用RNAi有效防治昆虫及蜘蛛类有害生物的方法
阅读：78发布：2023-01-28
专利汇可以提供用RNAi有效防治昆虫及蜘蛛类有害生物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且用RNAi抑制昆虫及蜘蛛类 有害 生物 的HMG-CoA还原酶表达，进行有效防治的方法，用注射的方式将大于20bp针对 有害生物 HMG-CoA还原酶基因(HMGR基因)双链RNA序列导入有害生物体内，抑制其HMG-CoA还原酶的表达，从而抑制保幼 激素 合成，导致其死亡或绝育，达到防治有害生物的目的。注射时，提取昆虫或蜘蛛类物种总RNA，反转录全部mRNA为cDNA，根据已知HMGR基因设计特异性引物，PCR扩增特异 片段 ，获得HMG-CoA还原酶基因片段，连接到T载体上，转化扩增培养，PCR扩增获得两端带有启动子的HMG-CoA还原酶基因片段，体外合成HMG-CoA还原酶基因特异dsRNA片段，配制注射液从雌性成虫虫体第3和第4腹节节间膜处注射入虫体。采用本 发明 ，抑制有害生物保幼激素合成，既可以使有害生物致死，也可以使其绝育。，下面是用RNAi有效防治昆虫及蜘蛛类有害生物的方法专利的具体信息内容。
1.用RNAi有效防治昆虫及蜘蛛类有害生物的方法，其特征在于用注射的方式将大于
20bp的针对昆虫及蜘蛛类有害生物的HMG-CoA还原酶基因的双链RNA序列导入有害生物体内，抑制昆虫及蜘蛛类有害生物的HMG-CoA还原酶的表达，抑制保幼激素合成，导致有害生物死亡或者绝育，从而防治有害生物，
注射的具体作法是：
(1)提取总RNA，反转录全部mRNA为cDNA，根据已知的昆虫及蜘蛛类有害生物的HMGR基因设计特异性引物，PCR扩增特异片段，获得HMGR基因片段，从琼脂糖凝胶中回收HMGR基因片段，
将HMGR基因片段连接到T载体上，并且转化到大肠杆菌中扩增培养，提取扩增培养后大肠杆菌中的带有害虫的HMG-CoA还原酶基因片段T载体质粒；
(2)设计带有启动子的特异引物对，用来为目的片段加上启动子序列，PCR扩增获得两端带有启动子的害虫的HMG-CoA还原酶基因片段，并回收纯化；
(3)体外合成HMG-CoA还原酶基因特异dsRNA片段为dsRNAH，EGFP基因特异dsRNA片段为dsRNAE，纯化，最后获得针对害虫HMG-CoA还原酶基因的双链RNA片段和针对EGFP基因的双链RNA片段：
(4)dsRNA的注射：
用RNase-free H2O配制注射缓冲液，注射缓冲液中KCl终浓度5mmol/L，Na2HPO4终浓度1mmol/L，用注射缓冲液配制出HMG-CoA reductase基因特异dsRNA注射液，从雌性成虫虫体第3和第4腹节节间膜处注射入虫体dsRNAH注射液；
(5)注射后，按1∶1的雌雄比例配对饲养；
所述大于20bp的针对昆虫及蜘蛛类的HMG-CoA还原酶基因的双链RNA序列为登陆号：
GenBank：X70034.1、登陆号：GenBank：GU584103.1序列及其互补序列。
2.根据权利要求1所述的用RNAi有效防治昆虫及蜘蛛类有害生物的方法，其特征在于提取有害生物的总RNA的有害生物德国小蠊、棉铃虫的饲养条件为28±1℃，相对湿度为
50％-70％，光周期为L14:D10。
用RNAi有效防治昆虫及蜘蛛类有害生物的方法
技术领域
[0002] 技术领域
[0003] 现代生物技术的飞速发展为害虫防治提供了新的思路。本发明采用RNA干扰技术进行有害生物的防治。
[0004] RNA干涉(RNA interference，RNAi)是指双链RNA(dsRNA)在细胞内特异性诱导与其同源互补的mRNA的降解，从而使响应的基因表达关闭，引发基因转录后水平沉默的现象。目前依靠RNAi技术下调生物体内的基因表达已经成为非常完善的技术。而RNAi防治昆虫和蜘蛛类有害生物也已经在技术上相当成熟了，具体可参见国际申请WO2006/129204及WO2007/080127。
