技术领域
[0001] 本
发明属于
生物医学领域，具体涉及一种评价或辅助评价卵巢细胞的方法及其使用的标志物。
背景技术
[0002] 卵巢作为女性最重要的器官之一，主要功能是卵母细胞的成熟排放，这依赖于卵泡中卵母细胞与周围的颗粒细胞、膜细胞的
信号互作。卵母细胞或周围
体细胞(包括颗粒细胞)出现异常均会影响卵巢的正常功能。卵巢是在
机体衰老过程中相对较早出现退行性变化的器官，卵巢衰老及其伴随的女性生殖
水平的降低严重影响国家的人口出生率。尽管随着医疗水平的改善及发展，人类的寿命在逐渐延长，但人类女性生殖能
力的增龄性下降，及卵巢组织的衰老
进程却没有明显的改善。卵巢衰老指年龄依赖的卵泡数量及
质量的降低，导致女性生育能力的逐年降低。一般在35岁左右，女性的生育能力出现拐点式的下降，而绝经的到来则标志着卵巢衰老进入最后的阶段。一般在50岁左右，女性普遍进入绝经期，即卵巢出现不可逆的功能退行——卵巢出现卵泡的生理性耗竭。除了生理性卵巢衰老，部分中年女性(40岁及以下人群)由于遗传等原因易罹患卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)。此外还有部分女性易患多囊卵巢综合症、卵巢
肿瘤等衰老相关
疾病。因此，深入解析卵巢衰老过程的细胞分子机制，可以为延缓卵巢衰老和女性生殖力的下降提供重要的可干预的靶向细胞以及关键调控分子，进而为延缓卵巢衰老及相关疾病的干预策略提供重要的理论依据。寻找卵巢细胞标志物及卵巢细胞衰老标志物，将为卵巢发育、卵巢衰老相关疾病的研究和干预，特别是在人类
辅助生殖技术中评估卵巢功能提供重要的分子
指征。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供卵巢细胞标志物和卵巢细胞衰老标志物，进而研究卵巢发育和卵巢衰老相关的疾病。
[0004] 本发明首先保护用于检测LMOD3、RBM46、NETO1、REXO5、GPX1和GSR中至少一种的物质的应用，可为a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)：
[0005] a1)鉴定或辅助鉴定卵母细胞；
[0006] a2)筛选或辅助筛选卵母细胞；
[0007] a3)评估或辅助评估卵母细胞；
[0008] a4)鉴定或辅助鉴定早期卵母细胞；
[0009] a5)筛选或辅助筛选早期卵母细胞；
[0010] a6)区分衰老卵母细胞和年轻卵母细胞。
[0011] 本发明还保护用于检测LMOD3、RBM46、NETO1、REXO5、GPX1和GSR中至少一种的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)：
[0012] a1)鉴定或辅助鉴定卵母细胞；
[0013] a2)筛选或辅助筛选卵母细胞；
[0014] a3)评估或辅助评估卵母细胞；
[0015] a4)鉴定或辅助鉴定早期卵母细胞；
[0016] a5)筛选或辅助筛选早期卵母细胞；
[0017] a6)区分衰老卵母细胞和年轻卵母细胞。
[0018] 上述应用中，所述产品的检测样本可为从
哺乳动物分离的卵巢组织样本、其
石蜡切片或其
冰冻切片。
[0019] 上述应用中，所述产品的检测样本可为卵巢细胞。卵巢细胞是指从卵巢组织中分离获得的细胞。
[0020] 本发明还保护LMOD3、RBM46、NETO1、REXO5、GPX1和GSR中至少一个作为标志物的应用，可为a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)：
[0021] a1)鉴定或辅助鉴定卵母细胞；
[0022] a2)筛选或辅助筛选卵母细胞；
[0023] a3)评估或辅助评估卵母细胞；
[0024] a4)鉴定或辅助鉴定早期卵母细胞；
[0025] a5)筛选或辅助筛选早期卵母细胞；
[0026] a6)区分衰老卵母细胞和年轻卵母细胞。
[0027] 本发明还保护用于检测LMOD3、RBM46和NETO1中至少一种的物质的应用，可为a1)或a2)：
[0028] a1)鉴定或辅助鉴定卵母细胞；
[0029] a2)筛选或辅助筛选卵母细胞。
[0030] 本发明还保护用于检测LMOD3、RBM46和NETO1中至少一种的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为a1)或a2)：
[0031] a1)鉴定或辅助鉴定卵母细胞；
[0032] a2)筛选或辅助筛选卵母细胞。
[0033] 上述应用中，所述产品的检测样本可为从哺乳动物分离的卵巢组织样本、其石蜡切片或其冰冻切片。
