粒－巨细胞集落刺激因子基因修饰的异基因肿瘤细胞疫苗
阅读：920发布：2020-05-11
专利汇可以提供粒－巨细胞集落刺激因子基因修饰的异基因肿瘤细胞疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及GM－CSF基因修饰的异基因 肿瘤 细胞系及其在制备肿瘤 疫苗 中的用途。本发明公开了GM－CSF基因修饰的异基因肿瘤细胞系及其在制备肿瘤疫苗中的用途。，下面是粒－巨细胞集落刺激因子基因修饰的异基因肿瘤细胞疫苗专利的具体信息内容。
1.一种GM-CSF基因修饰的异基因肿瘤细胞系。
2.权利要求1的肿瘤细胞系，其中所述肿瘤细胞系为肺癌细胞系LA795或 A549、乳腺癌细胞系MCF-7、胃癌细胞系803、结肠癌细胞系HCT-8或卵巢癌 细胞系SKOV3。
3.权利要求1或2的肿瘤细胞系，其中GM-CSF是通过真核表达载体 pIRES-EGFP转染到所述肿瘤细胞系中的。
4.权利要求1或2的肿瘤细胞系，其中GM-CSF是通过病毒载体转染到所 述肿瘤细胞系中的。
5.权利要求4的肿瘤细胞系，其中病毒载体为腺病毒或逆转录病毒。
6.疫苗组合物，其含有权利要求1-5中任一项的转基因肿瘤细胞系和任选 的可药用载体。
7.权利要求1-5中任一项的肿瘤细胞系或者权利要求6中的疫苗组合物在 制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
发明领域
本发明涉及粒-巨细胞集落刺激因子(以下称：GM-CSF)基因修饰的异基 因肿瘤细胞系及其在制备肿瘤疫苗中的用途。
发明背景
近年来，随着免疫学、分子生物学等技术的不断发展，我们欣喜地注意到 肿瘤疫苗已经走到了肿瘤治疗的前沿，并给广大患者带来了希望。应用自身的 灭活的肿瘤细胞作为抗原来治疗肿瘤已有上百年历史，但一直疗效不佳。近几 年来将自身的灭活的肿瘤细胞联合细胞因子进行治疗取得较大进展，大致的方 法是将患者自体肿瘤细胞通过基因载体转移细胞因子，成为可分泌细胞因子的 肿瘤细胞，再将其经致死剂量的放射线照射后皮内或皮下注射，成为肿瘤疫苗。 由于这些疫苗，通过基因转染使肿瘤细胞能够表达某些细胞因子或共刺激分子， 使得肿瘤细胞的免疫原性获得了大幅度的提高。其中又以转染GM-CSF基因效 果更好，通过GM-CSF转染到肿瘤细胞，使其表达GM-CSF蛋白，在注射局部 形成GM-CSF高浓度区域，从而使注射局部的抗原提呈细胞的功能大幅度增强。
鉴于目前大多数人类肿瘤细胞抗原类型仍未得到明确的鉴定，用全肿瘤细 胞作为疫苗的有效组分仍不失简单有效。自身肿瘤细胞作为疫苗已用于临床试 验，但在大规模的临床使用中，存在着几个问题：自体肿瘤疫苗需要利用患者 的肿瘤组织制备，病例选择和治疗次数受到取材的限制，而且花费较高；原代 肿瘤细胞在体外培养及基因转染等操作方面，存在较大困难；不同患者来源的 肿瘤细胞在遗传性状、基因转染效率等方面存在较大差异，难以质控等等，这 些因素限制了其广泛使用。
应用已建株的肿瘤细胞系具有独特的优势：①能够以较小的成本，克服自 体/异体肿瘤细胞取材难的问题；②其体外培养及基因转染等方面的技术趋于成 熟，可以提供表达稳定的抗原；③经治疗基因转染的肿瘤细胞系，其治疗因子 分泌量稳定，易于质控，因此更适合于开发及广泛应用。
到目前为止，有关应用GM-CSF基因转染异基因肿瘤细胞系制备瘤苗及其 机制研究及肿瘤疫苗与放化疗结合治疗肺癌的报道在国内外尚未见报道，本发 明人进行了这方面的研究，证明其在肿瘤主动免疫方面的有效性。
鉴于目前大多数人类肿瘤细胞抗原类型仍未得到明确的鉴定，用全肿瘤细 胞作为疫苗的有效组分仍不失简单有效。自身肿瘤细胞作为疫苗已用于临床试 验，但在大规模的临床使用中，存在着几个问题：自体肿瘤疫苗需要利用患者 的肿瘤组织制备，病例选择和治疗次数受到取材的限制，而且花费较高；原代 肿瘤细胞在体外培养及基因转染等操作方面，存在较大困难；不同患者来源的 肿瘤细胞在遗传性状、基因转染效率等方面存在较大差异，难以质控等等，这 些因素限制了其广泛使用。
应用已建株的肿瘤细胞系具有独特的优势：①能够以较小的成本，克服自 体/异体肿瘤细胞取材难的问题；②其体外培养及基因转染等方面的技术趋于成 熟，可以提供表达稳定的抗原；③经治疗基因转染的肿瘤细胞系，其治疗因子 分泌量稳定，易于质控，因此更适合于开发及广泛应用。
到目前为止，有关应用GM-CSF基因转染异基因肿瘤细胞系制备瘤苗及其 机制研究及肿瘤疫苗与放化疗结合治疗肺癌的报道在国内外尚未见报道，本发 明人进行了这方面的研究，证明其在肿瘤主动免疫方面的有效性。
发明内容
本发明一方面提供了一种GM-CSF基因修饰的异基因肿瘤细胞系。
本发明GM-CSF基因修饰的异基因肿瘤细胞系。其中所述肿瘤细胞系为肺 癌细胞系LA795或A549、乳腺癌细胞系MCF-7、胃癌细胞系803、结肠癌细胞 系HCT-8或卵巢癌细胞系SKOV3；其中GM-CSF是通过真核表达载体 pIRES-EGFP转染到所述肿瘤细胞系中的；其中GM-CSF是通过病毒载体转染到 所述肿瘤细胞系中的；其中病毒载体为腺病毒或逆转录病毒。
疫苗组合物，其含有上述任一项的转基因肿瘤细胞系和任选的可药用载 体。
上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
可用的肿瘤细胞系可以选自肺癌细胞系LA795或A549、乳腺癌细胞系 MCF-7、胃癌细胞系803、结肠癌细胞系HCT-8或卵巢癌细胞系SKOV3等等。
本发明主要是利用GM-CSF基因修饰的同种异体肿瘤疫苗(即肿瘤细胞系) 作为治疗手段，因此比较有意义的是来源于人的肿瘤细胞系。
GM-CSF基因表达载体转染人肿瘤细胞系，同样可以整合到基因组DNA并 稳定表达该细胞因子(如后面提供的GM-CSF基因克隆、转染及筛选的实验方 法)。
在该种疫苗的治疗效果评价方面，由于应用于临床治疗的时间较短，仅能 就免疫反应进行监测(如DTH、注射部位的反应等)，而疗效观察还在进行中。 因此，试验周期短的动物实验就提供了评价异体疫苗效果的一种方法，我们构 建了GM-CSF基因修饰的小鼠肺癌细胞系LA795疫苗，而同时以另外一种小鼠 肺癌细胞系LLC接种小鼠构建动物模型，从而模拟人的异体疫苗的情况，来评 价该疫苗的治疗效果。
实验中利用动物实验探讨的主要问题--是否可以应用同种异体肿瘤疫苗作 为治疗，所以采用一种小鼠细胞系LLC接种后，用LA795制备疫苗，检验其诱 导免疫反应以及抑制肿瘤生长的作用，因此动物实验的意义并不是检验LA795 疫苗的作用，而是探讨异体疫苗是否可以应用以及治疗的效果。
GM-CSF可以通过真核表达载体或病毒载体转染到所述肿瘤细胞系中。例 如，包括但不限于真核表达载体pIRES-EGFP、腺病毒或逆转录病毒。
