本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法，具体讲是一种抗中国对!l!下（Fe"werape"ae船 c/H'we";y&)血蓝蛋白单克隆抗体及其制备方法，其属于对虫下分子免疫学技术领域。

中国对虾是我国重要的海水养殖经济动物，自1993年暴发的对4下白斑症病毒(WSSV)病以 来， 一直是严重制约着我国养虾业发展的瓶颈。基于疾病控制的目的，对中国对虫下免疫机理 的研究变的尤为迫切和需要。血蓝蛋白是甲壳动物血淋巴的重要组成部分，具有多种生理功 能，近年来已有研究表明血蓝蛋白除载氧外，还具有酚氧化物酶活性、抗细菌和抗病毒活性、 转运金属离子、储存蛋白质、调节渗透压、蜕皮激素的载体、参与表皮的固化等作用，因此， 对甲壳动物血蓝蛋白的研究成为国内外学者研究的热点领域。目前普遍认为甲壳动物是通过 调节血蓝蛋白的浓度和特性，执行各项生理功能，因此，可以通过利用抗中国对虾血蓝蛋白 单克隆抗体，方便快捷地检测和监测到中国对虾体内血蓝蛋白的浓度波动变化规律，为辅助 诊断对虾生理健康状况提供了有力工具，同时也为更好地掌握了解血蓝蛋白在对虫下各项生理 功能中所起的作用有着极为重要理论和现实意义。

本发明的目的是提供一种抗中国对虾血蓝蛋白的单克隆抗体及其制备方法，为实现血蓝 蛋白的免疫学检测提供了重要工具，为进一步了解血蓝蛋白在中国对虫下体内的免疫功能起到 重要作用。
本发明的任务是由以下技术方案实现的：研制了一种抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体，
所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞CS-H，保藏号为：CCTCC-C200937，保藏单位为: 中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2009年05月11日的杂交瘤细胞分泌的。
与所述的单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于分子量为73 kDa和75 kDa的中 国对虾血蓝蛋白的两个亚基上。
一种所述抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：首先，抽取中国 对虾血淋巴经离心分离血浆，经超速离心获得中国对虾血蓝蛋白粗提物，利用对虾白斑症病 毒（WSSV)亲和层析，纯化中国对虾血蓝蛋白，经电泳分析和多肽质谱分析确认后，以亲和 纯化的血蓝蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合制备杂交瘤细胞，经过免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞CS-H，然后采用常规 方法培养上述所得到的杂交瘤细胞CS-H，收集细胞培养上清液，经纯化后得到鼠抗中国对虾 血蓝蛋白的单克隆抗体。
所述的免疫学检测筛选方法是：间接酶联免疫法，转印免疫印迹法和免疫沉淀法。其中 所述的间接酶联免疫法和转印免疫印迹法综合确定该单抗与中国对虾血蓝蛋白特异性结合反 应真实存在;所述的转印免疫印迹法确定该单抗的抗原决定簇位于分子量为73kDa和75kDa 的中国对虾血蓝蛋白的两个亚基上。
一种所述抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体在制备检测中国对虾血蓝蛋白在血淋巴中含量 变化的试剂中的应用。
一种所述抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体在制备研究血蓝蛋白在中国对虾非特异性免疫 应答中功能的试剂中的应用。
本发明的单抗经间接酶联免疫反应实验结果显示：单抗能与中国对虾血浆中的血蓝蛋白 发生特异性结合；免疫共沉淀结果显示：与对照例相比，本发明的单克隆抗体能特异性沉淀 未变性的中国对虾血蓝蛋白，沉淀的血蓝蛋白经电泳分析显示为73 kDa和75kDa两个亚基。
本发明的单抗经转印免疫印迹检测结果显示：变性后的血蓝蛋白的两个亚基结合有该单 抗，即表征本发明的单抗的抗原决定簇位于分子量为73 kDa和75 kDa的中国对虾血蓝蛋白的 两个亚基上。
