抗蓝舌病病毒血清8型VP2蛋白的单克隆抗体BTV8-VP2-4D9及其识别的B细胞表位多肽和应用
阅读：635发布：2020-05-12
专利汇可以提供抗蓝舌病病毒血清8型VP2蛋白的单克隆抗体BTV8-VP2-4D9及其识别的B细胞表位多肽和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种抗蓝舌病病毒血清8型（BTV8）VP2蛋白的单克隆 抗体 BTV8-VP2-4D9及其识别的B细胞表位多肽和应用，属于BTV8的防治领域。本发明筛选得到一株稳定分泌抗BTV8-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其 微 生物 保藏号是：CGMCC No.7003，实验证明，该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体BTV8-VP2-4D9与BTV8-VP2蛋白能够发生特异性反应，而与其他血清型VP2蛋白不发生反应。本发明的单克隆抗体BTV8-VP2-4D9以及该单克隆抗体所识别的BTV8-VP2蛋白病毒特异性保守B细胞表位多肽可制备成诊断BTV8感染的 试剂 ，为建立BTV8与其他血清型的血清学诊断方法奠定了 基础 。，下面是抗蓝舌病病毒血清8型VP2蛋白的单克隆抗体BTV8-VP2-4D9及其识别的B细胞表位多肽和应用专利的具体信息内容。
1.一株分泌抗蓝舌病病毒血清8型(Bluetongue virus serotype8,BTV8)VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV8-VP2-4D9，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株的微生物保藏号为:CGMCC N0.7003。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.BTV8-VP2蛋白线性B细胞表位多肽，其特征在于，所述的B细胞表位多肽的氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示，所述表位多肽由权利要求2所述的单克隆抗体所识别。
4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或预防蓝舌病病毒血清8型感染药物中的应用。
5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或预防蓝舌病病毒血清8型感染药物中的应用。
6.权利要求3所述的BTV8-VP2蛋白线性B细胞表位多肽在制备诊断蓝舌病病毒血清8型感染药物中的 应用。
抗蓝舌病病毒血清8型VP2蛋白的单克隆抗体BTV8-VP2-4D9及其识别的B细胞表位多肽和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，尤其涉及一株分泌抗BTV8-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本发明还涉及ー个B细胞表位多肽，尤其涉及由上述单克隆抗体所识别的BTV8-VP2蛋白B细胞表位多肽；本发明还涉及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体以及B细胞表位多肽在制备诊断、检测或预防BTV8药物中的应用，属于BTV8的防治领域。
背景技术
[0002] 蓝舌病(Bluetongue, BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的反刍动物虫媒传染病。BTV能感染大多数家养的和野生的反刍动物，因动物的易感性不同表现出不同的临床症状。不同流行地区易感动物的死亡率差别很大，一般都可达到30%，在某些地区甚至更高。由于BT对世界经济的影响，世界动物卫生组织(OIE)将BT列为法定通报性疾病，我国将其划定为ー类动物疫病。BT所造成的相关经济损失一方面通过直接降低动物的生产能力和增加动物的死亡率，更重要的是由于控制动物的流动、控制牛精液出ロ以及实施这些控制措施所需的费用而间接造成的动物贸易损失。