[0034] 上述应用中，所述产品的检测样本可为卵巢细胞。卵巢细胞是指从卵巢组织中分离获得的细胞。
[0035] 上述应用中，所述“用于检测LMOD3、RBM46和NETO1中至少一种的物质”可为“能与LMOD3蛋白、RBM46蛋白和NETO1蛋白中的至少一种特异结合的物质”和/或“能与LMOD3基因转录本、RBM46基因转录本和NETO1基因转录本中的至少一种特异结合的物质”。
[0036] 本发明还保护LMOD3、RBM46和NETO1中至少一个作为标志物的应用，可为a1)或a2)：
[0037] a1)鉴定或辅助鉴定卵母细胞；
[0038] a2)筛选或辅助筛选卵母细胞。
[0039] 本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测细胞是否为卵母细胞的方法，可为(S1)或(S2)。
[0040] (S1)检测待测细胞是否表达目标蛋白，目标蛋白为LMOD3蛋白、RBM46蛋白和NETO1蛋白中的至少一种，然后进行如下判断：如果表达目标蛋白，则待测细胞为或疑似为卵母细胞；如果不表达目标蛋白，则待测细胞为或疑似为非卵母细胞。
[0041] (S2)检测待测细胞是否包含目标基因的转录本，目标基因为LMOD3基因、RBM46基因和NETO1基因中的至少一种，然后进行如下判断：如果包含目标基因的转录本，则待测细胞为或疑似为卵母细胞；如果不包含目标基因的转录本，则待测细胞为或疑似为非卵母细胞。
[0042] 本发明还保护检测REXO5表达量的系统的应用，可为b1)或b2)：
[0043] b1)鉴定或辅助鉴定早期卵母细胞；
[0044] b2)筛选或辅助筛选早期卵母细胞。
[0045] 本发明还保护检测REXO5表达量的系统在制备产品中的应用；所述产品的功能为b1)或b2)：
[0046] b1)鉴定或辅助鉴定早期卵母细胞；
[0047] b2)筛选或辅助筛选早期卵母细胞。
[0048] 上述应用中，所述产品的检测样本可为卵巢细胞或卵母细胞。
[0049] 上述应用中，所述产品的检测样本可为从哺乳动物分离的卵巢组织样本、其石蜡切片或其冰冻切片。
[0050] 上述任一所述的应用中，检测REXO5表达量的系统包括检测REXO5表达量的
试剂。所述检测REXO5表达量的试剂包括“能与REXO5蛋白特异结合的物质”和/或“能与REXO5基因转录本特异结合的物质”。所述检测REXO5表达量的系统具体可由检测REXO5表达量的试剂组成。所述检测REXO5表达量的试剂具体可由“能与REXO5蛋白特异结合的物质”和/或“能与REXO5基因转录本特异结合的物质”组成。
[0051] 所述检测REXO5表达量的系统可为定量PCR检测REXO5基因表达量的系统。
[0052] 本发明还保护REXO5作为标志物的应用，可为b1)或b2)：
[0053] b1)鉴定或辅助鉴定早期卵母细胞；
[0054] b2)筛选或辅助筛选早期卵母细胞。
[0055] 本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测卵母细胞为早期卵母细胞还是中晚期卵母细胞的方法，为(T1)或(T2)。
[0056] (T1)比较待测卵母细胞和早期卵母细胞中REXO5蛋白的表达量，然后进行如下判断：如果待测卵母细胞中REXO5蛋白的表达量低于早期卵母细胞，则待测卵母细胞为或疑似为中晚期卵母细胞；否则为或疑似为早期卵母细胞。
[0057] (T2)比较待测卵母细胞和早期卵母细胞中REXO5基因的表达量，然后进行如下判断：如果待测卵母细胞中REXO5基因的表达量低于早期卵母细胞，则待测卵母细胞为或疑似为中晚期卵母细胞；否则为或疑似为早期卵母细胞。
[0058] 上述任一所述早期卵母细胞可为位于原始卵泡中被
单层扁平颗粒细胞包围的致密卵母细胞或位于初级卵泡中被单层立方形颗粒细胞包围的更大的卵母细胞。
[0059] 上述任一所述中晚期卵母细胞可为被至少部分或完整的第二层立方形颗粒细胞包围的更大的卵母细胞或在有卵泡液或囊状结构的囊状卵泡中的更大的卵母细胞。
[0060] 本发明还保护检测GPX1表达量的系统和/或检测GSR表达量的系统在区分衰老卵母细胞和年轻卵母细胞中的应用。
[0061] 本发明还保护检测GPX1表达量的系统和/或检测GSR表达量的系统在制备用于区分衰老卵母细胞和年轻卵母细胞的产品中的应用。
[0062] 上述应用中，所述产品的检测样本可为卵巢细胞或卵母细胞。
[0063] 上述应用中，所述产品的检测样本可为从哺乳动物分离的卵巢组织样本、其石蜡切片或其冰冻切片。