在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞分裂旺盛、外观饱满、浑圆、折光 性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限分裂增殖能力；长势良好的该杂交瘤 细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的 抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体。
本发明的优点在于：由于本发明制备了抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体，为研究血蓝蛋 白在对虾非特异性免疫应答及其它生理功能提供了重要工具。由于本发明重要的制备技术路 线是：通过超速离心与亲和纯化获取血蓝蛋白，经质谱鉴定后作为抗原免疫小鼠，采用细胞 融合制备杂交瘤细胞，再经过免疫学检测筛选方法筛选出抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体。 这样的制备技术路线设计新颖，严密而合理。
由于使用的间接酶联免疫技术，通过包被亲和纯化的血蓝蛋白于酶标板上，使得确认该 发明单抗与中国对虾血蓝蛋白发生的特异性结合反应真实存在。本发明将免疫沉淀法和转印 免疫印迹法结合起来，能够更加直观的显示该发明单抗与非变性的和变性后的中国对虾血蓝 蛋白发生特异性结合反应。免疫共沉淀后经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现，该发 明单抗结合了中国对虾血浆蛋白在非变性条件下的73 kDa和75 kDa两条蛋白，证实了 73 kDa和75kDa蛋白为中国对虾血蓝蛋白的两个亚基，在非变性条件下它们以非共价键形式结合在 一起；通过转印免疫印迹结果显示，在变性后的中国对虾血浆蛋白的73kDa和75kDa位置出 现了两条紫褐色条带，即进一步证实与该发明单抗发生特异性结合反应的抗原决定簇位于分 子量为73 kDa和75 kDa的中国对虫下血蓝蛋白的两个亚基上。
附图说明
图1为利用WSSV亲和纯化中国对虾血蓝蛋白结果图。
图2为亲和纯化的血蓝蛋白蛋白的质谱分析结果。
图3为本发明的抗中国对虾血蓝蛋白单抗的转印免疫印迹结果图。
图4为本发明的中国对虾血蓝蛋白的免疫共沉淀结果图。
图5为间接酶联免疫法检测健康状态下与WSSV感染后中国对虾血淋巴内血蓝蛋白含量变 化结果图。
图6为间接酶联免疫法检测健康状态下与饥饿处理后中国对虾血淋巴内血蓝蛋白含量变 化结果图。
参见图l一图6:
图1中有：M是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；1表示粗提的中国对虾血蓝蛋 白的考马斯亮蓝染色结果；2表示WSSV亲和纯化的中国对虾血蓝蛋白的考马斯亮蓝染色结 果。
图2表示WSSV亲和纯化的血蓝蛋白73 kDa蛋白的质谱分析结果。
图3中有：M是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；l表示粗提的中国对虾血蓝蛋 白考马斯亮蓝染色结果；2表示本发明的单抗与变性后的中国对虾血蓝蛋白反应，识别的蛋 白为中国对虫下血蓝蛋白的两个亚基，分子量为73 kDa和75 kDa; 3表示阴性对照。
图4中有：M是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；l表示结合在Agarose G beads 上的本发明单抗的考马斯亮蓝染色结果；2表示本发明的单抗与非变性的中国对虾血蓝蛋白 反应，识别的蛋白为中国对虾血蓝蛋白的两个亚基，分子量为73kDa和75kDa; 3表示粗提 的中国对虫下血蓝蛋白考马斯亮蓝染色结果。
图5表示通过本发明的抗中国对虫下血蓝蛋白单抗，利用间接酶联免疫技术检测健康中国 对虫下和WSSV感染的中国对虾血淋巴中血蓝蛋白的水平变化。V表示感染WSSV的中国对虾； H表示健康的中国对虾。
图6表示通过本发明的抗中国对虾血蓝蛋白单抗，利用间接酶联免疫技术检测健康中国 对虫下和饥饿状态下的中国对虾血淋巴中血蓝蛋白的水平变化。饥饿组表示饥饿状态下的中国 对虾；健康组表示健康的中国对虾。具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。 实施例1:
制备抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体 一、抗原的制备
(1) 中国对虾血蓝蛋白粗提物的制备