[0003] BT最早于1876年发现于南非的绵羊，1905年被正式命名为“蓝舌病”。20世纪初，由于高度易感的非本土绵羊品种的引进致使BT开始在非洲蔓延。BT被认为是ー种地方流行性疾病，位于纬度 40° S和53° N的美洲、非洲、亚洲、澳洲是高发地区，仅1996年造成全球范围内的经济损失高达30亿美。1979年我国首次在云南绵羊发现蓝舌病，随后在29个省均检出BT阳性家畜，如山西(1991)、甘肃(1990)、四川(1988)、安徽(1985)、湖北(1983)等。BT主要通过媒介昆虫库蠓叮咬传播。2006年以来，随着气候变暖，BT尤其是BTV8在欧洲许多国家如比利时、荷兰、法国、德国等爆发，造成了严重的经济损失，同时也扩大了 BTV的传统分布范围。覃绍敏等(2011)对广西11个地区的山羊BT进行了血清学调查，结果表明阳性率为6.3%-45.1%，平均阳性率为20.5%。这表明BT对我国的反刍动物具有潜在的威胁性。
[0004] BTV血清型众多，目前已发现24个血清型，而随着气候变化新的血清型不断出现，如最近又相继分离到的BTV25 (瑞士，2008年)和BTV26 (科威特，2011年)。然而由于各个血清型之间交叉免疫保护性差，使得疫苗免疫错综复杂不能起到很好的保护作用，到目前为止尚未有有效的疫苗。早期准确诊断，早期预防，是防止本病爆发的最有效方法。所以，必须加强我国BT尤其是BTV8的相关工作的研究，做好必要的技术储备。
[0005] BTV属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus),其基因组为分节段的线性双链RNA，包含10个节段，大小约为19kb，共编码11种蛋白。BTV病毒粒子有三层衣壳蛋白组成，由L2基因编码的VP2是BTV外壳蛋白的主要成分之一。VP2为血清型特异性抗原，能刺激中和抗体产生，也是病毒血凝素抗原。BTV8-VP2长961个氨基酸，不同BTV血清型之间VP2序列差异最大。将BTV的24个血清型标准株的L2基因序列进行系统发育树比较，发现编码VP2的L2基因序列的变异与BTV血清型之间有密切联系。这表明VP2在决定BTV血清型方面起重要作用，是建立BTV血清型鉴别诊断的理想抗原。所以，筛选出一株可以分泌抗BTV8-VP2蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定出其所分泌的单克隆抗体所识别的BTV8-VP2蛋白特异性B细胞表位对BTV8诊断、预防或治疗具有重要作用，并为BTV8亚单位疫苗的研制奠定了基础。
发明内容
[0006] 本发明目的之ー是提供一株分泌BTV8-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0007] 本发明目的之ニ是提供ー种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体(Mab)，该单克隆抗体可与BTV8-VP2蛋白发生特异性反应，而与其他血清型VP2蛋白不反应；
[0008] 本发明目的之三是鉴定ー个BTV8-VP2蛋白的特异性B细胞表位多肽。
[0009] 本发明的目的之四是提供上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体以及B细胞表位多肽在制备诊断或预防BTV8病毒感染药物中的应用。
[0010] 本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的:[0011 ] 本发明采用TRIZOL法提取BTV8型病毒总RNA，进而利用反转录技术克隆VP2基因cDNA，将该cDNA插入原核表达载体pMAL_c4X，利用pMAL_c4X原核表达载体对BTV8-VP2基因进行原核表达，将所表达出的包涵体形式的BTV8-VP2蛋白切胶纯化后作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髄瘤细胞进行融合。此外，本发明还利用杆状病毒表达系统对BTV8-VP2基因进行真核表达，对所表达的包涵体形式的BTV8-VP2蛋白进行包涵体纯化后作为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选，最终获得一株稳定分泌抗BTV8-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV8-VP2-4D9，其微生物保藏号是=CGMCC N0.7003 ;分类命名是:分泌抗BTV8-VP2-4D9单克隆抗体的杂交瘤细胞株；保藏时间:2012年12月11日；保藏单位是:中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所。
[0012] 本发明还提供了 ー种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，命名为BTV8-VP2-4D9, Western blot 检测结果表明单克隆抗体 BTV8-VP2-4D9 可与 BTV8-VP2蛋白发生特异性反应，而与对照BHK-21细胞蛋白不发生反应；IFA检测结果表明MabBTV8-VP2-4D9只与BTV8发生特异性反应，与其他血清型BTV不发生反应。