[0064] 上述任一所述的应用中，检测GPX1表达量的系统可包括检测GPX1表达量的试剂。所述检测GPX1表达量的试剂可包括“能与GPX1蛋白特异结合的物质”和/或“能与GPX1基因转录本特异结合的物质”。所述检测GPX1表达量的系统具体可由检测GPX1表达量的试剂组成。所述检测GPX1表达量的试剂具体可由“能与GPX1蛋白特异结合的物质”和/或“能与GPX1基因转录本特异结合的物质”组成。
[0065] 上述任一所述的应用中，检测GSR表达量的系统可包括检测GSR表达量的试剂。所述检测GSR表达量的试剂可包括“能与GSR蛋白特异结合的物质”和/或“能与GSR基因转录本特异结合的物质”。所述检测GSR表达量的系统具体可由检测GSR表达量的试剂组成。所述检测GSR表达量的试剂具体可由“能与GSR蛋白特异结合的物质”和/或“能与GSR基因转录本特异结合的物质”组成。
[0066] 上述任一所述的应用中，所述检测GPX1表达量的系统可为定量PCR检测GPX1基因表达量的系统。所述检测GSR表达量的系统可为定量PCR检测GSR基因表达量的系统。
[0067] 本发明还保护GPX1和/或GSR作为标志物在区分衰老卵母细胞和年轻卵母细胞中的应用。
[0068] 本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测卵母细胞为衰老卵母细胞还是年轻卵母细胞的方法，为(R1)或(R2)。
[0069] (R1)比较待测卵母细胞和年轻卵母细胞中目标蛋白的表达量，目标蛋白为GPX1蛋白和/或GSR蛋白；然后进行如下判断：如果待测卵母细胞中目标蛋白的表达量低于年轻卵母细胞，则待测卵母细胞为或疑似为衰老卵母细胞；否则为或疑似为年轻卵母细胞。
[0070] (R2)比较待测卵母细胞和年轻卵母细胞中目标基因的表达量，目标基因为GPX1基因和/或GSR基因；然后进行如下判断：如果待测卵母细胞中目标基因的表达量低于年轻卵母细胞，则待测卵母细胞为或疑似为衰老卵母细胞；否则为或疑似为年轻卵母细胞。
[0071] 上述任一所述衰老卵母细胞是指年老哺乳动物的卵母细胞。上述任一所述年轻卵母细胞是指年轻哺乳动物的卵母细胞。
[0072] 本发明还保护检测IDH1、PRDX4和NDUFB10中至少一个表达量的系统在区分衰老颗粒细胞和年轻颗粒细胞中的应用。
[0073] 本发明还保护检测IDH1、PRDX4和NDUFB10中至少一个表达量的系统在制备用于区分衰老颗粒细胞和年轻颗粒细胞的产品中的应用。
[0074] 上述应用中，所述产品的检测样本可为卵巢细胞或颗粒细胞。
[0075] 上述应用中，所述产品的检测样本可为从哺乳动物分离的卵巢组织样本、其石蜡切片或其冰冻切片。
[0076] 上述任一所述的应用中，检测IDH1表达量的系统可包括检测IDH1表达量的试剂。所述检测IDH1表达量的试剂可包括“能与IDH1蛋白特异结合的物质”和/或“能与IDH1基因转录本特异结合的物质”。所述检测IDH1表达量的系统具体可由检测IDH1表达量的试剂组成。所述检测IDH1表达量的试剂具体可由“能与IDH1蛋白特异结合的物质”和/或“能与IDH1基因转录本特异结合的物质”组成。
[0077] 上述任一所述的应用中，检测PRDX4表达量的系统可包括检测PRDX4表达量的试剂。所述检测PRDX4表达量的试剂可包括“能与PRDX4蛋白特异结合的物质”和/或“能与PRDX4基因转录本特异结合的物质”。所述检测PRDX4表达量的系统具体可由检测PRDX4表达量的试剂组成。所述检测PRDX4表达量的试剂具体可由“能与PRDX4蛋白特异结合的物质”和/或“能与PRDX4基因转录本特异结合的物质”组成。
[0078] 上述任一所述的应用中，检测NDUFB10表达量的系统可包括检测NDUFB10表达量的试剂。所述检测NDUFB10表达量的试剂可包括“能与NDUFB10蛋白特异结合的物质”和/或“能与NDUFB10基因转录本特异结合的物质”。所述检测NDUFB10表达量的系统具体可由检测NDUFB10表达量的试剂组成。所述检测NDUFB10表达量的试剂具体可由“能与NDUFB10蛋白特异结合的物质”和/或“能与NDUFB10基因转录本特异结合的物质”组成。
[0079] 上述任一所述的应用中，所述检测IDH1表达量的系统可为定量PCR检测IDH1基因表达量的系统。所述检测PRDX4表达量的系统可为定量PCR检测PRDX4基因表达量的系统。所述检测NDUFB10表达量的系统可为定量PCR检测NDUFB10基因表达量的系统。
[0080] 上述任一所述的应用中，所述检测IDH1表达量的系统包括表2第5行或第6行所示的引物。检测PRDX4表达量的系统包括表2第3行或第4行所示的引物。检测NDUFB10表达量的系统包括表2第7行或第8行所示的引物。
