供阻断FcRH5配体
和FcRH5之间的结合，但不阻断FcRH5配体和第二蛋白之间的结合的抗-FcRH5抗体。与
所述抗-FcRH5抗体相对应的Fv克隆可以通过以下选择：(1)如上所述由噬菌体文库分离
抗-FcRH5克隆，和任选地，通过在合适的细菌宿主中生长噬菌体克隆的分离群来扩增该
群；(2)选择FcRH5和分别需要针对其的阻断和非阻断活性的第二蛋白；(3)将抗-FcRH5噬
菌体克隆吸附到固定的FcRH5；(4)利用过量第二蛋白来洗脱任何不需要的克隆所述不需
要的克隆识别与第二蛋白的结合决定子重叠或共享的FcRH5-结合决定子；和(5)洗脱在步
骤(4) 后保持被吸附的克隆。任选地，具有所需的阻断/非阻断特性的克隆可以通过重复
本文中所述的选择程序或更多次来进一步富集。
和FcRH5之间的结合，但不阻断FcRH5配体和第二蛋白之间的结合的抗-FcRH5抗体。与
所述抗-FcRH5抗体相对应的Fv克隆可以通过以下选择：(1)如上所述由噬菌体文库分离
抗-FcRH5克隆，和任选地，通过在合适的细菌宿主中生长噬菌体克隆的分离群来扩增该
群；(2)选择FcRH5和分别需要针对其的阻断和非阻断活性的第二蛋白；(3)将抗-FcRH5噬
菌体克隆吸附到固定的FcRH5；(4)利用过量第二蛋白来洗脱任何不需要的克隆所述不需
要的克隆识别与第二蛋白的结合决定子重叠或共享的FcRH5-结合决定子；和(5)洗脱在步
骤(4) 后保持被吸附的克隆。任选地，具有所需的阻断/非阻断特性的克隆可以通过重复
本文中所述的选择程序或更多次来进一步富集。
[0885] 编码杂交瘤来源的单克隆抗体或本发明的噬菌体展示Fv克隆的DNA利用常规程序(例如，通过利用设计用于由杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增目标重链和轻链编码
区的寡核苷酸引物)容易地分离和测序。一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，然后将其
转染至否则不产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢
(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中，以在重组的宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合成。关于在
抗体编码DNA的细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.
(当前免疫学观点)，5：256(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs(免疫学综述)，130：
151(1992)。
区的寡核苷酸引物)容易地分离和测序。一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，然后将其
转染至否则不产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢
(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中，以在重组的宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合成。关于在
抗体编码DNA的细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.
(当前免疫学观点)，5：256(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs(免疫学综述)，130：
151(1992)。
[0886] 编码本发明的Fv克隆的DNA可以与编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如，合适的DNA序列可以获自Kabat等，见上)组合，以形成编码全长或部分长度的重
链和/或轻链的克隆。应该理解任何同种型的恒定区可以用于该目的，包括IgG，IgM，IgA，
IgD，和IgE恒定区，且这样的恒定区可以获自任何人或动物物种。Fv克隆源自一种动物(诸
如人)物种的可变结构域DNA并然后与另一种动物物种的恒定区DNA融合形成关于“杂种”
的编码序列，全长重链和/或轻链包括在如本文中所用的“嵌合”和“杂种”抗体的定义中。
在某些实施方案中，源自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合形成全长或部分长度人
重链和/或轻链的编码序列。
链和/或轻链的克隆。应该理解任何同种型的恒定区可以用于该目的，包括IgG，IgM，IgA，
IgD，和IgE恒定区，且这样的恒定区可以获自任何人或动物物种。Fv克隆源自一种动物(诸
如人)物种的可变结构域DNA并然后与另一种动物物种的恒定区DNA融合形成关于“杂种”
的编码序列，全长重链和/或轻链包括在如本文中所用的“嵌合”和“杂种”抗体的定义中。
在某些实施方案中，源自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合形成全长或部分长度人
重链和/或轻链的编码序列。
[0887] 编码源自杂交瘤的抗-FcRH5抗体的DNA也可以，例如，通过置换关于人重链和轻链恒定结构域的编码序列来代替源自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如，如Morrison等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，81：6851-6855(1984)的方法)来修饰。
编码杂交瘤-或Fv克隆-来源的抗体或片段的DNA可以通过与免疫球蛋白编码序列共价
连接来进一步修饰，所述编码序列的全部或部分关于非免疫球蛋白多肽。以这种方式，制备
“嵌合”或“杂种”抗体，其具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆-来源的抗体的结合特异性。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，81：6851-6855(1984)的方法)来修饰。
编码杂交瘤-或Fv克隆-来源的抗体或片段的DNA可以通过与免疫球蛋白编码序列共价
连接来进一步修饰，所述编码序列的全部或部分关于非免疫球蛋白多肽。以这种方式，制备
“嵌合”或“杂种”抗体，其具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆-来源的抗体的结合特异性。
[0888] C.抗体依赖性酶介导的前药治疗(ADEPT)
[0889] 本发明的抗体还可以通过使抗体与前药活化酶缀合而在ADEPT中使用，所述前药活化酶将前药(例如，肽基化学治疗试剂，参见WO81/01145)转变为活性抗癌药。参见，例
如，WO 88/07378和美国专利号4,975,278。
如，WO 88/07378和美国专利号4,975,278。
[0890] 有效用于ADEPT的免疫缀合物的酶成分包括任何能够以这样的方式对前药起作用的酶，所述方式是使其转变为其更具有活性、细胞毒性的形式。
[0891] 有效用于本发明的方法中的酶包括，但不仅限于，有效用于使含有磷酸盐的前药转变为游离药物的碱性磷酸酶；有效用于使含有硫酸盐的前药转变为游离药物的芳基硫酸
酯酶；有效用于使非毒性5-氟胞嘧啶转变为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；有效用
于使含肽前药转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋
白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；有效用于转变含有D-氨基酸置换的
前药的D-丙氨酰基羧肽酶；有效用于使糖基化前药转变为游离药物的碳水化合物裂解酶
诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；有效用于将使用β-内酰胺衍生化的药物转变为游离
药物的β-内酰胺酶；和有效用于将在其胺氮处分别使用苯氧乙酰基或苯乙酰基基团衍生
化的药物转变为游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。备选
地，具有酶活性的抗体，本领域中也称为“抗体酶”，可以用于使本发明的前药转变为游离的活性药物(参见，例如，Massey，Nature(自然)328：457-458(1987))。抗体-抗体酶缀合
物可以如本文中所述地制备，以用于将抗体酶递送至肿瘤细胞群。
酯酶；有效用于使非毒性5-氟胞嘧啶转变为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；有效用
于使含肽前药转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋
白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；有效用于转变含有D-氨基酸置换的
前药的D-丙氨酰基羧肽酶；有效用于使糖基化前药转变为游离药物的碳水化合物裂解酶
诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；有效用于将使用β-内酰胺衍生化的药物转变为游离
药物的β-内酰胺酶；和有效用于将在其胺氮处分别使用苯氧乙酰基或苯乙酰基基团衍生
化的药物转变为游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。备选
地，具有酶活性的抗体，本领域中也称为“抗体酶”，可以用于使本发明的前药转变为游离的活性药物(参见，例如，Massey，Nature(自然)328：457-458(1987))。抗体-抗体酶缀合
物可以如本文中所述地制备，以用于将抗体酶递送至肿瘤细胞群。
[0892] 本发明的酶可以通过本领域中公知的技术，诸如利用上文讨论的异双功能交联剂，与抗-FcRH5抗体共价结合。备选地，可以利用本领域中公知的重组DNA技术构建融合
蛋白，所述融合蛋白至少包含本发明的抗体的抗原结合区，其至少与本发明的酶的功能活
性部分相连((参见，例如，Neuberger等，Nature(自然)312：604-608(1984))。
蛋白，所述融合蛋白至少包含本发明的抗体的抗原结合区，其至少与本发明的酶的功能活
性部分相连((参见，例如，Neuberger等，Nature(自然)312：604-608(1984))。
[0893] D.抗-FcRH5抗体
[0894] 除本文中所述的抗-FcRH5抗体外，还预期可以制备抗-FcRH5抗体变 体。抗-FcRH5抗体变体可以通过将合适的核苷酸变化引入编码DNA，和/或通过合成所需的抗
体或多肽来制备。本领域中技术人员应该理解氨基酸变化可以改变抗-FcRH5抗体的翻译
后过程，诸如改变糖基化位点的数量或位置或改变膜锚定特征。
体或多肽来制备。本领域中技术人员应该理解氨基酸变化可以改变抗-FcRH5抗体的翻译
后过程，诸如改变糖基化位点的数量或位置或改变膜锚定特征。
[0895] 本文中所述的抗-FcRH5抗体中的变化可以，例如，利用例如在美国专利号5,364,934中所述的关于保守和非保守突变的任何技术和指导来形成。变化可以是置换、缺
失或插入一个或多个编码抗体或多肽的密码子，其导致与天然序列抗体或多肽相比较时氨
基酸序列的改变。任选地，所述变化是通过在抗-FcRH5抗体的一个或多个结构域中将至少
一个氨基酸置换为任何其他氨基酸。确定哪种氨基酸残基可以在不有害地影响所需活性的
条件下插入、置换或缺失可以通过比较抗-FcRH5抗体的序列和同源已知蛋白分子的序列
并最小化高同源性区域中形成的氨基酸序列变化的数量来发现。氨基酸置换可以是将一个
氨基酸取代为另一个具有类似结构和/或化学特性的氨基酸的结果，诸如将亮氨酸取代为
丝氨酸，即保守的氨基酸取代。插入或缺失可以任选地在约1-5个氨基酸的范围内。容许
的变化可以通过在序列中合成地制备氨基酸的插入、缺失或置换和测试由此产生的变体通
过全长或成熟天然序列表现出的活性来确定。
失或插入一个或多个编码抗体或多肽的密码子，其导致与天然序列抗体或多肽相比较时氨
基酸序列的改变。任选地，所述变化是通过在抗-FcRH5抗体的一个或多个结构域中将至少
一个氨基酸置换为任何其他氨基酸。确定哪种氨基酸残基可以在不有害地影响所需活性的
条件下插入、置换或缺失可以通过比较抗-FcRH5抗体的序列和同源已知蛋白分子的序列
并最小化高同源性区域中形成的氨基酸序列变化的数量来发现。氨基酸置换可以是将一个
氨基酸取代为另一个具有类似结构和/或化学特性的氨基酸的结果，诸如将亮氨酸取代为
丝氨酸，即保守的氨基酸取代。插入或缺失可以任选地在约1-5个氨基酸的范围内。容许
的变化可以通过在序列中合成地制备氨基酸的插入、缺失或置换和测试由此产生的变体通
过全长或成熟天然序列表现出的活性来确定。
[0896] 本文中提供抗-FcRH5抗体片段。所述片段可以在N-端或C-端截断，或可以缺少内部残基，例如，在与全长天然抗体或蛋白相比较时。某些片段缺少对抗-FcRH5抗体的所
需生物学活性非必要的氨基酸残基。
需生物学活性非必要的氨基酸残基。
[0897] 抗-FcRH5抗体片段可以通过许多常规技术中的任一种来制备。所需的肽片段可以化学合成。备选的方法包括通过酶消化，例如，通过使用已知在由特殊氨基酸残基定义的
位点处裂解蛋白的酶处理该蛋白，或通过使用合适的限制性酶消化DNA来产生抗体或多肽
片段，和分离所需的片段。另一种合适的技术包括分离和通过聚合酶链反应(PCR)扩增编
码所需抗体或多肽片段的DNA片段。定义DNA片段的所需末端的寡核苷酸在PCR中在5’
和3’引物处使用。优选地，抗-FcRH5抗体片段与本文中公开的天然抗-FcRH5抗体至少共
享一种生物学和/或免疫学活性。
位点处裂解蛋白的酶处理该蛋白，或通过使用合适的限制性酶消化DNA来产生抗体或多肽
片段，和分离所需的片段。另一种合适的技术包括分离和通过聚合酶链反应(PCR)扩增编
码所需抗体或多肽片段的DNA片段。定义DNA片段的所需末端的寡核苷酸在PCR中在5’
和3’引物处使用。优选地，抗-FcRH5抗体片段与本文中公开的天然抗-FcRH5抗体至少共
享一种生物学和/或免疫学活性。
[0898] 在特殊的实施方案中，目标的保守置换显示在表8中，标题为优选的置换。如果所述置换导致生物学活性的变化，则引入表8中的更多实质性 变化、命名的示范性置换，或
如下文中参考氨基酸分离进一步所述地，并筛选产物。
如下文中参考氨基酸分离进一步所述地，并筛选产物。
[0899] 表8
[0900]
[0901] 抗-FcRH5抗体的功能或免疫学特性的实质性变化通过选择置换来实 现，所述置换在它们对维持(a)置换区域内多肽主链的结构，例如，作为折叠或螺旋构象，(b)靶位点
处分子的变化或疏水性，或(c)侧链的体积的作用中显著不同。天然存在的残基基于共有
侧链特性分组：
处分子的变化或疏水性，或(c)侧链的体积的作用中显著不同。天然存在的残基基于共有
侧链特性分组：
[0902] (1)疏水性的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
[0903] (2)中性亲水性的：cys，ser，thr；
[0904] (3)酸性的：asp，glu；
[0905] (4)碱性的：asn，gln，his，lys，arg；
[0906] (5)影响链方向的残基：gly，pro；和
[0907] (6)芳香族的：trp，tyr，phe。
[0908] 非保守置换应该伴随将这些组之一中的一个成员交换为另一个组的成员。这样置换的残基也可以引入至保守置换位点，或更优选地，引入至其余(非保守的)位点。
[0909] 变化可以利用本领域中已知的方法，诸如寡核苷酸-介导的(位点-定向的)诱变、丙氨酸扫描、和PCR诱变来形成。位点-定向的诱变[Carter等，Nucl.Acids Res.(核
酸研究)，13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，10：6487(1987)]、盒诱变[Wells等，Gene(基因)，34：315(1985)]、限制性选择诱变[Wells等，Philos.Trans.
R.Soc.London SerA(伦敦皇家社会哲学学报A)，317：415(1986)]或其其他已知技术可以
对克隆的DNA进行，以产生抗-FcRH5抗体变体DNA。
酸研究)，13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，10：6487(1987)]、盒诱变[Wells等，Gene(基因)，34：315(1985)]、限制性选择诱变[Wells等，Philos.Trans.
R.Soc.London SerA(伦敦皇家社会哲学学报A)，317：415(1986)]或其其他已知技术可以
对克隆的DNA进行，以产生抗-FcRH5抗体变体DNA。
[0910] 扫描氨基酸分析也可以用于沿着连续的序列鉴别一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸包括相对小的、中性氨基酸。这样的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、
和半胱氨酸。丙氨酸典型地是该组中的优选的扫描氨基酸，因为它消除超过β-碳的
侧链并不太可能改变所变体的主链构象[Cunningham和Wells，Science(科学)，244：
1081-1085(1989)]。丙氨酸还是典型优选的，因为它是最常见的氨基酸。此外，它频繁存在
于隐藏的和暴露的位置[Creighton，The Proteins(蛋白质)，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；
Chothia，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，150：1(1976)]。如果丙氨酸置换不产生足够量
的变体，则可以使用等构(isoteric)氨基酸。
和半胱氨酸。丙氨酸典型地是该组中的优选的扫描氨基酸，因为它消除超过β-碳的
侧链并不太可能改变所变体的主链构象[Cunningham和Wells，Science(科学)，244：
1081-1085(1989)]。丙氨酸还是典型优选的，因为它是最常见的氨基酸。此外，它频繁存在
于隐藏的和暴露的位置[Creighton，The Proteins(蛋白质)，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；
Chothia，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，150：1(1976)]。如果丙氨酸置换不产生足够量
的变体，则可以使用等构(isoteric)氨基酸。
[0911] 未参与维持抗-FcRH5抗体适当构象的任何半胱氨酸残基也可以被通常置换为丝氨酸，从而促进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反地， 可以将半胱氨酸键加入至
抗-FcRH5抗体，从而促进其稳定性(特别是在抗体是抗体片段诸如Fv片段的情况下)。
抗-FcRH5抗体，从而促进其稳定性(特别是在抗体是抗体片段诸如Fv片段的情况下)。
[0912] 置换变体的特别优选类型包括置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个超变区残基。一般地，由此产生的选择用于进一步开发的变体应该具有相对于产生它
们的亲本抗体改进的生物学特性。用于产生所述置换变体的便利方法包括利用噬菌体展示
的亲和力成熟。简言之，突变若干超变区位点(例如，6-7位点)，以在各位点处产生全部可
能的氨基置换。由此产生的抗体变体以单价方式由丝状噬菌体粒子展示为与各粒子中包
装的M13的基因III产物的融合。然后筛选噬菌体展示的变体，以获得它们的生物学活性
(例如，结合亲和性)，如本文中所公开地。为了鉴别用于修饰的候选超变区位点，可以进行
丙氨酸扫描诱变，以鉴别对抗原结合起显著贡献的超变区残基。备选地，或另外地，分析抗
原-抗体复合物的晶体结构以鉴别抗体和FcRH5多肽之间的接触点可以是有益的。所述接
触残基和相邻残基是根据本文中详述的技术置换的候选者。所述变体一旦产生，变体组如
本文中所述地进行筛选，并可以选择在一个或多个相关测定中具有较好特性的抗体进一步
开发。
们的亲本抗体改进的生物学特性。用于产生所述置换变体的便利方法包括利用噬菌体展示
的亲和力成熟。简言之，突变若干超变区位点(例如，6-7位点)，以在各位点处产生全部可
能的氨基置换。由此产生的抗体变体以单价方式由丝状噬菌体粒子展示为与各粒子中包
装的M13的基因III产物的融合。然后筛选噬菌体展示的变体，以获得它们的生物学活性
(例如，结合亲和性)，如本文中所公开地。为了鉴别用于修饰的候选超变区位点，可以进行
丙氨酸扫描诱变，以鉴别对抗原结合起显著贡献的超变区残基。备选地，或另外地，分析抗
原-抗体复合物的晶体结构以鉴别抗体和FcRH5多肽之间的接触点可以是有益的。所述接
触残基和相邻残基是根据本文中详述的技术置换的候选者。所述变体一旦产生，变体组如
本文中所述地进行筛选，并可以选择在一个或多个相关测定中具有较好特性的抗体进一步
开发。
[0913] 编码抗-FcRH5抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域中已知的多种方法来制备。这些方法包括，但不仅限于，由天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情
形中)或通过寡核苷酸-介导的(或位点-定向的)诱变、PCR诱变、和盒诱变早先制备的
抗-FcRH5抗体变体或非变体形式来制备。
形中)或通过寡核苷酸-介导的(或位点-定向的)诱变、PCR诱变、和盒诱变早先制备的
抗-FcRH5抗体变体或非变体形式来制备。
[0914] E.抗-FcRH5抗体的修饰
[0915] 抗-FcRH5抗体的共价修饰属于本发明的范围。一种共价修饰类型包括使抗-FcRH5抗体的靶定氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，所述衍生化试剂能够与该
抗-FcRH5抗体的所选侧链或N-或C-端残基反应。使用双功能性试剂的衍生化作用有效用
于，例如，使抗-FcRH5抗体与在本方法中用于纯化抗-FcRH5抗体的不溶于水的支持基质或
表面交联，并且反之亦然。常用的交联剂包括，例如，1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊
二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，具有4-叠氮水杨酸的酯，同双功能亚氨酸酯， 包括二琥珀酰亚胺酯诸如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)，双功能马来酰亚胺诸如双-N-马
来酰亚胺-1，8-辛烷和试剂诸如甲基-3-[(p-叠氮苯基)二硫代]丙亚胺酯。
抗-FcRH5抗体的所选侧链或N-或C-端残基反应。使用双功能性试剂的衍生化作用有效用
于，例如，使抗-FcRH5抗体与在本方法中用于纯化抗-FcRH5抗体的不溶于水的支持基质或
表面交联，并且反之亦然。常用的交联剂包括，例如，1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊
二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，具有4-叠氮水杨酸的酯，同双功能亚氨酸酯， 包括二琥珀酰亚胺酯诸如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)，双功能马来酰亚胺诸如双-N-马
来酰亚胺-1，8-辛烷和试剂诸如甲基-3-[(p-叠氮苯基)二硫代]丙亚胺酯。
[0916] 其他修饰包括谷氨酰胺和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基基团的磷酸
化，赖氨酸、精氨酸、和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化[T.E.Creighton，Proteins：
Structure and Molecular Properties(蛋白质：结构和分子特性)，W.H.Freeman & Co.，
San Francisco(旧金山)，第79-86页(1983)]，N-端胺的乙酰化，和任何C-端羧基基团的
酰胺化。
化，赖氨酸、精氨酸、和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化[T.E.Creighton，Proteins：
Structure and Molecular Properties(蛋白质：结构和分子特性)，W.H.Freeman & Co.，
San Francisco(旧金山)，第79-86页(1983)]，N-端胺的乙酰化，和任何C-端羧基基团的
酰胺化。
[0917] 本发明范围包括的抗-FcRH5抗体的另一种共价修饰类型包括改变抗体或多肽的天然糖基化模式。“改变天然糖基化模式”在本文中的目的为意指缺失天然序列抗-FcRH5
抗体中存在的一个或多个碳水化合物结构部分(通过去除基本糖基化位点或通过经由化
学和/或酶手段缺失糖基化位点)，和/或添加天然序列抗-FcRH5抗体中不存在的一个或
多个糖基化位点。另外，该短语包括天然蛋白的糖基化的定性改变，包括存在的多种碳水化
合物结构部分的天性和比例的改变。
抗体中存在的一个或多个碳水化合物结构部分(通过去除基本糖基化位点或通过经由化
学和/或酶手段缺失糖基化位点)，和/或添加天然序列抗-FcRH5抗体中不存在的一个或
多个糖基化位点。另外，该短语包括天然蛋白的糖基化的定性改变，包括存在的多种碳水化
合物结构部分的天性和比例的改变。
[0918] 抗体和其他多肽的糖基化作用典型地是N-连接或O-连接的。N-连接指碳水化合物结构部分连接到天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏
氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸，是碳水化合物结构部分酶连接至天冬酰胺侧
链的识别序列。因此，这些三肽序列中任一种在多肽中的存在形成潜在的糖基化位点。O-连
接的糖基化作用指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一连接至羟基氨基酸，最一般地，
丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸，是碳水化合物结构部分酶连接至天冬酰胺侧
链的识别序列。因此，这些三肽序列中任一种在多肽中的存在形成潜在的糖基化位点。O-连
接的糖基化作用指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一连接至羟基氨基酸，最一般地，
丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
[0919] 向抗-FcRH5抗体添加糖基化位点通过改变氨基酸序列以使其含有一个或多个上述三肽序列来实现(对于N-连接的糖基化位点)。改变还可以通过添加，或置换，一个或多
个丝氨酸或苏氨酸残基到原始抗-FcRH5抗体的序列来形成(对于O-连接的糖基化位点)。
抗-FcRH5抗体氨基酸序列可以任选地通过DNA水平的变化，特别是通过在预选碱基处突变
编码抗-FcRH5抗体的DNA以使得产生将翻译为所需氨基酸的密码子来改变。
个丝氨酸或苏氨酸残基到原始抗-FcRH5抗体的序列来形成(对于O-连接的糖基化位点)。
抗-FcRH5抗体氨基酸序列可以任选地通过DNA水平的变化，特别是通过在预选碱基处突变
编码抗-FcRH5抗体的DNA以使得产生将翻译为所需氨基酸的密码子来改变。
[0920] 增加抗-FcRH5抗体上碳水化合物结构部分数量的另一种手段是通过 化学或酶偶联糖苷至多肽。这样的方法记述在本领域中，例如，在1987年9月11日公开的WO
87/05330，和在Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981)中。
87/05330，和在Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981)中。
[0921] 去除抗-FcRH5抗体上存在的碳水化合物结构部分可以化学地或酶促地或通过突变置换编码担当糖基化靶标的氨基酸残基的密码子来实现。化学去糖基化技术是本领
域中已知的且通过例如，Hakimuddin，等，Arch.Biochem.Biophys.(生物化学和生物物理
纪录)，259：52(1987)和Edge等， Anal.Biochem.(分析生物化学)，118：131(1981)记
述。多肽上的碳水化合物结构部分的酶促裂解可以通过使用多种如Thotakura等，Meth.
Enzymol.(酶学方法)，138：350(1987)所述的内切-和外切-糖苷酶来完成。
域中已知的且通过例如，Hakimuddin，等，Arch.Biochem.Biophys.(生物化学和生物物理
纪录)，259：52(1987)和Edge等， Anal.Biochem.(分析生物化学)，118：131(1981)记
述。多肽上的碳水化合物结构部分的酶促裂解可以通过使用多种如Thotakura等，Meth.
Enzymol.(酶学方法)，138：350(1987)所述的内切-和外切-糖苷酶来完成。
[0922] 抗-FcRH5抗体的另一种共价修饰类型包括以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式，将抗体连接至多种非蛋
白质多聚体之一，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、或聚氧化烯。抗体还可以包载在例如
通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如，分别地，羟甲基纤维素或明胶-微
胶囊和聚-(异丁烯酸甲酯)微胶囊)中，胶状药物递送系统(例如，脂质体，清蛋白微
球，微乳液，纳米-颗粒和纳米胶囊)中，或粗乳液中。这样的技术公开在Remington′s
Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第16版，Oslo，A.，编，(1980)中。
白质多聚体之一，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、或聚氧化烯。抗体还可以包载在例如
通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如，分别地，羟甲基纤维素或明胶-微
胶囊和聚-(异丁烯酸甲酯)微胶囊)中，胶状药物递送系统(例如，脂质体，清蛋白微
球，微乳液，纳米-颗粒和纳米胶囊)中，或粗乳液中。这样的技术公开在Remington′s
Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第16版，Oslo，A.，编，(1980)中。
[0923] 本发明的抗-FcRH5抗体还可以以形成嵌合分子的方式来修饰，所述嵌合分子包含与另一种抗-FcRH5抗体、异源多肽或氨基酸序列融合的抗-FcRH5抗体。
[0924] 在一个实施方案中，这样的嵌合分子包含抗-FcRH5抗体与标记物多肽的融合，所述标记物多肽提供抗-标记物抗体可以选择结合的表位。表位标记物通常位于抗-FcRH5
抗体的氨基或羧基端。这样的抗-FcRH5抗体表位标记形式可以利用针对标记物多肽的抗
体来检测。而且，表位标记物的提供容许通过亲和纯化，利用抗-标记物抗体或另一种类
型的与表位标记物结合的亲合性基质容易地纯化抗-FcRH5抗体。不同的标记物多肽和
它们各自的抗体是本领域中公知的。实例包括聚-组氨酸(聚-his)或聚-组氨酸-甘
氨酸(聚-his-gly)标记物；流感HA标记物多肽及其抗体12CA5[Field等， Mol.Cell.
Biol.(分子和细胞生物学)，8：2159-2165(1988)]；c-myc标记物及其8F9，3C7，6E10，G4，B7和9E10抗体[Evan等，Molecular and Cellular Biology(分子和细胞生物学)，5：
3610-3616(1985)]；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记物及其抗体[Paborsky等，Protein
Engineering(蛋白质工程)， 3(6)：547-553(1990)]。其他标记物多肽包括Flag-肽[Hopp
等，BioTechnology(生物技术)，6：1204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin等，Science(科
学)， 255：192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.(生物化学杂
志)，266：15163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白肽标记物[Lutz-Freyermuth等，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)， 87：6393-6397(1990)]。
抗体的氨基或羧基端。这样的抗-FcRH5抗体表位标记形式可以利用针对标记物多肽的抗
体来检测。而且，表位标记物的提供容许通过亲和纯化，利用抗-标记物抗体或另一种类
型的与表位标记物结合的亲合性基质容易地纯化抗-FcRH5抗体。不同的标记物多肽和
它们各自的抗体是本领域中公知的。实例包括聚-组氨酸(聚-his)或聚-组氨酸-甘
氨酸(聚-his-gly)标记物；流感HA标记物多肽及其抗体12CA5[Field等， Mol.Cell.
Biol.(分子和细胞生物学)，8：2159-2165(1988)]；c-myc标记物及其8F9，3C7，6E10，G4，B7和9E10抗体[Evan等，Molecular and Cellular Biology(分子和细胞生物学)，5：
3610-3616(1985)]；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记物及其抗体[Paborsky等，Protein
Engineering(蛋白质工程)， 3(6)：547-553(1990)]。其他标记物多肽包括Flag-肽[Hopp
等，BioTechnology(生物技术)，6：1204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin等，Science(科
学)， 255：192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.(生物化学杂
志)，266：15163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白肽标记物[Lutz-Freyermuth等，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)， 87：6393-6397(1990)]。
[0925] 在备选的实施方案中，嵌合分子可以包含抗-FcRH5抗体与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特殊区域的融合。关于嵌合分子的二价形式(也称为“免疫粘附素”)，这样的融合
可以针对IgG分子的Fc区。Ig融合优选包括代替Ig分子内至少一个可变区的抗-FcRH5
抗体可溶(缺失或灭活跨膜结构域)形式的置换。在特别优选的实施方案中，免疫球蛋白
融合包括IgGl分子的铰合部，CH2和CH3，或铰合部，CH1，CH2和CH3区。关于产生免疫球蛋
白融合，也参见1995年6月27日授权的美国专利号5,428,130。
可以针对IgG分子的Fc区。Ig融合优选包括代替Ig分子内至少一个可变区的抗-FcRH5
抗体可溶(缺失或灭活跨膜结构域)形式的置换。在特别优选的实施方案中，免疫球蛋白
融合包括IgGl分子的铰合部，CH2和CH3，或铰合部，CH1，CH2和CH3区。关于产生免疫球蛋
白融合，也参见1995年6月27日授权的美国专利号5,428,130。
[0926] F.制备抗-FcRH5抗体
[0927] 以下描述主要涉及通过培养使用包含抗-FcRH5抗体-编码核酸的载体转化或转染的细胞生成抗-FcRH5抗体。当然，预期本领域中公知的备选方法可以用于制备抗-FcRH5
抗体。例如，合适的氨基酸序列，或其部分，可以通过利用固相技术指导肽合成来产生[参
见，例如，Stewart等， Solid-Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，W.H.Freeman
Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.(美国化学界杂志)， 85：
2149-2154(1963)]。体外蛋白质合成可以利用手工技术或通过自动控制来进行。自动化合
成可以，例如，使用应用生物系统肽合成器(Applied Biosystems Peptide Synthesizer)
(Foster City，CA)，利用制造商说明书来完成。抗-FcRH5抗体的不同部分可以分别化学合
成并利用化学或酶促方法组合以产生所需的抗-FcRH5抗体。
抗体。例如，合适的氨基酸序列，或其部分，可以通过利用固相技术指导肽合成来产生[参
见，例如，Stewart等， Solid-Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，W.H.Freeman
Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.(美国化学界杂志)， 85：
2149-2154(1963)]。体外蛋白质合成可以利用手工技术或通过自动控制来进行。自动化合
成可以，例如，使用应用生物系统肽合成器(Applied Biosystems Peptide Synthesizer)
(Foster City，CA)，利用制造商说明书来完成。抗-FcRH5抗体的不同部分可以分别化学合
成并利用化学或酶促方法组合以产生所需的抗-FcRH5抗体。
[0928] 1.分离编码抗-FcRH5抗体的DNA
[0929] 编码抗-FcRH5抗体的DNA可以获自由被认为具有抗-FcRH5抗体mRNA并以可检测水平对其进行表达的组织制备的cDNA文库。因此，人抗-FcRH5抗体DNA可以方便地获
自由人组织制备的cDNA文库。抗-FcRH5抗体-编码基因也可以获自基因组文库或通过已
知的合成程序(例如，自动化的核酸合成)获得。
自由人组织制备的cDNA文库。抗-FcRH5抗体-编码基因也可以获自基因组文库或通过已
知的合成程序(例如，自动化的核酸合成)获得。
[0930] 文库可以使用设计用于鉴别目标基因或由其编码的蛋白的探针(诸如至少约20-80个碱基的寡核苷酸)来筛选。使用所选的探针筛选cDNA或基因组文库可以利用标
准程序来进行，诸如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克
隆：实验室手册)(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(纽约：冷泉港出版
社)，1989)中所述。用于分离编码抗-FcRH5抗体的基因的备选手段是使用PCR方法学
[Sambrook等，见上；Dieffenbach等，PCR Primer：A Laboratory Manual(PCR引物：实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港出版社)，1995)]。
准程序来进行，诸如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克
隆：实验室手册)(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(纽约：冷泉港出版
社)，1989)中所述。用于分离编码抗-FcRH5抗体的基因的备选手段是使用PCR方法学
[Sambrook等，见上；Dieffenbach等，PCR Primer：A Laboratory Manual(PCR引物：实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港出版社)，1995)]。
[0931] 用于筛选cDNA文库的技术是本领域中公知的。选择作为探针的寡核苷酸序列应该具有足够的长度并且是充分明确的，假阳性最小化。寡核苷酸优选是标记的，以使其可以
在与被筛选文库中的DNA杂交时被检测。标记的方法是本领域中公知的，且包括使用放射
32
性标记物如 p-标记的ATP、生物素化或酶标记。杂交条件，包括中等严格和高度严格，在
Sambrook等，见上中提供。
在与被筛选文库中的DNA杂交时被检测。标记的方法是本领域中公知的，且包括使用放射
32
性标记物如 p-标记的ATP、生物素化或酶标记。杂交条件，包括中等严格和高度严格，在
Sambrook等，见上中提供。
[0932] 以这样的文库筛选方法鉴别的序列可以与公共数据库诸如GenBank或其他私人序列数据库中保存和可获得的其他已知序列比较和比对。在分子的定义的区域内或跨全长
序列的序列同一性(在氨基酸或核苷酸水平)可以利用本领域中已知的方法并如本文中所
述来确定。
序列的序列同一性(在氨基酸或核苷酸水平)可以利用本领域中已知的方法并如本文中所
述来确定。
[0933] 具有蛋白编码序列的核酸可以通过以下步骤获得：利用本文中公开的首次推定的氨基酸序列筛选所选cDNA或基因组文库，和，如果需要，使用如Sambrook等，见上中所述的
常规引物延伸程序检测前体和处理可能未被反转录为cDNA的mRNA中间产物。
常规引物延伸程序检测前体和处理可能未被反转录为cDNA的mRNA中间产物。
[0934] 2.选择和转化宿主细胞
[0935] 宿主细胞使用本文中关于抗-FcRH5抗体产生所述的表达或克隆载体来转染或转化并常规营养培养基中培养，所述培养基在适当时为了诱导启动子，选择转化体，或扩增编
码所需序列的基因而进行改良。培养条件，诸如培养基、温度、pH等，可以由本领域中技术
人员，在不需要过度实验的条件下选择。一般地，用于最大化细胞培养产率的原则、方案、和实践技术可以存在于Mammalian Cell Biotechnology：a Practical Approach(哺乳动物
细胞生物技术：实践方法)，M.Butler，编(IRL Press，1991)和Sambrook等，见上中。
码所需序列的基因而进行改良。培养条件，诸如培养基、温度、pH等，可以由本领域中技术
人员，在不需要过度实验的条件下选择。一般地，用于最大化细胞培养产率的原则、方案、和实践技术可以存在于Mammalian Cell Biotechnology：a Practical Approach(哺乳动物
细胞生物技术：实践方法)，M.Butler，编(IRL Press，1991)和Sambrook等，见上中。
[0936] 真核细胞转染和原核细胞转化的方法，其意指将DNA引入宿主以使得DNA作为染色体外成分或通过染色体成分可复制，是本领域中技术人员已知的，例如，CaCl2，CaPO4，脂质体-介导的，聚乙二醇/DMSO和电穿孔。根据所用的宿主细胞，转化利用适合于所述
细胞的标准技术来进行。使用氯化钙的钙处理，如Sambrook等，见上中所述，或电穿孔通
常用于原核生物。使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的感染用于转化某
些植物细胞，如由Shaw等，Gene(基因)，23：315(1983)和1989年6月29日公开的WO
89/05859所述。关于不具有这样的细胞壁的哺乳动物细胞，可以使用Graham和van der
Eb，Virology(病毒学)，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染
的一般方面已经记述在美国专利号4,399,216中。转化到酵母中典型地按照Van Solingen
等，J.Bact.(细菌杂志)，130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(美国国
家科学院学报)，76：3829(1979)的方法来进行。然而，还可以使用用于将DNA引入细胞的其
他方法，诸如通过细胞核显微注射、电穿孔、与完整细胞的细菌原生质体融合，或聚阳离子，例如，聚凝胺(polybrene)，聚鸟氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的不同技术，参见Keown
等，Methods in Enzymology(酶学方法)，185：527-537(1990)和Mansour等，Nature(自
然)，336：348-352(1988)。
细胞的标准技术来进行。使用氯化钙的钙处理，如Sambrook等，见上中所述，或电穿孔通
常用于原核生物。使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的感染用于转化某
些植物细胞，如由Shaw等，Gene(基因)，23：315(1983)和1989年6月29日公开的WO
89/05859所述。关于不具有这样的细胞壁的哺乳动物细胞，可以使用Graham和van der
Eb，Virology(病毒学)，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染
的一般方面已经记述在美国专利号4,399,216中。转化到酵母中典型地按照Van Solingen
等，J.Bact.(细菌杂志)，130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(美国国
家科学院学报)，76：3829(1979)的方法来进行。然而，还可以使用用于将DNA引入细胞的其
他方法，诸如通过细胞核显微注射、电穿孔、与完整细胞的细菌原生质体融合，或聚阳离子，例如，聚凝胺(polybrene)，聚鸟氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的不同技术，参见Keown
等，Methods in Enzymology(酶学方法)，185：527-537(1990)和Mansour等，Nature(自
然)，336：348-352(1988)。
[0937] 对于在本文中的载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞包括原核生物、酵母或更高等的真核细胞。
[0938] a.原核宿主细胞
[0939] 合适的原核生物包括但不仅限于原始细菌和真细菌，诸如革兰士-阴性或革兰士-阳性生物体，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)诸如大肠杆菌(E.coli)。不同
的大肠杆菌菌株是公众可获得地，诸如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆
菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5772(ATCC 53,635)。
其他合适的原核宿主细胞包括肠杆菌科诸如希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠杆
菌，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，
变形菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella
typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和
贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和
地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，1989年4月12日公开的DD 266,710中公开
的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，
根瘤菌属(Rhizobia)，透明颤菌属(Vitreoscilla)，副球菌属(Paracoccus)和链霉菌
属(Streptomyces)。这些实例是用于举例说明的而非用于限制的。菌株W3110是一
种特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是关于重组DNA产物发酵的普遍宿主菌株。优
选地，宿主细胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110(Bachmann，Cellular and
Molecular Biology(细胞和分子生物学)，卷2(Washington，D.C.：American Society
for Microbiology(华盛顿特区：美国微生物学界)，1987)，第1190-1219页；ATCC保藏
号27,325)可以被修饰，以影响编码对所述宿主内源的蛋白的基因中的遗传学突变，所述
宿主的实例包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株
9E4，其具有完整基因型tonA ptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整
r
基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kan ；大肠杆菌W3110菌株37D6，
r
其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan ；大
肠杆菌W3110菌株40B4，其是具有非卡那霉素(kanamycin)抗性degP缺失突变的菌株
37D6；大肠杆菌W3110菌株33D3，其具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8
R
ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kan(美国专利 号5,639,635)和大肠杆菌菌株，其具有1990
年8月7日授权的美国专利号4,946,783中公开的突变周质蛋白酶。其他菌株及其衍生物，
诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)，大肠杆菌B，大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌
RV308(ATCC 31,608)也是适合的。这些实例是用于举例说明的而非限制的。用于构建以上
提及的具有定义的基因型的任何细菌的衍生物的方法是本领域中已知的且记述在，例如，
Bass等，Proteins(蛋白质)，8：309-314(1990)中。一般需要考虑细菌的细胞内复制子的
可复制性来选择合适的细菌。例如，当使用公知的质粒诸如pBR322，pBR325，pACYC177，或
pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可以合适地用作宿主。
典型地，宿主细胞应该分泌最少量的蛋白水解酶，并且另外的蛋白酶抑制剂可以理想地引
入至细胞培养物中。备选地，体外克隆方法，例如，PCR或其他核酸聚合酶反应，是合适的。
的大肠杆菌菌株是公众可获得地，诸如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆
菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5772(ATCC 53,635)。
其他合适的原核宿主细胞包括肠杆菌科诸如希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠杆
菌，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，
变形菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella
typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和
贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和
地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，1989年4月12日公开的DD 266,710中公开
的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，
根瘤菌属(Rhizobia)，透明颤菌属(Vitreoscilla)，副球菌属(Paracoccus)和链霉菌
属(Streptomyces)。这些实例是用于举例说明的而非用于限制的。菌株W3110是一
种特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是关于重组DNA产物发酵的普遍宿主菌株。优
选地，宿主细胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110(Bachmann，Cellular and
Molecular Biology(细胞和分子生物学)，卷2(Washington，D.C.：American Society
for Microbiology(华盛顿特区：美国微生物学界)，1987)，第1190-1219页；ATCC保藏
号27,325)可以被修饰，以影响编码对所述宿主内源的蛋白的基因中的遗传学突变，所述
宿主的实例包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株
9E4，其具有完整基因型tonA ptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整
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基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kan ；大肠杆菌W3110菌株37D6，
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其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan ；大
肠杆菌W3110菌株40B4，其是具有非卡那霉素(kanamycin)抗性degP缺失突变的菌株
37D6；大肠杆菌W3110菌株33D3，其具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8
R
ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kan(美国专利 号5,639,635)和大肠杆菌菌株，其具有1990
年8月7日授权的美国专利号4,946,783中公开的突变周质蛋白酶。其他菌株及其衍生物，
诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)，大肠杆菌B，大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌
RV308(ATCC 31,608)也是适合的。这些实例是用于举例说明的而非限制的。用于构建以上
提及的具有定义的基因型的任何细菌的衍生物的方法是本领域中已知的且记述在，例如，
Bass等，Proteins(蛋白质)，8：309-314(1990)中。一般需要考虑细菌的细胞内复制子的
可复制性来选择合适的细菌。例如，当使用公知的质粒诸如pBR322，pBR325，pACYC177，或
pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可以合适地用作宿主。
典型地，宿主细胞应该分泌最少量的蛋白水解酶，并且另外的蛋白酶抑制剂可以理想地引
入至细胞培养物中。备选地，体外克隆方法，例如，PCR或其他核酸聚合酶反应，是合适的。
[0940] 全长抗体、抗体片段、和抗体融合蛋白可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时，诸如治疗抗体与细胞毒性剂(例如，毒素)缀合和免疫缀合
物通过自身显示肿瘤细胞破坏效力时。全长抗体在循环中具有较长的半衰期。在大肠
杆菌中的产生较快并更具成本效率。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，
U.S.5,648,237(Carter等)，U.S.5,789,199(Joly等)，和U.S.5,840,523(Simmons等)，
其描述用于最优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列，这些专利通过参考引入本
文。表达后，抗体从可溶性级分中的大肠杆菌细胞浆中分离，并可以通过，例如，蛋白质A或G柱，根据同种型来纯化。最终纯化可以以与纯化，例如在CHO细胞中表达的抗体的过程类
似地进行。
物通过自身显示肿瘤细胞破坏效力时。全长抗体在循环中具有较长的半衰期。在大肠
杆菌中的产生较快并更具成本效率。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，
U.S.5,648,237(Carter等)，U.S.5,789,199(Joly等)，和U.S.5,840,523(Simmons等)，
其描述用于最优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列，这些专利通过参考引入本
文。表达后，抗体从可溶性级分中的大肠杆菌细胞浆中分离，并可以通过，例如，蛋白质A或G柱，根据同种型来纯化。最终纯化可以以与纯化，例如在CHO细胞中表达的抗体的过程类
似地进行。
[0941] b.真核宿主细胞
[0942] 除原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是对于抗-FcRH5抗体-编码载体合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是普通使用的低等真
核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，
Nature(自然)，290：140[1981]；1985年5月2日公开的EP 139,383)；克鲁维酵母属
(Kluyveromyces)宿主(美国专利号4,943,529；Fleer等，Bio/Technology(生物/技术)，
9：968-975(1991))诸如，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；
Louvencourt等，J.Bacteriol.(细菌学杂志)，154(2)：737-742[1983])，脆壁克鲁维酵母
(K.fragilis)(ATCC 12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)，威克
克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)，K. waltii(ATCC 56,500)，果蝇克鲁维酵母
(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg等，Bio/Technology(生物/技术)，8：
135(1990))，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)，和马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)；
西洋蓍霉(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070；
Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.(基础微生物学杂志)，28：265-278[1988])；念珠
菌属(Candida)；Trichoderma reesia(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)
(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，76：5259-5263[1979])；许
旺酵母属(Schwanniomyces)诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(1990年
10月31日公开的EP 394,538)；和丝状真菌诸如，例如，脉孢菌属(Neurospora)，青霉属
(Penicillium)，弯颈霉属(Tolypocladium)(1991年1月10日公开的WO 91/00357)，和
曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等，Biochem.Biophys.
