抗蓝舌病病毒血清8型VP2蛋白的单克隆抗体BTV8-VP2-3E11及其识别的B细胞表位多肽和应用专利检索-多克隆血清疗法专利检索查询-专利查询网

抗蓝舌病病毒血清8型VP2蛋白的单克隆抗体BTV8-VP2-3E11及其识别的B细胞表位多肽和应用

阅读：262发布：2020-05-13

专利汇可以提供抗蓝舌病病毒血清8型VP2蛋白的单克隆抗体BTV8-VP2-3E11及其识别的B细胞表位多肽和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种抗蓝舌病病毒血清8型（BTV8）VP2蛋白的单克隆抗体 BTV8-VP2-3E11及其识别的B细胞表位多肽和应用，属于BTV8的防治领域。本发明筛选得到一株稳定分泌抗BTV8-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC No.7004，实验证明，该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体BTV8-VP2-3E11与BTV8-VP2蛋白能够发生特异性反应，而与其他血清型VP2蛋白不发生反应。本发明的单克隆抗体BTV8-VP2-3E11以及该单克隆抗体所识别的BTV8-VP2蛋白病毒特异性保守B细胞表位多肽可制备成诊断BTV8感染的试剂，为建立BTV8与其他血清型的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。，下面是抗蓝舌病病毒血清8型VP2蛋白的单克隆抗体BTV8-VP2-3E11及其识别的B细胞表位多肽和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一株分泌抗蓝舌病病毒血清8型（Bluetongue virus serotype8，BTV8）VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV8-VP2-3E11，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株的微生物保藏号为：CGMCC No.7004。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.BTV8-VP2蛋白线性B细胞表位多肽，其特征在于，所述的B细胞表位多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述表位多肽由权利要求2所述的单克隆抗体所识别。
4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或预防蓝舌病病毒血清8型感染药物中的应用。
5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或预防蓝舌病病毒血清8型感染药物中的应用。
6.权利要求3所述的BTV8-VP2蛋白线性B细胞表位多肽在制备诊断蓝舌病病毒血清
8型感染药物中的应用。

说明书全文

抗蓝舌病病毒血清8型VP2蛋白的单克隆抗体

BTV8-VP2-3E11及其识别的B细胞表位多肽和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，尤其涉及一株分泌抗BTV8-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本发明还涉及一个B细胞表位多肽，尤其涉及由上述单克隆抗体所识别的BTV8-VP2蛋白B细胞表位多肽；本发明还涉及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体以及B细胞表位多肽在制备诊断、检测或预防BTV8药物中的应用，属于BTV8的防治领域。

背景技术

[0002] 蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的反刍动物虫媒传染病。BTV能感染大多数家养的和野生的反刍动物，因动物的易感性不同表现出不同的临床症状。不同流行地区易感动物的死亡率差别很大，一般都可达到30%，在某些地区甚至更高。由于BT对世界经济的影响，世界动物卫生组织(OIE)将BT列为法定通报性疾病，我国将其划定为一类动物疫病。BT所造成的相关经济损失一方面是直接降低动物的生产能力和增加动物的死亡率，另一方面，也是更重要的一方面，是由于控制动物的流动、控制牛精液出口以及实施这些控制措施所需的费用而间接造成的动物贸易损失。

[0003] BT最早于1876年发现于南非的绵羊，1902年被命名为“抗疟疾绵羊卡他热”，1905年被正式命名为“蓝舌病”。20世纪初，由于高度易感的非本土绵羊品种的引进致使BT开始在非洲蔓延。BT被认为是一种地方流行性疾病，位于纬度40°S和53°N的美洲、非洲、亚洲、澳洲是高发地区，仅1996年造成全球范围内的经济损失高达30亿美元。1979年我国首次在云南绵羊发现蓝舌病，随后在29个省均检出BT阳性家畜，如山西（1991）、甘肃（1990）、四川（1988）、安徽（1985）、湖北（1983）等。BT主要通过媒介昆虫库蠓叮咬传播，病畜与健康家畜接触不传染，具有非接触传播的特点。2006年以来，随着气候变暖，BT尤其是BTV8在欧洲许多国家如比利时、荷兰、法国、德国等爆发，造成了严重的经济损失，同时也扩大了BTV的传统分布范围。覃绍敏等(2011)对广西11个地区的山羊BT进行了血清学调查，结果表明阳性率为6.3%-45.1%，平均阳性率为20.5%。这表明BT对我国的反刍动物具有潜在的威胁性。

