猪Ⅱ型圆环病毒抗体间接ELISA诊断试剂盒
专利汇可以提供猪Ⅱ型圆环病毒抗体间接ELISA诊断试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种猪II型 圆环病毒 (PCV2) 抗体 间接ELISA 诊断 试剂 盒 。试剂盒内设有抗体检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，该试剂盒的检测板为包被PCV2重组去核 定位 信号 衣壳蛋白(dCap)的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为HRP标记山羊抗猪IgG多克隆抗体，阳性对照为猪PCV2标准阳性血清，阴性对照为猪标准阴性血清。本发明有益的积极效果是：检测试剂盒、特异性强、敏感性高、操作简单，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。，下面是猪Ⅱ型圆环病毒抗体间接ELISA诊断试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种猪II型圆环病毒抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于：试剂盒 内设有抗体检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10× 浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，抗体检测板为包被猪II型圆环病 毒重组去核定位信号衣壳蛋白的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧 化物酶标记山羊抗猪IgG多克隆抗体，阳性对照为猪II型圆环病毒标准阳性血 清，阴性对照为猪标准阴性血清。
2.根据权利要求1所述的一种猪II型圆环病毒抗体间接ELISA诊断试剂盒， 其特征在于：所说的猪II型圆环病毒重组去核定位信号衣壳蛋白的制备为利用 PCR技术扩增猪II型圆环病毒去核定位信号的衣壳蛋白基因序列(衣壳蛋白基 因3’端579bp的片段)，将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1的谷胱苷肽-S-转 移酶基因(GST)下游构建pGEX-PCV2-dCap表达载体，并转化大肠杆菌BL21， 经0.1mM IPTG诱导表达并经商用GST亲和层析柱纯化获得猪II型圆环病毒重 组去核定位信号衣壳蛋白，该蛋白保留了完整衣壳蛋白的抗原性，可与猪II型 圆环病毒阳性血清特异结合。
3.根据权利要求1所述的一种猪II型圆环病毒抗体间接ELISA诊断试剂盒， 其特征在于：所说的抗体检测板的最佳制备条件为，用pH8.5的0.05M Tris-HCl缓冲液作包被液，将猪II型圆环病毒重组去核定位信号衣壳蛋白稀释为 0.1-10μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，37℃2小时，再4℃包被过夜， 甩干，按100μl/孔加入含1％牛血清白蛋白(BSA)，PH7.4的磷酸盐缓冲液37 ℃封闭2小时，洗涤甩干，再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，置 干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存。
4.根据权利要求1所述的一种猪II型圆环病毒抗体间接ELISA诊断试剂盒， 其特征在于：所说的酶结合物工作液的制备为：用超纯水配制辣根过氧化物酶 (HRP，RZ≥3.0)溶液，加入0.06M过碘酸钠溶液4℃避光1小时，加入160mM 乙二醇，室温反应30分钟，加入PH4.4的醋酸缓冲液1小时2-8℃透析过夜， 换液两次。将纯化的羊抗猪IgG加入上述活化的酶中，转移至透析袋，于0.05mM PH9.6的碳酸缓冲液中透析，4℃搅拌过夜(换液两次)。透析液吸至离心管中， 加新配的NaBH4液，4℃反应2小时。加入等量的饱和硫酸铵溶液4℃30分钟，4 ℃离心20分钟，弃上清，沥干。将沉淀溶于少量PBS，装入透析袋中，对0.02M PBS(PH7.4)透析，4℃过夜。将透析液中液体吸至离心管中，离心，将上清液 吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存。再以含0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.01 ％硫柳汞钠，pH7.4的磷酸缓冲液按1∶200-5000稀释冻存的辣根过氧化物酶标 记的山羊抗猪IgG多克隆抗体作为酶结合物工作液。
