人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因序列
阅读：628发布：2020-05-13
专利汇可以提供人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因序列专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因序列，属于 生物 技术领域。本 发明 根据 植物 密码子的特点和植物生理特性人工合成人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因，该基因的5′非翻译端具有 烟草 花叶病毒的5′非翻译端的特征，起始密码子附近有植物Kozak序列特点，该序列能够提高基因的起始效率和表达量，该基因的 信号 肽被菜豆植物血球凝集素基因的信号肽取代，该基因的末端加上内质网导向信号SEQ ID10多核苷酸序列，含有SEQID5多核苷酸序列。本发明为利用植物生产人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，实现外源蛋白在植物 种子 和贮藏器官中表达，大幅提高人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子及其相关蛋白的生产。，下面是人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因序列专利的具体信息内容。
1、一种人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因序列，其特征在 于，根据植物密码子的特点和植物生理特性人工合成人粒细胞巨噬细胞集落刺激 因子特异性表达的基因，该序列能够提高基因的起始效率和表达量，所述的基因 序列如SEQ ID No.5所示。
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的基因序列。具体地说，是一种人粒细 胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因序列。
技术背景
大豆种子蛋白质的含量一般为40％左右。大豆种子的蛋白主要由两个家族 组成，分别为7S和11S家族，其中7S家族蛋白的量占种子总蛋白量的25％左 右。7S家族蛋白主要是由α，α′和β三个亚单位组成，其中α′启动子是种 子特异性的启动子，能够在种子中高效表达。在本发明中，从大豆品种合丰39 中克隆出与所有报道不同的β—伴大豆球蛋白α′亚单位启动子(Gene Bank中 序列号：M13759；SEQ ID1)，并加以人工改造，能够在植物种子和贮藏器官中 高效表达。
人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子主要应用于临床上因造血系统异常而导致 白细胞减少的症状。能刺激粒细胞和巨噬细胞的繁殖、分化，加速骨髓移植病 人造血功能的恢复，增强癌症病人对化疗的耐受性，治疗造血障碍性疾病、增 强机体防御功能等方面均具有显著作用，且副作用小。荫俊等(中国医学院科 学院报，1999年21卷第一期31-36页)采用PCR和定点突变的方法，对hGM-CSF 基因5′端序列进行插入和定点修饰，提高了N端起始区的翻译效率，并实现 在大肠杆菌中的高效表达，这种改造适用的是原核表达系统。以植物为宿主来 表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，Ravinder等(Biological activity of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor is maintained in a fusion with seed glutelin peptide.Ravinder K.Sardana，Zaman Alli， Anil Dudani，Eilleen Tackaberry，Mitra Panahi，Muthukrishnan Narayanan， Peter Ganz and Illimar altossaar.Transgenic Research，11：521-531，用 水稻种子谷蛋白启动子表达具有活性的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，转基 因研究，2002年，11期，521-531页)用水稻谷蛋白启动子，在烟草中表达人 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，最高表达量达到种子可溶性总蛋白的0.03％。 用植物来表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，有两个问题没有解决。一、适 合在植物中高效表达的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子多核苷酸编码优化序列 还没有报道。二、缺乏高效的组织特异性启动子。本发明解决了这方面的问题 题。表达量占组织可溶性蛋白总量的1％以上，比已经报道的植物特异性表达系 统高出30～100倍。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种人粒细胞巨噬细胞集 落刺激因子特异性表达的基因序列。使其为利用植物生产人粒细胞巨噬细胞集 落刺激因子，实现外源蛋白在植物种子和贮藏器官中表达，生产具有生理活性 的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，大幅提高人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 及其相关蛋白的生产。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明根据植物密码子的特点和植物 生理特性人工合成人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因，该基因 的5′非翻译端具有烟草花叶病毒的5′非翻译端的特征，起始密码子附近有植 物Kozak序列特点，该序列能够提高基因的起始效率和表达量，该基因的信号 肽被菜豆植物血球凝集素基因的信号肽取代，该基因的末端加上内质网导向信 号SEQ ID10多核苷酸序列，含有SEQ ID5多核苷酸序列。
所述的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因，在该基因的末 端加上液泡导向信号SEQ ID9多核苷酸序列，含有SEQ ID6多核苷酸序列。
所述的多核苷酸序列，包含有SEQ ID2，含有改造过的从大豆合丰39中克 隆出的β—伴大豆球蛋白α′亚单位启动子。
所述的基因序列，其构建的载体，转化植物细胞，表达出的人粒细胞巨噬 细胞集落刺激因子。其特征是，它包括成熟人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子氨 基酸多肽，或其保守区域，或其活性片断，或其活性的衍生物。
本发明具有能够在植物种子和贮藏器官中表达的特异性启动子，该启动子 是从大豆中克隆出来的并加以改造，与现在已知的β—伴大豆球蛋白α′亚单 位启动子的核苷酸序列不同，但与β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子有很 高的同源性，或者所述的多核苷酸能够在55℃条件下与SEQ ID1杂交。不同的 位置主要在集中在第350—500位核苷酸之间，以及第907—980位核苷酸，经 过改造的启动子能够在种子中特异高效表达，是一组织特异性启动子，它与β —伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子能够杂交，它具有SEQ ID2所述的多核苷 酸序列。
本发明具有适合在植物中表达的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子多核苷酸 序列，人工设计并合成的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，该基因具有烟 草花叶病毒5′非翻译端；菜豆植物血球凝集素的信号肽；起始位点附近有植物 Kozak特征序列；经过优化的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子成熟肽多核苷酸编 码区；末端加上内质网的导向信号，这是根据植物特点设计的，能够在植物表 达和累积人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，具体地说，是具有SEQ ID3多核苷酸 序列。
本发明还具有适合在植物中表达的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子多核苷 酸序列。人工设计并合成的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，该基因具有 烟草花叶病毒5′非翻译端；菜豆植物血球凝集素的信号肽；起始位点附近有植 物Kozak特征序列；经过优化的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子成熟肽多核苷 酸编码区；末端加上液泡的导向信号，这是根据植物特点设计的，能够在植物 中表达和累积人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，具体地说，是具有SEQ ID4多 核苷酸序列。
所述的载体，是本发明的克隆和表达载体，这些载体包括：结合有SEQ ID2 序列新的β—伴大豆球蛋白α′亚单位启动子pMD18—T载体；结合有SEQ ID2 序列新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子和胭脂碱合成酶基因(NOS)终 止子的pMD18—T载体；具有改造的人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID5多核苷 酸序列pMD18—T载体；具有改造的人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID6多核苷 酸序列pMD18—T载体；结合有新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，人 粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID5多核苷酸序列和NOS终止子的pMD18—T载体； 结合有新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，SEQ ID6多核苷酸序列和 NOS终止子pMD18—T载体；具有新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子， 人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID5多核苷酸序列和NOS终止子的pCAMBIA2300 表达载体；具有新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，人粒细胞巨噬细 胞刺激因子SEQ ID6多核苷酸序列和NOS终止子的pCAMBIA2300表达载体；具 有新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID5多核苷酸序列和NOS终止子pCAMBIA3300表达载体；具有新的β—伴大豆球 蛋白的α′亚单位启动子，人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID6多核苷酸序列 和NOS终止子pCAMBIA3300表达载体。
所述的新的β—伴大豆球蛋白α′亚单位启动子是指：从大豆品种合丰39 中克隆出β—伴大豆球蛋白α′亚单位启动子转录起始位点下游第二个核苷酸 到上游904个核苷酸的基础上，用烟草花叶病毒5′非翻译端代替β—伴大豆球 蛋白α′亚单位基因的5′非翻译端。
所述的烟草花叶病毒5′非翻译端是指：烟草花叶病毒的RNA翻译起始位 点上游的序列(又叫Ω序列)，具体地说，是指具有所示SEQ ID7的多核苷酸序 列。
植物血球凝集素的信号肽序列是指菜豆(Phaseous Vulgaris)中植物血球 凝集素前端的21个氨基酸多肽，是由63个核苷酸编码。具体寡核苷酸序列见 SEQ ID8。
所述的Kozak序列是指：Kozak等人(1984)发现的，在植物或动物基因的 起始密码子ATG之前存在的特定序列。总结出在真核生物中，起始密码子周边 序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。
液泡导向信号，是指菜豆球蛋白(Phaseolin)C端一个短肽AFVY(Ala— Phe—Val—Tyr)，由12个核苷酸编码，具有SEQ ID9寡核苷酸序列，能够将多 肽导向液泡贮藏器官。
内质网导向信号，是指某些成熟蛋白C端4个氨基酸KDEL(Lys—Asp—Glu —Leu)短肽，由12个核苷酸编码，具有SEQ ID10寡核苷酸序列，将所连接的 多肽导向内质网。