[0004] BTV血清型众多，目前已发现24个血清型，而随着气候变化新的血清型不断出现，如最近又相继分离到的BTV25（瑞士，2008年）和BTV26（科威特，2011年）。然而由于各个血清型之间交叉免疫保护性差，使得疫苗免疫错综复杂不能起到很好的保护作用，到目前为止尚未有有效的疫苗出现。早期诊断，早期预防，是防止本病爆发的最有效方法。所以，必须加强我国BT尤其是BTV8的相关工作的研究，做好必要的技术储备。

[0005] BTV属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus），其基因组为分节段的线性双链RNA，包含10个节段，大小约为19kb，共编码11种蛋白。BTV病毒粒子有三层衣壳蛋白组成，由L2基因编码的VP2是BTV 外壳蛋白的主要成分之一。VP2为血清型特异性抗原，能刺激中和抗体产生，也是病毒血凝素抗原。BTV8-VP2长961个氨基酸，不同BTV血清型之间VP2序列差异最大。将BTV的24个血清型标准株的L2基因序列进行系统发育树比较，发现编码VP2的L2基因序列的变异与BTV血清型之间有密切联系。这表明VP2在决定BTV血清型方面起重要作用，是建立BTV血清型鉴别诊断的理想抗原。所以，筛选出一株可以分泌抗BTV8-VP2蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定出其所分泌的单克隆抗体所识别的BTV8-VP2蛋白特异性B细胞表位多肽对BTV8的诊断、预防具有重要作用，并为BTV8亚单位疫苗的研制奠定了基础。

发明内容

[0006] 本发明目的之一是提供一株分泌BTV8-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株； [0007] 本发明目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与BTV8-VP2蛋白发生特异性反应，而与其他血清型VP2蛋白不反应；

[0008] 本发明目的之三是鉴定一个BTV8-VP2蛋白的特异性B细胞表位多肽。

[0009] 本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

[0010] 本发明采用TRIZOL法提取BTV8型病毒总RNA，进而利用反转录技术克隆VP2基因cDNA，将该cDNA插入原核表达载体pMAL-c4X，利用pMAL-c4X原核表达载体对BTV8-VP2基因进行原核表达，将所表达出的包涵体形式的BTV8-VP2蛋白切胶纯化后作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。此外，本发明还利用杆状病毒表达系统对BTV8-VP2基因进行真核表达，对所表达的包涵体形式的BTV8-VP2蛋白进行包涵体纯化后作为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选，最终获得一株稳定分泌抗BTV8-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC No.7004，命名为BTV8-VP2-3E11，分类命名是：分泌抗BTV8-VP2-3E11单克隆抗体的杂交瘤细胞株；保藏时间：2012年12月11日；保藏单位是：中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

[0011] 本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，其命名为BTV8-VP2-3E11，Western blot检测结果表明单克隆抗体BTV8-VP2-3E11可与BTV8-VP2蛋白发生特异性反应，而与对照BHK-21细胞蛋白不发生反应；IFA检测结果表明单克隆抗体BTV8-VP2-3E11只与BTV8发生特异性反应，与其他血清型不发生反应。

[0012] 本发明利用肽扫描技术对BTV8-VP2-3E11所识别的BTV8-VP2蛋白的B细胞表位99 111
进行了鉴定，最终将表位精确定位为：HSEFHTKSNWVQW （SEQ ID NO.1所示。）。同时，序列比对结果显示这个表位多肽为BTV8所特有并保守的B细胞表位多肽。

