评价乙肝患者机体免疫力水平的检测试剂盒及其制备方法
阅读：1027发布：2020-09-13
专利汇可以提供评价乙肝患者机体免疫力水平的检测试剂盒及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及了一种评价乙肝患者 机体 免疫 力 水 平的方法、应用于该方法的一种检测核心 抗体 亚类IgG3和IgG1的酶联免疫 试剂 盒 和一种检测核心抗体亚类IgG3和IgG1的 化学发光 检测试剂盒检测试剂盒及其制备方法。所述方法包括下列步骤：(1)检测核心抗体亚类IgG3和IgG1；(2)计算IgG3和IgG1的比值；(3)根据IgG3和IgG1的比值评估乙肝患者机体清除病原体的能力，预测乙肝 治疗 效果和 预后 。所述各试剂盒采用所述方法，对人血清中的乙肝核心 抗原 抗体中的亚类IgG3和IgG1进行检验。本发明可用于乙型 肝炎 病毒的发展水平、预后诊断，治疗效果评价等。，下面是评价乙肝患者机体免疫力水平的检测试剂盒及其制备方法专利的具体信息内容。
1、一种检测核心抗体亚类IgG3和IgG1的酶联免疫试剂盒，包括下列组件： (1)包被了乙肝核心抗原的酶标板； (2)酶工作液； (3)酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液， 所述的底物溶液为磷酸-柠檬酸缓冲液配制的3％过氧化氢溶液；显色液为四甲基联苯胺甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；反应终止液为2mol/L硫酸；清洗缓冲液为PBS配制的0.05％吐温20溶液。
2、如权利要求1所述的试剂盒的制作方法，包括以下步骤：(1) 获得乙肝核心抗原，包被到酶标板吸附过夜；(2) 用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐緩冲 液封闭过夜，甩干后晾干；(3 )获得酶标记物鼠抗人IgG3单克隆抗体和鼠抗人IgGl单克隆抗体；(4 )将酶标记物分别溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工 作液1、酶工作液2;(5)将酶标板、各酶工作液、酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液 和清洗緩冲液共同包装，得到试剂盒。
3、如权利要求1或2所述的试剂盒的制作方法，其特征在于所述酶标单克隆抗体的制备采用下列步骤：(a ) NaI04-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml;(b )单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐緩冲液中透析6小时，实现HRP对 单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBIi溶液终止反应，再对PBS透析过夜；(c )用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标鼠抗人IgGl或IgG3单克隆抗体。
4、 一种^r测核心抗体亚类IgG3和IgGl的化学发光^^测试剂盒，包括下列组件：(1)包被了乙肝核心抗原的化学发光酶标板；(2 )酶工作液；(3) 酶联反应底物溶液、显色液、清洗缓冲液、标准品。所述的底物;容液为l.Oml EDTA、 1. Oml H202 、 0.4ml HC1 、 0.2ml吐温20;显色液为luminol;清洗緩冲液为PBS配制的0. 05°/。吐温20溶液；标准品包括人核心抗体IgG3和人核心抗体IgGl标准品。
5、 如权利要求4所述的试剂盒的制作方法，包括以下步骤：(1) 获得乙肝核心抗原，包被到化学发光酶标板吸附过夜；(2) 用吐温磷酸盐緩冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐緩冲液封闭过夜，甩干后晾干；(3 )获得酶标记物鼠抗人IgG3单克隆抗体和鼠抗人IgGl单克隆抗体；(4) 将酶标记物分别溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液l、酶工作液2;(5) 将酶标板、各酶工作液、酶联反应底物溶液、显色液、清洗緩沖液、标准品共同包装，得到试剂盒。 如权利要求4或5所述的试剂盒的制作方法，其特征在于所述酶标单克隆抗体的制备采用下列步骤：(a ) NaIOr乙二醇法进行服P的氧化，达到终浓度10mg/ml;(b )单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐緩冲液中透析6小时，实现HRP对多克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜；(c )用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标鼠抗人IgGl或IgG3单克隆抗体。
评价乙肝患者机体免疫力水平的检测试剂盒 及其制备方法
技术领域
本发明涉及了一种评价乙肝病毒感染者机体免疫力水平的方法，还涉及 应用于该方法的两种4全测试剂盒及其制备，该方法通过4全测乙肝核心抗原
抗体亚类IgG3/IgGl比值评价乙肝病毒感染者的免疫力水平，其检测结果 同乙肝五项指标、ALT的检测结果对照，对判断HBV病毒在体内的发展和治疗 情况的预后有重要的指导意义。 背景技术
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV)引起的全球性传染病，据估计，全世 界目前大约有3亿乙肝病毒携带者，且这一数字还在增加。其中，中国是乙型 肝炎的高流行区，据我国7 0年代末和9 0年代初两次全国肝炎的流行病学调查 的数据显示，我们国家感染过乙肝病毒的人有6.9亿，感染率是57.6%,长 期携带乙肝病毒的人有1. 2亿，乙肝病毒表面抗原的携带率9. 75%,历年累 积下来，现有慢性乙肝病人约两千多万。HBV属嗜肝病毒家族，可引起急性肝 炎、慢性肝炎和肝硬化，而且与肝癌的发生有密切的关系。
CD4+细胞是调节免疫应答的一类重要调节性细胞，具有辅助体液免疫和 细胞免疫的功能。1986年Mosmann据其产生的细胞因子的不同，将小鼠〔04+ 细胞分为Thl和Th2两个亚群，Thl主要分泌IL-2、 IFN-y和TNF-a ,主要 参与诱导细胞免疫反应和产生IgG2a型抗体，Th2主要分泌IL-4、 IL-5、 IL-IO、 IL-13等细胞因子，刺激B细胞增殖和分化，主要参与介导体液免疫和产生IgG 1 和IgE型抗体。Thl、 Th2相互调节、相互制约，共同维持机体的免疫状态。 随着对Thl和Th2的研究逐步深入，发现在人类也存在Thl和Th2细胞，现在 已经明确Thl /Th2型细胞因子可以调节机体的免疫反应，影响免疫应答的格局。人TH2通过分泌IL-4和IL-5辅助IgGl和IgA合成，分泌IL-10，抑制 TH1细胞合成细胞因子，而TH1对IgGl合成则有抑制作用，但辅助其他几种 类型IG的合成，包括IgG3的合成。因此TH2功能与抗体亚类IgGl产量相关， TH1功能与抗体亚类IgG3产量相关。
免疫学研究表明TH1/TH2应答能反映机体对病源体清除的能力。TH1和 TH2型细胞因子的平衡是机体处于正常状态的保证，二者失衡是感染、自身免 疫病、变态反应、器官移植排斥反应、肿瘤发生与恶化的重要促进因素。在 HBV感染中，机体能否建立有效清除HBV的保护性免疫有赖于免疫系统中的细 胞免疫和体液免疫，而免疫应答过程需要多种免疫细胞的参与，其中Th细胞 起重要作用。
研究已经证实乙型肝炎的发生和发展与机体的免疫功能密切相关。许多 临床表明，慢乙肝的发展和后果主要取决于宿主的免疫应答。
一般认为Thl免疫应答能增强宿主对感染（尤其是胞内病原体）的免疫应 答和防御功能，而Th2应答则与感染的进展、持续性和慢化性有关，Thl和Th2 所介导的免疫反应通常是通过自己分泌的细胞因子互相抑制的，既总是一个较 另外一个具有优势。以往的研究已经证实，在乙肝慢性者外周血中TH2占优势， TH1较弱。
