β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒
专利汇可以提供β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测 试剂 盒 ，其包括β-呋喃果糖苷酶标准酶液、包被有β-呋喃果糖苷酶鼠单克隆 抗体 的酶标板、样品稀释液、β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体工作液、酶标记二抗工作液、底物显色液、浓缩洗涤液和终止液。本发明试剂盒采用双抗夹心ELISA方法测定蜂蜜样品中β-呋喃果糖苷酶的含量，剂量-反应曲线的线性相关系数＞0.980，R2=0.9993，灵敏度为10U/KG，符合国家ELISA检测 质量 要求。本试剂盒板内变异系数（CV%）小于10%，测定结果稳定，精 密度 良好。本发明试剂盒的优点是样品处理简单，检测快速，检测时间仅为2.5小时，灵敏、准确和高通量，为检测蜂蜜造假提供了有效的手段。，下面是β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于其包括β-呋喃果糖苷酶标准酶液、包被有β-呋喃果糖苷酶鼠单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体工作液、酶标记二抗工作液、底物显色液、浓缩洗涤液和终止液。
2.根据权利要求1所述的β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述β-呋喃果糖苷酶标准酶液的浓度为10U/ml。
3.根据权利要求1所述的β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述包被有β-呋喃果糖苷酶鼠单克隆抗体的酶标板的制备方法为：用5-50mmol/L碳酸缓冲液作为包被液稀释β-呋喃果糖苷酶鼠单克隆抗体至2-20µg/ml，混匀，加到96孔酶标板中，每孔100µl，4℃反应14-16小时，然后倒掉孔中溶液，用所述浓缩洗涤液洗板4次，拍干，每孔加入150µl封闭液，37℃封闭1小时，倒掉孔中溶液，浓缩洗涤液洗板4次，每孔加入200µl保护剂，反应1-2小时，倒掉保护剂，拍干，真空干燥，装入铝箔袋真空密封保存。
4.根据权利要求3所述的β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述保护剂为8%（w/w）酶稳定剂M。
5.根据权利要求1所述的β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述样品稀释液是在10mmol/L pH7-10的碳酸盐缓冲液中加入1%（w/w）小牛血清、0.05%（w/w）Tween-20和0.01%（w/w）叠氮钠制成。
6.根据权利要求1所述的β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体工作液是在封闭液中加入与所述封闭液质量比为
1:2000-5000的β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体制成。
7.根据权利要求1所述的β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述酶标记二抗工作液是在封闭液中加入与所述封闭液质量比为1:5000-10000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体制成。
8.根据权利要求3或6或7所述的β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述封闭液是在0.1mol/L pH7.2-7.4磷酸缓冲液中加入5%（w/w）的小牛血清和0.05%（w/w）Tween-20制成。
9.根据权利要求1所述的β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述底物显色液包括A底物显色液和B底物显色液，所述A底物显色液是由20mg TMB加10ml无水乙醇,充分震荡溶解后加双蒸水定容至100ml制成，所述B底物显色液是由0.47g柠檬酸、1.84g Na2HPO4.12H2O，0.75%（w/w）的过氧化氢尿素0.64ml，pH5.0-5.4，双蒸水定容至
100ml制成，使用时所述A底物显色液和B底物显色液质量比1：1混合；所述浓缩洗涤液是在0.1mol/L pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中加入0.05%（w/w）Tween-20和0.01%（w/w）的叠氮钠制成；所述终止液为1.0mol/L的硫酸。
β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒
技术领域
发明内容
R=0.9993，灵敏度为10U/KG，符合国家ELISA检测质量要求。本试剂盒板内变异系数（CV%）小于10%，测定结果稳定，精密度良好。本发明试剂盒的优点是样品处理简单，检测快速，检测时间仅为2.5小时，灵敏、准确和高通量，为检测蜂蜜造假提供了有效的手段。
附图说明
具体实施方式
选取健康的8周龄雌性BALB/C小鼠进行β-呋喃果糖苷酶免疫，免疫剂量以β-呋喃果糖苷酶计每次50-100µg/只，每次免疫间隔两周，免疫5次。第一次免疫将免疫原β-呋喃果糖苷酶与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂注射，采用颈背部皮下多点注射，2-4次免疫将免疫原与等量的弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂注射，采用颈背部皮下多点注射，最后一次，不加佐剂进行腹部加强免疫。最后一次免疫3天后取小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤细胞。筛选阳性细胞株,经数次亚克隆，直至细胞株达到全阳性，稳定分泌β-呋喃果糖苷酶抗体后，进行细胞冻存。培养该细胞株，注入致敏的小鼠腹腔，收集腹水。经辛酸-硫酸铵沉淀，葡萄球菌蛋白A-Separose CL-4B柱纯化，透析、冻干后保存。
350µg/只/次，颈背部皮下多点注射，每次免疫间隔为两周，免疫六次。第一次免疫将抗原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，二到六次免疫将抗原与等量的弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂。三免后开始监测血清抗体效价。六免后7-10天颈动脉采血，分离血清。经硫酸铵沉淀，葡萄球菌蛋白A-Separose CL-4B柱纯化、透析、冻干后保存。
准确称取一定量蜂蜜样品，加入3倍重量样品稀释液，50-80℃恒温水浴5-10分钟，取出，冷却至室温备用。
OD值 0.026±0.003 0.04±0.002 0.06±0.002 0.104±0.005 0.175±0.002 0.339±0.015根据以上数据绘制标准曲线，见图1。 10 U/KG的OD值是0 U/KG OD值的2.31倍，大于2.1。
2
β-呋喃果糖苷酶浓度(U/KG) 4.7±0.41 4.10±0.26 57.52±2.96
CV% 8.82 6.38 5.15
结果表明，本试剂盒板内变异系数（CV%）小于10%，测定结果稳定，精密度良好。
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