[0013] 因此，本发明提出了所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或预防蓝舌病病毒血清8型感染药物中的应用。及

[0014] 所述的单克隆抗体在制备诊断或预防蓝舌病病毒血清8型感染药物中的应用。及 [0015] 所述的BTV8-VP2蛋白线性B细胞表位多肽在制备诊断蓝舌病病毒血清8型感染药物中的应用。

[0016] 综上所述，本发明制备并鉴定出了一种特异性针对BTV8-VP2蛋白的单克隆抗体，本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的BTV8-VP2蛋白病毒特异性保守B细胞表位多肽可用于制备成诊断或预防BTV8病毒感染的试剂，为建立BTV8与其他血清型BTV的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。附图说明

[0017] 图1为BTV8-VP2基因RT-PCR扩增结果；

[0018] 1：DL5000DNA Marker；2：BTV8-VP2基因RT-PCR扩增产物；

[0019] 图2为重组质粒pMAL-c4X-VP2的双酶切鉴定；

[0020] 1：DL5000DNA Marker；2：BamH I和Hind III双酶切pMAL-c4X-VP2结果； [0021] 图3为重组BTV8-VP2蛋白的SDS-PAGE分析结果；

[0022] M:标准蛋白Marker；1：pMAL-c4X-VP2诱导前产物；2：pMAL-c4X-VP237°C诱导4小时表达产物；3：重组BTV8-VP2蛋白超声后上清；4：重组BTV8-VP2蛋白超声后沉淀；5：
空载体pMAL-c4X诱导前产物；7：空载体pMAL-c4X37°C诱导4小时表达产物；

[0023] 图4为应用Western blot试验检测单克隆抗体BTV8-VP2-3E11与BTV8-VP2蛋白和BHK-21细胞的反应性结果；

[0024] 1：BTV8-VP2-3E11与BHK-21细胞裂解沉淀的反应；2：BTV8-VP2-3E11与BTV8感染的BHK-21细胞裂解沉淀的反应；M：标准蛋白Marker；

[0025] 图5为原核表达的24条短肽的SDS-PAGE分析；

[0026] 1-24：24条短肽；M：标准蛋白Marker；

[0027] 图6为原核表达的24条短肽与BTV8-VP2-3E11反应性的间接ELISA分析； [0028] 图7为表2中所合成短肽与BTV8-VP2-3E11反应性的间接ELISA分析；

[0029] 图8为表3中所合成短肽与BTV8-VP2-3E11反应性的间接ELISA分析。

具体实施方式

[0030] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0031] 主要实验材料和来源

[0032] 1.蛋白、细胞、病毒

[0033] 原核表达并纯化的BTV8-VP2蛋白、真核表达并纯化的BTV8-VP2蛋白、SP2/0细胞、Sf9细胞、BHK-21细胞和BTV1-24型毒株均由本实验室保存。

[0034] 2.主要试剂和药品

[0035] 胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司；50%PEG、50×HAT、50×HT、FITC标记羊抗鼠IgG抗体购自Sigma公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG抗体购自北京中杉金桥公司；邻苯二胺(OPD)购自哈尔滨博瑞生物技术有限公司；预染蛋白Marker购自Fermentas公司；SBAClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购于Southern Biotechnology公司; 限制性内切酶BamH I和Hind III、反转录酶、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒购自上海华舜公司。

[0036] 3.实验动物

[0037] 6周龄BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。 [0038] 实施例1BTV8-VP2蛋白的原核表达及纯化

[0039] 1.引物设计

[0040] 根据Genbank中已登录的BTV8VP2基因序列(登录号：AJ585129)，设计PCR扩增引物，序列如下：

[0041] BTV8VP2-BamHI-atg-1-18:5’-CGGGATCCATGGAGGAGCTAGCAATTC-3’

