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CRISPR-Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性的sgRNA

阅读：816发布：2020-05-12

专利汇可以提供CRISPR-Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性的sgRNA专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了CRISPR/Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性sgRNA。首先是获得特异性靶向SANIL1基因外显子的sgRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其次是构建SANIL1基因的sgRNA到病毒载体系统，该系统含有Cas9蛋白；最后将含有该sgRNA的CRISPR/Cas9 病毒感染人细胞，获得SANIL1蛋白表达水平显著降低的细胞株。本发明具有操作步骤简单、sgRNA靶向性好、且对SANIL1基因切割效率高；此外，所构建的CRISPR/Cas9慢病毒系统具有敲除效率高的优势，并能特异性敲除SANIL1基因，得到敲除SANIL1基因的人细胞，从而为进一步研究人细胞中SANIL1的作用机制提供强有力的工具。，下面是CRISPR-Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性的sgRNA专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种CRISPR/Cas9 靶向敲除SANIL1基因及其特异性的sgRNA，其特征在于，首先设计获得特异性靶向SANIL1 基因外显子的sgRNA；其次构建SANIL1基因的sgRNA到病毒载体系统，然后将此质粒或者病毒载体系统转染或者感染人细胞，得到的SANIL1基因敲除细胞株。
2.根据权利要求1所述的特异性靶向SANIL1 基因外显子的sgRNA，其DNA 序列如SEQ ID NO.1、2、3所示，所述sgRNA 在SANIL1基因上的靶序列是唯一的。
3.根据权利要求2所述的特异性靶向SANIL1 基因外显子的sgRNA，其引物包括针对SANIL1基因的靶点位于外显子上的引物对：
SANIL1sgRNAoligo1：如SEQ ID NO.2所示；
SANIL1sgRNAoligo2：如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的构建SANIL1基因的sgRNA到病毒载体系统，是一种靶向敲除SANIL1 基因的CRISPR/Cas9 重组表达病毒载体Lenti-CRISPRv2-hSANIL1sg，其特征在于：
含有特异性靶向SANIL1 基因显子的sgRNA 和Cas9 蛋白的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体的骨架载体的序列如序列表中SEQ ID NO ：4 所示；
根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9 靶向敲除人SANIL1基因及其特异性的sgRNA，其特征在于包括如下步骤：
(1) 提供sgRNA序列，所述sgRNA 在SANIL1基因上的靶序列符合5’-N(21)G 的序列排列规则，所述sgRNA 在SANIL1基因上的靶序列位于基因的外显子，所述sgRNA 在SANIL1 基因上的靶序列位于不同的各种剪切形式的共有外显子上，所述sgRNA 在SANIL1基因上的靶序列是唯一的，并且所述sgRNA 在SANIL1 上的靶位点序列如序列表SEQ ID NO.1、2、3序列所示任意一条，在所述sgRNA 在SANIL1 上的靶位点序列的5’- 端加上ACCG序列合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo ；获得sgRNA 在SANIL1 上的靶位点序列的互补链，并且在互补链的5’ - 端加上AAAC序列，合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo ；将合成的1 对互补的sgRNA 寡聚核苷酸的Forward oligo 和Reverse oligo 成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6 真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；
(2) 线性化序列如序列表SEQ ID NO.4 所示的Lenti-CRISPRv2质粒；将退火的双链sgRNA 寡聚核苷酸与线性化的携带Cas9 基因的表达载体Lenti-CRISPRv2连接获得携带含相应靶序列的sgRNA 寡聚核苷酸和Cas9 基因的表达载体Lenti-CRISPRv2-hSANIL1sg 质粒，转化感受态细菌并涂Amp+ 平板，挑取单克隆并用通用引物U6 通过测序鉴定出阳性克隆，并对所述阳性克隆摇菌、提取pLenti-U6-SANIL1 gRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9质粒；
（3）用所述携带有sgRNA 寡聚核苷酸和Cas9 基因的序列为SEQ ID NO.9的表达载体Lenti-CRISPRv2-hSANIL1sg 质粒、序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11 的pLP-VSVG (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260)包装质粒和包装细胞系，包装细胞系为
293TN 细胞；包装出同时携带靶向SANIL1基因的sgRNA 和Cas9 的假型病毒；
（4）使用所述假型病毒感染目的细胞，加puromycin抗性筛选后并进一步培养；
（5）铺单克隆细胞，然后收集单克隆细胞，抽提基因组DNA,以其基因组DNA 为模板扩增包含所述靶序列的基因片段，TA 克隆测序确认SANIL1 基因已经被敲除并获得基因敲除的细胞。
6.根据权利要求1所述的敲除SANIL1基因的细胞株，为人细胞；其特征在于：是人细胞中的SANIL1基因缺失或插入核苷酸得到的细胞株。