在慢性肝炎TH1和TH2的对比中，TH1类细胞因子明显降低(P<0. 001)， TH2类细胞则升高（P〈0. 001),即在慢性肝炎中，细胞免疫下降，而体液免疫 加强，TH1/TH2类细胞免疫应答出现了失衡，可见TH2类细胞因子水平上升 与感染慢性化相关；目前的研究显示，TH2型细胞应答与病情慢性化有关，TH2 型应答愈占优势，炎症反应愈趋向于慢性化。各型慢性肝炎中，TH1类细胞因 子均降低，TH2类细胞因子则升高。自限性HBV急性感染期间以Thl应答为主， 恢复期表现以ThO细胞应答占优（即同时分泌Thl类和Th2类细胞因子），但分 泌水平均下降。因此机体对HBV的免疫应答失衡是慢性乙型肝炎的重要发生机制之一，表现为Thl型免疫低下而Th2型免疫亢迸。Thl型免疫低下致使免疫 系统不能产生足量的Tc细胞及Thl型细胞因子以杀伤、破坏病毒感染的靶细 胞和抑制病毒基因的复制及表达，机体不能及时清除病毒；Th2型细胞因子则 进一步抑制Thl型免疫应答；病毒抗原的持续刺激又诱导特异性T细胞凋亡或 无能，因此形成宿主对病毒抗原的免疫耐受；最终导致了 HBV的慢性持续感染。 因此如何检测宿主（即患者）的免疫应答对于有效治疗和预后预示都是 具有重大意义。
当前判断疾病免疫发病机制中Thl或Th2细胞效应为主导的方法，主要 是依据炎症组织局部细胞因子的表达，也可根据外周血清中抗体反应，如IgG 亚类的变化进行判断。细胞因子检测方法既检测TH1相关的IL-2、 IFN y和TH2 相关的IL-4、 IL-IO。本方法检测指标较多，联合评价方法复杂。由于已经知 道TH2与抗体亚类IgGl相关，TH1与抗体亚类IgG3相关，因此检测抗体的亚 类是个可以选择的方向。
乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen, HBcAg)蛋白 由183 ~ 185个氨基酸残基(各亚型之间稍有不同）组成，相对分子质量为21 000，其C端富含精氨酸，有结合核酸RNA的能力，并与其组装成乙肝核心颗 粒有关，同时也含有多种蛋白酶作用位点，N端的1-144位氨基酸残基是真 正的颗粒装配区。HBcAg能够直接激活B细胞，是典型的T细胞非依赖性抗原。 同时HBcAg也是强有效的T细胞免疫原，即也是T细胞依赖性抗原。
HBcAg为强免疫原，几乎在所有HBV感染中均可出现抗-HBc和T细胞应 答。乙肝感染后，HBcAb在绝大部分患者体液内都可以获得，目前所检测方法 均为测总抗体方法，没有对其抗体亚类进行检测。在多种病毒和寄生虫的免疫 机制中发现，患者感染后血液中总的IgG也许是正常，但是IgG某些亚类是缺 陷的，而不同亚类IgG与肌体免疫保护力相关，因此此时正常水平总的IgG 可能是误导，不能起到诊断的作用。目前临床上缺乏简便的手段来衡量乙肝患者自身对病源体清除的能力。
申请人研究发现了检测乙肝核心抗体中的IgG3和IgGl亚类的比值可以反映乙 肝患者体内TH1/TH2的平衡，并发现这对指标联合检测可以预示疾病恢复，肌 体免疫力。对不同人群乙肝抗体亚类IgGl、 IgG2 、 IgG3 、 IgG4进^f亍分析， 发现乙肝核心抗体IgG3亚类与IgGl亚类的比率是预示肝炎疾病转归的指示性 指标。由于IgG3/IgGl被认为可以反映TH1/TH2的相关情况，因此检测 IgG3/IgGl可以用于评价乙肝病毒感染者免疫力水平。本方法较采用双抗体 夹心ELISA法检测血清TH1型细胞因子（IL-2、 IFNy)和TH2型细胞因子（IL4、 IL-10)水平判断TH1/TH2更为简便。 发明内容
为克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了 一种筒便有效的评价乙肝患 者机体免疫力水平的方法，还提供了应用于该方法的两种检测试剂盒及其制 备方法。采用本发明的方法和产品，可以更好地评估乙型肝炎感染后机体的 免疫情况，更好地评价治疗效果和预后情况，并配合现有的检测技术，为乙肝 患者的治疗提供帮助。
本发明提供的评价乙肝患者机体免疫力水平的方法，包括下列步骤： (1)检测核心抗体亚类IgG3和IgGl; ( 2 )计算IgG3和IgGl的比值；(3 ) 根据IgG3和IgGl的比值评估乙肝患者机体清除病原体的能力，预测乙肝治 疗效果和预后。
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种或几种：酶联免疫吸附实验方法、化学发光检测方法、时间分辨方法、流式 细胞仪。
如IgG3/IgGl的比值小于1，说明机体免疫能力不完善，比值越小说明免 疫能力越不完善；随着比值升高，显示机体免疫能力趋向完善，如果IgG3/IgGl 的比值大于l,说明机体免疫能力较好，治疗有效。
7本发明提供一种试剂盒为检测核心抗体亚类IgG3和IgGl的酶联免疫试剂 盒，其包括包被了乙肝核心抗原的酶标板、酶工作液、酶联反应底物溶液、 显色液、反应终止液和清洗緩冲液。
这种试剂盒的制作方法如下：
(1) 获得乙肝核心抗原，包被到酶标板吸附过夜；
(2) 用吐温磷酸盐緩冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐緩沖 液封闭过夜，甩干后晾干；
(3 )获得酶标记物鼠抗人IgG3单克隆抗体和鼠抗人IgGl单克隆抗体；
(4) 将酶标记物分别溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工 作液l、酶工作液2;
(5) 将酶标板、各酶工作液、酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液 和清洗緩冲液共同包装，得到试剂盒。
其中：所述包被板制作的过程为：包被乙肝核心抗原，该核心抗原可以 是病毒中提取也可以是基因工程重组蛋白，具有生'物高活性，经过电泳鉴定， 蛋白纯度超过90%。将此抗原用碳酸緩沖液体（CB Buffer )稀释成低浓度进 行包被，包被载体为聚苯乙烯塑料板。包被时每孔100n1,吸附过夜，用吐温 磷酸盐緩冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐緩冲液封闭过夜，甩干 后晾干，即获得核心抗原包被酶标板，酶标板可选用国产板或进口板，规格可 以是96孔平板或12x8、 12X4可拆条板；
所述酶工作液的制备过程为：将酶标记物HRP (辣根过氧化物酶）标记的 鼠抗人IgG3单克隆抗体和HRP标记鼠抗人IgGl单克隆抗体，分别溶解于含有 小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液l、酶工作液2;
所述酶标单克隆抗体的制备可以采用下列步骤：
(a) NaIO广乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml;
(b) 单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐緩冲液中透析6小时，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜； (c )用饱和疏酸铵沉淀，获得纯化的.HRP酶标鼠抗人IgGl或IgG3单克
隆抗体。
所述辅助试剂的配制过程为：
(a) 底物溶液：磷酸-柠檬酸緩冲液（pH5. 0)配制的3%过氧化氢溶液；
(b) 显色液：四甲基联苯胺（TMB)甲醇溶液，浓度为0. lmg/ml;
(c) 反应终止液:2mol/L硫酸;
(d) 清洗緩冲液（20倍浓缩液，20x): PBS ( pHL 4 )配制的0. 05%吐温 20溶液。
检测方法包括下述步骤：
(1)抗原-抗体反应：在包被板的2个微孔中分别加入50nl待测血清样 品，进行温育：37。C水浴保温30分钟；
(2 )加酶：2个微孔中分别加入酶工作液1和酶工作液2，进行温育：37°C 水浴保温30分钟；
(3) 显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各50^tl， 37。C水浴保温 IO分钟，每孔再加入50pl反应终止液结束反应；
(4) 测量：以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD值并
记录；
(5) 结果判断:对比IgG3和IgGl的显色0D值，IgG3/IgGl比值越小， 说明机体清除病原体能力越差，IgG3/IgGl比值越大，说明机体清除病原体能 力越好，比值升高或者大于l说明即将恢复或已经恢复。
本发明提供的另一种试剂盒为检测核心抗体亚类IgG3和IgGl的化学发 光检测试剂盒，其包括包被了乙肝核心抗原的酶标板；酶工作液；酶M应底 物溶液、显色液、清洗緩冲液、标准品。 这种试剂盒的制作方法包括以下步骤：(1) 获得乙肝核心抗原，包被到化学发光酶标板吸附过夜；