[0005] 寻找调控昆虫生长发育和生殖代表性通路中的关键基因是利用RNAi技术防治害虫的前提。
[0006] HMG-CoA还原酶基因在昆虫和蜘蛛体内普遍存在，HMG-CoA在HMG-CoA还原酶(HMGR)作用下还原为甲羟戊酸(MVA)，该反应是MVA途径上的限速反应(Basson et al.，1988)，鉴于MVA途径是萜类化合物生物合成中IPP的主要来源，并最终合成保幼激素，因此HMGR是昆虫保幼激素生物合成过程中一个重要的限速酶，而保幼激素调控昆虫的生长发育和生殖。
[0007] 德国小蠊(Blattella germanica Linnaeus)是蜚蠊目中分布最广泛且难治理、与人类生活关系密切的一种重要的世界性卫生害虫。它们能从身体不同部位排出怪味分泌物，使食物变味、变质；咬食和破坏食品、药材、纸张、纤维制品、服装和文物藏品等；能够携带多种致病菌，如痢疾杆菌、绿脓杆菌、沙门杆菌、伤寒杆菌和寄生虫卵等，是人类多种疾病的传播媒介；其排泄物和脱落表皮带有过敏原，使过敏体质的人出现皮疹、哮喘、打喷嚏等症状。其具有繁殖迅速、隐蔽性好、适应能力强等特点。
[0008] 棉铃虫(Helicoverpa armigera)是鳞翅目夜蛾科害虫，具有植食性、运动性强、繁殖率高、抗逆性强、危害重等特性。在我国，棉铃虫危害棉花、玉米、蔬菜等多种农作物。从其南北棉区消长规律看，由于南北方自然生态环境条件的差异，一般在北方的黄河流域棉区为常发性害虫，在南方棉区为偶发性害虫。
[0009] 目前，这些害虫的防治大部分仍以化学防治为主，常用的化学杀虫剂主要有：有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类等。长期大量和不当使用常规性残留杀虫剂，不仅对环境造成了严重污染，对人类健康和其他动物产生巨大危害，还使得这些有害生物的抗药性问题日益严重。现有文献资料表明，德国小蠊已对有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等类杀虫剂均产生了抗性，部分甚至达到高抗水平(冯向阳，2004；郑越平等，2005；刘丹红等，2001)。而棉铃虫的防治中，棉铃虫不仅对各种化学杀虫剂产生了抗性，而且由于大量种植转Bt抗虫棉，部分棉区棉铃虫已对Bt毒蛋白产生了抗性。针对这些害虫寻找有效的防治措施迫在眉睫。
[0010] 目前国内外有关RNAi防治害虫的专利有很多，用RNAi方法防治害虫在技术上已经相当成熟，而且国内外学者及生物公司也已经找到了很多适合防治害虫的RNAi靶标。比较有代表性的是《作为昆虫防治剂的dsRNA》(中国专利申请号200780002294.X)，通过RNAi介导的基因沉默来防治害虫侵害，通过将完好的昆虫细胞与该昆虫细胞外部的双链RNA接触以及通过所述双链RNA被所述完好的昆虫细胞摄取来实现。《用于防治昆虫和蜘蛛类动物的RNAi》(中国专利申请号200680024099.2)，它鉴定了新的靶标，新靶标的核苷酸系列和氨基酸系列，用于在昆虫中介导RNAi的双链RNA区的RNA构建体、DNA构建体、表达载体、宿组细胞和组合物，用RNAi防治昆虫/蜘蛛类动物。
[0011] 但是用HMG-CoA还原酶基因作为防治害虫的RNAi靶标，不论是昆虫生理学理论上还是应用上都没有进行过探索。
发明内容
[0012] 本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种以害虫、蜘蛛等有害生物的HMG-CoA还原酶基因作为RNAi靶标，使害虫死亡或绝育，达到害虫防治的目的，且防治效果好、持久的用RNAi有效防治昆虫及蜘蛛类有害生物的的方法。