说明书全文

CRISPR-Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性的sgRNA

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR-Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性的sgRNA。

背景技术

[0002] SANIL1(snail family transcriptional repressor 1)：是锌指转录抑制子，下调中胚层中的外胚层基因。由该基因编码的核蛋白在结构上和果蝇snail蛋白类似，而且同样也被认为在发育中的胚胎的中胚层形成是至关重要的。在2号染色体上，人们已经发现了至少2种类似的加工过的假基因的突变体。

[0003] Snail1蛋白是锌指蛋白Snail超家族的成员,具有强大的EMT诱导能力。借由其羧基末端的锌指结构与CDH1核心启动子区的E-box基序结合,Snail1蛋白能有效遏制后者的转录表达,造成E-cadherin表达缺失,诱导EMT发生。

[0004] CRISPR-Cas系统是最近几年兴起用于靶向基因特定DNA修饰的重要工具，具有快速、高效及特异性靶向等优势，已被应用于多种模式生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。CRISPR RNA(crRNA)与转录激活crRNA 退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂。这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA进行简化。基因组的靶序列中有长约20bp的片段与crRNA或sgRNA互补配对；靶序列末端的三核苷酸区域PAM(5’-NGG-3’)为spCas9识别位点，是实现剪切功能的关键。sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR/Cas9特异性敲除目标基因的先决条件，脱靶和错误靶向都会影响CRISPR/Cas9对目标基因的特异性敲除，因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR/Cas9基因敲除的关键技术。

[0005] 本发明利用CRISPR/Cas9慢病毒系统，获得敲除SANIL1基因的人细胞，为研究肠癌细胞中SANIL1的作用机制提供有力工具。

[0006] 参考文献：

[0007] 1.Doudna，J.A.；Charpentier，E.，Genome editing.The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.Science，2014，346，(6213)，1258096.[0008] 2.Fang，R.；Chang，F.；Sun，Z.-L.；Li，N.；Meng，Q.-Y.，New Method of Genome Editing Derived From CRISPR/Cas9.Acta Agronomica Sinica，2013，40，(8)，691.发明内容

[0009] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种靶向敲除SANIL1基因的sgRNA序列；本发明的另一目的在于提供所述一种靶向敲除SANIL1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的应用；本发明的再一目的在于提供靶向敲除SANIL1基因的人细胞的应用。

[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种靶向敲除SANIL1基因的sgRNA序列，选自DNA序列如下的SANIL1sgRNA：

[0011] SANIL1sgRNA的序列如下：

[0012] SANIL1sgRNA oligo1：5’-ACCGACGCCGCTGCGGAAACCTTC-3’；

[0013] SANIL1sgRNA oligo2：5’-AAACGAAGGTTTCCGCAGCGGCGT-3’；

[0014] SANIL1sgRNA oligo3：5’-ACCGCAACCTCTCCCCTGGCCCTG-3’；

[0015] SANIL1sgRNA oligo4：5’-AAACCAGGGCCAGGGGAGAGGTTG-3’；

[0016] SANIL1sgRNA oligo5：5’-ACCGTGCAGGCCCAAGCTGCCCGCC-3’；

[0017] SANIL1sgRNA oligo6：5’-AAACAAACGGCGGGCAGCTTGGGCCTGCA-3’；

[0018] 一种靶向敲除SANIL1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统，含有上述靶向敲除SANIL1基因的sgRNA的DNA序列。

[0019] 所述的靶向敲除SANIL1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的构建，包括如下步骤：

[0020] (1)使用BsmBI酶切CRISPR/Cas9慢病毒载体Lenti-CRISPRv2，得到酶切后的CRISPR/Cas9慢病毒载体；

[0021] (2)将上述靶向敲除SANIL1基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后与酶切后的CRISPR/Cas9慢病毒载体连接，得到靶向敲除SANIL1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统。

[0022] 步骤(2)中所述的DNA序列是将寡核苷酸链1(oligo1)和寡核苷酸链2(oligo2)退火得到双链序列。

[0023] 所述的靶向敲除SANIL1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统在制备敲除SANIL1基因的细胞株中的应用。