(2) 用吐温磷酸盐緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐緩沖 液封闹过夜，甩干后晾干；
(3) 获得酶标记物鼠抗人IgG3单克隆抗体和鼠抗人IgGl单克隆抗体；
(4) 将酶标记物分别溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工 作液l、酶工作液2;
(5) 将酶标板、各酶工作液、酶联反应底物溶液、显色液、清洗緩冲液、 标准品共同包装，得到试剂盒。其中，
所述包被板的制作过程为：包被乙肝核心抗原，该核心抗原可以是病毒中 提取也可以是基因工程重组蛋白，具有生物高活性，经过电泳鉴定，蛋白纯度 超过90%。将此抗原用柠檬酸緩冲液体稀释成低浓度进行包被，包被栽体为化 学发光塑料板，包被时每孔100nl，吸附过夜，用吐温磷酸盐緩沖液洗板，再 用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐緩冲液封闭过夜，甩千后晾干，即获得核心抗 原包被酶标板，酶标板可选用国产或进口化学发光酶标板，规格可以是96孔 平才反或12x8、 12X4可拆条板；
所述酶工作液的制备过程为：将酶标记物HRP (辣^l过氧化物酶）标记的 鼠抗人IgG3单克隆抗体和HRP标记鼠抗人IgGl单克隆抗体，分别溶解于含有 小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液l、酶工作液2; 所述酶标单克隆抗体的制备可以采用下列步骤： (a ) Nal04-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml; (b)单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐緩沖液中透析6小时，实现HRP对 多克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜； (c )用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化后的HRP酶标鼠抗人IgGl或IgG3单 克隆抗体。
所述辅助试剂的配制，方法如下：(a) 底物溶液:1.0ml EDTA (1. Oxl(T2M) 1. Oml H202 (7. 5xl(T3M)、 0.4ml HC1 (1. 0x10—2M) 、 0.2ml Tween20 (1%);
(b) 显色液:luminol 5. OX 10 —4Mol/L;
(c) 清洗緩冲液（20倍浓缩液，20x): PBS ( pH7. 4 )配制的0. 05%吐 温20溶液；
(d )标准品：包括人核心抗体IgG3和人核心抗体IgGl标准品。 检测方法包括下述步骤：
(1) 抗原-抗体反应：在化学发光包被板的微孔中分别加入50^U已稀释 好的不同浓度的2个系列标准品，或2孔待测血清样品，进行温育：37。C水浴 保温30分钟，重复洗板操作4次
(2) 加酶：将配成酶工作液1、酶工作液2分别加入相应孔内；进行温 育：37。C水浴保温30分钟，重复洗板操作4次
(3) 显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各25pl， 37。C水浴保温 IO分钟；
(4) 测量：在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度（RLU)，测量 时间1秒/孔；
(5 )结果计算：
(a)制作标准曲线：以IgG3标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU 值为纵坐标，作出标准曲线；以IgGl标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU 值为纵坐标，作出标准曲线；
(b )计算待测血清样品浓度：根据待测样品的RLU值从标准曲线计算出 待测血清样品的核心抗体IgG3和IgGl浓度
(c)结果判断:对比IgG3和IgGl的含量，IgG3/IgG3比值越小，说明 机体清除病原体能力越差，IgG3/IgG3比值越大，说明机体清除病原体能力越 好，比值升高或大于l说明即将恢复或已经恢复。
ii由于本发明通过检测乙肝核心抗体中的IgG3和IgGl亚类的比值，反映 出乙肝患者体内TH1/TH2的平衡，从而对乙肝患者机体免疫力水平进行评价和 判断，为评价治疗效果、预测预后情况提供了一个重要的依据，这些指标或判 断同现有检测技术相配合，有助于做出更为准确的诊断，为乙肝患者的治疗提 供帮助。本发明的两种试剂盒采用了本发明提出的方法，使用和操作方便，成 本低，使本发明的方法得以实现。 附图说明
图1为大三阳标本的IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4的数据分布图;
图2为小三阳标本的IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4的数据分布图;
图3为感染后自动恢复的标本245或25的IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4的 数据分布图。 具体实施方式
下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用 于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的筒单 改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1: 一种乙型肝炎病毒核心抗原抗体亚类IgG3/IgGl酶联免疫检 测试剂盒（96人份）
其组成包括：
核心抗原包被板（96孔）1块；
辣根过氧化物酶（HRP )标记的鼠抗人IgG3酶标工作液体1瓶，6ml/瓶； 辣根过氧化物酶（HRP)标记的鼠抗人IgGl酶标工作液体1瓶，6ml/瓶； 底物溶液、显色液各l瓶，各5ml/瓶； 反应终止液l瓶，5ml/瓶；
清洗緩冲液（20X浓缩）1瓶，30ml/瓶。 具体制作如下：1 .制作核心抗原包纟皮板：
包被：酶标板采用Costar公司生产的12x8可拆条板，核心抗原为市购。 所获核心抗原用0. 05mol/L碳酸盐緩冲液稀释为20pg/ml后加入酶标板各孔， 每孔10(^1，吸附过夜，用清洗緩冲液洗板，再用该封闭液緩冲液封闭过夜， 甩干后晾干，即获得核心抗原包被酶标板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封 闭；
2.制备辣根过氧化物酶（HRP )标记的鼠抗人抗IgG3或IgGl抗体：
1) 酶的氧化（全过程避光）：
a) 称取HRP 5mg，加ddH20 250nl溶解；
b) 称取Nal04 5mg，加ddH20 25(^1溶解，配制成20mg/mL的浓度；
c) 往HRP溶液中逐滴加入Nal04溶液，边加边搅拌；
d) 将混合好的溶液置于4。C,静置30分钟；
e) 取5ml乙二醇溶于25^1 ddH20中，逐滴加入上述混合溶液中，边加 边搅拌；
f) 室温静置30分钟；
g) 酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml;
2) 单克隆抗体的准备及标记（避光）：
a) 调整抗体浓度到5mg/ml左右（蛋白浓度过低则用PEG20000浓缩）， 用pH9. 5左右的50麵1/L CB(lmol/L Na线与lmol/L ^20)3按10:1的比例 混合，使用前以蒸馏水稀释20倍)透析去甘油或杂质（如Tris)， 4。C下透析 过夜，其中换液3次；
b) 将单克隆抗体与HRP按1: 4混合，于50mmol/L pH9. 5 CB中透析6 小时以上，头两个小时换液一次；
c) 用新鲜配置的lmg NaBH4溶液终止反应。摇匀，4。C静置2小时，每 半小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适；d)用pH7. 2的10 mM PBS (预配置0. Olmol/L的Na2HP04和NaH2P04储备液， 根据需要的pH值混匀二者成PBS緩冲液)透析过夜。换液一次即可；
3) 纯化HRP酶标鼠抗人IgG3或IgG3单克隆抗体：
