一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法
专利汇可以提供一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 荧光 假单胞菌免疫 磁珠 -酶联免疫检测方法，将活化后的羧基磁珠与辛酸 硫酸 铵纯化的荧光假单胞菌多克隆 抗体 相偶联，得到荧光假单胞菌免疫磁珠，建立免疫磁珠富集结合酶联免疫检测法，将该检测方法与普通的ELISA快速检测方法进行比较，从而得到一种快速、有效的荧光假单胞菌检测方法。结果表明，本发明建立的荧光假单胞菌免疫磁珠-ELISA检测方法，板内板间重复性良好，与单增李斯特菌、大肠杆菌、粪肠球菌CR均小于0.1%，且对于荧光假单胞菌的检测平均回收率为100.6%，是一种快速准确检测 牛 奶等食品中荧光假单胞菌污染的有效方法。，下面是一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法专利的具体信息内容。
1.一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于按以下工艺步骤：
1）辛酸-硫酸铵法纯化多克隆抗体：血清和醋酸缓冲液按体积比1:2混合，用1mol/L HCL 调节pH至4.8，逐滴加入辛酸至其终浓度为25μL/mL，4℃静置2h后离心，弃沉淀，加入1/10体积的PBS缓冲液，用1mol/L NaOH 调节pH至7.2，加入饱和NH4(SO4)2至其终浓度为45%，4℃反应30min后离心，弃上清，PBS重悬沉淀，悬浮液用100倍体积PBS透析过夜，透析物离心后，取上清于零下20℃保存备用；
2）磁珠的活化：取200μL经200w条件下超声处理10min的羧基磁珠于离心管中在样品混合仪上震荡，将离心管置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附后弃掉上清，加入1mL MES缓冲液重悬磁珠，再加入100μL EDC溶液，室温条件下在样品混合仪上活化30min，得活化后的磁珠；
3）磁珠的包被：用1mL MES缓冲液洗涤活化后的磁珠2遍，加入500μL纯化后的多克隆血清抗体蛋白，室温反应过夜，即得到免疫磁珠；用1mL MES缓冲液洗涤封闭后免疫磁珠
2遍，用1mL含牛血清蛋白的PBS重悬免疫磁珠，保存于4℃冰箱待用；
4）效价的测定：采用间接ELISA 进行效价测定；
5）最佳工作浓度的确定：选用效价最高的血清，用方阵滴定法，分别稀释抗体和抗原包被物，按步骤4）所述方法进行测定，最终选择OD450 ≈1的抗体和抗原包被物的稀释度作为最佳工作浓度；
6）标准曲线的建立：选择最佳工作浓度的抗原包被，采用步骤4）所述的方法制作标准曲线，不同之处是加抗血清步骤中，每孔加入最佳工作浓度的抗血清或免疫磁珠-抗体蛋白90μL，同时分别加入不同稀释倍数的抗原10μL，混匀，使混合液中抗原的最终浓度依
2 3 4 5 6 7 8
次0，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，竞争抑制率（%）= 各浓度孔的吸光值/阳性对照孔的吸光值×100%；
7）特异性检测：用上述建立的ELISA方法分别检测单增李斯特菌，大肠杆菌，粪肠球菌，结果观察荧光假单胞菌的抗性血清是否会与其它细菌有交叉反应；
8）重复性试验
板内重复性试验：应用已经建立的间接ELISA方法，使用同样的荧光假单胞菌阳性血清或免疫磁珠-抗体蛋白偶联物分别进行检测，样品中荧光假单胞菌菌落浓度依次为
5 6 7
10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，每份样品重复10孔，同时设立与抗原并列的阴性对照孔和空白对照孔，计算每份血清的OD值的平均值与标准差，进而计算每份血清的板内变异系数；
板间重复性试验：按照已经建立的间接ELISA方法对同样的荧光假单胞菌阳性血清或免疫磁珠-抗体蛋白分别在3块酶标板上进行检测，每板每份血清重复10孔，同时设立与抗原并列的阴性对照空和空白对照孔，测定OD值，计算每份血清的板间变异系数；