[0081] 本发明还保护IDH1、PRDX4和NDUFB10中的至少一个作为标志物在区分衰老颗粒细胞和年轻颗粒细胞中的应用。
[0082] 本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测颗粒细胞为衰老颗粒细胞还是年轻颗粒细胞的方法，为(U1)或(U2)。
[0083] (U1)比较待测颗粒细胞和年轻颗粒细胞中目标蛋白的表达量，目标蛋白为IDH1蛋白、PRDX4蛋白和NDUFB10蛋白中至少一种；然后进行如下判断：如果待测颗粒细胞中目标蛋白的表达量低于年轻颗粒细胞，则待测颗粒细胞为或疑似为衰老颗粒细胞；否则为或疑似为年轻颗粒细胞。
[0084] (U2)比较待测颗粒细胞和年轻颗粒细胞中目标基因的表达量，目标基因为IDH1基因、PRDX4基因和NDUFB10基因中至少一种；然后进行如下判断：如果待测颗粒细胞中目标基因的表达量低于年轻颗粒细胞，则待测颗粒细胞为或疑似为衰老颗粒细胞；否则为或疑似为年轻颗粒细胞。
[0085] 上述任一所述衰老颗粒细胞是指年老哺乳动物的颗粒细胞。上述任一所述年轻颗粒细胞是指年轻哺乳动物的颗粒细胞。
[0086] 上文中，所述低于为统计学上的低于。
[0087] 所述哺乳动物为食蟹猴或人。
[0088] 所述哺乳动物为食蟹猴时，年老指18-20岁，年轻指4-5岁。所述哺乳动物为人时，年老指绝经前女性，年轻指青春期女性。
[0089] 本发明的
发明人通过构建并分析食蟹猴卵母细胞测序文库和食蟹猴卵巢体细胞测序文库及免疫
荧光检测，发现LMOD3、RBM46和NETO1中至少一个可以作为标志物鉴定或辅助鉴定卵母细胞，REXO5可以作为标志物鉴定或辅助鉴定早期卵母细胞，GPX1和/或GSR可以作为标志物区分衰老卵母细胞和年轻卵母细胞，IDH1、PRDX4和NDUFB10中的至少一个可以作为标志物区分衰老颗粒细胞和年轻颗粒细胞。利用上述标志物可以评估卵巢癌、卵巢早衰等卵巢衰老相关疾病，还可以检测人类辅助生殖技术中的卵巢功能、卵母细胞活力等。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
[0090] 图1为食蟹猴单细胞测序文库构建和分析的示意图。
[0091] 图2为卵母细胞分子标志物在卵巢细胞中的表达量。
[0092] 图3为免疫荧光鉴定卵母细胞分子标志物在不同阶段卵母细胞中的表达和
定位情况。*标记为新鉴定的卵母细胞分子标志物。
[0093] 图4为生物信息学分析卵母细胞亚群。
[0094] 图5为早期卵母细胞分子标志物REXO5在不同发育阶段卵母细胞中的表达情况。
[0095] 图6为免疫荧光鉴定早期卵母细胞分子标志物REXO5在不同阶段卵母细胞中的表达和定位情况。
[0096] 图7为生物信息学分析卵母细胞的衰老相关的差异表达基因。
[0097] 图8为免疫荧光鉴定衰老卵母细胞的分子标志物GPX1和GSR在卵母细胞中的表达和定位情况。
[0098] 图9为生物信息学分析颗粒细胞的衰老相关的差异表达基因。
[0099] 图10为免疫荧光鉴定衰老颗粒细胞的分子标志物IDH1、PRDX4和NDUFB10在颗粒细胞中的表达和定位情况。
[0100] 图11为实时荧光定量PCR检测IDH1基因、PRDX4基因和NDUFB10基因在不同年龄人类颗粒细胞中的表达情况。
具体实施方式
[0101] 以下的
实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
[0102] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0103] 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0104] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0105] 下述实施例中，dNTP购自Fermentas，货号为R0193；无核酸酶的水购自Ambion，货号为AM9937；M2培养基和透明质酸酶均购自Sigma，货号依次为M7167和H3506；兔抗LMOD3、兔抗PRDX4和兔抗SYCP3均购自Abcam，货号依次为ab122305、ab184167和ab15093；ERCC RNA Spike-In Mix购自Life Technologies，货号为4456740；AMPure XP
磁珠购自Beckman，货号为A63881；Tissue- OCTTM化合物购自Sakura Finetek，货号为4583； 抗褪色固定介质购自Vector Laboratories，货号为H-1000；人外周血淋巴细胞分离液购自TBD Science，货号为LTS1077；