Res.Commun.(生物化学和生物物理研究通信)，112：284-289[1983]；Tilburn等，Gene(基
因)，26：205-221[1983]；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，
81：1470-1474[1984])和黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，EMBO J.(EMBO杂志)，4：
475-479[1985])。甲基营养酵母在本文中是适合的并包括，但不仅限于，能够在甲醇上
生长的酵母，其选自由汉逊酵母属(Hansenula)，念珠菌属，克勒克酵母属(Kloeckera)，
毕赤酵母属(Pichia)，酵母属(Saccharomyces)，球拟酵母属(Torulopsis)，和红酵母
属(Rhodotorula)组成的属。示范该类酵母的具体物种列表可以存在于C.Anthony，The
Biochemistry of Methylotrophs(甲基营养的生物化学)，269(1982)中。
核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，
Nature(自然)，290：140[1981]；1985年5月2日公开的EP 139,383)；克鲁维酵母属
(Kluyveromyces)宿主(美国专利号4,943,529；Fleer等，Bio/Technology(生物/技术)，
9：968-975(1991))诸如，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；
Louvencourt等，J.Bacteriol.(细菌学杂志)，154(2)：737-742[1983])，脆壁克鲁维酵母
(K.fragilis)(ATCC 12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)，威克
克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)，K. waltii(ATCC 56,500)，果蝇克鲁维酵母
(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg等，Bio/Technology(生物/技术)，8：
135(1990))，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)，和马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)；
西洋蓍霉(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070；
Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.(基础微生物学杂志)，28：265-278[1988])；念珠
菌属(Candida)；Trichoderma reesia(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)
(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，76：5259-5263[1979])；许
旺酵母属(Schwanniomyces)诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(1990年
10月31日公开的EP 394,538)；和丝状真菌诸如，例如，脉孢菌属(Neurospora)，青霉属
(Penicillium)，弯颈霉属(Tolypocladium)(1991年1月10日公开的WO 91/00357)，和
曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等，Biochem.Biophys.
Res.Commun.(生物化学和生物物理研究通信)，112：284-289[1983]；Tilburn等，Gene(基
因)，26：205-221[1983]；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，
81：1470-1474[1984])和黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，EMBO J.(EMBO杂志)，4：
475-479[1985])。甲基营养酵母在本文中是适合的并包括，但不仅限于，能够在甲醇上
生长的酵母，其选自由汉逊酵母属(Hansenula)，念珠菌属，克勒克酵母属(Kloeckera)，
毕赤酵母属(Pichia)，酵母属(Saccharomyces)，球拟酵母属(Torulopsis)，和红酵母
属(Rhodotorula)组成的属。示范该类酵母的具体物种列表可以存在于C.Anthony，The
Biochemistry of Methylotrophs(甲基营养的生物化学)，269(1982)中。
[0943] 关于表达糖基化抗-FcRH5抗体合适的宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞诸如果蝇S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9，以及植物细胞，诸如棉花、
玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、和烟草 的细胞培养物。已经鉴别了许多杆状病毒毒株和变体以及相应允许的来自宿主诸如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊
蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophila
melanogaster)(果蝇)，和家蚕(Bombyx mori)的昆虫宿主细胞。许多用于转染的病毒毒
株是公众可获得的，例如，苜蓿丫纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕
NPV的Bm-5毒株，且这样的病毒可以根据本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地
贪夜蛾细胞。
玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、和烟草 的细胞培养物。已经鉴别了许多杆状病毒毒株和变体以及相应允许的来自宿主诸如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊
蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophila
melanogaster)(果蝇)，和家蚕(Bombyx mori)的昆虫宿主细胞。许多用于转染的病毒毒
株是公众可获得的，例如，苜蓿丫纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕
NPV的Bm-5毒株，且这样的病毒可以根据本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地
贪夜蛾细胞。
[0944] 然而，最大的兴趣存在于脊椎动物细胞中，并且在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已经成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是通过SV40转化
的猴肾CV1细胞(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293细胞或亚克隆以用于在悬浮培
养物中生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.(遗传病毒学杂志)36：59(1977))；幼
仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.
Reprod.(生物繁殖)23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细
胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC
CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人
肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等，
Annals N.Y.Acad.Sci.(纽约科学院年报)383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人
肝细胞瘤系(Hep G2)。
的猴肾CV1细胞(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293细胞或亚克隆以用于在悬浮培
养物中生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.(遗传病毒学杂志)36：59(1977))；幼
仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.
Reprod.(生物繁殖)23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细
胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC
CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人
肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等，
Annals N.Y.Acad.Sci.(纽约科学院年报)383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人
肝细胞瘤系(Hep G2)。
[0945] 宿主细胞用上述用于抗-FcRH5抗体生成的表达或克隆载体来转化并在常规营养培养基中培养，所述培养基在适当时改良，从而诱导启动子，选择转化体，或扩增编码所需
序列的基因。
序列的基因。
[0946] 3.选择和使用可复制的载体
[0947] 为了重组产生本发明的抗体，将编码它的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)分离并插入可复制的载体，以用于进一步克隆(扩增DNA)或表达。编码抗体的DNA容易利用常规
程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来分
离和测序。可获得 许多载体。载体的选择部分地取决于待使用的宿主细胞。一般地，优选
的宿主细胞具有原核或真核(一般地哺乳动物)起源。
程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来分
离和测序。可获得 许多载体。载体的选择部分地取决于待使用的宿主细胞。一般地，优选
的宿主细胞具有原核或真核(一般地哺乳动物)起源。
[0948] 载体可以，例如，处于质粒、粘粒、病毒粒子、或噬菌体的形式。合适的核酸序列可以通过许多程序插入至载体中。一般地，利用本领域中已知的技术将DNA插入至合适的限制性内切酶位点中。载体成分一般包括，但不仅限于，信号序列、复制原点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列中的一种或多种。包含一种或多种这些成分的
合适载体的构建使用本领域中技术人员已知的标准连接技术。
合适载体的构建使用本领域中技术人员已知的标准连接技术。
[0949] FcRH5不仅可以直接，而且可以作为与异源多肽的融合多肽来重组产生，所述异源多肽可以是信号序列或在成熟蛋白或多肽的N端具有特异性裂解位点的其他多肽。一
般地，所述信号系列可以是载体的成分，或其可以是插入至载体中的抗-FcRH5抗体-编码
DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，其选自，例如，碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定肠毒素II前导区的组。关于酵母分泌，信号序列可以是，例如，酵母转化酶前导
区、α因子前导区(包括酵母属和克鲁维酵母属α因子前导区，后者记述在美国专利号
5,010,182中)、或酸性磷酸酶前导区，白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导区(1990
年4月4日公开的EP 362,179)、或1990年11月15日公开的WO 90/13646中所述的信号。
在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列可以用于直接分泌蛋白，诸如来自相同或相关
物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导区。
般地，所述信号系列可以是载体的成分，或其可以是插入至载体中的抗-FcRH5抗体-编码
DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，其选自，例如，碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定肠毒素II前导区的组。关于酵母分泌，信号序列可以是，例如，酵母转化酶前导
区、α因子前导区(包括酵母属和克鲁维酵母属α因子前导区，后者记述在美国专利号
5,010,182中)、或酸性磷酸酶前导区，白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导区(1990
年4月4日公开的EP 362,179)、或1990年11月15日公开的WO 90/13646中所述的信号。
在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列可以用于直接分泌蛋白，诸如来自相同或相关
物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导区。
[0950] a.原核宿主细胞
[0951] 编码本发明抗体的多肽成分的多核苷酸序列可以利用标准重组技术获得。所需的多核苷酸序列可以由产生抗体的细胞诸如杂交瘤细胞分离和测序。备选地，多核苷酸可以
利用核苷酸合成器或PCR技术来合成。一旦获得，将编码多肽的序列插入至能够在原核宿
主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域中可获得和已知的许多载体可以用于
本发明的目的。选择合适的载体应该主要取决于待插入载体的核酸的大小和待使用载体转
化的具体宿主细胞。各载体包含不同的成分，这取决于其功能(扩增或表达异源多核苷酸，
或二者)和其与其所定居的具体宿主细胞的相容 性。
利用核苷酸合成器或PCR技术来合成。一旦获得，将编码多肽的序列插入至能够在原核宿
主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域中可获得和已知的许多载体可以用于
本发明的目的。选择合适的载体应该主要取决于待插入载体的核酸的大小和待使用载体转
化的具体宿主细胞。各载体包含不同的成分，这取决于其功能(扩增或表达异源多核苷酸，
或二者)和其与其所定居的具体宿主细胞的相容 性。
[0952] 一般地，含有源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主细胞结合使用。表达和克隆载体二者均含有容许载体在一种或多种所选择宿主细胞中
复制的载体的核酸序列，以及能够在转化的细胞中提供表型选择的标记序列。这样的序列
对于许多细菌、酵母、和病毒是公知的。来自质粒pBR322的复制原点，其含有编码氨苄青霉
素(ampicillin)(Amp)和四环素(tetracycline)(Tet)抗性的基因并由此提供鉴别转化的
细胞的简单方法，适合于大部分革兰士-阴性细菌，2μ质粒起源适合于酵母，且不同病毒
起源(SV40，多瘤，腺病毒，VSV或BPV)有效用于在哺乳动物细胞中克隆载体。pBR322、其
衍生物、或其他微生物质粒或噬菌体也可以包含，或被改良为包含，能够被微生物生物体用
于表达内源蛋白的启动子。用于表达特殊抗体的pBR322衍生物的实例详细记述在Carter
等，美国专利号5,648,237中。
复制的载体的核酸序列，以及能够在转化的细胞中提供表型选择的标记序列。这样的序列
对于许多细菌、酵母、和病毒是公知的。来自质粒pBR322的复制原点，其含有编码氨苄青霉
素(ampicillin)(Amp)和四环素(tetracycline)(Tet)抗性的基因并由此提供鉴别转化的
细胞的简单方法，适合于大部分革兰士-阴性细菌，2μ质粒起源适合于酵母，且不同病毒
起源(SV40，多瘤，腺病毒，VSV或BPV)有效用于在哺乳动物细胞中克隆载体。pBR322、其
衍生物、或其他微生物质粒或噬菌体也可以包含，或被改良为包含，能够被微生物生物体用
于表达内源蛋白的启动子。用于表达特殊抗体的pBR322衍生物的实例详细记述在Carter
等，美国专利号5,648,237中。
[0953] 另外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以作为转化载体与这些宿主结合使用。例如，噬菌体诸如λGEM.TM.-11可以用于制备可以用于转化易感
宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。
宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。
[0954] 本发明的表达载体可以包含两个或更多启动子-顺反子对，其编码各多肽成分。启动子是位于调节其表达的顺反子上游(5′)的非翻译调节序列。原核启动子典型地归于
两类，即诱导型和组成型。诱导型启动子是响应培养条件变化，例如，存在或不存在营养物
或温度变化，在其控制下起始增加水平的顺反子转录的启动子。
两类，即诱导型和组成型。诱导型启动子是响应培养条件变化，例如，存在或不存在营养物
或温度变化，在其控制下起始增加水平的顺反子转录的启动子。
[0955] 公知大量由许多潜在宿主细胞识别的启动子。所选启动子可以通过以下步骤可操作地连接编码轻链或重链的顺反子DNA：通过限制酶消化由来源DNA中去除启动子并将分
离的启动子序列插入本发明的载体。天然启动子序列和许多异源启动子二者均可以用于直
接扩增和/或表达靶基因。在一些实施方案中，使用异源启动子，因为它们与天然靶多肽启
动子相比，一般允许被表达靶基因的更好的转录和更高产率。
离的启动子序列插入本发明的载体。天然启动子序列和许多异源启动子二者均可以用于直
接扩增和/或表达靶基因。在一些实施方案中，使用异源启动子，因为它们与天然靶多肽启
动子相比，一般允许被表达靶基因的更好的转录和更高产率。
[0956] 公知由许多潜在宿主细胞识别的启动子。适合与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子，β-galactamase和乳糖启动子系统[Chang等， Nature(自然)，275：
615(1978)；Goeddel等，Nature(自然)，281：544(1979)]， 碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启
动子系统[Goeddel，Nucleic Acids Res.(核酸研究)，8：4057(1980)；EP 36,776]和
杂交启动子诸如tac[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，80：
21-25(1983)]或trc启动子。用于细菌系统中的启动子还应该包含与编码抗-FcRH5抗体
的DNA可操作相连的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。然而，在细菌中起作用的其他启动子
(诸如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也适合。已经公开了它们的核酸序列，由此容许
本领域中技术人员利用接头或衔接子将它们可操作地连接于编码靶轻链和重链的顺反子
(Siebenlist等(1980)Cell(细胞)20：269)，从而提供任何需要的限制性位点。
615(1978)；Goeddel等，Nature(自然)，281：544(1979)]， 碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启
动子系统[Goeddel，Nucleic Acids Res.(核酸研究)，8：4057(1980)；EP 36,776]和
杂交启动子诸如tac[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，80：
21-25(1983)]或trc启动子。用于细菌系统中的启动子还应该包含与编码抗-FcRH5抗体
的DNA可操作相连的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。然而，在细菌中起作用的其他启动子
(诸如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也适合。已经公开了它们的核酸序列，由此容许
本领域中技术人员利用接头或衔接子将它们可操作地连接于编码靶轻链和重链的顺反子
(Siebenlist等(1980)Cell(细胞)20：269)，从而提供任何需要的限制性位点。
[0957] 在本发明的一方面中，重组载体内的各顺反子包含指导被表达多肽跨膜易位的分泌信号序列成分。一般地，所述信号序列可以是载体的成分，或其可以是插入至载体中的靶
多肽DNA的一部分。为本发明的目的选择的信号序列应该是由宿主细胞识别和处理(即由
信号肽酶裂解)的信号序列。关于不识别和处理异源多肽固有的信号序列的原核宿主细
胞，信号序列由选自，例如，由碱性磷酸酶，青霉素酶，Ipp，或热稳定肠毒素II(STII)前导区，Lamb，PhoE，PelB，OmpA和MBP组成的组的原核信号序列置换。在本发明的一个实施方
案中，表达系统的两个顺反子中使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
多肽DNA的一部分。为本发明的目的选择的信号序列应该是由宿主细胞识别和处理(即由
信号肽酶裂解)的信号序列。关于不识别和处理异源多肽固有的信号序列的原核宿主细
胞，信号序列由选自，例如，由碱性磷酸酶，青霉素酶，Ipp，或热稳定肠毒素II(STII)前导区，Lamb，PhoE，PelB，OmpA和MBP组成的组的原核信号序列置换。在本发明的一个实施方
案中，表达系统的两个顺反子中使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
[0958] 在另一方面，生成根据本发明的免疫球蛋白可以发生在宿主细胞的细胞质中，并因此不需要各顺反子中存在分泌信号序列。关于这一点，表达、折叠并装配免疫球蛋白轻
-
链和重链，以在细胞质内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主品系(例如，大肠杆菌trxB 菌
株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，由此允许被表达蛋白亚单元的合适折叠和装
配。Proba和Pluckthun Gene(基因)，159：203(1995)。
-
链和重链，以在细胞质内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主品系(例如，大肠杆菌trxB 菌
株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，由此允许被表达蛋白亚单元的合适折叠和装
配。Proba和Pluckthun Gene(基因)，159：203(1995)。
[0959] 本发明提供表达系统，其中被表达多肽成分的定量比率可以调节，从而最大化本发明的分泌的和适当装配的抗体的产率。这样的调节至少部分地通过同时调节多肽成分的
翻译强度来实现。
翻译强度来实现。
[0960] 一种用于调节翻译强度的技术公开在Simmons等，美国专利号5,840,523中。它利用顺反子内的翻译起始区(TIR)的变体。关于给定的TIR，可以形成一系列氨基酸或核酸序
列变体，其具有一定范围的翻译强度，由 此提供方便的手段，通过该方便的手段来调节该
因素以获得所需的特定链的表达水平。TIR变体可以通过常规诱变技术产生，所述常规诱变
技术导致可以改变氨基酸序列的密码子变化，尽管核苷酸序列中的沉默变化是优选的。TIR
的变化可以包括，例如，Shine-Dalgarno序列数量或间隔的变化，以及信号序列的变化。一
种用于产生突变信号序列的方法是在不改变信号序列氨基酸序列(即，变化是沉默的)的
编码序列开始处产生“密码子库”。这可以通过改变各密码子的第三个核苷酸位置来实现；
另外，一些氨基酸，诸如亮氨酸、丝氨酸、和精氨酸，具有多个第一和第二位置，其可以增加制备所述库的复杂性。该诱变方法详细记述在Yansura等(1992)METHODS：A Companion to
Methods in Enzymol.(方法：与酶学方法的比较)4：151-158中。
列变体，其具有一定范围的翻译强度，由 此提供方便的手段，通过该方便的手段来调节该
因素以获得所需的特定链的表达水平。TIR变体可以通过常规诱变技术产生，所述常规诱变
技术导致可以改变氨基酸序列的密码子变化，尽管核苷酸序列中的沉默变化是优选的。TIR
的变化可以包括，例如，Shine-Dalgarno序列数量或间隔的变化，以及信号序列的变化。一
种用于产生突变信号序列的方法是在不改变信号序列氨基酸序列(即，变化是沉默的)的
编码序列开始处产生“密码子库”。这可以通过改变各密码子的第三个核苷酸位置来实现；
另外，一些氨基酸，诸如亮氨酸、丝氨酸、和精氨酸，具有多个第一和第二位置，其可以增加制备所述库的复杂性。该诱变方法详细记述在Yansura等(1992)METHODS：A Companion to
Methods in Enzymol.(方法：与酶学方法的比较)4：151-158中。
[0961] 优选地，产生一组载体，其对其中的各顺反子具有一定范围的TIR强度。该有限组提供各链表达水平以及所需抗体产物产率在不同TIR强度组合条件下的比较。TIR强度可
以通过量化如Simmons等美国专利号5，840,523中详细描述的报告基因的表达水平来确
定。基于翻译强度的比较，选择所需的各TIRs，以在本发明的表达载体构建体中组合。
以通过量化如Simmons等美国专利号5，840,523中详细描述的报告基因的表达水平来确
定。基于翻译强度的比较，选择所需的各TIRs，以在本发明的表达载体构建体中组合。
[0962] b.真核宿主细胞
[0963] 载体成分一般包括，但不仅限于，以下各项中的一种或多种：信号序列、复制原点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
[0964] (1)信号序列成分
[0965] 用于真核宿主细胞中的载体也可以包含信号系列或在成熟目标蛋白或多肽的N端具有特异性裂解位点的其他多肽。所选的异源信号序列优选是由宿主细胞识别和处理
(即，由信号肽酶裂解)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以
及病毒分泌前导区，例如，单纯疱疹gD信号。
(即，由信号肽酶裂解)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以
及病毒分泌前导区，例如，单纯疱疹gD信号。
[0966] 关于所述前体区域的DNA在阅读框中连接到编码所述抗体的DNA。
[0967] (2)复制原点
[0968] 一般地，复制原点成分对于哺乳动物表达载体是不需要的。例如，SV40 原点可以典型地使用，仅因为它包含早期启动子。
[0969] (3)选择基因成分
[0970] 表达和克隆载体应该典型地包含选择基因，其也称为可选择的标记物。典型的选择基因编码蛋白，其(a)赋予针对抗生素或其他毒素，例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨喋呤(methotrexate)、或四环素的抗性，(b)弥补营养缺陷型不足，或(c)提供不能获自复杂培
养基的关键营养物，例如，编码芽孢杆菌属D-丙氨酸消旋酶的基因。
养基的关键营养物，例如，编码芽孢杆菌属D-丙氨酸消旋酶的基因。
[0971] 选择方案的一个实例利用药物停止宿主细胞的生长。使用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白并由在该选择方案中存活。这样的优势选择的实例使用药
物新霉素，麦考酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。
物新霉素，麦考酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。
[0972] 关于哺乳动物细胞合适的可选择标记物的实例是容许鉴别能够吸收抗-FcRH5抗体-编码核酸的细胞的那些，诸如DHFR或胸苷激酶，金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类动物
金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶，等。当使用野生型DHFR时，合适的宿主细胞
是缺乏DHFR活性的CHO细胞系(例如，ATCC CRL-9096)，其如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA(美国国家科学院学报)，77：4216(1980)所述制备和繁殖。例如，用DHFR选择基
因转化的细胞首先通过在含有甲氨喋呤(Mtx)，即一种DHFR的竞争拮抗剂的培养基中培养
全部转化体来鉴别。备选地，使用编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种可选择标记物诸如
氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别地，含有内源
DHFR的野生型宿主)可以通过在含有关于所述可选择标记物诸如氨基糖苷抗生素，例如，
卡那霉素，新霉素，或G418的选择试剂的培养基中进行细胞生长来选择。参见美国专利号
4,965,199。
金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶，等。当使用野生型DHFR时，合适的宿主细胞
是缺乏DHFR活性的CHO细胞系(例如，ATCC CRL-9096)，其如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA(美国国家科学院学报)，77：4216(1980)所述制备和繁殖。例如，用DHFR选择基
因转化的细胞首先通过在含有甲氨喋呤(Mtx)，即一种DHFR的竞争拮抗剂的培养基中培养
全部转化体来鉴别。备选地，使用编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种可选择标记物诸如
氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别地，含有内源
DHFR的野生型宿主)可以通过在含有关于所述可选择标记物诸如氨基糖苷抗生素，例如，
卡那霉素，新霉素，或G418的选择试剂的培养基中进行细胞生长来选择。参见美国专利号
4,965,199。
[0973] 用于酵母中的合适选择基因是酵母质粒YRp7中存在的trp1基因[Stinchcomb等，Nature(自然)，282：39(1979)；Kingsman等，Gene(基因)，7：141(1979)；Tschemper
等，Gene(基因)，10：157(1980)]。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变
菌株，例如，ATCC No.44076或PEP4-1提供选择标记物[Jones，Genetics(遗传学)，85：
12(1977)]。
等，Gene(基因)，10：157(1980)]。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变
菌株，例如，ATCC No.44076或PEP4-1提供选择标记物[Jones，Genetics(遗传学)，85：
12(1977)]。
[0974] (4)启动子成分
[0975] 表达和克隆载体通常含有与抗-FcRH5抗体-编码核酸序列可操作相连的启动子，以指导mRNA合成。公知由多种潜在宿主细胞识别的启动子。
[0976] 几乎全部真核基因具有富含AT的区域，其位于转录起始位点上游约25-30个碱基处。许多基因转录起点上游70-80个碱基处存在的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以是
任何核苷酸。在大部分真核基因的3’末端处是AATAAA序列，其可以是关于向编码序列的
3’末端添加多聚A尾部的信号。所有这些序列合适地插入至真核表达载体中。
任何核苷酸。在大部分真核基因的3’末端处是AATAAA序列，其可以是关于向编码序列的
3’末端添加多聚A尾部的信号。所有这些序列合适地插入至真核表达载体中。
[0977] 与酵母宿主一起使用的合适启动序列的实例包括关于3-磷酸甘油酸酯激酶[Hitzeman等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，255：2073(1980)]或其他糖酵解酶[Hess
等，J.Adv.Enzyme Reg.(酶调节进展杂志)，7：149(1968)；Holland，Biochemistry(生物化学)，17：4900(1978)]，诸如烯醇酶，甘油醛3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，果糖磷酸激酶，葡糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸酯变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡糖异构酶，和葡糖激酶的启动子。
等，J.Adv.Enzyme Reg.(酶调节进展杂志)，7：149(1968)；Holland，Biochemistry(生物化学)，17：4900(1978)]，诸如烯醇酶，甘油醛3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，果糖磷酸激酶，葡糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸酯变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡糖异构酶，和葡糖激酶的启动子。
[0978] 其他酵母启动子，其是具有由生长条件控制的转录的另外优势的诱导型启动子，是关于醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，与氮代谢有关的降解酶，金属硫蛋白，甘油
醛3-磷酸脱氢酶，和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母表达中的合适
载体和启动子进一步记述在EP 73,657中。
醛3-磷酸脱氢酶，和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母表达中的合适
载体和启动子进一步记述在EP 73,657中。
[0979] 由哺乳动物细胞中载体的抗-FcRH5抗体转录受控于，例如，获自病毒诸如多瘤病毒，鸟痘病毒(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)，腺病毒(诸如腺病毒2)，牛乳头瘤
病毒，鸟肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录酶病毒，乙肝病毒和猿病毒40(SV40)的基因组的启
动子，获自异源哺乳动物启动子，例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子的启动子，和
获自热激启动子的启动子，条件是这样的启动子与宿主细胞系统相容。
病毒，鸟肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录酶病毒，乙肝病毒和猿病毒40(SV40)的基因组的启
动子，获自异源哺乳动物启动子，例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子的启动子，和
获自热激启动子的启动子，条件是这样的启动子与宿主细胞系统相容。
[0980] SV40病毒的早期和晚期启动子作为SV40限制性片段方便地获得，所述片段还包含SV40病毒的复制原点。人巨细胞病毒的直接早期启动子作为HindIII E限制性片段方
便地获得。利用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开在美国专利
号4,419,446中。该系统的改进记述在美国专利号4,601,978中。关于在来自单纯疱疹病
毒的胸苷激酶 启动子的控制下，在小鼠细胞中表达人β-干扰素cDNA，也参见Reyes等，
Nature(自然)297：598-601(1982)。备选地，劳斯肉瘤病毒长末端重复可以用作启动子。
便地获得。利用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开在美国专利
号4,419,446中。该系统的改进记述在美国专利号4,601,978中。关于在来自单纯疱疹病
毒的胸苷激酶 启动子的控制下，在小鼠细胞中表达人β-干扰素cDNA，也参见Reyes等，
Nature(自然)297：598-601(1982)。备选地，劳斯肉瘤病毒长末端重复可以用作启动子。
[0981] (5)增强子元件成分
[0982] 编码抗-FcRH5抗体的DNA通过较高等真核生物的转录可以通过将增强子序列插入至载体中来增加。增强子是DNA的顺式-作用元件，通常约10-300bp，其起启动子的作
用，以增加其转录。许多增强子序列现已知来自哺乳动物基因(球蛋白，弹性蛋白酶，清蛋
白，α-胎蛋白，和胰岛素)。然而，典型地，人们应该使用来自真核细胞病毒的增强子。实
例包括在复制原点晚期侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复
制原点晚期侧的多瘤增强子、和腺病毒增强子。关于用于活化真核启动子的增强子元件，还
参见Yaniv，Nature(自然)297：17-18(1982)。增强子可以在抗-FcRH5抗体编码序列的位
置5’或3’处剪接为载体，但是优选位于由启动子的位点5’处。
用，以增加其转录。许多增强子序列现已知来自哺乳动物基因(球蛋白，弹性蛋白酶，清蛋
白，α-胎蛋白，和胰岛素)。然而，典型地，人们应该使用来自真核细胞病毒的增强子。实
例包括在复制原点晚期侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复
制原点晚期侧的多瘤增强子、和腺病毒增强子。关于用于活化真核启动子的增强子元件，还
参见Yaniv，Nature(自然)297：17-18(1982)。增强子可以在抗-FcRH5抗体编码序列的位
置5’或3’处剪接为载体，但是优选位于由启动子的位点5’处。
[0983] (6)转录终止成分
[0984] 真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体应该还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这样的序列普遍获自真核或病毒DNAs或cDNAs的5’和，偶尔3’，非翻译区。这些区域包含在编码
抗-FcRH5抗体的mRNA的非翻译部分中作为聚腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。一种有效
的转录终止成分是牛生长素聚腺苷酸化位点。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
抗-FcRH5抗体的mRNA的非翻译部分中作为聚腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。一种有效
的转录终止成分是牛生长素聚腺苷酸化位点。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
[0985] 适合于适应在重组脊椎动物细胞培养物中合成抗-FcRH5抗体的其他方法、载体、和宿主细胞记述在Gething等，Nature(自然)，293：620-625(1981)；Mantei等，Nature(自
然)，281：40-46(1979)；EP 117，060；和EP117,058中。
然)，281：40-46(1979)；EP 117，060；和EP117,058中。
[0986] 4.培养宿主细胞
[0987] 用于产生本发明的抗-FcRH5抗体的宿主细胞可以在多种培养基中培养。
[0988] a.原核宿主细胞
[0989] 用于产生本发明的多肽的原核细胞在本领域中已知的培养基中生长并适合于培养所选择的宿主细胞。合适的培养基的实例包括luria broth(LB)加必需的营养增补剂。
在一些实施方案中，所述培养基还含有选择试剂，其基于表达载体的结构来选择，从而选择
性地允许含有该表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素加入至培养基中，从而使表
达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。
在一些实施方案中，所述培养基还含有选择试剂，其基于表达载体的结构来选择，从而选择
性地允许含有该表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素加入至培养基中，从而使表
达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。
[0990] 除碳、氮、和无机磷酸盐来源以外的任何必需增补剂也可以以合适的浓度单独引入或作为与另一种增补剂或培养基诸如复杂氮源的混合物引入。任选地，培养基可以含有
一种或多种还原剂，其选自由谷胱甘肽，半胱氨酸，胱胺，巯基乙酸，二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇组成的组。
一种或多种还原剂，其选自由谷胱甘肽，半胱氨酸，胱胺，巯基乙酸，二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇组成的组。
[0991] 原核宿主细胞在合适的温度下培养。关于大肠杆菌生长，例如，优选的温度范围为约20℃-约39℃，更优选约25℃-约37℃，甚至更优选约30℃。培养基的pH可以是约
5-约9范围内的任何pH，其主要取决于宿主生物体。关于肠杆菌，pH优选是约6.8-约7.4，
和更优选约7.0。
5-约9范围内的任何pH，其主要取决于宿主生物体。关于肠杆菌，pH优选是约6.8-约7.4，
和更优选约7.0。
[0992] 如果在本发明的表达载体中使用诱导型启动子，则蛋白表达在适合于激活启动子的条件下诱导。在本发明的一方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，转化的宿
主细胞在用于诱导的磷酸盐-限制性培养基中培养。优选地，磷酸盐-限制性培养基是
C.R.A.P培养基(参见，例如，Simmons等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)(2002)，
263：133-147)。根据使用的载体构建体，可以使用多种其他诱导物，如本领域中已知的。
主细胞在用于诱导的磷酸盐-限制性培养基中培养。优选地，磷酸盐-限制性培养基是
C.R.A.P培养基(参见，例如，Simmons等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)(2002)，
263：133-147)。根据使用的载体构建体，可以使用多种其他诱导物，如本领域中已知的。
[0993] 在一个实施方案中，本发明的被表达多肽分泌到并回收自宿主细胞的周质。蛋白回收典型地包括破坏微生物，其一般通过这样的手段如渗压休克，超声波降解或溶胞。一旦
破坏细胞，细胞碎片或完整细胞可以通过离心或过滤来去除。蛋白可以进一步，例如，通过
亲合树脂层析来纯化。备选地，蛋白可以运输到培养基中并在其中分离。细胞可以由培养
物中去除并且过滤和产生浓缩的培养物上清，以进一步纯化蛋白。被表达的多肽可以进一
步利用普遍已知的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹测定来分离和鉴
定。
破坏细胞，细胞碎片或完整细胞可以通过离心或过滤来去除。蛋白可以进一步，例如，通过
亲合树脂层析来纯化。备选地，蛋白可以运输到培养基中并在其中分离。细胞可以由培养
物中去除并且过滤和产生浓缩的培养物上清，以进一步纯化蛋白。被表达的多肽可以进一
步利用普遍已知的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹测定来分离和鉴
定。
[0994] 在本发明的一方面，抗体产生通过发酵过程大量进行。可获得不同的大规模分批供应发酵程序，以生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约
1,000-100,000升的容量。这些发酵器使用搅拌器叶轮来分配氧和营养物，特别是葡萄糖
(优选碳/能量来源)。小规模发酵一般指在不超过约100升体积容量的发酵器中的发酵，
且可以在约1升-约100升的范围内。
1,000-100,000升的容量。这些发酵器使用搅拌器叶轮来分配氧和营养物，特别是葡萄糖
(优选碳/能量来源)。小规模发酵一般指在不超过约100升体积容量的发酵器中的发酵，
且可以在约1升-约100升的范围内。
[0995] 在发酵过程中，诱导蛋白表达典型地在细胞已经在合适的条件下生长到所需密度，例如，OD550为约180-220后开始，在该阶段细胞处于早期静止期。根据使用的载体构建
体，可以使用不同的诱导物，如本领域中已知的和上述的。细胞可以在诱导前生长较短的时
期。细胞通常诱导约12-50小时，尽管可以使用更长或更短的诱导时间。
体，可以使用不同的诱导物，如本领域中已知的和上述的。细胞可以在诱导前生长较短的时
期。细胞通常诱导约12-50小时，尽管可以使用更长或更短的诱导时间。
[0996] 为了提高本发明的多肽的产率和质量，可以改进不同的发酵条件。例如，为了改进分泌的抗体多肽的适当装配和折叠，可以使用过表达伴侣蛋白，诸如Dsb蛋白(DsbA，DsbB，
DsbC，DsbD和或DsbG)或FkpA(具有陪伴活性的肽基脯氨酸顺反异构酶)的另外的载体来
共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白的适当折
叠和溶解性。Chen等(1999)J Bio Chem(生物化学杂志)274：19601-19605；Georgiou等，美
国专利号6,083,715；Georgiou等，美国专利号6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)
J.Biol.Chem.(生物化学杂志)275：17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.
(生物化学杂志)275：17106-17113；Arie等(2001)Mol.Microbiol.(分子微生物学)39：
199-210。
DsbC，DsbD和或DsbG)或FkpA(具有陪伴活性的肽基脯氨酸顺反异构酶)的另外的载体来
共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白的适当折
叠和溶解性。Chen等(1999)J Bio Chem(生物化学杂志)274：19601-19605；Georgiou等，美
国专利号6,083,715；Georgiou等，美国专利号6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)
J.Biol.Chem.(生物化学杂志)275：17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.
