一种治疗斑秃药物的制备方法
专利汇可以提供一种治疗斑秃药物的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种药物的制备方法，特别是涉及一种 治疗 斑秃药物的制备方法。药物的前体为含15％人AB型血清的 基础 培养基，该基础培养基按15ml人AB型血清、85ml低糖培养基(DMEM)、0.24gHepes、0.2g 碳 酸氢钠、0.03g L－谷 氨 酰胺配比构成。用基础培养基培养低传代人毛 乳头 细胞，收集低传代人毛乳头细胞培养上清为人毛乳头细胞条件培养液，将所收集的人毛乳头细胞条件培养液制备成冻干粉。本发明所制备的药物在治疗斑秃中有明显的疗效，明显优于其它药物(如 激素 )对斑秃的治疗效果，且本药物所用细胞和培养血清对人体均无 抗原 性，用于人体无任何过敏反应，克服激素治疗斑秃给人体带来的 副作用 。，下面是一种治疗斑秃药物的制备方法专利的具体信息内容。
1、一种治疗斑秃药物的制备方法，其特征在于：用含人AB型血清的 基础培养基培养低传代人毛乳头细胞，收集低传代人毛乳头细胞培养上 清，将所收集上清液制备成冻干粉。
(1)上述人AB型血清制备的步骤为：
a)采集健康献血员全血200ml入无抗凝剂的血袋；
b)将全血血袋37℃水箱中放置1小时；
c)2000rpm离心30分钟；
d)用血清分离器分离人AB型血清，
e)将人AB型血清在56℃水箱中放置1小时去除补体，注意其上下温差 应小于0.5℃；
f)在超净台上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分钟，空干；
g)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，将血清倒入已消毒好的100ml瓶中；
h)用吸管分装为15ml/瓶，-20℃冻存备用。
(3)上述的基础培养基的制备方法：
基础培养基：将15ml人AB型血清与85ml低糖培养基(DMEM)， 0.24gHepes，0.2g碳酸氢钠，0.03g L-谷氨酰胺混匀后，用0.22微米孔 径的微孔滤膜过滤除菌，直接使用或-20℃冻存备用。
(4)人毛乳头细胞条件培养液的收集过程为：
a)取意外死亡的正常健康青年枕后一手掌大小头皮，用二步酶法分离人 毛乳头；
b)培养时在50ml培养瓶中加入5ml基础培养基，100ml培养瓶中加入7ml 基础培养基，3天换一次基础培养基；
c)开启超净台并用紫外线消毒30分钟，操作时着隔离衣，戴一次性口罩 和帽子，用75％酒精消毒双手后在超净台上将低传代人毛乳头细胞培 养上清从培养瓶中无菌倒入50ml无菌离心管中，用旋丝口盖盖上离心 管并拧紧，在离心机中离心；
d)在超净台上打开离心管，用无菌吸管吸出离心管中的上清，移入无菌 玻璃容器中，加无菌橡皮塞后，作好标记，-20℃冻存备用。
(5)人毛乳头细胞条件培养液的冻干过程为：
a)冻干室紫外线消毒4小时；
b)操作时着隔离衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超 净台上用无菌吸管将药物分为3ml/冻干瓶，盖上瓶塞且留出冻干孔；
c)将冻干瓶放入冻干机中；
d)连续冻干过程：
I -40℃ 4小时
II -20℃ 3小时
III -5℃ 10小时
IV 5℃ 4小时
V 15℃ 3小时
VI 25℃ 5小时
e)在真空环境下，用手摇下压力盖，真空封包冻干瓶完成；
f)打开冻干机冻干室门，取出冻干瓶，加瓶盖并加压封包瓶塞；
g)贴上标签，注明标识和日期，4℃保存备用。
2、根据权利要求1所述的一种治疗斑秃药物的制备方法，其特征在于： 上述人AB型血清制备的步骤也可为：
a)采集健康献血员全血200ml入无抗凝剂的血袋；
b)将全血血袋37℃水箱中放置1小时；
c)2000rpm离心30分钟；
d)用血清分离器分离人AB型血清，所分离的AB型血清可放入-20℃冷 冻箱备用；
e)将人AB型血清袋从-20℃冷冻箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小时；
f)将人AB型血清室温放置2小时；
g)将人AB型血清在37℃水箱中放置1小时；
h)将人AB型血清在56℃水箱中放置1小时去除补体，注意其上下温差 应小于0.5℃；
i)在超净台上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分钟，空干；
j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，将血清倒入已消毒好的100ml瓶中；
k)用吸管分装为15ml/瓶，-20℃冻存备用。
技术领域