绵羊抗NETO1购自R&D，货号为AF4337；IV型胶原酶、胰蛋白酶和DPBS均购自Gibco，货号依次为17104-019、25200-072和21600-069；
牛血清
白蛋白(BSA)购自MP，货号为0219989991；RNase
抑制剂、SuperScript II逆转录酶、5×SuperScript II一链合成缓冲液、二硫苏糖醇(DTT)、Dynabeads MyOne链霉亲和素C1、Alexa 488驴抗小鼠IgG(H+L)二抗、Alexa 488驴抗兔IgG(H+L)二抗、Alexa 568驴抗绵羊
IgG(H+L)二抗和Alexa 568驴抗小鼠IgG(H+L)二抗均购自Invitrogen，货号依次为AM2684、18064-071、18064-071、18064-071、65001、A21202、A21206、A21099和A10037；
Triton X-100、甜菜
碱和MgCl2均购自Sigma-Aldrich，货号依次为T9284、61962和M8266；兔抗GPX1、兔抗GSR、兔抗IDH1、鼠抗NDUFB10、兔抗REXO5、Hoechst 33342和兔抗RBM46均购自Thermo Fisher Scientific，货号依次为PA5-30593、PA5-79334、PA5-28206、MA5-26082、PA5-59283、H3570和PA5-69118；2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix和KAPA Hyper Prep建库
试剂盒均购自KAPA公司，货号依次为kk2602和KK8054。
[0106] 下述实施例中，构建食蟹猴单细胞测序文库的引物名称及核苷酸序列见表1。
[0107] 表1
[0108]
[0109] 注：
条形码引物中，“XXXXXXXX”为8bp的条形码序列(即barcode)，“NNNNNNNN”为8bp随机唯一分子标识符(UMI)序列，“T25”表示25个T；TSO引物中，“rG”为核糖
鸟苷，“+G”为经
锁定核酸(LNA)修饰的鸟苷；生物素引物中，“/biotin/”为引物5’端进行生物素修饰，“/index/”为6bp的文库条形码序列。
[0110] 下述实施例中的食蟹猴实验是基于《非人类灵长类动物的伦理对待准则》进行的，并已通过中国科学院动物研究所的伦理审批。
[0111] 实施例1、食蟹猴单细胞测序文库(包括食蟹猴卵母细胞测序文库和食蟹猴卵巢体细胞测序文库)的获得
[0112] 食蟹猴单细胞测序文库构建和分析的示意图见图1。
[0113] 一、食蟹猴细胞悬浮液的获得
[0114] 根据食蟹猴的平均寿命及其与人类年龄的对应关系，由4只4-5岁的(雌)食蟹猴组成年轻组，4只18-20岁的(雌)食蟹猴组成年老组。所有食蟹猴均进行体检，包括基本参数的测量(如身体质量指数(Body Mass Index，BMI))、生化指标(如血常规、尿常规)的检测、脑部核磁和心脏等重要内脏器官的超声检测，以确定年轻组和年老组中的食蟹猴均无重大疾病。
[0115] 获得每只食蟹猴的细胞悬浮液。具体步骤依次如下：
[0116] 1、麻醉食蟹猴并用生理盐水灌注，然后分离卵巢组织并立即浸入M2培养基。
[0117] 2、在解剖
显微镜下去除卵巢组织周围的脂肪和其它粘附组织，获得2个“干净”的卵巢。
[0118] 3、取其中1个卵巢，切碎并置于EP管中；然后加入500μL浓度为2mg/mL的IV型胶原酶，混匀，37℃、1000rpm孵育20min，1000rpm瞬时离心，收集沉淀1。
[0119] 4、向沉淀1中加入1mL 0.25％(w/v)胰蛋白酶，混匀，37℃、1000rpm孵育20min，1000rpm瞬时离心，收集上清液2和沉淀2。
[0120] 5、向沉淀2中的加入500μL含1％(w/v)BSA的M2培养基，停止消化，获得
混合液。
[0121] 6、用移液枪吸移混合液50-100次，得到细胞悬浮液；该细胞悬浮液中含有卵母细胞和体细胞。
[0122] 二、食蟹猴卵母细胞测序文库和食蟹猴卵巢体细胞测序文库的构建
[0123] 裂解缓冲液由0.05μL浓度为40U/μL RNase抑制剂、0.095μL 10％(v/v)Triton X-100、0.5μL浓度为10mM的dNTP水溶液、1.105μL无核酸酶水、0.1μL 1：2000000稀释的ERCC RNA Spike-In Mix和0.15μL浓度为10μM的条形码引物水溶液组成。