(生物化学杂志)275：17106-17113；Arie等(2001)Mol.Microbiol.(分子微生物学)39：
199-210。
[0997] 为了最小化被表达异源蛋白(特别是蛋白水解敏感的那些)的蛋白水解作用，可以对本发明使用缺乏蛋白水解酶的某些宿主品系。例如，宿主细胞品系可以改进为在编码
已知细菌蛋白酶诸如蛋白酶III，OmpT，DegP，Tsp，蛋白酶I，蛋白酶Mi，蛋白酶V，蛋白酶VI及其组合的基因中影响遗传突变。一些大肠杆菌蛋白酶-缺陷型菌株可以获得并记述在，
例如，Joly等(1998)，见上；Georgiou等，美国专利号5,264,365；Georgiou等，美国专利号
5,508,192；Hara等，Microbial Drug Resistance (微生物药物抗性)，2：63-72(1996)中。
已知细菌蛋白酶诸如蛋白酶III，OmpT，DegP，Tsp，蛋白酶I，蛋白酶Mi，蛋白酶V，蛋白酶VI及其组合的基因中影响遗传突变。一些大肠杆菌蛋白酶-缺陷型菌株可以获得并记述在，
例如，Joly等(1998)，见上；Georgiou等，美国专利号5,264,365；Georgiou等，美国专利号
5,508,192；Hara等，Microbial Drug Resistance (微生物药物抗性)，2：63-72(1996)中。
[0998] 在一个实施方案中，缺乏蛋白水解酶和用过表达一种或多种伴侣蛋白 的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞用于本发明的表达系统中。
[0999] b.真核宿主细胞
[1000] 可商购的培养基诸如Ham’s F10(Sigma(西格玛))，极限必需培养基((MEM)，(Sigma(西格玛))，RPMI-1640(Sigma(西格 玛))，和Dulbecco改良Eagle培养 基
((DMEM)，Sigma(西格玛))适合于培养所述宿主细胞。另外，Ham等，Meth.Enz.(酶学
方法)58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem(分析生物化学)102：255(1980)，美国
专利 号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或 5,122,469；WO 90/03430；WO
87/00195；或美国专利参考30,985中所述的任何培养基可以作为培养基用于所述宿主细
胞。这些培养基中的任一种可以在必要时增补激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素，转
铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(诸如氯化钠，钙，镁，和磷酸盐)，缓冲剂(诸如HEPES)，核苷TM
酸(诸如腺苷和胸苷)，抗生素(诸如GENTAMYCIN 药物)，痕量元素(定义为通常以微摩
尔范围的终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等价能量来源。任何其他必需的增补剂
也可以以合适的浓度存在，所述合适的浓度是本领域中技术人员已知的。培养条件，诸如温
度、pH等，是以前与为了表达所选择的宿主细胞使用的那些，并且对于本领域中技术人员应
该是显然的。
((DMEM)，Sigma(西格玛))适合于培养所述宿主细胞。另外，Ham等，Meth.Enz.(酶学
方法)58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem(分析生物化学)102：255(1980)，美国
专利 号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或 5,122,469；WO 90/03430；WO
87/00195；或美国专利参考30,985中所述的任何培养基可以作为培养基用于所述宿主细
胞。这些培养基中的任一种可以在必要时增补激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素，转
铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(诸如氯化钠，钙，镁，和磷酸盐)，缓冲剂(诸如HEPES)，核苷TM
酸(诸如腺苷和胸苷)，抗生素(诸如GENTAMYCIN 药物)，痕量元素(定义为通常以微摩
尔范围的终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等价能量来源。任何其他必需的增补剂
也可以以合适的浓度存在，所述合适的浓度是本领域中技术人员已知的。培养条件，诸如温
度、pH等，是以前与为了表达所选择的宿主细胞使用的那些，并且对于本领域中技术人员应
该是显然的。
[1001] 5.检测基因扩增/表达
[1002] 基因扩增和/或表达可以在样品中直接，例如，通过常规Southern印迹、用于量化mRNA的转录的Northern印迹[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，
77：5201-5205(1980)]，点印迹(DNA分析)，或原位杂交，利用合适标记的探针，基于本文中提供的序列来测量。备选地，可以使用能够识别特异性双链体，包括DNA双链体，RNA双链
体，和DNA-RNA杂交双链体或DNA-蛋白双链体的抗体。所述抗体随之可以标记并且可以进
行测定，其中双链体结合于表面，以使得在表面上形成双链体时，可以检测与双链体结合的
抗体的存在。
77：5201-5205(1980)]，点印迹(DNA分析)，或原位杂交，利用合适标记的探针，基于本文中提供的序列来测量。备选地，可以使用能够识别特异性双链体，包括DNA双链体，RNA双链
体，和DNA-RNA杂交双链体或DNA-蛋白双链体的抗体。所述抗体随之可以标记并且可以进
行测定，其中双链体结合于表面，以使得在表面上形成双链体时，可以检测与双链体结合的
抗体的存在。
[1003] 基因表达，备选地，可以通过免疫学方法，诸如细胞或组织切片的免疫组织化学染色和细胞培养物或体液的测定来测量，从而直接量化基因产 物的表达。有效用于免疫组织
化学染色和/或样品液测定的抗体可以是单克隆的或多克隆的，且可以在任何哺乳动物中
制备。方便地，抗体可以针对天然序列FcRH5多肽或针对基于本文中提供的DNA序列的合
成肽或针对与FcRH5DNA融合并编码特异性抗体表位的外源序列来制备。
化学染色和/或样品液测定的抗体可以是单克隆的或多克隆的，且可以在任何哺乳动物中
制备。方便地，抗体可以针对天然序列FcRH5多肽或针对基于本文中提供的DNA序列的合
成肽或针对与FcRH5DNA融合并编码特异性抗体表位的外源序列来制备。
[1004] 6.纯化抗-FcRH5抗体
[1005] 抗-FcRH5抗体形式可以由培养基或由宿主细胞溶解产物中回收。如果是膜-结合的，则它可以利用合适的洗涤剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶促裂解，从该膜释放。
抗-FcRH5抗体表达中使用的细胞可以通过不同的物理或化学手段，诸如冻融循环、超声波
降解、机械破坏、或细胞溶解剂来破坏。
抗-FcRH5抗体表达中使用的细胞可以通过不同的物理或化学手段，诸如冻融循环、超声波
降解、机械破坏、或细胞溶解剂来破坏。
[1006] 可能需要从重组细胞蛋白或多肽纯化抗-FcRH5抗体。以下程序是合适纯化程序的示范：通过在离子交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅石或在阳离子交换
树脂诸如DEAE上层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；利用例如，Sephadex G-75的
凝胶过滤；蛋白A琼脂糖柱以去除污染物诸如IgG；和金属螯合柱以结合抗-FcRH5抗体
的表位标记形式。可以使用不同的蛋白纯化方法并且所述方法是本领域中已知的并记述
在例如Deutscher，Methods in Enzymology(酶学方法)，182(1990)；Scopes， Protein
Purification：Principles and Practice(蛋白质纯化：原则和瞬间)，Springer-Verlag，
纽约(1982)中。所选择的纯化步骤应该取决于，例如，所用生成过程的性质和产生的具体
抗-FcRH5抗体。
树脂诸如DEAE上层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；利用例如，Sephadex G-75的
凝胶过滤；蛋白A琼脂糖柱以去除污染物诸如IgG；和金属螯合柱以结合抗-FcRH5抗体
的表位标记形式。可以使用不同的蛋白纯化方法并且所述方法是本领域中已知的并记述
在例如Deutscher，Methods in Enzymology(酶学方法)，182(1990)；Scopes， Protein
Purification：Principles and Practice(蛋白质纯化：原则和瞬间)，Springer-Verlag，
纽约(1982)中。所选择的纯化步骤应该取决于，例如，所用生成过程的性质和产生的具体
抗-FcRH5抗体。
[1007] 当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌培养基中。如果抗体在细胞内产生，则作为第一步，特殊的碎片，宿主细胞或溶解的片段，例如通过离
心或超滤去除。Carter等，Bio/Technology(生物/技术)10：163-167(1992)描述用于分
离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的程序。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)，EDTA，和苯甲基磺
酰氟(PMSF)的存在中融化细胞浆超过约30分钟。细胞碎片可以通过离心去除。在抗体分
泌到培养基中的情形中，来自所述表达系统的上清液一般首先利用可商购的蛋白浓缩过滤
器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤元件来浓缩。蛋白酶抑制剂诸如PMSF可以
包括在前述任一步骤中，以抑制蛋白水解并 且可以包含抗生素，从而防止外来污染物的生
长。
心或超滤去除。Carter等，Bio/Technology(生物/技术)10：163-167(1992)描述用于分
离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的程序。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)，EDTA，和苯甲基磺
酰氟(PMSF)的存在中融化细胞浆超过约30分钟。细胞碎片可以通过离心去除。在抗体分
泌到培养基中的情形中，来自所述表达系统的上清液一般首先利用可商购的蛋白浓缩过滤
器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤元件来浓缩。蛋白酶抑制剂诸如PMSF可以
包括在前述任一步骤中，以抑制蛋白水解并 且可以包含抗生素，从而防止外来污染物的生
长。
[1008] 由所述细胞制备的抗体组合物可以利用，例如，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析，和亲合层析来纯化，其中亲合层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲合配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基
于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)62：
1-13(1983))。推荐蛋白G用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.(EMBO杂志)5：
15671575(1986))。亲合配体相连接的基质最常见是琼脂糖，但可以使用其他基质。机械
稳定基质诸如受控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯容许比使用琼脂糖可以获得的更快
TM
的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域的情形中，主链ABX 树脂(J.T.Baker，
Phillipsburg，NJ)有效用于纯化。也可以使用其他用于蛋白纯化的技术诸如在离子交换
柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅石上层析、在肝素上层析、在阴离子或阳离子交换TM
树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上SEPHAROSE 层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀，其取
决于待回收的抗体。
于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)62：
1-13(1983))。推荐蛋白G用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.(EMBO杂志)5：
15671575(1986))。亲合配体相连接的基质最常见是琼脂糖，但可以使用其他基质。机械
稳定基质诸如受控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯容许比使用琼脂糖可以获得的更快
TM
的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域的情形中，主链ABX 树脂(J.T.Baker，
Phillipsburg，NJ)有效用于纯化。也可以使用其他用于蛋白纯化的技术诸如在离子交换
柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅石上层析、在肝素上层析、在阴离子或阳离子交换TM
树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上SEPHAROSE 层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀，其取
决于待回收的抗体。
[1009] 在任何初步纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可以经历低pH疏水性相互作用层析，其利用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度下(例如，约
0-0.25M盐)进行。
0-0.25M盐)进行。
[1010] G.药物制剂
[1011] 本发明的抗体-药物缀合物(ADC)可以通过任何适合于待治疗病症的途径来施用。ADC典型地应该经肠胃外，即输注、皮下、肌肉、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外施用。
[1012] 为了治疗这些癌症，在一个实施方案中，抗体-药物缀合物经由静脉内输注来施2 2
用。经由输注施用的剂量在约1μg/m-约10,000μg/m/剂量的范围内，一般1个剂量/
2 2 2
周，总共1、2、3或4个剂量。备选地，剂量范围是约1μg/m-约1000μg/m，约1μg/m-约
2 2 2 2 2 2
800μg/m，约1μg/m-约600μg/m，约1μg/m-约400μg/m，约10μg/m-约500μg/
2 2 2 2 2 2 2
m，约10μg/m-约300μg/m，约10μg/m-约200μg/m，和约1μg/m-约200μg/m。所
述剂量可以施用一次/日，一次/周，多次/周，而少于一次/日，多次/月，而少 于一次/
日，多次/月，而少于一次/周，一次/月或间断地减轻或缓解所述疾病的症状。施药可以
以任意公开的间隔持续进行直至肿瘤或待治疗的淋巴瘤、白血病症状好转。施药可以在获
得症状的好转或减轻后继续进行，其中所述好转或减轻通过这样继续的施药来延长。
用。经由输注施用的剂量在约1μg/m-约10,000μg/m/剂量的范围内，一般1个剂量/
2 2 2
周，总共1、2、3或4个剂量。备选地，剂量范围是约1μg/m-约1000μg/m，约1μg/m-约
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800μg/m，约1μg/m-约600μg/m，约1μg/m-约400μg/m，约10μg/m-约500μg/
2 2 2 2 2 2 2
m，约10μg/m-约300μg/m，约10μg/m-约200μg/m，和约1μg/m-约200μg/m。所
述剂量可以施用一次/日，一次/周，多次/周，而少于一次/日，多次/月，而少 于一次/
日，多次/月，而少于一次/周，一次/月或间断地减轻或缓解所述疾病的症状。施药可以
以任意公开的间隔持续进行直至肿瘤或待治疗的淋巴瘤、白血病症状好转。施药可以在获
得症状的好转或减轻后继续进行，其中所述好转或减轻通过这样继续的施药来延长。
[1013] 本发明还提供缓解自身免疫病的方法，其包括对患有自身免疫病的患者施用治疗有效量的任一种前述实施方案中的人源化13G9抗体-药物缀合物。在优选的实施方案中，
2 2
抗体通过静脉内或皮下施用。抗体-药物缀合物以范围为约1μg/m-约100mg/m/剂量的
2 2
剂量静脉内施用，并且在特殊的实施方案中，所述剂量为1μg/m-约500μg/m。所述剂量
可以施用一次/日，一次/周，多次/周，而少于一次/日，多次/月，而少于一次/日，多次
/月，而少于一次/周，一次/月或间断地减轻或缓解所述疾病的症状。施药可以以任意公
开的间隔持续进行直至待治疗的自身免疫病的症状的减轻或缓解。施药可以在获得症状的
减轻或缓解后继续进行，其中所述缓解或减轻通过这样继续的施药来延长。
2 2
抗体通过静脉内或皮下施用。抗体-药物缀合物以范围为约1μg/m-约100mg/m/剂量的
2 2
剂量静脉内施用，并且在特殊的实施方案中，所述剂量为1μg/m-约500μg/m。所述剂量
可以施用一次/日，一次/周，多次/周，而少于一次/日，多次/月，而少于一次/日，多次
/月，而少于一次/周，一次/月或间断地减轻或缓解所述疾病的症状。施药可以以任意公
开的间隔持续进行直至待治疗的自身免疫病的症状的减轻或缓解。施药可以在获得症状的
减轻或缓解后继续进行，其中所述缓解或减轻通过这样继续的施药来延长。
[1014] 本发明还提供治疗B细胞病症的方法，其包括向患有B细胞病症，诸如B细胞增殖病症(包括但不仅限于淋巴瘤和白血病)或自身免疫病的患者施用治疗有效量的任一种前
述实施方案中的人源化13G9抗体，所述抗体不与细胞毒性分子或可检测的分子缀合。所述
2 2
抗体典型地应该以约1μg/m-约1000mg/m 的剂量范围施用。
述实施方案中的人源化13G9抗体，所述抗体不与细胞毒性分子或可检测的分子缀合。所述
2 2
抗体典型地应该以约1μg/m-约1000mg/m 的剂量范围施用。
[1015] 在一方面，本发明还提供药物制剂，其包含至少一种本发明的抗-FcRH5抗体和/或其至少一种免疫缀合物和/或至少一种本发明的抗-FcRH5抗体-药物缀合物。在一些
实施方案中，药物制剂包含(1)本发明的抗体和/或其免疫缀合物，和(2)药用载体。在一
些实施方案中，药物制剂包含(1)本发明的抗体和/或其免疫缀合物，和任选地，(2)至少
一种另外的治疗剂。另外的治疗剂包括，但不仅限于，以下所述的那些。ADC典型地应该经
肠胃外，即输注、皮下、肌肉、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外施用。
实施方案中，药物制剂包含(1)本发明的抗体和/或其免疫缀合物，和(2)药用载体。在一
些实施方案中，药物制剂包含(1)本发明的抗体和/或其免疫缀合物，和任选地，(2)至少
一种另外的治疗剂。另外的治疗剂包括，但不仅限于，以下所述的那些。ADC典型地应该经
肠胃外，即输注、皮下、肌肉、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外施用。
[1016] 制备治疗制剂，其包含根据本发明使用的抗-FcRH5抗体或FcRH5免疫缀合物，以用于通过在冻干制剂或水溶液形式中混合具有所需纯度的所述抗体或免疫缀合物和任选
的药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科
学)第16版，Osol，A.编.(1980))来保存。可用的载体、赋形剂、或稳定剂在所用剂量和
浓度下对接受者无毒，并包括缓冲剂诸如乙酸、Tris、磷酸、柠檬酸、和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；六甲氯铵；氯化苯
甲烃铵，氯化苄甲乙氧铵；苯酚，丁醇或苄醇；烷基对羟苯甲酸酯类诸如甲基对羟苯甲酸酯
类或丙基对羟苯甲酸酯类；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少
于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙
烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其他碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂诸如EDTA；tonicifiers诸如海藻糖和氯化钠；糖诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；表面活性剂诸如聚山梨醇酯；盐
形成抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂
诸如 或聚乙二醇(PEG)。待用于体内施用的药物制剂一般是
无菌的。这通过经由无菌过滤膜过滤而容易地实现。
的药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科
学)第16版，Osol，A.编.(1980))来保存。可用的载体、赋形剂、或稳定剂在所用剂量和
浓度下对接受者无毒，并包括缓冲剂诸如乙酸、Tris、磷酸、柠檬酸、和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；六甲氯铵；氯化苯
甲烃铵，氯化苄甲乙氧铵；苯酚，丁醇或苄醇；烷基对羟苯甲酸酯类诸如甲基对羟苯甲酸酯
类或丙基对羟苯甲酸酯类；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少
于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙
烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其他碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂诸如EDTA；tonicifiers诸如海藻糖和氯化钠；糖诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；表面活性剂诸如聚山梨醇酯；盐
形成抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂
诸如 或聚乙二醇(PEG)。待用于体内施用的药物制剂一般是
无菌的。这通过经由无菌过滤膜过滤而容易地实现。
[1017] 本文中的制剂在必要时，还可以包含多于一种活性化合物，以用于待治疗的特殊适应证，优选彼此见无不利影响的具有互补活性的那些。例如，除抗-FcRH5抗体以外，可能
需要在一种制剂中包括另外的抗体，例如，结合FcRH5多肽上不同表位的第二种抗-FcRH5
抗体，或针对一些其他靶标诸如影响特殊癌症生长的生长因子的抗体。备选地，或另外地，
所述组合物还可以包含化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、和/或保心药。这样的分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。
需要在一种制剂中包括另外的抗体，例如，结合FcRH5多肽上不同表位的第二种抗-FcRH5
抗体，或针对一些其他靶标诸如影响特殊癌症生长的生长因子的抗体。备选地，或另外地，
所述组合物还可以包含化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、和/或保心药。这样的分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。
[1018] 活性成分也可以包载在，例如，通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊，例如，分别地，羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(异丁烯酸甲酯)微胶囊中，胶状药物递送
系统(例如，脂质体，清蛋白微球，微乳液，纳米-颗粒和纳米胶囊)中，或粗乳液中。这样
的技术公开在Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第16版，
Oslo，A.，编，(1980)中。
系统(例如，脂质体，清蛋白微球，微乳液，纳米-颗粒和纳米胶囊)中，或粗乳液中。这样
的技术公开在Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第16版，
Oslo，A.，编，(1980)中。
[1019] 可以制备持续释放的制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有所述抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质采用有形物体，例如，膜或 微胶囊的形式。持续释放基质的实例包括聚酯，水凝胶(例如，聚甲基丙烯酸2-羟乙酯，或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国
专利号3,773,919)，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯醋酸乙烯
酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸
亮丙立德组成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物诸如乙烯醋酸乙烯酯
和乳酸-乙醇酸容许分子释放超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白较短的时期。当包封
的免疫球蛋白在体内长期保持时，它们作为在37℃暴露于湿度的结果，可以变性或聚集，由
此导致生物学活性的缺失和免疫原性可能的变化。可以设计理性策略来进行稳定化，其取
决于涉及的机制。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物互换的分子间S-S键形
成，则稳定化可以通过修饰硫氢基残基，由酸性溶液冻干，控制湿量，使用合适的添加剂，和开发特殊的聚合物基质组合物来完成。
专利号3,773,919)，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯醋酸乙烯
酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸
亮丙立德组成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物诸如乙烯醋酸乙烯酯
和乳酸-乙醇酸容许分子释放超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白较短的时期。当包封
的免疫球蛋白在体内长期保持时，它们作为在37℃暴露于湿度的结果，可以变性或聚集，由
此导致生物学活性的缺失和免疫原性可能的变化。可以设计理性策略来进行稳定化，其取
决于涉及的机制。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物互换的分子间S-S键形
成，则稳定化可以通过修饰硫氢基残基，由酸性溶液冻干，控制湿量，使用合适的添加剂，和开发特殊的聚合物基质组合物来完成。
[1020] 抗体可以配制为任何适合于递送至靶细胞/组织的形式。例如，抗体可以配制为免疫脂质体。“脂质体”是由不同类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小泡囊，其有
效用于递送药物至哺乳动物。脂质体的成分一般以双侧形式排列，类似于生物膜的脂质排
列。包含抗体的脂质体通过本领域中已知的方法制备，诸如记述在Epstein等，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.
USA(美国国家科学院学报)77：4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；和1997
年10月23日公开的WO97/38731中。具有提高的循环时间的脂质体公开在美国专利号
5,013,556中。
效用于递送药物至哺乳动物。脂质体的成分一般以双侧形式排列，类似于生物膜的脂质排
列。包含抗体的脂质体通过本领域中已知的方法制备，诸如记述在Epstein等，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.
USA(美国国家科学院学报)77：4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；和1997
年10月23日公开的WO97/38731中。具有提高的循环时间的脂质体公开在美国专利号
5,013,556中。
[1021] 特别有效的脂质体可以通过反相蒸发方法，使用包含卵磷脂、胆固醇和PEG-来源的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物来生成。脂质体经由定义孔大小的过滤器压出，以
产生具有所需直径的脂质体。本发明的抗体的Fab’片段可以经由二硫化物互换反应，如
Martin等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志) 257：286-288(1982)所述与脂质体缀合。化疗
剂任选地包含在脂质体中。参见，Gabizon等，J.National Cancer Inst.(国家癌症研究所
杂志)81(19)：1484(1989)。
产生具有所需直径的脂质体。本发明的抗体的Fab’片段可以经由二硫化物互换反应，如
Martin等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志) 257：286-288(1982)所述与脂质体缀合。化疗
剂任选地包含在脂质体中。参见，Gabizon等，J.National Cancer Inst.(国家癌症研究所
杂志)81(19)：1484(1989)。
[1022] 待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过经由无菌过滤膜容易地实现。
[1023] H.使用抗-FcRH5抗体治疗
[1024] 为了确定癌症中的FcRH5表达，可使用不同检测测定法。在一个实施方案中，FcRH5多肽过表达可以通过免疫组织化学(IHC)来分析。来自肿瘤活检的石蜡包埋组织切
片可以进行IHC测定并符合如下的FcRH5蛋白染色强度标准：
片可以进行IHC测定并符合如下的FcRH5蛋白染色强度标准：
[1025] 分数0-没有观察到染色或在少于10％肿瘤细胞中观察到膜染色。
[1026] 分数1+-在超过10％肿瘤细胞中检测到微弱/勉强能察觉的膜染色。所述细胞仅在它们的膜的一部分中染色。
[1027] 分数2+-在超过10％肿瘤细胞中观察到弱至中度的完整膜染色。
[1028] 分数3+-在超过10％肿瘤细胞中观察到中度至强的完整膜染色。
[1029] 关于FcRH5多肽表达具有0或1+分数的那些肿瘤可以表征为不过表达FcRH5，而具有2+或3+分数的那些肿瘤可以表征为过表达FcRH5。
[1030] 备选地，或另外地，FISH测定诸如 (由Ventana，Arizona(亚利桑那州)销售)或 (Vysis，Illinois(伊利诺斯州))可以在福尔马林固定
的、石蜡包埋的肿瘤组织上进行，以确定肿瘤中FcRH5过表达程度(如果有任何过表达)。
的、石蜡包埋的肿瘤组织上进行，以确定肿瘤中FcRH5过表达程度(如果有任何过表达)。
[1031] FcRH5过表达或扩增可以利用体内检测测定，例如，通过施用结合待检测分子并用可检测的标记物(例如放射性同位素或荧光标记物)标记的分子(诸如抗体)和外部扫描
患者以获得所述标记物的定位来评估。
患者以获得所述标记物的定位来评估。
[1032] 如上所述，本发明的抗-FcRH5抗体具有不同的非治疗应用。本发明的抗-FcRH5抗体可以有效用于分级表达FcRH5多肽的癌症(例如，在放射性成像中)。所述抗体还有效
用于由细胞中纯化或免疫沉淀FcRH5多肽，体外检测和量化FcRH5多肽，例如，在ELISA或
Western印迹中，从而从混合细胞群体中杀死和消除表达FcRH5的细胞，以作为纯化其他细
胞的步骤。
用于由细胞中纯化或免疫沉淀FcRH5多肽，体外检测和量化FcRH5多肽，例如，在ELISA或
Western印迹中，从而从混合细胞群体中杀死和消除表达FcRH5的细胞，以作为纯化其他细
胞的步骤。
[1033] 目前，根据癌症的级别，癌症治疗包括下列治疗法中的一种或组合：手术去除癌组织、放射疗法、和化学疗法。抗-FcRH5抗体治疗法可以在不耐受化学疗法毒性和副作
用的老年患者中和其中放射疗法具有有限效用的转移型疾病中特别需要。本发明的肿瘤
靶向抗-FcRH5抗体在最初诊 断疾病时或在复发过程中有效用于缓解表达FcRH5的癌
症。为了治疗应用，抗-FcRH5抗体可以单独地，或以与例如，激素、antiangiogens、或放
射性标记化合物，或与手术、冷冻疗法、和/或放射疗法的组合疗法来使用。抗-FcRH5抗
体治疗可以与其他常规治疗形式，连续地，在常规治疗前或在常规治疗后协同施用。化疗
剂诸如 (多西他赛(docetaxel))， (palictaxel)，雌莫司汀
(estramustine)和米托蒽醌(mitoxantrone)用于治疗癌症，特别是在良性风险患者中。在
本发明的用于治疗或缓解癌症的方法中，癌症患者可以与使用一种或多种前述化疗剂的治
疗协同施用抗-FcRH5抗体。特别地，预期了与紫杉醇(palictaxel)和改良衍生物的组合
治疗法(参见，例如，EP0600517)。抗-FcRH5抗体可以与治疗有效剂量的化疗剂一起施用。
在另一个实施方案中，抗-FcRH5抗体与化学疗法协同施用，从而增加化疗剂，例如，紫杉醇
(palictaxel)的活性和效率。医师书桌文献(Physicians’Desk Reference(PDR))公开已
经用于治疗不同癌症的这些试剂的剂量。治疗有效的这些前述化疗药的给药方案和剂量应
该取决于待治疗的具体癌症，疾病的程度和本领域中技术医师所熟悉的其他因素，并可以
由医师确定。
用的老年患者中和其中放射疗法具有有限效用的转移型疾病中特别需要。本发明的肿瘤
靶向抗-FcRH5抗体在最初诊 断疾病时或在复发过程中有效用于缓解表达FcRH5的癌
症。为了治疗应用，抗-FcRH5抗体可以单独地，或以与例如，激素、antiangiogens、或放
射性标记化合物，或与手术、冷冻疗法、和/或放射疗法的组合疗法来使用。抗-FcRH5抗
体治疗可以与其他常规治疗形式，连续地，在常规治疗前或在常规治疗后协同施用。化疗
剂诸如 (多西他赛(docetaxel))， (palictaxel)，雌莫司汀
(estramustine)和米托蒽醌(mitoxantrone)用于治疗癌症，特别是在良性风险患者中。在
本发明的用于治疗或缓解癌症的方法中，癌症患者可以与使用一种或多种前述化疗剂的治
疗协同施用抗-FcRH5抗体。特别地，预期了与紫杉醇(palictaxel)和改良衍生物的组合
治疗法(参见，例如，EP0600517)。抗-FcRH5抗体可以与治疗有效剂量的化疗剂一起施用。
在另一个实施方案中，抗-FcRH5抗体与化学疗法协同施用，从而增加化疗剂，例如，紫杉醇
(palictaxel)的活性和效率。医师书桌文献(Physicians’Desk Reference(PDR))公开已
经用于治疗不同癌症的这些试剂的剂量。治疗有效的这些前述化疗药的给药方案和剂量应
该取决于待治疗的具体癌症，疾病的程度和本领域中技术医师所熟悉的其他因素，并可以
由医师确定。
[1034] 在一个特殊的实施方案中，将包含与细胞毒性剂缀合的抗-FcRH5抗体的缀合物施用于患者。优选地，与FcRH5蛋白结合的免疫缀合物通过细胞内在化，由此导致免疫缀
合物在杀死它所结合的癌细胞中增加的治疗效率。在优选的实施方案中，细胞毒性剂靶向
或干扰癌细胞中的核酸。所述细胞毒性剂的实例记述在上文中，并包括美坦生类化合物
(maytansinoids)，刺孢霉素(calicheamicins)，核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。
合物在杀死它所结合的癌细胞中增加的治疗效率。在优选的实施方案中，细胞毒性剂靶向
或干扰癌细胞中的核酸。所述细胞毒性剂的实例记述在上文中，并包括美坦生类化合物
(maytansinoids)，刺孢霉素(calicheamicins)，核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。
[1035] 将抗-FcRH5抗体或其毒素缀合物根据已知方法，诸如静脉内施用，例如，作为推注或通过连续输注一段时期，通过肌肉、腹膜内、脑脊内(intracerobrospinal)、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、或吸入途径施用。抗体的静脉内或皮下施用是优选的。
[1036] 也可以使用先体外再体内(ex vivo)的策略进行治疗应用。先体外再体内策略包括转染或转导获自具有编码FcRH5拮抗剂的多核苷酸的受试者的细胞。然后将转染或转导
的细胞返回受试者。所述细胞可以是广泛范围 类型中的任一种，包括，但不仅限于，造血细胞(例如，骨髓细胞，巨噬细胞，单核细胞，树突细胞，T细胞，或B细胞)，成纤维细胞，上皮细胞，内皮细胞，角化细胞，或肌肉细胞。
的细胞返回受试者。所述细胞可以是广泛范围 类型中的任一种，包括，但不仅限于，造血细胞(例如，骨髓细胞，巨噬细胞，单核细胞，树突细胞，T细胞，或B细胞)，成纤维细胞，上皮细胞，内皮细胞，角化细胞，或肌肉细胞。
[1037] 例如，如果FcRH5拮抗剂是抗体或免疫缀合物，则该拮抗剂通过任何合适的手段，包括肠胃外，皮下，腹膜内，肺内，和鼻内来使用，且，如果需要局部免疫抑制治疗，则进行病灶内施药。肠胃外输注包括肌肉，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施药。另外，拮抗剂通过脉冲输注，特别是与减低剂量的抗体一起合适地施用。优选地，所述剂量通过注射，最优选
静脉内或皮下注射给药，其部分地取决于施药是短暂的还是持续的。
静脉内或皮下注射给药，其部分地取决于施药是短暂的还是持续的。
[1038] 在另一个实例中，当病症或肿瘤位置容许时，FcRH5拮抗剂化合物，例如，通过直接注射，局部施用，且注射可以周期性重复。FcRH5拮抗剂还可以全身性地递送至受试者或直接递送至肿瘤细胞，例如，递送至肿瘤或手术切除肿瘤后的肿瘤床，从而预防或减少局部复
发或转移。
发或转移。
[1039] 治疗剂的组合施用典型地进行一段确定的时期(通常数分钟、小时、天或周，其取决于所选择的组合)。组合疗法意欲包括以顺序方式施用这些治疗剂，即，其中各治疗剂在
不同时间施用，以及这些治疗剂，或至少两种所述治疗剂，以基本同时的方式施用。
不同时间施用，以及这些治疗剂，或至少两种所述治疗剂，以基本同时的方式施用。
[1040] 治疗剂可以通过相同途径或不同途径来施用。例如，组合中的抗-FcRH抗体或免疫缀合物可以通过静脉内注射来施用，而组合中的化疗剂可以口服施用。备选地，例如，两
种治疗剂均可以口服施用，或两种治疗剂均可以通过静脉内注射来施用，其取决于具体的
治疗剂。施用治疗剂的顺序还根据具体的试剂而变化。
种治疗剂均可以口服施用，或两种治疗剂均可以通过静脉内注射来施用，其取决于具体的
治疗剂。施用治疗剂的顺序还根据具体的试剂而变化。
[1041] 根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-100mg/kg的各种治疗剂是用于施用于患者的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分别施药，或通过连续输注。典型的每日剂量可以在约1μg/kg-约100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因素。为了重复
施用数日或更长，根据病症，持续治疗直至癌症得到治疗，如上述方法所测量地。然而，其他剂量方案可以是有效的。
施用数日或更长，根据病症，持续治疗直至癌症得到治疗，如上述方法所测量地。然而，其他剂量方案可以是有效的。
[1042] 本申请预期通过基因疗法施用抗-FcRH5抗体。关于使用基因疗法产生胞内抗体参见，例如，1996年3月14日公开的WO96/07321。
[1043] 其他治疗方案可以与抗-FcRH5抗体的施用组合。组合的施用包括利用单独的制剂，或单药物制剂共同施用，和以任一顺序连续施用，其中优选存在这样的时期，在所述时
期时，两种(或所有)活性试剂同时发挥它们的生物学活性。优选地，这样的组合疗法导致
协同治疗效果。
期时，两种(或所有)活性试剂同时发挥它们的生物学活性。优选地，这样的组合疗法导致
协同治疗效果。
[1044] 可能还需要组合抗-FcRH5抗体或抗体的施用和针对与具体癌症相关的另一种肿瘤抗原的抗体的施用。
[1045] 在另一个实施方案中，本发明的治疗方法包括抗-FcRH5抗体(或多种抗体)和一种或多种化疗剂或生长抑制剂的组合施用，包括不同化疗剂的混合物、其他细胞毒性剂
或也抑制肿瘤生长的其他治疗剂的共同施用。化疗剂包括磷酸雌莫司汀(estramustine
phosphate)，泼尼莫司汀(prednimustine)，顺铂(cisplatin)，5-氟尿嘧啶，美法仑
(melphalan)，环 磷 酰 胺(cyclophosphamide)，羟 脲 (hydroxyurea)和 hydroxyurea
taxanes(诸如紫杉醇(paclitaxel)和多西他塞(doxetaxel))和/或蒽环类抗生素
(anthracycline antibiotics)。所述化疗剂的制备和给药时间表可以根据生产商的说明
书或如技术从业者通过经验确定地来使用。这样的化学疗法的制备和给药时间表也记述
在Chemotherapy Service Ed.(化学疗法服务版本)，M.C.Perry，Williams & Wilkins，
Baltimore，MD(1992)中。抗体可以与抗激素化合物；例如，抗雌激素化合物诸如他莫昔芬
(tamoxifen)；抗孕酮诸如奥那司酮(onapristone)(参见，EP 616812)；或抗雄激素诸如氟
他胺(flutamide)，所述抗激素化合物处于关于该分子已知的剂量。在待治疗的癌症是不依
赖雄激素的癌症的情形中，患者可以预先已经经历抗雄激素治疗并且，在癌症变为不依赖
雄激素后，可以对患者施用抗-FcRH5抗体(和任选地，如本文中所述的其他试剂)。
或也抑制肿瘤生长的其他治疗剂的共同施用。化疗剂包括磷酸雌莫司汀(estramustine
phosphate)，泼尼莫司汀(prednimustine)，顺铂(cisplatin)，5-氟尿嘧啶，美法仑
(melphalan)，环 磷 酰 胺(cyclophosphamide)，羟 脲 (hydroxyurea)和 hydroxyurea
taxanes(诸如紫杉醇(paclitaxel)和多西他塞(doxetaxel))和/或蒽环类抗生素
(anthracycline antibiotics)。所述化疗剂的制备和给药时间表可以根据生产商的说明
书或如技术从业者通过经验确定地来使用。这样的化学疗法的制备和给药时间表也记述
在Chemotherapy Service Ed.(化学疗法服务版本)，M.C.Perry，Williams & Wilkins，
Baltimore，MD(1992)中。抗体可以与抗激素化合物；例如，抗雌激素化合物诸如他莫昔芬
(tamoxifen)；抗孕酮诸如奥那司酮(onapristone)(参见，EP 616812)；或抗雄激素诸如氟
他胺(flutamide)，所述抗激素化合物处于关于该分子已知的剂量。在待治疗的癌症是不依
赖雄激素的癌症的情形中，患者可以预先已经经历抗雄激素治疗并且，在癌症变为不依赖
雄激素后，可以对患者施用抗-FcRH5抗体(和任选地，如本文中所述的其他试剂)。
[1046] 有时，还向患者共同施用保心药(从而预防或减少与治疗相关的心肌功能障碍)或一种或多种细胞因子可以是有益的。除以上治疗方案以外，患者可以进行手术去除癌细
胞和/或放射疗法(例如外部波束照射或使用放射性标记的试剂，诸如抗体的疗法)，其在
抗体治疗法之前，同时，或之后。关于上述共同施用的试剂的合适剂量是目前使用的那些，
并可以降低，这归因于所述试剂和抗-FcRH5抗体的组合作用(协同)。
胞和/或放射疗法(例如外部波束照射或使用放射性标记的试剂，诸如抗体的疗法)，其在
抗体治疗法之前，同时，或之后。关于上述共同施用的试剂的合适剂量是目前使用的那些，
并可以降低，这归因于所述试剂和抗-FcRH5抗体的组合作用(协同)。
[1047] 本发明的抗体组合物应该以与良好医疗实践相一致的方式来配制、给 药、和施用。在该背景下考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临
床状态、病症的原因、递送试剂的位点、施药方法、施药时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。抗体不需要，但任选地，与一种或多种目前用于预防或治疗待讨论病症的试剂一起配
制。所述其他试剂的有效量取决于制剂中存在的本发明抗体的量、病症或治疗的类型、和以
上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，并使用如前文所用的施药途径，或以迄今为止使