① 取体长18m左右的健康海捕中国对虾，用酒精棉球消毒对虾头胸甲后缘，用吸取预冷 抗凝剂（氯化钠8.2g/L，柠檬酸5.5g/L，葡萄糖19.8g/L,柠檬酸钠8.8 g/L， pH6.4)的5ml 一次性医用注射器插入对虾心脏等比例抽取血液，离心650g， 10min， 4°C。
② 吸取上清液去除细胞沉淀，以400, OOOg超速离心4h，沉淀以结合缓冲液（O.lmol/L Tris-HCl， pH8.0)重悬，调整蛋白浓度为2 mg/ml。
(2) 中国对虾血蓝蛋白亚基的亲和纯化
① 取感染白斑病的虾鳃组织，利用研磨、差速离心和蔗糖密度梯度离心分离纯化WSSV， 将WSSV重悬于连接缓冲液（0.1 M NaHC03, 0.5 M NaCl, pH 8.3 )。
② 将①获得的WSSV与溴化氰活化琼脂糖凝胶4B (GE Healthcare)于室温下孵育lh，以 5倍体积的连接缓冲液洗涤去除未结合的WSSV，然后以O.lmol/L的Tris-HCl缓冲液室温孵 育2h以封闭琼脂糖凝胶4B未结合的偶联位点。
③ 分别以0. lmol/L的乙酸钠缓冲液(含0. 5 mol/L的NaCl， pH 4. 0)和0. lmol/L的乙 酸钠缓冲液（含0.5 mol/L的NaCl， pH 8.0)轮流洗涤凝胶3个循环，然后装柱子。
④ 以结合缓冲液溶解的中国对虾血蓝蛋白粗提物经0.22|im的滤膜过滤后上样，先用结 合缓冲液洗脱未结合的蛋白样品，然后以洗脱缓冲液（0.1mol/LTris-HCl， lmol/LNaCl， pH 8.0) 洗脱蛋白。
(3) SDS-PAGE和质谱分析鉴定纯化的血蓝蛋白
① 将亲和纯化的中国对虫下血桨蛋白与等量含十二垸基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮 3-5min;
② 将①处理过的样品加入上样孔中，每孔内加样品16^1，在恒流条件下,起始时用低电 流(30-40mA)，待样品在浓縮胶部分浓縮成一条线后，加大电流（50-70mA)，电泳至溴酚蓝 指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶以考马斯亮蓝R-250染色观察；
③ 切取其中一条蛋白条带，按体积l: l加入50 mMNH4HC03和乙腈溶液50uL， 37。C脱 色20min，吸干，重复3次，直至蓝色褪去。
©加乙腈50pL脱水至胶粒完全变白，真空抽干5min，将0.1pg4iL的酶储液以25mM NH4HC03稀释10倍后加入5pL，冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mMNH4HC03 10-15pL置37。C，消化过夜；
⑤吸取蛋白消化液进行MALDI-TOF MS质谱分析，所得到的质谱数据结果采用Mascot在 Genebank数据库中检索。
结果：利用WSSV成功亲和纯化出中国对虾血蓝蛋白，电泳显示其分子量为73kDa和75kDa (图l)，切取73kDa蛋白经质谱鉴定分析，确定其为血蓝蛋白（如图2)。
二、 免疫小鼠
用提纯的中国对虾血蓝蛋白作为抗原。每次的免疫剂量为O.lml，免疫共分4次进行，前 2次免疫间隔为2周，后3次免疫间隔为1周，前两次为腹腔注射，后两次为尾静脉注射：
(1) 基础免疫：提纯的中国对虾血蓝蛋白与福氏完全佐剂等量（V/V)混匀作为抗原；
(2) 加强免疫：提纯的中国对虾血蓝蛋白与福氏不完全佐剂等量（V/V)混匀作为抗原；
(3) 二次加强免疫：提纯的中国对虾血蓝蛋白作为抗原；
(4) 融合前三天的扩增免疫：提纯的中国对虾血蓝蛋白作为抗原。
三、 细胞融合
(1) 脱颈椎处死免疫小鼠，无菌取出脾脏和胸腺后，分别过100目网筛，用RPMI-1640 溶液吹打形成单细胞悬液；
(2) 分别将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃去上清液，脾细胞沉淀 用RPMI-1640溶液重悬，胸腺细胞沉淀用含有1%HAT的RPMI-1640 (含10%胎牛血清）选 择性细胞培养液重悬。
(3) 取3xl()7个处于对数生长期的P3-X63-Ag8Ul骨髓瘤细胞，1000rpm离心3min，去 上清液后，用RPMI-1640溶液重悬；
(4) 将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均匀后，1000rpm离心3min，完全吸去上清液， 轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀成糊状;用吸管吸取预温到37'C的聚乙二醇溶液lml， 滴加到离心管内，在lmin内加完；然后在37。C水浴静置5min;