本发明另一方面也提供了疫苗组合物，其含有前述的肿瘤细胞系，并任选 地含有可药用载体。其中肿瘤细胞系的合适的量为1×107/次；可药用载体的实 例如目前在国内已用于临床的Ad-P53(即腺病毒载体携带的野生型P53基因)， 其载体的使用剂量为1-2×1012VP/周，共4周(Peng Z.Current status of gendicine in China：recombinant human Ad-p53 agent for treatment of cancers.Hum Gene Ther 2005；16：1016-1027)；所述疫苗组合物用量需依据预防和/或治疗的目的、疾病 种类以及患者具体情况如年龄、性别、病史、体重等酌情使用，通常剂量范围 为1×106-1×108(其中，全细胞型肿瘤疫苗的剂量以转染并照射处理的肿瘤细 胞数来计算)；所述组合物可以配制成注射液；给药方式为真皮内注射；用药 频率一般每周一次，共5次。
本发明又一方面还提供了所述转基因肿瘤细胞系或疫苗组合物在制备预防 和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
附图的简短说明
图1.肿瘤疫苗的制备流程图。
图2.检测肿瘤疫苗的安全性及有效性的动物实验流程图。
图3.GM-CSF扩增、测序、克隆的电泳图。显示了GM-CSF扩增、测序和 克隆的结果。图3a为RT-PCR获得GM-CSF的cDNA电泳图，而图3b为PCR 获得GM-CSF的DNA序列扩增产物电泳图；图3c为连接有GM-CSF目的片段 的pIRES2-EGFP质粒酶切鉴定图；图3d为GM-CSF-pMD18-T质粒双酶切片段 的测序结果。
图4.免疫小鼠的生存期。
图5.免疫小鼠血清学细胞因子的变化。图5a，5b，5c分别显示了IL-4、IFN-γ、 IFN-β的水平变化。各图中，1为GM-CSF分泌性LA795瘤苗接种组；2为 GM-CSF分泌性LLC瘤苗接种组；3为LA795瘤苗接种组；4为LLC瘤苗接种 组；5为PBS对照组。
图6.免疫小鼠脾细胞的杀伤实验。图6a显示了未经分选脾细胞对作为抗 原的Lewis肺癌细胞系的杀伤率；图6b显示了分选的CD8+阳性脾细胞对所述 抗原的杀伤率。各图中，1为GM-CSF分泌性LA795瘤苗接种组；2为GM-CSF 分泌性LLC瘤苗接种组；3为LA795瘤苗接种组；4为LLC瘤苗接种组；5为 PBS对照组。
图7.免疫小鼠ELISOPT实验结果。
图8.免疫小鼠的接种部位免疫组化照片。
本发明GM-CSF基因修饰的异基因肿瘤细胞系。其中所述肿瘤细胞系为肺 癌细胞系LA795或A549、乳腺癌细胞系MCF-7、胃癌细胞系803、结肠癌细胞 系HCT-8或卵巢癌细胞系SKOV3；其中GM-CSF是通过真核表达载体 pIRES-EGFP转染到所述肿瘤细胞系中的；其中GM-CSF是通过病毒载体转染到 所述肿瘤细胞系中的；其中病毒载体为腺病毒或逆转录病毒。
疫苗组合物，其含有上述任一项的转基因肿瘤细胞系和任选的可药用载 体。
上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
可用的肿瘤细胞系可以选自肺癌细胞系LA795或A549、乳腺癌细胞系 MCF-7、胃癌细胞系803、结肠癌细胞系HCT-8或卵巢癌细胞系SKOV3等等。
本发明主要是利用GM-CSF基因修饰的同种异体肿瘤疫苗(即肿瘤细胞系) 作为治疗手段，因此比较有意义的是来源于人的肿瘤细胞系。
GM-CSF基因表达载体转染人肿瘤细胞系，同样可以整合到基因组DNA并 稳定表达该细胞因子(如后面提供的GM-CSF基因克隆、转染及筛选的实验方 法)。
在该种疫苗的治疗效果评价方面，由于应用于临床治疗的时间较短，仅能 就免疫反应进行监测(如DTH、注射部位的反应等)，而疗效观察还在进行中。 因此，试验周期短的动物实验就提供了评价异体疫苗效果的一种方法，我们构 建了GM-CSF基因修饰的小鼠肺癌细胞系LA795疫苗，而同时以另外一种小鼠 肺癌细胞系LLC接种小鼠构建动物模型，从而模拟人的异体疫苗的情况，来评 价该疫苗的治疗效果。
实验中利用动物实验探讨的主要问题--是否可以应用同种异体肿瘤疫苗作 为治疗，所以采用一种小鼠细胞系LLC接种后，用LA795制备疫苗，检验其诱 导免疫反应以及抑制肿瘤生长的作用，因此动物实验的意义并不是检验LA795 疫苗的作用，而是探讨异体疫苗是否可以应用以及治疗的效果。
GM-CSF可以通过真核表达载体或病毒载体转染到所述肿瘤细胞系中。例 如，包括但不限于真核表达载体pIRES-EGFP、腺病毒或逆转录病毒。
本发明另一方面也提供了疫苗组合物，其含有前述的肿瘤细胞系，并任选 地含有可药用载体。其中肿瘤细胞系的合适的量为1×107/次；可药用载体的实 例如目前在国内已用于临床的Ad-P53(即腺病毒载体携带的野生型P53基因)， 其载体的使用剂量为1-2×1012VP/周，共4周(Peng Z.Current status of gendicine in China：recombinant human Ad-p53 agent for treatment of cancers.Hum Gene Ther 2005；16：1016-1027)；所述疫苗组合物用量需依据预防和/或治疗的目的、疾病 种类以及患者具体情况如年龄、性别、病史、体重等酌情使用，通常剂量范围 为1×106-1×108(其中，全细胞型肿瘤疫苗的剂量以转染并照射处理的肿瘤细 胞数来计算)；所述组合物可以配制成注射液；给药方式为真皮内注射；用药 频率一般每周一次，共5次。
本发明又一方面还提供了所述转基因肿瘤细胞系或疫苗组合物在制备预防 和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
附图的简短说明
图1.肿瘤疫苗的制备流程图。
图2.检测肿瘤疫苗的安全性及有效性的动物实验流程图。
图3.GM-CSF扩增、测序、克隆的电泳图。显示了GM-CSF扩增、测序和 克隆的结果。图3a为RT-PCR获得GM-CSF的cDNA电泳图，而图3b为PCR 获得GM-CSF的DNA序列扩增产物电泳图；图3c为连接有GM-CSF目的片段 的pIRES2-EGFP质粒酶切鉴定图；图3d为GM-CSF-pMD18-T质粒双酶切片段 的测序结果。
图4.免疫小鼠的生存期。
图5.免疫小鼠血清学细胞因子的变化。图5a，5b，5c分别显示了IL-4、IFN-γ、 IFN-β的水平变化。各图中，1为GM-CSF分泌性LA795瘤苗接种组；2为 GM-CSF分泌性LLC瘤苗接种组；3为LA795瘤苗接种组；4为LLC瘤苗接种 组；5为PBS对照组。
图6.免疫小鼠脾细胞的杀伤实验。图6a显示了未经分选脾细胞对作为抗 原的Lewis肺癌细胞系的杀伤率；图6b显示了分选的CD8+阳性脾细胞对所述 抗原的杀伤率。各图中，1为GM-CSF分泌性LA795瘤苗接种组；2为GM-CSF 分泌性LLC瘤苗接种组；3为LA795瘤苗接种组；4为LLC瘤苗接种组；5为 PBS对照组。