[0042] BTV8VP2-HindⅢ-2903-2884R:5’-GTCAAGCTTCTATACATTGAGCAGRTTAG-3’ [0043] 下划线部分为引入的BamH I、Hind III酶切位点，预计扩增产物长度为2886bp。 [0044] 2.BTV8病毒RNA的提取及反转录

[0045] 利用Trizol法从感染BTV8的BHK-21细胞中提取病毒基因组RNA作为模板，用BTV8VP2-HindⅢ-2903-2884R引物进行反转录合成病毒cDNA。

[0046] Trizol法提取RNA步骤：收获感染BTV8的BHK-21细胞1-5×107个，加入1mLTrizol混匀，室温静置5min，加入0.2mL氯仿，用力振摇15s，室温孵育2-3min，12000g，
4℃离心15min，离心后液体分三层，小心取出上层无色液体，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后室温孵育10min，12000g，4℃离心10min，弃上清，沉淀加入1mL75％的乙醇（DEPC水配制的），轻振15s，7500g，4℃离心5min，小心弃尽上清，沉淀室温风干3-5min，加入20-30μL DEPC水溶解，-20℃保存。

[0047] 用提取的病毒总RNA进行反转录合成cDNA，体系如下：

[0048]

[0049] 反应过程中，先将模板RNA溶液和下游引物于95℃孵育10min，冰浴冷却5min，然后将其余试剂加入，混匀，室温放置10min，42℃孵育60min，冰中冷却2min。 [0050] 3.BTV8VP2基因扩增与纯化

[0051] 以反转录获得的cDNA为模板，利用所设计的PCR扩增引物，扩增BTV8VP2基因（图1）。

[0052] PCR反应体系（50μL）如下：

[0053]

[0054] 反应条件为95°C预变性5min；95°C变性30s，54°C 退火30s，72°C延伸3min，循环30个周期；72°C延伸10min。

[0055] 然后对PCR产物胶回收，将全部PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下切取含有目的基因的胶块，之后按照上海华舜生物工程有限公司胶回收试剂盒说明书回收PCR扩增出的VP2基因。

[0056] 4.BTV8-VP2蛋白原核表达重组载体的构建

[0057] 将胶回收得到的VP2基因以及原核表达载体pMAL-c4X分别进行双酶切，酶切体系如下：

[0058]

[0059] 同时，对原核表达载体pMAL-c4X进行双酶切，酶切体系如下：

[0060]

[0061] 将酶切反应体系混匀后，置37°C水浴锅中静置2h。将L2基因双酶切后的体系用上海华舜生物工程有限公司PCR产物纯化试剂盒进行纯化，操作步骤按试剂盒说明书进行。将原核表达载体pMAL-c4X双酶切后的体系进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行胶回收。 [0062] 将双酶切后的L2基因和原核表达载体pMAL-c4X进行连接，连接体系为：10×T4DNA Ligase Buffer1μL，酶切后L2基因4μL，酶切后pMAL-c4X1.5μL，T4DNA连接酶1μL，ddH2O2.5μL。16°C连接过夜。

[0063] 5.转化与挑菌

[0064] 将4中得到的连接产物全部转入Ecoli DH5α感受态细胞中，冰浴30min，之后42℃水浴热刺激90s，再迅速冰浴2min。向管中加入250μL LB液体培养基，37℃摇床中摇动培养1h，将100μL菌液涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜。
从平板上随机挑取单个菌落，分别接种到5mL LB(Amp+，100μg/mL)液体培养基中37℃振荡培养。

[0065] 6.重组质粒的酶切鉴定与测序

[0066] 1）利用AXYGEN公司的质粒小量抽提试剂盒，按照试剂盒说明书操作从5中培养的菌液中提取质粒，将所提取的质粒与pMAL-c4X载体质粒一起进行琼脂糖凝胶电泳，选出疑似重组质粒。