用的剂量的约1-99％来使用。
床状态、病症的原因、递送试剂的位点、施药方法、施药时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。抗体不需要，但任选地，与一种或多种目前用于预防或治疗待讨论病症的试剂一起配
制。所述其他试剂的有效量取决于制剂中存在的本发明抗体的量、病症或治疗的类型、和以
上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，并使用如前文所用的施药途径，或以迄今为止使
用的剂量的约1-99％来使用。
[1048] 为了预防或治疗疾病，施药的剂量和模式应该由医师根据已知的标准来选择。抗体的合适剂量应该取决于如上定义的待治疗疾病的类型，疾病的严重性和过程，为了预防
还是治疗目的施用抗体，以前的治疗，患者的临床病史和对抗体的应答，和主治医师的判断
力。抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。优选地，抗体通过静脉内输注
或通过皮下注射施用。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-约50mg/kg体重(例如，约
0.1-15mg/kg/剂量)的抗体可以是用于施用于患者的最初候选剂量，无论，例如，通过一次
或多次分别施药，或通过连续输注。给药方案可以包括施用约4mg/kg的最初负荷剂量，随
后施用约2mg/kg抗-FcRH5抗体的周维持剂量。然而，其他剂量方案可以是有效的。典型的
每日剂量可以在约1μg/kg-约100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因素。为了
重复施用数日或更长，根据病症，持续治疗直至出现疾病症状的理想抑制。该疗法的进展可
以容易地通过常规方法和测定并基于本领域中的医师或其他技术人员已知的标准来监测。
还是治疗目的施用抗体，以前的治疗，患者的临床病史和对抗体的应答，和主治医师的判断
力。抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。优选地，抗体通过静脉内输注
或通过皮下注射施用。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-约50mg/kg体重(例如，约
0.1-15mg/kg/剂量)的抗体可以是用于施用于患者的最初候选剂量，无论，例如，通过一次
或多次分别施药，或通过连续输注。给药方案可以包括施用约4mg/kg的最初负荷剂量，随
后施用约2mg/kg抗-FcRH5抗体的周维持剂量。然而，其他剂量方案可以是有效的。典型的
每日剂量可以在约1μg/kg-约100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因素。为了
重复施用数日或更长，根据病症，持续治疗直至出现疾病症状的理想抑制。该疗法的进展可
以容易地通过常规方法和测定并基于本领域中的医师或其他技术人员已知的标准来监测。
[1049] 除向患者施用抗体蛋白以外，本申请还预期通过基因疗法施用抗体。编码抗体的核酸的所述施用包括在表述“施用治疗有效量的抗体”中。关于使用基因疗法产生胞内抗
体参见，例如，1996年3月14日公开的WO96/07321。
体参见，例如，1996年3月14日公开的WO96/07321。
[1050] 存在两种用于使核酸(任选地，包含在载体中)进入患者细胞的主要方法；体内和先体外再体内。为了体内递送，将核酸直接注射到患者中，通常在需要抗体的位点。为了先
体外再体内治疗，可以取出患者细胞，将核酸引入至这些分离细胞中并将改良的细胞直接
或，例如包封在植入患者内的多孔膜中施用于患者(参见，例如，美国专利号4,892,538和
5,283,187)。 存在多种可用于将核酸引入至活细胞的技术。所述技术根据核酸是体外转
入培养的细胞还是体内转染目的宿主的细胞而变化。适合于体外转移核酸进入哺乳动物细
胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。关于先体外再体内递送基因的常用载体是反转录病毒载体。
体外再体内治疗，可以取出患者细胞，将核酸引入至这些分离细胞中并将改良的细胞直接
或，例如包封在植入患者内的多孔膜中施用于患者(参见，例如，美国专利号4,892,538和
5,283,187)。 存在多种可用于将核酸引入至活细胞的技术。所述技术根据核酸是体外转
入培养的细胞还是体内转染目的宿主的细胞而变化。适合于体外转移核酸进入哺乳动物细
胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。关于先体外再体内递送基因的常用载体是反转录病毒载体。
[1051] 目前优选的体内核酸转移技术包括使用病毒载体(诸如腺病毒，单纯疱疹I病毒，或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(例如，关于脂质介导转移基因的有效脂质是DOTMA，
DOPE和DC-Chol)的转染。为了回顾目前已知的基因标记和基因疗法流程，参见Anderson
等，Science(科学)256：808-813(1992)。还参见WO 93/25673和其中引用的参考文献。
DOPE和DC-Chol)的转染。为了回顾目前已知的基因标记和基因疗法流程，参见Anderson
等，Science(科学)256：808-813(1992)。还参见WO 93/25673和其中引用的参考文献。
[1052] 本发明的抗-FcRH5抗体可以采用本文中定义“抗体”所包括的不同形式。因此，所述抗体包括全长或完整抗体、抗体片段、天然序列抗体或氨基酸变体、人源化、嵌合或融
合抗体、免疫缀合物、及其功能片段。在融合抗体中，抗体序列与异源多肽序列融合。所述
抗体可以在Fc区内进行修饰，以提供所需的效应子功能。如本文中该部分中更详细讨论
地，使用合适的Fc区，结合在细胞表面上的裸抗体可以诱导细胞毒性，例如，经由抗体依赖
性细胞毒性(ADCC)或通过在补体依赖性细胞毒性中募集补体，或一些其他机制实现。备选
地，在需要消除或减少效应子功能，从而最小化副作用或治疗并发症的情形中，可以使用某
些其他Fc区。
合抗体、免疫缀合物、及其功能片段。在融合抗体中，抗体序列与异源多肽序列融合。所述
抗体可以在Fc区内进行修饰，以提供所需的效应子功能。如本文中该部分中更详细讨论
地，使用合适的Fc区，结合在细胞表面上的裸抗体可以诱导细胞毒性，例如，经由抗体依赖
性细胞毒性(ADCC)或通过在补体依赖性细胞毒性中募集补体，或一些其他机制实现。备选
地，在需要消除或减少效应子功能，从而最小化副作用或治疗并发症的情形中，可以使用某
些其他Fc区。
[1053] 在一个实施方案中，所述抗体竞争结合或基本结合与本发明的抗体相同的表位。还预期了具有本发明抗-FcRH5抗体生物学特征的抗体，其特别包括体内肿瘤靶向和任何
细胞增殖抑制或细胞毒性特征。
细胞增殖抑制或细胞毒性特征。
[1054] 用于产生以上抗体的方法详细记述在本文中。
[1055] 本发明的抗-FcRH5抗体有效用于治疗表达FcRH5的癌症或缓解哺乳动物中该癌症的一种或多种症状。这样的癌症包括，但不仅限于，造血癌症(hematopoietic
cancers)或血液相关癌症(blood-related cancers)，诸如淋巴瘤，白血病，骨髓瘤或
淋巴恶性肿瘤(lymphoid malignancies)，而且还包括脾的癌症和淋巴结的癌症。所
述B细胞相关癌症的更具体实例，包括例如，高、中和低级淋巴瘤(high，intermediate
and low grade lymphomas)(包括B细胞淋巴瘤诸如，例如，粘膜相关淋巴组织B细
胞淋巴瘤 (mucosa-associated-lymphoid tissue B cell lymphoma)和非霍奇金淋
巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)，套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)，Burkitt
淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，缘带淋巴瘤(marginal
zone lymphoma)，扩散性大细胞淋巴瘤(diffuse large cell lymphoma)，卵泡淋巴瘤
(follicular lymphoma)，和霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)和T细胞淋巴瘤)
和白血病(包括继发性白血病(secondary leukemia)，慢性淋巴细胞白血病(chronic
lymphocytic leukemia)，诸如B细胞白血病(CD5+B淋巴细胞)，骨髓白血病(myeloid
leukemia)，诸如急性骨髓白血病(acute myeloid leukemia)，慢性骨髓白血病(chronic
myeloid leukemia)，淋巴白血病(lymphoid leukemia)，诸如急性成淋巴细胞白血病
(acute lymphoblastic leukemia)和脊髓发育不良(myelodysplasia))，和其他血液和/
或B细胞-或T-细胞-相关癌症。所述癌症包括任何前述转移型癌症。所述抗体能够结合
在哺乳动物中表达FcRH5多肽的癌细胞的至少一部分。在优选的实施方案中，所述抗体在
结合细胞上的FcRH5多肽时，体外或体内地，有效破坏或杀死表达FcRH5的肿瘤细胞或抑制
所述肿瘤细胞的生长。这样的抗体包括裸抗-FcRH5抗体(不与任何试剂缀合)。具有细胞
毒性或细胞生长抑制特性的裸抗体可以进一步使用细胞毒性剂来控制，从而致使它们具有
甚至更大的肿瘤细胞破坏能力。细胞毒性特性可以通过，例如，缀合抗体和细胞毒性剂以形
成如本文中所述的免疫缀合物来赋予抗-FcRH5抗体。细胞毒性剂或细胞生长抑制剂优选
是小分子。毒素诸如诸如加利车霉素(calicheamicin)或美坦生类化合物(maytansinoid)
及其类似物或衍生物是优选的。
cancers)或血液相关癌症(blood-related cancers)，诸如淋巴瘤，白血病，骨髓瘤或
淋巴恶性肿瘤(lymphoid malignancies)，而且还包括脾的癌症和淋巴结的癌症。所
述B细胞相关癌症的更具体实例，包括例如，高、中和低级淋巴瘤(high，intermediate
and low grade lymphomas)(包括B细胞淋巴瘤诸如，例如，粘膜相关淋巴组织B细
胞淋巴瘤 (mucosa-associated-lymphoid tissue B cell lymphoma)和非霍奇金淋
巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)，套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)，Burkitt
淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，缘带淋巴瘤(marginal
zone lymphoma)，扩散性大细胞淋巴瘤(diffuse large cell lymphoma)，卵泡淋巴瘤
(follicular lymphoma)，和霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)和T细胞淋巴瘤)
和白血病(包括继发性白血病(secondary leukemia)，慢性淋巴细胞白血病(chronic
lymphocytic leukemia)，诸如B细胞白血病(CD5+B淋巴细胞)，骨髓白血病(myeloid
leukemia)，诸如急性骨髓白血病(acute myeloid leukemia)，慢性骨髓白血病(chronic
myeloid leukemia)，淋巴白血病(lymphoid leukemia)，诸如急性成淋巴细胞白血病
(acute lymphoblastic leukemia)和脊髓发育不良(myelodysplasia))，和其他血液和/
或B细胞-或T-细胞-相关癌症。所述癌症包括任何前述转移型癌症。所述抗体能够结合
在哺乳动物中表达FcRH5多肽的癌细胞的至少一部分。在优选的实施方案中，所述抗体在
结合细胞上的FcRH5多肽时，体外或体内地，有效破坏或杀死表达FcRH5的肿瘤细胞或抑制
所述肿瘤细胞的生长。这样的抗体包括裸抗-FcRH5抗体(不与任何试剂缀合)。具有细胞
毒性或细胞生长抑制特性的裸抗体可以进一步使用细胞毒性剂来控制，从而致使它们具有
甚至更大的肿瘤细胞破坏能力。细胞毒性特性可以通过，例如，缀合抗体和细胞毒性剂以形
成如本文中所述的免疫缀合物来赋予抗-FcRH5抗体。细胞毒性剂或细胞生长抑制剂优选
是小分子。毒素诸如诸如加利车霉素(calicheamicin)或美坦生类化合物(maytansinoid)
及其类似物或衍生物是优选的。
[1056] 本发明提供包含本发明的抗-FcRH5抗体和载体的组合物。为了治疗癌症的目的，组合物可以施用于需要所述治疗的患者，其中所述组合物可以包含作为免疫缀合物或作为
裸抗体存在的一种或多种抗-FcRH5抗体。在另一个实施方案中，所述组合物可以包含与其
他治疗剂诸如细胞毒性剂或生长抑制剂，包括化疗剂组合的这些抗体。本发明还提供包含
本发明的抗-FcRH5抗体和载体的制剂。在一个实施方案中，所述制剂是包含药用载体的治
疗制剂。
裸抗体存在的一种或多种抗-FcRH5抗体。在另一个实施方案中，所述组合物可以包含与其
他治疗剂诸如细胞毒性剂或生长抑制剂，包括化疗剂组合的这些抗体。本发明还提供包含
本发明的抗-FcRH5抗体和载体的制剂。在一个实施方案中，所述制剂是包含药用载体的治
疗制剂。
[1057] 本发明的另一方面是编码抗-FcRH5抗体的分离的核酸。包括编码H 链和L链二者和特别地，编码天然序列抗体以及所述抗体的变体、修饰、和人源化形式的超变区残基、
链的核酸。
链的核酸。
[1058] 本发明还提供有效用于治疗表达FcRH5多肽的癌症或缓解哺乳动物中所述癌症的一种或多种症状，其包括将治疗有效量的抗-FcRH5抗体施用于所述哺乳动物。抗体治疗
组合物可以如医师指导地，短期(急性)或持续，或间歇施用。还提供抑制表达FcRH5多肽
的细胞的生长和杀死FcRH5多肽的细胞的方法。
组合物可以如医师指导地，短期(急性)或持续，或间歇施用。还提供抑制表达FcRH5多肽
的细胞的生长和杀死FcRH5多肽的细胞的方法。
[1059] 本发明还提供制造试剂盒和物品，其包括至少一种抗-FcRH5抗体。包含抗-FcRH5抗体的试剂盒存在，例如，用于FcRH5细胞杀死测定，用于由细胞纯化或免疫沉淀FcRH5多
肽的应用。例如，为了分离和纯化FcRH5，试剂盒可以包含与珠(例如，琼脂糖珠)偶联的
抗-FcRH5抗体。可以提供这样的试剂盒，其包含用于，例如，在ELISA或Western印迹中，
体外检测和量化FcRH5的抗体。所述有效用于检测的抗体可以与标记物诸如荧光或放射性
标记物一起提供。
肽的应用。例如，为了分离和纯化FcRH5，试剂盒可以包含与珠(例如，琼脂糖珠)偶联的
抗-FcRH5抗体。可以提供这样的试剂盒，其包含用于，例如，在ELISA或Western印迹中，
体外检测和量化FcRH5的抗体。所述有效用于检测的抗体可以与标记物诸如荧光或放射性
标记物一起提供。
[1060] I.抗体-药物缀合物治疗
[1061] 预期本发明的抗体-药物缀合物可以用于治疗不同的疾病或病症，例如，通过过表达肿瘤抗原表征的疾病或病症。示范性病症或过增殖病症包括良性或恶性肿瘤；白血病
和淋巴恶性肿瘤。其他包括神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑、腺性、巨噬细胞、上皮、基质、囊胚腔、炎性、血管发生和免疫、包括自身免疫病症。
和淋巴恶性肿瘤。其他包括神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑、腺性、巨噬细胞、上皮、基质、囊胚腔、炎性、血管发生和免疫、包括自身免疫病症。
[1062] 在动物模型和基于细胞的测定中鉴别的ADC化合物可以在携带肿瘤的较高等灵长类动物和人临床实验中进一步测试。人临床实验可以设计用于测试本发明的抗-FcRH5
单克隆抗体或免疫缀合物在经历B细胞增殖病症包括但不仅限于淋巴瘤，非霍奇金淋巴
瘤(NHL)，侵袭性NHL(aggressive NHL)，复发性侵袭性NHL，复发性惰性NHL(relapsed
indolent NHL)，难治性NHL(refractory NHL)，难治性惰性NHL(refractory indolent
NHL)，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)，小淋巴细胞淋巴瘤
(small lymphocytic lymphoma)，白血病，多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)，
急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)，和套细胞淋巴瘤的患者的功
效。临床实验可以设计用于评估与抑制治疗方案，诸如辐射和/或涉及已知的化疗剂和/
或细胞毒性剂的化学疗法组合的ADC的功效。
单克隆抗体或免疫缀合物在经历B细胞增殖病症包括但不仅限于淋巴瘤，非霍奇金淋巴
瘤(NHL)，侵袭性NHL(aggressive NHL)，复发性侵袭性NHL，复发性惰性NHL(relapsed
indolent NHL)，难治性NHL(refractory NHL)，难治性惰性NHL(refractory indolent
NHL)，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)，小淋巴细胞淋巴瘤
(small lymphocytic lymphoma)，白血病，多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)，
急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)，和套细胞淋巴瘤的患者的功
效。临床实验可以设计用于评估与抑制治疗方案，诸如辐射和/或涉及已知的化疗剂和/
或细胞毒性剂的化学疗法组合的ADC的功效。
[1063] 一般地，待治疗的疾病或病症是过度增殖疾病诸如B细胞增殖疾病和/或B细胞癌症。本文中待治疗的癌症的实例包括，但不仅限于，B细胞增殖疾病，选自淋巴瘤，
非霍奇金淋巴瘤(NHL)，侵袭性NHL(aggressiveNHL)，复发性侵袭性NHL，复发性惰性
NHL(relapsed indolent NHL)，难治性NHL(refractory NHL)，难治性惰性NHL(refractory
indolent NHL)，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)，小淋
巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，白血病，多毛细胞白血病(hairy cell
leukemia)(HCL)，急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)，和套细胞淋
巴瘤。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)，侵袭性NHL(aggressiveNHL)，复发性侵袭性NHL，复发性惰性
NHL(relapsed indolent NHL)，难治性NHL(refractory NHL)，难治性惰性NHL(refractory
indolent NHL)，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)，小淋
巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，白血病，多毛细胞白血病(hairy cell
leukemia)(HCL)，急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)，和套细胞淋
巴瘤。
[1064] 所述癌症可以包括表达FcRH5的细胞，以使得本发明的ADC能够结合癌细胞。为了确定癌症中的FcRH5表达，可以使用不同的诊断/预后测定法。在一个实施方案中，FcRH5
过表达可以通过IHC来分析。来自肿瘤活检的石蜡包埋的组织切片可以进行IHC测定，并
关于染色程度和检查肿瘤细胞的比例方面符合FcRH5蛋白染色强度标准。
过表达可以通过IHC来分析。来自肿瘤活检的石蜡包埋的组织切片可以进行IHC测定，并
关于染色程度和检查肿瘤细胞的比例方面符合FcRH5蛋白染色强度标准。
[1065] 为了预防或治疗疾病，ADC的合适剂量应该取决于如上定义的待治疗疾病的类型，疾病的严重性和过程，为了预防还是治疗目的施用抗体，以前的治疗，患者的临床病史和对
抗体的应答，和主治医师的判断力。所述分子以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于
患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如，约0.1-20mg/kg)的分子可以
是用于施用于患者的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分别施药，或通过连续输
注。典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因
素。待施用于患者的ADC的示范性剂量在约0.1-约10mg/kg患者体重的范围内。
抗体的应答，和主治医师的判断力。所述分子以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于
患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如，约0.1-20mg/kg)的分子可以
是用于施用于患者的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分别施药，或通过连续输
注。典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因
素。待施用于患者的ADC的示范性剂量在约0.1-约10mg/kg患者体重的范围内。
[1066] 为了重复施用数日或更长，根据病症，持续治疗直至出现疾病症状的理想抑制。示范性给药方案包括施用约4mg/kg的最初负荷剂量，随后施用约2mg/kg抗-ErbB2抗体的周
维持剂量。其他剂量方案可以是有效的。该疗法的进展可以容易地通过常规方法和测定来
监测。
维持剂量。其他剂量方案可以是有效的。该疗法的进展可以容易地通过常规方法和测定来
监测。
[1067] J.组合疗法
[1068] 本发明的抗体-药物缀合物(ADC)可以与具有抗癌特性的第二种化合物组合为药物组合制剂，或作为组合疗法的给药方案。药物组合制剂或给药方案的第二种化合物优选
具有该组合的ADC互补的活性，以使得它们彼此间无不利影响。
具有该组合的ADC互补的活性，以使得它们彼此间无不利影响。
[1069] 所述第二种化合物可以是化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、和/或保心药。这样的分子适合以有效于所意欲的目的的量组合存在。含有本发明的ADC的药物组合物还可以具有治疗有效量的化疗剂，诸如微管蛋白形成抑制剂、拓扑异构酶抑
制剂、或DNA结合剂。
制剂、或DNA结合剂。
[1070] 在一方面，所述第一种化合物是本发明的抗-FcRH5 ADC，且所述第二种化合物是抗-CD20抗体(裸抗体或ADC)。在一个实施方案中，所述第二种化合物是抗-CD20抗体
利妥昔单抗(rituximab) 或2H7(Genentech，Inc.，South San Francisco，
CA)。有效用于与本发明的抗-FcRH5ADC的组合免疫疗法的另一种抗体包括但不仅限于
抗-VEGF(例如，
利妥昔单抗(rituximab) 或2H7(Genentech，Inc.，South San Francisco，
CA)。有效用于与本发明的抗-FcRH5ADC的组合免疫疗法的另一种抗体包括但不仅限于
抗-VEGF(例如，
[1071] 另一种治疗方案可以与施用根据本发明鉴别的抗癌剂组合，包括但不仅限于放射性疗法和/或骨髓和外周血移植，和/或细胞毒性剂，化疗剂，或生长抑制剂。在一个这
样的实施方案中，化疗剂是试剂或试剂组合，诸如，例如，环磷酰胺(cyclophosphamide)，
羟基柔红霉素(hydroxydaunorubicin)，阿霉素(adriamycin)，doxorubincin，长春新碱
TM
(vincristine)(Oncovin )，泼尼松龙(prednisolone)，CHOP，CVP，或COP，或免疫治疗剂诸如抗-CD20(例如， )或抗-VEGF(例如，
样的实施方案中，化疗剂是试剂或试剂组合，诸如，例如，环磷酰胺(cyclophosphamide)，
羟基柔红霉素(hydroxydaunorubicin)，阿霉素(adriamycin)，doxorubincin，长春新碱
TM
(vincristine)(Oncovin )，泼尼松龙(prednisolone)，CHOP，CVP，或COP，或免疫治疗剂诸如抗-CD20(例如， )或抗-VEGF(例如，
[1072] 组合疗法可以作为同时或相继的方案来施用。当相继施用时，所述组合可以以两次或更多次施用的方式来施用。组合施用包括利用分别的制剂或单一药物制剂，并以任意
顺序连续施用的共同施用，其中优选存在两种(或全部)活性试剂同时发挥它们的生物学
活性的时期。
顺序连续施用的共同施用，其中优选存在两种(或全部)活性试剂同时发挥它们的生物学
活性的时期。
[1073] 在一个实施方案中，使用ADC的治疗涉及组合施用本文中鉴别的抗癌剂，和一种或多种化疗剂或生长抑制剂，包括共同施用不同化疗剂的混合物。化疗剂包括紫杉烷类
(taxanes)(诸如紫杉醇(paclitaxel)和多西他 赛(docetaxel))和/或蒽环类抗生素
(anthracycline antibiotics)。这样的化疗剂的制备和给药时间表可以根据生产商的说
明书或如技术从业者通过经验确定地来使用。这样的化学疗法的制备和给药时间表也记述
在“Chemotherapy Service(化学疗法服务)”，(1992)编，M.C.Perry，Williams &Wilkins，Baltimore，Md中。
(taxanes)(诸如紫杉醇(paclitaxel)和多西他 赛(docetaxel))和/或蒽环类抗生素
(anthracycline antibiotics)。这样的化疗剂的制备和给药时间表可以根据生产商的说
明书或如技术从业者通过经验确定地来使用。这样的化学疗法的制备和给药时间表也记述
在“Chemotherapy Service(化学疗法服务)”，(1992)编，M.C.Perry，Williams &Wilkins，Baltimore，Md中。
[1074] 对任意以上共同使用的试剂合适的剂量是目前使用的剂量且可以降低，这归因于新鉴别的试剂和其他化疗剂或治疗的组合作用(协同)。
[1075] 组合疗法可以提供“协同”并证明“协同的”，即当一起使用活性成分时获得的作用大于由分别使用化合物所引起的作用的总和。协同作用可以在活性成分：(1)以组合的单位剂量制剂共同配制和同时施用或递送；(2)交替地或作为单独的制剂平行递送；或(3)通
过一些其他方案递送时获得。当以交替疗法递送时，协同作用可以在相继，例如通过在分别
的注射器中的不同注射来施用或递送时获得。一般地，在交替疗法过程中，有效剂量的各种
活性成分相继，即连续地施用，而在组合疗法中，有效剂量的两种或更多种活性成分一起施
用。
过一些其他方案递送时获得。当以交替疗法递送时，协同作用可以在相继，例如通过在分别
的注射器中的不同注射来施用或递送时获得。一般地，在交替疗法过程中，有效剂量的各种
活性成分相继，即连续地施用，而在组合疗法中，有效剂量的两种或更多种活性成分一起施
用。
[1076] 本发明的组合疗法还可以包括一种或多种化疗剂。组合施用包括利用分别的制剂或单一药物制剂的共同施用或同时施用，和以任意顺序的连续施用，其中优选存在两种
(或全部)活性试剂同时发挥它们的生物学活性的时期。
(或全部)活性试剂同时发挥它们的生物学活性的时期。
[1077] 所述化疗剂，如果施用，通常以关于其已知的剂量来施用，或任选地，以降低的剂量施用，这归因于药物的组合作用或由施用抗代谢物化疗剂的负面副作用。这样的化疗剂
的制备和给药时间表可以根据生产商的说明书或如技术从业者通过经验确定地来使用。
的制备和给药时间表可以根据生产商的说明书或如技术从业者通过经验确定地来使用。
[1078] 在本文中公开了可以组合的不同化疗剂。
[1079] 在一些实施方案中，待组合的化疗剂选自由以下各项组成的组：免疫调节剂(IMids)(包括沙利度胺(thalidomide)和 (来那度胺(lenalidomide)))，蛋
白体抑制剂(诸如 (硼替佐米(bortezomib))和PS342)，bora taxoid(包括
多西他赛(docetaxel)和紫杉醇(paclitaxel))，长春花(诸如长春瑞滨(vinorelbine)
或长春碱(vinblastine))，铂化合物(诸如卡铂(carboplatin)或顺铂(cisplatin))，
芳化酶抑制剂(诸如来曲唑(letrozole)，阿那 曲唑(anastrazole)，或依西美坦
(exemestane))，抗-雌激素(例如氟维斯群(fulvestrant)或他莫昔芬(tamoxifen))，
依托泊苷(etoposide)，塞替哌(thiotepa)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，培美曲塞
(pemetrexed)，甲氨喋呤，脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)，聚乙二醇化脂质
体多柔比星(pegylated liposomal doxorubicin)，卡培他滨(capecitabine)，吉西他滨
(gemcitabine)，melthalin，多柔比星(doxorubicin)，长春新碱(vincristine)，COX-2抑
制剂(例如，塞来考昔(celecoxib))，或类固醇(例如，地塞米松(dexamethasone)和泼
尼松龙(prednisone))。在一些实施方案(例如涉及多发性骨髓瘤(multiple myeloma)
的实施方案)中，组合地塞米松(dexamethasone)和来那度胺(lenalidomide)，或地
塞米松(dexamethasone)，或硼替佐米(bortezomib)，或长春新碱(vincristine)，
多柔比星(doxorubicin)和dexamethason，或沙利度胺(thalidomide)和地塞米松
(dexamethasone)，或脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)，长春新碱(vincristine)
和地塞米松(dexamethasone)，或来那度胺(lenalidomide)和地塞米松(dexamethasone)，
或硼替佐米(bortezomib)和地塞米松(dexamethasone)，或硼替佐米(bortezomib)，多柔
比星(doxorubicin)，和地塞米松(dexamethasone)。
白体抑制剂(诸如 (硼替佐米(bortezomib))和PS342)，bora taxoid(包括
多西他赛(docetaxel)和紫杉醇(paclitaxel))，长春花(诸如长春瑞滨(vinorelbine)
或长春碱(vinblastine))，铂化合物(诸如卡铂(carboplatin)或顺铂(cisplatin))，
芳化酶抑制剂(诸如来曲唑(letrozole)，阿那 曲唑(anastrazole)，或依西美坦
(exemestane))，抗-雌激素(例如氟维斯群(fulvestrant)或他莫昔芬(tamoxifen))，
依托泊苷(etoposide)，塞替哌(thiotepa)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，培美曲塞
(pemetrexed)，甲氨喋呤，脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)，聚乙二醇化脂质
体多柔比星(pegylated liposomal doxorubicin)，卡培他滨(capecitabine)，吉西他滨
(gemcitabine)，melthalin，多柔比星(doxorubicin)，长春新碱(vincristine)，COX-2抑
制剂(例如，塞来考昔(celecoxib))，或类固醇(例如，地塞米松(dexamethasone)和泼
尼松龙(prednisone))。在一些实施方案(例如涉及多发性骨髓瘤(multiple myeloma)
的实施方案)中，组合地塞米松(dexamethasone)和来那度胺(lenalidomide)，或地
塞米松(dexamethasone)，或硼替佐米(bortezomib)，或长春新碱(vincristine)，
多柔比星(doxorubicin)和dexamethason，或沙利度胺(thalidomide)和地塞米松
(dexamethasone)，或脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)，长春新碱(vincristine)
和地塞米松(dexamethasone)，或来那度胺(lenalidomide)和地塞米松(dexamethasone)，
或硼替佐米(bortezomib)和地塞米松(dexamethasone)，或硼替佐米(bortezomib)，多柔
比星(doxorubicin)，和地塞米松(dexamethasone)。
[1080] 在一些实施方案中，待组合的化疗剂选自由以下各项组成的组：(来那度胺(lenalidomide))，蛋白体抑制剂(诸如 (硼替佐米(bortezomib))
和PS342)，bora taxoid(包括多西他赛(docetaxel)和紫杉醇(paclitaxel))，长春
花(诸如长春瑞滨(vinorelbine)或长春碱(vinblastine))，铂化合物(诸如卡铂
(carboplatin)或顺铂(cisplatin))，芳化酶抑制剂(诸如来曲唑(letrozole)，阿那曲唑
(anastrazole)，或依西美坦(exemestane))，抗-雌激素(例如氟维斯群(fulvestrant)
或他莫昔芬(tamoxifen))，依托泊苷(etoposide)，塞替哌(thiotepa)，环磷酰胺
(cyclophosphamide)，培美曲塞(pemetrexed)，甲氨喋呤，脂质体多柔比星(liposomal
doxorubicin)，聚乙二醇化脂质体多柔比星(pegylated liposomal doxorubicin)，卡培他
滨(capecitabine)，吉西他滨(gemcitabine)，melthalin，多柔比星(doxorubicin)，长春
新碱(vincristine)，COX-2抑制剂(例如，塞来考昔(celecoxib))，或类固醇(例如，地塞
米松(dexamethasone)和泼尼松龙(prednisone))。
和PS342)，bora taxoid(包括多西他赛(docetaxel)和紫杉醇(paclitaxel))，长春
花(诸如长春瑞滨(vinorelbine)或长春碱(vinblastine))，铂化合物(诸如卡铂
(carboplatin)或顺铂(cisplatin))，芳化酶抑制剂(诸如来曲唑(letrozole)，阿那曲唑
(anastrazole)，或依西美坦(exemestane))，抗-雌激素(例如氟维斯群(fulvestrant)
或他莫昔芬(tamoxifen))，依托泊苷(etoposide)，塞替哌(thiotepa)，环磷酰胺
(cyclophosphamide)，培美曲塞(pemetrexed)，甲氨喋呤，脂质体多柔比星(liposomal
doxorubicin)，聚乙二醇化脂质体多柔比星(pegylated liposomal doxorubicin)，卡培他
滨(capecitabine)，吉西他滨(gemcitabine)，melthalin，多柔比星(doxorubicin)，长春
新碱(vincristine)，COX-2抑制剂(例如，塞来考昔(celecoxib))，或类固醇(例如，地塞
米松(dexamethasone)和泼尼松龙(prednisone))。
[1081] 在一些实施方案(例如涉及恶性骨髓瘤(malignant myeloma)的实施方案)中，组合地塞米松(dexamethasone)和来那度胺(lenalidomide)，或地塞米松
(dexamethasone)，和硼替佐米(bortezomib)。
(dexamethasone)，和硼替佐米(bortezomib)。
[1082] 在一个其他实施方案中，组合疗法包括抗体或免疫缀合物和超过一种化疗剂。例如，抗体或免疫缀合物可以与下述各项组合：(i)长春新碱(vincristine)，多柔比
星(doxorubicin)(在脂质体或非脂质体制剂中)，和地塞米松(dexamethasone)；(ii)
沙利度胺(thalidomide)和地塞米松(dexamethasone)；(iii) (硼替佐米
(bortezomib))，多柔比星(doxorubicin)，和地塞米松(dexamethasone)；(iv)
(硼替佐米(bortezomib))，沙利度胺(thalidomide)，和地塞米松(dexamethasone)；
(v)美法仑(melphalan)和泼尼松 龙(prednisone)；(vi)美法仑(melphalan)，泼
尼松龙(prednisone)，和沙利度胺(thalidomide)；(vii)美法仑(melphalan)，泼
尼松龙(prednisone)，和 (硼替佐米(bortezomib))；(viii)长春新碱
(vincristine)，多柔比星(doxorubicin)，和地塞米松(dexamethasone)；或(ix)沙利度胺
(thalidomide)和地塞米松(dexamethasone)。
星(doxorubicin)(在脂质体或非脂质体制剂中)，和地塞米松(dexamethasone)；(ii)
沙利度胺(thalidomide)和地塞米松(dexamethasone)；(iii) (硼替佐米
(bortezomib))，多柔比星(doxorubicin)，和地塞米松(dexamethasone)；(iv)
(硼替佐米(bortezomib))，沙利度胺(thalidomide)，和地塞米松(dexamethasone)；
(v)美法仑(melphalan)和泼尼松 龙(prednisone)；(vi)美法仑(melphalan)，泼
尼松龙(prednisone)，和沙利度胺(thalidomide)；(vii)美法仑(melphalan)，泼
尼松龙(prednisone)，和 (硼替佐米(bortezomib))；(viii)长春新碱
(vincristine)，多柔比星(doxorubicin)，和地塞米松(dexamethasone)；或(ix)沙利度胺
(thalidomide)和地塞米松(dexamethasone)。
[1083] 在一个实施方案中，组合疗法可以包括本文中所述的抗体或免疫缀合物和(i) (硼替佐米(bortezomib))，(ii)地塞米松(dexamethasone)，(iii)
(来那度胺(lenalidomide))中的一种或多种。在另一个实施方案中，组
合疗法包括抗体或免疫缀合物和地塞米松(dexamethasone)和 (来
那度胺(lenalidomide))二者或 (硼替佐米(bortezomib))和地塞米松
(dexamethasone)二者。在一个其他实施方案中，组合疗法包括抗体或免疫缀合物和
(硼替佐米(bortezomib))，地塞米松(dexamethasone)和 (来那
度胺(lenalidomide))中的每一种。
(来那度胺(lenalidomide))中的一种或多种。在另一个实施方案中，组
合疗法包括抗体或免疫缀合物和地塞米松(dexamethasone)和 (来
那度胺(lenalidomide))二者或 (硼替佐米(bortezomib))和地塞米松
(dexamethasone)二者。在一个其他实施方案中，组合疗法包括抗体或免疫缀合物和
(硼替佐米(bortezomib))，地塞米松(dexamethasone)和 (来那
度胺(lenalidomide))中的每一种。
[1084] K.制品和试剂盒
[1085] 本发明的另一个实施方案是包含有效用于治疗、预防和/或诊断表达FcRH5的癌症的制品。所述制品包括容器和在容器上或与容器结合的标签或包装说明书。合适的容器
包括，例如，瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳有效治疗、预防和/或诊断癌症病症的组合物并可以具有无菌进入端口(例如，容器可以是静脉
内溶液袋 或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中至少一种活性试剂是
本发明的抗-FcRH5抗体。所述标签或包装说明书指示所述组合物用于治疗癌症。所述标
签或包装说明书还应该包括将抗体组合物施用于癌症患者的说明。另外，所述制品还可以
包括第二容器，其包含药用缓冲剂，诸如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲液、Ringer
溶液和葡萄糖溶液。其还可以包括由商业和使用者立场所需的其他材料，包括其他缓冲剂、
稀释剂、滤器、针头、和注射器。
包括，例如，瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳有效治疗、预防和/或诊断癌症病症的组合物并可以具有无菌进入端口(例如，容器可以是静脉
内溶液袋 或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中至少一种活性试剂是
本发明的抗-FcRH5抗体。所述标签或包装说明书指示所述组合物用于治疗癌症。所述标
签或包装说明书还应该包括将抗体组合物施用于癌症患者的说明。另外，所述制品还可以
包括第二容器，其包含药用缓冲剂，诸如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲液、Ringer
溶液和葡萄糖溶液。其还可以包括由商业和使用者立场所需的其他材料，包括其他缓冲剂、
稀释剂、滤器、针头、和注射器。
[1086] 还提供有效用于多种目的，例如，用于FcRH5-表达细胞杀死测定，用于细胞纯化或免疫沉淀FcRH5多肽的试剂盒。为了分离和纯化FcRH5多肽，试剂盒可以包含与珠(例
如，琼脂糖珠)偶联的抗-FcRH5抗体。可以提供包含用于体外，例如，在ELISA或Western
印迹中检测和量化FcRH5多肽的试剂盒。如关于所述制品，所述试剂盒包括容器和在容器
上或与容器结合的标签或包装说明书。所述容器容纳包含至少一种本发明的抗-FcRH5抗
体的组合物。可以包括另外的容器，其容纳，例如，稀释剂和缓冲剂，对照抗体。标签或包装说明书可以提供组合物的描述以及关于意欲的体外或检测应用的说明。
如，琼脂糖珠)偶联的抗-FcRH5抗体。可以提供包含用于体外，例如，在ELISA或Western
印迹中检测和量化FcRH5多肽的试剂盒。如关于所述制品，所述试剂盒包括容器和在容器
上或与容器结合的标签或包装说明书。所述容器容纳包含至少一种本发明的抗-FcRH5抗
体的组合物。可以包括另外的容器，其容纳，例如，稀释剂和缓冲剂，对照抗体。标签或包装说明书可以提供组合物的描述以及关于意欲的体外或检测应用的说明。
[1087] L.关于FcRH5多肽的应用
[1088] 本发明包括筛选组合物以鉴别模拟FcRH5多肽(激动剂)或抑制FcRH5多肽作用(拮抗剂)的那些化合物的方法。将关于拮抗剂药物候选者的筛选测定涉及为通过本文中
鉴别的基因来鉴别这样的化合物，所述化合物与FcRH5多肽结合或复合，或否则干扰所编
码的多肽与其他细胞蛋白质的相互作用，包括，例如，抑制由细胞表达FcRH5多肽。这样的
筛选测定应该包括可按照高通量筛选化学制品库进行的测定，这使得它们特别适合于鉴别
小分子药物候选者。
鉴别的基因来鉴别这样的化合物，所述化合物与FcRH5多肽结合或复合，或否则干扰所编
码的多肽与其他细胞蛋白质的相互作用，包括，例如，抑制由细胞表达FcRH5多肽。这样的
筛选测定应该包括可按照高通量筛选化学制品库进行的测定，这使得它们特别适合于鉴别
小分子药物候选者。
[1089] 所述测定可以以多种形式，包括蛋白-蛋白结合测定、生物化学筛选测定、免疫测定、和基于细胞的测定来进行，其在本领域中充分表征。
[1090] 关于拮抗剂的所有测定的共同之处在于它们要求药物候选者与由本文中鉴别的核酸编码的FcRH5多肽在足以容许这两种成分相互作用的条件下和时间内接触。
[1091] 在结合测定中，相互作用是结合，且形成的复合物可以在反应化合物中分离或检测。在具体的实施方案中，通过共价或非共价连接将由本文中鉴别的基因编码的FcRH5多
肽或药物候选者固定在固相上，例如，微量滴定板上。非共价连接一般通过使用FcRH5多肽
溶液包被固体表面和干燥来实现。备选地，可以使用固定的抗体，例如，单克隆抗体(其特
异于待固定的FcRH5多肽)将其锚定在固体表面上。所述测定通过将非固定成分添加至固
定成分(例如含有锚定成分的包被表面)来进行，所述非固定成分可以由可检测的标记物
来标记。当所述反应完成时，未反应的成分，例如，通过洗涤去除，并检测锚定在固体表面上的复合物。当初始非固定成分携带可检测的标记物时，所述表面上固定的标记物的检测指
示发生复合。在初始非固定成分不携带标记物的情形中，复合可以，例如，通过利用特异性
结合固定复合物的标记抗体来检测。
肽或药物候选者固定在固相上，例如，微量滴定板上。非共价连接一般通过使用FcRH5多肽
溶液包被固体表面和干燥来实现。备选地，可以使用固定的抗体，例如，单克隆抗体(其特
异于待固定的FcRH5多肽)将其锚定在固体表面上。所述测定通过将非固定成分添加至固
定成分(例如含有锚定成分的包被表面)来进行，所述非固定成分可以由可检测的标记物
来标记。当所述反应完成时，未反应的成分，例如，通过洗涤去除，并检测锚定在固体表面上的复合物。当初始非固定成分携带可检测的标记物时，所述表面上固定的标记物的检测指