[0013] 本发明目的的实现方式为，用RNAi有效防治昆虫及蜘蛛类有害生物的方法，用注射的方式将大于20bp的针对昆虫及蜘蛛类有害生物的HMG-CoA还原酶基因的双链RNA序列导入有害生物体内，抑制昆虫及蜘蛛类有害生物的HMG-CoA还原酶的表达，抑制保幼激素合成，导致有害生物死亡或者绝育，从而防治有害生物，
[0014] 注射的具体作法是：
[0015] (1)提取总RNA，反转录全部mRNA为cDNA，根据已知的昆虫及蜘蛛类有害生物的HMGR基因设计特异性引物，PCR扩增特异片段，获得HMGR基因片段，从琼脂糖凝胶中回收HMGR基因片段，
[0016] 将HMGR基因片段连接到T载体上，并且转化到大肠杆菌中扩增培养，提取扩增培养后大肠杆菌中的带有害虫的HMG-CoA还原酶基因片段T载体质粒；
[0017] (2)设计带有启动子的特异引物对，用来为目的片段加上启动子序列，PCR扩增获得两端带有启动子的害虫的HMG-CoA还原酶基因片段，并回收纯化；
[0018] (3)体外合成HMG-CoA还原酶基因特异dsRNA片段为dsRNAH，EGFP基因特异dsRNA片段为dsRNAE，纯化，最后获得针对害虫HMG-CoA还原酶基因的双链RNA片段和针对EGFP基因的双链RNA片段：
[0019] (4)dsRNA的注射：
[0020] 用RNase-free H2O配制注射缓冲液，注射缓冲液中KCl终浓度5mmol/L，Na2HPO4终浓度1mmol/L，用注射缓冲液配制出HMG-CoA reductase基因特异dsRNA注射液，从雌性成虫虫体第3和第4腹节节间膜处注射入虫体dsRNAH注射液；
[0021] (5)注射后，按1∶1的雌雄比例配对饲养；
[0022] 所述大于20bp的针对昆虫及蜘蛛类的HMG-CoA还原酶基因的双链RNA序列为登陆号：GenBank：X70034.1、登陆号：GenBank：GU584103.1序列及其互补序列。
[0023] 本发明通过RNAi的方法，干扰HMG-CoA还原酶的表达，在很低的dsRNA作用下，即可使有害生物失去生殖能力。证明HMG-CoA还原酶基因作为RNAi靶标防治有害生物高效而持久，非常具有开发潜力。
[0024] 本发明的优点：
[0025] (1)因采用RNAi这种针对序列的技术，故防治特异性很强；
[0026] (2)通过RNAi防治害虫，在较低双链RNA浓度处理时，依然可以取得很好的防治效果；
[0027] (3)双链RNA在体内可以持久存在，故对昆虫及蜘蛛类有害生物的防治效果持久；
[0029] 图1是dsRNA处理后3d的德国小蠊雌虫卵母细胞长度
[0030] 图2是dsRNA处理后3d的德国小蠊雌虫生殖附腺小管宽度
具体实施方式
[0031] 本发明用注射的方式将大于20bp的针对有害生物(具体为昆虫或蜘蛛类物种)的HMG-CoA还原酶基因的双链RNA序列导入害虫的体内，抑制害虫的HMG-CoA还原酶的表达，抑制保幼激素合成，导致有害生物死亡或者绝育，从而防治害虫。
[0032] 注射的具体作法是，提取昆虫或蜘蛛类物种的总RNA，反转录全部mRNA为cDNA，根据已知的HMGR基因设计特异性引物，PCR扩增特异片段，获得HMG-CoA还原酶基因片段，连接到T载体上，转化到大肠杆菌中扩增培养，PCR扩增获得两端带有启动子的害虫的HMG-CoA还原酶基因片段，体外合成HMG-CoA还原酶基因特异dsRNA片段，配制注射液从雌性成虫虫体第3和第4腹节节间膜处注射入虫体。
[0033] 下面仅用德国小蠊、棉铃虫的具体实施例详述本发明。
[0034] 实施例1、防治德国小蠊。
[0035] (1)虫源及饲养方法，