图7.免疫小鼠ELISOPT实验结果。
图8.免疫小鼠的接种部位免疫组化照片。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明，而并不旨在以 任何方式限制本发明。
实施例1：GM-CSF基因的克隆
1.1GM-CSF基因的扩增
首先，取于-80℃冻存的人脾组织100mg，如Sambrook等《分子克隆：实 验室指南》，第二版，1989，F.M.Ausubel等编辑的《现代分子生物学实验》(Current Protocols In Molecular Biology)(1987)所述进行组织总RNA提取。
然后，以此为模板，设计引物进行RT-PCR实验。在GenBank检索人GM CSF 基因编码序列，确定扩增区域。GM-CSF基因编码序列CDS(33-467，gi：27437029)。 利用Olig6软件进行引物设计：
外上游引物P1 5’GGCTAAAGTTCTCTGGAGGATGTG 3’(SEQ ID NO：1)
外下游引物P2 5’CTCATCTGGCCGGTCTCACTC 3’(SEQ ID NO：2)
内上游引物P3 5’GAATTCATGTGGCTGCAGAGCCTG 3’(SEQ ID NO：3)
内下游引物P4 5’GGATCCTCACTCCTGGACTGGCTC 3’(SEQ ID NO：4)
PCR扩增引物由大连宝生物公司合成，其中P3携带BamH I酶切位点P4 携带EcoR I酶切位点，PCR扩增产物的长度为447bp。
配制如下反应体系，置于PE-9600型PCR仪中，72℃5min，然后立即置于 冰上。
在反应体系中加入以下试剂，置于PCR仪中，42℃1h。
接下来，利用巢式PCR扩增目的片段。
第一次PCR扩增：按照50μl体系配置PCR反应液
将上述各组分混合均匀，按照如下反应条件进行PCR扩增：预变性94℃3 分钟、变性94℃40秒、退火60℃1分钟、延伸72℃1分钟，经过30个循环后 再72℃10分钟。
第二次PCR扩增：按照50μl体系配置PCR反应液：
将上述各组分混合均匀进行PCR扩增反应。反应条件：预变性94℃3分钟、 变性94℃40秒、退火62℃1分钟、延伸72℃1分钟，经过30个循环后再72℃ 10分钟。
PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳检测。选取在符合目的基因大小处有明显条 带的PCR产物进行纯化以及下一步的实验。以P1为引物，以总RNA为模板， 进行RT时获得GM-CSF的cDNA电泳图见图3a，而以P3和P4为引物，进行 PCR扩增时获得GM-CSF的DNA序列扩增产物电泳图见图3b。
1.2扩增的GM-CSF基因的验证
将前述纯化的PCR产物与pMD18-T载体(Promega)用T4DAN连接酶于 4℃过夜连接。取重组质粒，通过电转化或氯化钙法对感受态菌株DH5α(日本 TaKaRa公司)进行转化。借助于蓝白斑鉴定筛选含重组质粒的载体。挑取白色 菌落，接种，37℃摇床250rpm振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒，EcoRI+BamH I双酶切，然后进行电泳鉴定，并送宝生物公司进行测序验证，GM-CSF-pMD18-T 质粒双酶切片段的测序结果见图3d。
1.3GM-CSF基因的克隆即表达载体的构建
含GM-CSF的目的质粒经扩增提取后，利用限制性内切酶EcoR I+BamH I 切割，与经同样双酶切的真核表达载体pIRES-EGFP(购自Invitrogen)以大约4∶1 的摩尔比利用T4DNA连接酶于4℃过夜连接，反应体系如下：
10×T4 Ligation buffer 2μl
T4 ligase 2μl
目的基因片段 8μl
pIRES2-EGFP载体片段 8μl
同前文所述，取连接产物直接转化感受态细菌DH5α，筛选重组质粒，酶 切电泳鉴定，连接有GM-CSF目的片段的pIRES2-EGFP质粒酶切鉴定如图3c 所示。
为构建病毒表达载体，以类似方法切割购自Clontech公司AdEasy腺病毒载 体系统或逆转录病毒载体pLNCX，后续的连接和回收步骤同上，所得重组载体 同样可用于重复实施以下各实验。载体为常用载体。
实施例2：GM-CSF基因修饰的异基因肿瘤细胞系的制备
转染方法
将状态良好的肿瘤细胞以1.5×106/孔接种于35mm六孔板中，以2ml含有 10％胎牛血清的RPMI 1640培养液37℃、5％CO2、培养18～24h，使转染当日细 胞达到90～95％互相接触。
对每个转染孔，按如下方法准备脂质体复合物：
DNA稀释液制备：将来自实施例1的DNA 4μg溶于250μl Opti-I 无抗生素、无血清培养基中，轻柔混匀；脂质体稀释液制备：使用前轻柔混匀 Lipofectamine T M 2000，取10μl用Opti-I无抗生素、无血清培养基稀 释至250μl，轻柔混匀。室温孵育5min后，将脂质体稀释液与DNA稀释液混 合在一起，室温孵育20min以形成DNA-LipofectamineTM 2000复合物。
将这500μl DNA-Lipofectamine T M 2000复合物加入到一个含培养基和细 胞的孔中，轻晃培养板以使其混匀。5％CO2的37℃温箱中孵育6小时。弃去培 养液，用无血清培养基洗涤3次，加入完全培养基孵育。
筛选策略
G418筛选
抗性克隆的筛选：
将转染细胞进行传代，生长24h后，更换为选择性培养基(5％小牛血清并 含有600ug/ml G418)继续培养。间隔2～3d换液一次，待对照细胞全部死亡 时，已基本得到G418抗性LA795细胞的克隆，挑取单个细胞的克隆继续进行 筛选扩增，即为G418抗性的LA795细胞。
抗性克隆的鉴定：从基因和蛋白水平检测GM-CSF的表达。
基因水平的检测：用SDS/蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提的方法制备细胞 基因组DNA，PCR方法扩增GM-CSF基因。结果可见GM-CSF基因的表达。
蛋白水平的检测：ELISA方法检测GM-CSF基因分泌，收获细胞培养上清 液，ELISA方法测定106细胞24h内的GM-CSF分泌量，结果GM-CSF分泌 /106/24h＞400ng。ELISA实验方法：除空白孔外每孔加入样品或标准品100μl， 37℃孵箱孵育90min。洗板，加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)，37℃孵 箱孵育60min。洗板，加入酶结合物工作液(100l/孔)，37℃孵箱孵育30min。 洗板，加入显色剂100μl/孔，避光，37℃孵育10-25min。加入终止液100μl/ 孔，混匀，5min内以酶标仪测量OD450值。绘制标准曲线，并计算样品中GM-CSF 的浓度。