5.根据权利要求1所述的一种猪II型圆环病毒抗体间接ELISA诊断试剂盒， 其特征在于：所说的样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液 (pH7.4)；10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)；显色 液A为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液，显色液B为含0.5‰过氧化氢尿 素的柠檬酸—磷酸盐缓冲液；终止液为2M硫酸溶液。
6.根据权利要求1所述的一种猪II型圆环病毒抗体间接ELISA诊断试剂盒， 其特征在于：所说的阳性对照为经筛选获得的猪II型圆环病毒标准阳性血清 (OD450nm≥1.00)加入少量红色颜料并按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌 过滤；阴性对照为经筛选获得的猪标准阴性血清(OD450nm≤0.150)，按1000U/ml 加入青霉素和链霉素，无菌过滤。
7.根据权利要求1所述的一种猪II型圆环病毒抗体间接ELISA诊断试剂盒， 其检测程序为：1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；2)将待检血清用 样品稀释液作1∶100稀释，按100μl/孔加入抗体检测板中，同时设空白(只加100μl 样品稀释液)、阴性对照(PCV2阴性血清)、阳性对照(PCV2标准阳性血清)， 37℃孵育20-45分钟，甩干；3)每孔加洗涤液200μl，洗涤6次，每次间隔1 分钟，拍干；4)每孔加100μl的酶结合物工作液(空白不加)，37℃孵育20- 45分钟，甩干；5)每孔加洗涤液200μl，洗涤6次，每次间隔1分钟，拍干；6) 依次加50μl显色液A和50μl显色液B，37℃避光孵育5-15分钟；7)加50μl 终止液，用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值(OD450nm值)。
8.根据权利要求1所述的一种猪II型圆环病毒抗体间接ELISA诊断试剂盒， 其检测样本的判定标准为：以待检样本OD450nm值与标准阴性OD450nm值的比值 (P/N)，大于等于2.2判为阳性，小于等于1.7为阴性。介于1.7-2.2之间为可 疑，须重检，重测时P/N值大于等于2.0判为阳性，小于2.0为阴性。
技术领域
本发明涉及猪的一种病毒抗体的快速诊断方法和器具，具体是猪II型圆环 病毒(PCV2)抗体间接ELISA诊断试剂盒。
背景技术
目前，国内外采用的PCV2检测技术主要有：病毒分离培养，间接免疫荧 光(IFA)，免疫酶单层试验(IMPA)，原位杂交(ISH)，聚合酶链式反应(PCR)等等。 上述技术和方法虽然可以检测PCV2及其抗体水平，在实践中也取得一定的效 果，但均存在试验操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，常 限于实验室内进行，很难在基层普及和推广。因此，研制开发适用于养殖基层 的快捷、简便的PCV2抗体检测器具，对猪群PCV2免疫水平进行实时监测，建 立科学的、灵活的猪群疫病免疫程序，对疫病的预防和控制有重要意义。
发明内容
本发明的目的是这样实现的：采用原核表达的猪II型圆环病毒重组去核定 位信号衣壳蛋白(dCap)作为抗原包被可拆96孔酶标板，以辣根过氧化物酶标 记山羊抗猪IgG制备酶结合物工作液，以间接ELISA法直接检测标本中的PCV2 抗体。具体如下：
1.抗体检测板的制备：用pH8.5的0.05M Tris-HCl缓冲液作包被液，将猪 II型圆环病毒重组去核定位信号衣壳蛋白稀释为0.1-10μg/ml，按100μl/孔加入 聚苯乙烯微孔板中，37℃2小时，再4℃包被过夜，甩干，按100μl/孔加入含1 ％牛血清白蛋白(BSA)，PH7.4的磷酸盐缓冲液37℃封闭2小时，洗涤甩干， 再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，置干燥室干燥后，装入含干燥 剂的包装袋中保存。
2.酶结合物工作液的制备：用超纯水配制辣根过氧化物酶(HRP，RZ≥3.0) 溶液，加入0.06M过碘酸钠溶液4℃避光1小时，加入160mM乙二醇，室温反 应30分钟，加入PH4.4的醋酸缓冲液1小时2-8℃透析过夜，换液两次。将纯 化的山羊抗猪IgG加入上述活化的酶中，转移至透析袋，于0.05mM PH9.6的碳 酸缓冲液中透析，4℃搅拌过夜(换液两次)。透析液吸至离心管中，加新配的 NaBH4液，4℃反应2小时。加入等量的饱和硫酸铵溶液，4℃30分钟，4℃离心 20分钟，弃上清，沥干。将沉淀溶于少量PBS，装入透析袋中，对0.02M PBS(PH7.4) 透析，4℃过夜。将透析液中液体吸至离心管中，离心，将上清液吸出，加等量 甘油，混匀，-20℃保存。再以含0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.01％硫柳汞钠， pH7.4的磷酸缓冲液按1∶200-5000稀释冻存的辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪 IgG多克隆抗体作为酶结合物工作液。