本发明涉及一种药物的制备方法，特别是涉及一种治疗斑秃药物的制备 方法。
技术背景
斑秃是皮肤科临床常见疾病之一，占皮肤科门诊量的10～15％，由于生 活节奏的加快，这一数字还有进一步升高的趋势，斑秃进一步发展可演变为 普秃和全秃，这给患者身心带来严重的负担。在斑秃的的治疗中，多以全身 或局部应用激素，但长期使用激素会产生一系列明显的副作用如：库欣氏征、 皮肤变薄等。如何减少或不用激素治疗斑秃是目前亟待解决的问题。
一般认为，人毛乳头细胞(dermal papilla cells，DPC)在毛囊的发育及周期性 生长调控中起重要作用。要阐明人毛乳头细胞对调节毛囊生长和发育的机制， 必须从人毛乳头细胞自身分泌的生物活性成份着手，这也是今后毛囊研究的 重要内容之一。我们在建立人毛乳头细胞体外培养模型基础上，应用低传代 人毛乳头细胞的培养上清制成条件培养基，观察其对不同传代的人毛乳头细 胞生长状态的影响，发现人毛乳头细胞条件培养液(dermal papilla cell conditional medium DPCCM)能将非凝集生长的人毛乳头细胞有效诱导为凝 集性生长状态，并促进细胞增殖。为进一步分析人毛乳头细胞生长活性蛋白 的体内生物学活性，我们将人毛乳头细胞条件培养液制成冻干粉，初步应用 于斑秃患者，发现其有确切的治疗作用。
发明内容
本发明药物制备的方案：是通过以下步骤来实现的：
1.试剂和材料
低糖培养基(DMEM)：购自Sigma公司。Hepes：购自Boehringer Mannheim公司。健康人AB型血清：第三军医大学西南医院输血科提供。
2.药物制备的方法
基础培养基的制备：
1).人AB型血清的制备
a)采集健康献血员(经查排除HIV、HBV、HCV、梅毒螺旋体感染)全 血200ml入无抗凝剂的血袋；
b)将全血血袋37℃水箱中放置1小时；
c)2000rpm离心30分钟；
d)用血清分离器分离人AB型血清，所分离的人AB型血清可放入-20℃ 冷冻箱备用，也可直接行下例步骤h)；
e)将人AB型血清袋从-20℃冷冻箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小时；
f)将人AB型血清室温放置2小时；
g)将人AB型血清在37℃水箱中放置1小时；
h)将人AB型血清在56℃水箱中放置1小时去除补体，注意其上下温差 应小于0.5℃；
i)在超净台上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分钟，空干；
j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，将血清倒入已消毒好的100ml瓶中；
k)用吸管分装为15ml/瓶，-20℃冻存备用。
2).基础培养基的制备：将15ml人AB型血清与85ml低糖培养基 (DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氢钠，0.03g L-谷氨酰胺混匀后，用0.22 微米孔径的微孔滤膜过滤除菌，直接使用或-20℃冻存备用。
3).人毛乳头细胞条件培养液的收集
(1)取意外死亡的正常健康青年(经查排除HIV、HBV、HCV、梅毒螺 旋体感染)枕后一手掌大小头皮，用二步酶法分离人毛乳头细胞(参见：钟白 玉，杨希川，杨卫兵，等。二步酶消化法分离人头皮毛乳头细胞[J]。中华皮 肤科杂志，2003；36(7)：406。)；
(2)培养时在50ml培养瓶中加入5ml基础培养基，100ml培养瓶中加入 7ml基础培养基，3天换一次基础培养基；
(3)开启超净台并用紫外线消毒30分钟，操作时着隔离衣，戴一次性口 罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超净台上将低传代毛乳头细胞培养上清 从培养瓶中无菌倒入50ml无菌离心管中，用旋丝口盖盖上离心管并拧紧，在 IK16型离心机(美国SIGMA公司)中3000rpm离心10分钟；
(4)在超净台上打开离心管，用无菌吸管吸出离心管中的上清(小心不能 搅起底部的沉淀)，移入无菌玻璃容器中，加无菌橡皮塞后，作好标记，-20 ℃冻存备用。
4).人毛乳头细胞条件培养液冻干粉的制备
(1)冻干室紫外线消毒4小时；
(2)操作时着隔离衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超 净台上用无菌吸管将人毛乳头细胞条件培养液分为3ml/冻干瓶，盖上瓶塞且 留出冻干孔；
(3)将冻干瓶放入冻干机中；
(4)冻干过程：
I -40℃ 4小时
II -20℃ 3小时
III -5℃ 10小时
IV 5℃ 4小时
V 15℃ 3小时
VI 25℃ 5小时
