一种牙鲆卵母细胞特异基因figla及其应用
阅读：242发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种牙鲆卵母细胞特异基因figla及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种牙鲆卵母细胞特异基因figla及其应用，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1， 氨 基酸序列为SEQ ID NO:2。本发明首次从牙鲆中克隆了figla基因，根据其cDNA序列设计了探针，通过原位杂交方法分析，能够特异性标记卵母细胞，可用于 鉴别 卵母细胞。本发明还进一步公开了通过活体卵巢注射figla-dsRNA来抑制该基因表达并直接影响卵母细胞发育的应用方法，该方法的效果是dsRNA注射后，通过组织细胞学观察并结合定量与 定位 基因表达变化来评价的。本发明的技术方法可用于该基因在牙鲆卵巢卵母细胞的功能研究，也可在其它鱼类上进行推广应用。，下面是一种牙鲆卵母细胞特异基因figla及其应用专利的具体信息内容。
1.一种牙鲆卵母细胞特异基因figla，其特征是：牙鲆卵母细胞特异基因figla的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.按权利要求1所述的牙鲆卵母细胞特异基因figla，其特征是：所述牙鲆卵母细胞特异基因figla编码序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种权利要求1所述的牙鲆卵母细胞特异基因figla的应用，其特征是：牙鲆卵母细胞特异基因figla在鉴别卵母细胞中的应用。
4.一种权利要求1所述的牙鲆卵母细胞特异基因figla的探针，其特征是：探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.一种抑制牙鲆卵母细胞特异基因figla表达的dsRNA，其特征在于：抑制牙鲆卵母细胞特异基因figla表达的figla-dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.一种抑制牙鲆卵母细胞特异基因figla表达的figla-dsRNA的制备方法，其特征在于：
(1)提取牙鲆卵巢总RNA，并逆转录为cDNA；
(2)筛选figla cDNA siRNA位点，根据siRNA位点选取figla cDNA片段，经Blast比对确认其特异性后作为模板，并以特异的上下游引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6进行PCR扩增，回收目的片段体外转录合成figla-dsRNA。
7.按权利要求6所述的抑制牙鲆卵母细胞特异基因figla表达的figla-dsRNA的制备方法，其特征是所述引物为：
正向引物SEQ ID NO:5：
5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGTTCATCCTCAGGGTTCATAC-3’
反向引物SEQ ID NO:6：
5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGCAGTCTGACCATAAGTGATTGC-3’，下划线为T7启动子序列。
一种牙鲆卵母细胞特异基因figla及其应用
技术领域
背景技术
[0002] Basic helix-loop-helix(bHLH)蛋白是bHLH超家族转录因子，其在性别决定、细胞分化、神经系统发育和胆固醇代谢等发育过程中发挥重要作用。The factor in the germ cell line alpha(FIGLA)是该家族的成员之一，已有研究表明figla对哺乳动物的卵巢发育发挥重要作用。但是，在硬骨鱼中报道的figla基因一般多是涉及qPCR表达分析，部分报道采用原位杂交进行了组织细胞学定位研究。有关该基因的功能研究在鱼类中很少，仅见于模式鱼种斑马鱼及淡水经济鱼罗非鱼中的报道，均是通过显微注射来分析的，并都发现figla对卵巢发育至关重要，但未明确对卵母细胞增殖的影响。斑马鱼作为模式鱼种虽然繁殖周期较短，也需2～3个月，故要获得纯合子二代个体需要较长时间；而经济鱼类繁殖周期更长，一般要2～4年，采用显微注射方法周期较长，直接影响了基因功能研究和应用的进程。牙鲆作为海水经济鱼类，其生殖周期也比较长，特别是显微注射方法在海水鱼类浮性卵中虽已有尝试，但技术尚不稳定，效率也低，因此目前还不能广泛使用。对于基因功能的研究迫切需要一种简便易行的技术手段。