依据本实施例中的方法，分别成功筛选到GM-CSF基因修饰的肺癌细胞系 A549、乳腺癌细胞系MCF-7、胃癌细胞系803、结肠癌细胞系HCT-8或卵巢癌 细胞系SKOV3。
上述的A549为人肺癌细胞系，接种正常动物模型不能形成移植瘤，而接种 裸鼠虽可成瘤，但裸鼠为免疫缺陷型，接种疫苗后不能产生正常的免疫反应， 此为肿瘤疫苗的动物实验中难以解决的问题。在此，可以补充GM-CSF基因修 饰异体肿瘤细胞疫苗接种人体的情况。
GM-CSF基因修饰异体肿瘤细胞疫苗接种后，患者注射部位不同程度的红 肿等炎症反应，红肿硬结的直径可达2-3cm，周围发红的区域直径可达10-30cm； 未出现发热、流感样症状及其他不良反应。注射部位皮肤行病理检测，可见大 量淋巴细胞等单个核细胞在腺体、血管等周围浸润；免疫组化染色可见CD3+和 CD8+细胞较多。并且治疗后患者DTH反应为阳性(DTH是目前检测体内特异 性免疫反应的常规方法)。
实施例3：小鼠肿瘤疫苗的制备和接种
实验小鼠为清洁级近交系C57BL/6(H-2Kb，雌性)，8-12周龄，体重18-22g， 购自北京维通利华动物中心。
以接种Lewis Lung Cancer(LLC)的C57小鼠作为动物模型，如实施例2所 述方法分别以LLC和LA795细胞制备GM-CSF基因修饰的自体和异体肿瘤疫 苗。
接种疫苗的步骤：在无菌条件下，取细胞系肿瘤疫苗(小鼠GM-CSF基因 修饰LA795细胞疫苗)0.1ml(107)悬液，注射与小鼠左后肢内侧皮下，不需 麻醉，每7天重复1次，共3次。对照小鼠注射相同体积的PBS、未经GM-CSF 基因修饰的LLC或LA795瘤苗。分别按照如下实施例4-8的操作评估各项疗效 指标。
实施例4：肿瘤疫苗接种小鼠的成瘤时间、肿瘤体积及生存时间
治疗开始后，由专人用游标卡尺每3天测量肿瘤的最大径(A)和垂直径(B)， 根据公式1/6πAB2计算肿瘤体积(A＞B)，并记录小鼠的成瘤时间和生存期。
有关小鼠生存期结果参见图4，各组小鼠在给予三次瘤苗接种后第7天给予 肿瘤接种，剂量为1×107，接种后观察接种后的存活时间，相对于PBS对照组， 单纯LA795和LLC接种组的小鼠荷瘤存活时间并无明显延长(P＞0.05)，而 GM-CSF分泌性的自体或同种异体肿瘤疫苗组的荷瘤存活时间却明显被延长 (P＜0.01)。通过这种预防接种，发现与PBS对照组以及单纯LA 795和LLC接 种组相比，经GM-CSF基因修饰的LLC和LA795瘤苗接种后，成瘤时间明显 推迟，肿瘤生长延缓，主要体现在接种后出现可测量肿瘤的时间推迟，并且同 期相比的肿瘤体积小于对照组。同成瘤时间相似的是，GM-CSF分泌性的LLC (自体)瘤苗接种组的生存期有长于LA795(同种异体)瘤苗接种组的趋势， 但无显著性差异(P＞0.05)。
从以上结果可以看出，GM-CSF基因修饰的异基因瘤苗能够有效地诱导抗 肿瘤免疫活性，抑制肿瘤的生长，延长生存期。
实施例5：小鼠血清学细胞因子的变化
各组小鼠分别于肿瘤疫苗接种前、每次接种瘤苗前及最后一次接种瘤苗后7 天，处死小鼠3只，各经眼球取血约0.6-1ml，用于血清学指标检测，利用ELISA 法检测小鼠血清IFN-γ、IL-4的分泌水平。简言之，监测小鼠疫苗接种前后血清 IFN-γ、IL-4分泌水平的变化。
以上细胞因子检测ELISA试剂盒购自Bender公司(Austrian)。
在预先包被抗体的96孔板加入标准品和实验样品(每孔100ul)，37℃孵育 90min；弃去液体并用Washing Buffer洗板5次，加入生物素标记抗体，孵育 60min；洗板，加入HRP孵育30min；洗板，加入显色液孵育10min；加终止液 (2N HCl)终止反应，于450nm检测吸光度。以标准品的吸光度绘制标准曲线， 并根据标准曲线计算样品中相应细胞因子的浓度。
结果见图5a-5b，图中，1为GM-CSF分泌性LA795瘤苗接种组，2为GM-CSF 分泌性LLC瘤苗接种组，3为LA795瘤苗接种组，4为LLC瘤苗接种组，5为 PBS对照组。可见各组中随肿瘤疫苗的注射，其血清IL-4水平并无明显变化 (P＞0.05)，各组之间的血清IL-4水平也无显著性差异(P＞0.05)。可见各组中 随肿瘤疫苗的注射，其血清IFN-γ水平变化明显(P＞0.05)；IFN-γ水平尤以第3 次注射后增高明显(其中自体瘤苗组比同种异体组的IFN-γ高，但无显著性差 异)；其中GM-CSF分泌性自体和同种异体瘤苗组的IFN-γ水平随注射次数的增 加变化明显，远高于其他各组(P＜0.01)，而无GM-CSF分泌性的自体或同种异 体瘤苗组的IFN-γ水平的升高远不及有GM-CSF的分泌组明显；PBS对照组 IFN-γ水平注射前后无明显变化。
从以上结果可以看出，GM-CSF基因修饰的异基因瘤苗与自体瘤苗一样能 够有效地诱导血清Th1类细胞因子的升高。
Th1升高的意义：CD4+的辅助性T细胞即Th细胞，而Th细胞又可向Th1 和Th2两个方向分化，Th1类细胞主要分泌IFN-γ，IL-2等细胞因子，而Th2类 细胞则分泌IL-4，IL-10等。肿瘤患者体内大多出现Th2偏移，在形成肿瘤导致 的免疫抑制当中具有重要的作用。通过免疫治疗调节该现象，使其Th1方向漂 移，即本研究中检测到的Th1类细胞因子升高，而Th2类细胞因子无显著变化， 这种Th1漂移的现象有利于诱导有效的免疫反应。
实施例6：免疫小鼠脾细胞的杀伤实验
小鼠外周血免疫细胞亚群的分布
预防组各组小鼠分别于肿瘤疫苗接种前、每次接种瘤苗前及最后一次接种 瘤苗后7天，处死小鼠3只，各取脾细胞制备成匀浆，利用流式细胞仪(BD Pharmingen)通过流式细胞术检测各细胞亚群的分布：CD4-FITC/CD3-PE、 CD8-FITC/CD3-PE、CD4-FITC/CD25-PE。
表1.各组小鼠流式细胞检测的淋巴细胞亚群比例(％)
免疫小鼠脾细胞的杀伤实验结果
然后使用LDH法检测瘤苗接种后小鼠脾细胞对肿瘤细胞的杀伤活性 (Program)：以Lewis肺癌细胞系作为抗原进行重复刺激，观察效应细胞对抗原 的杀伤比率(图6a)。进而对脾细胞进行CD8+阳性分选，以此CD8+细胞作为 效应细胞对含有特异性抗原的肿瘤细胞进行杀伤实验(图6b)。图中，1为 GM-CSF分泌性LA795瘤苗接种组，2为GM-CSF分泌性LLC瘤苗接种组，3 为LA795瘤苗接种组，4为LLC瘤苗接种组，5为PBS对照组。可见各组中随 肿瘤疫苗的注射，其脾细胞(效应细胞)对抗原的杀伤能力不断增强(P＜0.01)， 尤以第3次免疫后的增强最为明显(P＜0.01)；其中GM-CSF分泌性自体和同种 异体瘤苗组的效应细胞的杀伤特定抗原的能力增加明显，远高于其他各组 (P＜0.01)；而无GM-CSF分泌性的自体或同种异体瘤苗组的效应细胞的杀伤能 力的升高远不及有GM-CSF的分泌组明显；PBS对照组注射前后无明显变化； 经CD8+分选后各组的效应细胞的杀伤实验亦证实肿瘤疫苗可以有效诱导抗原 特异性的CD8+CTL细胞，对相应靶细胞产生特异性杀伤作用。