胭脂碱合成酶基因(NOS)终止子，是指胭脂碱合成酶基因3′非翻译端的 多核苷酸序列，它的作用是提供转录终止信号，具有SEQ ID11寡核苷酸序列。
本发明人工设计并合成的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，在植物中 高效表达和累积人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。这些人工合成粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子为利用植物来生产人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子提供了一种 崭新的途径。本发明利用所述的载体转化宿主细胞，产生转基因后代植株。首 先将这些载体导入农杆菌中，用上述改造过的pCAMBIA2300表达载体转化拟南 芥，用上述改造过的pCAMBIA3300表达载体转化大豆。利用转基因植物生产药 用重组蛋白的成本，仅为利用大肠杆菌发酵生产成本的1/10～1/50。
具体的实施方式
下面结合具体的实施例子，进一步阐述本发明的具体实施方式。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等(1989)编著的 分子克隆实验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实验所用的pMD18—T载体是大 连TaKaRa公司产品，pCAMBIA2300和pCAMBIA2300是由澳大利亚CAMBIA实验室 提供。
实施例1 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在拟南芥中进行表达
步骤1新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子获得
1.从大豆品种合丰39中用SEQ ID12和SEQ ID13所列的引物，用高保真的 Taq酶(购自大连TaKaRa公司公司)克隆出SEQ ID14，连入pMD18—T载体， 导入大肠杆菌DH5α，测序验证，与已报道的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启 动子有93％的同源性。
2.提取质粒，以SEQ ID14为模板，用SEQ ID12和SEQ ID15所列的引物， 克隆出SEQ ID2。连入pMD18—T载体，导入大肠杆菌DH5α，测序验证。
3.从pBI101质粒中用EcoR I和Sac I酶切下NOS终止子，连入含有上述 SEQ ID2的pMD18—T载体，组成含有SEQ ID2和NOS终止子的pMD18—T载体， 命名pMD18—ID2—NOS。
步骤2 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的人工合成
人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子选用植物偏爱的密码子和根据植物生理特 性，合成SEQ ID5和SEQ ID6之后连入载体pMD18—T，分别为pMD18—ID5和 pMD18—ID6。
步骤3 人粒细胞巨噬细胞序列信息和同源性分析
本发明的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因全长详见序列SEQ ID5和SEQ ID6，其中开放读框位于核苷酸第8—469位核苷酸，编码152个氨基酸，分子 量分别为17142和17137，等电点分别pI＝5.18和pI＝5.33。
将人工合成的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长序列及其编码的蛋白用 BLAST程序在Non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷 酸和蛋白同源性检索，结果发现在核苷酸水平上，它与人粒细胞巨噬细胞集落 刺激因子编码区(SEQ ID18)有64％的同源性。在氨基酸水平上，包含有人粒 细胞巨噬细胞集落刺激因子成熟肽的全部127个氨基酸(SEQ ID19)。
步骤4 pCAMBIA2300表达载体的构建
1.将携带合成基因的质粒载体pMD18—ID5和pMD18—ID6用EcoR I和ApaL I双酶切，切下目的基因SEQ ID5和SEQ ID6。
2.用ApaL I部分酶切pMD18—ID2—NOS质粒，用0.8％琼脂糖电泳分离， 获得含有SEQID2和NOS终止子的载体片断后用EcoR I酶切。
3.将2中的目标片断分别与人工合成的基因SEQ ID5和SEQ ID6用T4连接 酶连接，过夜，用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。
4.用EcoR I和Sal I双酶切上述产物，获得SEQ ID16和SEQ ID17片断。
5.用EcoR I和Sal I双酶切pCAMBIA2300质粒，分别与SEQ ID16和SEQ ID17 片断用T4连接酶连接，过夜。导入农杆菌GV3101中。
步骤5转化拟南芥
1.当拟南芥开始开花，将花苔的基部剪断，待其侧枝抽苔后再用于转化。
2.将含有步骤3中构建的pCAMBIA2300表达载体农杆菌GV3101菌液，吸取 适量加入YEP(每升含10g胰蛋白胨，10g酵母抽提物，5gNaCl)/Gent(庆大 霉素80mg/L)+Kan(卡那霉素50mg/L)培养基中，28℃，250rpm培养36hr。
2.22℃，5500g离心20min，去上清，用转化介质(1/2×MS大量成分 (Murashige and Skoog，1962)，1/2×B5微量成分(Gamborg et al，1968)， 5％sucrose，0.05％silwet-77，44nM benzylaminopurine)重悬，调整OD值达 到0.8左右。
3.将刚开花的拟南芥倒立在转化介质中，浸30秒中，并轻轻摇动。
4.取出拟南芥，将叶、茎、花上多余的水珠抖落，平放在干净的塑料盆中， 并用薄膜覆盖闭光保湿16hr。
5.揭开薄膜，将拟南芥放置在日光灯下，光照强度80～110μmol.m-2.s-1， 并浇Hogland营养液(KNO35×10-3mol/L，KH2PO45×10-3mol/L，MgSO4·7H2O 4× 10-3mol/L，Ca(NO3)24×10-3mol/L，FeSO4·7H2O 5×10-5mol/L，Na2-EDTA 5×10-5 mol/L，MS微量成分(Murashige and Skoog，1962))，待其拟南芥角果完全 枯黄、开裂时，收获种子。
6.将消毒过的拟南芥种子移至含有Kan(50mg/L)的筛选平板上，均匀平铺， 并吸去平板内多余的水。
7.4’C春化2d，移至温室中，保证光照强度80～110μmol.m-2.s-1。
8.约10d之后已转入质粒的植株具有Kan抗性，所以子叶为绿色，下胚轴 较长，并已长出两片真叶。
9.将转化子移至已用营养液浇透的蛭石中，用薄膜保湿过夜，第二天移至 气候温室中，培养条件同5。
10.收获T2代种子，分析。
步骤6利用western blot检测人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在转基因 拟南芥中的表达。
1.蛋白的提取：a)取50mg叶片，加入100μl1×PBS(KH2PO4 0.2g/l，Na2HPO4 1.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于1.5ml离心管中研碎；b)13000g，4℃ 离心10分钟；c)取上清，备用(以上过程于冰上进行)。
2.蛋白质定量：参考Bradford法(Bradford，1976)。取2μl蛋白样品， 加入1mlBradford试剂，混匀后，分光光度计测OD595。
3.SDS—PAGE分离蛋白：SDS—PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等， 1989)：a)加样前，将样品置于含50mmol/LDTT的加样缓冲液(2×加样缓冲液： 甘油2.4g，1M Tris-HCl 1ml(pH6.8)；溴酚兰0.01％，H2O定容20ml)，煮沸 10分钟；c)室温100V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿 达到凝胶的底部。
4.蛋白质向硝酸纤维素膜上转移：a)转移之前，用缓冲液(39ml甘氨酸， 48mmol Tris-base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟； b)室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。
膜上蛋白检测：a)将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37℃缓慢摇动，封闭60 分钟(封闭液：取5克脱脂奶粉溶于100ml1×PBS(含0.5g叠氮钠))；b)再将 滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37℃洗涤两次，每次15分钟；c)加入第一抗体(抗 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤 三次；d)加入第二抗体(亲和素—碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟；同 步骤b)，洗涤两次；e)加入底物显色观察蛋白带。
实施例2 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在大豆品种合丰25中的表达
步骤1 pCAMBIA3300表达载体的构建
1.将携带合成基因的质粒载体pMD18—ID5和pMD18—ID6用EcoR I和ApaL I双酶切，切下目的基因SEQ ID5和SEQ ID6。
2.用ApaL I部分酶切pMD18—ID2—NOS质粒，用0.8％琼脂糖电泳分离， 获得含有SEQID2和NOS终止子的载体片断用EcoR I酶切。
3.将2中的目标片断分别与人工合成的基因SEQ ID5和SEQ ID6用T4连接 酶连接，过夜，用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。
4.用EcoR I和Sal I双酶切上述产物，获得SEQ ID16和SEQ ID17片断。
5.用EcoR I酶切pCAMBIA3300质粒，用T4DNA聚合酶补平，用Shrimp碱 性磷酸酶去磷酸化。
6.将上述片断分别与SEQ ID16和SEQ ID17片断用T4连接酶连接，过夜， 导入农杆菌LBA4404中。
步骤2 转化大豆品种合丰25
1.大豆种子经过消毒，放在MSB(MS大量成分(Murashige and Skoog， 1962)+B5微量成分(Gamborg et al，1968))+6-BA(6-苄氨基嘌 呤，6-benzylaminopurine)0.4mg/L(PH5.8)培养基上萌发5天，去顶芽并制造伤 口，得到外植体，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA 0.2mg/L(PH5.8)培养基预培养一 天。
2.真空条件下在104Pa负压条件下，实施列4中构建pCAMBIA3300表达载 体农杆菌LBA4404感染10～20分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA 1.0mg/L+ IBA 0.2mg/L(PH5.8)培养基上共培养3天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1 mg/L+头孢霉素300mg/L+羧苄青霉素300mg/L(PH＝5.8)培养基上除菌2周。
3.除菌后的外植体放在MSB+卡那霉素80mg/L(PH＝5.8)培养基上，每2周 转接一次，进行筛选至出现不定芽。伸长到1～2cm时切除子叶，至伸长到3～ 4cm。
4.切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH＝5.8)培 养基上，进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆直至获得转化植株产生的 种子。
5.收获T2代种子，进行分析。
蛋白的定量分析同实施例1中的步骤6
实施例3 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在大豆品种合丰42中的表达
步骤同实施例2，但转化的品种是大豆合丰42
实验结果表明，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子累积可以达到种子可溶性 蛋白的1％以上，能够在贮藏器官中累积具有生理活性的人粒细胞巨噬细胞集落 刺激因子。
SEQ ID NO.1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：962bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.1
gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac 60
aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttattaaa aaaatatgta 120
ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt 180
gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt 240
tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac 300
atattgttgg aaccatatga agtgttcatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc 360
catgcccttc atttgccgct attaattaat ttggtaacag attcgttcta atcagttact 420
taatccttcc tcatcataat taatctggta gttcgaatgc cataatattg attagttttt 480
tggaccataa gaaaaagcca aggaacaaaa gaagacaaaa cacaatgaga gtatcctttg 540
catagcaatg tctaagttca taaaattcaa acaaaaacgc aatcacacac agtggacatc 600
acttatccac tagctgatca ggatcgccgc gtcaagaaaa aaaaactgga ccccaaaagc 660
catgcacaac aacacgtact cacaaaggcg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac 720
tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc 780
ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac acccgtcaaa ctgcatccca ccccgtggcc 840
aaatgttcat gcatgttaac aagacctatg actataaata tctgcaatct cggcccaagt 900
tttcatcatc aagaaccagt tcaatatcct agtacgccgt attaaagaat ttaagatata 960
ct 962
SEQ ID NO.2的信息
(i)序列特征：
(A)长度：980bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.2
gttttcaaat ttgaatttta atgtgtsttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac 60
aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttaagaaa aaaatatgta 120
ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt 180
gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt 240
tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac 300
atattgttgg aaccatatga agtgtccatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc 360
caggcctcca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt 420
atccttcctc catcataatt aatcttggta gtctcgaatg ccacaacact gactagtctc 480
ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt 540
gcatagcaat gtctaagttc ataaaattca aacaaaaacg caatcacaca cagtggacat 600
cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaactgga ccccaaaagc 660
catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac 720
tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc 780
ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac accccgtcaa actgcatgcc accccgtggc 840
caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat atctgcaatc tcggcccaag 900
ttttcattat ttttacaaca attaccaaca acaacaaaca acaaacaaca ttacaattac 960
tatttacaat tacagtgcac 980
SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征：
(A)长度：536bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.3
tatttttaca acaattacca acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac 60
aattacagtg cacaatggct tcctccaact tactctccct agccctcttc cttgtgcttc 120
tcacccacgc aaactcagca cccgcccgct cgcccagccc cagcacgcag ccctgggagc 180
atgtgaatgc catccaggag gcccggcgtc tcctgaacct gagtagagac actgctgctg 240
agatgaatga aacagtagaa gtcatctcag aaatgtttga cctccaggag ccgacctgcc 300
tacagacccg cctggagctg tacaagcagg gcctgcgggg cagcctcacc aagctcaagg 360
gccccttgac catgatagcc agccactaca agcagcactg ccctccaacc ccggaaactt 420
cctgtgcaac ccagattatc acctttgaaa gtttcaaaga gaacctgaag gactttctgc 480
ttgtcatccc ctttgactgc tgggagccag tccaggagaa ggatgagctt tgatga 536
SEQ ID NO.4的信息
(i)序列特征：
(A)长度：536bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性；单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.4
tatttttaca acaattacca acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac 60
aattacagtg cacaatggct tcctccaact tactctccct agccctcttc cttgtgcttc 120
tcacccacgc aaactcagct ccagctagat ctccatctcc atctactcaa ccatgggagc 180
atgttaacgc tattcaagag gctagaagac ttcttaacct ttctagagat actgctgctg 240
agatgaacga gactgttgag gttatttctg agatgttcga tcttcaagag ccaacttgcc 300
ttcaaactag acttgagctt tataagcaag gacttagagg atctcttact aagcttaagg 360
gaccacttac tatgattgct tctcattata agcaacattg cccaccaact ccagagactt 420
cttgcgctac tcaaattatt actttcgagt ctttcaagga gaaccttaag gatttccttc 480
ttgttattcc attcgattgc tgggagccag ttcaagaggc tttcgtttac tgatga 536
SEQ ID NO.5的信息
(i)序列特征：
(A)长度：469bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.5
gtgcacaatg gcttcctcca acttactctc cctagccctc ttccttgtgc ttctcaccca 60
cgcaaactca gctccagcta gatctccatc tccatctact caaccatggg agcatgttaa 120
cgctattcaa gaggctagaa gacttcttaa cctttctaga gatactgctg ctgagatgaa 180
cgagactgtt gaggttattt ctgagatgtt cgatcttcaa gagccaactt gccttcaaac 240
tagacttgag ctttataagc aaggacttag aggatctctt actaagctta agggaccact 300
tactatgatt gcttctcatt ataagcaaca ttgcccacca actccagaga cttcttgcgc 360
tactcaaatt attactttcg agtctttcaa ggagaacctt aaggatttcc ttcttgttat 420
tccattcgat tgctgggagc cagttcaaga gaaggatgag ctttgatga 469
SEQ ID NO.6的信息
(i)序列特征：
(A)长度：469bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.6
gtgcacaatg gcttcctcca acttactctc cctagccctc ttccttgtgc ttctcaccca 60
cgcaaactca gctccagcta gatctccatc tccatctact caaccatggg agcatgttaa 120
cgctattcaa gaggctagaa gacttcttaa cctttctaga gatactgctg ctgagatgaa 180
cgagactgtt gaggttattt ctgagatgtt cgatcttcaa gagccaactt gccttcaaac 240
tagacttgag ctttataagc aaggacttag aggatctctt actaagctta agggaccact 300
tactatgatt gcttctcatt ataagcaaca ttgcccacca actccagaga cttcttgcgc 360
tactcaaatt attactttcg agtctttcaa ggagaacctt aaggatttcc ttcttgttat 420
tccattcgat tgctgggagc cagttcaaga ggctttcgtt tactgatga 469
SEQ ID NO.7的信息
(i)序列特征：
(A)长度：67bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.7
tatttttaca acaattacca acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac 60
aattaca 67
SEQ ID NO.8的信息
(i)序列特征：
(A)长度：63bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.8
atggcttcct ccaacttact ctccctagcc ctcttccttg tgcttctcac ccacgcaaac 60
tca 63
SEQ ID NO.9的信息
(i)序列特征：
(A)长度：12bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.9
gctttcgttt ac 12
SEQ ID NO.10的信息
(i)序列特征：
(A)长度：12bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.10
aaggatgagc tt 12
SEQ ID NO.11的信息
(i)序列特征：
(A)长度：277bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.11
gagctcgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc 60
tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat 120
aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca 180
attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc 240
gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg ggaattc 277
SEQ ID NO.12的信息
(i)序列特征：
(A)长度：25bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.12
gttttcaaat ttgaatttta atgtg 25
SEQ ID NO.13的信息
(i)序列特征：
(A)长度：60bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.13
gttgtttgtt gttgttggta attgttgtaa aaataatgaa aacttgggcc gagattgcag 60
SEQ ID NO.14的信息
(i)序列特征：
(A)长度：907bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.14
gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac 60
aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttaagaaa aaaatatgta 120
ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt 180
gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt 240
tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac 300
atattgttgg aaccatatga agtgtccatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc 360
caggcctcca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt 420
atccttcctc catcataatt aatcttggta gtctcgaatg ccacaacact gactagtctc 480
ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt 540
gcatagcaat gtctaagttc ataaaattca aacaaaaacg caatcacaca cagtggacat 600
cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaactgga ccccaaaagc 660
catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac 720
tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc 780
ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac accccgtcaa actgcatgcc accccgtggc 840
caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat atctgcaatc tcggcccaag 900
ttttcat 907
SEQ ID NO.15的信息
(i)序列特征：
(A)长度：56bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.15
gtgcactgta attgtaaata gtaattgtaa tgttgtttgt tgtttgttgt tgttgg 56
SEQ ID NO.16的信息
(i)序列特征：
(A)长度：1726bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.16
gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac 60
aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttaagaaa aaaatatgta 120
ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt 180
gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt 240
tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac 300
atattgttgg aaccatatga agtgtccatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc 360
caggcctcca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt 420
atccttcctc catcataatt aatcttggta gtctcgaatg ccacaacact gactagtctc 480
ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt 540
gcatagcaat gtctaagttc ataaaattca aacaaaaacg caatcacaca cagtggacat 600
cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaactgga ccccaaaagc 660
catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac 720
tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc 780
ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac accccgtcaa actgcatgcc accccgtggc 840
caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat atctgcaatc tcggcccaag 900
ttttcattat ttttacaaca attaccaaca acaacaaaca acaaacaaca ttacaattac 960
tatttacaat tacagtgcac aatggcttcc tccaacttac tctccctagc cctcttcctt 1020
gtgcttctca cccacgcaaa ctcagcaccc gcccgctcgc ccagccccag cacgcagccc 1080
tgggagcatg tgaatgccat ccaggaggcc cggcgtctcc tgaacctgag tagagacact 1140
gctgctgaga tgaatgaaac agtagaagtc atctcagaaa tgtttgacct ccaggagccg 1200
acctgcctac agacccgcct ggagctgtac aagcagggcc tgcggggcag cctcaccaag 1260
ctcaagggcc ccttgaccat gatagccagc cactacaagc agcactgccc tccaaccccg 1320
gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt tcaaagagaa cctgaaggac 1380
tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg gagccagtcc aggaggcttt cgtttactga 1440
tgaggtaccg agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag 1500
attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa 1560
gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag 1620
agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga 1680
taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattc 1726
SEQ ID NO.17的信息
(i)序列特征：
(A)长度：1726bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.17
gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac 60
aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttaagaaa aaaatatgta 120
ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt 180
gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt 240
tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac 300
atattgttgg aaccatatga agtgtccatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc 360
caggcctcca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt 420
atccttcctc catcataatt aatcttggta gtctcgaatg ccacaacact gactagtctc 480
ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt 540
gcatagcaat gtctaagttc ataaaattca aacaaaaacg caatcacaca cagtggacat 600
cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaactgga ccccaaaagc 660
catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac 720
tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc 780
ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac accccgtcaa actgcatgcc accccgtggc 840
caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat atctgcaatc tcggcccaag 900
ttttcattat ttttacaaca attaccaaca acaacaaaca acaaacaaca ttacaattac 960
tatttacaat tacagtgcac aatggcttcc tccaacttac tctccctagc cctcttcctt 1020
gtgcttctca cccacgcaaa ctcagcaccc gcccgctcgc ccagccccag cacgcagccc 1080
tgggagcatg tgaatgccat ccaggaggcc cggcgtctcc tgaacctgag tagagacact 1140
gctgctgaga tgaatgaaac agtagaagtc atctcagaaa tgtttgacct ccaggagccg 1200
acctgcctac agacccgcct ggagctgtac aagcagggcc tgcggggcag cctcaccaag 1260
ctcaagggcc ccttgaccat gatagccagc cactacaagc agcactgccc tccaaccccg 1320
gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt tcaaagagaa cctgaaggac 1380
tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg gagccagtcc aggagaagga tgagctttga 1440
tgaggtaccg agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag 1500
attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa 1560
gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag 1620
agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga 1680
taaattatcg cgcgcggtgtcatctatgtt actagatcgg gaattc 1726
SEQ ID NO.18的信息
(i)序列特征：
(A)长度：435bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.18
atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc 60
cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg 120
cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc 180
tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag 240
cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat agccagccac 300
tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt 360
gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag 420
ccagtccagg agtga 435
SEQ ID NO.19的信息
(i)序列特征：
(A)长度；127个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：多肽
(iii)序列描述：SEQ ID NO.19
APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV EVISEMFDLQ EPTCLQTRLE 60
LYKQGLRGSL TKLKGPLTMI ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFESFKENL KDFLLVIPFD 120
CWEPVQE 127
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明根据植物密码子的特点和植物 生理特性人工合成人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因，该基因 的5′非翻译端具有烟草花叶病毒的5′非翻译端的特征，起始密码子附近有植 物Kozak序列特点，该序列能够提高基因的起始效率和表达量，该基因的信号 肽被菜豆植物血球凝集素基因的信号肽取代，该基因的末端加上内质网导向信 号SEQ ID10多核苷酸序列，含有SEQ ID5多核苷酸序列。
所述的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子特异性表达的基因，在该基因的末 端加上液泡导向信号SEQ ID9多核苷酸序列，含有SEQ ID6多核苷酸序列。
所述的多核苷酸序列，包含有SEQ ID2，含有改造过的从大豆合丰39中克 隆出的β—伴大豆球蛋白α′亚单位启动子。
所述的基因序列，其构建的载体，转化植物细胞，表达出的人粒细胞巨噬 细胞集落刺激因子。其特征是，它包括成熟人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子氨 基酸多肽，或其保守区域，或其活性片断，或其活性的衍生物。
本发明具有能够在植物种子和贮藏器官中表达的特异性启动子，该启动子 是从大豆中克隆出来的并加以改造，与现在已知的β—伴大豆球蛋白α′亚单 位启动子的核苷酸序列不同，但与β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子有很 高的同源性，或者所述的多核苷酸能够在55℃条件下与SEQ ID1杂交。不同的 位置主要在集中在第350—500位核苷酸之间，以及第907—980位核苷酸，经 过改造的启动子能够在种子中特异高效表达，是一组织特异性启动子，它与β —伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子能够杂交，它具有SEQ ID2所述的多核苷 酸序列。
本发明具有适合在植物中表达的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子多核苷酸 序列，人工设计并合成的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，该基因具有烟 草花叶病毒5′非翻译端；菜豆植物血球凝集素的信号肽；起始位点附近有植物 Kozak特征序列；经过优化的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子成熟肽多核苷酸编 码区；末端加上内质网的导向信号，这是根据植物特点设计的，能够在植物表 达和累积人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，具体地说，是具有SEQ ID3多核苷酸 序列。
本发明还具有适合在植物中表达的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子多核苷 酸序列。人工设计并合成的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，该基因具有 烟草花叶病毒5′非翻译端；菜豆植物血球凝集素的信号肽；起始位点附近有植 物Kozak特征序列；经过优化的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子成熟肽多核苷 酸编码区；末端加上液泡的导向信号，这是根据植物特点设计的，能够在植物 中表达和累积人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，具体地说，是具有SEQ ID4多 核苷酸序列。
所述的载体，是本发明的克隆和表达载体，这些载体包括：结合有SEQ ID2 序列新的β—伴大豆球蛋白α′亚单位启动子pMD18—T载体；结合有SEQ ID2 序列新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子和胭脂碱合成酶基因(NOS)终 止子的pMD18—T载体；具有改造的人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID5多核苷 酸序列pMD18—T载体；具有改造的人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID6多核苷 酸序列pMD18—T载体；结合有新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，人 粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID5多核苷酸序列和NOS终止子的pMD18—T载体； 结合有新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，SEQ ID6多核苷酸序列和 NOS终止子pMD18—T载体；具有新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子， 人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID5多核苷酸序列和NOS终止子的pCAMBIA2300 表达载体；具有新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，人粒细胞巨噬细 胞刺激因子SEQ ID6多核苷酸序列和NOS终止子的pCAMBIA2300表达载体；具 有新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子，人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID5多核苷酸序列和NOS终止子pCAMBIA3300表达载体；具有新的β—伴大豆球 蛋白的α′亚单位启动子，人粒细胞巨噬细胞刺激因子SEQ ID6多核苷酸序列 和NOS终止子pCAMBIA3300表达载体。
所述的新的β—伴大豆球蛋白α′亚单位启动子是指：从大豆品种合丰39 中克隆出β—伴大豆球蛋白α′亚单位启动子转录起始位点下游第二个核苷酸 到上游904个核苷酸的基础上，用烟草花叶病毒5′非翻译端代替β—伴大豆球 蛋白α′亚单位基因的5′非翻译端。
所述的烟草花叶病毒5′非翻译端是指：烟草花叶病毒的RNA翻译起始位 点上游的序列(又叫Ω序列)，具体地说，是指具有所示SEQ ID7的多核苷酸序 列。
植物血球凝集素的信号肽序列是指菜豆(Phaseous Vulgaris)中植物血球 凝集素前端的21个氨基酸多肽，是由63个核苷酸编码。具体寡核苷酸序列见 SEQ ID8。
所述的Kozak序列是指：Kozak等人(1984)发现的，在植物或动物基因的 起始密码子ATG之前存在的特定序列。总结出在真核生物中，起始密码子周边 序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。
液泡导向信号，是指菜豆球蛋白(Phaseolin)C端一个短肽AFVY(Ala— Phe—Val—Tyr)，由12个核苷酸编码，具有SEQ ID9寡核苷酸序列，能够将多 肽导向液泡贮藏器官。
内质网导向信号，是指某些成熟蛋白C端4个氨基酸KDEL(Lys—Asp—Glu —Leu)短肽，由12个核苷酸编码，具有SEQ ID10寡核苷酸序列，将所连接的 多肽导向内质网。
胭脂碱合成酶基因(NOS)终止子，是指胭脂碱合成酶基因3′非翻译端的 多核苷酸序列，它的作用是提供转录终止信号，具有SEQ ID11寡核苷酸序列。
本发明人工设计并合成的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，在植物中 高效表达和累积人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。这些人工合成粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子为利用植物来生产人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子提供了一种 崭新的途径。本发明利用所述的载体转化宿主细胞，产生转基因后代植株。首 先将这些载体导入农杆菌中，用上述改造过的pCAMBIA2300表达载体转化拟南 芥，用上述改造过的pCAMBIA3300表达载体转化大豆。利用转基因植物生产药 用重组蛋白的成本，仅为利用大肠杆菌发酵生产成本的1/10～1/50。
具体的实施方式
下面结合具体的实施例子，进一步阐述本发明的具体实施方式。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等(1989)编著的 分子克隆实验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实验所用的pMD18—T载体是大 连TaKaRa公司产品，pCAMBIA2300和pCAMBIA2300是由澳大利亚CAMBIA实验室 提供。
实施例1 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在拟南芥中进行表达
步骤1新的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启动子获得
1.从大豆品种合丰39中用SEQ ID12和SEQ ID13所列的引物，用高保真的 Taq酶(购自大连TaKaRa公司公司)克隆出SEQ ID14，连入pMD18—T载体， 导入大肠杆菌DH5α，测序验证，与已报道的β—伴大豆球蛋白的α′亚单位启 动子有93％的同源性。
2.提取质粒，以SEQ ID14为模板，用SEQ ID12和SEQ ID15所列的引物， 克隆出SEQ ID2。连入pMD18—T载体，导入大肠杆菌DH5α，测序验证。
3.从pBI101质粒中用EcoR I和Sac I酶切下NOS终止子，连入含有上述 SEQ ID2的pMD18—T载体，组成含有SEQ ID2和NOS终止子的pMD18—T载体， 命名pMD18—ID2—NOS。
步骤2 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的人工合成