示发生复合。在初始非固定成分不携带标记物的情形中，复合可以，例如，通过利用特异性
结合固定复合物的标记抗体来检测。
[1092] 如果候选化合物与由本文中鉴别的基因编码的特定FcRH5多肽相互作用但不结合，则其与该多肽的相互作用可以通过公知的用于检测蛋白-蛋白相互作用的方法来
测定。这样的测定包括传统方法，诸如，例如，交联、共同免疫沉淀、和通过梯度或层析
柱共同纯化。另外，蛋白-蛋白相互作用可以通过利用由Fields及其同事(Fields和
Song，Nature(London)(自然(伦敦))，340：245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA(美国国家科学院学报)，88：9578-9582(1991))所述的基于酵母的遗传系统来
监测，如Chevray和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，89：
5789-5793(1991)公开地。许多转录活化剂，诸如酵母GAL4，由两种物理上离散的组件结构
域组成，一种担当DNA-结合结构域，另一种起转录活化结构域的作用。前述公开物中所述
的酵母表达系统(一般称为“双杂交系统”)利用该特性，并使用两种杂合蛋白，一种中靶蛋
白与GAL4的DNA-结合结构域融合，且另一种中候选活化蛋白与活化结构域融合。受控于
GAL4-活化的启动子的GAL1-lacZ报告基因的表达取决于GAL4活性通过蛋白-蛋白相互作
用的重新形成。包含相互作用多肽的集群使用关于β-半乳糖苷酶的发色物质来检测。利
TM
用双杂交技术鉴别两种特定蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKER )
可商购自Clontech。该系统还可以延伸用于对参与特定蛋白相互作用的蛋白结构域 进行
绘图以及用于精确确定对于这些相互作用至关紧要的氨基酸残基。
测定。这样的测定包括传统方法，诸如，例如，交联、共同免疫沉淀、和通过梯度或层析
柱共同纯化。另外，蛋白-蛋白相互作用可以通过利用由Fields及其同事(Fields和
Song，Nature(London)(自然(伦敦))，340：245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA(美国国家科学院学报)，88：9578-9582(1991))所述的基于酵母的遗传系统来
监测，如Chevray和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，89：
5789-5793(1991)公开地。许多转录活化剂，诸如酵母GAL4，由两种物理上离散的组件结构
域组成，一种担当DNA-结合结构域，另一种起转录活化结构域的作用。前述公开物中所述
的酵母表达系统(一般称为“双杂交系统”)利用该特性，并使用两种杂合蛋白，一种中靶蛋
白与GAL4的DNA-结合结构域融合，且另一种中候选活化蛋白与活化结构域融合。受控于
GAL4-活化的启动子的GAL1-lacZ报告基因的表达取决于GAL4活性通过蛋白-蛋白相互作
用的重新形成。包含相互作用多肽的集群使用关于β-半乳糖苷酶的发色物质来检测。利
TM
用双杂交技术鉴别两种特定蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKER )
可商购自Clontech。该系统还可以延伸用于对参与特定蛋白相互作用的蛋白结构域 进行
绘图以及用于精确确定对于这些相互作用至关紧要的氨基酸残基。
[1093] 干扰编码本文中鉴别的FcRH5多肽的基因与其他胞内或胞外成分的相互作用的化合物可以如下测试：通常在容许基因产物和胞内或胞外成分相互作用和结合的条件下和
时间内制备含有这两种产物的反应混合物。为了测试候选化合物抑制结合的能力，反应在
不存在和存在测定化合物的条件下运行。另外，可以将安慰剂添加至第三反应混合物，其担
当阳性对照。混合物中存在的测试化合物和胞内或胞外成分之间的结合(复合物形成)如
上文所述监测。对照反应而非含有测试化合物的反应混合物中的复合物的形成表示测试化
合物干扰测试化合物及其反应配偶体的相互作用。
时间内制备含有这两种产物的反应混合物。为了测试候选化合物抑制结合的能力，反应在
不存在和存在测定化合物的条件下运行。另外，可以将安慰剂添加至第三反应混合物，其担
当阳性对照。混合物中存在的测试化合物和胞内或胞外成分之间的结合(复合物形成)如
上文所述监测。对照反应而非含有测试化合物的反应混合物中的复合物的形成表示测试化
合物干扰测试化合物及其反应配偶体的相互作用。
[1094] 为了测定拮抗剂，可以将FcRH5多肽和待筛选特殊活性的化合物添加至细胞，且该化合物在存在FcRH5多肽的条件下抑制目的活性的能力说明给化合物是FcRH5多肽的
拮抗剂。备选地，拮抗剂可以通过在关于竞争抑制测定合适的条件下组合FcRH5多肽和潜
在拮抗剂以及膜结合FcRH5多肽受体或重组受体进行检测。FcRH5多肽可以，诸如通过放
射性来标记，以使得与受体结合的FcRH5多肽分子数可以用于确定潜在拮抗剂的效力。编
码所述受体的基因可以通过本领域中技术人员已知的许多方法，例如，配体淘选和FACS分
选来鉴别。Coligan等，Current Protocols in Immun.(当前免疫学方案)，1(2)：第5章
(1991)。优选地，使用表达克隆，其中聚腺苷酸化RNA由对FcRH5多肽应答的细胞制备且由
该RNA构建的cDNA文库分为多个集合并用于转染COS细胞或不对FcRH5多肽应答的其他
细胞。在载玻片上生长的转染细胞暴露于标记的FcRH5多肽。FcRH5多肽可以通过多种手
段包括碘化或包含位点特异性蛋白激酶的识别位点来标记。固定和温育后，对载玻片进行
放射自显影分析。鉴别阳性集合(pools)并利用相互作用的亚集合和再筛选方法来制备和
再转染亚集合，最终产生编码推定受体的单克隆。
拮抗剂。备选地，拮抗剂可以通过在关于竞争抑制测定合适的条件下组合FcRH5多肽和潜
在拮抗剂以及膜结合FcRH5多肽受体或重组受体进行检测。FcRH5多肽可以，诸如通过放
射性来标记，以使得与受体结合的FcRH5多肽分子数可以用于确定潜在拮抗剂的效力。编
码所述受体的基因可以通过本领域中技术人员已知的许多方法，例如，配体淘选和FACS分
选来鉴别。Coligan等，Current Protocols in Immun.(当前免疫学方案)，1(2)：第5章
(1991)。优选地，使用表达克隆，其中聚腺苷酸化RNA由对FcRH5多肽应答的细胞制备且由
该RNA构建的cDNA文库分为多个集合并用于转染COS细胞或不对FcRH5多肽应答的其他
细胞。在载玻片上生长的转染细胞暴露于标记的FcRH5多肽。FcRH5多肽可以通过多种手
段包括碘化或包含位点特异性蛋白激酶的识别位点来标记。固定和温育后，对载玻片进行
放射自显影分析。鉴别阳性集合(pools)并利用相互作用的亚集合和再筛选方法来制备和
再转染亚集合，最终产生编码推定受体的单克隆。
[1095] 作为受体鉴别的备选方法，标记的FcRH5多肽可以与表达受体分子的细胞膜或提取物制剂光亲和性连接。交联材料通过PAGE解析并暴露于X-射线膜。含有所述受体的被
标记复合物可以切除，分解为肽片段，并进行蛋白微测序。获自微测序的氨基酸序列应该用
于设计一组简并寡核苷酸探针，以筛选cDNA文库，从而鉴别编码推定受体的基因。
标记复合物可以切除，分解为肽片段，并进行蛋白微测序。获自微测序的氨基酸序列应该用
于设计一组简并寡核苷酸探针，以筛选cDNA文库，从而鉴别编码推定受体的基因。
[1096] 在另一项关于拮抗剂的测定中，哺乳动物细胞或表达所述受体的膜制剂应该使用标记的FcRH5多肽在存在候选化合物的条件下温育。然后可以测量该化合物增强或阻断该
相互作用的能力。
相互作用的能力。
[1097] 潜在拮抗剂的更具体实例包括结合免疫球蛋白与FcRH5多肽的融合物的寡核苷酸，和，具体地，抗体包括，但不仅限于，多克隆抗体和单克隆抗体和抗体片段、单链抗体、抗-独特型抗体、和所述抗体或片段的嵌合或人源化形式、以及人抗体和抗体片段。备选
地，潜在拮抗剂可以是密切相关的蛋白，例如，识别所述受体但不施加影响的FcRH5多肽的
突变形式，由此竞争抑制FcRH5多肽的作用。
地，潜在拮抗剂可以是密切相关的蛋白，例如，识别所述受体但不施加影响的FcRH5多肽的
突变形式，由此竞争抑制FcRH5多肽的作用。
[1098] 特异性结合本文中鉴别的FcRH5多肽的抗体，以及通过前文中公开的筛选测定法鉴别的其他分子可以以药物组合物的形式施用，从而治疗不同病症，包括癌症。
[1099] 如果FcRH5多肽是胞内的且完整抗体用作抑制剂，则优选内在化抗体。然而，脂转染或脂质体也可以用于递送抗体或抗体片段至细胞中。在使用抗体片段的情形中，特异性
结合靶蛋白的结合结构域的最小抑制性片段是优选的。例如，基于抗体的可变区序列，可
以将肽分子设计为保持结合靶蛋白序列的能力。所述肽可以化学合成和/或通过重组DNA
技术产生。参见，例加，Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90：
7889-7893(1993)。
结合靶蛋白的结合结构域的最小抑制性片段是优选的。例如，基于抗体的可变区序列，可
以将肽分子设计为保持结合靶蛋白序列的能力。所述肽可以化学合成和/或通过重组DNA
技术产生。参见，例加，Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90：
7889-7893(1993)。
[1100] 本文中的制剂在对被治疗的具体适应证需要时，还可以包含多于一种活性成分，优选彼此无有害作用的具有互补活性的那些。备选地，或另外地，所述组合物可以包含增强
功能的试剂，诸如，例如，细胞毒性剂，细胞因子，化疗剂，或生长抑制剂。这样的分子适合以有效用于意欲的目的的量组合存在。
功能的试剂，诸如，例如，细胞毒性剂，细胞因子，化疗剂，或生长抑制剂。这样的分子适合以有效用于意欲的目的的量组合存在。
[1101] M.抗体衍生物
[1102] 本发明的抗体可以进一步修饰为包含本领域中已知且容易获得的另外的非蛋白质结构部分。优选地，适合于衍生化抗体的结构部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非
限制性实例包括，但不仅限于，聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，
葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯 烷酮，聚-1，3-二噁烷，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，聚
丙二醇(propropylene glycol)均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇
(例如，甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制备优势，这归因于它在水
中的稳定性。所述聚合物可以具有任意分子量，并可以是分支的或不分支的。与抗体连接
的聚合物数量可以变化，且如果连接超过一个聚合物，则它们可以是相同的或不同的分子。
一般地，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑来确定，包括，但不仅限
于待改善的抗体的具体特性或功能，抗体衍生物是否将用于在确定的条件下治疗，等。
限制性实例包括，但不仅限于，聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，
葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯 烷酮，聚-1，3-二噁烷，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，聚
丙二醇(propropylene glycol)均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇
(例如，甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制备优势，这归因于它在水
中的稳定性。所述聚合物可以具有任意分子量，并可以是分支的或不分支的。与抗体连接
的聚合物数量可以变化，且如果连接超过一个聚合物，则它们可以是相同的或不同的分子。
一般地，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑来确定，包括，但不仅限
于待改善的抗体的具体特性或功能，抗体衍生物是否将用于在确定的条件下治疗，等。
[1103] N.筛选方法
[1104] 本发明的另一个实施方案涉及确定怀疑包含FcRH5多肽的样品中FcRH5多肽存在的方法，其中所述方法包括使样品暴露于其抗体药物缀合物，所述其抗体药物缀合物与
FcRH5多肽结合，和确定所述其抗体药物缀合物与样品中FcRH5多肽的结合，其中所述结合
的存在指示样品中存在FcRH5多肽。任选地，所述样品可以含有怀疑表达FcRH5多肽的细
胞(其可以是癌细胞)。用于该包被中的所述其抗体药物缀合物可以任选地可测地标记，连
接于固体支持物，等。
FcRH5多肽结合，和确定所述其抗体药物缀合物与样品中FcRH5多肽的结合，其中所述结合
的存在指示样品中存在FcRH5多肽。任选地，所述样品可以含有怀疑表达FcRH5多肽的细
胞(其可以是癌细胞)。用于该包被中的所述其抗体药物缀合物可以任选地可测地标记，连
接于固体支持物，等。
[1105] 本发明的另一种实施方案涉及诊断哺乳动物中肿瘤存在的方法，其中所述方法包括(a)使包含获自所述哺乳动物的组织细胞的测定样品与其抗体药物缀合物相接触，所述
其抗体药物缀合物与FcRH5多肽结合，和
其抗体药物缀合物与FcRH5多肽结合，和
[1106] (b)检测所述其抗体药物缀合物和测试样品中的FcRH5多肽之间的复合物的形成，其中复合物的形成表示所述哺乳动物中存在肿瘤。任选地，所述其抗体药物缀合物可测
地标记，连接于固体支持物，等，和/或所述组织细胞测试样品获自怀疑具有癌性肿瘤的个
体。
地标记，连接于固体支持物，等，和/或所述组织细胞测试样品获自怀疑具有癌性肿瘤的个
体。
[1107] IV.使用抗-FcRH5抗体和免疫缀合物的另外的方法
[1108] A.诊断方法和检测方法
[1109] 在一方面，本发明的抗-FcRH5抗体和免疫缀合物有效用于检测生物 样品中FcRH5的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织。在某些实施方案中，所述组织包括正常和/或以相对于其他组织以
更高水平表达FcRH5的癌性组织，例如，B细胞和/或B细胞相关组织。
更高水平表达FcRH5的癌性组织，例如，B细胞和/或B细胞相关组织。
[1110] 在一方面，本发明提供检测生物样品中FcRH5的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使所述生物样品与抗-FcRH5抗体在容许抗-FcRH5抗体与FcRH5结合的条件
下相接触，和检测所述抗-FcRH5抗体和FcRH5之间是否形成复合物。
下相接触，和检测所述抗-FcRH5抗体和FcRH5之间是否形成复合物。
[1111] 在一方面，本发明提供诊断与增多的FcRH5表达相关的病症的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使测试细胞与抗-FcRH5抗体相接触；通过将所述抗-FcRH5抗体与
FcRH5的结合来确定由所述测试细胞引起的FcRH5表达水平(定量地或定性地)；和比较
由所述测试细胞引起的FcRH5表达水平和由对照细胞(例如，与所述测试细胞相同组织来
源的正常细胞或以与这样的正常细胞相当的水平表达FcRH5的细胞)引起的FcRH5表达水
平，其中与所述对照细胞相比由所述测试细胞引起的更高的FcRH5表达水平表示与增多的
FcRH5表达相关的疾病的存在。在某些实施方案中，测试细胞获自怀疑具有与增多的FcRH5
表达相关的病症的个体。在某些实施方案中，所述病症是细胞增殖病症，诸如癌症或肿瘤。
FcRH5的结合来确定由所述测试细胞引起的FcRH5表达水平(定量地或定性地)；和比较
由所述测试细胞引起的FcRH5表达水平和由对照细胞(例如，与所述测试细胞相同组织来
源的正常细胞或以与这样的正常细胞相当的水平表达FcRH5的细胞)引起的FcRH5表达水
平，其中与所述对照细胞相比由所述测试细胞引起的更高的FcRH5表达水平表示与增多的
FcRH5表达相关的疾病的存在。在某些实施方案中，测试细胞获自怀疑具有与增多的FcRH5
表达相关的病症的个体。在某些实施方案中，所述病症是细胞增殖病症，诸如癌症或肿瘤。
[1112] 可以利用本发明的抗体诊断的示范性细胞增殖病症包括B细胞病症和/或B细胞增殖病症包括，但不仅限于，淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，侵袭性NHL(aggressive NHL)，复发性侵袭性NHL，复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)，难治性NHL(refractory
NHL)，难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)，慢性淋巴细胞白血病(chronic
lymphocytic leukemia)(CLL)，小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，
白血病，多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)，急性淋巴细胞白血病(acute
lymphocytic leukemia)(ALL)，和套细胞淋巴瘤。
NHL)，难治性惰性NHL(refractory indolent NHL)，慢性淋巴细胞白血病(chronic
lymphocytic leukemia)(CLL)，小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，
白血病，多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)，急性淋巴细胞白血病(acute
lymphocytic leukemia)(ALL)，和套细胞淋巴瘤。
[1113] 在某些实施方案中，诊断或检测的方法，诸如上述那些，包括检测抗-FcRH5抗体与在细胞表面上表达的或在获自在其表面上表达FcRH5的细胞的膜制剂中的FcRH5的结
合。在某些实施方案中，所述方法包括使细胞与抗-FcRH5抗体在允许抗-FcRH5抗体与
FcRH5结合的条件下相接触， 和检测所述抗-FcRH5抗体和细胞表面上的FcRH5之间是否形
成复合物。用于检测抗-FcRH5抗体与细胞表面上表达的FcRH5的结合的示范性测定法是
“FACS”测定法。
合。在某些实施方案中，所述方法包括使细胞与抗-FcRH5抗体在允许抗-FcRH5抗体与
FcRH5结合的条件下相接触， 和检测所述抗-FcRH5抗体和细胞表面上的FcRH5之间是否形
成复合物。用于检测抗-FcRH5抗体与细胞表面上表达的FcRH5的结合的示范性测定法是
“FACS”测定法。
[1114] 可以使用某些其他方法来检测抗-FcRH5抗体与FcRH5的结合。这样的方法包括，但不仅限于，本领域中公知的抗原结合测定，诸如western印迹、放射性免疫测定、
ELISA(酶联免疫吸附试验)、“夹心式”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定、和免疫组织化学(IHC)。
ELISA(酶联免疫吸附试验)、“夹心式”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定、和免疫组织化学(IHC)。
[1115] 在某些实施方案中，抗-FcRH5抗体是标记的，标记物包括，但不仅限于，直接检测的标记物或结构部分(诸如荧光、发色、电子密集、化学发光、和放射性活性标记物)，
以及间接，例如通过酶反应或分子相互作用检测的结构部分，诸如酶或配体。示范性
32 14 125 3 131
标记物包括，但不仅限于，放射性同位素 P，C，I，H，和 I，荧光团诸如稀土螯合物
或荧光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹磺酰，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶
(luceriferases)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光
素(luciferin)，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与使用过氧化氢的酶偶联，从而氧化染料
前体诸如HRP，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定自由基，等。
以及间接，例如通过酶反应或分子相互作用检测的结构部分，诸如酶或配体。示范性
32 14 125 3 131
标记物包括，但不仅限于，放射性同位素 P，C，I，H，和 I，荧光团诸如稀土螯合物
或荧光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹磺酰，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶
(luceriferases)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光
素(luciferin)，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与使用过氧化氢的酶偶联，从而氧化染料
前体诸如HRP，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定自由基，等。
[1116] 在某些实施方案中，抗-FcRH5抗体固定在不溶性基质上。固定伴随着使抗-FcRH5抗体与在溶液中保持游离的任意FcRH5分离。这常规地通过在测定程序前使抗-FcRH5抗
体不溶解，如通过吸附于不溶于水的基质或表面(Bennich等.，U.S.3,720,760)，或通过共
价偶联(例如，利用戊二醛交联)，或通过在抗-FcRH5抗体和FcRH5之间形成复合物后使
抗-FcRH5抗体不溶解，例如，通过免疫沉淀来完成。
体不溶解，如通过吸附于不溶于水的基质或表面(Bennich等.，U.S.3,720,760)，或通过共
价偶联(例如，利用戊二醛交联)，或通过在抗-FcRH5抗体和FcRH5之间形成复合物后使
抗-FcRH5抗体不溶解，例如，通过免疫沉淀来完成。
[1117] 任意以上诊断或检测的实施方案可以利用本发明的免疫缀合物代替或附加抗-FcRH5抗体来执行。
[1118] B.治疗方法
[1119] 本发明的抗体或免疫缀合物可以，例如，体外地、先体外再体内地、或体内地用于治疗方法。在一方面，本发明提供用于体内或体外抑制细胞生长或增殖的方法，所述方法包
括使细胞在这样的条件下暴露于抗-FcRH5抗体或其免疫缀合物，所述条件容许所述缀合
物与FcRH5结合。“抑制细胞生长或增殖”意指减少细胞生长或增殖至少10％，20％，30％，
40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，或100％，并包括诱导细胞死亡。在某些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在某些实施方案中，所述细胞是B细胞。在某些实施方案中，所
述细胞是异种移植物，例如，如本文中示范地。
括使细胞在这样的条件下暴露于抗-FcRH5抗体或其免疫缀合物，所述条件容许所述缀合
物与FcRH5结合。“抑制细胞生长或增殖”意指减少细胞生长或增殖至少10％，20％，30％，
40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，或100％，并包括诱导细胞死亡。在某些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在某些实施方案中，所述细胞是B细胞。在某些实施方案中，所
述细胞是异种移植物，例如，如本文中示范地。
[1120] 在一方面，本发明的抗体或免疫缀合物用于治疗或预防B细胞增殖病症。在某些实施方案中，所述细胞增殖病症与增加的FcRH5表达和/或活性相关。例如，在某些实施方
案中，B细胞增殖病症与B细胞表面上的增加的FcRH5表达相关。在某些实施方案中，B细
胞增殖病症是肿瘤或癌症。待通过本发明的抗体或免疫缀合物治疗的B细胞增殖病症的实
例包括，但不仅限于，淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，侵袭性NHL(aggressive NHL)，复发性侵袭性NHL，复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)，难治性NHL(refractory NHL)，难
治性惰性NHL(refractory indolent NHL)，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic
leukemia)(CLL)，小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，白血病，多毛细胞白
血病(hairy cell leukemia)(HCL)，急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia)
(ALL)，和套细胞淋巴瘤。
案中，B细胞增殖病症与B细胞表面上的增加的FcRH5表达相关。在某些实施方案中，B细
胞增殖病症是肿瘤或癌症。待通过本发明的抗体或免疫缀合物治疗的B细胞增殖病症的实
例包括，但不仅限于，淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，侵袭性NHL(aggressive NHL)，复发性侵袭性NHL，复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)，难治性NHL(refractory NHL)，难
治性惰性NHL(refractory indolent NHL)，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic
leukemia)(CLL)，小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)，白血病，多毛细胞白
血病(hairy cell leukemia)(HCL)，急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia)
(ALL)，和套细胞淋巴瘤。
[1121] 在一方面，本发明提供用于治疗B细胞增殖病症的方法，其包括向个体施用有效量的抗-FcRH5抗体或其免疫缀合物。在某些实施方案中，用于治疗B细胞增殖病症的方
法包括向个体施用有效量的药物制剂，所述药物制剂包含-FcRH5抗体或抗-FcRH5免疫缀
合物和，任选地，至少一种另外的治疗剂，诸如以下提供的那些。在某些实施方案中，用于
制备细胞增殖病症的方法包括向个体施用有效量的药物制剂，所述药物制剂包含1)包含
抗-FcRH5抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物；和任选地，2)至少一种另外的治疗剂，诸如以
下提供的那些。
法包括向个体施用有效量的药物制剂，所述药物制剂包含-FcRH5抗体或抗-FcRH5免疫缀
合物和，任选地，至少一种另外的治疗剂，诸如以下提供的那些。在某些实施方案中，用于
制备细胞增殖病症的方法包括向个体施用有效量的药物制剂，所述药物制剂包含1)包含
抗-FcRH5抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物；和任选地，2)至少一种另外的治疗剂，诸如以
下提供的那些。
[1122] 在一方面，至少一些的本发明抗体或免疫缀合物可以结合来自除人以外的物种的FcRH5。因此，本发明的抗体或免疫缀合物可以用于结合，例 如，含有FcRH5的细胞培
养物中，人中，或在具有FcRH5(本发明的抗体或免疫缀合物与其交叉反应)的其他哺乳动
物(例如黑猩猩、狒狒、狨、食蟹猴、和恒河猴、猪或小鼠)中的FcRH5。在一个实施方案中，抗-FcRH5抗体或免疫缀合物可以通过以下过程靶向B细胞上的FcRH5：使所述抗体或免疫
缀合物与FcRH5相接触形成抗体或免疫缀合物-抗原复合物，从而使免疫缀合物的缀合细
胞毒素进入细胞内部。在一个实施方案中，所述FcRH5是人FcRH5。
养物中，人中，或在具有FcRH5(本发明的抗体或免疫缀合物与其交叉反应)的其他哺乳动
物(例如黑猩猩、狒狒、狨、食蟹猴、和恒河猴、猪或小鼠)中的FcRH5。在一个实施方案中，抗-FcRH5抗体或免疫缀合物可以通过以下过程靶向B细胞上的FcRH5：使所述抗体或免疫
缀合物与FcRH5相接触形成抗体或免疫缀合物-抗原复合物，从而使免疫缀合物的缀合细
胞毒素进入细胞内部。在一个实施方案中，所述FcRH5是人FcRH5。
[1123] 在一个实施方案中，抗-FcRH5抗体或免疫缀合物可以在用于结合患有与增加的FcRH5表达和/或活性相关的病症的个体中的FcRH5的方法中使用，所述方法包括向所述个
体施用所述抗体或免疫缀合物，以使得结合所述个体中的FcRH5。在一个实施方案中，结合
的抗体或免疫缀合物内在化进入表达FcRH5的B细胞。在一个实施方案中，所述FcRH5是
人FcRH5，且所述个体是人个体。备选地，所述个体可以是表达抗-FcRH5抗体与之结合的
FcRH5的哺乳动物。另外，所述个体可以是已经将FcRH5引入其中的哺乳动物(例如，通过
施用FcRH5或通过表达编码FcRH5的转基因)。
体施用所述抗体或免疫缀合物，以使得结合所述个体中的FcRH5。在一个实施方案中，结合
的抗体或免疫缀合物内在化进入表达FcRH5的B细胞。在一个实施方案中，所述FcRH5是
人FcRH5，且所述个体是人个体。备选地，所述个体可以是表达抗-FcRH5抗体与之结合的
FcRH5的哺乳动物。另外，所述个体可以是已经将FcRH5引入其中的哺乳动物(例如，通过
施用FcRH5或通过表达编码FcRH5的转基因)。
[1124] 抗-FcRH5抗体或免疫缀合物可以为了治疗目的施用于人。而且，抗-FcRH5抗体或免疫缀合物可以施用于表达所述抗体与之交叉反应的FcRH5的非人哺乳动物(例如，灵
长类动物、猪、大鼠、或小鼠)，以获得兽医目的或作为人疾病的动物模型。关于后者，所述动物模型可以有效用于评估本发明的抗体或免疫缀合物的治疗功效(例如，测试施药剂量和
时程)。
长类动物、猪、大鼠、或小鼠)，以获得兽医目的或作为人疾病的动物模型。关于后者，所述动物模型可以有效用于评估本发明的抗体或免疫缀合物的治疗功效(例如，测试施药剂量和
时程)。
[1125] 本发明的抗体或免疫缀合物在治疗中可以单独地或与其他组合物组合使用。例如，本发明的抗体或免疫缀合物可以与至少一种另外的治疗剂和/或佐剂共同施用。在
某些实施方案中，另外的治疗剂是细胞毒性剂、化疗剂、或生长抑制剂。在这样的实施方
案之一中，化疗剂是试剂或试剂组合物，诸如，例如，环磷酰胺(cyclophosphamide)，羟
基柔红霉素(hydroxydaunorubicin)，阿霉素(adriamycin)，doxorubincin，长春新碱
TM
(vincristine)(Oncovin )，泼尼松龙(prednisolone)，CHOP，CVP，或COP，或免疫治疗基诸如抗-CD20(例如， )或抗-VEGF(例如， )，其中所述组合疗法有效用
于治疗癌症和/或B细胞病症诸如B细胞增殖病症包 括淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，侵
袭性NHL(aggressive NHL)，复发性侵袭性NHL，复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)，
难治性NHL(refractory NHL)，难治性惰性NHL(refractory indolentNHL)，慢性淋巴细胞
白血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)，小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)，白血病，多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)，急性淋巴细胞白血病
(acute lymphocytic leukemia)(ALL)，和套细胞淋巴瘤。
某些实施方案中，另外的治疗剂是细胞毒性剂、化疗剂、或生长抑制剂。在这样的实施方
案之一中，化疗剂是试剂或试剂组合物，诸如，例如，环磷酰胺(cyclophosphamide)，羟
基柔红霉素(hydroxydaunorubicin)，阿霉素(adriamycin)，doxorubincin，长春新碱
TM
(vincristine)(Oncovin )，泼尼松龙(prednisolone)，CHOP，CVP，或COP，或免疫治疗基诸如抗-CD20(例如， )或抗-VEGF(例如， )，其中所述组合疗法有效用
于治疗癌症和/或B细胞病症诸如B细胞增殖病症包 括淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，侵
袭性NHL(aggressive NHL)，复发性侵袭性NHL，复发性惰性NHL(relapsed indolent NHL)，
难治性NHL(refractory NHL)，难治性惰性NHL(refractory indolentNHL)，慢性淋巴细胞
白血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)，小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic
lymphoma)，白血病，多毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)，急性淋巴细胞白血病
(acute lymphocytic leukemia)(ALL)，和套细胞淋巴瘤。
[1126] 上文提及的所述组合疗法包括组合施用(其中以同一或分别的制剂包括两种或更多治疗剂)，和分别施用，在该情形中，本发明的抗体或免疫缀合物的施用可以发生在施
用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时、和/或之后。本发明的抗体或免疫缀合物还可以与
放射性疗法组合物使用。
用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时、和/或之后。本发明的抗体或免疫缀合物还可以与
放射性疗法组合物使用。
[1127] 本发明的抗体或免疫缀合物(和任意另外的治疗剂或佐剂)可以通过任何合适的方式，包括肠胃外，皮下，腹膜内，肺内，和鼻内来施用，且如果需要，可以施用于局部治疗，病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。另外，所述抗体或免疫缀合物适合通过脉冲输注，特别是以减低的抗体或免疫缀合物剂量来施用。给药可
以通过任何合适的途径，例如，通过注射，诸如静脉内或皮下注射，其部分地取决于施药是
短暂的或持续的。
以通过任何合适的途径，例如，通过注射，诸如静脉内或皮下注射，其部分地取决于施药是
短暂的或持续的。
[1128] 本发明的抗体或免疫缀合物应该以与良好医疗实践相一致的方式配制、给药、和施用。在该背景下考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的
临床状态、病症的原因、递送试剂的位点、施药方法、施药时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。所述抗体或免疫缀合物不需要，但任选地，与一种或多种目前用于预防或治疗待讨
论病症的一种或多种试剂一起配制。所述其他试剂的有效量取决于制剂中存在的本发明抗
体或免疫缀合物的量、病症或治疗的类型、和以上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，
并使用如本文中所用的施药途径，或以本文中所述的剂量的约1-99％，或以通过经验或临
床确定合适的任意剂量和任何途径来使用。
临床状态、病症的原因、递送试剂的位点、施药方法、施药时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。所述抗体或免疫缀合物不需要，但任选地，与一种或多种目前用于预防或治疗待讨
论病症的一种或多种试剂一起配制。所述其他试剂的有效量取决于制剂中存在的本发明抗
体或免疫缀合物的量、病症或治疗的类型、和以上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，
并使用如本文中所用的施药途径，或以本文中所述的剂量的约1-99％，或以通过经验或临
床确定合适的任意剂量和任何途径来使用。
[1129] 为了预防或治疗疾病，本发明的抗体或免疫缀合物的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂，诸如化疗剂组合使用时)应该取决 于待治疗疾病的类型、抗体
或免疫缀合物的类型、疾病的严重性和进程、以预防还治疗目的施用所述抗体或免疫缀合
物、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体或免疫缀合物的应答，和主治医师的判断
力。所述抗体或免疫缀合物以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。根据疾病
的类型和严重性，约1μg/kg-100mg/kg(例如0.1mg/kg-20mg/kg)的抗体或免疫缀合物可
以是用于施用于患者的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分别施药，或通过连续
输注。一个典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提
及的因素。为了重复施用数日或更长，根据病症，应该持续治疗直至出现疾病症状的理想抑
制。所述抗体或免疫缀合物的一个示范性剂量应该在约0.05mg/kg-约10mg/kg范围内。因
此，约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)抗体或免疫缀合物的一
个或多个剂量可以施用于患者。这样的剂量可以间隔地，例如每周或每三周施用(例如以
使得患者接受约2-约20，或例如约6剂量的所述抗体或免疫缀合物)。可以施用最初较高
的负荷剂量，随后是一个或多个较低的剂量。示范性给药方案包括施用约4mg/kg的最初负
荷剂量，随后每周维持剂量约2mg/kg的抗体。然而，其它治疗方案可以是有用的。该疗法
的进展可以容易地通过常规方法和测定来监测。
或免疫缀合物的类型、疾病的严重性和进程、以预防还治疗目的施用所述抗体或免疫缀合
物、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体或免疫缀合物的应答，和主治医师的判断
力。所述抗体或免疫缀合物以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。根据疾病
的类型和严重性，约1μg/kg-100mg/kg(例如0.1mg/kg-20mg/kg)的抗体或免疫缀合物可
以是用于施用于患者的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分别施药，或通过连续
输注。一个典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提
及的因素。为了重复施用数日或更长，根据病症，应该持续治疗直至出现疾病症状的理想抑
制。所述抗体或免疫缀合物的一个示范性剂量应该在约0.05mg/kg-约10mg/kg范围内。因
此，约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)抗体或免疫缀合物的一
个或多个剂量可以施用于患者。这样的剂量可以间隔地，例如每周或每三周施用(例如以
使得患者接受约2-约20，或例如约6剂量的所述抗体或免疫缀合物)。可以施用最初较高
的负荷剂量，随后是一个或多个较低的剂量。示范性给药方案包括施用约4mg/kg的最初负
荷剂量，随后每周维持剂量约2mg/kg的抗体。然而，其它治疗方案可以是有用的。该疗法
的进展可以容易地通过常规方法和测定来监测。
[1130] C.活性测定
[1131] 本发明的抗-FcRH5抗体和免疫缀合物可以对它们的物理/化学特性和/或生物活性，通过已知的不同测定来表征。
[1132] 1.活性测定
[1133] 在一方面，提供用于鉴别具有生物学活性的抗-FcRH5抗体或其免疫缀合物的测定。生物学活性可以包括，例如，抑制细胞生长或增殖的能力(例如，“细胞杀死”活性)，或诱导细胞死亡，包括程序性细胞死亡(凋亡)的能力。还提供体内和/或体外具有这样的
生物学活性的抗体或免疫缀合物。
生物学活性的抗体或免疫缀合物。
[1134] 在某些实施方案中，测试抗-FcRH5抗体或其免疫缀合物体外抑制细 胞生长或增殖的能力。用于抑制细胞生长或增殖的测定是本领域中公知的。关于细胞增殖的某些
测定，由本文中所述的“细胞杀死”测定示范地，测量细胞生存能力。一种这样的测定是
TM
CellTiter-Glo 发光细胞生存能力测定，其可商购自Promega(Madison，WI)。该测定基于
量化ATP的存在来确定培养物中活细胞的数量，它是代谢活性细胞的指示。参见Crouch等
(1993)J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)160：81-88，美国专利号6602677。所述测定可
以以96-或384-孔形式进行，这使其容许进行自动高通量筛选(HTS)。参见Cree等(1995)
AntiCancer Drugs(抗癌药)6：398-404。所述测定程序包括将单一试剂(
试剂)直接加入至培养的细胞。这导致细胞溶解和由荧光素酶反应产生的发光信号的产
生。发光信号与ATP存在量成比例，其与培养物中存在的活细胞数量直接成比例。数据可
以由光度计或CCD相机成像装置来记录。发光输出表示为相对光单位(RLU)。
测定，由本文中所述的“细胞杀死”测定示范地，测量细胞生存能力。一种这样的测定是
TM
CellTiter-Glo 发光细胞生存能力测定，其可商购自Promega(Madison，WI)。该测定基于
量化ATP的存在来确定培养物中活细胞的数量，它是代谢活性细胞的指示。参见Crouch等
(1993)J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)160：81-88，美国专利号6602677。所述测定可
以以96-或384-孔形式进行，这使其容许进行自动高通量筛选(HTS)。参见Cree等(1995)
AntiCancer Drugs(抗癌药)6：398-404。所述测定程序包括将单一试剂(
试剂)直接加入至培养的细胞。这导致细胞溶解和由荧光素酶反应产生的发光信号的产
生。发光信号与ATP存在量成比例，其与培养物中存在的活细胞数量直接成比例。数据可
以由光度计或CCD相机成像装置来记录。发光输出表示为相对光单位(RLU)。
[1135] 另一种用于细胞增殖的测定是“MTT”测定，即通过线粒体还原酶测量3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑到的甲瞄(formazan)氧化的比色测定。如
CellTiter-GloTM测定，该测定表示细胞培养物中存在的代谢活性细胞的数量。参见，例如，Mosmann(1983)J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)65：55-63，和Zhang等(2005)Cancer
Res.(癌症研究)65：3877-3882。
CellTiter-GloTM测定，该测定表示细胞培养物中存在的代谢活性细胞的数量。参见，例如，Mosmann(1983)J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)65：55-63，和Zhang等(2005)Cancer
Res.(癌症研究)65：3877-3882。
[1136] 在一方面，测试抗-FcRH5抗体体外诱导细胞死亡的能力。关于细胞死亡诱导的测定是本领域中公知的，在一些实施方案中，这样的测定测量，例如，膜完整性的缺失，如通过碘化丙锭(PI)，台盼蓝(参见Moore等(1995)Cytotechnology(细胞技术学)，17：1-11)，
或7AAD的吸收所示。在示范性PI吸收测定中，细胞在增补10％加热灭活的FBS(Hyclone)
和2mML-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基(D-MEM)：Ham′s F-12(50：50)中培养。
因此，所述测定在不存在补体和免疫效应细胞的条件下进行。细胞在100x 20mm器皿中，以
3x106/皿的密度接种，并容许附着过夜。除去培养基并更换为单独的新鲜培养基或含有不
同浓度的所述抗体或免疫缀合物的培养基。细胞温育3天的时期。处理后，单细胞层使用
PBS洗涤并通过胰蛋白酶消化分离。细胞然后以1200rpm，4℃离心5分钟，将沉淀 物重新
悬浮在3ml冷Ca2+结合缓冲液(10mM Hepes，pH 7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)并等分到
35mm滤网加盖的12x 75管(1ml/管，3管/处理组)以去除细胞团块。管再接受PI(10μg/
ml)。样品利用 流式细胞计数器和 CellQuest软件
(Becton Dickinson)来分析。由此鉴别如通过PI吸收所确定的诱导统计学显著水平的细
胞死亡的那些抗体或免疫缀合物。
或7AAD的吸收所示。在示范性PI吸收测定中，细胞在增补10％加热灭活的FBS(Hyclone)
和2mML-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基(D-MEM)：Ham′s F-12(50：50)中培养。