(5) 继续滴加己经预温到37'C的RPMI-1640溶液15ml，使PEG稀释而失去作用；
(6) 补加RPMI-1640溶液至40ml，经1000rpm离心3min，弃去上清液；
(7) 将沉淀的细胞用3ml37。C的RPMI-1640(含10%胎牛血清）细胞培养液重悬，冻存
2ml;
(8) 将剩下的lml细胞悬液加入(2)制成的胸腺细胞悬液，混合均匀后滴加到96孔培养
板中；
(9) 将培养板放入37'C， C02浓度为4.5%的培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞生长 情况，大约两周后，取杂交瘤细胞培养上清液检测。
四、 筛选和克隆
(1)筛选：融合后，待杂交瘤细胞群长到96孔培养板的孔底面积1/3时开始检测，采用间接酶联免疫技术筛选阳性杂交瘤细胞。
① 包被抗原：将提纯的中国对虾血蓝蛋白用碳酸盐包被液（pH9.6) 1:10稀释，加入96 孔酶标板中（50pl/孔），4'C包被过夜；
② 吸出包被液，用含0.05。/。吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST)洗涤，每次5min，洗三次；
③ 每孔加入200nl3。/o的牛血清白蛋白（PBS配），37。C封闭lh; ©同②法洗涤三次；
©将杂交瘤细胞培养上清作为第一抗体按每孔50^d加入至酶标板，37。C温箱孵育lh;
⑥ 同②法洗涤三次；
⑦ 碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig (1:4000稀释）作为第二抗体按每孔50pl加入至酶标 板，37'C温箱孵育lh;
⑧ 同②法洗涤三次；然后每孔加入100pl 4-硝基酚磷酸盐（pNPP)应用液，暗处反应5 一20min，每孔加入50pl 2M的NaOH，稳定3—5min即可用405nm工作波长测定OD值。
测波长为405nm时各孔光吸收值，计算各实验孔与阴性对照光吸收值之比（P/N)，当 时该孔为阳性。
(2)克隆：采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，步骤如下-
① 脱颈椎处死小鼠，无菌取出胸腺，在100目网筛上研磨，用RPMI-1640溶液吹打形成 单细胞悬液；
② 把胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃去上清液，胸腺细胞沉淀用10ml RPMI-1640(含 10%胎牛血清)细胞培养液重悬；
③ 把要克隆的阳性细胞孔中的细胞用血球记数板记数，然后用培养液以10倍梯度稀释， 取出100个杂交瘤细胞，放入胸腺细胞悬液中；
④ 细胞悬液用滴管吹打均匀，滴加到96孔培养板中，每孔100nl，平均每个孔含有一个 杂交瘤细胞；
⑤ 放入C02培养箱中培养；
⑥ 两周后通过间接酶联免疫技术检测各孔杂交瘤细胞培养上清，把所得阳性克隆孔的杂 交瘤细胞按上述方法再克隆一次，以保证形成单克隆。
五、冻存
取生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，制成细胞悬液，200g离心5min，去上清，加冻存 液（9份RPMI-1640培养基+ 1份二甲亚砜），使最终细胞密度为5xl(^个/ml，将lml细胞悬 液装于2ml冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管装入盛有棉花的小盒内，放于-80。C超低温冰 箱内过夜（8-12小时）后，再浸入液氮内长期保存。本发明获得的生长旺盛，形态良好的杂 交瘤细胞，其名称为：小鼠杂交瘤细胞CS-H，保藏号为：CCTCC-C200937，保藏日期为： 2009年05月11日。实施例2:
本发明单抗的间接酶联免疫法鉴定-
O)包被抗原：将中国对虾血蓝蛋白用碳酸盐包被液（pH 9.6) 1:10稀释，加入96孔酶 标板中（50pl/孔），4"C包被过夜；
(2) 吸出包被液，用PBST洗涤，每次5min，洗三次；
(3) 每孔加入200nl3o/。的牛血清白蛋白（PBS配）37。C封闭lh;
(4) 同②法洗涤三次；
(5) 将上述筛选和克隆出的杂交瘤细胞培养上清作为第一抗体按每孔50pl加入至酶标 板，37'C温箱孵育lh;