[0036] 本发明所用的昆虫选择德国小蠊，它由湖北省疾病预防与控制中心长期饲养的室内种群，现由华中农业大学昆虫资源利用与害虫可持续治理湖北省重点实验室饲养繁殖。
[0038] (2)试验方法
[0039] ①德国小蠊成虫HMGR基因特异片段的克隆
[0040] 总RNA提取，用TaKaRa公司的Trizol试剂提取德国小蠊总RNA。
[0041] 反转录，用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录德国小蠊的mRNA为cDNA。
[0042] 引物设计，根据已经报道的德国小蠊HMGR基因(登陆号：GenBank：X70034.1)，EGFP基因，设计特异性引物，扩增ORF靠3’-UTR中一段。引物序列信息见表1：
[0043] 表1
[0044]
[0045] PCR扩增特异片段，TAKARAEx Taq试剂，PCR扩增获得德国小蠊HMG-CoA还原酶基因片段。
[0046] HMG-CoA还原酶基因特异片段HMGR1
[0047] 片段的回收与纯化，用TakaRa的Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0从琼脂糖凝胶中回收德国小蠊HMG-CoA还原酶基因片段。
[0048] 片段与载体的连接，将德国小蠊HMG-CoA还原酶基因片段连接到TaKaRapMD18-T载体上，并且转化到Transgene公司的DH5α大肠杆菌中扩增培养。
[0049] 质粒提取，用Axygen的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit提取扩增培养后大肠杆菌中的带有德国小蠊HMG-CoA还原酶基因片段TaKaRa pMD18-T质粒。
[0050] PCR和测序鉴定确认获得的质粒带有德国小蠊HMG-CoA还原酶基因片段。
[0051] ②制备带有T7启动子的DNA模板
[0052] 引物合成，根据已经测序的HMG-CoA还原酶基因片段序列和实验室保存的EGFP基因序列，设计了带有T7启动子的特异引物对，用来为目的片段加上T7启动子序列。引物序列信息见表2：
[0053] HMG-CoA还原酶基因特异片段为T7TemH，增强绿色荧光蛋白EGFP基因特异片段为T7TemE。
[0054] 表2
[0055]
[0056] PCR扩增DNA模板序列，TAKARA Ex Taq试剂，PCR扩增获得两端带有T7启动子的德国小蠊HMG-CoA还原酶基因片段及两端带有T7启动子的EGFP基因片段。并回收纯化两种片段。
[0057] ③dsRNA合成与纯化
[0058] 合成HMG-CoA还原酶基因特异dsRNA片段为dsRNAH，EGFP基因特异dsRNA片段为dsRNAE。
[0059] dsRNA合成采用Ambion公司的MEGAScript High Yield Transcription Kit。
[0060] dsRNA的纯化采用Ambion公司的MEGAclear Purification Kit。
[0061] 最后获得针对德国小蠊HMG-CoA还原酶基因的双链RNA片段和针对EGFP基因的双链RNA片段。
[0062] ④dsRNA的注射
[0063] A.分组方法，取羽化1d的德国小蠊雌性成虫分为11组，分别为：20μg dsRNAH处理组，2μg dsRNAH处理组，0.2μg dsRNAH，0.02μg dsRNAH，0.002μg dsRNAH，20μg dsRNAE对照组，2μg dsRNAE对照组，0.2μg dsRNAE对照组，0.02μg dsRNAE对照组，0.002μg dsRNAE对照组，缓冲液对照组；每组1头若虫。
[0064] 羽化1d的德国小蠊雌性成虫根据上述方法，设置多个生物学重复。