人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子选用植物偏爱的密码子和根据植物生理特 性，合成SEQ ID5和SEQ ID6之后连入载体pMD18—T，分别为pMD18—ID5和 pMD18—ID6。
步骤3 人粒细胞巨噬细胞序列信息和同源性分析
本发明的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因全长详见序列SEQ ID5和SEQ ID6，其中开放读框位于核苷酸第8—469位核苷酸，编码152个氨基酸，分子 量分别为17142和17137，等电点分别pI＝5.18和pI＝5.33。
将人工合成的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长序列及其编码的蛋白用 BLAST程序在Non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷 酸和蛋白同源性检索，结果发现在核苷酸水平上，它与人粒细胞巨噬细胞集落 刺激因子编码区(SEQ ID18)有64％的同源性。在氨基酸水平上，包含有人粒 细胞巨噬细胞集落刺激因子成熟肽的全部127个氨基酸(SEQ ID19)。
步骤4 pCAMBIA2300表达载体的构建
1.将携带合成基因的质粒载体pMD18—ID5和pMD18—ID6用EcoR I和ApaL I双酶切，切下目的基因SEQ ID5和SEQ ID6。
2.用ApaL I部分酶切pMD18—ID2—NOS质粒，用0.8％琼脂糖电泳分离， 获得含有SEQID2和NOS终止子的载体片断后用EcoR I酶切。
3.将2中的目标片断分别与人工合成的基因SEQ ID5和SEQ ID6用T4连接 酶连接，过夜，用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。
4.用EcoR I和Sal I双酶切上述产物，获得SEQ ID16和SEQ ID17片断。
5.用EcoR I和Sal I双酶切pCAMBIA2300质粒，分别与SEQ ID16和SEQ ID17 片断用T4连接酶连接，过夜。导入农杆菌GV3101中。
步骤5转化拟南芥
1.当拟南芥开始开花，将花苔的基部剪断，待其侧枝抽苔后再用于转化。
2.将含有步骤3中构建的pCAMBIA2300表达载体农杆菌GV3101菌液，吸取 适量加入YEP(每升含10g胰蛋白胨，10g酵母抽提物，5gNaCl)/Gent(庆大 霉素80mg/L)+Kan(卡那霉素50mg/L)培养基中，28℃，250rpm培养36hr。
2.22℃，5500g离心20min，去上清，用转化介质(1/2×MS大量成分 (Murashige and Skoog，1962)，1/2×B5微量成分(Gamborg et al，1968)， 5％sucrose，0.05％silwet-77，44nM benzylaminopurine)重悬，调整OD值达 到0.8左右。
3.将刚开花的拟南芥倒立在转化介质中，浸30秒中，并轻轻摇动。
4.取出拟南芥，将叶、茎、花上多余的水珠抖落，平放在干净的塑料盆中， 并用薄膜覆盖闭光保湿16hr。
5.揭开薄膜，将拟南芥放置在日光灯下，光照强度80～110μmol.m-2.s-1， 并浇Hogland营养液(KNO35×10-3mol/L，KH2PO45×10-3mol/L，MgSO4·7H2O 4× 10-3mol/L，Ca(NO3)24×10-3mol/L，FeSO4·7H2O 5×10-5mol/L，Na2-EDTA 5×10-5 mol/L，MS微量成分(Murashige and Skoog，1962))，待其拟南芥角果完全 枯黄、开裂时，收获种子。
6.将消毒过的拟南芥种子移至含有Kan(50mg/L)的筛选平板上，均匀平铺， 并吸去平板内多余的水。
7.4’C春化2d，移至温室中，保证光照强度80～110μmol.m-2.s-1。
8.约10d之后已转入质粒的植株具有Kan抗性，所以子叶为绿色，下胚轴 较长，并已长出两片真叶。
9.将转化子移至已用营养液浇透的蛭石中，用薄膜保湿过夜，第二天移至 气候温室中，培养条件同5。
10.收获T2代种子，分析。
步骤6利用western blot检测人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在转基因 拟南芥中的表达。
1.蛋白的提取：a)取50mg叶片，加入100μl1×PBS(KH2PO4 0.2g/l，Na2HPO4 1.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于1.5ml离心管中研碎；b)13000g，4℃ 离心10分钟；c)取上清，备用(以上过程于冰上进行)。
2.蛋白质定量：参考Bradford法(Bradford，1976)。取2μl蛋白样品， 加入1mlBradford试剂，混匀后，分光光度计测OD595。
3.SDS—PAGE分离蛋白：SDS—PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等， 1989)：a)加样前，将样品置于含50mmol/LDTT的加样缓冲液(2×加样缓冲液： 甘油2.4g，1M Tris-HCl 1ml(pH6.8)；溴酚兰0.01％，H2O定容20ml)，煮沸 10分钟；c)室温100V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿 达到凝胶的底部。
4.蛋白质向硝酸纤维素膜上转移：a)转移之前，用缓冲液(39ml甘氨酸， 48mmol Tris-base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟； b)室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。
膜上蛋白检测：a)将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37℃缓慢摇动，封闭60 分钟(封闭液：取5克脱脂奶粉溶于100ml1×PBS(含0.5g叠氮钠))；b)再将 滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37℃洗涤两次，每次15分钟；c)加入第一抗体(抗 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤 三次；d)加入第二抗体(亲和素—碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟；同 步骤b)，洗涤两次；e)加入底物显色观察蛋白带。
实施例2 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在大豆品种合丰25中的表达
步骤1 pCAMBIA3300表达载体的构建
1.将携带合成基因的质粒载体pMD18—ID5和pMD18—ID6用EcoR I和ApaL I双酶切，切下目的基因SEQ ID5和SEQ ID6。
2.用ApaL I部分酶切pMD18—ID2—NOS质粒，用0.8％琼脂糖电泳分离， 获得含有SEQID2和NOS终止子的载体片断用EcoR I酶切。
3.将2中的目标片断分别与人工合成的基因SEQ ID5和SEQ ID6用T4连接 酶连接，过夜，用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。
4.用EcoR I和Sal I双酶切上述产物，获得SEQ ID16和SEQ ID17片断。
5.用EcoR I酶切pCAMBIA3300质粒，用T4DNA聚合酶补平，用Shrimp碱 性磷酸酶去磷酸化。
6.将上述片断分别与SEQ ID16和SEQ ID17片断用T4连接酶连接，过夜， 导入农杆菌LBA4404中。
步骤2 转化大豆品种合丰25
1.大豆种子经过消毒，放在MSB(MS大量成分(Murashige and Skoog， 1962)+B5微量成分(Gamborg et al，1968))+6-BA(6-苄氨基嘌 呤，6-benzylaminopurine)0.4mg/L(PH5.8)培养基上萌发5天，去顶芽并制造伤 口，得到外植体，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA 0.2mg/L(PH5.8)培养基预培养一 天。
2.真空条件下在104Pa负压条件下，实施列4中构建pCAMBIA3300表达载 体农杆菌LBA4404感染10～20分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA 1.0mg/L+ IBA 0.2mg/L(PH5.8)培养基上共培养3天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1 mg/L+头孢霉素300mg/L+羧苄青霉素300mg/L(PH＝5.8)培养基上除菌2周。
3.除菌后的外植体放在MSB+卡那霉素80mg/L(PH＝5.8)培养基上，每2周 转接一次，进行筛选至出现不定芽。伸长到1～2cm时切除子叶，至伸长到3～ 4cm。
4.切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH＝5.8)培 养基上，进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆直至获得转化植株产生的 种子。
5.收获T2代种子，进行分析。
蛋白的定量分析同实施例1中的步骤6
实施例3 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在大豆品种合丰42中的表达
步骤同实施例2，但转化的品种是大豆合丰42
实验结果表明，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子累积可以达到种子可溶性 蛋白的1％以上，能够在贮藏器官中累积具有生理活性的人粒细胞巨噬细胞集落 刺激因子。
SEQ ID NO.1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：962bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.1
gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac 60
aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttattaaa aaaatatgta 120
ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt 180
gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt 240
tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac 300
atattgttgg aaccatatga agtgttcatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc 360
catgcccttc atttgccgct attaattaat ttggtaacag attcgttcta atcagttact 420
taatccttcc tcatcataat taatctggta gttcgaatgc cataatattg attagttttt 480
tggaccataa gaaaaagcca aggaacaaaa gaagacaaaa cacaatgaga gtatcctttg 540
catagcaatg tctaagttca taaaattcaa acaaaaacgc aatcacacac agtggacatc 600
acttatccac tagctgatca ggatcgccgc gtcaagaaaa aaaaactgga ccccaaaagc 660
catgcacaac aacacgtact cacaaaggcg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac 720
tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc 780
ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac acccgtcaaa ctgcatccca ccccgtggcc 840
aaatgttcat gcatgttaac aagacctatg actataaata tctgcaatct cggcccaagt 900
tttcatcatc aagaaccagt tcaatatcct agtacgccgt attaaagaat ttaagatata 960
ct 962
SEQ ID NO.2的信息
(i)序列特征：
(A)长度：980bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.2
gttttcaaat ttgaatttta atgtgtsttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac 60
aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttaagaaa aaaatatgta 120
ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt 180
gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt 240
tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac 300
atattgttgg aaccatatga agtgtccatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc 360
caggcctcca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt 420
atccttcctc catcataatt aatcttggta gtctcgaatg ccacaacact gactagtctc 480
ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt 540
gcatagcaat gtctaagttc ataaaattca aacaaaaacg caatcacaca cagtggacat 600
cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaactgga ccccaaaagc 660
catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac 720
tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc 780
ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac accccgtcaa actgcatgcc accccgtggc 840
caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat atctgcaatc tcggcccaag 900
ttttcattat ttttacaaca attaccaaca acaacaaaca acaaacaaca ttacaattac 960
tatttacaat tacagtgcac 980
SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征：
(A)长度：536bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.3
tatttttaca acaattacca acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac 60
aattacagtg cacaatggct tcctccaact tactctccct agccctcttc cttgtgcttc 120
tcacccacgc aaactcagca cccgcccgct cgcccagccc cagcacgcag ccctgggagc 180
atgtgaatgc catccaggag gcccggcgtc tcctgaacct gagtagagac actgctgctg 240
agatgaatga aacagtagaa gtcatctcag aaatgtttga cctccaggag ccgacctgcc 300
tacagacccg cctggagctg tacaagcagg gcctgcgggg cagcctcacc aagctcaagg 360
gccccttgac catgatagcc agccactaca agcagcactg ccctccaacc ccggaaactt 420
cctgtgcaac ccagattatc acctttgaaa gtttcaaaga gaacctgaag gactttctgc 480
ttgtcatccc ctttgactgc tgggagccag tccaggagaa ggatgagctt tgatga 536
SEQ ID NO.4的信息
(i)序列特征：
(A)长度：536bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性；单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.4
tatttttaca acaattacca acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac 60
aattacagtg cacaatggct tcctccaact tactctccct agccctcttc cttgtgcttc 120
tcacccacgc aaactcagct ccagctagat ctccatctcc atctactcaa ccatgggagc 180
atgttaacgc tattcaagag gctagaagac ttcttaacct ttctagagat actgctgctg 240
agatgaacga gactgttgag gttatttctg agatgttcga tcttcaagag ccaacttgcc 300
ttcaaactag acttgagctt tataagcaag gacttagagg atctcttact aagcttaagg 360
gaccacttac tatgattgct tctcattata agcaacattg cccaccaact ccagagactt 420
cttgcgctac tcaaattatt actttcgagt ctttcaagga gaaccttaag gatttccttc 480
ttgttattcc attcgattgc tgggagccag ttcaagaggc tttcgtttac tgatga 536
SEQ ID NO.5的信息
(i)序列特征：
(A)长度：469bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.5
gtgcacaatg gcttcctcca acttactctc cctagccctc ttccttgtgc ttctcaccca 60
cgcaaactca gctccagcta gatctccatc tccatctact caaccatggg agcatgttaa 120
cgctattcaa gaggctagaa gacttcttaa cctttctaga gatactgctg ctgagatgaa 180
cgagactgtt gaggttattt ctgagatgtt cgatcttcaa gagccaactt gccttcaaac 240
tagacttgag ctttataagc aaggacttag aggatctctt actaagctta agggaccact 300
tactatgatt gcttctcatt ataagcaaca ttgcccacca actccagaga cttcttgcgc 360
tactcaaatt attactttcg agtctttcaa ggagaacctt aaggatttcc ttcttgttat 420
tccattcgat tgctgggagc cagttcaaga gaaggatgag ctttgatga 469
SEQ ID NO.6的信息
(i)序列特征：
(A)长度：469bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.6
gtgcacaatg gcttcctcca acttactctc cctagccctc ttccttgtgc ttctcaccca 60
cgcaaactca gctccagcta gatctccatc tccatctact caaccatggg agcatgttaa 120
cgctattcaa gaggctagaa gacttcttaa cctttctaga gatactgctg ctgagatgaa 180
cgagactgtt gaggttattt ctgagatgtt cgatcttcaa gagccaactt gccttcaaac 240
tagacttgag ctttataagc aaggacttag aggatctctt actaagctta agggaccact 300
tactatgatt gcttctcatt ataagcaaca ttgcccacca actccagaga cttcttgcgc 360
tactcaaatt attactttcg agtctttcaa ggagaacctt aaggatttcc ttcttgttat 420
tccattcgat tgctgggagc cagttcaaga ggctttcgtt tactgatga 469
SEQ ID NO.7的信息
(i)序列特征：
(A)长度：67bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.7
tatttttaca acaattacca acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac 60
aattaca 67
SEQ ID NO.8的信息
(i)序列特征：
(A)长度：63bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.8
atggcttcct ccaacttact ctccctagcc ctcttccttg tgcttctcac ccacgcaaac 60
tca 63
SEQ ID NO.9的信息
(i)序列特征：
(A)长度：12bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.9
gctttcgttt ac 12
SEQ ID NO.10的信息
(i)序列特征：
(A)长度：12bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.10
aaggatgagc tt 12
SEQ ID NO.11的信息
(i)序列特征：
(A)长度：277bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.11
gagctcgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc 60
tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat 120
aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca 180
attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc 240
gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg ggaattc 277
SEQ ID NO.12的信息
(i)序列特征：
(A)长度：25bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.12
gttttcaaat ttgaatttta atgtg 25
SEQ ID NO.13的信息
(i)序列特征：
(A)长度：60bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.13
gttgtttgtt gttgttggta attgttgtaa aaataatgaa aacttgggcc gagattgcag 60
SEQ ID NO.14的信息
(i)序列特征：
(A)长度：907bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.14
gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac 60
aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttaagaaa aaaatatgta 120
ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt 180
gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt 240
tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac 300
atattgttgg aaccatatga agtgtccatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc 360
caggcctcca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt 420
atccttcctc catcataatt aatcttggta gtctcgaatg ccacaacact gactagtctc 480
ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt 540