从以上结果可以看出，GM-CSF基因修饰的异基因瘤苗同自体瘤苗一样能 够有效地刺激机体淋巴细胞特别是CD8+CTL细胞对“自体”肿瘤细胞的杀伤活 性。
实施例7：免疫小鼠的ELISOPT实验结果
免疫斑点实验(ELISOPT)检测脾细胞活化，即分泌IFN-γ的细胞数量(BD Bioscience)。简言之，应用ELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞经LLC肺癌抗原 刺激后的活化。
ELISPOT的实验步骤(针对LA795瘤苗的动物实验)：
每孔加入50μL MagiTM Coating Buffer稀释好的包被抗体，4℃过夜。倾倒 包被液，用PBS洗涤3次，在灭菌的吸水纸上扣干。加入200μL稀释好的封 闭液，37℃封闭1h后，倾倒封闭液。接种细胞(100μL/well)，实验组：1×106 细胞/well，同时加入刺激物即抗原(本实验中为放射灭活后的LLC细胞)；背景 负对照孔加入100μL的Lympho-SpotTM无血清培养基；正对照孔1×104细胞 /well同时加入10μL PHA(终浓度1-4ug/mL)。37℃培养18-24h，倾倒孔内的 细胞及培养基。每孔加入200μL冰冷的去离子水，冰浴10min。每孔用200μLPBS 洗涤10次，在吸水纸上扣干。每孔加入100μL稀释好的生物素标记检测抗体， 37℃孵育1h。每孔用200μLPBS洗涤5次，在吸水纸上扣干。每孔加入100μL 酶标亲和素工作液，37℃孵育1小时。每孔用200μL PBS洗涤5次，在吸水纸 上扣干。每孔加入100μL的AEC显色液，室温避光静置15-45min，待斑点形 成到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水 纸上拍干之后取下保护层，在通风处室温静置10-30min，让膜自然晾干。将 ELISPOT板置于Biosys Bioreader4000PRO自动读板仪内分析。
治疗组小鼠在免疫接种前和第3次免疫接种后7天，分别处死小鼠，取脾 进行ELISPOT实验。加入抗原LLC肺癌细胞后，可见小鼠效应细胞被特异性抗 原活化在预防组各组小鼠中免疫后活化细胞数量明显增加(P＜0.01)，免疫后 GM-CSF分泌性瘤苗组的活化明显高于其他组(P＜0.01)。
从以上结果可以看出，GM-CSF基因修饰的异基因瘤苗同自体瘤苗一样能 够有效地刺激脾淋巴细胞对“自体”肿瘤细胞抗原的活化，即可以诱导产生针 对“自体”肿瘤细胞的特异性免疫反应。
实施例8：免疫小鼠接种部位淋巴细胞浸润情况
以常规HE染色及免疫组化染色，简言之，以免疫组化法检测疫苗接种部位 的淋巴细胞浸润情况。
HE染色：
切片在二甲苯中脱蜡5～10分钟。移入二甲苯和纯酒精(1∶1)混合液中5 分钟左右。依次放入100％、95％、85％、70％酒精，各级分别为2～5分钟， 最后经蒸馏水转入染液。苏木精染液染色5～15分钟。水洗玻片上多余染液， 0.5～1％盐酸酒精(70％酒精配制)分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染 色质清晰为止，约10秒钟。流水冲洗15～30分钟；或者在碳酸锂饱和液中短 时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色，蒸馏水短洗。0.1～0.5％伊红染液染色1～5 分钟。依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3分钟。二甲苯 透明(二次)，共约10分钟。封片。
免疫组化：
组织切片脱蜡、水化后，PBS洗2～3次各5分钟。滴加3％H2O2，室温静 置10分钟；PBS洗2～3次各5分钟。抗原修复，PBS洗。滴加正常山羊血清 封闭液，室温20分钟，甩去多余液体。滴加I抗50μl，室温静置1小时或者4℃ 过夜或者37℃1小时。PBS洗3次各5分钟；滴加II抗40～50μl，室温静置， 或37℃1小时(II抗中可加入0.05％的tween-20)。PBS洗3次各5分钟；DAB 显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度。PBS或自来水冲洗10分钟；苏木 精复染2分钟，盐酸酒精分化；自来水冲洗10～15分钟。脱水、透明、封片、 镜检。
接种部位免疫组化照片见图8，通过比较可知，GM-CSF基因修饰自体或异 体肿瘤疫苗注射部位可见明显的CD8+T细胞浸润，而对照组未见淋巴细胞浸润 现象。从以上结果可以看出，GM-CSF基因修饰的异基因瘤苗同自体瘤苗一样 能够有效地诱导CD8+T细胞的趋化和浸润，即刺激局部的CTL细胞介导的免 疫反应。
序列表
<110>天津肿瘤医院
<120>GM-CSF基因修饰的异基因肿瘤细胞疫苗
<130>tj002
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>misc_feature
<223>外上游引物P1
<400>1
ggctaaagtt ctctggagga tgtg 24
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>misc_feature
<223>外下游引物P2
<400>2
ctcatctggc cggtctcact c 21
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>misc_feature
<223>内上游引物P3
<400>3
gaattcatgt ggctgcagag cctg 24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>misc_feature
<223>内下游引物P4
<400>4
ggatcctcac tcctggactg gctc 24
实施例1：GM-CSF基因的克隆
1.1GM-CSF基因的扩增
首先，取于-80℃冻存的人脾组织100mg，如Sambrook等《分子克隆：实 验室指南》，第二版，1989，F.M.Ausubel等编辑的《现代分子生物学实验》(Current Protocols In Molecular Biology)(1987)所述进行组织总RNA提取。