[0065] B.配制注射液，用RNase-free H2O配制注射缓冲液，注射缓冲液中KCl终浓度5mmol/L，Na2HPO4终浓度1mmol/L。
[0066] 用注射缓冲液配制出4000ng/μL dsRNAH，400ng/μL dsRNAH，40ng/μLdsRNAH，4ng/μL dsRNAH，0.4ng/μL dsRNAH注射液。
[0067] 用 注 射 缓 冲 液 配 配 制 出 4000ng/μL dsRNAE，400ng/μL dsRNAE，40ng/μLdsRNAE，4ng/μL dsRNAE，0.4ng/μL dsRNAE注射液。
[0068] C.每组供试德国小蠊注射方法如下：
[0069] 取1头雌性成虫，-20℃冷冻麻醉2min，同时降低体压。再用酒精棉球消毒虫体。
[0070] 用微量进样器将5μL 40ng/μL dsRNA注射液或缓冲液从虫体第3和第4腹节节间膜出注射入虫体。
[0071] 注射后，按1∶1的雌雄比例配对饲养。
[0072] ⑤RNA干扰后德国小蠊成虫HMGR基因后生理学指标检测
[0073] 检测指标：卵母细胞长度，生殖附腺小管的直径。
[0074] 检测方法，取处理后3d的雌性成虫，置于-20℃冷冻麻醉2min。用75％乙醇消毒并清洁虫体。
[0075] 解剖雌性成虫卵巢及生殖附腺，用75％乙醇洗净。
[0076] 将卵巢和生殖附腺置于Nikon Digital Sight体视镜下，放大40倍。
[0078] ⑥RNA干扰后德国小蠊成虫HMGR基因后表型的观察
[0079] 观察第一个卵荚的产生时间。
[0080] 检测方法，从处理开始，每天观察雌性成虫是否产生第一个卵荚。
[0081] ⑦结果分析采用SPSS 16.0Release 16.0.0(Sep 13，2007)。分析方法采用One-WayANOVA，差异性分析采用LSD法和Tukey法。
[0082] (3)试验结果
[0083] ①RNA干扰后德国小蠊成虫HMGR基因后生理学指标检测
[0084] a卵母细胞长度结果见图1，从图1可见：
[0085] 2μgdsRNAE处理组和空白对照组卵母细胞长度最长，0.02μgdsRNAH处理组卵母细胞长度次之，0.2μgdsRNAH处理组和2μgdsRNAH处理组卵母细胞长度最短。
[0086] 2μgdsRNAE处理组和空白对照组卵母细胞长度，在P＜0.05水平上无显著性差异。0.2μgdsRNAH处理组和2μgdsRNAH处理组，在P＜0.05水平上无显著性差异。
[0087] 0.2μgdsRNAH处理组和2μgdsRNAH处理组与2μgdsRNAE处理组和空白对照组，在P＜0.05水平上差异显著。
[0088] 0.02μgdsRNAH处理组在P＜0.05水平上与2μgdsRNAE处理组和空白对照组，差异显著。0.02μgdsRNAH处理组在P＜0.05水平上与0.2μgdsRNAH处理组和2μgdsRNAH，差异显著。
[0089] b副腺管宽度结果见图2，从图2可见：
[0090] 2μgdsRNAE处理组、0.02μgdsRNAH处理组和空白对照组卵母细胞长度最长，00.2μgdsRNAH处理组和2μgdsRNAH处理组卵母细胞长度较短，在P＜0.05水平上差异显著。
[0091] 2μgdsRNAE处理组、0.02μgdsRNAH处理组在P＜0.05水平上无显著性差异。0.2μgdsRNAH处理组和2μgdsRNAH处理组，在P＜0.05水平上无显著性差异。
[0092] 0.2μgdsRNAH处理组和2μgdsRNAH处理组与2μgdsRNAE处理组和空白对照组，在P＜0.05水平上差异显著。
[0093] 0.02μgdsRNAH处理组在P＜0.05水平上与2μgdsRNAE处理组和空白对照组，差异显著。0.02μgdsRNAH处理组在P＜0.05水平上与0.2μgdsRNAH处理组和2μgdsRNAH，差异显著。