gcatagcaat gtctaagttc ataaaattca aacaaaaacg caatcacaca cagtggacat 600
cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaactgga ccccaaaagc 660
catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac 720
tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc 780
ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac accccgtcaa actgcatgcc accccgtggc 840
caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat atctgcaatc tcggcccaag 900
ttttcat 907
SEQ ID NO.15的信息
(i)序列特征：
(A)长度：56bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.15
gtgcactgta attgtaaata gtaattgtaa tgttgtttgt tgtttgttgt tgttgg 56
SEQ ID NO.16的信息
(i)序列特征：
(A)长度：1726bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.16
gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac 60
aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttaagaaa aaaatatgta 120
ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt 180
gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt 240
tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac 300
atattgttgg aaccatatga agtgtccatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc 360
caggcctcca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt 420
atccttcctc catcataatt aatcttggta gtctcgaatg ccacaacact gactagtctc 480
ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt 540
gcatagcaat gtctaagttc ataaaattca aacaaaaacg caatcacaca cagtggacat 600
cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaactgga ccccaaaagc 660
catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac 720
tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc 780
ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac accccgtcaa actgcatgcc accccgtggc 840
caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat atctgcaatc tcggcccaag 900
ttttcattat ttttacaaca attaccaaca acaacaaaca acaaacaaca ttacaattac 960
tatttacaat tacagtgcac aatggcttcc tccaacttac tctccctagc cctcttcctt 1020
gtgcttctca cccacgcaaa ctcagcaccc gcccgctcgc ccagccccag cacgcagccc 1080
tgggagcatg tgaatgccat ccaggaggcc cggcgtctcc tgaacctgag tagagacact 1140
gctgctgaga tgaatgaaac agtagaagtc atctcagaaa tgtttgacct ccaggagccg 1200
acctgcctac agacccgcct ggagctgtac aagcagggcc tgcggggcag cctcaccaag 1260
ctcaagggcc ccttgaccat gatagccagc cactacaagc agcactgccc tccaaccccg 1320
gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt tcaaagagaa cctgaaggac 1380
tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg gagccagtcc aggaggcttt cgtttactga 1440
tgaggtaccg agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag 1500
attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa 1560
gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag 1620
agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga 1680
taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattc 1726
SEQ ID NO.17的信息
(i)序列特征：
(A)长度：1726bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.17
gttttcaaat ttgaatttta atgtgtgttg taagtataaa tttaaaataa aaataaaaac 60
aattattata tcaaaatggc aaaaacattt aatacgtatt atttaagaaa aaaatatgta 120
ataatatatt tatattttaa tatctattct tatgtatttt ttaaaaatct attatatatt 180
gatcaactaa aatattttta tatctacact tattttgcat ttttatcaat tttcttgcgt 240
tttttggcat atttaataat gactattctt taataatcaa tcattattct tacatggtac 300
atattgttgg aaccatatga agtgtccatt gcatttgact atgtggatag tgttttgatc 360
caggcctcca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt 420
atccttcctc catcataatt aatcttggta gtctcgaatg ccacaacact gactagtctc 480
ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt 540
gcatagcaat gtctaagttc ataaaattca aacaaaaacg caatcacaca cagtggacat 600
cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaactgga ccccaaaagc 660
catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac 720
tcaacccatc atgagcccac acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc 780
ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac accccgtcaa actgcatgcc accccgtggc 840
caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat atctgcaatc tcggcccaag 900
ttttcattat ttttacaaca attaccaaca acaacaaaca acaaacaaca ttacaattac 960
tatttacaat tacagtgcac aatggcttcc tccaacttac tctccctagc cctcttcctt 1020
gtgcttctca cccacgcaaa ctcagcaccc gcccgctcgc ccagccccag cacgcagccc 1080
tgggagcatg tgaatgccat ccaggaggcc cggcgtctcc tgaacctgag tagagacact 1140
gctgctgaga tgaatgaaac agtagaagtc atctcagaaa tgtttgacct ccaggagccg 1200
acctgcctac agacccgcct ggagctgtac aagcagggcc tgcggggcag cctcaccaag 1260
ctcaagggcc ccttgaccat gatagccagc cactacaagc agcactgccc tccaaccccg 1320
gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt tcaaagagaa cctgaaggac 1380
tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg gagccagtcc aggagaagga tgagctttga 1440
tgaggtaccg agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag 1500
attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa 1560
gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag 1620
agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga 1680
taaattatcg cgcgcggtgtcatctatgtt actagatcgg gaattc 1726
SEQ ID NO.18的信息
(i)序列特征：
(A)长度：435bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.18
atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc 60
cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg 120
cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc 180
tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag 240
cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat agccagccac 300
tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt 360
gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag 420
ccagtccagg agtga 435
SEQ ID NO.19的信息
(i)序列特征：
(A)长度；127个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：多肽
(iii)序列描述：SEQ ID NO.19
APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV EVISEMFDLQ EPTCLQTRLE 60
LYKQGLRGSL TKLKGPLTMI ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFESFKENL KDFLLVIPFD 120
CWEPVQE 127
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