3.其它试剂的配制：样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲 液(pH7.4)；10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)；显 色液A为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液，显色液B为含0.5‰过氧化氢 尿素的柠檬酸—磷酸盐缓冲液；终止液为2M硫酸溶液。
4.阳性、阴性对照的制备：将筛选获得的猪II型圆环病毒标准阳性血清 (OD450nm≥1.00)加入少量红色颜料并按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌 过滤，作为阳性对照；将筛选获得的猪标准阴性血清(OD450nm≤0.150)，按 1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌过滤，作为阴性对照。
5.其检测程序为：1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；2)将待检 血清用样品稀释液作1∶100稀释，按100μl/孔加入抗体检测板中，同时设空白(只 加100μl样品稀释液)、阴性对照(PCV2阴性血清)、阳性对照(PCV2标准阳 性血清)，37℃孵育20-45分钟，甩干；3)每孔加洗涤液200μl，洗涤6次，每 次间隔1分钟，拍干；4)每孔加100μl酶结合物工作液(空白不加)，37℃孵育 20-45分钟，甩干；5)每孔加洗涤液200μl，洗涤6次，每次间隔1分钟，拍 干；6)依次加50μl显色液A和50μl显色液B，37℃避光孵育5-15分钟；7) 加50μl终止液，用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值(OD450nm值)。
6.检测样本的判定标准为：以待检样本OD450nm值与标准阴性OD450nm值的 比值(P/N)，大于等于2.2判为阳性，小于等于1.7为阴性。介于1.7-2.2之间 为可疑，须重检，重测时P/N值大于等于2.0判为阳性，小于2.0为阴性。
本发明有益的积极效果是：操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层 次人员的需要，如疫病监测、海关检疫、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等， 易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。本发明 具有下列优点：
(1)特异性强，敏感性高。PCV2抗体间接ELISA诊断试剂盒以基因工程 表达的重组dCap蛋白为基础制备而成；重组dCap蛋白为非全病毒抗原、安全 性好，不含无关杂蛋白，只与猪II型圆环病毒阳性血清特异结合，不与PCV1 阳性血清等猪其它疫病阳性血清发生交叉反应。具有良好抗原性，因此具有很 高的特异性和敏感性。
(2)操作简便快速。使用PCV2抗体检测试剂盒检测PCV2抗体时，无需另 配其它试剂，样品无需无菌处理，按试剂盒说明在1-2小时内即可判定检测结果。
(3)结果判定形象、准确、可靠。PCV2抗体间接ELISA诊断试剂盒以显 色的深浅显示检测结果，即检测孔出现蓝色显色为阳性，中止后呈黄色，无色 为阴性，结果判定形象。采用酶标仪机读数，减少主观性，准确可靠。
(4)成本低，投资少。PCV2抗体间接ELISA诊断试剂盒可批量检测，一 步到位，成本低廉，投资少，见效快。
附图说明
图1是PCV2抗体间接ELISA诊断试剂盒检测原理示意图，图中；1为酶 标板，2为PCV2 dCap抗原，3为猪PCV2抗体或待检血清，4为HRP标记山 羊抗猪IgG多克隆抗体。
图2是重组PCV2 dCap蛋白的抗原活性鉴定结果，图中：为重组蛋白的 SDS-PAGE分析，B为重组蛋白的Western Blot鉴定，1为大肠杆菌BL21菌体 蛋白，2为空载体pGEX-4T-1的诱导表达产物，3为重组质粒未诱导菌体蛋白， 4为重组质粒诱导4h表达产物，5为纯化的重组GST-dCap融合蛋白，6为经凝 血酶切割后的重组dCap蛋白，M.为蛋白质Marker。
具体实施方式
(1)PCV2重组dCap蛋白的制备
