本发明涉及一种肝癌细胞特异的基因工程腺病毒的构建及应用。

腺病毒是一种双链DNA病毒。除了引起呼吸道疾病及象感冒症状之外，至今 未发现腺病毒引起其它严重疾病。腺病毒的基因组有36000左右碱基对。编码的 基因分为早期基因和晚期基因。早期基因当中除了基因组3之外，其它基因都是 病毒复制繁殖所必需的。象基因组E1，E2和E4缺失的病毒变种在一般细胞中是 不会复制繁殖的(Shenk T.，Fundamantal Virology，Third Edition，979-1005， 1996)。现在常用的腺病毒载体，都是复制缺陷型(Replication-deficient)。由 于腺病毒基因组的基因表达调控已研究得较清楚，同时腺病毒可以感染各种类型 的细胞，不会引起严重疾病，不会整合到染色体中去，腺病毒很稳定且易生产。 因此腺病毒被认为可发展成具有巨大应用潜力的基因治疗的载体。

早在上世纪50年代，腺病毒就被科学家用来尝试治疗肿瘤。美国国家卫生研 究院的Smith博士等人尝试利用野生型的腺病毒治疗子宫癌(Smith et.al.， Cancer 9：1211-1218，1956)。他们把腺病毒直接注射到原位子宫肿瘤中，发现 65％的病人表现出疗效。同时没有一位病人出现任何副作用(Smith et.al.， Cancer 9：1211-1218，1956)。可惜的是由于当时病毒纯化技术的落后和子宫肿瘤 注射操作的困难，使得这项试验没有进展下去。

直到1996年，美国的ONYX制药公司，采用基因工程技术，将早期基因EIB 当中的p55K编码区切除而改造成一种倾向于在p53肿瘤细胞缺陷的肿瘤细胞中复 制的腺病毒变种：dl1520(Barker and Berk，Virology 156：107-121，1987)。 这种病毒在p53缺陷的细胞中复制效率比在p53正常的细胞中要高100倍 (Bischoff et.al.，Science 274：373-376，1996)。但由于p55K蛋白的功能除 了与p53结合而使p53失去活性的功能之外，还参与病毒信使RNA在细胞核和细 胞质之间的运输。由于p55蛋白的缺失而严重影响到病毒mRNA的转运，以致 dl1520的复制能力比野生型腺病毒要低成千上万倍(Babiss et.al.，Mol.Cell. Biol.52551-2558，1985)。这严重影响到它杀死肿瘤细胞的能力。

1997，美国另一家生物制药公司—Calydon提出利用组织特异基因激活子去 控制腺病毒的复制。他们成功地将人体前列腺细胞专一的抗原基因(PSA)的激活 子和增强子放到腺病毒的早期基因EIA的激活子和编码区之间，产生的基因工程 病毒CN706在PSΛ+细胞中的复制水平比PSΛ-细胞中要高100倍(Rodrigucz et. al.，Cancer Research 57：2559-2563，1997)。随后，另一家生物公司利用类似 技术生产出倾向于在甲胎球蛋白质表达的细胞中复制的腺病毒变种(Avela041). 他们将甲胎球蛋白(AFP)的激活子和增强子放到腺病毒早期基因IA的编码区上 面，取代EIA基因的激活子。早期基因EIB仍然由野生的EIB自己的激活子控制。 这种变种在AFP+细胞中比在AFP-细胞中复制水平要高100至1000倍。动物试验 表明，这种变种能使AFP+肿瘤生长放缓(Halleubeck et.al.，Human Gene Therapy 10：1721-1733，1999)。但上述的几种基因工程在肝脏肿瘤细胞中的复制特异性不 高，杀死肿瘤细胞的能力还有待进一步提高。