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9）样品检测：分别配制浓度依次为10，10，10，10，10，10,10cfu/mL的荧光假单胞菌液体作为样品，每0.1mL样品同偶联好的0.9 mL免疫磁珠混合，震荡孵育时间是45 min, 磁分离时间是3min,捕获样品中的荧光假单胞菌，分别用已建立的IC-ELISA方法以及免疫磁珠-酶联免疫试剂盒检测并计算回收率。
2.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于步骤1）中醋酸缓冲液的pH值为5.0，浓度为0.06 mol/L，离心时间为30min，转速为
10000rpm。
3.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于步骤2）中超声处理时间为10min，混合仪上震荡时间为30min，EMS缓冲液的pH值为6.0，EDC溶液的浓度为10mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于步骤3）中MES缓冲液的pH值为6.0，PBS中牛血清蛋白的含量为0.1%。
5.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于ELISA按以下步骤进行测定：
5
1）包被：将抗原用CBS稀释至最佳工作浓度，即10cfu/mL,每孔100μL加入96孔酶标板，盖上保鲜膜，37℃孵育2h；
2）洗板：迅速倒去孔中液体，用PBST洗涤3遍,每次洗3min；
3）封闭：每孔加入200μL封闭液，置于37℃恒温培养箱封闭 2h；接着用 PBST洗涤3遍后拍干；
4）加入一抗：按1:100-1:51200梯度稀释抗血清或免疫磁珠-抗体蛋白，加入酶标孔中，每样至少重复一次，每孔加100μL, 37℃孵育半小时，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干；
5）加入二抗：将HRP酶标山羊抗兔IgG稀释1000倍，每孔加50μL，37℃孵育60min，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干；
6）加入TMB显色剂显色：每孔100μL，37℃避光放置10-15min；
7）终止反应,每孔加入100μL终止液结束反应，在结束反应后20min内测定结果；
8）酶标仪检测：TMB 反应后酶标仪450nm波长读取OD450。
一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法
技术领域
背景技术
发明内容
2）磁珠的活化：羧基磁珠经200w条件下超声处理10min后取200μL于离心管中，在样品混合仪上震荡，将离心管置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附后弃掉上清，加入1mL MES缓冲液重悬磁珠，再加入100μL EDC溶液，室温条件下，在样品混合仪上活化30min，得活化后的磁珠；
3）磁珠的包被：用1mL MES缓冲液洗涤活化后的磁珠2遍，加入500μL纯化后的多克隆血清抗体，室温反应过夜，即得到免疫磁珠，用1mL MES缓冲液洗涤封闭后的磁珠2遍，用
1mL含牛血清蛋白的PBS重悬磁珠，保存于4℃冰箱待用；
4）效价的测定：采用间接ELISA 进行效价测定；
5）最佳工作浓度的确定：选用效价最高的血清，用方阵滴定法，分别稀释抗体和抗原包被物，按步骤4）所述方法进行测定，最终选择OD450≈1的抗体和抗原包被物的稀释度作为最佳工作浓度；
6）标准曲线的建立：选择最佳工作浓度的抗原包被，采用步骤4）所述的方法制作标准曲线，不同之处是加抗血清步骤中，每孔加入最佳工作浓度的抗血清或免疫磁珠-抗体蛋白90μL，同时分别加入不同稀释倍数的抗原10μL，混匀，使混合液中抗原的最终浓度依
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次0，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，竞争抑制率（%）= 各浓度孔的吸光值/阳性对照孔的吸光值×100%；