a )完成标记的单克隆抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅 拌，直至饱和硫酸铵浓度降低至1/3;
b) 4。C静置1小B^;
c) 8000rpm离心IO分钟，将上清移至新管中，沉淀用等体积、PBS重新
悬浮；
d) 重复以上操作，将饱和疏酸铵浓度提高到40%,分别收集上清和沉淀；
e) 重复以上操作,.将饱和硫酸铵浓度提高到50%,分别收集上清和沉淀； f )重复以上操作，,饱和硫酸铵浓度提高到60%,分别收集上清和沉淀；
g) 收集分离的各个组分，SDS-PAGE鉴定纯度；
h) 提纯的HRP-单克隆抗体对PBS透析过夜；
i) 超滤管离心浓缩纯化的HRP-单克隆抗体，获得克分子比接近1:8的 酶标鼠抗人IgG3或IgGl单克隆抗体；
4) 组装：用含10%胎牛血清的緩沖液稀释由步骤3)获得的酶标鼠抗人 IgG3或IgGl单克隆抗体至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4。C。
4. 配制底物溶液：磷酸-柠檬酸緩冲液（PH5. 0)配制的3%过氧化氢溶 液，4姿5ml/瓶分装；
5. 配制显色液：TMB(O. lmg/ml)曱醇溶液，按5ml/瓶分装；
6. 配制反应终止液：2mol/L H2S04，按3ml/瓶分装；
7. 配制清洗緩冲液（20倍浓缩液）：PBS (pH7. 4 )配制的1%吐温20溶液， 按15ml/瓶分装。
这种试剂盒的质量检测方式为：
1)准确性：15份大三阳慢性肝炎质控血清（包括特异性对照血清）参考品的检测结果，IgGl/IgG3大于1。 15份小三阳慢性肝炎质量控制血清中，3 份标本的IgG3/ IgGl大于1, 15份感染后恢复的标本（245阳性），12份IgG3/ IgGl大于1; '
2)精密度：随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份质控血清按说明 书操作步骤进行重复测定。分别计算核心抗体亚类IgGl/IgG3测定结果，分别 求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV《15%。
这种试剂盒的具体^f吏用方式为：
1. 清洗緩冲液配制：将试剂盒提供的浓缩清洗緩沖液加蒸馏水20倍稀释；
2. 抗原-抗体反应：在试剂盒提供的核心抗原包被板的2个微孔中分别加 入同 一 个待测血清样品；
3. 温育：37。C水浴保温30分钟，重复洗板操作5次，每次3分钟；
4. 加酶：分别加入鼠抗人IgG3酶工作液和鼠抗人IgGl酶工作液；
5. 温育：37。C水浴保温30分钟。重复洗板操作5次，每次3分钟；
6. 显色反应：每孑L依次加入底物溶液、TMB显色液各50pl， 37'C水浴保 温10分钟，每孔再加入50ul反应终止液结束反应；
7. 比色：以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD平均 值；记录各孔吸光值；
6.结果判断：
对比IgG3和IgGl的OD值，IgG3/IgGl比值越小，说明机体清除病原体 能力越差，IgG3/IgGl比值越大，说明才几体清除病原体能力越好，比值升高或 大于1说明即将恢复或已经恢复。
实施例2: —种乙肝核心抗体亚类IgG3/IgGl化学发光定量检测试剂（96 人份）
其组成包括：
核心抗原IgG3标准品1瓶；核心抗原IgGl标准品1瓶； 核心抗原包被板（96孔）1块；
辣根过氧化物酶（HRP)标记的鼠抗人IgG3单克隆抗体1瓶，6ml/瓶； 辣根过氧化物酶（HRP)标记的鼠抗人IgG3单克隆抗体1瓶，6ml/瓶； 底物溶液、显色液各1瓶，各5ml/瓶； 清洗緩冲液（20X浓缩）l瓶，30ml/瓶。 具体制作方法如下：
1 .制作核心抗原包被板：
1 )酶标板采用Costar公司生产的12x8可拆条板，核心抗原为基因工 程重组或病毒提取，市购；
2 )所获核心抗原用0. 05mol/L柠檬酸緩冲液稀释为20^ig/ml后加入酶标 板各孔，每孔100ixl，吸附过夜，用清洗緩沖液洗板，再用该封闭液緩沖液封 闭过夜，甩干后晾干，即获得核心抗原包被酶标板，按96孑L/块用铝箔袋包装、
真空封闭；
2.制备辣根过氧化物酶（HRP )标记的鼠抗人抗IgG3或IgGl抗体： 1)酶的氧化（全过程避光）：
a) 称取HRP 5mg,加ddH20 250^1溶解；
b) 称取Nal。4 5mg，加細20 250^1溶解,配制成20mg/mL的浓度；
c) 往HRP溶液中逐滴加入Nal04溶液，边加边搅拌；
d) 将混合好的溶液置于4r，静置30分钟；
e) 取5ml乙二醇溶于ddH20中，逐滴加入上述混合溶液中，边加 边搅拌；
f) 室温静置30分钟；
g) 酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml; 2 )组装：用含10%胎牛血清的緩冲液稀释由步骤3)获得的鼠抗人抗IgG3或IgGl 抗体至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4。C;
3) 底物溶液：1. Oml EDTA (1. 0x10—2M)1. 0mlH2O2 (7. 5xl(T3M) 、 0.4ml HC1 (1. 0x10—2M) 、 0.2ml Tween20 (1%)，按5ml/瓶分装；
4) 配制显色液：显色液：luminol 5. OX l(T 4Mol/L,按5ml/瓶分装；
5 )配制清洗緩冲液（20倍浓缩液）：PBS (pH7. 4 )配制的1°/。吐温20溶液， 按15ml/瓶分装。
这种试剂盒的质量检测方式为：
1) 准确性：15份大三阳慢性肝炎质控血清（包括特异性对照血清）参考 品的检测结果，IgGl含量/IgG3含量大于1。 15份小三阳慢性肝炎质量控制血 清中，3份标本的IgG3含量/IgGl含量大于l， 15份感染后恢复的标本（245 阳性），12份IgG3/ IgGl大于1;
2) 精密度：随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份质控血清按说明 书操作步骤进行重复测定。分别计算核心抗体亚类IgGl/IgG3测定结果，分别 求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV《15%;
3) 线性范围：用核心抗体亚类IgGl或IgG3纯品稀释成一系列不同浓度 的纯品溶液：300ng、 100 ng、 25ng、 10ng、 5ng、 lng。按照说明书操作步骤 进行测定。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制曲线。线性范围内最高检测 上限值为300ng/ml，最低检测下限值为lng/ml 。试剂盒的线性范围为 l-300ng/ml;
4) 检测灵敏度：根据上述线性范围测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为 lng/ml。
这种试剂盒的具体使用方式为：
1.清洗緩沖液配制：将试剂盒提供的浓缩清洗緩冲液加蒸馏水20倍稀
释；2. 将试剂盒提供的IgG3和IgGl标准品作为标本平行检测，标准品各点 浓度分别为300ng、. 100 ng、 25ng、 10ng、 5ng、 lng;
3. 抗原-抗体反应：在试剂盒提供的核心包被板的微孔中分别加入50pl 已稀斧疗的2个系列的不同浓度的标准品，或在平行的2孔中加入同一个待测 血清样品，37。C水浴保温30分钟。然后用清洗緩沖液重复洗板4次，每次3 分钟；
4. 酶联反应：分别加入相应的鼠抗人IgG3或IgGl单克隆抗体酶工作液， 溶液加入各孔，每孔10(^1, 37。C水浴保温30分钟。重复洗板操作4次，每 次3分钟；
5. 显色反应：每孔依次加入底物溶液、显色液各25pl;
6. 读值：在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度（RLU)，测量时 间1秒/孔；
7. 结杲计算：
a) 制作标准曲线：以IgG3标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU值 为纵坐标，作出标准曲线；以IgGl标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU 值为纵坐标，作出标准曲线；