本发明的目的是制备一种在肝脏肿瘤细胞中复制特异性更高，杀死肿瘤细胞 能力更强的基因工程腺病毒。 本发明的实施方案如下： 将人类的甲球蛋白基因的激活子，增强子和静止子被组装成一个只在肝癌细胞中 表达调控的激活开关，取代腺病毒的早期表达基因EIA的激活子。并且将病毒早 期表达基因EIA和EIB用“翻译中介因子”(TS)连起来，这样基因EIA和EIB 在转录水平上同时受肝癌细胞专一的激活开关控制。同时在病毒的基因组中，将 基因EIB中的19K蛋白编码序列切除，以增加病毒杀死细胞的能力。在早期基因 组3的基因中切割10.4K，10.7K和14.7K基因，并装入抑制血管生长的基因 (ENDOSTATIN)。经过上述基因改造后成为本发明的SF-1：人类腺病毒血清型5 (保藏号：CGMCC NO.0589，保藏日期：2001年6月14日)。 本发明的优点及其原因： 1)利用一个肿瘤细胞专一基因激活开关同时控制病毒的两个早期基因。在我们 构建的基因工程病毒SF-1中，病毒的两个早期基因同时被一个肿瘤细胞专一的基 因启动子所控制。这样使SF-1中EIA和EIB的表达，同时受到肝脏肿瘤细胞的专 一转录因子(HCCSS)在转录水平上的控制。而在翻译水平上，基因EIB是通过翻 译中介因子来完成的。

以上介绍的几种病毒变种都是只有一个基因被肿瘤基因开关控制，所以用本 发明的SF-1的腺病毒的肿瘤细胞的特异性更高(要比以上介绍的几种病毒变种在 肝脏肿瘤细胞中复制的特异性高出100倍)。同时，利用一个肿瘤专一基因的激活 开关同时控制两个病毒基因而构建只在肿瘤中复制的技术，在世界上还未见有报 导。 2)在我们构建的肝癌专一的基因工程病毒变种中，早期基因EIB当中的p19K蛋 白编码区以被切除。基因EIB编码至少两个蛋白，P55和P19。P19蛋白被认为是 抑制细胞雕亡的抑制蛋白，有了它，病毒感染之后死亡得较慢，而切除p19K蛋白 的变种比野生型腺病毒的杀伤肿瘤的能力更强。这在我们的实验中以得到验证。 因此，本发明制备的腺病毒变种比已发表的变种可能会有更好的治疗肿瘤的效果。 在肿瘤细胞专一的腺病毒中缺失P19K蛋白的工作，作者还未见报道。 3)本发明制备的腺病毒变种中同时携带有肿瘤生长所需血管的抑制基因。这样制 备的产品可以在体内肿瘤细胞中随着病毒的复制而不断转录翻译生产出抑制肿瘤 血管生产的抑制剂，以进一步达到杀死肿瘤细胞的效果。这与发表的腺病毒变种 也是不一样的。利用腺病毒做载体，去表达血管生长抑制因子，已有前例。但是， 利用只感染肿瘤细胞的基因工程病毒去表达血管生长因子，是本发明特征之一。 4)本发明的基因工程病毒，不但表现出比所有已发表的癌细胞专一的病毒更好的 特异性，而且能在静脉给药的情况下，6个星期内治愈动物身上的肿瘤，药效特 别好。 本发明用于制备肝脏肿瘤细胞特异复制腺病毒的DNA组件组成有： 1)pXC 1，本质粒购于加拿大的Microbix Biosystems，INC，含有人类腺病毒 血清型5的左手6Kb左右的DNA序列，编码早期基因EIA和EIB。 2)pBHG11，本质粒购于加拿大的Microbix Biosystems，INC，含有人类腺病毒 血清型5的全长基因，但是其中从矸基对188至1339(包含病毒的包装序列)和 矸基对从27865至30995两段DNA以被切除。 3)甲胎球蛋白基因的调控开关(HCCSS)从人类基因组中分离出来，其中包括从 矸基对-163至+34的激活子，从矸基对-3856至-3267的增强子和从矸基对 -1800至-953的静止子。克隆到pGEM-T载体(Promaga)之中。 4)Endostatin基因来自于InvivoGen，Inc.它是抑制血管生长的基因。

以下实施例对本发明的用于建造肝脏肿瘤细胞特异性，并表达心血管形成生 长抑制剂基因工程腺病毒的制备和用途作了详细说明，但不意味着限制本发明的 内容。 实施例1：SF-1人类腺病毒血清型5的制备

两个新的限制性脢切位点SpeI和SalI被通过定点突变方法加到pXC.1之 中，然后将甲胎球蛋白的调控组件HCCSS两端加上SpeI和SalI切口，然后用限 制性内切脢切割HCCSS将切割好的HCCSS片段克隆到通过SpEI和SalI切割的 PXC.1之中。与此同时，在EIA和EIB基因之间加入一种翻译中介因子，从而使 EIB的翻译受中介因子控制而产生中间质粒WP-1，接着将进行下一步骤。