[0124] 逆转录混合物：由0.25μL200U/μL SuperScript II逆转录酶、1μL5×SuperScript II一链合成缓冲液、0.125μL RNase抑制剂、0.25μL浓度为0.1M的DTT水溶液、1μL浓度为5M的甜菜碱水溶液、0.03μL浓度为1M的MgCl2水溶液、0.145μL无核酸酶水和0.05μL浓度为100μM的TSO引物水溶液。
[0125] PCR混合物：由6.25μL 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix、0.25μL浓度为10μM的预扩增引物水溶液、0.75μL浓度为10μM的3'P2引物水溶液和0.25μL无核酸酶水组成。
[0126] 采用优化的STRT-seq的单细胞转录组建库方法，分别对每只食蟹猴卵母细胞和体细胞进行裂解、反转录和预扩增，分别构建食蟹猴卵母细胞测序文库和食蟹猴卵巢体细胞测序文库，之后在Illumina X Ten平台上进行测序。具体步骤如下：
[0127] 1、取细胞悬浮液，在解剖显微镜下手动挑选卵母细胞并转移至含1％(w/v)BSA的M2培养基液滴中。每只食蟹猴收集的卵母细胞数量最多为96个，最少为9个。之后通过荧光激活细胞分选术(FACS)(BD FACSAriaTMII)去除残留细胞悬浮液中的碎片，收集单细胞。
[0128] 2、完成步骤1后，从单细胞中进一步收集体细胞(每只食蟹猴收集体细胞323-480个，8只食蟹猴收集的体细胞数平均为386个)，然后置于装有裂解缓冲液的PCR管中。
[0129] 3、将步骤1收集的卵母细胞通过口吸管分别挑入装有2μL裂解缓冲液的Eppendorf管(规格为200μL)中，72℃裂解3min。
[0130] 4、完成步骤3后，加入2.85μL逆转录混合物，混匀，之后25℃孵育5min，42℃孵育60min，50℃孵育30min，70℃孵育10min。
[0131] 5、将完成步骤4的体系加入装有7.5μLPCR混合物的EP管中，进行PCR扩增，然后合并标记有不同条形码的预扩增cDNA，再使用AMPure XP磁珠将合并的DNA纯化两次，得到合并的DNA。
[0132] PCR反应程序：95℃ 3min；98℃ 20s，65℃ 30s，72℃ 5min；98℃ 20s，67℃ 15s，72℃ 5min，13个循环数；72℃ 5min。
[0133] 6、制备生物素PCR反应体系，然后进行PCR扩增，之后使用AMPure XP磁珠纯化两次，得到生物素标记的DNA
片段。
[0134] 生物素PCR反应体系为50μL，由25μL 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix、2μL浓度为10μM的锚定引物水溶液、2μL浓度为10μM的生物素引物水溶液、30-40ng合并的DNA和无核酸酶水组成。
[0135] 7、完成步骤6后，利用超声
破碎仪将生物素标记的DNA片段断裂至300bp左右，使用AMPure XP磁珠纯化1次；之后用Dynabeads MyOne链霉亲和素C1富集生物素标记的3'末端。
[0136] 8、取步骤7富集的DNA片段，按照KAPA Hyper Prep建库试剂盒
说明书的步骤，进行末端修复、dA加尾和接头连接，得到连接接头的DNA。
[0137] 9、制备PCR反应体系，然后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0138] PCR反应体系为50μL，由25μL 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix、Illumina QP2引物、短通用引物、连接接头的DNA和无核酸酶水组成。Illumina QP2引物和短通用引物在PCR反应体系中的浓度均为0.3μM。
[0139] 10、使用Illumina HiSeq 4000对步骤9得到的PCR扩增产物进行150bp读长的双端测序，得到食蟹猴卵母细胞测序文库。
[0140] 11、按照步骤3-10的方法，将步骤3中“步骤1收集的卵母细胞”替换为“步骤2收集的体细胞”，步骤5中“13个循环数”替换为“19-21个循环数”，其它步骤均不变，得到食蟹猴卵巢体细胞测序文库。
[0141] 实施例2、卵母细胞分子标志物的获得和检测
[0142] 一、生物信息分析获得卵母细胞分子标志物
[0143] 以食蟹猴基因组Macaca_fascicularis_5.0(Ensemble)为参考，比对质量控制后的测序数据，统计唯一比对读长，并拆分为不同的细胞数据，细胞为卵母细胞和体细胞，体细胞包括基质细胞、平滑肌细胞、颗粒细胞、内皮细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞等)。以唯一分子序号标记单个分子，矫正扩增偏差，获得食蟹猴卵巢单细胞表达图谱。通过Seurat