[0094] (2)RNA干扰后德国小蠊成虫HMGR基因后表型的观察
[0095] dsRNAE处理各组和空白对照组100％产生第一个卵荚，0.002μgdsRNAH处理组100％产生第一个卵荚，0.02μgdsRNAH处理组40％产生第一个卵荚，其他dsRNAH处理组不产生第一个卵荚，dsRNA处理后雌性德国小蠊成虫第一个卵荚形成时间和数量结果见表3。
[0096] (3)结论与讨论
[0097] 0.2μgdsRNAH就可以对德国小蠊卵巢、生殖附腺的发育以及第一个卵荚的形成造成明显的影响，大于0.2μgdsRNAH后影响程度进入基本恒定的水平。
[0098] 0.02μgdsRNAH处理是一个中间值，剂量从0.2μg下降到0.02μg，首先被沉默表型百分比迅速下降。处理后3d的德国小蠊卵母细胞长度长于0.2μgdsRNAH处理组，且差异显著。处理后3d的德国小蠊生殖附腺小管宽度与对照组无差异。
[0099] 0.002μgdsRNAH剂量太低，已经无法沉默HMGR基因的表达。
[0100] 实验结果表明，通过RNAi的方法，干扰HMG-CoA还原酶的表达，在很低的dsRNA作用下，即可使雌性德国小蠊失去生殖能力。证明HMG-CoA还原酶基因作为RNAi靶标防治害虫高效而持久，非常具有开发潜力。
[0101]
[0102] 实施例2、防治棉铃虫。
[0103] (1)虫源及饲养方法，
[0104] 本发明所用的棉铃虫由湖北省农科院长期饲养的室内种群。后由华中农业大学资源昆虫与有害生物综合治理重点实验室饲养繁殖。
[0105] 饲料为人工饲料，由本实验室配置。水源为自来水。饲养条件为28±1℃，相对湿度为50％-70％，光周期为L14:D10。
[0106] (2)试验方法
[0107] ①棉铃虫HMGR基因特异片段的克隆
[0108] 总RNA提取，用TaKaRa公司的Trizol试剂提取棉铃虫总RNA。
[0109] 反转录，用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录棉铃虫的全部mRNA为cDNA。
[0110] 引物设计，根据本实验室克隆的棉铃虫HMGR基因(GenBank登陆号：GU584103)，EGFP基因，设计特异性引物，扩增HMGR基因靠3’-UTR中一段。引物序列信息见表4：
[0111] 表4
[0112]
[0113] PCR扩增特异片段，用TAKARA Ex Taq试剂，PCR法扩增获得棉铃虫HMG-CoA还原酶基因片段。
[0114] HMG-CoA reductase基因特异片段HMGR1
[0115] 片段的回收与纯化，用TakaRa的Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0从琼脂糖凝胶中回收棉铃虫HMG-CoA还原酶基因片段。
[0116] 片段与载体的连接，将棉铃虫HMG-CoA还原酶基因片段连接到TaKaRapMD18-T载体上，并且转化到Transgene公司的DH5α大肠杆菌中扩增培养。
[0117] 质粒提取用Axygen的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit提取扩增培养后大肠杆菌中的带有棉铃虫HMG-CoA还原酶基因片段TaKaRa pMD18-T质粒。
[0118] PCR和测序鉴定确认获得的质粒带有棉铃虫HMG-CoA还原酶基因片段。
[0119] ②制备带有T7启动子的DNA模板
[0120] 引物合成，根据已经测序的HMG-CoA reductase片段序列和实验室保存的EGFP基因序列，设计了带有T7启动子的特异引物对，用来为目的片段加上T7启动子序列。引物序列信息见表5：