[0003] RNA干扰是一种通过双链RNA(dsRNA)诱导使同源mRNA降解，从而抑制靶基因表达的技术。该技术已被广泛用于昆虫，虾蟹，贝类等物种的基因功能研究，且效果显著。鱼类中，RNA干扰在斑马鱼胚胎发育基因的研究中有所涉及，但在鱼类活体上仅有舌齿鲈和纹鳢通过肌肉注射，以及福瑞鲤的腹腔注射来对靶基因进行干扰的报道。有关于figla基因的RNA干扰研究，仅见于半滑舌鳎细胞水平上的报道，是通过对其伪雄鱼精巢细胞系转染siRNA实现的，经过该基因转录水平的变化显示其可对靶基因进行干扰。而通过对靶向组织(性腺)直接注射dsRNA来研究目的基因功能尚未见报道。
[0004] 牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的海水鱼类养殖品种，肉质鲜美，营养丰富，具有较高的经济价值。其繁育与其卵巢发育和卵子发生密不可分，卵子的数量和质量能够直接影响人工育苗与养殖产量，因此研究牙鲆卵母细胞特异基因功能，对牙鲆繁育及卵巢发育促熟具有重要意义。同时，由于牙鲆雌性个体比雄性个体生长快，全雌养殖也可以获得更高的经济效益，所以，研究牙鲆的性别，发掘卵巢生殖细胞的特异基因及其功能，对鱼类性控和性腺发育成熟机制研究与养殖应用均具有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于一种牙鲆卵母细胞特异基因figla及其应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007] 一种牙鲆卵母细胞特异基因figla，牙鲆卵母细胞特异基因figla的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008] 一种牙鲆卵母细胞特异基因figla编码序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009] 一种牙鲆卵母细胞特异基因figla的应用，牙鲆卵母细胞特异基因figla在鉴别卵母细胞中的应用。
[0010] 一种牙鲆卵母细胞特异基因figla的探针，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。其用于特异性标记和鉴别卵母细胞；
[0011] 一种抑制牙鲆卵母细胞特异基因figla表达的基因片段，抑制牙鲆卵母细胞特异基因figla表达的figla-dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0012] 一种抑制牙鲆卵母细胞特异基因figla表达的figla-dsRNA的制备方法：
[0013] (1)提取牙鲆卵巢总RNA，并逆转录为cDNA；
[0014] (2)筛选figla cDNA siRNA位点，根据siRNA位点选取figla cDNA片段，经Blast比对确认其特异性后作为模板，并以特异的上下游引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6进行PCR扩增，回收目的片段体外转录合成figla-dsRNA。
[0015] 所述引物为：
[0016] 正向引物SEQ ID NO:5：
[0017] 5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGTTCATCCTCAGGGTTCATAC-3’
[0018] 反向引物SEQ ID NO:6：
[0019] 5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGCAGTCTGACCATAAGTGATTGC-3’，下划线为T7启动子序列。
[0020] 在常规培育的牙鲆幼鱼的卵巢部位活体注射15、30μg的figla-dsRNA，对照组在卵巢部位活体注射30μg EGFP-dsRNA，共注射3次，注射时间分别记为d1、d8和d20。
[0021] Figla表达被抑制的检测方法如下：在注射figla-dsRNA后的d3、d10和d27采集卵巢组织，采用荧光定量PCR、原位杂交以及组织细胞学观察相结合的方法来检测figla基因表达变化和卵巢发育变化，确定该基因对卵母细胞发育的作用。