软件包寻找高变异度基因，基于该基因群对所测细胞中的这些基因进行非线性
降维(t-SNE)，通过Seurat
软件包Find Clusters功能进行聚类以及Seurat软件包find_all_markers功能，获得SYCP3、DDX4、LMOD3、RBM46和NETO1在部分细胞中的表达情况(见图2)。SYCP3和DDX4均为经典卵母细胞标志物。
[0144] 二、免疫荧光检测
[0145] 1、分别取实施例1步骤一中2获得的另1个卵巢，先用4％(m/v)多聚甲
醛溶液4℃固定过夜，然后用PBS缓冲液充分洗涤，再浸入30％(m/v)
蔗糖水溶液，包埋在Tissue-OCTTM化合物中，然后冷冻。
[0146] 2、冷冻切片(约8μm)，置于带正电的
载玻片上，-80℃保存。
[0147] 3、取切片，先用PBS缓冲液清洗，再置于pH6.0、10mM的
柠檬酸钠缓冲液中，98℃
微波加热切片3次(每次5min)，目的为进行
抗原修复。
[0148] 4、完成步骤3后，冷却后，先将载玻片用PBS缓冲液洗涤3次，再用PBS缓冲液稀释的0.4％(v/v)Triton X-100通透25min，之后室温下用PBS缓冲液稀释的10％驴血清封闭缓冲液封闭1h，并在4℃下用一抗
染色过夜。一抗包括兔抗LMOD3、绵羊抗NETO1、兔抗RBM46或兔抗SYCP3。
[0149] 5、完成步骤4后，取所述切片，先用PBS缓冲液充分洗涤，再与相应的二抗在室温下孵育1h。
[0150] 6、完成步骤5后，取所述切片，先进行Hoechst 33342染色，再用PBS缓冲液洗涤3次，之后用 抗褪色固定介质固定，使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP5Ⅱ)获得图像。
[0151] 染色结果来自4个年轻和4个年老的食蟹猴个体的卵巢切片。部分免疫荧光检测结果见图3。结果表明，LMOD3、RBM46和NETO1均在卵母细胞中特异表达。
[0152] 上述结果表明，LMOD3、RBM46和NETO1均为卵母细胞分子标志物。
[0153] 实施例3、早期卵母细胞分子标志物的获得和检测
[0154] 早期卵母细胞为位于原始卵泡中被单层扁平颗粒细胞包围的致密卵母细胞，或位于初级卵泡中被单层立方形颗粒细胞包围的更大的卵母细胞(次级卵泡)。中晚期卵母细胞为被至少部分或完整的第二层立方形颗粒细胞包围的更大的卵母细胞，或在有卵泡液或囊状结构的囊状卵泡中的更大的卵母细胞(有腔卵泡)。
[0155] 一、生物信息分析获得早期卵母细胞分子标志物
[0156] 1、PCA分析食蟹猴卵母细胞测序文库的数据。
[0157] PCA分析结果见图4中A。结果表明，卵母细胞分为C1-C4共4个亚群。
[0158] 2、分别检测ZP1基因、WEE2基因、DNMT1基因、ATP6基因、FIGLA基因和SOX17基因在4个亚群的相对表达量。ZP1、WEE2、DNMT1、ATP6、FIGLA和SOX17均为经典卵母细胞标志物。
[0159] 检测结果见图4中B。
[0160] 3、检测4个亚群中UMI数目。
[0161] 检测结果见图4中C。
[0162] 4、对不同亚群特异分子标志物的基因注释分析。
[0163] 分析结果见图4中D。
[0164] 上述结果表明，C1-C4 4个亚群为按照卵母细胞发育阶段顺序排列的4个亚群。C1-C2属于早期卵母细胞，C3-C4属于中晚期卵母细胞。
[0165] 5、通过Seurat软件包Find Clusters功能进行聚类以及Seurat软件包find_all_markers功能，获得REXO5在C1-C4卵母细胞4个亚群中的表达情况(见图5)。
[0166] 二、免疫荧光检测
[0167] 按照实施例2中步骤二的方法，将一抗替换为兔抗REXO5，其它步骤均不变。
[0168] 染色结果来自4个年轻和4个年老的食蟹猴个体的卵巢切片。部分免疫荧光检测结果见图6。结果表明，早期卵母细胞中REXO5的表达量均显著高于中晚期卵母细胞。
[0169] 上述结果表明，REXO5为早期卵母细胞分子标志物。
[0170] 实施例4、衰老卵母细胞分子标志物的获得和检测
[0171] 一、生物信息分析获得衰老卵母细胞分子标志物
[0172] 基于年轻和年老的食蟹猴卵母细胞测序文库，通过Seurat软件包find_all_markers功能获得衰老卵母细胞分子标志物(|log2(fold change)|≥0.5，P<0.05，FDR<0.05)。
[0173] 结果见图7：A为衰老卵母细胞中上调(红色，左侧)和下调(蓝色，右侧)的差异表达基因，B为GPX1和GSR在不同阶段年轻衰老卵母细胞中的表达情况。