b) 计算待测血清样品浓度：根据待测样品的RLU值从标准曲线计算出 待测血清样品的核心抗体IgG3和IgGl浓度；
c) 结果判定：
对比IgG3和IgGl的含量，IgG3/IgG3比值越小，说明机体清除病原体 能力越差，IgG3/IgG3比值越大，说明机体清除病原体能力越好，比值大于1 说明即将恢复或已经恢复。
为对本发明进行检验，申请人采用本发明的两种试剂盒，对不同状况下 的乙肝患者、过往感染者以及健康人群进行了 IgG3/IgGl指标和其他现有检验 指标的对比检验和分析，证明本发明的方法以及本发明的两种试剂盒的可靠性和有效性。采用本发明的方法和本发明的试剂盒，可以有效地检测出乙肝核
心抗原抗体亚类IgG3/IgGl比值，用于评价乙肝病毒感染者的免疫力水平， 其检测结果同乙肝五项指标、ALT的检测结果对照，对判断HBV病毒在体内的 发展和治疗情况的预后有重要的指导意义。
实验1:采用实施例1的酶联免疫检测试剂盒对不同乙型肝炎患者和过 往感染恢复样品的检测
为判断本发明乙肝核心抗体亚类IgG3/IgGl酶联免疫检测试剂盒的检测 情况，本发明取地坛医院病毒研究室血清总共280份研究数据：100份已知HBV-大三阳慢性肝炎标本，IOO份经过抗病毒治疗后转阴性既小三阳标本，80份过 往感染乙肝病毒已经恢复的血清标本（245阳性）。分别检测每个标本的 IgG3/IgGl的0D值,结果见表l。
表l.不同肝炎人群的IgG3/IgGl比较
血清来源 例数 检测情况IgG3/IgGl >1
大三阳慢性乙型肝炎患者 100 97% 3%
小三阳慢性乙型肝炎患者 100 78% 22%
245阳性 80 10% - 90%
本实验结果表明，本发明对于与病程转归正性相关，小三阳中有22%免疫 能力接近于达到清除病原体的能力。在恢复期标本中，体现了抗体亚类较为均 衡，也体现了 TH1/TH2的转化情况。
实验2:采用实施例2的化学发光定量检测试剂盒对不同乙型肝炎患者 和过往感染恢复样品的检测
检测来源于浙江湖州医院的拉米夫定治疗系列血清5例，观察这些标本 在经过治疗的过程中既从大三阳性到小三阳的转化过程中，核心抗体亚类 IgG3/IgGl的情况。检测结果与乙肝五项指标、ALT的检测结果对照，对判断 HBV病毒在体内的发展和治疗情况的预后有重要的指导意义。结果分别见表2(基于保护患者个人隐私的考虑，删除了表中的患者姓名）。
表2.乙肝患者IgG3/IgGl以及其他检测指标对照表
table see original document page 20table see original document page 21实验背景：对照组为中心血站献血人员20例，未携带病毒，并且单独表 面抗体阳性。慢性肝炎65例，来源于地坛医院住院病人，ALT均高于正常值。 乙肝感染后恢复血清，其标志是乙肝二对半中245 P日性。TH1和TH2细胞因子 检测采用商品化试剂盒。结果见表3 。
抗体亚类IgG3/IgGl比值评价乙肝病毒感染者的免疫力水平，其检测结果 同乙肝五项指标、ALT的检测结果对照，对判断HBV病毒在体内的发展和治疗 情况的预后有重要的指导意义。 背景技术
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV)引起的全球性传染病，据估计，全世 界目前大约有3亿乙肝病毒携带者，且这一数字还在增加。其中，中国是乙型 肝炎的高流行区，据我国7 0年代末和9 0年代初两次全国肝炎的流行病学调查 的数据显示，我们国家感染过乙肝病毒的人有6.9亿，感染率是57.6%,长 期携带乙肝病毒的人有1. 2亿，乙肝病毒表面抗原的携带率9. 75%,历年累 积下来，现有慢性乙肝病人约两千多万。HBV属嗜肝病毒家族，可引起急性肝 炎、慢性肝炎和肝硬化，而且与肝癌的发生有密切的关系。
CD4+细胞是调节免疫应答的一类重要调节性细胞，具有辅助体液免疫和 细胞免疫的功能。1986年Mosmann据其产生的细胞因子的不同，将小鼠〔04+ 细胞分为Thl和Th2两个亚群，Thl主要分泌IL-2、 IFN-y和TNF-a ,主要 参与诱导细胞免疫反应和产生IgG2a型抗体，Th2主要分泌IL-4、 IL-5、 IL-IO、 IL-13等细胞因子，刺激B细胞增殖和分化，主要参与介导体液免疫和产生IgG 1 和IgE型抗体。Thl、 Th2相互调节、相互制约，共同维持机体的免疫状态。 随着对Thl和Th2的研究逐步深入，发现在人类也存在Thl和Th2细胞，现在 已经明确Thl /Th2型细胞因子可以调节机体的免疫反应，影响免疫应答的格局。人TH2通过分泌IL-4和IL-5辅助IgGl和IgA合成，分泌IL-10，抑制 TH1细胞合成细胞因子，而TH1对IgGl合成则有抑制作用，但辅助其他几种 类型IG的合成，包括IgG3的合成。因此TH2功能与抗体亚类IgGl产量相关， TH1功能与抗体亚类IgG3产量相关。
免疫学研究表明TH1/TH2应答能反映机体对病源体清除的能力。TH1和 TH2型细胞因子的平衡是机体处于正常状态的保证，二者失衡是感染、自身免 疫病、变态反应、器官移植排斥反应、肿瘤发生与恶化的重要促进因素。在 HBV感染中，机体能否建立有效清除HBV的保护性免疫有赖于免疫系统中的细 胞免疫和体液免疫，而免疫应答过程需要多种免疫细胞的参与，其中Th细胞 起重要作用。
研究已经证实乙型肝炎的发生和发展与机体的免疫功能密切相关。许多 临床表明，慢乙肝的发展和后果主要取决于宿主的免疫应答。
一般认为Thl免疫应答能增强宿主对感染（尤其是胞内病原体）的免疫应 答和防御功能，而Th2应答则与感染的进展、持续性和慢化性有关，Thl和Th2 所介导的免疫反应通常是通过自己分泌的细胞因子互相抑制的，既总是一个较 另外一个具有优势。以往的研究已经证实，在乙肝慢性者外周血中TH2占优势， TH1较弱。
在慢性肝炎TH1和TH2的对比中，TH1类细胞因子明显降低(P<0. 001)， TH2类细胞则升高（P〈0. 001),即在慢性肝炎中，细胞免疫下降，而体液免疫 加强，TH1/TH2类细胞免疫应答出现了失衡，可见TH2类细胞因子水平上升 与感染慢性化相关；目前的研究显示，TH2型细胞应答与病情慢性化有关，TH2 型应答愈占优势，炎症反应愈趋向于慢性化。各型慢性肝炎中，TH1类细胞因 子均降低，TH2类细胞因子则升高。自限性HBV急性感染期间以Thl应答为主， 恢复期表现以ThO细胞应答占优（即同时分泌Thl类和Th2类细胞因子），但分 泌水平均下降。因此机体对HBV的免疫应答失衡是慢性乙型肝炎的重要发生机制之一，表现为Thl型免疫低下而Th2型免疫亢迸。Thl型免疫低下致使免疫 系统不能产生足量的Tc细胞及Thl型细胞因子以杀伤、破坏病毒感染的靶细 胞和抑制病毒基因的复制及表达，机体不能及时清除病毒；Th2型细胞因子则 进一步抑制Thl型免疫应答；病毒抗原的持续刺激又诱导特异性T细胞凋亡或 无能，因此形成宿主对病毒抗原的免疫耐受；最终导致了 HBV的慢性持续感染。 因此如何检测宿主（即患者）的免疫应答对于有效治疗和预后预示都是 具有重大意义。
当前判断疾病免疫发病机制中Thl或Th2细胞效应为主导的方法，主要 是依据炎症组织局部细胞因子的表达，也可根据外周血清中抗体反应，如IgG 亚类的变化进行判断。细胞因子检测方法既检测TH1相关的IL-2、 IFN y和TH2 相关的IL-4、 IL-IO。本方法检测指标较多，联合评价方法复杂。由于已经知 道TH2与抗体亚类IgGl相关，TH1与抗体亚类IgG3相关，因此检测抗体的亚 类是个可以选择的方向。
乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen, HBcAg)蛋白 由183 ~ 185个氨基酸残基(各亚型之间稍有不同）组成，相对分子质量为21 000，其C端富含精氨酸，有结合核酸RNA的能力，并与其组装成乙肝核心颗 粒有关，同时也含有多种蛋白酶作用位点，N端的1-144位氨基酸残基是真 正的颗粒装配区。HBcAg能够直接激活B细胞，是典型的T细胞非依赖性抗原。 同时HBcAg也是强有效的T细胞免疫原，即也是T细胞依赖性抗原。
HBcAg为强免疫原，几乎在所有HBV感染中均可出现抗-HBc和T细胞应 答。乙肝感染后，HBcAb在绝大部分患者体液内都可以获得，目前所检测方法 均为测总抗体方法，没有对其抗体亚类进行检测。在多种病毒和寄生虫的免疫 机制中发现，患者感染后血液中总的IgG也许是正常，但是IgG某些亚类是缺 陷的，而不同亚类IgG与肌体免疫保护力相关，因此此时正常水平总的IgG 可能是误导，不能起到诊断的作用。目前临床上缺乏简便的手段来衡量乙肝患者自身对病源体清除的能力。