根据PCV2 Cap基因序列设计特异性引物(上游引物： 5’-GC GGATCCAATGGCATCT TCAACAC-3’；下游引物： 5’-CCG CTCGA GTTAAGGGTTAAGTGGG-3’)，利用PCR技术从猪PCV2基因 组中扩增去核定位信号的衣壳蛋白基因序列(Cap基因3’端579bp的片段)(见 图3)，将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1的谷胱苷肽-S-转移酶基因(GST)下 游构建pGEX-PCV2-dCap表达载体，并转化大肠杆菌BL21，经0.1mM IPTG诱 导表达5小时后，用超声波裂解细菌，利用商用的GST亲和层析柱纯化表达的 融合蛋白(GST-dCap)，再以凝血酶酶解去除GST标签，获得猪II型圆环病毒重 组去核定位信号衣壳蛋白(图2)，该蛋白保留了完整衣壳蛋白的抗原性，可与 猪II型圆环病毒阳性血清特异结合(图2)。分别测定GST-dCap融合蛋白和重 组dCap蛋白的蛋白浓度，用于间接ELISA诊断试剂盒抗体检测板的制备。
1 AATGGCATCT TCAACACCCG CCTCTCCCGC ACCTTCGGAT ATACTATCAA GCGAACCACA
61 GTCAAAACGC CCTCCTGGGC GGTGGACATG ATGAGATTCA ATATTAATGA CTTTCTTCCC
121 CCAGGAGGGG GCTCAAACCC CCGCTCTGTG CCCTTTGAAT ACTACAGAAT AAGAAAGGTT
181 AAGGTTGAAT TCTGGCCCTG CTCCCCGATC ACCCAGGGTG ACAGGGGAGT GGGCTCCAGT
241 GCTGTTATTC TAGATGATAA CTTTGTAACA AAGGCCACAG CCCTCACCTA TGACCCCTAT
301 GTAAACTACT CCTCCCGCCA TACCATAACC CAGCCCTTCT CCTACCACTC CCGCTACTTT
361 ACCCCCAAAC CTGTCCTAGA TTCCACTATT GATTACTTCC AACCAAACAA CAAAAGAAAT
421 CAGCTGTGGC TGAGACTACA AACTGCTGGA AATGTGGACC ACGTAGGCCT CGGCACTGCG
481 TTCGAAAACA GTATATACGA CCAGGAATAC AATATCCGTG TAACCATGTA TGTACAATTC
541 AGAGAATTTA ATCTTAAAGA CCCCCCACTT AACCCTTAA
(2)PCV2抗体检测板的制备
用pH8.5的0.05M Tris-HCl缓冲液作包被液，将猪II型圆环病毒重组去核 定位信号衣壳蛋白稀释为0.1-10μg/ml，按100μl/孔加入可拆96孔酶标板，37℃2 小时，再4℃包被过夜，用1％BSA 37℃封闭2小时，以含0.05％吐温-20的 PBS(pH7.4)洗涤液充分洗涤，甩干。再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3 小时，置干燥室干燥后，用于PCV2抗体间接ELISA诊断试剂盒装配。
(3)山羊抗猪IgG多克隆抗体的制备
采取猪全血，分离血清，以饱和硫酸铵沉淀法粗提猪IgG。再经DEAE纤 维素离子交换层析纯化获得猪IgG纯品。将纯化的猪IgG蛋白按50～100μg/kg 体重皮下和肌肉注射免疫健康山羊3～4次，末次免疫10天后，静脉采血，以 ELISA测定其血清抗体效价在1∶2000以上时，心脏采血或颈动脉放血，收集高 免血清；以饱和硫酸铵法纯化山羊抗猪IgG抗体，不重述，再经DEAE纤维素 离子交换层析纯化，收集浓缩羊抗猪多克隆抗体，用于制备PCV2抗体检测试 剂盒酶结合物工作液。
(4)酶结合物工作液的制备
用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物(HRP)酶偶联于山羊抗猪IgG多克隆抗 体。用超纯水1ml溶解辣根过氧化物酶(HRP，RZ≥3.0)5mg溶液，加入1ml 0.06M 过碘酸钠溶液4℃避光1小时，加入1ml 160mM乙二醇，室温反应30分钟，加 入PH4.4的醋酸缓冲液2-8℃透析过夜，换液两次。将10mg纯化的羊抗猪IgG 加入上述活化的酶中，转移至透析袋，于0.05mM PH9.6的碳酸缓冲液中透析， 4℃搅拌过夜(换液两次)。透析液吸至离心管中，加入5mg/ml的NaBH4液0.4ml， 4℃反应2小时。加入等量的饱和硫酸铵溶液，4℃30分钟，4℃4000转离心20 分钟，弃上清，沥干。将沉淀溶于少量PBS，装入透析袋中，对0.02M PBS(PH7.4) 透析，4℃过夜。将透析液中液体吸至离心管中，离心，将上清液吸出，加等量 甘油，混匀，-20℃保存。再以含0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.01％硫柳汞钠 的磷酸缓冲液(pH7.4)按1∶200-5000稀释冻存的标记酶作为酶结合物工作液。