质粒pBHG11之中有Pac I单一限制脢切口，腺病毒早期基因E3之中的致死 基因(ADP)被克隆到Pac I切口之中，然后再克隆ENDOSTATIN基因到此之中而 产生中间质粒WP-2，接着将进行下一步骤。

中间质粒WP-1和WP-2分别用NruI和ClaI内切脢切割，并用phenol和 chloroform纯化溶在重蒸水之中(1μg/ml)。转化有腺病毒左手区域大约6Kb 片段DNA的293细胞种在玻璃皿之中，48小时之后达到80％左右的细胞密度。然 后用Transfectin(Gibco，Lifescience)同DNA混合并转化293细胞。8天之后 细胞被括下来收集于15ml试验之中，然后注-80℃和+37℃冻融三次，细胞液 用来转染293细胞并挑选单个分离的病毒斑点，6个病毒斑点被挑选并感染已生 长好的293细胞。5天左右时间，细胞裂变，收集细胞液于试管之中，并分装到 小试管之中，保存在负80℃的冰箱之中，用于以下实验。首先200微升的细胞 液被用来提取DNA。然后用聚合链式反映(PCR)重新验证得到病毒的结构，实 验证实，得到的病毒正如设计的那样如图1病毒结构示意图。HCCSS被正确地放 在早期基因EIA之上，早期基因EIB被用转译切入信号(TS)连于早期基因EIB 之后。在早期基因区域E3，包含着ADP基因和ENDOSTATIN基因。经上述分析， 基因插入的位置和方向都正确。命名这个病毒为SF-1。 实验比较1：病毒在各种细胞中的复制

8种人体细胞其中包括人体正常细胞：内体细胞(Human Microvescular Endothelium Cells)微小通气道细胞(Small airway cell)，人体肝脏细胞(human hepatocytes)和人体成纤维细胞(fibroblast)。这些细胞和人体胸腺细胞 (HBL-100)都不生产甲胎球蛋白，而肝脏肿瘤细胞Hep3B SW620和H1299都生产高 水平的甲胎球蛋白。

将细胞长在培养皿中，24小时之后，三种病毒(WT-Ad(由PXC.1提供)，SF-1 和dl1520(由加州大学提供)被用来感染上述细胞(2PFU/cell)。四小时之后， 培养基被取出，并用PBS洗一次细胞然后将新的培养基加入，在37℃含5％CO2的培养厢中培养72小时，然后细胞和培养基被一起收入到试管中。然后经冻融三 次，样品用于分析有多少新的病毒复制繁殖起来。

图2病毒在不同细胞中的复制效率结果表明，SF-1同野生型腺病毒(WT-Ad) 相似，能有效地在甲胎球蛋白表达的细胞中复制繁殖，每个细胞产生超过10000 病毒感染颗粒。但是在甲胎球蛋白不生产的细胞中，野生型WT-Ad能有效地复制 繁殖每个细胞产生的病毒从1000至50000感染颗粒不等。有趣的是SF-1在这些 非甲胎球蛋白生产的细胞中基本上不复制。每个细胞生产的感染病毒颗粒从0.05 至5个不等。这样的复制水平比起它在甲胎球蛋白生产的肝脏肿瘤细胞中要低 5000至50,000倍。说明SF-1倾向于在肝脏肿瘤细胞中复制。

同样dl1520在不同细胞中的复制繁殖效率也被检测分析，发现dl1520在肝 脏肿瘤中的复制比野生腺病毒要低10至5000倍不等。而在非肝癌细胞中比SF-1 复制又要好50至500倍。说明SF-1的肿瘤选择性好，而dl1520没有肿瘤细胞的 选择性。 实验比较2：病毒在人体正常微泡内皮细胞中的生长曲线

将人体微泡内皮细胞种在培养皿中，48小时之后之三种病毒去感染一个培养 皿细胞，4小时之后吸去培养皿中的培养基，再用PBS洗一遍，然后加新的培养 基。然后在不同时间(6，12，24，36，48，72和108小时)之后将细胞和培养 基一起收集到试管中，冻融三次之后，在293细胞上检测有多少新的病毒产生。