[0121] HMG-CoAreductase基因特异片段为T7TemH，EGFP基因特异片段为T7TemE。
[0122] 表5
[0123]
[0124] PCR扩增DNA模板序列，用TAKARA Ex Taq试剂，PCR扩增获得两端带有T7启动子的棉铃虫HMG-CoA还原酶基因片段及两端带有T7启动子的EGFP基因片段。并回收纯化两种片段。
[0125] ③dsRNA合成与纯化
[0126] 合成HMG-CoA reductase基因特异dsRNA片段为dsRNAH，EGFP基因特异dsRNA片段为dsRNAE。
[0127] dsRNA合成采用Ambion公司的MEGAScript High Yield Transcription Kit。
[0128] dsRNA的纯化采用Ambion公司的MEGAclear Purification Kit。
[0129] 最后获得针对棉铃虫MG-CoA还原酶基因的双链RNA片段和针对EGFP基因的双链RNA片段。
[0130] ④dsRNA的注射
[0131] a分组方法，取羽化1d的棉铃虫雌性成虫分为11组，分别为：20μg dsRNAH处理组，2μg dsRNAH处理组，0.2μg dsRNAH，0.02μg dsRNAH，0.002μg dsRNAH，20μg dsRNAE对照组，2μg dsRNAE对照组，0.2μg dsRNAE对照组，0.02μg dsRNAE对照组，0.002μg dsRNAE对照组，缓冲液对照组；每组1头若虫。
[0132] 羽化1d的棉铃虫雌性成虫根据上述方法，设置多个生物学重复。
[0133] b配制注射液，用RNase-free H2O配制注射缓冲液，注射缓冲液中KCl终浓度5mmol/L，Na2HPO4终浓度1mmol/L。
[0134] 用注射缓冲液配制出4000ng/μL dsRNAH，400ng/μL dsRNAH，40ng/μLdsRNAH，4ng/μL dsRNAH，0.4ng/μL dsRNAH注射液。
[0135] 用 注 射 缓 冲 液 配 配 制 出 4000ng/μL dsRNAE，400ng/μL dsRNAE，40ng/μLdsRNAE，4ng/μL dsRNAE，0.4ng/μL dsRNAE注射液。
[0136] c注射方法如下：
[0137] 取1头雌性成虫，-20℃冷冻麻醉2min，同时降低体压。再用酒精棉球消毒虫体。
[0138] 用微量进样器将10μL 20ng/μL dsRNA注液或缓冲液从虫体第3和第4腹节节间膜出注射入虫体。
[0139] 注射后，按1∶1的雌雄比例配对饲养。
[0140] ⑤RNA干扰后棉铃虫成虫HMGR基因后表型的观察
[0141] 观察指标：雌虫产卵量。
[0142] 检测方法，每天统计雌性成虫产卵量。
[0143] ⑥结果与分析
[0144] 结果分析采用SPSS 16.0Release 16.0.0(Sep 13，2007)。分析方法采用One-WayANOVA，差异性分析采用LSD法和Turkey法。
[0145] dsRNA处理后雌性棉铃虫成虫平均产卵数量结果见表6。
[0146] 由表6可见，0.002μgdsRNAH就可以对棉铃虫雌性成虫的产卵造成明显的影响。
[0147] 2μgdsRNAH可使棉铃虫雌性成虫的产卵量降低98％以上。
[0148] 实验结果表明，通过RNAi的方法，干扰HMG-CoA还原酶的表达，在很低的dsRNA作用下，即可使棉铃虫雌性成虫产卵量大幅下降。证明HMG-CoA还原酶基因作为RNAi靶标防治昆虫及蜘蛛类有害生物高效而持久，非常具有开发潜力。
[0149]
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