[0022] 本发明所具有的优点：
[0023] 本发明首次从牙鲆中克隆获得figla基因，根据其cDNA序列获得其特异性探针，通过原位杂交方法分析，能够特异性标记卵母细胞，可用于鉴别卵母细胞。本发明还进一步公开了通过活体卵巢注射figla-dsRNA来抑制该基因表达并直接影响卵母细胞发育的应用方法，该方法的效果是dsRNA注射后，通过组织细胞学观察并结合定量与定位基因表达变化来评价的，本发明注射的dsRNA能够降低目的基因表达量，实验组目的基因表达效率降低可达到50％；通过卵巢组织细胞学和原位杂交分析，实验组卵母细胞数量显著少于对照组，且实验组卵母细胞的杂交信号强度弱于对照组，说明活体卵巢注射figla-dsRNA能抑制其表达，并影响卵母细胞的正常发育。
[0025] 图1为本发明实施例1提供的牙鲆figla在III期卵巢中的细胞学定位情况；A，阳性探针结果；B，阴性探针结果。II，第2时相卵母细胞；III，第3时相卵母细胞。Og，卵原细胞；Oc，卵母细胞。Bar，50μm。
[0026] 图2为本发明实施例2提供的牙鲆卵母细胞特异基因figla敲降后的该基因定量PCR检测图；a和b，表示存在显著性差异(P＜0.05)。
[0027] 图3为本发明实施例2提供的牙鲆卵母细胞特异基因figla敲降后的组织学观察和该基因原位杂交图；其中，A-C，d10对照组和实验组的卵巢组织学观察；D-F，d27对照组和实验组的卵巢组织学观察；G-I，d27对照组和敲降组的卵巢原位杂交。Oc，卵母细胞；Bar，50μm。
具体实施方式
[0028] 以下结合附图和实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
[0029] 本发明牙鲆卵母细胞特异基因figla的cDNA及其探针，用以特异性标记和鉴别卵母细胞；敲降牙鲆卵母细胞特异基因figla，可以抑制该特异基因的表达，并影响卵母细胞发育，进而获知抑制该基因表达后评价指标。
[0030] 实施例1牙鲆figla基因克隆及其在卵母细胞特异表达的应用
[0031] 1.基因克隆
[0032] 1.1牙鲆卵巢组织RNA提取及反转录：采集牙鲆卵巢组织，采用Trizol法提取RNA，通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，Nanodrop2000测定RNA浓度后，保存于-80℃备用；利用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)，按照说明书步骤将卵巢RNA反转为cDNA模板。
[0033] 1.2基因克隆及序列分析：根据牙鲆性腺转录组测序结果，获得牙鲆figla基因部分mRNA序列，其长度为693bp；根据此序列设计一对特异性引物
[0034] figla-S:5’-GCACCTCCTCACGGTCCAAAC-3’
[0035] figla-AS:5’-CAAGCCATCTGCTCTACACATCA-3’
[0036] 采用1.1中获得的卵巢cDNA模板，经RACE扩增，对获得的产物通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，将目的条带切胶回收，送往测序公司测序。用EditSeq去除测序引物及载体序列，用SeqMan将测序序列与已知序列拼接，获得全长cDNA，如SEQ ID NO:1所示。通过EditSeq搜索并翻译开放阅读框(ORF)，获得氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0037] SEQ ID NO:1(牙鲆figla全长cDNA序列，下划线部分为有效长度为309-914)：
[0038]
[0039] SEQ ID NO:2(牙鲆figla编码的氨基酸序列)：
[0040]
[0041]
[0042] 2.基因定位表达
[0044] 2.2探针合成：选取figla cDNA序列中的片段，经Blast比对确认其特异性后，设计一对特异引物：
[0045] 上游引物
[0046] 5’-ATTTAGGTGACACTATAGAAGCGGCTGAGGACTTCAACGAAACGGT-3’(下划线为SP6启动子序列)
[0047] 下游引物
[0048] 5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGCCATCTGCTCTACACAT-3’(下划线为T7启动子序列)