[0013] 本发明利用肽扫描技术对Mab BTV8-VP2-4D9所识别的BTV8-VP2蛋白的B细胞表位进行了鉴定，最终将表位精确定位为:622aqyvfektclyvle635 (seq id n0.1所示。)。同时，序列比对结果显示这个表位为BTV8所特有并保守的B细胞表位。
[0014] 因此，本发明提出了所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或预防蓝舌病病毒血清8型感染药物中的应用。及
[0015] 所述的单克隆抗体在制备诊断或预防蓝舌病病毒血清8型感染药物中的应用。及
[0016]所述的 BTV8-VP2 蛋白线性 B 细胞表位多肽 622AQYVFEKTCLYVLE635(SEQ ID N0.1 所示。)在制备诊断蓝舌病病毒血清8型感染药物中的应用。
[0017] 综上所述，本发明制备并鉴定出了一种特异性针对BTV8-VP2蛋白的单克隆抗体及其所识别的B细胞表位多肽，本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的BTV8-VP2蛋白病毒特异性保守B细胞表位多肽可用于制备成诊断或预防BTV8的试剂，从而为建立BTV8与其他血清型BTV的血清学诊断方法奠定了基础。附图说明
[0018] 图1为BTV8-VP2基因RT-PCR扩增结果；
[0019] I:DL5000DNA Marker ；2:BTV8-VP2 基因 RT-PCR 扩增产物；
[0020] 图2为重组质粒pMAL-c4X_VP2的双酶切鉴定；
[0021] I:DL5000DNA Marker ；2 =BamH I 和 Hind III 双酶切 pMAL_c4X_VP2 结果；
[0022] 图3为重组BTV8-VP2蛋白的SDS-PAGE分析结果；
[0023] M:标准蛋白 Marker ；1:pMAL-c4X-VP2 诱导前产物；2:pMAL-c4X-VP237° C 诱导4小时表达产物；3:重组BTV8-VP2蛋白超声后上清；4:重组BTV8-VP2蛋白超声后沉淀；5:空载体pMAL-c4X诱导前产物；7:空载体pMAL-c4X37° C诱导4小时表达产物；
[0024] 图4为应用Western blot试验检测单克隆抗体BTV8-VP2-4D9与BTV8-VP2蛋白和BHK-21细胞的反应性结果；
[0025] I:BTV8-VP2-4D9 与 BHK-21 细胞裂解沉淀的反应；2:BTV8-VP2-4D9 与 BTV8 感染的BHK-21细胞裂解沉淀的反应;M:标准蛋白Marker ；
[0026] 图5为原核表达的24条短肽的SDS-PAGE分析；
[0027] 1-24:24 条短肽;M:标准蛋白 Marker ；
[0028] 图6为原核表达的24条短肽与BTV8-VP2-4D9反应性的间接ELISA分析；
[0029] 图7为表2中所合成短肽与BTV8-VP2-4D9反应性的间接ELISA分析；
[0030] 图8为表3中所合成短肽与BTV8-VP2-4D9反应性的间接ELISA分析。
具体实施方式
[0031] 下面结合具体实施例来进ー步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0032] 主要实验材料和来源
[0033] 1.蛋白、细胞、病毒
[0034] 原核表达并纯化的BTV8-VP2蛋白、真核表达并纯化的BTV8-VP2蛋白、SP2/0细胞、Sf9细胞、BHK-21细胞和BTV1-24型毒株均由本实验室保存。
[0035] 2.主要试剂和药品
[0036] 胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司；50%PEG、50XHAT、50XHT、FITC标记羊抗鼠IgG抗体购自Sigma公司；ニ氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG抗体购自北京中杉金桥公司；邻苯ニ胺(OPD)购自哈尔滨博瑞生物技术有限公司；预染蛋白 Marker 购自 Fermentas 公司；SBA ClonotypingTM System/HRP 抗体亚类鉴定试剂盒购于Southern Biotechnology公司;限制性内切酶BamH I和Hind II1、反转录酶、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；胶回收试剂盒购自上海华舜公司。[0037] 3.实验动物