(6) 同②法洗涤三次；
(7) 碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig (1:4000稀释）作为第二抗体按每孔50pl加入至酶标 板，37。C温箱孵育lh;
(8) 同②法洗涤三次；然后每孔加入lOOplpNPP应用液，暗处反应5-20min，每孔加入 50|nl 2M的NaOH，稳定3-5min即可用405nm工作波长测定OD值。
用包被PBS作为阴性对照，测波长为405rai时各孔光吸收值，计算阳性血清与PBS光吸 收值之比（P/N)，当P/N^2.1时为阳性。
结果：阳性：0.412;阴性对照：0.102。此结果证实本发明单抗能与中国对奸血蓝蛋白发
生特异性结合反应。
实施例3:
本发明单抗的转印免疫印迹法鉴定：
(1)十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳：
① 将粗提的中国对虾血浆蛋白加入等比例含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮 3-5min;
② 将①处理过的样品加入上样孔中，每孔内加样品10nl，在恒流条件下,起始时用低电 流(30-40mA)，待样品在浓縮胶部分浓縮成一条线后，加大电流（50-70mA)，电泳至溴酚蓝 指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶；
(D剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(孔径0.22pm)以电转移缓冲液（电转移 缓冲液：25mmol/L Tris-Base， 192mmol/L甘氨酸，20%甲醇，pH 8.3)润湿，放在电泳后的 凝胶上。在硝酸纤维素膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持,将第 二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面；按上述放置顺序，使胶块与硝酸纤维素膜及滤纸形成 一套夹心的〃三明治〃；
④将"凝胶三明治"置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内，将硝酸纤维素膜面向阳极；电泳 恒流200mA，通电5小时；
9⑤转移完毕，取出硝酸纤维素膜。 (2)免疫印迹：
① 将硝酸纤维素膜用PBS洗10分钟，然后置3%的牛血清白蛋白溶液（PBS配）中封闭 lh， 37°C;
② 用PBST洗3次，每次5分钟；
③ 将硝酸纤维素膜置于杂交瘤细胞培养上清中，37'C缓慢摇动1小时；以骨髓瘤细胞培 养上清孵育硝酸纤维素膜作为阴性对照；
④ 同②法洗涤三次；
⑤ 将硝酸纤维素膜加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig抗体（1:4000稀释）中，37'C缓慢摇 动1小时；
⑥ 同②法洗涤三次；
⑦ 把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液（NBT-BCIP发色液）中发色，直到颜色清晰 为止；
⑧ 用去离子水洗涤，以终止反应。将硝酸纤维素膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。 结果：本发明单抗与中国对虾血蓝蛋白分子量为73 kDa和75 kDa的两个亚基发生特异
性反应，显示紫褐色条带，而阴性对照无条带显示（图3)。 实施例4:
本发明单抗的免疫共沉淀法鉴定：
(1) 取两支1.5ml的无菌离心管，每管加入20^d偶联蛋白G的琼脂糖微珠（Agrose G beads),每管加入lml纯化后的抗体，将管子固定于混匀器上使混匀器匀速旋转（15rpm)， 室温下孵育2h。
(2) 将离心管于4。C 1000g离心5min，取上清，加入lralPBS洗涤微珠再次同上进行离 心，弃上清，如此反复洗涤共3次。
(3) 最后一次洗涤完毕弃上清，往其中一只离心管内加入lml粗提的中国对虾血浆蛋白 溶液，往另一只离心管内加入lmlPBS作为阴性对照，37。C同步骤（1)于混匀器上孵育lh。
(4) 同步骤（2)用PBS进行洗涤3次。
(5) 最后一次洗涤完毕后，弃上清，管中只剩AgroseG beads,往管中各加入35pl含十 二烷基磺酸钠的样品缓冲液混合后，于IOO'C煮沸10分钟，1000g离心5min后分别从两个离 心管中取15^x1进行SDS-PAGE。