申请人研究发现了检测乙肝核心抗体中的IgG3和IgGl亚类的比值可以反映乙 肝患者体内TH1/TH2的平衡，并发现这对指标联合检测可以预示疾病恢复，肌 体免疫力。对不同人群乙肝抗体亚类IgGl、 IgG2 、 IgG3 、 IgG4进^f亍分析， 发现乙肝核心抗体IgG3亚类与IgGl亚类的比率是预示肝炎疾病转归的指示性 指标。由于IgG3/IgGl被认为可以反映TH1/TH2的相关情况，因此检测 IgG3/IgGl可以用于评价乙肝病毒感染者免疫力水平。本方法较采用双抗体 夹心ELISA法检测血清TH1型细胞因子（IL-2、 IFNy)和TH2型细胞因子（IL4、 IL-10)水平判断TH1/TH2更为简便。 发明内容
为克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了 一种筒便有效的评价乙肝患 者机体免疫力水平的方法，还提供了应用于该方法的两种检测试剂盒及其制 备方法。采用本发明的方法和产品，可以更好地评估乙型肝炎感染后机体的 免疫情况，更好地评价治疗效果和预后情况，并配合现有的检测技术，为乙肝 患者的治疗提供帮助。
本发明提供的评价乙肝患者机体免疫力水平的方法，包括下列步骤： (1)检测核心抗体亚类IgG3和IgGl; ( 2 )计算IgG3和IgGl的比值；(3 ) 根据IgG3和IgGl的比值评估乙肝患者机体清除病原体的能力，预测乙肝治 疗效果和预后。
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种或几种：酶联免疫吸附实验方法、化学发光检测方法、时间分辨方法、流式 细胞仪。
如IgG3/IgGl的比值小于1，说明机体免疫能力不完善，比值越小说明免 疫能力越不完善；随着比值升高，显示机体免疫能力趋向完善，如果IgG3/IgGl 的比值大于l,说明机体免疫能力较好，治疗有效。
7本发明提供一种试剂盒为检测核心抗体亚类IgG3和IgGl的酶联免疫试剂 盒，其包括包被了乙肝核心抗原的酶标板、酶工作液、酶联反应底物溶液、 显色液、反应终止液和清洗緩冲液。
这种试剂盒的制作方法如下：
(1) 获得乙肝核心抗原，包被到酶标板吸附过夜；
(2) 用吐温磷酸盐緩冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐緩沖 液封闭过夜，甩干后晾干；
(3 )获得酶标记物鼠抗人IgG3单克隆抗体和鼠抗人IgGl单克隆抗体；
(4) 将酶标记物分别溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工 作液l、酶工作液2;
(5) 将酶标板、各酶工作液、酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液 和清洗緩冲液共同包装，得到试剂盒。
其中：所述包被板制作的过程为：包被乙肝核心抗原，该核心抗原可以 是病毒中提取也可以是基因工程重组蛋白，具有生'物高活性，经过电泳鉴定， 蛋白纯度超过90%。将此抗原用碳酸緩沖液体（CB Buffer )稀释成低浓度进 行包被，包被载体为聚苯乙烯塑料板。包被时每孔100n1,吸附过夜，用吐温 磷酸盐緩冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐緩冲液封闭过夜，甩干 后晾干，即获得核心抗原包被酶标板，酶标板可选用国产板或进口板，规格可 以是96孔平板或12x8、 12X4可拆条板；
所述酶工作液的制备过程为：将酶标记物HRP (辣根过氧化物酶）标记的 鼠抗人IgG3单克隆抗体和HRP标记鼠抗人IgGl单克隆抗体，分别溶解于含有 小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液l、酶工作液2;
所述酶标单克隆抗体的制备可以采用下列步骤：
(a) NaIO广乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml;
(b) 单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐緩冲液中透析6小时，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜； (c )用饱和疏酸铵沉淀，获得纯化的.HRP酶标鼠抗人IgGl或IgG3单克
隆抗体。
所述辅助试剂的配制过程为：
(a) 底物溶液：磷酸-柠檬酸緩冲液（pH5. 0)配制的3%过氧化氢溶液；
(b) 显色液：四甲基联苯胺（TMB)甲醇溶液，浓度为0. lmg/ml;
(c) 反应终止液:2mol/L硫酸;
(d) 清洗緩冲液（20倍浓缩液，20x): PBS ( pHL 4 )配制的0. 05%吐温 20溶液。
检测方法包括下述步骤：
(1)抗原-抗体反应：在包被板的2个微孔中分别加入50nl待测血清样 品，进行温育：37。C水浴保温30分钟；
(2 )加酶：2个微孔中分别加入酶工作液1和酶工作液2，进行温育：37°C 水浴保温30分钟；
(3) 显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各50^tl， 37。C水浴保温 IO分钟，每孔再加入50pl反应终止液结束反应；
(4) 测量：以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD值并
记录；
(5) 结果判断:对比IgG3和IgGl的显色0D值，IgG3/IgGl比值越小， 说明机体清除病原体能力越差，IgG3/IgGl比值越大，说明机体清除病原体能 力越好，比值升高或者大于l说明即将恢复或已经恢复。
本发明提供的另一种试剂盒为检测核心抗体亚类IgG3和IgGl的化学发 光检测试剂盒，其包括包被了乙肝核心抗原的酶标板；酶工作液；酶M应底 物溶液、显色液、清洗緩冲液、标准品。 这种试剂盒的制作方法包括以下步骤：(1) 获得乙肝核心抗原，包被到化学发光酶标板吸附过夜；
(2) 用吐温磷酸盐緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐緩沖 液封闹过夜，甩干后晾干；
(3) 获得酶标记物鼠抗人IgG3单克隆抗体和鼠抗人IgGl单克隆抗体；
(4) 将酶标记物分别溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工 作液l、酶工作液2;
(5) 将酶标板、各酶工作液、酶联反应底物溶液、显色液、清洗緩冲液、 标准品共同包装，得到试剂盒。其中，
所述包被板的制作过程为：包被乙肝核心抗原，该核心抗原可以是病毒中 提取也可以是基因工程重组蛋白，具有生物高活性，经过电泳鉴定，蛋白纯度 超过90%。将此抗原用柠檬酸緩冲液体稀释成低浓度进行包被，包被栽体为化 学发光塑料板，包被时每孔100nl，吸附过夜，用吐温磷酸盐緩沖液洗板，再 用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐緩冲液封闭过夜，甩千后晾干，即获得核心抗 原包被酶标板，酶标板可选用国产或进口化学发光酶标板，规格可以是96孔 平才反或12x8、 12X4可拆条板；
所述酶工作液的制备过程为：将酶标记物HRP (辣^l过氧化物酶）标记的 鼠抗人IgG3单克隆抗体和HRP标记鼠抗人IgGl单克隆抗体，分别溶解于含有 小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液l、酶工作液2; 所述酶标单克隆抗体的制备可以采用下列步骤： (a ) Nal04-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml; (b)单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐緩沖液中透析6小时，实现HRP对 多克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜； (c )用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化后的HRP酶标鼠抗人IgGl或IgG3单 克隆抗体。
所述辅助试剂的配制，方法如下：(a) 底物溶液:1.0ml EDTA (1. Oxl(T2M) 1. Oml H202 (7. 5xl(T3M)、 0.4ml HC1 (1. 0x10—2M) 、 0.2ml Tween20 (1%);