7）特异性检测：用上述建立的ELISA方法分别检测单增李斯特菌，大肠杆菌，粪肠球菌，结果观察荧光假单胞菌的抗性血清是否会与其它细菌有交叉反应；
8）重复性试验
板内重复性试验：应用已经建立的间接ELISA方法，使用同样的荧光假单胞菌阳性血清或免疫磁珠-抗体蛋白偶联物分别进行检测，样品中银光假单胞菌菌落浓度依次为
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10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，每份样品重复10孔，同时设立与抗原并列的阴性对照孔和空白对照孔，计算每份血清的OD值的平均值与标准差，进而计算每份血清的板内变异系数；
板间重复性试验：按照已经建立的间接ELISA方法对同样的荧光假单胞菌阳性血清或免疫磁珠-抗体蛋白分别在3块酶标板上进行检测，每板每份血清重复10孔，同时设立与抗原并列的阴性对照空和空白对照空，测定OD值，计算每份血清的板间变异系数；
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9）样品检测：分别配置浓度依次为10，10，10，10，10，10,10 cfu/mL的荧光假单胞菌液体，作为样品，每0.1mL样品同偶联好的0.9 mL免疫磁珠混合，震荡孵育时间是45 min, 磁分离时间是3min,捕获样品中的荧光假单胞菌，分别用已建立的IC-ELISA方法以及免疫磁珠-酶联免疫试剂盒检测并计算回收率。
1）包被：将抗原用CBS至最佳工作浓度，即10cfu/mL,每孔100μL加入96孔酶标板，盖上保鲜膜，37℃孵育2h；
2）洗板：迅速倒去孔中液体，用PBST洗涤3遍,每次洗3min；
3）封闭：每孔加入200μL封闭液，置于37℃恒温培养箱封闭 2h；接着用 PBST洗涤3遍后拍干；
4）加入一抗：按1:100-1:51200梯度稀释抗血清或免疫磁珠-抗体蛋白，加入酶标孔中，每样至少重复一次，每孔加100μL,37℃孵育半小时，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干；
5）加入二抗：将HRP酶标山羊抗兔IgG稀释1000倍，每孔加50μL，37℃孵育60min，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干；
6）加入TMB显色剂显色：每孔100μL，37℃避光放置10-15min；
7）终止反应,每孔加入100μL终止液结束反应，在结束反应后20min内测定结果；
8）酶标仪检测：TMB 反应后酶标仪450nm波长读取OD450。设空白及阴性对照，分别为 PBS 溶液和免疫前采集的阴性血清。
具体实施方式
2 h 后10000 rpm离心30 min，弃沉淀，加入1/10 体积的PBS 缓冲液，用1mol/L NaOH 调节pH至7.2，加入饱和NH4(SO4)2至其终浓度为 45%，4℃ 反应30 min后， 10000 rpm离心
30 min，弃上清，PBS 重悬沉淀，悬浮液用100倍体积PBS透析过夜，透析物10000 rpm离心
30min，取上清于-20℃保存备用。结果见图1。
1）包被：将抗原用CBS 稀释至10cfu/mL-10 cfu/mL，每孔 100μL加入96孔酶标板，盖上保鲜膜，37℃孵育2 h；
2）洗板：迅速倒去孔中液体，用 PBST 洗涤3遍,每次洗 3min；
3）封闭：每孔加入 200μL 封闭液，置于 37℃恒温培养箱封闭 2 h；接着用 PBST 洗涤3遍后拍干；
4）加入一抗：按 1:100-1:51200梯度稀释抗血清或免疫磁珠-抗体蛋白，加入酶标孔中，每样至少重复一次，每孔加100μL, 37℃孵育半小时，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干；
5）加入二抗：将 HRP 酶标山羊抗兔 IgG 稀释 1000 倍，每孔加 50μL， 37℃孵育
60min，倒空，洗涤3遍，每遍 3分钟，拍干；
6）加入TMB显色剂显色：每孔100μL，37℃避光放置10-15min；
7）终止反应：每孔加入100μL终止液结束反应，在结束反应后20min 内测定结果；