[0024] 一种敲除SANIL1基因的细胞株，是将所述的靶向敲除SANIL1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统转染目的细胞株得到的。

[0025] 所述的敲除SANIL1基因的细胞株，具体是通过如下步骤构建得到：

[0026] 1)将所述的靶向敲除SANIL1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统通过包装细胞进行包装，得到慢病毒颗粒；

[0027] 2)将慢病毒颗粒感染目的细胞株；

[0028] 3)将感染后的细胞铺单克隆，得到敲除SANIL1基因的细胞株。

[0029] 所述的目的细胞株优选为人细胞株。

[0030] 所述的目的细胞株优选为肿瘤细胞株。

[0031] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0032] 本发明提供SANIL1基因的sgRNA能特异靶向SANIL1基因，将其构建入CRISPR/Cas9慢病毒系统，该系统能特异靶向敲除SANIL1基因，得到敲除SANIL1基因的细胞株，从而有利于研究细胞株中的SANIL1的作用机制。附图说明

[0033] 附图1:pLenti-U6-gRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9质粒图谱；

[0034] 附图2：pLenti-U6-SANIL1 gRNA 1-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9质粒图谱；

[0035] 附图3：pLenti-U6-SANIL1gRNA 2-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9质粒图谱；

[0036] 附图4：pLenti-U6-SANIL1 gRNA 3-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9质粒图谱；

[0037] 附图5：293T细胞转染含有SANIL1gRNA1的活性鉴定测序图；

[0038] 附图6：293T细胞转染含有SANIL1gRNA2的活性鉴定测序图；

[0039] 附图7：293T细胞转染含有SANIL1gRNA3的活性鉴定测序图。

具体实施方式

[0040] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0041] 实施例1

[0042] 1.使用CRISPR/Cas9技术构建敲除SANIL1质粒

[0043] 1.1sgRNA寡核苷酸链合成

[0044] 使用CRISPR在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)根据评分系统，在SANIL1的外显子2上设计1个20bp的sgRNA，并通过BLAST验证无非特异性基因。编码链模板5′端添加ACCG，非编码链模板3′端添加AAAC，与BsmBI酶切后形成的粘性末端互补，设计1对CRISPR寡核苷酸链，见表1。

[0045] 表1SANIL1靶向位点及sgRNA寡核苷酸序列

[0046]sgRNA名称 sgRNA寡核苷酸序列
SANIL1sgRNAoligo1 5’-ACCGACGCCGCTGCGGAAACCTTC-3’
SANIL1sgRNA oligo2 5’-AAACGAAGGTTTCCGCAGCGGCGT-3’
SANIL1sgRNAoligo3 5’-ACCGCAACCTCTCCCCTGGCCCTG-3’
SANIL1sgRNA oligo4 5’-AAACCAGGGCCAGGGGAGAGGTTG-3’
SANIL1sgRNAoligo5 5’-ACCGTGCAGGCCCAAGCTGCCCGCC-3’
SANIL1sgRNA oligo6 5’-AAACAAACGGCGGGCAGCTTGGGCCTGCA-3’

[0047] 1.2载体构建

[0048] 1.2.1使用BsmBI酶切2μg Lenti-CRISPRv2质粒(购于Addgene公司)，2h，37℃,[0049] 酶切体系为：

[0050]2μg(2μl) Lenti-CRISPRv2
1μl BsmBI(NEB)
5μl 10X Cutsmart
42μl ddH2O
50μl 合计

[0051] 1.2.2使用捷瑞基因胶回收试剂盒纯化酶切质粒产物，按说明书进行操作。

[0052] 1.2.3磷酸化并退火sgRNA oligos：

[0053] 酶连体系为：

[0054]1μl Oligo1(100μM)
1μl Oligo2(100μM)
1μl 10X T4链接缓冲液(NEB)
6.5μl ddH2O
0.5μl T4PNK(NEB)
10μl 合计

[0055] PCR仪器退火程序：

[0056] 37℃30min,95℃维持5min，每分钟降低5℃至25℃，4℃维持

[0057] 1.2.4将退火形成的Oligo双链和酶切后的Lenti-CRISPRv2载体直接连接，室温下，10min。

[0058] 1.2.5将连接后的质粒转化至感受态细胞DH5α中，均匀涂至LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。