[0067] 2）对疑似重组质粒进行酶切鉴定，酶切体系如下：

[0068]

[0069] 酶切条件为37℃水浴，作用2h。

[0070] 3）将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果初步判定阳性质粒（图2）。 [0071] 4）将经过初步断定含有阳性质粒的菌液送交上海英俊生物技术有限公司进行序列测定，将通过序列测定鉴定正确的重组质粒命名为pMAL-c4X-VP2。

[0072] 7.BTV8VP2基因的原核表达与纯化

[0073] 按照5所述转化方法将重组质粒pMAL-c4X-VP2转化到原核表达用BL21(DE3)感受态细胞，然后取出100μL菌液涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃培养过夜，挑取LB平板培养基上的白色孤立菌落，接种于5mL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中37℃培养过夜。表达诱导具体操作如下：取1mL重组菌菌液加入到100mL的LB培养基中37℃震荡培养至OD600nm约为0.5-1时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导4-5h（图3）。将表达产物进行SDS-PAGE电泳，通过切胶方法进行纯化。将切下的胶块加入适量的PBS将其研磨成细的碎颗粒，该胶粒不必加佐剂即可用于动物免疫，可缓慢释放出目的蛋白。

[0074] 实施例2单克隆抗体的制备

[0075] 1.小鼠免疫

[0076] 以切胶纯化的原核表达的重组BTV8-VP2蛋白免疫5只6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，每次免疫间隔两周，免疫剂量为50μg/只，免疫途径为腹腔免疫。 [0077] 分别在二免和三免后一周对小鼠进行断尾采血，分离血清（4℃，10000rpm，20min），用间接ELISA检测抗体水平。在细胞融合前3天，对免疫效果好的BALB/c小鼠再进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射50μg免疫抗原。

[0078] 2.细胞融合

[0079] 融合前1天准备饲养层细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞4∶1的比例用PEG进行细胞融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上。 [0080] 3.阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆

[0081] 利用纯化后的真核表达BTV8-VP2蛋白建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的亚克隆，至少亚克隆3次，将亚克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得一株可以稳定分泌抗BTV8-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC No.7004；并将其分泌的单克隆抗体命名为BTV8-VP2-3E11，以下简称3E11。

[0082] 4.单克隆抗体的大量制备

[0083] 给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，0.5mL/只，1周后腹6
腔注射1×10 个杂交瘤细胞，7～10d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水10000r/min离心10min，去除上层油脂和沉淀，上清分装保存于-20℃。 [0084] 实施例3单克隆抗体的鉴定

[0085] 1.单克隆抗体的亚类鉴定

[0086] 按照SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例2所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定。

[0087] 结果显示本发明单克隆抗体3E11的重链为IgG1，轻链为κ链。

[0088] 2.Western blot试验

[0089] 将离心收获BTV8病毒上清后的细胞沉淀和BHK-21细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE电泳，然后经电转印将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为18V 电压30min；用5%脱脂奶粉封闭液将转印后的硝酸纤维素膜4°C封闭过夜；加入单克隆抗体上清室温孵育1h，用PBST（含0.5mL/L吐温-20的pH7.4的PBS缓冲液）洗涤三次，再与4000倍稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG抗体室温孵育1h，PBST洗涤3次后，用DAB显色试剂盒显色，扫描记录。

[0090] 试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体3E11能够与BTV8-VP2蛋白发生特异性反应，而与对照BHK-21细胞不发生反应（图4），同时根据本实验结果推测3E11所识别的BTV8-VP2蛋白B细胞表位应该是一个线性表位。

[0091] 3.IFA试验

[0092] 将生长至70%～80%的BHK-21细胞接毒1～24型BTV。感染48小时后冷乙醇4°C固定30分钟，1：10倍稀释的3E11腹水孵育1小时，然后1:128倍稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗37°C孵育1小时。最后荧光显微镜观察拍照。