因此，所述测定在不存在补体和免疫效应细胞的条件下进行。细胞在100x 20mm器皿中，以
3x106/皿的密度接种，并容许附着过夜。除去培养基并更换为单独的新鲜培养基或含有不
同浓度的所述抗体或免疫缀合物的培养基。细胞温育3天的时期。处理后，单细胞层使用
PBS洗涤并通过胰蛋白酶消化分离。细胞然后以1200rpm，4℃离心5分钟，将沉淀 物重新
悬浮在3ml冷Ca2+结合缓冲液(10mM Hepes，pH 7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)并等分到
35mm滤网加盖的12x 75管(1ml/管，3管/处理组)以去除细胞团块。管再接受PI(10μg/
ml)。样品利用 流式细胞计数器和 CellQuest软件
(Becton Dickinson)来分析。由此鉴别如通过PI吸收所确定的诱导统计学显著水平的细
胞死亡的那些抗体或免疫缀合物。
[1137] 在一方面，测试抗-FcRH5抗体或免疫缀合物体外诱导凋亡(程序性细胞死亡)的能力。关于诱导凋亡的抗体或免疫缀合物的示范性测定是膜联蛋白(annexin)结合测定。
在示范性膜联蛋白结合测定中，如前段所讨论地在器皿中培养和接种细胞。除去培养基并
更换为单独的新鲜培养基或含有0.001-10μg/ml所述抗体或免疫缀合物的培养基。3天温
育期后，单细胞层使用PBS洗涤并通过胰蛋白酶消化分离。细胞然后离心，重新悬浮在Ca2+
结合缓冲液中，并如前段所讨论地等分到管中。管再接受标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白
V-FITC)(1μg/ml)。样品利用FACSCANTM流式细胞计数器和FACSCONVERTTM CellQuest软件
(BD Biosciences)来分析。由此鉴别相对于对照诱导统计学显著水平的膜联蛋白结合的抗
体或免疫缀合物。关于诱导凋亡的抗体或免疫缀合物的另一种示范性测定是用于检测基因
组DNA核小体间降解的组蛋白DNA ELISA比色测定。这样的测定可以利用，例如，细胞死亡
检测ELISA试剂盒(Roche(罗氏)，Palo Alto，CA)来进行。
在示范性膜联蛋白结合测定中，如前段所讨论地在器皿中培养和接种细胞。除去培养基并
更换为单独的新鲜培养基或含有0.001-10μg/ml所述抗体或免疫缀合物的培养基。3天温
育期后，单细胞层使用PBS洗涤并通过胰蛋白酶消化分离。细胞然后离心，重新悬浮在Ca2+
结合缓冲液中，并如前段所讨论地等分到管中。管再接受标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白
V-FITC)(1μg/ml)。样品利用FACSCANTM流式细胞计数器和FACSCONVERTTM CellQuest软件
(BD Biosciences)来分析。由此鉴别相对于对照诱导统计学显著水平的膜联蛋白结合的抗
体或免疫缀合物。关于诱导凋亡的抗体或免疫缀合物的另一种示范性测定是用于检测基因
组DNA核小体间降解的组蛋白DNA ELISA比色测定。这样的测定可以利用，例如，细胞死亡
检测ELISA试剂盒(Roche(罗氏)，Palo Alto，CA)来进行。
[1138] 在任何以上体外测定中使用的细胞包括天然表达FcRH5或已经改造为表达FcRH5的细胞或细胞系。这样的细胞包括与相同组织来源的正常细胞相比过表达FcRH5的肿瘤细
胞。这样的细胞还包括表达FcRH5细胞系(包括肿瘤细胞系)和正常不表达FcRH5但已经
用编码FcRH5的核酸转染的细胞系。
胞。这样的细胞还包括表达FcRH5细胞系(包括肿瘤细胞系)和正常不表达FcRH5但已经
用编码FcRH5的核酸转染的细胞系。
[1139] 在一方面，测试抗-FcRH5抗体或其免疫缀合物体内抑制细胞生长或增殖的能力。在某些实施方案中，测试抗-FcRH5抗体或其免疫缀合物体内抑制肿瘤生长的能力。体内
模型系统，诸如异种移植模型，可以用于所述测试。在示范性异种移植系统中，将人肿瘤细
胞引入至适当免疫受损的非人动物，例如，SCID小鼠。将本发明的抗体或免疫缀合物施用
于所述 动物。测量所述抗体或免疫缀合物抑制或减小肿瘤生长的能力。在以上异种移植
系统的某些实施方案中，人肿瘤细胞是来自人患者的肿瘤细胞。这样的有效用于制备异种
移植模型的细胞包括人白血病和淋巴瘤细胞系，其包括但不仅限于BJAB-luc细胞(用荧
光素酶报告基因转染的EBV-阴性Burkitt淋巴瘤细胞系)，Ramos细胞(ATCC，Manassas，
VA，CRL-1923)，SuDHL-4细胞(DSMZ，Braunschweig，德国，AAC 495)，DoHH2细胞(参见
Kluin-Neilemans，H.C.等，Leukemia(白血病)5：221-224(1991)，和Kluin-Neilemans，
H.C.等，Leukemia( 白 血 病 )8：1385-1391(1994))，Granta-519 细 胞 (see Jadayel，
D.M.等，Leukemia(白血病)11(1)：64-72(1997))。在某些实施方案中，通过皮下注射或通
过植入合适位点，诸如哺乳动物脂肪垫，将人肿瘤细胞引入至适当免疫受损的非人动物。
模型系统，诸如异种移植模型，可以用于所述测试。在示范性异种移植系统中，将人肿瘤细
胞引入至适当免疫受损的非人动物，例如，SCID小鼠。将本发明的抗体或免疫缀合物施用
于所述 动物。测量所述抗体或免疫缀合物抑制或减小肿瘤生长的能力。在以上异种移植
系统的某些实施方案中，人肿瘤细胞是来自人患者的肿瘤细胞。这样的有效用于制备异种
移植模型的细胞包括人白血病和淋巴瘤细胞系，其包括但不仅限于BJAB-luc细胞(用荧
光素酶报告基因转染的EBV-阴性Burkitt淋巴瘤细胞系)，Ramos细胞(ATCC，Manassas，
VA，CRL-1923)，SuDHL-4细胞(DSMZ，Braunschweig，德国，AAC 495)，DoHH2细胞(参见
Kluin-Neilemans，H.C.等，Leukemia(白血病)5：221-224(1991)，和Kluin-Neilemans，
H.C.等，Leukemia( 白 血 病 )8：1385-1391(1994))，Granta-519 细 胞 (see Jadayel，
D.M.等，Leukemia(白血病)11(1)：64-72(1997))。在某些实施方案中，通过皮下注射或通
过植入合适位点，诸如哺乳动物脂肪垫，将人肿瘤细胞引入至适当免疫受损的非人动物。
[1140] 2.结合测定和其他测定
[1141] 在一方面，测试抗-FcRH5抗体的抗原结合活性。例如，在某些实施方案中，测试抗-FcRH5抗体结合细胞表面上表达的FcRH5的能力。FACS测定可以用于这样的测试。
[1142] 在一方面，可以使用竞争测定来鉴别与鼠13G9抗体(mu13G9)，人源化13G9抗体和/或人源化13G9.v1和/或人源化13G9.v3和/或人源化13G9.v8抗体竞争结合
FcRH5的单克隆抗体。在某些实施方案中，这样的竞争抗体结合与由鼠13G9抗体，人源化
13G9.v1抗体和/或人源化13G9.v3抗体和/或人源化13G9.v8结合的表位相同的表位
(例如，线性或构象表位)。示范性竞争测定包括，但不仅限于，常规测定，诸如Harlow和
Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)第14章(Cold Spring
Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，NY)中提供的那些。
用于对抗体结合的表位进行绘图的详细示范性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping
Protocols(表位绘图流程)，”Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)卷
66(Humana Press，Totowa，NJ)中提供。认为两种抗体结合相同的表位，条件是每种阻断另
一种的结合50％以上。
FcRH5的单克隆抗体。在某些实施方案中，这样的竞争抗体结合与由鼠13G9抗体，人源化
13G9.v1抗体和/或人源化13G9.v3抗体和/或人源化13G9.v8结合的表位相同的表位
(例如，线性或构象表位)。示范性竞争测定包括，但不仅限于，常规测定，诸如Harlow和
Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)第14章(Cold Spring
Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，NY)中提供的那些。
用于对抗体结合的表位进行绘图的详细示范性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping
Protocols(表位绘图流程)，”Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)卷
66(Humana Press，Totowa，NJ)中提供。认为两种抗体结合相同的表位，条件是每种阻断另
一种的结合50％以上。
[1143] 在示范性竞争测定中，固定的FcRH5在包含结合FcRH5的第一标记 抗体(例如，鼠13G9(mu13G9)抗体，嵌合13G9(ch13G9)，和/或人源化13G9(hu13G9)抗体)和被测试其
与所述第一抗体竞争结合FcRH5的能力的第二未标记抗体的溶液中温育。所述第二抗体可
以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，固定的FcRH5在包含所述第一标记抗体但无所述第
二未标记抗体的溶液中温育。在容许所述第一抗体与FcRH5结合的条件下温育后，去除过
滤未结合的过量抗体，测量与固定的FcRH5相关的标记物量。如果与固定的FcRH5相关的
标记物量在测试样品中相对于对照样品实质减少，则这说明所述第二抗体与所述第一抗体
竞争结合FcRH5。在某些实施方案中，固定的FcRH5存在于细胞表面上或在获自在其表面上
表达FcRH5的细胞的膜制剂中。
与所述第一抗体竞争结合FcRH5的能力的第二未标记抗体的溶液中温育。所述第二抗体可
以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，固定的FcRH5在包含所述第一标记抗体但无所述第
二未标记抗体的溶液中温育。在容许所述第一抗体与FcRH5结合的条件下温育后，去除过
滤未结合的过量抗体，测量与固定的FcRH5相关的标记物量。如果与固定的FcRH5相关的
标记物量在测试样品中相对于对照样品实质减少，则这说明所述第二抗体与所述第一抗体
竞争结合FcRH5。在某些实施方案中，固定的FcRH5存在于细胞表面上或在获自在其表面上
表达FcRH5的细胞的膜制剂中。
[1144] 在一方面，纯化的抗-FcRH5抗体可以进一步通过一系列测定，包括，但不仅限于，N-端测序，氨基酸分析，非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)，质谱法，离子交换层析和木
瓜蛋白酶消化来表征。
瓜蛋白酶消化来表征。
[1145] 在一个实施方案中，本发明预期具有一些但非全部效应子功能的改变的抗体，这使其成为对于其中抗体体内半衰期很重要但某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必
要的或有害的许多应用的理想候选者。在某些实施方案中，测量所述抗体的Fc活性，从而
确保仅保持所需的特性。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定来验证CDC和/或ADCC
活性的降低/消失。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保所述抗体缺乏FcyR
结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。用于介导初级细胞，NK细胞，表
达Fc(仅RIII，而单核细胞表达Fc(RI，Fc(RII和Fc(RIII。造血细胞上的FcR表达总结
在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)9：457-92(1991)的第464页
表3中。用于评估目标分子ADCC活性的体外测定的实例记述在美国专利号5,500,362或
5,821,337中。对于这样的测定有效的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤
(NK)细胞。备选地，或另外，目标分子的ADCC活性可以，例如，在动物模型诸如在Clynes等
PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估。还可以进行C1q结合测定，
以验证所述抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。为了评估补体活性，可以进行CDC测
定，例如，如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志) 202：163(1996)
中所述。还可以利用本领域中已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期确定。
要的或有害的许多应用的理想候选者。在某些实施方案中，测量所述抗体的Fc活性，从而
确保仅保持所需的特性。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定来验证CDC和/或ADCC
活性的降低/消失。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保所述抗体缺乏FcyR
结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。用于介导初级细胞，NK细胞，表
达Fc(仅RIII，而单核细胞表达Fc(RI，Fc(RII和Fc(RIII。造血细胞上的FcR表达总结
在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)9：457-92(1991)的第464页
表3中。用于评估目标分子ADCC活性的体外测定的实例记述在美国专利号5,500,362或
5,821,337中。对于这样的测定有效的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤
(NK)细胞。备选地，或另外，目标分子的ADCC活性可以，例如，在动物模型诸如在Clynes等
PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估。还可以进行C1q结合测定，
以验证所述抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。为了评估补体活性，可以进行CDC测
定，例如，如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志) 202：163(1996)
中所述。还可以利用本领域中已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期确定。
[1146] 以下实施例仅为了举例说明的目的提供，且不意欲以任何方式限制本发明的范围。
[1147] 本说明书中引用的全部专利和文献参考由此通过参考整体引入本文。实施例
[1148] 实施例中提及的可商购试剂根据生产商说明书使用，除非另外指示。实施例中使用的抗体是可商购的抗体或本文中所述的抗体。以下实施例中和整个说明书中通过ATCC
登记号识别的那些细胞的来源是American Type Culture Collection(美国典型培养物中
心)，Manassas，VA。
登记号识别的那些细胞的来源是American Type Culture Collection(美国典型培养物中
心)，Manassas，VA。
[1149] 实施例1：制备结合FcRH5的抗体
[1150] 该实施例举例说明可以特异性结合FcRH5的单克隆抗体的制备。
[1151] 用于产生所述单克隆的技术是本领域中已知的且记述在，例如，Goding，见上中。可以使用的免疫原包括纯化的FcRH5、包含FcRH5的融合蛋白、和在细胞表面上表达重组
FcRH5的细胞。免疫原的选择可以在不需要过多实验的条件下，由技术人员进行。
FcRH5的细胞。免疫原的选择可以在不需要过多实验的条件下，由技术人员进行。
[1152] 小鼠，诸如Balb/c，使用在完全Freund佐剂中乳化的FcRH5免疫原来免疫并以1-100微克的量皮下或腹膜内注射。备选地，所述免疫原在MPL-TDM佐剂(Ribi
Immunochemical Research(Ribi免疫化学研究)，Hamilton，MT)中乳化，并注射到动物后
足垫中。免疫的小鼠然后在10-12天后，用在所选佐剂中乳化的另外的免疫原加强。其后，
在数周内，小鼠还可以用另外的免疫注射来加强。血清样品可以周期性地通过眼窝后获自
小鼠，从而在ELISA测定中测试，以检测抗-FcRH5抗体。
Immunochemical Research(Ribi免疫化学研究)，Hamilton，MT)中乳化，并注射到动物后
足垫中。免疫的小鼠然后在10-12天后，用在所选佐剂中乳化的另外的免疫原加强。其后，
在数周内，小鼠还可以用另外的免疫注射来加强。血清样品可以周期性地通过眼窝后获自
小鼠，从而在ELISA测定中测试，以检测抗-FcRH5抗体。
[1153] 在已经检测了合适的抗体效价后，可以用最终静脉内免疫原注射来注射关于抗体“阳性”的动物。3-4天后，处死小鼠并收获脾细胞。脾细胞然后与所选择的鼠骨髓瘤细胞
系诸如P3X63AgU.1(获自ATCC，No.CRL1597)融合(利用35％聚乙二醇)。融合物产生杂
交瘤细胞，所述杂交瘤细胞可以然后在含有HAT(次黄嘌呤，氨喋呤，和胸苷)培养基的96
孔组织 培养板中涂布，从而抑制非融合细胞、骨髓瘤杂种、和脾细胞杂种的增殖。
系诸如P3X63AgU.1(获自ATCC，No.CRL1597)融合(利用35％聚乙二醇)。融合物产生杂
交瘤细胞，所述杂交瘤细胞可以然后在含有HAT(次黄嘌呤，氨喋呤，和胸苷)培养基的96
孔组织 培养板中涂布，从而抑制非融合细胞、骨髓瘤杂种、和脾细胞杂种的增殖。
[1154] 杂交瘤细胞应该在ELISA中筛选，以获得针对免疫原的反应性。确定分泌所需的针对免疫原的单克隆抗体的“阳性”杂交瘤细胞属于本领域中的技术。
[1155] 阳性杂交瘤细胞可以通过腹膜内注射到同系基因Balb/c小鼠中，以产生含有抗免疫原单克隆抗体的腹水。备选地，所述杂交瘤细胞可以在组织培养瓶或滚瓶中生长。纯
化在腹水中产生的单克隆抗体可以利用硫酸铵沉淀，及随后通过凝胶排阻层析法完成。备
选地，可以使用基于抗体与蛋白A或蛋白G的结合的亲合层析。
化在腹水中产生的单克隆抗体可以利用硫酸铵沉淀，及随后通过凝胶排阻层析法完成。备
选地，可以使用基于抗体与蛋白A或蛋白G的结合的亲合层析。
[1156] 本文中公开的针对FcRH5多肽的抗体可以利用该技术成功地产生。更特别地，能够识别和结合FcRH5蛋白(如通过标准ELISA，FACS分选分析和/或免疫组织化学
分析测量)的功能性单克隆抗体可以针对如本文中所公开的如下FcRH5蛋白成功产生：
PRO820(DNA56041)，PRO52387(DNA257845)。
分析测量)的功能性单克隆抗体可以针对如本文中所公开的如下FcRH5蛋白成功产生：
PRO820(DNA56041)，PRO52387(DNA257845)。
[1157] 除制备针对如本文中所述的FcRH5多肽的单克隆抗体以外，许多单克隆抗体可以成功地与细胞毒素缀合，以用于指引细胞毒素到表达目标FcRH5多肽的细胞(或组织)(体
外和体内)。例如，可以针对如本文中所述的以下FcRH5多肽成功地产生毒素(例如，DM1)
来源的单克隆抗体：PRO820(DNA56041)，PRO52387(DNA257845)。
外和体内)。例如，可以针对如本文中所述的以下FcRH5多肽成功地产生毒素(例如，DM1)
来源的单克隆抗体：PRO820(DNA56041)，PRO52387(DNA257845)。
[1158] A.产生FcRH5/IRTA2(PRO820，PRO52387)稳定细胞系
[1159] 为了制备用于筛选FcRH5抗体的细胞系，产生稳定表达标记的和未标记的FcRH5/IRTA2的SVT2小鼠成纤维细胞细胞系。FcRH5/IRTA2cDNA从脾细胞文库PCR扩增并TA克隆
(Invitrogen)至pCR4中。为了制备未标记的表达构建体，通过利用PCR将可读框(ORFs)
克隆至哺乳动物表达载体pCMV.PD.nbe中，以将限制性位点、PCR产物消化和连接加入至
载体中。N-端标记的表达构建体通过在无信号序列和PCR产物连接的条件下将FcRH5/
IRTA2ORFs扩增到包含gD标记物和信号序列(M G G TA A R L G A V I L F V V I V G
H G V R G K Y A L A D A S L K M A DP N R F R G K D L P V L D Q L L)(SEQ ID NO：
1)的pMSCVneo(Clontech) 载体中来制备。关于各FcRH5/IRTA2，构建两种稳定的细胞系，
以用于筛选单克隆抗体的FACS特异性反应性和FcRH/IRTAs之间的交叉反应性。将gD-标
记的和未标记的表达载体通过标准Lipofectamine 2000(Invitrogen；Carlsbad，Ca)流
程转染到SVT2(在高葡萄糖DMEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺细胞中生长)中。将gD-标
记的转化体置于0.5mg/ml遗传霉素(Invitrogen；Carlsbad，Ca)选择下一周，并然后使
用gD-标记的特异性单克隆抗体(gD：952，Genentech；South San Francisco)分选单细
胞FACS，以获得最高表达克隆。将未标记的转化体置于5.0ug/ml嘌呤霉素(puromycin)
(Calbiochem；La Jolla，Ca)选择下，直至可视的集落长出。来自各集落的RNA通过标准
(Invitrogen；Carlsbad，Ca)流程和 (ABI；Foster City，Ca)运行来分
离，以确定最高产生克隆。
(Invitrogen)至pCR4中。为了制备未标记的表达构建体，通过利用PCR将可读框(ORFs)
克隆至哺乳动物表达载体pCMV.PD.nbe中，以将限制性位点、PCR产物消化和连接加入至
载体中。N-端标记的表达构建体通过在无信号序列和PCR产物连接的条件下将FcRH5/
IRTA2ORFs扩增到包含gD标记物和信号序列(M G G TA A R L G A V I L F V V I V G
H G V R G K Y A L A D A S L K M A DP N R F R G K D L P V L D Q L L)(SEQ ID NO：
1)的pMSCVneo(Clontech) 载体中来制备。关于各FcRH5/IRTA2，构建两种稳定的细胞系，
以用于筛选单克隆抗体的FACS特异性反应性和FcRH/IRTAs之间的交叉反应性。将gD-标
记的和未标记的表达载体通过标准Lipofectamine 2000(Invitrogen；Carlsbad，Ca)流
程转染到SVT2(在高葡萄糖DMEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺细胞中生长)中。将gD-标
记的转化体置于0.5mg/ml遗传霉素(Invitrogen；Carlsbad，Ca)选择下一周，并然后使
用gD-标记的特异性单克隆抗体(gD：952，Genentech；South San Francisco)分选单细
胞FACS，以获得最高表达克隆。将未标记的转化体置于5.0ug/ml嘌呤霉素(puromycin)
(Calbiochem；La Jolla，Ca)选择下，直至可视的集落长出。来自各集落的RNA通过标准
(Invitrogen；Carlsbad，Ca)流程和 (ABI；Foster City，Ca)运行来分
离，以确定最高产生克隆。
[1160] B.产生针对FcRH5/IRTA2(PRO820，PRO52387)的单克隆抗体
[1161] 制备能够结合人FcRH5的鼠单克隆抗体。
[1162] 用于免疫小鼠的蛋白通过将表达His-标记的FcRH5/IRTA2胞外结构域的载体瞬时转染到CHO细胞中而产生。在镍柱上从转染的细胞上清液中纯化蛋白，并通过N-端测序
验证蛋白的特征。
验证蛋白的特征。
[1163] 10只Balb/c小鼠(Charles River Laboratories(查尔斯河实验室)，Hollister，CA)用重组聚组氨酸-标记(HIS6(SEQ ID NO：69))蛋白，在Ribi佐剂(Ribi Immunochem
Research，Inc.(Ribi免疫研究公司)，Hamilton，MO)中进行超免疫。来自通过直接ELISA证
明针对免疫原的高抗体效价和通过FACS证明与稳定表达目的FcRH的SVT2小鼠成纤维细
胞细胞特异性结合的小鼠的B细胞，利用类似于一种以前所述的流程(Kohler和Milstein，
1975；Hongo等，1995)的改良流程，与小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653；American Type
Culture Collection(美国典型培养物中心)，Rockville，MD)融合。10-12天后，收获上清
液并通过直接ELISA和FACS筛选抗体产物和结合。对阳性克隆，其通过限制稀释显示在第
二轮亚克隆后的最高免疫结合，进行增殖和培养，从而进一步表征，包括FcRH1，-2，-3，-4，和-5特异性和交叉反应性。由各杂交瘤谱系收获的上清液通过亲合层析(Pharmacia fast
protein liquid chromatography(Pharmacia快速蛋白液相层 析)[FPLC]；Pharmacia，
Uppsala，瑞典)，利用类似于一种以前所述的流程(Hongo等，1995)的改良流程来纯化。纯
化的抗体制剂然后进行无菌过滤(0.2-μm孔大小；Nalgene，Rochester NY)并以4℃保存
在磷酸盐缓冲液(PBS)中。
Research，Inc.(Ribi免疫研究公司)，Hamilton，MO)中进行超免疫。来自通过直接ELISA证
明针对免疫原的高抗体效价和通过FACS证明与稳定表达目的FcRH的SVT2小鼠成纤维细
胞细胞特异性结合的小鼠的B细胞，利用类似于一种以前所述的流程(Kohler和Milstein，
1975；Hongo等，1995)的改良流程，与小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653；American Type
Culture Collection(美国典型培养物中心)，Rockville，MD)融合。10-12天后，收获上清
液并通过直接ELISA和FACS筛选抗体产物和结合。对阳性克隆，其通过限制稀释显示在第
二轮亚克隆后的最高免疫结合，进行增殖和培养，从而进一步表征，包括FcRH1，-2，-3，-4，和-5特异性和交叉反应性。由各杂交瘤谱系收获的上清液通过亲合层析(Pharmacia fast
protein liquid chromatography(Pharmacia快速蛋白液相层 析)[FPLC]；Pharmacia，
Uppsala，瑞典)，利用类似于一种以前所述的流程(Hongo等，1995)的改良流程来纯化。纯
化的抗体制剂然后进行无菌过滤(0.2-μm孔大小；Nalgene，Rochester NY)并以4℃保存
在磷酸盐缓冲液(PBS)中。
[1164] 能够识别和结合FcRH5蛋白的(如通过标准ELISA，FACS分选分析和/或免疫组织化学分析测量地)的单克隆抗体已经针对PRO52837(FcRH5c/IRTA2c)成功产生并已经命
名为：
名为：
[1165] -FcRH5-9E2(本文中称为9E2或9E2.1.1)(ATCC No.PTA-7207，保藏于2005年11月9日)，
[1166] 抗-FcRH5-1H4(本文中称为1H4或1H4.1.1)(ATCC No.PTA-7208，保藏于2005年11月9日)，
[1167] 抗-FcRH5-13G9(本文中称为13G9或13G9.1.1)(本文中所述)，
[1168] 抗-FcRH5-4D10(本文中称为4D10或4D10.1.1)(ATCC No.PTA-7210，保藏于2005年11月9日)，
[1169] 抗-FcRH5-6H1(本文中称为6H1或6H1.1.1)(ATCC No.PTA-7211，保藏于2005年11月9日)，
[1170] 抗-FcRH5-8H6(本文中称为8H6或8H6.1.1)(ATCC No.PTA-7212，保藏于2005年11月9日)，
[1171] 抗-FcRH5-7D11(本文中称为7D11或7D11.1.1)(本文中所述)，
[1172] 抗-FcRH5-10A8(本文中称为10A8或10A8.1.1)(记述在美国临时专利申请号61/211,695(2009年 4月1日提 交)，61/166,217(2009年4月 2日提 交)，和
61/266,972(2009年12月4日提交))。
61/266,972(2009年12月4日提交))。
[1173] 1.亲和性确定(Biacore分析)
[1174] IgG的FcRH-结合亲和性由利用Biacore 2000表面等离振子共振系统(BIAcore，Inc.)测量的结合和解离速度常数来计算。激活生物传感器芯片，从而利用N-乙
基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-盐酸碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，根据
供应商的说明书(BIAcore，Inc.)来共价偶联任一抗-鼠IgG(BR-1008-338)。简言之，关
于每个动力学分析周期，在芯片上捕获5ul100nM IgG，以流速20ul/min注射不同FcRH的
两倍连续稀释物150 秒。在再生前监测抗原解离180秒。25℃的平衡解离常数通过使用
1∶1Langmuir结合模型拟合数据。运行的缓冲液是具有0.05％吐温-20的PBS。结果显
示在下表9中。所有抗体以足以作为治疗剂使用的亲和性结合抗原。
基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-盐酸碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，根据
供应商的说明书(BIAcore，Inc.)来共价偶联任一抗-鼠IgG(BR-1008-338)。简言之，关
于每个动力学分析周期，在芯片上捕获5ul100nM IgG，以流速20ul/min注射不同FcRH的
两倍连续稀释物150 秒。在再生前监测抗原解离180秒。25℃的平衡解离常数通过使用
1∶1Langmuir结合模型拟合数据。运行的缓冲液是具有0.05％吐温-20的PBS。结果显
示在下表9中。所有抗体以足以作为治疗剂使用的亲和性结合抗原。
[1175] 表9
[1176]*
[1177] 在饱和浓度非常微小
[1178] C.构建和测序嵌合抗人FcRH5抗体
[1179] 1.嵌合抗人FcRH5抗体7D11(ch7D11)
[1180] 为了构建嵌合7D11IgG1，利用Qiagen RNeasy小试剂盒(Cat#74104)和生产商建议的流程，由7D11杂交瘤细胞提取总RNA。使用为7D11单克隆抗体的轻链和重链获得的
N-端氨基酸序列，设计特异于各条链的PCR引物。将RT-PCR的反向引物设计为匹配与N-端
序列相对应的基因家族的构架4。引物也设计为加入用于克隆的所需限制性位点。关于轻
链，这些在N-端是EcoRV，且在构架4的3′末端是KpnI。关于重链，加入的位点在N-端是
BsiWI，且在VH-CH1连接稍微下游处是ApaI。引物序列如下：
N-端氨基酸序列，设计特异于各条链的PCR引物。将RT-PCR的反向引物设计为匹配与N-端
序列相对应的基因家族的构架4。引物也设计为加入用于克隆的所需限制性位点。关于轻
链，这些在N-端是EcoRV，且在构架4的3′末端是KpnI。关于重链，加入的位点在N-端是
BsiWI，且在VH-CH1连接稍微下游处是ApaI。引物序列如下：
[1181] 7D11LCF.EcoRV(7D11轻链正向引物)：
[1182] 5’-GATCGATATCYTGCTSACMCARTGTCCAGC-3’(SEQ ID NO：2)
[1183] (B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T.S＝G/C，H＝A/T/C)
[1184] C7F7LC R.KpnI(7D11轻链反向引物)：
[1185] 5’-TTTDAKYTCCAGCTIGGTACC-3’(SEQ ID NO：3)
[1186] (B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T.S＝G/C，H＝A/T/C)
[1187] 1D1(IIID-2)HCF.BsiWI(7D11重链正向引物)：
[1188] 5’-GATCGACGTACGCTGARGTGCARYTGGTGGARTCTGG-3’(SEQ ID NO：4)
[1189] (B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T.S＝G/C，H＝A/T/C)
[1190] C7F7HC R.ApaI(7D11重链反向引物)：
[1191] 5’-ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3’(SEQ ID NO：5)
[1192] (B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T.S＝G/C，H＝A/T/C)
[1193] 关于轻链和重链的RT-PCR反应利用Qiagen一步式RT-PCR试剂盒(Cat#210210)和建议的反应混合物和条件来进行。以前已经记述了用于哺乳动物细胞表达IgG的pRK
载体(Gorman等，DNA Prot Eng Tech(DNA蛋白改造技术)2：3-10(1990)。载体已经被改
进并具有引入的某些核酸限制性内切酶识别位点，以促进克隆和表达(Shields等，J Biol
Chem(生物化学杂志)2000；276：6591-6604)。将扩增的VL克隆至包含人κ恒定结构域
的pRK哺乳动物细胞表达载体(pRK.LPG3.HumanKappa)中。将扩增的VH插入至编码全长
人IgG1恒定结构域的pRK哺乳动物细胞表达载体(pRK.LPG4.HumanHC)中。
载体(Gorman等，DNA Prot Eng Tech(DNA蛋白改造技术)2：3-10(1990)。载体已经被改
进并具有引入的某些核酸限制性内切酶识别位点，以促进克隆和表达(Shields等，J Biol
Chem(生物化学杂志)2000；276：6591-6604)。将扩增的VL克隆至包含人κ恒定结构域
的pRK哺乳动物细胞表达载体(pRK.LPG3.HumanKappa)中。将扩增的VH插入至编码全长
人IgG1恒定结构域的pRK哺乳动物细胞表达载体(pRK.LPG4.HumanHC)中。
[1194] 关于由此产生的抗-人FcRH5(ch7D11)的鼠-人嵌合轻链(图1)和重链(图3)的完整编码区获得DNA序列。关于由该DNA编码的鼠-人嵌合轻链和重链的编码多肽分别
显示在图2和4中。DNA测序后，分析质粒的表达。
显示在图2和4中。DNA测序后，分析质粒的表达。
[1195] 在293(腺病毒-转化的人胚胎肾细胞系(Graham等，J.Gen.Virol.(遗 传病毒学杂志)，36：59-74(1977))中瞬间转染质粒。具体地，在转染前一天分解293细胞，并将其
涂布在含有血清的培养基中。在第二天，加入作为磷酸钙沉淀物制备的双链DNA，随后加入
TM
pAdVAntage DNA(Promega，Madison，WI)，并在37C温育细胞过夜。将细胞在无血清培养基
中培养并在4天后收获。在蛋白A柱上由转染的细胞上清液纯化抗体蛋白，并然后将缓冲
液更换为10mM琥珀酸钠，140mM NaCl，pH 6.0，并使用Centricon-10(Amicon)来浓缩。通
过N-端测序验证蛋白的特征。蛋白浓度通过定量氨基酸分析来确定。通过FACS，在SVT2
细胞中测试抗体与人FcRH5的结合，如下所述。
涂布在含有血清的培养基中。在第二天，加入作为磷酸钙沉淀物制备的双链DNA，随后加入
TM
pAdVAntage DNA(Promega，Madison，WI)，并在37C温育细胞过夜。将细胞在无血清培养基
中培养并在4天后收获。在蛋白A柱上由转染的细胞上清液纯化抗体蛋白，并然后将缓冲
液更换为10mM琥珀酸钠，140mM NaCl，pH 6.0，并使用Centricon-10(Amicon)来浓缩。通
过N-端测序验证蛋白的特征。蛋白浓度通过定量氨基酸分析来确定。通过FACS，在SVT2
细胞中测试抗体与人FcRH5的结合，如下所述。
[1196] 2.嵌合抗-人FcRH5抗体10A8(ch10A8)
[1197] 抗体10A8作为一组抗-人FcRH5杂交瘤的成员获得。这些抗体的小鼠/人嵌合体利用RT-PCR构建，从而利用总mRNA作为底物来扩增杂交瘤轻链和重链的可变结构
域。将轻链可变结构域克隆至包含人恒定κ结构域的载体pRK.LPG3.HumanKappa，而将
重链可变结构域克隆至编码全长人IgG1恒定结构域的载体pRK.LPG4.HumanHC中。DNA
测序容许识别可变结构域的构架和CDR区。10A8的嵌合和人源化形式记述在美国临时专
利申请号61/211,695(2009年4月1日提交)，61/166,217(2009年4月2日提交)，和
61/266,972(2009年12月4日提交)，其各自通过参考整体引入本文中。
域。将轻链可变结构域克隆至包含人恒定κ结构域的载体pRK.LPG3.HumanKappa，而将
重链可变结构域克隆至编码全长人IgG1恒定结构域的载体pRK.LPG4.HumanHC中。DNA
测序容许识别可变结构域的构架和CDR区。10A8的嵌合和人源化形式记述在美国临时专
利申请号61/211,695(2009年4月1日提交)，61/166,217(2009年4月2日提交)，和
61/266,972(2009年12月4日提交)，其各自通过参考整体引入本文中。
[1198] 3.嵌合抗-人FcRH5抗体13G9(ch13G9)
[1199] 抗体13G9作为一组抗-人FcRH5杂交瘤的成员获得。这些抗体的小鼠/人嵌合体利用RT-PCR构建，如上所述，从而利用总mRNA作为底物来扩增杂交瘤轻链和重链的可变
结构域。将轻链可变结构域克隆至包含人恒定κ结构域的载体pRK.LPG3.HumanKappa，而
将重链可变结构域克隆至编码全长人IgG1恒定结构域的载体pRK.LPG4.HumanHC中。关于
由此产生的抗-人FcRH5(ch13G9)的鼠-人嵌合轻链(图5)和重链(图7)的完整编码区
获得DNA序列，其容许识别可变结构域的构架和CDR区。关于由该DNA编码的13G9鼠-人
嵌合轻链和重链的编码多肽分别显示在 图6和8中。
结构域。将轻链可变结构域克隆至包含人恒定κ结构域的载体pRK.LPG3.HumanKappa，而
将重链可变结构域克隆至编码全长人IgG1恒定结构域的载体pRK.LPG4.HumanHC中。关于
由此产生的抗-人FcRH5(ch13G9)的鼠-人嵌合轻链(图5)和重链(图7)的完整编码区
获得DNA序列，其容许识别可变结构域的构架和CDR区。关于由该DNA编码的13G9鼠-人
嵌合轻链和重链的编码多肽分别显示在 图6和8中。
[1200] 用于RT-PCR的引物序列如下：
[1201] 13G9LCF.EcoRV(13G9轻链正向引物)：
[1202] 5’-GGAGTACATTCAGATATCGTGATGACCCARTCTCAGAAAATCATG-3’(SEQ ID NO：6)
[1203] (B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T.S＝G/C，H＝A/T/C)
[1204] CA1808RsrII(13G9轻链反向引物)：
[1205] 5’-GGTGCAGCCACGGTCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCCACC-3’(SEQ ID NO：7)
[1206] MM102hc.f.PvuII(13G9重链正向引物)：
[1207] 5’-GGA GTA CAT TCA CAG ATC CAG CTG GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTT AAGAAG-3’(SEQ IDNO：8)
[1208] CA2172.ApaI(13G9重链反向引物)：
[1209] 5’-GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGASTGWGGTTCC-3’(SEQ ID NO：9)
[1210] (B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T.S＝G/C，H＝A/T/C)
[1211] D.生成人源化抗-人FcRH5抗体13G9
[1212] 残基编号根据Kabat(Kabat等，Sequences of proteins of immunologicalinterest(免疫目标的蛋白序列)，第5版，Public Health Service(公共卫生服务)，
National Institutes of Health(国家卫生研究所)，Bethesda，MD(1991))。使用单字母
氨基酸缩写。利用IUB编码(N＝A/C/G/T，D＝A/G/T，V＝A/C/G，B＝C/G/T，H＝A/C/T，
K＝G/T，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，Y＝C/T)表示DNA简并。
National Institutes of Health(国家卫生研究所)，Bethesda，MD(1991))。使用单字母
氨基酸缩写。利用IUB编码(N＝A/C/G/T，D＝A/G/T，V＝A/C/G，B＝C/G/T，H＝A/C/T，
K＝G/T，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，Y＝C/T)表示DNA简并。
[1213] 1.人源化抗-FcRH5抗体移植
[1214] 生成不同的人源化抗-FcRH5抗体。来自鼠FcRH5抗体(13G9)的VL和VH结构域与人共有区VL κI(huKI)和人亚组III共有区VH(huIII)结构域比对。鼠13G9(mu13G9)
轻链可变结构域与人共有序列κI的比对显示在图9中。将13G9的CDRs改造到哺乳动物
表达载体上，所述表达载体包含哺乳动物信号序列，人V κI可变结构域的共有序列，和人
恒定κI 结构域。利用编码各CDR的单寡核苷酸和接受体质粒的ssDNA，根据Kunkle诱变
流程转染CDRs。一个鼠残基，丙氨酸46，即构架2中的游标残基(Vernier residue)，也由
供体mAb转移至接受体质粒中。残基移植，并且由此产生的人13G9形式1轻链可变结构域
显示在图9中。
轻链可变结构域与人共有序列κI的比对显示在图9中。将13G9的CDRs改造到哺乳动物
表达载体上，所述表达载体包含哺乳动物信号序列，人V κI可变结构域的共有序列，和人
恒定κI 结构域。利用编码各CDR的单寡核苷酸和接受体质粒的ssDNA，根据Kunkle诱变
流程转染CDRs。一个鼠残基，丙氨酸46，即构架2中的游标残基(Vernier residue)，也由
供体mAb转移至接受体质粒中。残基移植，并且由此产生的人13G9形式1轻链可变结构域
显示在图9中。
[1215] 同样地，将鼠13G9重链可变结构域的CDRs改造到载体上，所述载体包含哺乳动物信号序列，人重亚组III的共有序列和编码全长人IgG1恒定结构域的序列。因为在已知影
响CDRs构象的若干游标残基处鼠对比人残基注意到存在区别，所以处于位置6，69，71，73，
76和78处的鼠构架残基也由供体转移至接受体质粒。鼠13G9重可变结构域，人亚组III
可变结构域，和由此产生的人13G9形式1(hu13G9.v1)重链可变结构域的比对显示在图10
中。
响CDRs构象的若干游标残基处鼠对比人残基注意到存在区别，所以处于位置6，69，71，73，
76和78处的鼠构架残基也由供体转移至接受体质粒。鼠13G9重可变结构域，人亚组III
可变结构域，和由此产生的人13G9形式1(hu13G9.v1)重链可变结构域的比对显示在图10
中。
[1216] 13G9的嵌合体和形式1在293细胞中表达并纯化，如上所述。由此产生的蛋白的结合通过FACS和Scatchard分析来分析(见下)。13G9的形式1(hu13G9.v1)与表达FcRH5
的细胞的结合基本等价于所述嵌合体，因此，转用形式1进行缀合研究。
的细胞的结合基本等价于所述嵌合体，因此，转用形式1进行缀合研究。
[1217] 注意到人源化13G9的表达相对低。鼠13G9的构架序列与若干人亚组共有序列的比较显示13G9比亚组III更接近类似人亚组VII和I。这提示即使当13G9的CDRs人源化
到亚组III的构架时与FcRH5高亲和性结合，但是蛋白折叠可能不是最优的。因此，对13G9
形式1进行构架改变，以增加与亚组VII的同源性，从而提高表达。形式1、形式3和形式
8的重链可变结构域的比对显示在图11中。进行的置换如下：对于形式3(hu13G9.v3)，构
架中V12K，V13K，V78A。在CDR H1中，还进行置换M34I，以提高包装。关于形式8(hu13G9.
v8)，置换是：L11V，V12K，V13K，L18V，R19K，L20V，K75V，V78A，N82I，N82aS，R83K，和M34I。
到亚组III的构架时与FcRH5高亲和性结合，但是蛋白折叠可能不是最优的。因此，对13G9
形式1进行构架改变，以增加与亚组VII的同源性，从而提高表达。形式1、形式3和形式
8的重链可变结构域的比对显示在图11中。进行的置换如下：对于形式3(hu13G9.v3)，构
架中V12K，V13K，V78A。在CDR H1中，还进行置换M34I，以提高包装。关于形式8(hu13G9.