然后，以此为模板，设计引物进行RT-PCR实验。在GenBank检索人GM CSF 基因编码序列，确定扩增区域。GM-CSF基因编码序列CDS(33-467，gi：27437029)。 利用Olig6软件进行引物设计：
外上游引物P1 5’GGCTAAAGTTCTCTGGAGGATGTG 3’(SEQ ID NO：1)
外下游引物P2 5’CTCATCTGGCCGGTCTCACTC 3’(SEQ ID NO：2)
内上游引物P3 5’GAATTCATGTGGCTGCAGAGCCTG 3’(SEQ ID NO：3)
内下游引物P4 5’GGATCCTCACTCCTGGACTGGCTC 3’(SEQ ID NO：4)
PCR扩增引物由大连宝生物公司合成，其中P3携带BamH I酶切位点P4 携带EcoR I酶切位点，PCR扩增产物的长度为447bp。
配制如下反应体系，置于PE-9600型PCR仪中，72℃5min，然后立即置于 冰上。
在反应体系中加入以下试剂，置于PCR仪中，42℃1h。
接下来，利用巢式PCR扩增目的片段。
第一次PCR扩增：按照50μl体系配置PCR反应液
将上述各组分混合均匀，按照如下反应条件进行PCR扩增：预变性94℃3 分钟、变性94℃40秒、退火60℃1分钟、延伸72℃1分钟，经过30个循环后 再72℃10分钟。
第二次PCR扩增：按照50μl体系配置PCR反应液：
将上述各组分混合均匀进行PCR扩增反应。反应条件：预变性94℃3分钟、 变性94℃40秒、退火62℃1分钟、延伸72℃1分钟，经过30个循环后再72℃ 10分钟。
PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳检测。选取在符合目的基因大小处有明显条 带的PCR产物进行纯化以及下一步的实验。以P1为引物，以总RNA为模板， 进行RT时获得GM-CSF的cDNA电泳图见图3a，而以P3和P4为引物，进行 PCR扩增时获得GM-CSF的DNA序列扩增产物电泳图见图3b。
1.2扩增的GM-CSF基因的验证
将前述纯化的PCR产物与pMD18-T载体(Promega)用T4DAN连接酶于 4℃过夜连接。取重组质粒，通过电转化或氯化钙法对感受态菌株DH5α(日本 TaKaRa公司)进行转化。借助于蓝白斑鉴定筛选含重组质粒的载体。挑取白色 菌落，接种，37℃摇床250rpm振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒，EcoRI+BamH I双酶切，然后进行电泳鉴定，并送宝生物公司进行测序验证，GM-CSF-pMD18-T 质粒双酶切片段的测序结果见图3d。
1.3GM-CSF基因的克隆即表达载体的构建
含GM-CSF的目的质粒经扩增提取后，利用限制性内切酶EcoR I+BamH I 切割，与经同样双酶切的真核表达载体pIRES-EGFP(购自Invitrogen)以大约4∶1 的摩尔比利用T4DNA连接酶于4℃过夜连接，反应体系如下：
10×T4 Ligation buffer 2μl
T4 ligase 2μl
目的基因片段 8μl
pIRES2-EGFP载体片段 8μl
同前文所述，取连接产物直接转化感受态细菌DH5α，筛选重组质粒，酶 切电泳鉴定，连接有GM-CSF目的片段的pIRES2-EGFP质粒酶切鉴定如图3c 所示。
为构建病毒表达载体，以类似方法切割购自Clontech公司AdEasy腺病毒载 体系统或逆转录病毒载体pLNCX，后续的连接和回收步骤同上，所得重组载体 同样可用于重复实施以下各实验。载体为常用载体。
实施例2：GM-CSF基因修饰的异基因肿瘤细胞系的制备
转染方法
将状态良好的肿瘤细胞以1.5×106/孔接种于35mm六孔板中，以2ml含有 10％胎牛血清的RPMI 1640培养液37℃、5％CO2、培养18～24h，使转染当日细 胞达到90～95％互相接触。
对每个转染孔，按如下方法准备脂质体复合物：
DNA稀释液制备：将来自实施例1的DNA 4μg溶于250μl Opti-I 无抗生素、无血清培养基中，轻柔混匀；脂质体稀释液制备：使用前轻柔混匀 Lipofectamine T M 2000，取10μl用Opti-I无抗生素、无血清培养基稀 释至250μl，轻柔混匀。室温孵育5min后，将脂质体稀释液与DNA稀释液混 合在一起，室温孵育20min以形成DNA-LipofectamineTM 2000复合物。
将这500μl DNA-Lipofectamine T M 2000复合物加入到一个含培养基和细 胞的孔中，轻晃培养板以使其混匀。5％CO2的37℃温箱中孵育6小时。弃去培 养液，用无血清培养基洗涤3次，加入完全培养基孵育。
筛选策略
G418筛选
抗性克隆的筛选：
将转染细胞进行传代，生长24h后，更换为选择性培养基(5％小牛血清并 含有600ug/ml G418)继续培养。间隔2～3d换液一次，待对照细胞全部死亡 时，已基本得到G418抗性LA795细胞的克隆，挑取单个细胞的克隆继续进行 筛选扩增，即为G418抗性的LA795细胞。
抗性克隆的鉴定：从基因和蛋白水平检测GM-CSF的表达。
基因水平的检测：用SDS/蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提的方法制备细胞 基因组DNA，PCR方法扩增GM-CSF基因。结果可见GM-CSF基因的表达。
蛋白水平的检测：ELISA方法检测GM-CSF基因分泌，收获细胞培养上清 液，ELISA方法测定106细胞24h内的GM-CSF分泌量，结果GM-CSF分泌 /106/24h＞400ng。ELISA实验方法：除空白孔外每孔加入样品或标准品100μl， 37℃孵箱孵育90min。洗板，加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)，37℃孵 箱孵育60min。洗板，加入酶结合物工作液(100l/孔)，37℃孵箱孵育30min。 洗板，加入显色剂100μl/孔，避光，37℃孵育10-25min。加入终止液100μl/ 孔，混匀，5min内以酶标仪测量OD450值。绘制标准曲线，并计算样品中GM-CSF 的浓度。
依据本实施例中的方法，分别成功筛选到GM-CSF基因修饰的肺癌细胞系 A549、乳腺癌细胞系MCF-7、胃癌细胞系803、结肠癌细胞系HCT-8或卵巢癌 细胞系SKOV3。
上述的A549为人肺癌细胞系，接种正常动物模型不能形成移植瘤，而接种 裸鼠虽可成瘤，但裸鼠为免疫缺陷型，接种疫苗后不能产生正常的免疫反应， 此为肿瘤疫苗的动物实验中难以解决的问题。在此，可以补充GM-CSF基因修 饰异体肿瘤细胞疫苗接种人体的情况。