8）酶标仪检测：TMB 反应后酶标仪 450nm 波长读取 OD450。设空白及阴性对照，分别为 PBS 溶液和免疫前采集的阴性兔血清。
依次0，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL。
5 6 7
10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL，每份样品重复10孔。同时设立与抗原并列的阴性对照孔和空白对照孔。计算每份血清的OD值的平均值与标准差，进而计算每份血清的板内变异系数。
0.2左右且对应包被浓度下，P/N= 阳性血清OD值/阴性血清OD值≈2.1时的抗原稀释倍
6
数即为其效价。当包被抗原浓度为10cfu/mL，多克隆血清抗体稀释倍数为128000时，阴性血清OD值为0.214，阳性血清OD值为0.436，此时P/N=2.06；
最佳工作浓度的确定：采用ELISA操作步骤，分别使用不同浓度的抗原包被后进行方
5
阵滴定，确立最佳工作浓度。当OD值=1.041时，包被原浓度为10 cfu/mL、血清稀释倍数
1:800，为直接使用抗血清时ELISA方法的最佳工作浓度。
阵滴定后可知，当OD值=1.021 时，包被原浓度为10 cfu/mL、免疫磁珠-抗体蛋白偶联物稀释800倍，即为ELISA方法的最佳工作浓度。
10 cfu/mL时，进行方阵交叉反应，最终可得标准曲线如图2所示。从图2中可以看出，当
2
直接使用抗血清时，标准曲线所得线性方程为y=-7.448x+112.8，其中R=0.949；当使用免疫磁珠-抗体蛋白偶联物进行ELISA时，标准曲线所得线性方程为y=-9.5655x+105.76，其中R²=0.9606。
5 6 7
落浓度下（10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL），荧光假单胞菌阳性血清的OD值的板内变异系数分别为8.09％、4.24％和2.34％；当使用免疫磁珠-抗体蛋白的偶联物作为一抗，进行
5 6 7
ELISA操作时，测定3种不同菌落浓度下（10cfu/mL，10cfu/mL，10cfu/mL），荧光假单胞菌板内变异系数分别为7.25%、0.69%和2.88%。可发现，两种不同操作下，板内变异系数CR均小于10％，说明同一样品在同一批试验中变异程度很小，具有较好的重复性。与直接使用抗血清相比，免疫磁珠-抗体蛋白偶联物测定结果中，板内变异系数优于前者，因此在荧光假单胞菌检测中具有较好的应用前景。
106 4.24 0.69
107 2.34 2.88
板间重复性实验：板间重复试验试验结果经统计学处理，显示当直接使用抗血清时，荧光假单胞菌阳性血清的OD值的板间变异系数为2.82％；当使用免疫磁珠-抗体蛋白偶联物时，板间变异系数为1.96％。两种测定方法中，板间变异系数均小于10％，说明同一样品在不同批次试验中变异程度很小，具有较好的重复性。两者比较也可发现，在ELISA方法中，与直接使用抗血清相比，使用免疫磁珠-抗体蛋白偶联物板间重复性更好。见表2。
抗血清 0.519 0.514 0.492 2.82
免疫磁珠-抗体蛋白0.579 0.595 0.601 1.96
样品检测：采用上述建立的IC-ELISA方法，对已知浓度的样品进行检测，并计算样品
1
回收率，结果如表3所示。由结果可知，当样品中荧光假单胞菌浓度为10 cfu/mL以上时，使用抗血清作为一抗时，其平均回收率为92.2%；使用免疫磁珠-抗体蛋白作为一抗时，其平均回收率为100.6%，此时样品回收率高于直接使用抗血清。基本满足实际生产中的需求。
回收率2为使用免疫磁珠-抗体蛋白偶联物作为一抗时，ELISA检测荧光假单胞菌后的回收率。
有所降低。直接使用抗血清时，标准线性方程为y=-7.448x+112.8，其中R=0.949，此时可求
8.3
得IC50为10 cfu/mL；当使用免疫磁珠-抗体蛋白偶联物进行ELISA时，标准曲线所得线
5.8
性方程为y = -9.5655x + 105.76，其中R² = 0.9606，此时可求得IC50为10 cfu/mL。
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