(5)在真空环境下，用手摇下压力盖，真空封包冻干瓶完成；
(6)打开冻干机冻干室门，取出冻干瓶，加瓶盖并加压封包瓶塞；
(7)贴上标签，注明标识和日期，4℃保存备用。
治疗斑秃药物的理化特性为：
颜色：白色；
形态：粉末状；
pH值：7.35；
溶解度：每瓶用3ml生理盐水在3秒钟内可完全溶解，溶解后液体为 橙红色。
本发明的优点和产生的有益效果是：
人毛乳头细胞为分泌性细胞，在体外培养时可分泌许多蛋白质，这些蛋 白质可促进毛囊的生长和发育，在体外实验我们已证明其有确切的生物学活 性，但其应用于临床还未见报道，我们在原有的培养人毛乳头细胞的基础上， 改进其培养基，用人AB型血清替代小牛血清，成功地培养出人毛乳头细胞， 我们收集培养过低传代人毛乳头细胞的基础培养基，用于临床治疗斑秃，观 察其治疗效果，发现有确切的治疗作用，取得了良性的经济效益和社会效益。
应用本发明制备的药物在治疗斑秃中有明显的疗效，明显优于其它药物 (如激素)对斑秃的治疗效果，且本药物所用细胞和培养血清均对人体均无 抗原性，用于人体无任何过敏反应，本发明用含人AB型血清的基础培养基培 养人毛乳头细胞，较以前用小牛血清培养人毛乳头细胞在技术上取得了突破， 这就为本药物应用于临床奠定了基础，这也是本发明关键技术的核心所在。
具体实施方式
1).小鼠急性毒性试验：我们选用7～9周龄、体重为18～22g的昆明种小鼠。 按预试验公比0.8设立50.0ml/kg、40.0ml/kg、32.0ml/kg、25.6ml/kg、20.5ml/kg 等5个剂量组，每组10只小鼠，雌雄各半。单次腹腔注射，药后立即观察、 记录动物的中毒反应、死亡情况及时间，连续观察14天。
2).家兔热原试验：选3只体重为1.8～2.4kg的日本大耳白家兔。按10ml/kg 耳静脉注射给药。测量家兔肛门体温，深度为6厘米，以后每隔1小时测 量体温1次，共3次。
3).细菌培养：随机抽取5支冻干瓶，无菌生理盐水溶解，4道划线法接种于 普通血平板上，培养48小时后观察结果。
4).真菌培养：随机抽取5支冻干瓶，无菌生理盐水溶解，接种于沙堡氏培养 基上，培养10日后观察结果。
试验结果：小鼠急性毒性试验显示在腹腔注射不同剂量人毛乳头细胞条件培 养液样品溶液后，各组动物未发现明确的中毒症状，在整个试验期限内无 动物死亡或其它异常征象。家兔热原试验显示在耳静脉注射人毛乳头细胞 条件培养液样品溶液后，各动物的体温变化均符合热原试验的要求。细菌 和真菌培养均未见细菌和真菌生长。
药物的临床实施例
选择50例年龄在12～64岁的斑秃患者为人毛乳头细胞条件培养液治疗 组，其中26例为人毛乳头细胞条件培养液治疗组中多发性斑秃患者，选择 与人毛乳头细胞条件培养液治疗患部距离在2厘米以上的患部作为去炎松治 疗组；选择与人毛乳头细胞条件培养液距离在5厘米以上的患部作为空白自 身对照患部，以上3组均常规消毒患部皮肤后皮下多点注射治疗，2月后观 察疗效。
表1各组斑秃治疗2月后情况(％) n 治愈率(例) 总有效率(例) 空白对照组 去炎松治疗组 人毛乳头细胞条件培养 液治疗组 10 26 50 10(1) 54(14) 74(37*) 30(3) 73(19) 96(48*)
*与空白对照组比较，P＜0.01，
*与去炎松组比较，P＜0.01
人毛乳头细胞条件培养液在通过生物安全鉴定后，我们在患者知情同意 的情况下应用于患部。50例人毛乳头细胞条件培养液治疗的斑秃患者中，除 2例无效外其余均有一定疗效，这与去炎松治疗组比较取得了良好的疗效。 人毛乳头细胞条件培养液治疗组中有29例为复发性斑秃患者且多次临床治 疗无效，在这29例患者中除1例无效外其余均有一定疗效，说明人毛乳头细 胞条件培养液在治疗复发性斑秃上明显优于患者以前治疗所使用过的方法。 在人毛乳头细胞条件培养液治疗的50例斑秃患者中，我们选择26例多发性 斑秃患者，在同一患者头部不同的斑秃患部分别应用人毛乳头细胞条件培养 液和去炎松，发现人毛乳头细胞条件培养液在治疗斑秃时，其促进头发生长 的速度明显快于去炎松治疗组，而且新生毛发在光泽度上也明显优于去炎松 治疗组。人毛乳头细胞条件培养液治疗斑秃患者时新生毛发的生长先是呈岛 状生长的，而去炎松则是呈现平原状生长，说明毛发的生长是有一定的相互 促进作用，也可能与一定的毛乳头生长活性蛋白浓度依赖有关。我们用利多 卡因生理盐水溶液作空白对照，发现有3例新发斑秃患者有一定疗效，而复 发性斑秃无一有效，说明对于新发的斑秃，用一定的刺激是有一定的疗效的， 而复发性斑秃用普通刺激则效果较差，这也与过去临床上用生姜、辣椒膏、 石碳酸等外用治疗斑秃结果相一致。
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