图3病毒在人体微血管内及细胞中的生长的曲线表明了3种病毒在开始的24 小时内生长比较相近，但24小时之后，野生型腺病毒和dl1520在人体微泡内细 胞中生长的很好，每个细胞产生20000和2000感染颗粒不等，而SF-1在这种细 胞中基本上没有什幺复制，表明SF-1的复制已被严格地限制至肿瘤细胞而不会在 人体正常细胞中繁殖。 实验比较3：病毒杀死细胞的效率

脏肿瘤细胞Hep3B种在96孔的培养皿中，24小时之后，用三种病毒 (0.1PFU/Cell)各感染一个培养皿。然后分别在2天、4天、6天和8天之后测 定细胞的线粒体活性而计算细胞存活率。

图4病毒杀死肝癌细胞的动力学曲线表明SF-1杀死Hep3B的效率要显著高于 dl1520，同时也高于野生型腺病毒，例如感染8天之后，SF-1杀死95％的细胞，野 生型腺病毒杀死60％的细胞，而dl1520只杀死32％的细胞。这表明SF-1不但有显 著特异性杀死肿瘤细胞的活性，而且杀死肝癌细胞的效率很高。 实验比较4：病毒在动物模型上杀死肿瘤细胞的试验

首先在裸鼠上建立肝脏肿瘤模型。1×106个Hep3B细胞被注射到裸鼠的皮下， 四周之后，肿瘤块长大到300mm3左右，然后往这些鼠的尾巴血管中注射9？1010 颗粒的SF-1.每个星期测量肿块的大小，并按以下公式计算肿块的体积V＝长 X(宽)2/2。以注射前测量的体积为100％而得图5肝癌动物模型上的HEP3B肿瘤 大小在接受SF-1静脉注射之后的变化。表明肿瘤相对体积结果。

图标结果表明Hep3B在裸鼠上生长很快。6个星期之后体积增加超过9倍。 但是经静脉注射SF-1的老鼠背上的肿块体积则没有增加，反而降低，例如注射一 针的老鼠肿瘤体积下降到原来注射前的87％，而注射二针的老鼠背上的肿瘤体积 则下降到0。则表明SF-1有显著的杀死肿瘤的能力，注射二针可以杀灭肝脏肿瘤。 实验比较5：病毒对肝癌肿瘤血管生长的抑制作用

实验方法同上述例六一样，只是肿块在SF-1注射之后一周和二周的时候被收 割下来做成切片而用来检测肿瘤血管的生长情况。肿块切片用CD31单克隆抗体去 染色，这样新生血管中内皮细胞上表达CD31蛋白的细胞都会被染成兰色。图6SE-1 在肝癌动物模型上的抗血管生长的效应。表明，没有注射病毒的动物背上肿块中的 血管被CD31抗体染成兰色的当做100％，而被注射SF-1的动物背上的肿瘤块能染 成兰色的在注射一个星期之后减少为对照动物的42％，二个星期之后减少为对照 动物的18％。而注射dl1520的动物，能被CD31抗体染色的血管内皮细胞数与对 照相比变化不大，第一个星期为对照的98％，第二个星期为对照的80％。这组数据 表明SF-1是一个具有显著杀死心血管的，肿瘤细胞专一的基因工程病毒，具有抗 血管增生的功效。

(A OAP上述例六一样，只是肿块在WV-A注射之后一周和二周的时候被收割 下来做成切片而用来检测肿瘤血管的生长情况。肿块切片用CD31单克隆抗体去染 色，这样新生血管中内皮细胞上表达CD31蛋白的细胞都会被染成兰色。图6表示， 没有注射病毒的动物背上肿块中的血管被CD31抗体染成兰色的当做100％，而被 注射WV-A的动物背上的肿瘤块能染成兰色的在注射一个星期之后减少为对照动 物的42％，二个星期之后减少为对照动物的18％。而注射dl1520的动物，能被CD31 抗体染色的血管内皮细胞数与对照相比变化不大，第一个星期为对照的98％，第 二个星期为对照的80％。这组数据表明WV-A是一个具有显著杀死心血管的，肿瘤 细胞专一的基因工程病毒，具有抗血管增生的功能。

图1为病毒结构示意图 图2为病毒在不同细胞中的复制效率 图3为病毒在人体微血管内及细胞中的生长曲线 图4为病毒杀死肝癌细胞的动力学曲线 图5为肝癌动物模型上的HEP3B肿瘤大小在接受SF-1静脉注射之后的变化 图6为SF-1在肝癌动物模型上的抗血管生效应。