[0038] 6周龄BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。
[0039] 实施例1BTV8-VP2蛋白的原核表达及纯化
[0040] 1.引物设计
[0041] 根据Genbank中已登录的BTV8VP2基因序列(登录号:AJ585129)，设计PCR扩增引物，序列如下:
[0042] BTV8VP2-BamH1-atg-l-18:5，-CGGGATCCATGGAGGAGCTAGCAATTC-3’
[0043] BTV8VP2-Hind II1-2903-2884R: 5，-GTCAAGCTTCTATACATTGAGCAGRTTAG-3，
[0044] 下划线部分为引入的BamH 1.Hind III酶切位点，预计扩增产物长度为2886bp。
[0045] 2.BTV8病毒RNA的提取及反转录
[0046] 利用Trizol法从感染BTV8的BHK-21细胞中提取病毒基因组RNA作为模板，用BTV8VP2-Hind II1-2903-2884R引物进行反转录合成病毒cDNA。
[0047] Trizol法提取RNA步骤:收获感染BTV8的BHK-21细胞1-5X107个，加入ImLTrizol混匀，室温静置5min，加入0.2mL氯仿，用カ振摇15s，室温孵育2_3min，12000g, 4 °C离心15min，离心后液体分三层，小心取出上层无色液体，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后室温孵育10min，12000g，4°C离心lOmin，弃上清，沉淀加入lmL75%的こ醇(DEPC水配制的)，轻振15s，7500g，4°C离心5min,小心弃尽上清，沉淀室温风干3_5min，加入20-30 u LDEPC水溶解，-20°C保存。
[0048] 用提取的病毒总RNA进`行反转录合成cDNA，体系如下:
[0049]
[0050] 反应过程中，先将模板RNA溶液和下游引物于95°C孵育IOmin,冰浴冷却5min,然后将其余试剂加入，混匀，室温放置10min，42°C孵育60min，冰中冷却2min。
[0051] 3.BTV8VP2基因扩增与纯化
[0052] 以反转录获得的cDNA为模板，利用所设计的PCR扩增引物，扩增BTV8VP2基因(图1)。
[0053] PCR反应体系(50 ii L)如下:
[0054]
[0055] 反应条件为95° C预变性5min;95° C变性30s，54° C退火30s，72° C延伸3min,循环30个周期；72° C延伸lOmin。
[0057] 4.BTV8-VP2蛋白原核表达重组载体的构建
[0058] 将胶回收得到的VP2基因以及原核表达载体pMAL_c4X分别进行双酶切，酶切体系如下:
[0059]
[0060] 同时,对原核表达载体pMAL_c4X进行双酶切，酶切体系如下:
[0061]
[0062] 将酶切反应体系混匀后，置37° C水浴锅中静置2h。将L2基因双酶切后的体系用上海华舜生物工程有限公司PCR产物纯化试剂盒进行纯化，操作步骤按试剂盒说明书进行。将原核表达载体PMAL-C4X双酶切后的体系进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行胶回收。
[0063] 将双酶切后的L2基因和原核表达载体pMAL_c4X进行连接，连接体系为:10 X T4DNA Ligase Bufferl u L,酶切后 L2 基因 4 y L，酶切后 pMAL_c4Xl.5 u L, T4DNA 连接_liiL，ddH202.5 iiL。16° C 连接过夜。[0064] 5.转化与挑菌
[0065] 将4中得到的连接产物全部转入Ecoli DH5a感受态细胞中，冰浴30min，之后42°C水浴热刺激90s，再迅速冰浴2min。向管中加入250 u L LB液体培养基，37°C摇床中摇动培养lh，将IOOii L菌液涂布于含氨苄青霉素(IOOii g/mL)的LB平板上，37°C培养过夜。从平板上随机挑取单个菌落，分别接种到5mL LB (Amp+, 100 u g/mL)液体培养基中37°C振荡培养。
[0066] 6.重组质粒的酶切鉴定与测序
[0067] I)利用AXYGEN公司的质粒小量抽提试剂盒，按照试剂盒说明书操作从5中培养的菌液中提取质粒，将所提取的质粒与PMAL-C4X载体质粒一起进行琼脂糖凝胶电泳，选出疑似重组质粒。
[0068] 2)对疑似重组质粒进行酶切鉴定，酶切体系如下:
[0069]
[0070] 酶切条件为37°C水浴，作用2h。