GM-CSF基因修饰异体肿瘤细胞疫苗接种后，患者注射部位不同程度的红 肿等炎症反应，红肿硬结的直径可达2-3cm，周围发红的区域直径可达10-30cm； 未出现发热、流感样症状及其他不良反应。注射部位皮肤行病理检测，可见大 量淋巴细胞等单个核细胞在腺体、血管等周围浸润；免疫组化染色可见CD3+和 CD8+细胞较多。并且治疗后患者DTH反应为阳性(DTH是目前检测体内特异 性免疫反应的常规方法)。
实施例3：小鼠肿瘤疫苗的制备和接种
实验小鼠为清洁级近交系C57BL/6(H-2Kb，雌性)，8-12周龄，体重18-22g， 购自北京维通利华动物中心。
以接种Lewis Lung Cancer(LLC)的C57小鼠作为动物模型，如实施例2所 述方法分别以LLC和LA795细胞制备GM-CSF基因修饰的自体和异体肿瘤疫 苗。
接种疫苗的步骤：在无菌条件下，取细胞系肿瘤疫苗(小鼠GM-CSF基因 修饰LA795细胞疫苗)0.1ml(107)悬液，注射与小鼠左后肢内侧皮下，不需 麻醉，每7天重复1次，共3次。对照小鼠注射相同体积的PBS、未经GM-CSF 基因修饰的LLC或LA795瘤苗。分别按照如下实施例4-8的操作评估各项疗效 指标。
实施例4：肿瘤疫苗接种小鼠的成瘤时间、肿瘤体积及生存时间
治疗开始后，由专人用游标卡尺每3天测量肿瘤的最大径(A)和垂直径(B)， 根据公式1/6πAB2计算肿瘤体积(A＞B)，并记录小鼠的成瘤时间和生存期。
有关小鼠生存期结果参见图4，各组小鼠在给予三次瘤苗接种后第7天给予 肿瘤接种，剂量为1×107，接种后观察接种后的存活时间，相对于PBS对照组， 单纯LA795和LLC接种组的小鼠荷瘤存活时间并无明显延长(P＞0.05)，而 GM-CSF分泌性的自体或同种异体肿瘤疫苗组的荷瘤存活时间却明显被延长 (P＜0.01)。通过这种预防接种，发现与PBS对照组以及单纯LA 795和LLC接 种组相比，经GM-CSF基因修饰的LLC和LA795瘤苗接种后，成瘤时间明显 推迟，肿瘤生长延缓，主要体现在接种后出现可测量肿瘤的时间推迟，并且同 期相比的肿瘤体积小于对照组。同成瘤时间相似的是，GM-CSF分泌性的LLC (自体)瘤苗接种组的生存期有长于LA795(同种异体)瘤苗接种组的趋势， 但无显著性差异(P＞0.05)。
从以上结果可以看出，GM-CSF基因修饰的异基因瘤苗能够有效地诱导抗 肿瘤免疫活性，抑制肿瘤的生长，延长生存期。
实施例5：小鼠血清学细胞因子的变化
各组小鼠分别于肿瘤疫苗接种前、每次接种瘤苗前及最后一次接种瘤苗后7 天，处死小鼠3只，各经眼球取血约0.6-1ml，用于血清学指标检测，利用ELISA 法检测小鼠血清IFN-γ、IL-4的分泌水平。简言之，监测小鼠疫苗接种前后血清 IFN-γ、IL-4分泌水平的变化。
以上细胞因子检测ELISA试剂盒购自Bender公司(Austrian)。
在预先包被抗体的96孔板加入标准品和实验样品(每孔100ul)，37℃孵育 90min；弃去液体并用Washing Buffer洗板5次，加入生物素标记抗体，孵育 60min；洗板，加入HRP孵育30min；洗板，加入显色液孵育10min；加终止液 (2N HCl)终止反应，于450nm检测吸光度。以标准品的吸光度绘制标准曲线， 并根据标准曲线计算样品中相应细胞因子的浓度。
结果见图5a-5b，图中，1为GM-CSF分泌性LA795瘤苗接种组，2为GM-CSF 分泌性LLC瘤苗接种组，3为LA795瘤苗接种组，4为LLC瘤苗接种组，5为 PBS对照组。可见各组中随肿瘤疫苗的注射，其血清IL-4水平并无明显变化 (P＞0.05)，各组之间的血清IL-4水平也无显著性差异(P＞0.05)。可见各组中 随肿瘤疫苗的注射，其血清IFN-γ水平变化明显(P＞0.05)；IFN-γ水平尤以第3 次注射后增高明显(其中自体瘤苗组比同种异体组的IFN-γ高，但无显著性差 异)；其中GM-CSF分泌性自体和同种异体瘤苗组的IFN-γ水平随注射次数的增 加变化明显，远高于其他各组(P＜0.01)，而无GM-CSF分泌性的自体或同种异 体瘤苗组的IFN-γ水平的升高远不及有GM-CSF的分泌组明显；PBS对照组 IFN-γ水平注射前后无明显变化。
从以上结果可以看出，GM-CSF基因修饰的异基因瘤苗与自体瘤苗一样能 够有效地诱导血清Th1类细胞因子的升高。
Th1升高的意义：CD4+的辅助性T细胞即Th细胞，而Th细胞又可向Th1 和Th2两个方向分化，Th1类细胞主要分泌IFN-γ，IL-2等细胞因子，而Th2类 细胞则分泌IL-4，IL-10等。肿瘤患者体内大多出现Th2偏移，在形成肿瘤导致 的免疫抑制当中具有重要的作用。通过免疫治疗调节该现象，使其Th1方向漂 移，即本研究中检测到的Th1类细胞因子升高，而Th2类细胞因子无显著变化， 这种Th1漂移的现象有利于诱导有效的免疫反应。
实施例6：免疫小鼠脾细胞的杀伤实验
小鼠外周血免疫细胞亚群的分布
预防组各组小鼠分别于肿瘤疫苗接种前、每次接种瘤苗前及最后一次接种 瘤苗后7天，处死小鼠3只，各取脾细胞制备成匀浆，利用流式细胞仪(BD Pharmingen)通过流式细胞术检测各细胞亚群的分布：CD4-FITC/CD3-PE、 CD8-FITC/CD3-PE、CD4-FITC/CD25-PE。
表1.各组小鼠流式细胞检测的淋巴细胞亚群比例(％)
免疫小鼠脾细胞的杀伤实验结果
然后使用LDH法检测瘤苗接种后小鼠脾细胞对肿瘤细胞的杀伤活性 (Program)：以Lewis肺癌细胞系作为抗原进行重复刺激，观察效应细胞对抗原 的杀伤比率(图6a)。进而对脾细胞进行CD8+阳性分选，以此CD8+细胞作为 效应细胞对含有特异性抗原的肿瘤细胞进行杀伤实验(图6b)。图中，1为 GM-CSF分泌性LA795瘤苗接种组，2为GM-CSF分泌性LLC瘤苗接种组，3 为LA795瘤苗接种组，4为LLC瘤苗接种组，5为PBS对照组。可见各组中随 肿瘤疫苗的注射，其脾细胞(效应细胞)对抗原的杀伤能力不断增强(P＜0.01)， 尤以第3次免疫后的增强最为明显(P＜0.01)；其中GM-CSF分泌性自体和同种 异体瘤苗组的效应细胞的杀伤特定抗原的能力增加明显，远高于其他各组 (P＜0.01)；而无GM-CSF分泌性的自体或同种异体瘤苗组的效应细胞的杀伤能 力的升高远不及有GM-CSF的分泌组明显；PBS对照组注射前后无明显变化； 经CD8+分选后各组的效应细胞的杀伤实验亦证实肿瘤疫苗可以有效诱导抗原 特异性的CD8+CTL细胞，对相应靶细胞产生特异性杀伤作用。
从以上结果可以看出，GM-CSF基因修饰的异基因瘤苗同自体瘤苗一样能 够有效地刺激机体淋巴细胞特别是CD8+CTL细胞对“自体”肿瘤细胞的杀伤活 性。
实施例7：免疫小鼠的ELISOPT实验结果
免疫斑点实验(ELISOPT)检测脾细胞活化，即分泌IFN-γ的细胞数量(BD Bioscience)。简言之，应用ELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞经LLC肺癌抗原 刺激后的活化。