v8)，置换是：L11V，V12K，V13K，L18V，R19K，L20V，K75V，V78A，N82I，N82aS，R83K，和M34I。
[1218] 2.IgG产生
[1219] 在293(腺病毒-转化的人胚肾细胞系(Graham等，J.Gen.Virol.(遗传病毒学杂志)，36：59-74(1977))中瞬间转染质粒。具体地，在转染前一天分裂293细胞，并将其涂布
TM
在含血清的培养基中。次日，加入如磷酸钙沉淀法制备的双链DNA，及随后的pAdVAntage
DNA(Promega，Madison， WI)，并在37℃温育细胞过夜。细胞在无血清培养基中培养并在4
天后收获。在蛋白A柱上，由转染的细胞上清液纯化抗体蛋白，并然后将缓冲液更换为10mM
琥珀酸钠，140mM NaCl，pH 6.0并用Centricon-10(Amicon)浓缩。蛋白的特征通过N-端
测序验证。蛋白浓度通过定量氨基酸分析来确定。在SVT2细胞中通过FACS测试抗体与
FcRH5的结合，如下所述。
TM
在含血清的培养基中。次日，加入如磷酸钙沉淀法制备的双链DNA，及随后的pAdVAntage
DNA(Promega，Madison， WI)，并在37℃温育细胞过夜。细胞在无血清培养基中培养并在4
天后收获。在蛋白A柱上，由转染的细胞上清液纯化抗体蛋白，并然后将缓冲液更换为10mM
琥珀酸钠，140mM NaCl，pH 6.0并用Centricon-10(Amicon)浓缩。蛋白的特征通过N-端
测序验证。蛋白浓度通过定量氨基酸分析来确定。在SVT2细胞中通过FACS测试抗体与
FcRH5的结合，如下所述。
[1220] 3.结合分析(FACS分析)
[1221] 为了确定FcRH5抗体的交叉反应性，利用FACS分析来分析IgG变体与表达人FcRH1-6的SVT2细胞的结合。
[1222] 简言之，处于100μl中的约106个稳定表达gD标记的huFcRH1-6的SVT2细胞用1.0ug鼠或嵌合Ab[Mu抗-gD(阳性对照)，Mu抗-FcRH5(1H4)，(“mu1H4”)Mu
抗 -FcRH5(4D10)(“mu4D10”)，Mu 抗 -FcRH5(6H1)(“mu6H1”)，Mu 抗 -FcRH5(7D11)
(“mu7D11”)，Ch 抗 -FcRH5(7D11)(“ch7D11”)，Mu 抗 -FcRH5(8H6)(“mu8H6”)，Mu
抗-FcRH5(9E2)(“mu9E2”)，或Mu抗-FcRH5(13G9)(“mu13G9”)]来温育。稳定表达空载
体的SVT2细胞的温育使用相同抗体来温育并用作阴性对照。PE缀合的Rat抗-MuIgG1，Rat
抗-MuIgG2a+b，或Mu抗-HuIgG用作第二检测抗体。结果显示在图15中。除mu6H1外，所有
测试的抗体均特异性结合FcRH5，所述mu6H1与FcRH1交叉反应。通过FACS分析，mu8H6是
弱的但是是FcRH5特异性的抗体。
抗 -FcRH5(4D10)(“mu4D10”)，Mu 抗 -FcRH5(6H1)(“mu6H1”)，Mu 抗 -FcRH5(7D11)
(“mu7D11”)，Ch 抗 -FcRH5(7D11)(“ch7D11”)，Mu 抗 -FcRH5(8H6)(“mu8H6”)，Mu
抗-FcRH5(9E2)(“mu9E2”)，或Mu抗-FcRH5(13G9)(“mu13G9”)]来温育。稳定表达空载
体的SVT2细胞的温育使用相同抗体来温育并用作阴性对照。PE缀合的Rat抗-MuIgG1，Rat
抗-MuIgG2a+b，或Mu抗-HuIgG用作第二检测抗体。结果显示在图15中。除mu6H1外，所有
测试的抗体均特异性结合FcRH5，所述mu6H1与FcRH1交叉反应。通过FACS分析，mu8H6是
弱的但是是FcRH5特异性的抗体。
[1223] 为了进一步确定小鼠FcRH5抗体的结合，利用FACS分析来分析IgG变体与表达人FcRH5的Raji细胞和表达食蟹猴FcRH5的293T细胞的结合。
[1224] 简言之，约106个用人FcRH5稳定转染的Raji细胞和用gD标记的cynoFcRH5瞬间转染的293T细胞，用1.0μg生物素化小鼠同种型对照，生物素化mu抗-gD，生物素
化mu6H1，生物素化mu13G9，或生物素化mu7D11，在100μl FACS缓冲液(PBS，0.5％BSA，
0.05％叠氮化钠)中温育。PE缀合的链霉抗生物素蛋白用作第二检测试剂。结果显示在图
16和17中。
化mu6H1，生物素化mu13G9，或生物素化mu7D11，在100μl FACS缓冲液(PBS，0.5％BSA，
0.05％叠氮化钠)中温育。PE缀合的链霉抗生物素蛋白用作第二检测试剂。结果显示在图
16和17中。
[1225] 为了FcRH5抗体的另外的FACS分析，滴定1.0μg，0.1μg或0.01μg抗体/百万稳定表达huFcRH5的BJAB细胞和稳定表达cynoFcRH5的SVT2细胞。简言之，处于100μl
6
中的约10 个细胞用不同量(1.0ug，01.ug或0.01 ug)的鼠Ab(mu1H4，mu4D10，mu6H1，
mu7D11，mu9E2，mu10A8，mu10F5，或mu13G9)/百万稳定表达huFcRH5的BJAB细胞和稳定表
6
达cynoFcRH5的SVT2细胞来温育。使用1.0ug合适Mu IgG同种型对照/10 个细胞的温育用
作阴性对照。PE缀合的Rat抗-MuIgG1或Rat抗-MuIgG2a+b用作第二检测抗体。结果显示在
图18和19中。通过FACS分析，Mu抗-FcRH5(1H4)，Mu抗-FcRH5(6H1)，Mu抗-FcRH5(7D11)，
Ms抗-FcRH5(10A8)，Mu抗-FcRH5(10F5)，或Mu抗-FcRH5(13G9)与食蟹猴FcRH5反应，且
它们可以在评估靶标依赖性毒性的临床前安全研究中使用。
6
中的约10 个细胞用不同量(1.0ug，01.ug或0.01 ug)的鼠Ab(mu1H4，mu4D10，mu6H1，
mu7D11，mu9E2，mu10A8，mu10F5，或mu13G9)/百万稳定表达huFcRH5的BJAB细胞和稳定表
6
达cynoFcRH5的SVT2细胞来温育。使用1.0ug合适Mu IgG同种型对照/10 个细胞的温育用
作阴性对照。PE缀合的Rat抗-MuIgG1或Rat抗-MuIgG2a+b用作第二检测抗体。结果显示在
图18和19中。通过FACS分析，Mu抗-FcRH5(1H4)，Mu抗-FcRH5(6H1)，Mu抗-FcRH5(7D11)，
Ms抗-FcRH5(10A8)，Mu抗-FcRH5(10F5)，或Mu抗-FcRH5(13G9)与食蟹猴FcRH5反应，且
它们可以在评估靶标依赖性毒性的临床前安全研究中使用。
[1226] 4.亲和性确定(斯卡查德分析)
[1227] 为了进一步确定FcRH5鼠抗体和IgG克隆的结合，碘化IgG变体与表达人FcRH5的OPM2细胞和表达食蟹猴FcRH5的SVT2细胞的结合，进行斯卡查德分析(表9A)。
[1228] 关于斯卡查德分析，在存在稳定表达人-FcRH5的转染OPM2系和稳定表达食蟹125
猴-FcRH5的SVT2系的存在下，0.5nM I 标记的鼠或IgG克隆抗-FcRH5分别与范围为
50-0.02nM(12步1：2连续稀释)的未标记鼠或IgG克隆抗-FcRH5竞争。在4℃进行4小时
温育后，洗涤细胞并通过γ计算器(1470WIZARD自动γ计算器；Perkin Elmer，Walthem，
MA)读细胞沉淀数。所有点均进行一式三份并计数10分钟。使用平均CPM进行利用New
Ligand(新配体)(Genentech，South San Francisco，CA)程序的Kd计算。结果显示在表
9A中。
猴-FcRH5的SVT2系的存在下，0.5nM I 标记的鼠或IgG克隆抗-FcRH5分别与范围为
50-0.02nM(12步1：2连续稀释)的未标记鼠或IgG克隆抗-FcRH5竞争。在4℃进行4小时
温育后，洗涤细胞并通过γ计算器(1470WIZARD自动γ计算器；Perkin Elmer，Walthem，
MA)读细胞沉淀数。所有点均进行一式三份并计数10分钟。使用平均CPM进行利用New
Ligand(新配体)(Genentech，South San Francisco，CA)程序的Kd计算。结果显示在表
9A中。
[1229] 表9A.如通过斯卡查德分析确定的亲和性确定
[1230]细胞系 PUR/Lot Ab Kd(nM) 标准误
BJAB.huFcRH5 48350-22 mu13G9 0.13 0.007
SVT2.cyFcRH5 48350-22 mu13G9 0.54 0.064
OPM2.huFcRH5 MM071207 ch13G9 0.26 0.017
SVT2.cyFcRH5 MM071207 ch13G9 1.08 0.091
OPM2.huFcRH5 PUR 16864 hu13G9.1a(hu13G9.v1) 0.20 0.012
SVT2.cyFcRH5 CA51434-50 hu13G9.1a(hu13G9.v1) 0.56 0.027
BJAB.huFcRH5 50095-53 mu6H1 0.19 0.007
SVT2.cyFcRH5 50095-93 mu6H1 0.38 0.027
OPM2.huFcRH5 CA51434-50 hu13G9.1b* 0.30 0.027
SVT2.cyFcRH5 CA51434-50 hu13G9.1b* 0.53 0.012
BJAB.huFcRH5 48350-22 mu13G9 0.13 0.007
SVT2.cyFcRH5 48350-22 mu13G9 0.54 0.064
OPM2.huFcRH5 MM071207 ch13G9 0.26 0.017
SVT2.cyFcRH5 MM071207 ch13G9 1.08 0.091
OPM2.huFcRH5 PUR 16864 hu13G9.1a(hu13G9.v1) 0.20 0.012
SVT2.cyFcRH5 CA51434-50 hu13G9.1a(hu13G9.v1) 0.56 0.027
BJAB.huFcRH5 50095-53 mu6H1 0.19 0.007
SVT2.cyFcRH5 50095-93 mu6H1 0.38 0.027
OPM2.huFcRH5 CA51434-50 hu13G9.1b* 0.30 0.027
SVT2.cyFcRH5 CA51434-50 hu13G9.1b* 0.53 0.012
[1231] *hu13G9.1b不同于hu13G9.1a，因为hu13G9.1b在轻链的位置87处具有F而非Y(见图9)。
[1232] 实施例2：生成抗-FcRH5抗体药物缀合物(ADCs)
[1233] 用于生成关于抗-人FcRH5的抗体药物缀合物(ADCs)的药物包括美坦生类化合物(maytansinoid)DM1和DM4和多拉司他汀(dolastatin)10衍生物单甲基
auristatin(monomerhylauristatin)E(MMAE)和单甲基auristatin F(MMAF)。(参见2005
年5月31日提交的US20050276812和2004年11月5日提交的US20050238649，这二者均
通过参考整体引入本文)。MMAF，与MMAE，DM1和DM4不同，在中性pH下是相对不透膜的，
因此作为游离药物而言具有相对低活性，尽管它一旦在细胞中非常有效。(Doronina等，
Bioconjug.Chem(生物缀合化学).，17：114-123(2006))。DM1，DM4，MMAE和MMAF是有丝
分裂抑制剂，其是化学疗法治疗NHL中使用的长春花生物碱有丝分裂抑制剂的毒性的至少
100倍(Doronina等，Bioconjug.Chem(生物缀合化学).，17：114-123(2006)；Doronina等，
Nat.Biotechnol(自然生物技术).，21：778-784(2003)；Erickson等，Cancer Res.(癌症研
究)，66：4426-4433(2006))。用于生成ADC的接头是关于DM1的SMCC，关 于DM4的SPDB或
关于MMAE和MMAF的MC和MC-vc-PAB。关于DM1和DM4，抗体通过赖氨酸的ε-氨基基团，
利用稳定的硫酯接头SMCC(在缀合后指定的MCC)与DM1和DM4连接。备选地，关于DM4，抗
体通过赖氨酸的ε-氨基基团，利用SPDB接头与DM4连接。通过SMCC接头来连接的DM1
在还原条件下抗裂解。此外，SMCC-DM1和SPDB-DM4
auristatin(monomerhylauristatin)E(MMAE)和单甲基auristatin F(MMAF)。(参见2005
年5月31日提交的US20050276812和2004年11月5日提交的US20050238649，这二者均
通过参考整体引入本文)。MMAF，与MMAE，DM1和DM4不同，在中性pH下是相对不透膜的，
因此作为游离药物而言具有相对低活性，尽管它一旦在细胞中非常有效。(Doronina等，
Bioconjug.Chem(生物缀合化学).，17：114-123(2006))。DM1，DM4，MMAE和MMAF是有丝
分裂抑制剂，其是化学疗法治疗NHL中使用的长春花生物碱有丝分裂抑制剂的毒性的至少
100倍(Doronina等，Bioconjug.Chem(生物缀合化学).，17：114-123(2006)；Doronina等，
Nat.Biotechnol(自然生物技术).，21：778-784(2003)；Erickson等，Cancer Res.(癌症研
究)，66：4426-4433(2006))。用于生成ADC的接头是关于DM1的SMCC，关 于DM4的SPDB或
关于MMAE和MMAF的MC和MC-vc-PAB。关于DM1和DM4，抗体通过赖氨酸的ε-氨基基团，
利用稳定的硫酯接头SMCC(在缀合后指定的MCC)与DM1和DM4连接。备选地，关于DM4，抗
体通过赖氨酸的ε-氨基基团，利用SPDB接头与DM4连接。通过SMCC接头来连接的DM1
在还原条件下抗裂解。此外，SMCC-DM1和SPDB-DM4
[1234] ADCs诱导细胞毒性，条件是ADC内在化并靶向溶酶体，导致赖氨酸-Nε-DM1ε
的释放，所述赖氨酸-N -DM1是细胞内的有效抗有丝分裂剂，且当由细胞释放时，赖氨
ε
酸-N -DM1无毒(Erickson等，Cancer Res.(癌症研究)，66：4426-4433(2006))。关于MMAE
和MMAF，抗体通过马来酰亚胺基己酰基(maleeimidocaproyl)-缬氨酸-瓜氨酸(vc)-p-氨
基苄氧基羰基(MC-vc-PAB)，经由半胱氨酸与MMAE和MMAF连接。关于MMAF，抗体备选地通
过马来酰亚胺基己酰基(MC)接头，经由半胱氨酸与MMAF连接。MC-vc-PAB接头通过细胞
间蛋白酶诸如组织蛋白酶B并且当裂解时，释放游离药物(Doronina等，Nat.Biotechnol.
(自然生物技术)，21：778-784(2003))，而MC接头对细胞内蛋白酶引起的裂解具有抗性。
的释放，所述赖氨酸-N -DM1是细胞内的有效抗有丝分裂剂，且当由细胞释放时，赖氨
ε
酸-N -DM1无毒(Erickson等，Cancer Res.(癌症研究)，66：4426-4433(2006))。关于MMAE
和MMAF，抗体通过马来酰亚胺基己酰基(maleeimidocaproyl)-缬氨酸-瓜氨酸(vc)-p-氨
基苄氧基羰基(MC-vc-PAB)，经由半胱氨酸与MMAE和MMAF连接。关于MMAF，抗体备选地通
过马来酰亚胺基己酰基(MC)接头，经由半胱氨酸与MMAF连接。MC-vc-PAB接头通过细胞
间蛋白酶诸如组织蛋白酶B并且当裂解时，释放游离药物(Doronina等，Nat.Biotechnol.
(自然生物技术)，21：778-784(2003))，而MC接头对细胞内蛋白酶引起的裂解具有抗性。
[1235] 利用SMCC-DM1的关于抗-人FcRH5的抗体药物缀合物(ADCs)以类似于2005年5月31日提交的美国申请号11/141,344中所述的程序来生成，将其整体通过参考引入本
文中。对抗-人FcRH5纯化抗体进行缓冲液更换至含有50mM磷酸钾和2mM EDTA的溶液，
pH 7.0中。将SMCC(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)溶解在二甲基乙酰胺(DMA)中
并加入至抗体溶液中，以制成最终SMCC/Ab摩尔比10∶1。容许反应在室温下，伴随搅拌
进行3小时。随后在具有150mM NaCl和2mM EDTA，35mM的柠檬酸钠，pH 6.0中平衡的GE
Healthcare HiTrap脱盐柱(G-25)上纯化SMCC-修饰的抗体。将溶解在DMA中的DM1加入
至SMCC抗体制剂中，以提供DM1与抗体的摩尔比10∶1。容许反应在室温下，伴随搅拌进
行4-20小时。DM1-修饰的抗体溶液使用20倍体积的PBS进行渗滤(diafiltered)以除去
未反应的DM1，无菌过滤，并保存在4℃。典型地，通过该方法获得40-60％的抗体产率。如
通过凝胶过滤和激光散射评估地，该制剂通常是＞95％单体的。由于DM1在252nm处具有
吸收最大值，所以与抗体结合的药物量可以通过在252和280nn处的不同吸收测量值来确
定。典型 地，药物与抗体的比率为3-4。
文中。对抗-人FcRH5纯化抗体进行缓冲液更换至含有50mM磷酸钾和2mM EDTA的溶液，
pH 7.0中。将SMCC(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)溶解在二甲基乙酰胺(DMA)中
并加入至抗体溶液中，以制成最终SMCC/Ab摩尔比10∶1。容许反应在室温下，伴随搅拌
进行3小时。随后在具有150mM NaCl和2mM EDTA，35mM的柠檬酸钠，pH 6.0中平衡的GE
Healthcare HiTrap脱盐柱(G-25)上纯化SMCC-修饰的抗体。将溶解在DMA中的DM1加入
至SMCC抗体制剂中，以提供DM1与抗体的摩尔比10∶1。容许反应在室温下，伴随搅拌进
行4-20小时。DM1-修饰的抗体溶液使用20倍体积的PBS进行渗滤(diafiltered)以除去
未反应的DM1，无菌过滤，并保存在4℃。典型地，通过该方法获得40-60％的抗体产率。如
通过凝胶过滤和激光散射评估地，该制剂通常是＞95％单体的。由于DM1在252nm处具有
吸收最大值，所以与抗体结合的药物量可以通过在252和280nn处的不同吸收测量值来确
定。典型 地，药物与抗体的比率为3-4。
[1236] 为了生成具有3-4药物/Ab的抗-人FcRH5SPDB DM4抗体-药物缀合物，首先使用SPDB[4-(2-吡啶基二硫代)丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯]修饰抗体，以生成二硫代吡啶基
基团。加入相对于抗体而言4-6倍摩尔过量的SPDB，并容许在RT下反应90分钟。反应在
具有50mMNaCl，2mM EDTA的50mM磷酸钾，pH 7中，以抗体浓度5-10mgs/ml进行。在SPDB
反应后，加入乙醇至终浓度5％V/V并以超过SPDB1.7倍摩尔过量加入含有硫醇的DM4药
物。在室温下进行温育16小时。通过渗滤、凝胶过滤、或阳离子交换层析纯化缀合物。
基团。加入相对于抗体而言4-6倍摩尔过量的SPDB，并容许在RT下反应90分钟。反应在
具有50mMNaCl，2mM EDTA的50mM磷酸钾，pH 7中，以抗体浓度5-10mgs/ml进行。在SPDB
反应后，加入乙醇至终浓度5％V/V并以超过SPDB1.7倍摩尔过量加入含有硫醇的DM4药
物。在室温下进行温育16小时。通过渗滤、凝胶过滤、或阳离子交换层析纯化缀合物。
[1237] 利用MC-val-cit(vc)-PAB-MMAE药物接头的关于抗-人FcRH5的抗体药物缀合物(ADC)以类似于2004年11月5日提交的美国申请号10/983,340中所述的程序生成，将其
整体通过参考引入本文中。将纯化的抗-人FcRH5抗体溶解在500mM硼酸纳和500mM氯化
钠，pH 8.0中，并进一步使用过量的100MM二硫苏糖醇(DTT)处理。在37℃温育30分钟
后，缓冲液通过经由Sephadex G25树脂洗脱来更换并用具有1mM DTPA的PBS洗脱。通过
由溶液在280nm处的吸光度确定还原抗体浓度和通过与DTNB(Aldrich，Milwaukee，WI)反
应和确定在412nm处的吸光度确定的硫醇浓度来检查硫醇/Ab值。溶解在PBS中的还原抗
体在冰上冷冻。处于DMSO中的药物接头MC-val-cit(vc)-PAB-MMAE溶解在乙腈和水中，并
加入至在PBS中的冷冻还原抗体。1小时温育后，加入过量马来酰亚胺以猝灭反应并对任何
未反应的抗体硫醇基团加帽。反应混合物通过离心超滤浓缩并且抗体药物缀合物通过经在
PBS中由G25树脂纯化和脱盐，在无菌条件下经过0.2μm滤器过滤，并冷冻保存。
整体通过参考引入本文中。将纯化的抗-人FcRH5抗体溶解在500mM硼酸纳和500mM氯化
钠，pH 8.0中，并进一步使用过量的100MM二硫苏糖醇(DTT)处理。在37℃温育30分钟
后，缓冲液通过经由Sephadex G25树脂洗脱来更换并用具有1mM DTPA的PBS洗脱。通过
由溶液在280nm处的吸光度确定还原抗体浓度和通过与DTNB(Aldrich，Milwaukee，WI)反
应和确定在412nm处的吸光度确定的硫醇浓度来检查硫醇/Ab值。溶解在PBS中的还原抗
体在冰上冷冻。处于DMSO中的药物接头MC-val-cit(vc)-PAB-MMAE溶解在乙腈和水中，并
加入至在PBS中的冷冻还原抗体。1小时温育后，加入过量马来酰亚胺以猝灭反应并对任何
未反应的抗体硫醇基团加帽。反应混合物通过离心超滤浓缩并且抗体药物缀合物通过经在
PBS中由G25树脂纯化和脱盐，在无菌条件下经过0.2μm滤器过滤，并冷冻保存。
[1238] 实施例3：制备半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体
[1239] 如本文中所公开地进行半胱氨酸改造的抗-FcRH5抗体的制备。可以将半胱氨酸残基加入至抗体的轻链、重链或Fc区，以容许与不同药物缀合。在半胱氨酸改造的
抗-FcRH5抗体13G9的制备中，诱变编码轻链的DNA，从而在Kabat位置205处用半胱氨酸
置换缬氨酸，如图14中所示。诱变编码重链的DNA，从而在重链中的Kabat位置118(顺序
位置118， Kabat编号114)处用半胱氨酸置换丙氨酸，如图13中所示。可以诱变抗-FcRH5
抗体的Fc区，从而在重链Fc区中的EU位置400(顺序位置400；Kabat编号396)处用半胱
氨酸置换丝氨酸。
抗-FcRH5抗体13G9的制备中，诱变编码轻链的DNA，从而在Kabat位置205处用半胱氨酸
置换缬氨酸，如图14中所示。诱变编码重链的DNA，从而在重链中的Kabat位置118(顺序
位置118， Kabat编号114)处用半胱氨酸置换丙氨酸，如图13中所示。可以诱变抗-FcRH5
抗体的Fc区，从而在重链Fc区中的EU位置400(顺序位置400；Kabat编号396)处用半胱
氨酸置换丝氨酸。
[1240] 实施例4：利用鼠抗-FcRH5抗体药物缀合物的体内肿瘤细胞杀伤测定
[1241] A.异种移植
[1242] 为了测试不同抗-FcRH5抗体的功效，鼠抗-人抗体与DM1缀合，并分析缀合的变体对小鼠中肿瘤的影响。
[1243] 特别地，抗体对抑制BJAB-荧光素酶细胞(用人FcRH5稳定转染的Burkitt淋巴瘤细胞系)中肿瘤的能力。
[1244] 在将pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5转染到BJAB-荧光素酶细胞中和嘌呤霉素(puromycin)(Calbiochem，圣地亚哥，CA)选择后，存活细胞进行FACS自克隆，以获得具有
抗-FcRH5抗体(7D11)的中度范围表达子。自克隆后，利用抗-FcRH5抗体(7D11)，通过FACS
分析选择最接近类似血浆细胞表达的表达FcRH5的BJAB-荧光素酶细胞系，如通过FACS所
确定的。作为阴性对照，使用空载体pRK.CMV.PD.nbe以相同方式转染的BJAB-荧光素酶。
抗-FcRH5抗体(7D11)的中度范围表达子。自克隆后，利用抗-FcRH5抗体(7D11)，通过FACS
分析选择最接近类似血浆细胞表达的表达FcRH5的BJAB-荧光素酶细胞系，如通过FACS所
确定的。作为阴性对照，使用空载体pRK.CMV.PD.nbe以相同方式转染的BJAB-荧光素酶。
[1245] 为了分析小鼠抗体的功效，将雌性CB17ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自Charles Rivers实验室；Hollister，CA)通过注射到CB17ICR SCID小鼠两侧，皮下接
7 3
种2X 10BJAB-FcRH5细胞，并容许异种移植肿瘤生长到平均128mm。第0天指肿瘤平均
3
100-250mm 且施用第一/或唯一剂量治疗时的那天，除非如下特别指出。肿瘤体积基于利
3 2
用测径器测量的两个维度来计算，并以mm 为单位根据公式V＝0.5a X b 来表示，其中a
和b分别是肿瘤的长和短直径。由各实验组收集的数据表示为平均值±SE。8只小鼠的组
2
用400μg抗体-连接的药物/m 小鼠(对应于～8-10mg ADC/kg小鼠)及抗-FcRH5ADC或
对照抗体-药物缀合物的单次静脉内(i.v.)剂量来处理。在整个实验过程中每周测量肿
3
瘤2次。在整个实验过程中每周测量小鼠体重1次。在肿瘤体积达到2000mm 前或当肿瘤
显示迫近溃疡迹象时，对小鼠进行安乐死。所有动物流程均由研究动物护理和使用委员会
(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)批准。
7 3
种2X 10BJAB-FcRH5细胞，并容许异种移植肿瘤生长到平均128mm。第0天指肿瘤平均
3
100-250mm 且施用第一/或唯一剂量治疗时的那天，除非如下特别指出。肿瘤体积基于利
3 2
用测径器测量的两个维度来计算，并以mm 为单位根据公式V＝0.5a X b 来表示，其中a
和b分别是肿瘤的长和短直径。由各实验组收集的数据表示为平均值±SE。8只小鼠的组
2
用400μg抗体-连接的药物/m 小鼠(对应于～8-10mg ADC/kg小鼠)及抗-FcRH5ADC或
对照抗体-药物缀合物的单次静脉内(i.v.)剂量来处理。在整个实验过程中每周测量肿
3
瘤2次。在整个实验过程中每周测量小鼠体重1次。在肿瘤体积达到2000mm 前或当肿瘤
显示迫近溃疡迹象时，对小鼠进行安乐死。所有动物流程均由研究动物护理和使用委员会
(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)批准。
[1246] 使用的抗体和毒素之间的接头是关于DM1的硫醚交联体SMCC。另外的接头可以包括二硫化物接头SPP或关于DM1的硫醚交联体SMCC或MC或具有关于单甲基auristatin
E(MMAE)或单甲基auristatinF(MMAF)的马来酰亚胺成分和对-氨基苄基氨基甲酰(PAB)
self-immolative成分的MC-缬氨酸-瓜氨酸(vc)-PAB或(缬氨酸-瓜氨酸(vc))二肽接
头试剂)。所用的毒素是DM1。另外的毒素可以包括MMAE或MMAF。
E(MMAE)或单甲基auristatinF(MMAF)的马来酰亚胺成分和对-氨基苄基氨基甲酰(PAB)
self-immolative成分的MC-缬氨酸-瓜氨酸(vc)-PAB或(缬氨酸-瓜氨酸(vc))二肽接
头试剂)。所用的毒素是DM1。另外的毒素可以包括MMAE或MMAF。
[1247] 关于该实验的抗体包括mu7D11，其记述在Chang等PCT/US2004/043514(WO2005/063299)，将其作为整体通过参考引入本文中，以及本文中所述的抗-FcRH5(参见实
施例1B，诸如mu 7D11，mu6H11，mu10A8，mu13G9和mu9E2)。
施例1B，诸如mu 7D11，mu6H11，mu10A8，mu13G9和mu9E2)。
[1248] 阴性对照包括基于抗-gp-120的缀合物(SMCC-DM1)。
[1249] B.结果
[1250] 1.BJAB-FcRH5异种移植物
[1251] 在使用如所示的药物缀合物和剂量的48天时程内，mu7D11，mu6H1，mu10A8，mu13G9，和mu9E2ADC与阴性对照抗gp-120SMCC-DM1相比，显示对具有BJAB-FcRH5肿瘤的
SCID小鼠中肿瘤生长的抑制。关于全部ADC和对照，以两次剂量(如下表10中所示)在第
0天和第7天施用ADC。特别地，所有抗-FcRH5ADCs显著抑制肿瘤生长(图20)。
SCID小鼠中肿瘤生长的抑制。关于全部ADC和对照，以两次剂量(如下表10中所示)在第
0天和第7天施用ADC。特别地，所有抗-FcRH5ADCs显著抑制肿瘤生长(图20)。
[1252] 另外，在相同的研究中，在各剂量组中确定前17天内的百分比体重变化。结果(图21)说明施用这些鼠-抗-FcRH5ADCs在该时期内不导致体重显著减少或体重减轻。
[1253] 此外，在表10中，指出显示部分消退(Partial Regression，PR；其中施药后任意时刻的肿瘤体积降低低于在第0天测量的肿瘤体积的50％)，完全好转(Complete
Remission，CR；其中施药后任意时刻的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠占测试总数的数量
(NA＝不适用)；(TI＝在研究结束时可观察到的肿瘤数)。
Remission，CR；其中施药后任意时刻的肿瘤体积降低至0mm3)的小鼠占测试总数的数量
(NA＝不适用)；(TI＝在研究结束时可观察到的肿瘤数)。
[1254] 表10
[1255]
[1256] 实施例5：通过小鼠抗-FcRH5Mab药物缀合物测定体内肿瘤生长的抑制
[1257] A.异种移植
[1258] 为了测试具有-SPDB-DM4，SMCC-DM1，MC-vc-PAB-MMAE，和MC-MMAF的mu13G9药物缀合物的功效，分析mu13G9药物缀合物对小鼠中肿瘤的影响。
[1259] 特别地，检查抗体抑制稳定转染人FcRH5的OPM2细胞(多发性骨髓瘤细胞系)中肿瘤的能力。
[1260] 在将pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5转染到OPM2细胞中和嘌呤霉素(puromycin)(Calbiochem，圣地亚哥，CA)选择后，在MACS LS柱(Miltenyi Biotec，Auburn，Ca)
上分离存活细胞，以获得具有生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，I1)标记的
抗-FcRH5.7D11和MACS抗-生物素微珠的FcRH5表达细胞。分离后，利用抗-FcRH5抗体
(10A8)和(13G9)通过FACS分析验证FcRH5表达，用空载体pRK.CMV.PD.nbe以相同方式转
染的OPM2细胞系作为阴性对照。
上分离存活细胞，以获得具有生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，I1)标记的
抗-FcRH5.7D11和MACS抗-生物素微珠的FcRH5表达细胞。分离后，利用抗-FcRH5抗体
(10A8)和(13G9)通过FACS分析验证FcRH5表达，用空载体pRK.CMV.PD.nbe以相同方式转
染的OPM2细胞系作为阴性对照。
[1261] 为了分析具有SPDB-DM4，SMCC-DM1，MC-vc-PAB-MMAE，和 MC-MMAF的mu13G9药物缀合物的功效，将雌性CB17 ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自Charles Rivers实验室；
7
Hollister，CA)通过注射到CB17ICR SCID小鼠两侧，皮下接种2X 10OPM2-FcRH5细胞，并
3 3
容许异种移植肿瘤生长到平均215mm。第0天指肿瘤平均100-250mm 且施用第一/或唯
一剂量治疗时的那天，除非如下特别指出。肿瘤体积基于利用测径器测量的两个维度来计
3 2
算，并以mm 为单位根据公式V＝0.5a X b 来表示，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。
由各实验组收集的数据表示为平均值±SE。8只小鼠的组用10mg ADC/kg的抗-FcRH5ADC
或对照抗体-药物缀合物的单次静脉内(i.v.)剂量来处理。在整个实验过程中每周测量
3
肿瘤2次。在整个实验过程中每周测量小鼠体重1次。在肿瘤体积达到3000mm 前或当肿
瘤显示迫近溃疡迹象时，对小鼠进行安乐死。所有动物流程均由研究动物护理和使用委员
会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)批准。
7
Hollister，CA)通过注射到CB17ICR SCID小鼠两侧，皮下接种2X 10OPM2-FcRH5细胞，并
3 3
容许异种移植肿瘤生长到平均215mm。第0天指肿瘤平均100-250mm 且施用第一/或唯
一剂量治疗时的那天，除非如下特别指出。肿瘤体积基于利用测径器测量的两个维度来计
3 2
算，并以mm 为单位根据公式V＝0.5a X b 来表示，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。
由各实验组收集的数据表示为平均值±SE。8只小鼠的组用10mg ADC/kg的抗-FcRH5ADC
或对照抗体-药物缀合物的单次静脉内(i.v.)剂量来处理。在整个实验过程中每周测量
3
肿瘤2次。在整个实验过程中每周测量小鼠体重1次。在肿瘤体积达到3000mm 前或当肿
瘤显示迫近溃疡迹象时，对小鼠进行安乐死。所有动物流程均由研究动物护理和使用委员
会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)批准。
[1262] 阴性对照包括基于抗-gp-120的缀合物(SPDB-DM4，SMCC-DM1，MC-vc-PAB-MMAE，和MC-MMAF)。
[1263] B.结果
[1264] 1.OPM2-FcRH5异种移植物
[1265] 在使用如表11所示的药物缀合物和剂量的50天时程内，mu13G9SPDB-DM4，SMCC-DM1，MC-vc-PAB-MMAE，和MC-MMAF ADCs与阴性对照抗gp-120SPDB-DM4，SMCC-DM1，
MC-vc-PAB-MMAE，和MC-MMAF ADC相比，显示对具有OPM-FcRH5肿瘤的SCID小鼠中肿瘤生
长的抑制。关于全部ADC和对照，以两次剂量在第0天和第7天施用ADC。特别地，所有
抗-FcRH5ADCs显著抑制肿瘤生长(图22)。
MC-vc-PAB-MMAE，和MC-MMAF ADC相比，显示对具有OPM-FcRH5肿瘤的SCID小鼠中肿瘤生
长的抑制。关于全部ADC和对照，以两次剂量在第0天和第7天施用ADC。特别地，所有
抗-FcRH5ADCs显著抑制肿瘤生长(图22)。
[1266] 另外，在相同的研究中，在各剂量组中确定前14天内的百分比体重变化。结果(图23)说明施用这些鼠-抗-FcRH5ADCs在该时期内不导致体重显著减少或体重减轻。
[1267] 此外，在表11中，指出显示部分消退(PR；其中施药后任意时刻的肿瘤体积降低低于在第0天测量的肿瘤体积的50％)，完全好转(CR；其中其中施药后任意时刻的肿瘤体积
降低至0mm3)的小鼠占测试总数的数量(NA ＝不适用)；(TI＝在研究结束时可观察到的
肿瘤数)。
降低至0mm3)的小鼠占测试总数的数量(NA ＝不适用)；(TI＝在研究结束时可观察到的
肿瘤数)。
[1268] 表11.