[0071] 3)将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果初歩判定阳性质粒(图2)。
[0072] 4)将经过初歩断定含有阳性质粒的菌液送交上海英俊生物技术有限公司进行序列測定，将通过序列测定鉴定正确的重组质粒命名为pMAL-c4X_VP2。
[0073] 7.BTV8VP2基因的原核表达与纯化
[0074] 按照5所述转化方法将重组质粒pMAL-c4X_VP2转化到原核表达用BL21 (DE3)感受态细胞，然后取出IOOii L菌液涂布于含有氨苄青霉素(IOOii g/mL)的LB平板上，37°C培养过夜，挑取LB平板培养基上的白色孤立菌落，接种于5mL含有氨苄青霉素(100 yg/mL)的LB液体培养基中37°C培养过夜。表达诱导具体操作如下:取ImL重组菌菌液加入到IOOmL的LB培养基中37°C震荡培养至0D600nm约为0.5-1时，加IPTG至终浓度为Immol/L，37°C诱导4-5h (图3)。将表达产物进行SDS-PAGE电泳，通过切胶方法进行纯化。将切下的胶块加入适量的PBS将其研磨成细的碎颗粒，该胶粒不必加佐剂即可用于动物免疫，可缓慢释放出目的蛋白。
[0075] 实施例2单克隆抗体的制备
[0076] 1.小鼠免疫
[0077] 以切胶纯化的原核表达重组VP2蛋白免疫5只6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，毎次免疫间隔两周，免疫剂量为50 u g/只，免疫途径为腹腔免疫。
[0078] 分别在ニ免和三免后一周对小鼠进行断尾采血，分离血清(4 °C，IOOOOrpm,20min)，用间接ELISA检测抗体水平。在细胞融合前3天，对免疫效果好的BALB/c小鼠再进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射50 y g免疫抗原。
[0079] 2.细胞融合[0080] 融合前I天准备饲养层细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髄瘤细胞4: I的比例用PEG进行细胞融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上。
[0081] 3.阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆
[0082] 利用纯化后的真核表达BTV8-VP2蛋白建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的亚克隆，至少亚克隆3次，将亚克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得一株可以稳定分泌抗BTV8-VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是=CGMCC N0.7003 ;并将其分泌的单克隆抗体命名为BTV8-VP2-4D9，以下简称4D9。
[0083] 4.单克隆抗体的大量制备
[0084] 给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，0.5mL/只，I周后腹腔注射I X IO6个杂交瘤细胞，7〜IOd后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水10000r/min离心lOmin，去除上层油脂和沉淀，上清分装保存于_20°C。
[0085] 实施例3单克隆抗体的鉴定
[0086] 1.单克隆抗体的亚类鉴定
[0087] 按照SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例2所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定。
[0088] 结果显不本发明单克隆抗体4D9的重链为IgG1，轻链为k链。
[0089] 2.Western blot 试验
[0090] 将离心收获BTV8病毒上清后的细胞沉淀和BHK-21细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE电泳，然后经电转印将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为18V电压30min;用5%脱脂奶粉封闭液将转印后的硝酸纤维素膜4° C封闭过夜；加入单克隆抗体上清室温孵育lh，用PBST (含0.5mL/L吐温-20的pH7.4的PBS缓冲液)洗涤三次，再与4000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG抗体室温孵育Ih，PBST洗涤3次后，用DAB显色试剂盒显色，扫描记录。