(b) 显色液:luminol 5. OX 10 —4Mol/L;
(c) 清洗緩冲液（20倍浓缩液，20x): PBS ( pH7. 4 )配制的0. 05%吐 温20溶液；
(d )标准品：包括人核心抗体IgG3和人核心抗体IgGl标准品。 检测方法包括下述步骤：
(1) 抗原-抗体反应：在化学发光包被板的微孔中分别加入50^U已稀释 好的不同浓度的2个系列标准品，或2孔待测血清样品，进行温育：37。C水浴 保温30分钟，重复洗板操作4次
(2) 加酶：将配成酶工作液1、酶工作液2分别加入相应孔内；进行温 育：37。C水浴保温30分钟，重复洗板操作4次
(3) 显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各25pl， 37。C水浴保温 IO分钟；
(4) 测量：在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度（RLU)，测量 时间1秒/孔；
(5 )结果计算：
(a)制作标准曲线：以IgG3标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU 值为纵坐标，作出标准曲线；以IgGl标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU 值为纵坐标，作出标准曲线；
(b )计算待测血清样品浓度：根据待测样品的RLU值从标准曲线计算出 待测血清样品的核心抗体IgG3和IgGl浓度
(c)结果判断:对比IgG3和IgGl的含量，IgG3/IgG3比值越小，说明 机体清除病原体能力越差，IgG3/IgG3比值越大，说明机体清除病原体能力越 好，比值升高或大于l说明即将恢复或已经恢复。
ii由于本发明通过检测乙肝核心抗体中的IgG3和IgGl亚类的比值，反映 出乙肝患者体内TH1/TH2的平衡，从而对乙肝患者机体免疫力水平进行评价和 判断，为评价治疗效果、预测预后情况提供了一个重要的依据，这些指标或判 断同现有检测技术相配合，有助于做出更为准确的诊断，为乙肝患者的治疗提 供帮助。本发明的两种试剂盒采用了本发明提出的方法，使用和操作方便，成 本低，使本发明的方法得以实现。 附图说明
图1为大三阳标本的IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4的数据分布图;
图2为小三阳标本的IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4的数据分布图;
图3为感染后自动恢复的标本245或25的IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4的 数据分布图。 具体实施方式
下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用 于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的筒单 改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1: 一种乙型肝炎病毒核心抗原抗体亚类IgG3/IgGl酶联免疫检 测试剂盒（96人份）
其组成包括：
核心抗原包被板（96孔）1块；
辣根过氧化物酶（HRP )标记的鼠抗人IgG3酶标工作液体1瓶，6ml/瓶； 辣根过氧化物酶（HRP)标记的鼠抗人IgGl酶标工作液体1瓶，6ml/瓶； 底物溶液、显色液各l瓶，各5ml/瓶； 反应终止液l瓶，5ml/瓶；
清洗緩冲液（20X浓缩）1瓶，30ml/瓶。 具体制作如下：1 .制作核心抗原包纟皮板：
包被：酶标板采用Costar公司生产的12x8可拆条板，核心抗原为市购。 所获核心抗原用0. 05mol/L碳酸盐緩冲液稀释为20pg/ml后加入酶标板各孔， 每孔10(^1，吸附过夜，用清洗緩冲液洗板，再用该封闭液緩冲液封闭过夜， 甩干后晾干，即获得核心抗原包被酶标板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封 闭；
2.制备辣根过氧化物酶（HRP )标记的鼠抗人抗IgG3或IgGl抗体：
1) 酶的氧化（全过程避光）：
a) 称取HRP 5mg，加ddH20 250nl溶解；
b) 称取Nal04 5mg，加ddH20 25(^1溶解，配制成20mg/mL的浓度；
c) 往HRP溶液中逐滴加入Nal04溶液，边加边搅拌；
d) 将混合好的溶液置于4。C,静置30分钟；
e) 取5ml乙二醇溶于25^1 ddH20中，逐滴加入上述混合溶液中，边加 边搅拌；
f) 室温静置30分钟；
g) 酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml;
2) 单克隆抗体的准备及标记（避光）：
a) 调整抗体浓度到5mg/ml左右（蛋白浓度过低则用PEG20000浓缩）， 用pH9. 5左右的50麵1/L CB(lmol/L Na线与lmol/L ^20)3按10:1的比例 混合，使用前以蒸馏水稀释20倍)透析去甘油或杂质（如Tris)， 4。C下透析 过夜，其中换液3次；
b) 将单克隆抗体与HRP按1: 4混合，于50mmol/L pH9. 5 CB中透析6 小时以上，头两个小时换液一次；
c) 用新鲜配置的lmg NaBH4溶液终止反应。摇匀，4。C静置2小时，每 半小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适；d)用pH7. 2的10 mM PBS (预配置0. Olmol/L的Na2HP04和NaH2P04储备液， 根据需要的pH值混匀二者成PBS緩冲液)透析过夜。换液一次即可；
3) 纯化HRP酶标鼠抗人IgG3或IgG3单克隆抗体：
a )完成标记的单克隆抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅 拌，直至饱和硫酸铵浓度降低至1/3;
b) 4。C静置1小B^;
c) 8000rpm离心IO分钟，将上清移至新管中，沉淀用等体积、PBS重新
悬浮；
d) 重复以上操作，将饱和疏酸铵浓度提高到40%,分别收集上清和沉淀；
e) 重复以上操作,.将饱和硫酸铵浓度提高到50%,分别收集上清和沉淀； f )重复以上操作，,饱和硫酸铵浓度提高到60%,分别收集上清和沉淀；
g) 收集分离的各个组分，SDS-PAGE鉴定纯度；
h) 提纯的HRP-单克隆抗体对PBS透析过夜；
i) 超滤管离心浓缩纯化的HRP-单克隆抗体，获得克分子比接近1:8的 酶标鼠抗人IgG3或IgGl单克隆抗体；
4) 组装：用含10%胎牛血清的緩沖液稀释由步骤3)获得的酶标鼠抗人 IgG3或IgGl单克隆抗体至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4。C。
4. 配制底物溶液：磷酸-柠檬酸緩冲液（PH5. 0)配制的3%过氧化氢溶 液，4姿5ml/瓶分装；
5. 配制显色液：TMB(O. lmg/ml)曱醇溶液，按5ml/瓶分装；
6. 配制反应终止液：2mol/L H2S04，按3ml/瓶分装；
7. 配制清洗緩冲液（20倍浓缩液）：PBS (pH7. 4 )配制的1%吐温20溶液， 按15ml/瓶分装。
这种试剂盒的质量检测方式为：
1)准确性：15份大三阳慢性肝炎质控血清（包括特异性对照血清）参考品的检测结果，IgGl/IgG3大于1。 15份小三阳慢性肝炎质量控制血清中，3 份标本的IgG3/ IgGl大于1, 15份感染后恢复的标本（245阳性），12份IgG3/ IgGl大于1; '
2)精密度：随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份质控血清按说明 书操作步骤进行重复测定。分别计算核心抗体亚类IgGl/IgG3测定结果，分别 求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV《15%。
这种试剂盒的具体^f吏用方式为：
1. 清洗緩冲液配制：将试剂盒提供的浓缩清洗緩沖液加蒸馏水20倍稀释；
2. 抗原-抗体反应：在试剂盒提供的核心抗原包被板的2个微孔中分别加 入同 一 个待测血清样品；
3. 温育：37。C水浴保温30分钟，重复洗板操作5次，每次3分钟；