[1269]
[1270] *赋形剂＝20mM乙酸组氨酸，pH 5.5，240mM蔗糖，0.02％PS20
[1271] 实施例6：通过抗-FcRH5Mab药物缀合物测定体外细胞增殖减少
[1272] mu13G9 药 物 缀 合 物 ( 包 括 mu 抗 -FcRH5(13G9)-Naked，mu 抗 -FcRH5(13G9)-SMCC-DM1，mu 抗 -FcRH5(13G9)-SPDB-DM4，mu
抗-FcRH5(13G9)-MC-vc-PAB-MMAE，和mu抗-FcRH5(13G9)-MC-MMAF)的体外效力通过细
胞增殖测定，使用稳定表达人-FcRH5(OPM2.CMV.PD.FcRH5.SP.2)的OPM2品系来测量。
发光细胞存活力测定( Luminescent Cell Viability
Assay)是可商购的(Promega Corp.，Madison，WI)，基于鞘翅目(Coleoptera)荧光素
酶重组表达的均相测定法(US 5583024；US 5674713；US 5700670)。该细胞增殖测定基
于定量ATP存在，即一种代谢活性细胞指示剂，来确定培养物中存活细胞数(Crouch等，
J.Immunol.Metho.(免疫学方法杂志)，160：81-88(1993)； US 6602677)。CellTiter-
则定以96孔形式进行，这使其可以按照自动高通量筛选(HTS)来进行(Cree
等，AntiCancer Drugs(抗癌药物)，6：398-404(1995))。均相测定程序包括将单试剂
(CellTiter- 试剂)直接加入至在增补血清的培养基中培养的细胞。
抗-FcRH5(13G9)-MC-vc-PAB-MMAE，和mu抗-FcRH5(13G9)-MC-MMAF)的体外效力通过细
胞增殖测定，使用稳定表达人-FcRH5(OPM2.CMV.PD.FcRH5.SP.2)的OPM2品系来测量。
发光细胞存活力测定( Luminescent Cell Viability
Assay)是可商购的(Promega Corp.，Madison，WI)，基于鞘翅目(Coleoptera)荧光素
酶重组表达的均相测定法(US 5583024；US 5674713；US 5700670)。该细胞增殖测定基
于定量ATP存在，即一种代谢活性细胞指示剂，来确定培养物中存活细胞数(Crouch等，
J.Immunol.Metho.(免疫学方法杂志)，160：81-88(1993)； US 6602677)。CellTiter-
则定以96孔形式进行，这使其可以按照自动高通量筛选(HTS)来进行(Cree
等，AntiCancer Drugs(抗癌药物)，6：398-404(1995))。均相测定程序包括将单试剂
(CellTiter- 试剂)直接加入至在增补血清的培养基中培养的细胞。
[1273] 均相“添加-混合-测量”形式导致细胞裂解和产生与ATP存在成比例的发光信号。底物，即甲虫荧光素，通过重组萤火虫荧光素酶氧化脱羧，其伴随着ATP到AMP的转化
和光子的生成。存活细胞以相对发光单位(RLU)表示。数据可以通过光度计或CCD照相机
成像装置来记录。发光输出表示为经过一段时间测量的RLU。％RLU是与“非-药物-缀
合物”对照相比的标准化RLU百分比。备选地来自发光的光子可以在存在闪烁的条件下，在
闪烁计数器中计数。则光单位可以表示为CPS(计数/秒)。
和光子的生成。存活细胞以相对发光单位(RLU)表示。数据可以通过光度计或CCD照相机
成像装置来记录。发光输出表示为经过一段时间测量的RLU。％RLU是与“非-药物-缀
合物”对照相比的标准化RLU百分比。备选地来自发光的光子可以在存在闪烁的条件下，在
闪烁计数器中计数。则光单位可以表示为CPS(计数/秒)。
[1274] 人源化抗体-药物缀合物的功效通过细胞增殖测定，使用以下流程测量，所述流程根据CellTiter Glo发光细胞存活力测定，Promega Corp.技术报告TB288(CellTiter
Glo Luminescent Cell Viability Assay，Promega Corp.Technical bulletin TB288)；
Mendoza等，Cancer Res.(癌症研究)，62：5485-5488(2002))改进：
Glo Luminescent Cell Viability Assay，Promega Corp.Technical bulletin TB288)；
Mendoza等，Cancer Res.(癌症研究)，62：5485-5488(2002))改进：
[1275] 1.将处于培养基中的含有约75,000个OPM2.CMV.PD.FcRH5.SP.2细胞的50μl细胞培养物等分试样置于96孔不透明壁平板的每个孔中。
[1276] 2.将mu13G9Ab或ADC(50ul)加入至一式三份的实验孔中，到达最终浓度10000，3333，1111，370，123，41，14，4.6或1.5ng/mL，“非-药物缀合物”对照孔仅接收培养基，并温育3天。
[1277] 3.将平板平衡至室温约30分钟。
[1278] 4.加入CellTiter-Glo试剂(100μl)。
[1279] 5.在轨道摇动器上混合内容物2分钟，以诱导细胞裂解。
[1280] 6.在室温下温育平板10分钟，以稳定发光信号。
[1281] 7.记录发光并在图表中以％RLU(相对发光单位)报告。
[1282] 8.作为对照，相同细胞系与无关的非结合小鼠抗-GP120Abs或ADCs(包括 mu 抗 -GP120Naked，mu 抗 -GP120-SMCC-DM1，mu 抗 -GP120-SPDB-DM4，mu
抗-GP120-MC-vc-PAB-MMAE，和mu 抗-GP120-MC-MMAF)平行运行。
抗-GP120-MC-vc-PAB-MMAE，和mu 抗-GP120-MC-MMAF)平行运行。
[1283] 培养基：OPM2.CMV.PS.FcRH5.SP.2细胞在RPMI1640/20％FBS/2mM谷氨酰胺/1.0ug/ml嘌呤霉素(puromycin)中生长。
[1284] 小鼠抗体-药物缀合物的功效显示在图24-25中。该测定的结果以mg/ml为单位表示为IC50。IC50是50％抑制细胞生长所需的抗体或ADC的浓度。
[1285] 认为前述书面说明足以容许本领域中技术人员实践本发明。本发明不由保藏的构建体限定范围，因为保藏的实施方案意欲作为本发明某些方面的简单举例说明，并且功能
等价的任何构建体均属于本发明的范围。本文中的材料保藏不构成承认本文中所包含的书
面说明不充分容许实践本发明的任何方面，包括其最佳模式，且也不被解释为将权利要求
的范围限制为其所代表具体举例。实际上，除本文中所示和所述的那些以外的本发明的不
同变化对于本领域中技术人员应该由前述说明变得清楚并属于所附权利要求的范围。
等价的任何构建体均属于本发明的范围。本文中的材料保藏不构成承认本文中所包含的书
面说明不充分容许实践本发明的任何方面，包括其最佳模式，且也不被解释为将权利要求
的范围限制为其所代表具体举例。实际上，除本文中所示和所述的那些以外的本发明的不
同变化对于本领域中技术人员应该由前述说明变得清楚并属于所附权利要求的范围。
[1286] 实施例7：通过人源化抗-FcRH5药物缀合物和 测定体内肿瘤生长抑制
[1287] A.异种移植
[1288] 为了测试具有MC-vc-PAB-MMAE的人源化(13G9)药物缀合物与 (硼替佐米(bortezomib))的组合的功效，分析单独的和与 组合的缀合抗体对小鼠中
肿瘤(多发性骨髓瘤OPM2-FcRH5异种移植物)的影响。
肿瘤(多发性骨髓瘤OPM2-FcRH5异种移植物)的影响。
[1289] 特别地，检查抗体和 抑制稳定转染人FcRH5的OPM2细胞(多发性骨髓瘤细胞系)中肿瘤的能力。在将线性化pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5转染到OPM2细胞中和嘌呤
霉素(puromycin)(Calbiochem，圣地亚哥，CA)选择后，在MACS LS柱(Miltenyi Biotec，
Auburn，Ca)上分离存活细胞，以获得具有生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，Il)
标记的抗-FcRH5.7D11和MACS抗-生物素微珠的FcRH5表达细胞。分离后，利用抗-FcRH5
抗体(13G9)通过FACS分析验证FcRH5表达，用空载体pRK.CMV.PD.nbe以相同方式转染的
OPM2细胞系作为阴性对照。
霉素(puromycin)(Calbiochem，圣地亚哥，CA)选择后，在MACS LS柱(Miltenyi Biotec，
Auburn，Ca)上分离存活细胞，以获得具有生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，Il)
标记的抗-FcRH5.7D11和MACS抗-生物素微珠的FcRH5表达细胞。分离后，利用抗-FcRH5
抗体(13G9)通过FACS分析验证FcRH5表达，用空载体pRK.CMV.PD.nbe以相同方式转染的
OPM2细胞系作为阴性对照。
[1290] 为了分析与单独的和与 组合的与MC-vc-PAB-MMAE缀合的hu抗-FcRH513G9药物缀合物的功效，将雌性CB17ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自Charles
Rivers实验室；Hollister，CA)通过注射到CB17ICRSCID小鼠两侧，皮下接种2X
7 3
10OPM2-FcRH5细胞，并容许异种移植肿瘤生长到平均331mm。第0天指肿瘤平均
3
172-511mm 且施用第一/或唯一剂量治疗时的那天，除非如下特别指出。肿瘤体积基于
3 2
利用测径器测量的两个维度来计算，并以mm 为单位根据公式V＝0.5a X b 来表示，其
中a和b分别是肿瘤的长和短直径。由各实验组收集的数据表示为平均值±SE。将小
鼠随机化为9个各约9只小鼠的组并给药。组1在第0天接受单次静脉内(IV)注射组
氨酸并在第0，3，7，和10天接受IV注射0.9％氯化钠(盐水)，每周两次，进行两周，作
为赋形剂对照。组2在第0天接受单次IV注射10mg/kg Hu抗-Her2Trastuzumab-MC-v
c-PAB-MMAE，CNJ1135，作为缀合物对照。组3在第0，3，7，和10天接受IV注射1mg/kg
每周两次，进行两周。组4-5在第0天分别接受单次IV注射4或10mg/kg硫代
hu抗-FcRH5(13G9)-HC-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1465。组6-7在第0天分别接受单次IV注
射4或10mg/kg hu抗-FcRH5(13G9)-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1575。组8在第0天接受单次
IV注射4mg/kg hu抗-FcRH5(13G9)-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1575并在第0，3，7，和10天IV
注射1mg/kg 每周两次，进行两周。在整个实验过程中每周测量肿瘤2次。在前
3
三周每周测量小鼠体重2次。在肿瘤体积达到3000mm 前或当肿瘤显示迫近溃疡迹象时，对
小鼠进行安乐死。所有动物流程均由研究动物护理和使用委员会(Institutional Animal
Care and Use Committee)(IACUC)批准。
Rivers实验室；Hollister，CA)通过注射到CB17ICRSCID小鼠两侧，皮下接种2X
7 3
10OPM2-FcRH5细胞，并容许异种移植肿瘤生长到平均331mm。第0天指肿瘤平均
3
172-511mm 且施用第一/或唯一剂量治疗时的那天，除非如下特别指出。肿瘤体积基于
3 2
利用测径器测量的两个维度来计算，并以mm 为单位根据公式V＝0.5a X b 来表示，其
中a和b分别是肿瘤的长和短直径。由各实验组收集的数据表示为平均值±SE。将小
鼠随机化为9个各约9只小鼠的组并给药。组1在第0天接受单次静脉内(IV)注射组
氨酸并在第0，3，7，和10天接受IV注射0.9％氯化钠(盐水)，每周两次，进行两周，作
为赋形剂对照。组2在第0天接受单次IV注射10mg/kg Hu抗-Her2Trastuzumab-MC-v
c-PAB-MMAE，CNJ1135，作为缀合物对照。组3在第0，3，7，和10天接受IV注射1mg/kg
每周两次，进行两周。组4-5在第0天分别接受单次IV注射4或10mg/kg硫代
hu抗-FcRH5(13G9)-HC-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1465。组6-7在第0天分别接受单次IV注
射4或10mg/kg hu抗-FcRH5(13G9)-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1575。组8在第0天接受单次
IV注射4mg/kg hu抗-FcRH5(13G9)-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1575并在第0，3，7，和10天IV
注射1mg/kg 每周两次，进行两周。在整个实验过程中每周测量肿瘤2次。在前
3
三周每周测量小鼠体重2次。在肿瘤体积达到3000mm 前或当肿瘤显示迫近溃疡迹象时，对
小鼠进行安乐死。所有动物流程均由研究动物护理和使用委员会(Institutional Animal
Care and Use Committee)(IACUC)批准。
[1291] 阴性对照包括基于抗-HER2 (曲妥珠单抗(trastuzumab)))的缀合物(MC-vc-PAB-MMAE)。
[1292] B.结果
[1293] 1.OPM2-FcRH5异种移植物
[1294] 在使用单独的和与 组合的药物缀合物的研究结束时，测定与组合的与-MC-vc-PAB-MMAE缀合的hu13G9与阴性对照与 -MC-vc-PAB-MMAE缀
合的人源化抗-Her2(Hu抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-MC-vc-PAB-MMAE)相比，对具
有OPM2-FcRH5肿瘤的SCID小鼠中肿瘤生长的抑制。此外，在各剂量组中确定前24天内的
任何百分比体重变化。还确定显示部分消退(PR；其中施药后任意时刻的肿瘤体积降低低
于在第0天测量的肿瘤体积的50％)，完全好转(CR；其中其中施药后任意时刻的肿瘤体积
3
降低至0mm)的小鼠占测试总数的数量(NA＝不适用)；(TI＝在研究结束时可观察到的肿
瘤数)。
合的人源化抗-Her2(Hu抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-MC-vc-PAB-MMAE)相比，对具
有OPM2-FcRH5肿瘤的SCID小鼠中肿瘤生长的抑制。此外，在各剂量组中确定前24天内的
任何百分比体重变化。还确定显示部分消退(PR；其中施药后任意时刻的肿瘤体积降低低
于在第0天测量的肿瘤体积的50％)，完全好转(CR；其中其中施药后任意时刻的肿瘤体积
3
降低至0mm)的小鼠占测试总数的数量(NA＝不适用)；(TI＝在研究结束时可观察到的肿
瘤数)。
[1295] 实施例9：通过人源化抗-FcRH5药物缀合物测定体内肿瘤生长抑制
[1296] A.异种移植
[1297] 为了测试具有-SPDB-DM4的人源化(13G9)药物缀合物与 的组合的功效，分析单独的和与 组合的缀合抗体对小鼠中肿瘤(多发性骨髓瘤OPM2-FcRH5
异种移植物)的影响。
异种移植物)的影响。
[1298] 特别地，检查抗体和 抑制稳定转染人FcRH5的OPM2细胞(多发性骨髓瘤细胞系)中肿瘤的能力。在将线性化pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5转染到OPM2细胞中和嘌呤
霉素(puromycin)(Calbiochem，圣地亚哥，CA)选择后，在MACS LS柱(Miltenyi Biotec，
Auburn，Ca)上分离存活细胞，以获得具有生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，Il)
标记的抗-FcRH5.7D11和MACS抗-生物素微珠的FcRH5表达细胞。分离后，利用抗-FcRH5
抗体(13G9)通过FACS分析验证FcRH5表达，用空载体pRK.CMV.PD.nbe以相同方式转染的
OPM2细胞系作为阴性对照。
霉素(puromycin)(Calbiochem，圣地亚哥，CA)选择后，在MACS LS柱(Miltenyi Biotec，
Auburn，Ca)上分离存活细胞，以获得具有生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，Il)
标记的抗-FcRH5.7D11和MACS抗-生物素微珠的FcRH5表达细胞。分离后，利用抗-FcRH5
抗体(13G9)通过FACS分析验证FcRH5表达，用空载体pRK.CMV.PD.nbe以相同方式转染的
OPM2细胞系作为阴性对照。
[1299] 为了分析与单独的和与 组合的与-SPDB-DM4缀合的hu抗-FcRH513G9的功效，将雌性CB17ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自Charles Rivers实验室；Hollister，
7
CA)通过注射到CB 17ICR SCID小鼠两侧，皮下接种2X 10OPM2-FcRH5细胞，并容许异种移
3 3
植肿瘤生长到平均306mm。第0天指肿瘤平均197-499mm 且施用第一/或唯一剂量治疗
3
时的那天，除非如下特别指出。肿瘤体积基于利用测径器测量的两个维度来计算，并以mm
2
为单位根据公式V＝0.5a X b 来表示，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。由各实验
组收集的数据表示为平均值±SE。将小鼠随机化为 6个各约9只小鼠的组并给药。组1
在第0，3，7，和10天接受静脉内(IV)注射1mg/kg 每周两次，进行两周。组2
在第0天接受单次IV注射组氨酸缓冲液并在第0，3，7，和10天接受IV注射0.9％氯化钠
(盐水)，每周两次，进行两周，作为赋形剂对照。组3在第0天接受单次IV注射4mg/kg Hu
抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-SPDB-DM4，CNJ 1433，作为缀合物对照。组4在第0天
接受单次IV注射4mg/kg Hu抗-FcRH513G9SPDB-DM4，CNJ 1503。组5在第0天接受单次
IV注射4mg/kg Hu抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-SPDB-DM4，CNJ 1433并在第0，3，
7，和10天接受IV注射1mg/kg 每周两次，进行两周。组6在第0天接受单次
IV注射4mg/kg Hu抗-FcRH513G9SPDB-DM4，CNJ 1503并在第0，3，7，和10天接受IV注射
1mg/kg 每周两次，进行两周。在整个实验过程中每周测量肿瘤2次。在前三周
3
每周测量小鼠体重2次。在肿瘤体积达到3000mm 前或当肿瘤显示迫近溃疡迹象时，对小鼠
进行安乐死。所有动物流程均由研究动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care
and Use Committee)(IACUC)批准。
7
CA)通过注射到CB 17ICR SCID小鼠两侧，皮下接种2X 10OPM2-FcRH5细胞，并容许异种移
3 3
植肿瘤生长到平均306mm。第0天指肿瘤平均197-499mm 且施用第一/或唯一剂量治疗
3
时的那天，除非如下特别指出。肿瘤体积基于利用测径器测量的两个维度来计算，并以mm
2
为单位根据公式V＝0.5a X b 来表示，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。由各实验
组收集的数据表示为平均值±SE。将小鼠随机化为 6个各约9只小鼠的组并给药。组1
在第0，3，7，和10天接受静脉内(IV)注射1mg/kg 每周两次，进行两周。组2
在第0天接受单次IV注射组氨酸缓冲液并在第0，3，7，和10天接受IV注射0.9％氯化钠
(盐水)，每周两次，进行两周，作为赋形剂对照。组3在第0天接受单次IV注射4mg/kg Hu
抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-SPDB-DM4，CNJ 1433，作为缀合物对照。组4在第0天
接受单次IV注射4mg/kg Hu抗-FcRH513G9SPDB-DM4，CNJ 1503。组5在第0天接受单次
IV注射4mg/kg Hu抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-SPDB-DM4，CNJ 1433并在第0，3，
7，和10天接受IV注射1mg/kg 每周两次，进行两周。组6在第0天接受单次
IV注射4mg/kg Hu抗-FcRH513G9SPDB-DM4，CNJ 1503并在第0，3，7，和10天接受IV注射
1mg/kg 每周两次，进行两周。在整个实验过程中每周测量肿瘤2次。在前三周
3
每周测量小鼠体重2次。在肿瘤体积达到3000mm 前或当肿瘤显示迫近溃疡迹象时，对小鼠
进行安乐死。所有动物流程均由研究动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care
and Use Committee)(IACUC)批准。
[1300] 阴性对照包括基于抗-HER2 (曲妥珠单抗(trastuzumab)))的缀合物(SPDB-DM4)。
[1301] B.结果
[1302] 1.OPM2-FcRH5异种移植物
[1303] 在使用单独的和与 组合的药物缀合物的研究结束时，测定与组合的与-SPDB-DM4缀合的人源化抗-FcRH5(13G9)与阴性对照与-SPDB-DM4
缀合的人源化抗-Her2(Hu抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-SPDB-DM4)相比，对具有
OPM2-FcRH5肿瘤的SCID小鼠中肿瘤生长的抑制。此外，在各剂量组中确定前21天内的任
何百分比体重变化。还确定显示部分消退(PR；其中施药后任意时刻的肿瘤体积降低低于
在第0天测量的肿瘤体积的50％)，完全好转(CR；其中其中施药后任意时刻的肿瘤体积降
3
低至0mm)的小鼠占测试总数的数量(NA＝不适用)；(TI＝在研究结束时可观察到的肿瘤
数)。
缀合的人源化抗-Her2(Hu抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-SPDB-DM4)相比，对具有
OPM2-FcRH5肿瘤的SCID小鼠中肿瘤生长的抑制。此外，在各剂量组中确定前21天内的任
何百分比体重变化。还确定显示部分消退(PR；其中施药后任意时刻的肿瘤体积降低低于
在第0天测量的肿瘤体积的50％)，完全好转(CR；其中其中施药后任意时刻的肿瘤体积降
3
低至0mm)的小鼠占测试总数的数量(NA＝不适用)；(TI＝在研究结束时可观察到的肿瘤
数)。
[1304] 实施例10：通过人源化抗-FcRH5药物缀合物测定体内肿瘤生长抑制
[1305] A.异种移植
[1306] 为了测试具有-MC-vc-PAB-MMAE)的人源化(13G9)药物缀合物与和 加地塞米松(dexamethasone)的组合的功效，分析与 和
加地塞米松(dexamethasone)组合的缀合抗体对小鼠中肿瘤(多发性骨髓瘤
OPM2-FcRH5异种移植物)的影响。
加地塞米松(dexamethasone)组合的缀合抗体对小鼠中肿瘤(多发性骨髓瘤
OPM2-FcRH5异种移植物)的影响。
[1307] 特别地，检查抗体与 和 加地塞米松(dexamethasone)的组合抑制稳定转染人FcRH5的OPM2细胞(多发性骨髓瘤细胞系)中肿瘤的能力。在将
线性化pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5转染到OPM2细胞中和嘌呤霉素(puromycin)(Calbiochem，
圣地亚哥，CA)选择后，在MACS LS柱(Miltenyi Biotec，Auburn，Ca)上分离存活细胞，以
获得具有生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，Il)标记的抗-FcRH5.7D11和MACS
抗-生物素微珠的FcRH5表达细胞。分离后，利用抗-FcRH5抗体(13G9)通过FACS分析验
证FcRH5表达，用空载体pRK.CMV.PD.nbe以相同方式转染的OPM2细胞系作为阴性对照。
线性化pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5转染到OPM2细胞中和嘌呤霉素(puromycin)(Calbiochem，
圣地亚哥，CA)选择后，在MACS LS柱(Miltenyi Biotec，Auburn，Ca)上分离存活细胞，以
获得具有生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，Il)标记的抗-FcRH5.7D11和MACS
抗-生物素微珠的FcRH5表达细胞。分离后，利用抗-FcRH5抗体(13G9)通过FACS分析验
证FcRH5表达，用空载体pRK.CMV.PD.nbe以相同方式转染的OPM2细胞系作为阴性对照。
[1308] 为了分析与-MC-vc-PAB-MMAE缀合的hu抗-FcRH513G9与 和加地塞米松(dexamethasone)的组合的功效，将雌性CB17 ICR SCID小鼠(6-8
周龄，来自Charles Rivers实验室；Hollister，CA)通过注射到CB17 ICR SCID小鼠两侧，
7 3
皮下接种2X 10OPM2-FcRH5细胞，并容许异种移植肿瘤生长到平均446mm。第0天指肿瘤
3
263-630mm 且施用第一/或唯一剂量治疗时的那天，除非如下特别指出。肿瘤体积基于利
3 2
用测径器测量的两个维度来计算，并以mm 为单位根据公式V＝0.5a X b 来表示，其中a
和b分别是肿瘤的长和短直径。由各实验组收集的数据表示为平均值±SE。将小鼠随机
化为9个各约8只小鼠的组并给药。组1在第0-13天接受每日腹膜内(IP)注射DMSO和
MCT缓冲液混合物，作为赋形剂对照。组2在第0天接受单次静脉内(IV)注射6mg/kg Hu
抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1135，作为缀合物对照。组3在
第0天接受单次IV注射6mg/kg Hu抗-FcRH513G9-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1672，作为缀合物
对照。组4在第0-13天接受每日IP注射50mg/kg 组5在第0-3和7-10天
接受每日口 服(PO)给药3mg/kg地塞米松(dexamethasone)四天，随后停3天，进行2个
周期。组6在第0-13天接受每日IP注射50mg/kg 并在第0-3和7-10天接受
每日PO给药3mg/kg地塞米松(dexamethasone)四天，随后停3天，进行2个周期。组7在
第0天接受单次IV注射6mg/kg Hu抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-MC-vc-PAB-MMAE，
CNJ 1135，并在第0-13天接受每日IP注射50mg/kg 和在第0-3和7-10天接
受每日PO给药3mg/kg地塞米松(dexamethasone)四天，随后停3天，进行2个周期。组8
在第0天接受单次IV注射6mg/kg Hu抗-FcRH513G9-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1672，并在第
0-13天接受每日IP注射50mg/kg 和在第0-3和7-10天接受每日PO给药3mg/
kg地塞米松(dexamethasone)四天，随后停3天，进行2个周期。组9在第0天接受单次
IV注射6mg/kg Hu抗-FcRH513G9-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1672，并在第0-13天接受每日IP
注射50mg/kg 在整个实验过程中每周测量肿瘤2次。在整个实验过程中每周
测量小鼠体重2次。如果小鼠经历与其在第0天的体重相比超过15％的体重减轻，则每日
称重小鼠，直至重量恢复或直至体重减轻达到超过20％。小鼠体重减轻与第0天体重相比
3
达到超过20％时，在肿瘤体积达到3000mm 前或当肿瘤显示迫近溃疡迹象时，当对小鼠进行
安乐死。所有动物流程均由研究动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and
Use Committee)(IACUC)批准。
周龄，来自Charles Rivers实验室；Hollister，CA)通过注射到CB17 ICR SCID小鼠两侧，
7 3
皮下接种2X 10OPM2-FcRH5细胞，并容许异种移植肿瘤生长到平均446mm。第0天指肿瘤
3
263-630mm 且施用第一/或唯一剂量治疗时的那天，除非如下特别指出。肿瘤体积基于利
3 2
用测径器测量的两个维度来计算，并以mm 为单位根据公式V＝0.5a X b 来表示，其中a
和b分别是肿瘤的长和短直径。由各实验组收集的数据表示为平均值±SE。将小鼠随机
化为9个各约8只小鼠的组并给药。组1在第0-13天接受每日腹膜内(IP)注射DMSO和
MCT缓冲液混合物，作为赋形剂对照。组2在第0天接受单次静脉内(IV)注射6mg/kg Hu
抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1135，作为缀合物对照。组3在
第0天接受单次IV注射6mg/kg Hu抗-FcRH513G9-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1672，作为缀合物
对照。组4在第0-13天接受每日IP注射50mg/kg 组5在第0-3和7-10天
接受每日口 服(PO)给药3mg/kg地塞米松(dexamethasone)四天，随后停3天，进行2个
周期。组6在第0-13天接受每日IP注射50mg/kg 并在第0-3和7-10天接受
每日PO给药3mg/kg地塞米松(dexamethasone)四天，随后停3天，进行2个周期。组7在
第0天接受单次IV注射6mg/kg Hu抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-MC-vc-PAB-MMAE，
CNJ 1135，并在第0-13天接受每日IP注射50mg/kg 和在第0-3和7-10天接
受每日PO给药3mg/kg地塞米松(dexamethasone)四天，随后停3天，进行2个周期。组8
在第0天接受单次IV注射6mg/kg Hu抗-FcRH513G9-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1672，并在第
0-13天接受每日IP注射50mg/kg 和在第0-3和7-10天接受每日PO给药3mg/
kg地塞米松(dexamethasone)四天，随后停3天，进行2个周期。组9在第0天接受单次
IV注射6mg/kg Hu抗-FcRH513G9-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1672，并在第0-13天接受每日IP
注射50mg/kg 在整个实验过程中每周测量肿瘤2次。在整个实验过程中每周
测量小鼠体重2次。如果小鼠经历与其在第0天的体重相比超过15％的体重减轻，则每日
称重小鼠，直至重量恢复或直至体重减轻达到超过20％。小鼠体重减轻与第0天体重相比
3
达到超过20％时，在肿瘤体积达到3000mm 前或当肿瘤显示迫近溃疡迹象时，当对小鼠进行
安乐死。所有动物流程均由研究动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and
Use Committee)(IACUC)批准。
[1309] 阴性对照包括基于抗-HER2 (曲妥珠单抗(trastuzumab)))的缀合物(MC-vc-PAB-MMAE)。
[1310] B.结果
[1311] 1.OPM2-FcRH5异种移植物
[1312] 在使用与 和 加地塞米松(dexamethasone)组合的药物缀合物的研究结束时，测定与 和 加地塞米松(dexamethasone)
组合的与-MC-vc-PAB-MMAE缀合的人源化抗-FcRH5(13G9)与阴性对照与-MC-vc-PAB-MMAE
缀合的人源化抗-Her2(Hu抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-MC-vc-PAB-MMAE)相比，对
具有OPM2-FcRH5肿瘤的SCID小鼠中肿瘤生长的抑制。此外，在各剂量组中 确定前17天
内的任何百分比体重变化。还确定显示部分消退(PR；其中施药后任意时刻的肿瘤体积降
低低于在第0天测量的肿瘤体积的50％)，完全好转(CR；其中其中施药后任意时刻的肿瘤
3
体积降低至0mm)的小鼠占测试总数的数量(NA＝不适用)；(TI＝在研究结束时可观察到
的肿瘤数)。
组合的与-MC-vc-PAB-MMAE缀合的人源化抗-FcRH5(13G9)与阴性对照与-MC-vc-PAB-MMAE
缀合的人源化抗-Her2(Hu抗-Her2曲妥珠单抗(trastuzumab)-MC-vc-PAB-MMAE)相比，对
具有OPM2-FcRH5肿瘤的SCID小鼠中肿瘤生长的抑制。此外，在各剂量组中 确定前17天
内的任何百分比体重变化。还确定显示部分消退(PR；其中施药后任意时刻的肿瘤体积降
低低于在第0天测量的肿瘤体积的50％)，完全好转(CR；其中其中施药后任意时刻的肿瘤
3
体积降低至0mm)的小鼠占测试总数的数量(NA＝不适用)；(TI＝在研究结束时可观察到
的肿瘤数)。
[1313] 实施例11：生产和表征FcRH5双特异性抗体
[1314] 构建和生产抗-CD3/FcRH5双特异性抗体。FcRH5双特异性抗体，具体地抗-CD3/FcRH5突起-进入-腔(protruberance-into-cavity)双特异性抗体的构建记述如下。
[1315] 以前已经描述了不同突起-进入-腔双特异性抗体。参见，例如，美国专利号5,731,168和7,183,076；Ridgway等，Prot.Eng.(蛋白质工程)9：617-621(1996)；Atwell
等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270：26-35(1997)；Merchant等，Nat.Biotechn.(自然
生物技术)16：677-681(1998)。在某些实例中，改造以前由Chamow等J.Immunol.(免疫学
杂志)153：4268(1994)所述的人源化抗-CD3/CD4-IgG嵌合体之间的CH3界面，以最大化能
够由用表达构建体共同转染的哺乳动物细胞系回收的异多聚体(heteromultimer)的百分
比。用于本文中时，“异多聚体”指包含至少第一多肽和第二多肽的分子，例如，双特异性抗体，其中所述第二多肽的氨基酸序列与所述第一多肽存在至少一个氨基酸残基的区别。
等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270：26-35(1997)；Merchant等，Nat.Biotechn.(自然
生物技术)16：677-681(1998)。在某些实例中，改造以前由Chamow等J.Immunol.(免疫学
杂志)153：4268(1994)所述的人源化抗-CD3/CD4-IgG嵌合体之间的CH3界面，以最大化能
够由用表达构建体共同转染的哺乳动物细胞系回收的异多聚体(heteromultimer)的百分
比。用于本文中时，“异多聚体”指包含至少第一多肽和第二多肽的分子，例如，双特异性抗体，其中所述第二多肽的氨基酸序列与所述第一多肽存在至少一个氨基酸残基的区别。
[1316] 如前段中引用的文件中所述，用于驱动异多聚体形成的策略依赖于将一种或多种“突起”突变引入至第一多肽，例如一种抗体H链的CH3结构域，和还将一种或多种相对应的
“腔”突变引入至第二多肽，例如第二抗体H链的CH3结构域。“突起”突变将小氨基酸替换
为较大氨基酸，且“腔”突变将大氨基酸替换为较小氨基酸。此外，除突起和腔突变外，在两个多肽的界面，例如，2个CH3结构域处引入含有游离硫醇的残基，这显示提高异多聚体的形
成。已经描述了在多肽界面处引入的不同示范性突起-进入-腔突变和含游离硫醇的残基。
参见，例如，美国专利号5,731,168和7,183,076；Ridgway等，Prot.Eng.(蛋白质工程)9：
617-621(1996)；Atwell等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270：26-35(1997)；Merchant
等，Nat.Biotechn.(自然生物技术)16：677-681(1998)。
“腔”突变引入至第二多肽，例如第二抗体H链的CH3结构域。“突起”突变将小氨基酸替换
为较大氨基酸，且“腔”突变将大氨基酸替换为较小氨基酸。此外，除突起和腔突变外，在两个多肽的界面，例如，2个CH3结构域处引入含有游离硫醇的残基，这显示提高异多聚体的形
成。已经描述了在多肽界面处引入的不同示范性突起-进入-腔突变和含游离硫醇的残基。
参见，例如，美国专利号5,731,168和7,183,076；Ridgway等，Prot.Eng.(蛋白质工程)9：
617-621(1996)；Atwell等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270：26-35(1997)；Merchant
等，Nat.Biotechn.(自然生物技术)16：677-681(1998)。
[1317] 进行以下步骤，以生成抗-CD3/FcRH5双特异性抗体。构建编码鼠抗-CD3单克隆Ab UCHT1的人源化抗-CD3轻(L)和重(H)链变体的大肠杆菌表达质粒(美国专利
号5,821,337和6,407,213；Shalaby等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)175：217[1992]和
Rodrigues等，Int.J.Cancer(Suppl.)(国际癌症杂志副刊)7：45[1992])。许多合适的大
肠杆菌表达质粒是本领域中已知的，包括pAK19。Carter等，Bio/Tehcnology(生物/技
术)10：163-167(1992)。将突起或腔引入至人源化抗-CD3H链的CH3结构域的突变(如上
所述)，例如，通过位点定向诱变制备。不同的位点定向诱变法是本领域中公知的。参见，例如，Kunkel等，Methods Enzymol.(酶学方法)154：367-382(1987)。另外，构建编码人源化
抗-FcRH5轻链和重链，如本领域中所述的人源化抗-FcRH5轻链和重链的大肠杆菌表达质
粒。在人源化抗-FcRH5H链的CH3结构域(如上所述)中引入相应腔(如果抗-CD3CH3结
构域具有突起突变)或相应突起(如果抗-CD3CH3结构域具有腔突变)的突变，例如，通过
位点定向诱变制备。
号5,821,337和6,407,213；Shalaby等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)175：217[1992]和
Rodrigues等，Int.J.Cancer(Suppl.)(国际癌症杂志副刊)7：45[1992])。许多合适的大
肠杆菌表达质粒是本领域中已知的，包括pAK19。Carter等，Bio/Tehcnology(生物/技
术)10：163-167(1992)。将突起或腔引入至人源化抗-CD3H链的CH3结构域的突变(如上
所述)，例如，通过位点定向诱变制备。不同的位点定向诱变法是本领域中公知的。参见，例如，Kunkel等，Methods Enzymol.(酶学方法)154：367-382(1987)。另外，构建编码人源化
抗-FcRH5轻链和重链，如本领域中所述的人源化抗-FcRH5轻链和重链的大肠杆菌表达质
粒。在人源化抗-FcRH5H链的CH3结构域(如上所述)中引入相应腔(如果抗-CD3CH3结
构域具有突起突变)或相应突起(如果抗-CD3CH3结构域具有腔突变)的突变，例如，通过
位点定向诱变制备。
[1318] 双特异性抗-CD3/FcRH5抗体通过利用本领域中公知的方法将上述大肠杆菌表达质粒转化到合适大肠杆菌菌株，例如，33B6中而生成。参见，例如，Rodrigues等，Cancer
Res.(癌症研究)55：63-70(1995)。抗体由在10L发酵器中生长的转化大肠杆菌分泌，如
前所述。Carter等，Bio/Technology(生物/技术)10：163-167(1992)。抗体利用本领域
中已知的程序纯化和分析。参见，例如，Atwell等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270：
26-35(1997)。
Res.(癌症研究)55：63-70(1995)。抗体由在10L发酵器中生长的转化大肠杆菌分泌，如
前所述。Carter等，Bio/Technology(生物/技术)10：163-167(1992)。抗体利用本领域
中已知的程序纯化和分析。参见，例如，Atwell等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270：
26-35(1997)。
[1319] 细胞结合测定：为了评估抗-CD3/FcRH5双特异性抗体结合B细胞和T细胞的能力，利用Ficoll梯度，根据本领域中已知的标准程序，由来自健康供体的全血分离人
外周白细胞。使用抗-CD3/FcRH5双特异性抗体在冰上，在含有0.5％BSA和2mM EDTA
的PBS缓冲液中温育约1百万个细胞。然后洗涤细胞，并用FITC-缀合的山羊(Fab’)2
抗-人IgG，以及抗-CD8-APC和抗-CD138-PE和抗-CD38-PerCP-Cy5抗体，遵从生产商流
程(BD Biosciences，圣地亚哥，CA)对其进行染色。结合活性使用基于FACS的测定，利用
TM
FACSCalibur 流式细胞计数器(BD Biosciences，圣地亚哥，CA)来评估并利用Flowjo软
件(Tree Star，Ashland，OR)进行分析。
外周白细胞。使用抗-CD3/FcRH5双特异性抗体在冰上，在含有0.5％BSA和2mM EDTA
的PBS缓冲液中温育约1百万个细胞。然后洗涤细胞，并用FITC-缀合的山羊(Fab’)2
抗-人IgG，以及抗-CD8-APC和抗-CD138-PE和抗-CD38-PerCP-Cy5抗体，遵从生产商流
程(BD Biosciences，圣地亚哥，CA)对其进行染色。结合活性使用基于FACS的测定，利用
TM
FACSCalibur 流式细胞计数器(BD Biosciences，圣地亚哥，CA)来评估并利用Flowjo软
件(Tree Star，Ashland，OR)进行分析。
[1320] 体外细胞杀伤测定：EJM-FcRH5.LSP.2多发性骨髓瘤细胞(用人FcRH5稳定转染的EJM细胞，DSMZ ACC-560)用作靶细胞并与总人外周白细胞或CD8+T细胞共同培养。如果
使用CD8+T细胞，它们通过利用CD8+T细胞分离试剂盒，(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)
在96孔圆底平板中的阴性分选由人PBMC纯化。加入20,000EJM-FcRH5.LSP.2细胞/孔，靶
细胞∶效应细胞的比率＝1∶10，其具有或不具有抗-CD3/FcRH5双特异性抗体。约19小
时后，细胞用标记的抗-CD38-FITC和抗-CD138-PE，遵从生产商流程(BD Biosciences，圣
地亚哥，CA)来染色，并与 校准级6.0微米YG微球(Polysciences，Inc.，
Warrington，PA)混合。通过门控正向/侧向扩散和CD38-CD138染色进行FACS分析。根
据标准程序，利用碘化丙锭染色排除死亡细胞。抗-CD3/FcRH5双特异性抗体的特异性杀伤
活性根据下式计算：％特异性杀伤＝(1-进行处理的活EJM-FCRH5.LSP.2细胞数/效应器
和无抗-CD3/FcRH5双特异性抗体的EJM-FCRH5.LSP.2中的活EJM-FCRH5.LSP.2细胞数)x
100。
使用CD8+T细胞，它们通过利用CD8+T细胞分离试剂盒，(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)
在96孔圆底平板中的阴性分选由人PBMC纯化。加入20,000EJM-FcRH5.LSP.2细胞/孔，靶
细胞∶效应细胞的比率＝1∶10，其具有或不具有抗-CD3/FcRH5双特异性抗体。约19小
时后，细胞用标记的抗-CD38-FITC和抗-CD138-PE，遵从生产商流程(BD Biosciences，圣
地亚哥，CA)来染色，并与 校准级6.0微米YG微球(Polysciences，Inc.，
Warrington，PA)混合。通过门控正向/侧向扩散和CD38-CD138染色进行FACS分析。根
据标准程序，利用碘化丙锭染色排除死亡细胞。抗-CD3/FcRH5双特异性抗体的特异性杀伤
活性根据下式计算：％特异性杀伤＝(1-进行处理的活EJM-FCRH5.LSP.2细胞数/效应器
和无抗-CD3/FcRH5双特异性抗体的EJM-FCRH5.LSP.2中的活EJM-FCRH5.LSP.2细胞数)x
100。
[1321] 体内功效：EJM-FcRH5.LSP.2多发性骨髓瘤细胞与外周血单核细胞混合并皮下注scid
射到雌性NOD.CD17-Prkdc /J小鼠(Charles Rivers实验室，Wilmington，MA)的右胸侧。
接种的小鼠然后随机分为对照和处理组。对照组施用赋形剂或抗-CD3/Her2对照双特异性
抗体。处理组施用抗-CD3/FcRH5双特异性抗体。双特异性抗体以0.01-10mg/kg范围施用。
对照或处理在细胞接种后1-2小时内静脉内施用并每日重复，连续5天。肿瘤利用测径器
以两个维度(长度和宽度)来测量，每周2次。小鼠临床监测，每周2次。在实验结束时，
对照-处理动物中肿瘤大小与抗-CD3/FcRH5双特异性抗体-处理动物中的肿瘤大小比较，
以评估抗-CD3/FcRH5双特异性抗体处理的功效。
射到雌性NOD.CD17-Prkdc /J小鼠(Charles Rivers实验室，Wilmington，MA)的右胸侧。
接种的小鼠然后随机分为对照和处理组。对照组施用赋形剂或抗-CD3/Her2对照双特异性
抗体。处理组施用抗-CD3/FcRH5双特异性抗体。双特异性抗体以0.01-10mg/kg范围施用。
对照或处理在细胞接种后1-2小时内静脉内施用并每日重复，连续5天。肿瘤利用测径器
以两个维度(长度和宽度)来测量，每周2次。小鼠临床监测，每周2次。在实验结束时，
对照-处理动物中肿瘤大小与抗-CD3/FcRH5双特异性抗体-处理动物中的肿瘤大小比较，
以评估抗-CD3/FcRH5双特异性抗体处理的功效。
[1322] 实施例12：通过人源化抗-FcRH5药物缀合物测定体内肿瘤生长抑制
[1323] A.异种移植
[1324] 为了测试具有MC-vc-PAB-MMAE的hu13G9药物缀合物在不同剂量的功效，分析缀合抗体对小鼠中肿瘤的影响。
[1325] 特别地，检查抗体抑制稳定转染人FcRH5的EJM细胞(多发性骨髓瘤 细胞系)中肿瘤的能力。
[1326] EJM(ACC-560)细胞是获自DSMZ(德国)的可商购的人多发性骨髓瘤细胞系。由于EJM细胞不内源性表达FcRH5，所以用人FcRH5稳定转染EJM细胞，由此产生EJM.CMV.
PD.FcRH5.LSP.2细胞系。
PD.FcRH5.LSP.2细胞系。
[1327] 为了分析具有MC-vc-PAB-MMAE的hu13G9药物缀合物的功效，将雌性CB17ICRSCID小鼠(6-8周龄，来自Charles Rivers实验室；Hollister，CA)通过注射到CB17ICR
7
SCID小鼠两侧，皮下接种2X 10EJM2-FcRH5.LSP.2细胞，并容许异种移植肿瘤生长到平均
3 3
134mm。第0天指肿瘤100-250mm 且施用第一/或唯一剂量治疗时的那天，除非如下特别
3
指出。肿瘤体积基于利用测径器测量的两个维度来计算，并以mm 为单位根据公式V＝0.5a
2
X b 来表示，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。由各实验组收集的数据表示为平均
值±SE。小鼠的组用范围为约1-约8mgADC/kg的抗-FcRH5ADC或对照抗体-药物缀合物
(ADCs)单次静脉(i.v.)给药来处理。在整个实验过程中每周测量肿瘤2次。每周测量小鼠
3
体重1次，进行2周。在肿瘤体积达到3000mm 前或当肿瘤显示迫近溃疡迹象时，对小鼠进
行安乐死。阴性对照包括基于抗-HER2 (曲妥珠单抗(trastuzumab)))
的缀合物(MC-vc-PAB-MMAE)。
7
SCID小鼠两侧，皮下接种2X 10EJM2-FcRH5.LSP.2细胞，并容许异种移植肿瘤生长到平均
3 3
134mm。第0天指肿瘤100-250mm 且施用第一/或唯一剂量治疗时的那天，除非如下特别
3
指出。肿瘤体积基于利用测径器测量的两个维度来计算，并以mm 为单位根据公式V＝0.5a
2
X b 来表示，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。由各实验组收集的数据表示为平均
值±SE。小鼠的组用范围为约1-约8mgADC/kg的抗-FcRH5ADC或对照抗体-药物缀合物
(ADCs)单次静脉(i.v.)给药来处理。在整个实验过程中每周测量肿瘤2次。每周测量小鼠
3
体重1次，进行2周。在肿瘤体积达到3000mm 前或当肿瘤显示迫近溃疡迹象时，对小鼠进
行安乐死。阴性对照包括基于抗-HER2 (曲妥珠单抗(trastuzumab)))
的缀合物(MC-vc-PAB-MMAE)。
[1328] B.结果
[1329] 1.EJM-FcRH5.LSP.2异种移植物
[1330] 在实验结束时，对照-处理动物中的肿瘤大小与抗-FcRH5ADC-处理动物中的肿瘤大小比较，以评估抗-FcRH5ADC处理的功效。特别地，还确定显示部分消退(PR；其中施药
后任意时刻的肿瘤体积降低低于在第0天测量的肿瘤体积的50％)，完全好转(CR；其中其
3
中施药后任意时刻的肿瘤体积降低至0mm)的小鼠占测试总数的数量(NA＝不适用)；(TI
＝在研究结束时可观察到的肿瘤数)。
后任意时刻的肿瘤体积降低低于在第0天测量的肿瘤体积的50％)，完全好转(CR；其中其
3
中施药后任意时刻的肿瘤体积降低至0mm)的小鼠占测试总数的数量(NA＝不适用)；(TI
＝在研究结束时可观察到的肿瘤数)。
[1331] 实施例13：通过人源化抗-FcRH5药物缀合物测定体内肿瘤生长抑制
[1332] A.异种移植
[1333] 为了测试具有SPDB-DM4的hu13G9药物缀合物在不同剂量的功效， 分析缀合抗体对小鼠中肿瘤的影响。
[1334] 特别地，检查抗体抑制稳定转染人FcRH5的EJM细胞(多发性骨髓瘤细胞系)中肿瘤的能力。
[1335] EJM(ACC-560)细胞是获自DSMZ(德国)的可商购的人多发性骨髓瘤细胞系。由于EJM细胞不内源性表达FcRH5，所以用人FcRH5稳定转染EJM细胞，由此产生EJM.CMV.
PD.FcRH5.LSP.2细胞系。
PD.FcRH5.LSP.2细胞系。
[1336] 为了分析具有SPDB-DM4的hu13G9药物缀合物的功效，将雌性CB17ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自Charles Rivers实验室；Hollister，CA)通过注射到CB17 ICR SCID小鼠
7 3
两侧，皮下接种2X 10EJM2-FcRH5.LSP.2细胞，并容许异种移植肿瘤生长到平均134mm。第
3
0天指肿瘤100-250mm 且施用第一/或唯一剂量治疗时的那天，除非如下特别指出。肿瘤
3 2
体积基于利用测径器测量的两个维度来计算，并以mm 为单位根据公式V＝0.5a Xb 来表
示，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。由各实验组收集的数据表示为平均值±SE。小
鼠的组用范围为约2-约8mg ADC/kg的抗-FcRH5ADC或对照抗体-药物缀合物(ADCs)单
次静脉(i.v.)给药来处理。在整个实验过程中每周测量肿瘤2次。每周测量小鼠体重1
3
次，进行2周。在肿瘤体积达到3000mm 前或当肿瘤显示迫近溃疡迹象时，对小鼠进行安乐
死。阴性对照包括基于抗-HER2 (曲妥珠单抗(trastuzumab)))的缀
合物(SPDB-DM4)。
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两侧，皮下接种2X 10EJM2-FcRH5.LSP.2细胞，并容许异种移植肿瘤生长到平均134mm。第
3
0天指肿瘤100-250mm 且施用第一/或唯一剂量治疗时的那天，除非如下特别指出。肿瘤
3 2
体积基于利用测径器测量的两个维度来计算，并以mm 为单位根据公式V＝0.5a Xb 来表
示，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。由各实验组收集的数据表示为平均值±SE。小
鼠的组用范围为约2-约8mg ADC/kg的抗-FcRH5ADC或对照抗体-药物缀合物(ADCs)单
次静脉(i.v.)给药来处理。在整个实验过程中每周测量肿瘤2次。每周测量小鼠体重1
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次，进行2周。在肿瘤体积达到3000mm 前或当肿瘤显示迫近溃疡迹象时，对小鼠进行安乐
死。阴性对照包括基于抗-HER2 (曲妥珠单抗(trastuzumab)))的缀
合物(SPDB-DM4)。
[1337] B.结果
[1338] 1.EJM-FcRH5.LSP.2异种移植物
[1339] 在实验结束时，对照-处理动物中的肿瘤大小与抗-FcRH5ADC-处理动物中的肿瘤大小比较，以评估抗-FcRH5ADC处理的功效。特别地，还确定显示部分消退(PR；其中施药
后任意时刻的肿瘤体积降低低于在第0天测量的肿瘤体积的50％)，完全好转(CR；其中其
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中施药后任意时刻的肿瘤体积降低至0mm)的小鼠占测试总数的数量(NA＝不适用)；(TI
＝在研究结束时可观察到的肿瘤数)。
后任意时刻的肿瘤体积降低低于在第0天测量的肿瘤体积的50％)，完全好转(CR；其中其
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中施药后任意时刻的肿瘤体积降低至0mm)的小鼠占测试总数的数量(NA＝不适用)；(TI
＝在研究结束时可观察到的肿瘤数)。
[1340] 认为前述书面说明足以容许本领域中技术人员实践本发明。本发明不由保藏的构建体限定范围，因为保藏的实施方案意欲作为本发明某些方面 的简单举例说明，并且功能
等价的任何构建体均属于本发明的范围。本文中的材料保藏不构成承认本文中所包含的书
面说明不充分容许实践本发明的任何方面，包括其最佳模式，且也不被解释为将权利要求
的范围限制为其所代表具体举例。实际上，除本文中所示和所述的那些以外的本发明的不
同变化对于本领域中技术人员应该由前述说明变得清楚并属于所附权利要求的范围。
等价的任何构建体均属于本发明的范围。本文中的材料保藏不构成承认本文中所包含的书
面说明不充分容许实践本发明的任何方面，包括其最佳模式，且也不被解释为将权利要求
的范围限制为其所代表具体举例。实际上，除本文中所示和所述的那些以外的本发明的不
同变化对于本领域中技术人员应该由前述说明变得清楚并属于所附权利要求的范围。
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