[0059] 1.3挑取单个菌落扩大培养并质粒小提。

[0060] 1.4测序鉴定质粒构建成功，并命名为Lenti-CRISPRv2-hSANIL1sg。

[0061] 1.5敲除效率验证。

[0062] 用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于5％CO2，37℃恒温培养293T细胞(购于美5
国ATCC细胞库)。取对数期细胞以1×10/孔接种到24孔板培养。待细胞融合度达到70％～8
0％时更换成Opti-MEM培养基，1小时后将相应的CRISPR/Cas9敲除质粒0.8μg经Lipo2000试剂，转染到293T细胞中，转染48小时候，荧光显微镜下观察转染效果，消化收集细胞，采用基因组DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA。

[0063] 以各组细胞基因组DNA为模板，利用表2的引物(Seq No.8～11)PCR扩增靶向序列。用SANIL1-4-1和SANIL1-4-2进行PCR，得到751bp的片段a，以a为模板，用SANIL1-4-3和SANIL1-4-4进行PCR，得到388bp的片段b，该片段电泳后胶回收用于测序，测序引物为SANIL1-4-3。

[0064] 表2引物情况表

[0065]引物名称引物序列
SANIL1-4-1 GCTCAGAGAAGCCAGACAAC
SANIL1-4-2 CAGTGAGTCTGTCAGCCTTTG
SANIL1-4-3 TTGTCCCACGGCTCACTC
SANIL1-4-4 AATGGTCTTCATCAAAGTCC

[0066] 2.包装慢病毒

[0067] 100mm皿种入4×106个293TN细胞，培养24h(37℃,5％CO2)后，更换新鲜培养基，转染包装细胞：

[0068] a.混匀以下3个质粒：1)包装质粒psPAX2 12μg；辅助质粒pLP-VSVG 10μg；表达质粒Lenti-CRISPRv2-hSANIL1sg 22μg；加入CaCl2 250μl；加入ddH2O至总体积为500μl，37℃放置20min；

[0069] b. 2X BES 500μl，37℃放置20min；

[0070] c.把a中500μl三质粒混合液逐滴加入b中，并轻轻混匀；

[0071] d.小心的将c中混合液加入种有293TN的100mm皿中；培养12h后移除感染液，更换10ml新鲜培养基生产病毒液；培养48h后，收获病毒液至50ml离心管中，并重新向100mm皿中补加10ml培养基再次生产病毒；培养24h后，再次收获病毒液，室温离心，1000rpm，10min；使用0.22μm的滤器过滤病毒上清液；将病毒上清液装入超离管中，4℃，100000g，2h；弃去上清液后用Opti-MEM重悬过夜；再次使用0.22μm的滤器过滤重悬的病毒；分装后，-80℃保存。

[0072] 3.病毒感染

[0073] 1)将要感染的HT-29细胞(购于美国ATCC细胞库)接种到六孔板中，过夜，待细胞融合度约为50％时，移去培养基，更换2ml新鲜培养基；

[0074] 2)每孔加入20μl病毒液，再加入12μl聚凝胺polybrene，至终浓度为6μg/ml；

[0075] 3)37℃培养12h后，移除培养液，更换新鲜培养液后继续培养48h；

[0076] 4.筛选稳定细胞株

[0077] 感染结束48h后，向每孔加入嘌呤霉素(2.0μg/ml)，隔天换液，并保持培养基的嘌呤霉素浓度恒定，筛选阳性克隆细胞。所得细胞株命名为“胞名-SANIL1”。并使用有限稀释法挑选HT-29-SANIL1单克隆敲除细胞株。

[0078] 5.稳定细胞株鉴定及基因打靶方式鉴定

[0079] 以各组敲除SANIL1的单克隆细胞株基因组DNA为模板，分别设计针对SANIL1第二外显子的引物，序列如Seq No.8～11进行两轮巢式PCR扩增，对获得的第二轮PCR产物进行测序，如测序结果打靶位点附近出现双峰的情况，则可能为打靶成功。选择双峰的样品再次PCR，产物胶回收后TA克隆至T载体中，转化后挑取阳性克隆再次进行测序，如测序结果SANIL1基因靶位点附近发生非三倍数的碱基插入或碱基缺失，导致阅读框移码突变，则可判断为SANIL1基因敲除。鉴定出sgRNA是有活性的(图5)，并且找到2种类型的具有SANIL1基因缺失或插入突变的稳定细胞株(图6和图7)。

[0080] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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