[0093] 试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体3E11仅能够与BTV8发生特异性反应而与其他23个BTV血清型不反应（表1）。

[0094] 表1IFA鉴定单克隆抗体3E11特异性

[0095]

[0096] 实施例4B细胞表位多肽的鉴定

[0097] 1.BTV8-VP2蛋白的分段截短表达

[0098] 以重组质粒pMAL-c4X-VP2的基因序列为模板，设计24对引物，在每对上下游引物的5’端分别引入BamH I、Hind III酶切位点。经PCR扩增后，按实施例1的方法将他们分别连接到原核表达载体pMAL-c4X上构建重组质粒，分别命名为pMAL-VP2-1﹣pMAL-VP2-24，然后将其分别转化至BL21（DE3）表达感受态细胞中进行诱导表达，每条短肽长约50-53aa，分别命名为VP2-1-VP2-24，相邻两条肽之间重叠10-13个aa。对其进行SDS-PAGE电泳分析，确定短肽成功表达(图5)。

[0099] 2.3E11抗原表位的初步鉴定

[0100] 将表达的24条短肽经超声破碎后分别以100ng/孔包被ELISA反应板，以3E11细胞培养上清为一抗37°C孵育1h，然后HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗37°C孵育1h进行间接ELISA实验。结果显示3E11只与VP2-3发生特异性反应，与其他短肽均不反应(图78
6)，进而将3E11所识别的BTV8-VP2蛋白B细胞表位初步定位于 RVLDITLKAFDDRKRAILND
127
GHSEFHTKSNWVQWMIDDAMDVQPLKVDIA 所示的氨基酸序列上。

[0101] 3.BTV8-VP2-3E11抗原表位的精确定位

[0102] 将3E11的抗原表位初步确定后，将VP2-3进一步截短，利用PepScan技术合成如下短肽（表2），相邻两条短肽之间重叠6个aa，再进行间接ELISA实验检测，包被量为100ng/孔，进一步确定抗原表位。结果显示3E11-3与3E11呈阳性反应，其他的与3E11均
98 113
呈阴性反应（图7），从而进一步将3E11抗原表位定位在 GHSEFHTKSNWVQWMI 所示的氨基酸序列上。

[0103] 根据上述间接ELISA检测结果进一步合成出如下4条短肽（表3），最终完成3E11所识别BTV8-VP2蛋白B细胞表位的精确定位。

[0104] 对表3中的短肽进行间接ELISA检测显示3E11与3E11-3-1、3E11-3-2、3E11-3-5、99 99
3E11-3-6均呈阳性反应，但是当 H缺失后与3E11-3-2的OD492nm值降为0.26，所以推测 H
111 111
为关键性氨基酸；当 W缺失后与3E11-3-7、3E11-3-8呈阴性应，推测 W为关键性氨基酸，
99 111
最终将3E11抗原表位分别精确定位到 HSEFHTKSNWVQW （图8）所示的氨基酸序列上（SEQ ID NO.1所示）。

[0105] 表2针对3E11合成的短肽

[0106]

[0107] 表3针对3E11合成的短肽

[0108]

[0109] 4.B细胞表位多肽的保守性和病毒特异性分析

[0110] 利用European Bioinformatics Institute（EBI）数据库提供的氨基酸序列Blast程序，对所鉴定出的BTV8-VP2蛋白B细胞表位多肽进行保守性分析，同时将该表位多肽与其它BTV血清型VP2蛋白相应区段进行比对，分析该表位多肽是否是BTV8-VP2蛋白特异性表位多肽。

[0111] 比对结果显示所鉴定出的BTV8-VP2蛋白B细胞表位多肽的氨基酸序列在BTV8各毒株中是相当保守的，仅在100S->100T一处发生突变（表4），而且和其它BTV血清型VP2蛋白相应区段的比较显示同源性非常低，表明该表位多肽是BTV8所特有的（表4）。 [0112] 表43E11抗原表位多肽的保守性分析

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