(5)样品稀释液、洗涤液、终止液的配制
样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液(KH2PO4 0.2g， Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐温-20)； 10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1M磷酸盐缓冲液(KH2PO4 2g， Na2HPO4·12H2O 29g，NaCl80g，定容至1000ml，pH7.4，再加5ml吐温-20)； 终止液为2M硫酸溶液，即量取111.2ml浓硫酸(18M)稀释定容至1000ml。
(6)阳性对照和阴性对照的制备
将筛选获得的猪II型圆环病毒标准阳性血清用样品稀释液1∶100稀释 (OD450nm≥1.00)加入少量红色颜料并按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌 过滤，作为PCV2抗体间接ELISA诊断试剂盒阳性对照；将筛选获得的猪标准 阴性血清用样品稀释液1∶100稀释(OD450nm≤0.150)，按1000U/ml加入青霉素 和链霉素，无菌过滤，作为PCV2抗体间接ELISA诊断试剂盒阴性对照。
(7)显色液的配制
称取200mg四甲基联苯胺(TMB)，用100ml无水乙醇或DMSO溶解后，以 双蒸水定容至1000ml，配制显色液A；称取21g一水柠檬酸，28.2g无水磷酸氢 二钠(Na2HPO4)，6.4ml 0.75％过氧化氢尿素，双蒸水定容至1000ml，调pH值到 4.5-5.0，配制显色液B。
(8)试剂盒检测操作程序
其检测程序为：1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；2)将待检血 清用样品稀释液作1∶100稀释，按100μl/孔加入抗体检测板中，同时设空白(只 加100μl样品稀释液)、阴性对照(PCV2阴性血清)、阳性对照(PCV2标准阳 性血清)，37℃孵育20-45分钟，甩干；3)每孔加洗涤液200μl，洗涤6次，每 次间隔1分钟，拍干；4)每孔加100μl酶结合物工作液(空白不加)，37℃孵育 20-45分钟，甩干；5)每孔加洗涤液200μl，洗涤6次，每次间隔1分钟，拍 干；6)依次加50μl显色液A和50μl显色液B，混匀，37℃避光孵育5-15分钟； 7)加50μl终止液，用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值(OD450nm值)。
(9)结果判定标准
判定标准以待检样本OD450nm值与标准阴性OD450nm值比值(P/N)，大于等于 2.2判为阳性，小于等于1.7为阴性。介于1.7-2.2之间为可疑，须重检，重 测时P/N值大于等于2.0判为阳性，小于2.0为阴性。如果阳性对照无明显显色 反应，或阴性对照出现显色，表明试剂盒失效或检测操作有误，需重新检测。
实施实例 PCV2抗体间接ELISA诊断试剂盒
原理参见图1，按实施例中(1)方法步骤制备重组PCV2 dCap蛋白，按实施 例中(2)方法步骤制备PCV2抗体检测板，按实施例中(3)(4)方法步骤制备PCV2 抗体检测试剂盒酶结合物工作液，按实施例中(5)方法步骤制备样品稀释液、洗 涤液、终止液，按实施例中(6)方法步骤制备抗体检测试剂盒阳性对照和阴性对 照，按实施例中(7)方法步骤制备显色液A、显色液B，最后，将各种组成成份 装配成PCV2抗体检测试剂盒。
使用PCV2抗体间接ELISA诊断试剂盒检测猪PCV2抗体或抗体水平时， 将采集分离的猪血清，用样品稀释液作1∶100或梯度稀释，制备待检样品溶液或 梯度稀释样品溶液，将待检样品、阳性和阴性对照分别加入抗原检测板，按实 施例中(8)中操作程序，室温作用30分钟，洗涤液洗涤，加酶结合物工作液，室 温作用30分钟，同上洗涤，加入显色液A，显色液B各50μl，室温避光显色 5min，滴加终止液50μl终止显色反应，酶标仪检测OD450nm值。按实施例中(9) 中的判定标准判定结果。检测孔OD450nm值与标准阴性对照OD450nm值比值(P/N) 大于等于2.2判为阳性。对于梯度稀释样品则检测孔为阳性的样品最高稀释度 为该待检血清的PCV2抗体滴度。如果PCV2阳性对照无明显显色反应，或阴性 对照出现显色，表明试剂盒失效或检测操作有误，需重新检测。
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