4. 加酶：分别加入鼠抗人IgG3酶工作液和鼠抗人IgGl酶工作液；
5. 温育：37。C水浴保温30分钟。重复洗板操作5次，每次3分钟；
6. 显色反应：每孑L依次加入底物溶液、TMB显色液各50pl， 37'C水浴保 温10分钟，每孔再加入50ul反应终止液结束反应；
7. 比色：以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD平均 值；记录各孔吸光值；
6.结果判断：
对比IgG3和IgGl的OD值，IgG3/IgGl比值越小，说明机体清除病原体 能力越差，IgG3/IgGl比值越大，说明才几体清除病原体能力越好，比值升高或 大于1说明即将恢复或已经恢复。
实施例2: —种乙肝核心抗体亚类IgG3/IgGl化学发光定量检测试剂（96 人份）
其组成包括：
核心抗原IgG3标准品1瓶；核心抗原IgGl标准品1瓶； 核心抗原包被板（96孔）1块；
辣根过氧化物酶（HRP)标记的鼠抗人IgG3单克隆抗体1瓶，6ml/瓶； 辣根过氧化物酶（HRP)标记的鼠抗人IgG3单克隆抗体1瓶，6ml/瓶； 底物溶液、显色液各1瓶，各5ml/瓶； 清洗緩冲液（20X浓缩）l瓶，30ml/瓶。 具体制作方法如下：
1 .制作核心抗原包被板：
1 )酶标板采用Costar公司生产的12x8可拆条板，核心抗原为基因工 程重组或病毒提取，市购；
2 )所获核心抗原用0. 05mol/L柠檬酸緩冲液稀释为20^ig/ml后加入酶标 板各孔，每孔100ixl，吸附过夜，用清洗緩沖液洗板，再用该封闭液緩沖液封 闭过夜，甩干后晾干，即获得核心抗原包被酶标板，按96孑L/块用铝箔袋包装、
真空封闭；
2.制备辣根过氧化物酶（HRP )标记的鼠抗人抗IgG3或IgGl抗体： 1)酶的氧化（全过程避光）：
a) 称取HRP 5mg,加ddH20 250^1溶解；
b) 称取Nal。4 5mg，加細20 250^1溶解,配制成20mg/mL的浓度；
c) 往HRP溶液中逐滴加入Nal04溶液，边加边搅拌；
d) 将混合好的溶液置于4r，静置30分钟；
e) 取5ml乙二醇溶于ddH20中，逐滴加入上述混合溶液中，边加 边搅拌；
f) 室温静置30分钟；
g) 酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml; 2 )组装：用含10%胎牛血清的緩冲液稀释由步骤3)获得的鼠抗人抗IgG3或IgGl 抗体至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4。C;
3) 底物溶液：1. Oml EDTA (1. 0x10—2M)1. 0mlH2O2 (7. 5xl(T3M) 、 0.4ml HC1 (1. 0x10—2M) 、 0.2ml Tween20 (1%)，按5ml/瓶分装；
4) 配制显色液：显色液：luminol 5. OX l(T 4Mol/L,按5ml/瓶分装；
5 )配制清洗緩冲液（20倍浓缩液）：PBS (pH7. 4 )配制的1°/。吐温20溶液， 按15ml/瓶分装。
这种试剂盒的质量检测方式为：
1) 准确性：15份大三阳慢性肝炎质控血清（包括特异性对照血清）参考 品的检测结果，IgGl含量/IgG3含量大于1。 15份小三阳慢性肝炎质量控制血 清中，3份标本的IgG3含量/IgGl含量大于l， 15份感染后恢复的标本（245 阳性），12份IgG3/ IgGl大于1;
2) 精密度：随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份质控血清按说明 书操作步骤进行重复测定。分别计算核心抗体亚类IgGl/IgG3测定结果，分别 求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV《15%;
3) 线性范围：用核心抗体亚类IgGl或IgG3纯品稀释成一系列不同浓度 的纯品溶液：300ng、 100 ng、 25ng、 10ng、 5ng、 lng。按照说明书操作步骤 进行测定。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制曲线。线性范围内最高检测 上限值为300ng/ml，最低检测下限值为lng/ml 。试剂盒的线性范围为 l-300ng/ml;
4) 检测灵敏度：根据上述线性范围测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为 lng/ml。
这种试剂盒的具体使用方式为：
1.清洗緩沖液配制：将试剂盒提供的浓缩清洗緩冲液加蒸馏水20倍稀
释；2. 将试剂盒提供的IgG3和IgGl标准品作为标本平行检测，标准品各点 浓度分别为300ng、. 100 ng、 25ng、 10ng、 5ng、 lng;
3. 抗原-抗体反应：在试剂盒提供的核心包被板的微孔中分别加入50pl 已稀斧疗的2个系列的不同浓度的标准品，或在平行的2孔中加入同一个待测 血清样品，37。C水浴保温30分钟。然后用清洗緩沖液重复洗板4次，每次3 分钟；
4. 酶联反应：分别加入相应的鼠抗人IgG3或IgGl单克隆抗体酶工作液， 溶液加入各孔，每孔10(^1, 37。C水浴保温30分钟。重复洗板操作4次，每 次3分钟；
5. 显色反应：每孔依次加入底物溶液、显色液各25pl;
6. 读值：在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度（RLU)，测量时 间1秒/孔；
7. 结杲计算：
a) 制作标准曲线：以IgG3标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU值 为纵坐标，作出标准曲线；以IgGl标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU 值为纵坐标，作出标准曲线；
b) 计算待测血清样品浓度：根据待测样品的RLU值从标准曲线计算出 待测血清样品的核心抗体IgG3和IgGl浓度；
c) 结果判定：
对比IgG3和IgGl的含量，IgG3/IgG3比值越小，说明机体清除病原体 能力越差，IgG3/IgG3比值越大，说明机体清除病原体能力越好，比值大于1 说明即将恢复或已经恢复。
为对本发明进行检验，申请人采用本发明的两种试剂盒，对不同状况下 的乙肝患者、过往感染者以及健康人群进行了 IgG3/IgGl指标和其他现有检验 指标的对比检验和分析，证明本发明的方法以及本发明的两种试剂盒的可靠性和有效性。采用本发明的方法和本发明的试剂盒，可以有效地检测出乙肝核
心抗原抗体亚类IgG3/IgGl比值，用于评价乙肝病毒感染者的免疫力水平， 其检测结果同乙肝五项指标、ALT的检测结果对照，对判断HBV病毒在体内的 发展和治疗情况的预后有重要的指导意义。
实验1:采用实施例1的酶联免疫检测试剂盒对不同乙型肝炎患者和过 往感染恢复样品的检测
为判断本发明乙肝核心抗体亚类IgG3/IgGl酶联免疫检测试剂盒的检测 情况，本发明取地坛医院病毒研究室血清总共280份研究数据：100份已知HBV-大三阳慢性肝炎标本，IOO份经过抗病毒治疗后转阴性既小三阳标本，80份过 往感染乙肝病毒已经恢复的血清标本（245阳性）。分别检测每个标本的 IgG3/IgGl的0D值,结果见表l。
表l.不同肝炎人群的IgG3/IgGl比较
血清来源 例数 检测情况IgG3/IgGl >1
大三阳慢性乙型肝炎患者 100 97% 3%
小三阳慢性乙型肝炎患者 100 78% 22%
245阳性 80 10% - 90%
本实验结果表明，本发明对于与病程转归正性相关，小三阳中有22%免疫 能力接近于达到清除病原体的能力。在恢复期标本中，体现了抗体亚类较为均 衡，也体现了 TH1/TH2的转化情况。
实验2:采用实施例2的化学发光定量检测试剂盒对不同乙型肝炎患者 和过往感染恢复样品的检测
检测来源于浙江湖州医院的拉米夫定治疗系列血清5例，观察这些标本 在经过治疗的过程中既从大三阳性到小三阳的转化过程中，核心抗体亚类 IgG3/IgGl的情况。检测结果与乙肝五项指标、ALT的检测结果对照，对判断 HBV病毒在体内的发展和治疗情况的预后有重要的指导意义。结果分别见表2(基于保护患者个人隐私的考虑，删除了表中的患者姓名）。
表2.乙肝患者IgG3/IgGl以及其他检测指标对照表
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