[0091] 试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体4D9能够与BTV8-VP2蛋白发生特异性反应，而与对照BHK-21细胞不发生反应(图4)，同时根据本实验结果推测4D9所识别的BTV8-VP2蛋白B细胞表位应该是一个线性表位。
[0092] 3.1FA 试验
[0093] 将生长至70%〜80%的BHK-21细胞接毒I〜24型BTV。感染48小时后冷こ醇4°C固定30min，I: 10倍稀释的4D9腹水孵育I小时，然后1:128倍稀释的FITC标记的羊抗鼠ニ抗37°C孵育I小吋。最后荧光显微镜观察拍照。
[0094] 试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体4D9仅能够与BTV8发生特异性反应而与其他23个BTV血清型不反应(表I)。
[0095] 表IIFA鉴定单克隆抗体4D9特异性
[0096]
[0098] 实施例4B细胞表位多肽的鉴定
[0099] 1.BTV8-VP2蛋白的分段截短表达
[0100] 以重组质粒pMAL-c4X_VP2的基因序列为模板，设计24对引物，在每对上下游引物的5 ’端分别弓I入BamH 1.Hind 111酶切位点。经PCR扩增后，按实施例1的方法将他们分别连接到原核表达载体PMAL-C4X上构建重组质粒，分别命名为pMAL-VP2-l - pMAL_VP2_24，然后将其分别转化至BL21 (DE3)表达感受态细胞中进行诱导表达，每条短肽长约50-53aa，分别命名为VP2-1-VP2-24，相邻两条肽之间重叠10-13个aa。对其进行SDS-PAGE电泳分析，确定短肽成功表达(图5)。
[0101] 2.单克隆抗体4D9抗原表位的初步鉴定
[0102] 将表达的24条短肽经超声破碎后分别以IOOng/孔包被ELISA反应板，以3E11细胞培养上清为一抗37° C孵育lh，然后HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗37° C孵育Ih进行间接ELISA实验。结果显示单克隆抗体4D9只与VP2-17发生特异性反应，与其他短肽均不反应(图6)，进而将单克隆抗体4D9所识别的BTV8-VP2蛋白B细胞表位初步定位于622AQYVFEKTCLYVLELLSKHTMPSEDSEVTFEHPTVDPNIDIETWKIIDVSQLII675。
[0103] 3.单克隆抗体4D9抗原表位的精确定位
[0104] 将4D9的抗原表位初步确定后，将VP2-17进一步截短，利用P印Scan技术合成如下短肽(表2)，相邻两条短肽之间重叠6个aa，再进行间接ELISA实验检测，包被量为IOOng/孔，进一步确定抗原表位。结果显示4D9-1与4D9呈阳性反应，其他的与4D9均呈阴性反应(图7)，从而进一步将4D9抗原表位定位在622aqyvfektclyvlell637。
[0105] 根据上述间接ELISA检测结果进一步合成出如下短肽(表3)，最终完成4D9所识别BTV8-VP2蛋白B细胞表位的精确定位。
[0106] 对表3中的短肽进行间接ELISA检测显示单克隆抗体4D9只与4D9-1-5、4D9-1-6反应，当622A缺失后与相应短肽均不反应，推测622A为关键性氨基酸，当635E缺失后与相应短肽不反应，推测635E为关键性氨基酸，所以将4D9抗原表位精确定位到622Aqyvfektclyvle635 (seq id n0.1 所示。)(图 8)。
[0107] 表2针对单克隆抗体4D9合成的短肽
[0108]
[0109] 表3针对单克隆抗体4D9合成的短肽
[0110]
[0111] 4.B细胞表位多肽的保守性和病毒特异性分析
[0112]利用European Bioinformatics Institute(EBI)数据库提供的氨基酸序列Blast程序，对所鉴定出的BTV8-VP2蛋白B细胞表位进行保守性分析，同时将该表位序列与其它BTV血清型VP2蛋白相应区段进行比对，分析该表位是否是BTV8-VP2蛋白特异性表位。
[0113] 比对结果显示所鉴定出的BTV8-VP2蛋白B细胞表位在BTV8各毒株中是完全保守的(表4)，而且和其它BTV血清型VP2蛋白相应区段的比较显示同源性非常低，表明该表位是BTV8所特有的(表4)。
[0114] 表44D9抗原表位保守性分析
[0115]
[0001]
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