ELISPOT的实验步骤(针对LA795瘤苗的动物实验)：
每孔加入50μL MagiTM Coating Buffer稀释好的包被抗体，4℃过夜。倾倒 包被液，用PBS洗涤3次，在灭菌的吸水纸上扣干。加入200μL稀释好的封 闭液，37℃封闭1h后，倾倒封闭液。接种细胞(100μL/well)，实验组：1×106 细胞/well，同时加入刺激物即抗原(本实验中为放射灭活后的LLC细胞)；背景 负对照孔加入100μL的Lympho-SpotTM无血清培养基；正对照孔1×104细胞 /well同时加入10μL PHA(终浓度1-4ug/mL)。37℃培养18-24h，倾倒孔内的 细胞及培养基。每孔加入200μL冰冷的去离子水，冰浴10min。每孔用200μLPBS 洗涤10次，在吸水纸上扣干。每孔加入100μL稀释好的生物素标记检测抗体， 37℃孵育1h。每孔用200μLPBS洗涤5次，在吸水纸上扣干。每孔加入100μL 酶标亲和素工作液，37℃孵育1小时。每孔用200μL PBS洗涤5次，在吸水纸 上扣干。每孔加入100μL的AEC显色液，室温避光静置15-45min，待斑点形 成到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水 纸上拍干之后取下保护层，在通风处室温静置10-30min，让膜自然晾干。将 ELISPOT板置于Biosys Bioreader4000PRO自动读板仪内分析。
治疗组小鼠在免疫接种前和第3次免疫接种后7天，分别处死小鼠，取脾 进行ELISPOT实验。加入抗原LLC肺癌细胞后，可见小鼠效应细胞被特异性抗 原活化在预防组各组小鼠中免疫后活化细胞数量明显增加(P＜0.01)，免疫后 GM-CSF分泌性瘤苗组的活化明显高于其他组(P＜0.01)。
从以上结果可以看出，GM-CSF基因修饰的异基因瘤苗同自体瘤苗一样能 够有效地刺激脾淋巴细胞对“自体”肿瘤细胞抗原的活化，即可以诱导产生针 对“自体”肿瘤细胞的特异性免疫反应。
实施例8：免疫小鼠接种部位淋巴细胞浸润情况
以常规HE染色及免疫组化染色，简言之，以免疫组化法检测疫苗接种部位 的淋巴细胞浸润情况。
HE染色：
切片在二甲苯中脱蜡5～10分钟。移入二甲苯和纯酒精(1∶1)混合液中5 分钟左右。依次放入100％、95％、85％、70％酒精，各级分别为2～5分钟， 最后经蒸馏水转入染液。苏木精染液染色5～15分钟。水洗玻片上多余染液， 0.5～1％盐酸酒精(70％酒精配制)分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染 色质清晰为止，约10秒钟。流水冲洗15～30分钟；或者在碳酸锂饱和液中短 时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色，蒸馏水短洗。0.1～0.5％伊红染液染色1～5 分钟。依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3分钟。二甲苯 透明(二次)，共约10分钟。封片。
免疫组化：
组织切片脱蜡、水化后，PBS洗2～3次各5分钟。滴加3％H2O2，室温静 置10分钟；PBS洗2～3次各5分钟。抗原修复，PBS洗。滴加正常山羊血清 封闭液，室温20分钟，甩去多余液体。滴加I抗50μl，室温静置1小时或者4℃ 过夜或者37℃1小时。PBS洗3次各5分钟；滴加II抗40～50μl，室温静置， 或37℃1小时(II抗中可加入0.05％的tween-20)。PBS洗3次各5分钟；DAB 显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度。PBS或自来水冲洗10分钟；苏木 精复染2分钟，盐酸酒精分化；自来水冲洗10～15分钟。脱水、透明、封片、 镜检。
接种部位免疫组化照片见图8，通过比较可知，GM-CSF基因修饰自体或异 体肿瘤疫苗注射部位可见明显的CD8+T细胞浸润，而对照组未见淋巴细胞浸润 现象。从以上结果可以看出，GM-CSF基因修饰的异基因瘤苗同自体瘤苗一样 能够有效地诱导CD8+T细胞的趋化和浸润，即刺激局部的CTL细胞介导的免 疫反应。
序列表
<110>天津肿瘤医院
<120>GM-CSF基因修饰的异基因肿瘤细胞疫苗
<130>tj002
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>misc_feature
<223>外上游引物P1
<400>1
ggctaaagtt ctctggagga tgtg 24
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>misc_feature
<223>外下游引物P2
<400>2
ctcatctggc cggtctcact c 21
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>misc_feature
<223>内上游引物P3
<400>3
gaattcatgt ggctgcagag cctg 24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>misc_feature
<223>内下游引物P4
<400>4
ggatcctcac tcctggactg gctc 24
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| AFP158-166特异性TCR基因及其转基因T细胞及体外增殖方法及用途 | 2020-05-13 | 70 |
| 抑癌基因-细胞同质异能素的创建 | 2020-05-11 | 133 |
| 用于恶性肿瘤基因治疗的增殖和肿瘤细胞特异性基因操纵系统 | 2020-05-13 | 884 |
| 一种细胞差异表达与基因测试复合微流芯片 | 2020-05-12 | 463 |
| 转基因在棉花中的保卫细胞特异性表达 | 2020-05-12 | 982 |
| 人异基因有核细胞工业化制备自然杀伤性细胞(NK)及注射液 | 2020-05-12 | 225 |
| 抗原特异性辅助性T细胞受体基因 | 2020-05-11 | 491 |
| 癌抗原特异性T细胞受体基因、由该基因编码的肽及其使用 | 2020-05-13 | 173 |
| 肽癌抗原‑特异性T细胞的受体基因 | 2020-05-11 | 949 |
| 一种增强细胞特异性目的基因表达的方法 | 2020-05-12 | 569 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