[0174] 二、免疫荧光检测
[0175] 平均统计来自4个年轻和4个年老的食蟹猴个体的卵巢切片，每个个体包含三个独立切片的100个以上原始卵泡中卵母细胞和50个以上初级卵泡中卵母细胞用于定量。
[0176] 按照实施例2中步骤二的方法，将一抗替换为兔抗GPX1或兔抗GSR，步骤(6)替换为步骤(6A)，其它步骤均不变。步骤(6A)为：完成步骤(5)后，取所述切片，先进行Hoechst 33342染色，再用PBS缓冲液洗涤3次，之后用 抗褪色固定介质固定，使用共聚
焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP5Ⅱ)获得图像，使用ImageJ软件测量GPX1或GSR的荧光强度，取平均值。
[0177] 以年轻食蟹猴原始卵泡中的卵母细胞的GPX1平均荧光强度作为1，计算其它食蟹猴卵母细胞的GPX1相对荧光强度。
[0178] 以年轻食蟹猴原始卵泡中的卵母细胞的GSR平均荧光强度作为1，计算其它食蟹猴卵母细胞的GSR相对荧光强度。
[0179] 免疫荧光检测的结果和定量结果见图8。结果表明，不论原始卵泡还是初级卵泡，与年轻卵母细胞相比，衰老卵母细胞中GPX1和GSR的蛋白表达量均显著降低。
[0180] 上述结果表明，GPX1和GSR均为衰老卵母细胞分子标志物。
[0181] 实施例5、衰老颗粒细胞分子标志物的获得和检测
[0182] 一、生物信息分析获得衰老颗粒细胞分子标志物
[0183] 基于年轻和年老的食蟹猴卵巢体细胞测序文库，通过Seurat软件包find_all_markers功能获得衰老颗粒细胞分子标志物(|log2(fold change)|≥0.5，P<0.05，FDR<0.05)。
[0184] 结果见图9：A为衰老颗粒细胞中上调(红色，左侧)和下调(蓝色，右侧)的差异表达基因，B为年轻、年老食蟹猴的颗粒细胞中IDH1、PRDX4和NDUFB10的相对表达量。
[0185] 二、免疫荧光检测
[0186] 为了测量IDH1、PRDX4和NDUFB10的平均荧光强度，统计结果来自4个年轻和4个年老的食蟹猴个体的卵巢切片，每只食蟹猴统计包含三个独立切片的300个以上的颗粒细胞用于定量。
[0187] 按照实施例2中步骤二的方法，将一抗替换为兔抗IDH1、兔抗PRDX4或鼠抗NDUFB10，步骤(6)替换为步骤(6A)，其它步骤均不变。步骤(6A)为：完成步骤(5)后，取所述切片，先进行Hoechst 33342染色，再用PBS缓冲液洗涤3次，之后用 抗褪色固定介质固定，使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP5Ⅱ)获得图像，使用ImageJ软件测量IDH1、PRDX4或NDUFB10的荧光强度，取平均值。
[0188] 以年轻食蟹猴颗粒细胞的IDH1作为1，计算年老食蟹猴IDH1的相对荧光强度。
[0189] 以年轻食蟹猴颗粒细胞的PRDX4作为1，计算年老食蟹猴PRDX4的相对荧光强度。
[0190] 以年轻食蟹猴颗粒细胞的NDUFB10作为1，计算年老食蟹猴NDUFB10的相对荧光强度。
[0191] 免疫荧光检测结果和定量结果见图10。结果表明，与年轻颗粒细胞相比，衰老颗粒细胞中IDH1、PRDX4和NDUFB10的蛋白表达量均显著降低。
[0192] 三、实时荧光定量PCR检测
[0193] 人类颗粒细胞的获取通过北京大学第三医院的伦理委员会审核，捐献者均签署了知情同意书。获取步骤具体如下：在进行辅助生殖技术的健康捐献者的卵泡液中加入人外周血淋巴细胞分离液，
密度梯度离心(2000rpm，30min)，取
中间层加入DPBS和0.2％透明质酸酶，37℃处理2min，3000rpm离心5min，收集沉淀，沉淀即为人类颗粒细胞。
[0194] 1、提取不同年龄个体的人类颗粒细胞的RNA，反转录，得到人类颗粒细胞的cDNA。
[0195] 2、分别以人类颗粒细胞的cDNA模板，实时荧光定量PCR检测IDH1基因、PRDX4基因或NDUFB10基因的相对表达量(以18s rRNA基因为内参)。
[0196] 检测18s rRNA基因、IDH1基因、PRDX4基因和NDUFB10基因的引物序列见表2。
[0197] 表2
[0198]
[0199] 3、完成步骤2后，拟合线性曲线。
[0200] 检测结果见图11。结果表明，随着年龄增长，IDH1基因、PRDX4基因和NDUFB10基因的相对表达量出现下降的趋势。这一趋势与步骤二免疫荧光检测的趋势完全一致。
[0201] 上述结果表明，IDH1、PRDX4和NDUFB10均为衰老颗粒细胞分子标志物。