(6) 电泳完毕后，取下PAGE胶用烤马斯亮蓝R-250进行染色，脱色后观察拍照。 结果：本发明的单抗特异性沉淀了分子量为73kDa和75kDa的两条蛋白条带，表明73kDa
和75kDa的两条蛋白为中国对虫下血蓝蛋白的两个亚基（图4)，在非变性条件下它们相互以非
共价键的结合在一起，且该发明的单抗可以与非变性的中国对虾血蓝蛋白两个亚基发生特异性结合反应。 实施例5:
采用本发明制备的抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体，作为制备检测中国对虾在感染wssv
情况下血蓝蛋白含量变化试剂中的应用。 (1)样品的制备：
① WSSV粗提液的制备
称取lg感染WSSV的中国对虾虾鳃组织，加入10mlPBS溶液进行研磨，6000g离心20min， 取上清作为WSSV粗提液用于感染中国对虾。
② 中国对虫下的感染
将上述制备的WSSV粗提液以PBS溶液10"咅后采用腹部体腔注射感染健康的中国对虾， 每尾注射50|iL。
③ 感染WSSV中国对虫下血清采集
感染后第2天，以5ml—次性医用注射器吸取抗凝剂等比例抽取中国对虾血淋巴，650g 离心10min，取上清，用于血蓝蛋白检测。采用同样方法采集健康中国对虾血清。 (2)利用本发明的单抗进行间接酶联免疫技术检测：
① 包被抗原：将上述采集的健康和WSSV感染的中国对虾血清用碳酸盐包被液（pH9.6) 1:50稀释，加入96孔酶标板中（50nl/孔），4'C包被过夜；
② 吸出包被液，用PBST洗涤，每次5min，洗三次；
③ 每孔加入200nl3。/o的牛血清白蛋白（PBS配）37。C封闭lh;
④ 同②法洗涤三次；
⑤ 每孔加入100nl杂交瘤培养上清，37。C温箱孵育lh;
⑥ 同②法洗涤三次;
⑦ 碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig (1:4000稀释）作为第二抗体按每孔100nl加入至酶标 板，37。C温箱孵育lh;
⑧ 同②法洗涤三次；然后每孔加入100pl pNPP应用液，暗处反应5—20min，每孔加入 2M的NaOH，稳定3 — 5min即可用405nm工作波长测定OD值。
结果：结果发现感染WSSV的中国对虾血淋巴中的血蓝蛋白浓度显著高于健康组。表明 中国对虾在感染WSSV后，体内的血蓝蛋白含量有明显的上调（图5)。 实施例6:
采用本发明制备的抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体，作为制备检测中国对虾在饥饿情况 下血蓝蛋白含量变化试剂中的应用。 (1)样品的制备
将健康中国对虾分两组进行养殖实验， 一组进行正常投喂人工饲料，另一组不投喂饲料进行饥饿处理，2周以后，以5ml—次性医用注射器吸取抗凝剂等比例抽取两个组的中国对虾 血淋巴，650g离心10min，取上清，用于血蓝蛋白检测。 (2)利用本发明的单抗进行间接酶联免疫技术检测：
① 包被抗原：将上述采集的健康和饥饿处理的中国对虾血清用碳酸盐包被液（pH9.6) 1:50稀释，加入96孔酶标板中（50pl/孔），4'C包被过夜；
② 吸出包被液，用PBST洗涤，每次5min，洗三次；
③ 每孔加入200^il3o/o的牛血清白蛋白（PBS配）37。C封闭lh; ©同②法洗涤三次；
⑤ 每孔加入lOOial杂交瘤培养上清，37'C温箱孵育lh;
⑥ 同②法洗涤三次；
⑦ 碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig (1:4000稀释）作为第二抗体按每孔100pl加入至酶标 板，37。C温箱孵育lh;
⑧ 同②法洗涤三次；然后每孔加入10(^lpNPP应用液，暗处反应5—20min，每孔加入 2M的NaOH，稳定3—5min即可用405nm工作波长测定OD值。
结果：结果发现饥饿处理的中国对虾血淋巴中的血蓝蛋白浓度显著低于健康组（图6)。 表明中国对虾在饥饿状态下，体内的血蓝蛋白含量有明显的下调。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改， 添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
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