[0049] 进行10μl反应体系的PCR扩增，所得产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段，测序确认序列正确性，序列为SEQ ID NO:3。测序无误后，通过60μl反应体系的PCR扩增及胶回收，胶回收目的片段用DIG RNA Labeling Mix试剂盒，按照说明书步骤体外转录合成figla特异性探针，放于-80℃保存，探针核酸序列，如SEQ ID NO:3所示。SEQ ID NO:3(Figla特异探针序列)：
[0050]
[0051] 2.3卵巢组织原位杂交：
[0052] 2.3.1样品包埋及切片制备：将新鲜的卵巢组织块1cm3放入Davidsions’固定液(500ml固定液组分：156.75ml无水乙醇，110ml甲醛，57.5ml冰乙酸，175.75ml蒸馏水)中，4℃过夜后换至70％乙醇中保存。70％乙醇中的组织块经梯度乙醇(85％→95％→100％)脱水、组织脱水后放于二甲苯中透明，待组织块透亮后放于石蜡中浸蜡包埋，待蜡块冷却凝固后进行切片，组织切片厚度为5μm，展片后放于60℃烤片。
[0053] 2.3.2原位杂交：整个实验过程保证无RNA酶污染。
[0054] 第一天：取出烘烤过夜的组织切片，经二甲苯透明，梯度乙醇(100％→85％→70％→50％→30％)和无RNA酶水复水后，用磷酸缓冲液+0.1％吐温20(PBT)漂洗2次，再经含2μg/ml蛋白酶K的PBT溶液消化30min，消化处理后再用PBT漂洗两次，漂洗后经4％多聚甲醛固定30min，然后于60℃的预杂交液(1ml预杂交液为500μl去离子甲酰胺，250μl 20×柠檬酸钠缓冲液(SSC)，200μl封闭试剂，3μl酵母总RNA，1μl吐温20，46μl无RNA酶水)中孵育3h，之后用加入含有100ng/μl figla特异性探针的杂交液于60℃孵育16h。
[0055] 第二天：组织切片在60℃在下列液体依次漂洗2次，杂交液/2×SSC(1:1)、2×SSC、1×SSC、0.2×SSC(含0.1％吐温20)，每次20min。然后用马来酸室温漂洗两次，封闭缓冲液(blocking reagent/马来酸，体积比1:10)室温封闭2h后，按照体积比1:2000比例向封闭缓冲液中加入地高辛抗体，4℃条件下孵育16h。
[0056] 第三天：将上述孵育后组织切片取出，并在室温条件下进行实验，组织切片经马来酸漂洗6次。洗涤后再使用抗体稀释液漂洗两次，向1ml抗体稀释液中20μl NBT/BCIP制成显色液，将显色液均匀滴加在组织上进行闭光显色。显色结束后用PBT漂洗两次，4％多聚甲醛固定30min后再用PBT漂洗两次。用1％的中性红染液复染30min后，经梯度(70％→95％→100％)乙醇脱水，二甲苯透明后用中性树胶封片，待片子晾干后镜检观察(参见图1)。
[0057] 结果如图1，显示figla特异表达在卵母细胞中，故figla特异性探针可用于鉴别卵母细胞。
[0058] 实施例2 Figla-dsRNA抑制牙鲆卵母细胞特异基因figla表达的应用
[0059] 1.dsRNA制备
[0060] 1.1卵巢组织RNA提取及反转录：RNA提取及反转录方法步骤如实施例1中2.1所述。
[0061] 1.2 Figla-dsRNA合成：使用siRNA位点筛选网站http://sidirect2.rnai.jp/对figla全长cDNA序列中的siRNA位点进行筛选，根据siRNA位点从figla cDNA中选取部分片段，经Blast比对确认其特异性后，设计一对特异的上下游引物：
[0062] SEQ ID NO:5
[0063] 5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGTTCATCCTCAGGGTTCATAC-3’
[0064] SEQ ID NO:6
[0065] 5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGCAGTCTGACCATAAGTGATTGC-3’(下划线为T7启动子序列)
[0066] 进行10μl反应体系的PCR扩增，所得产物进行电泳，胶回收目的片段，测序确认序列正确性，序列为SEQ ID NO:4，即为figla-dsRNA。
[0067] 测序无误后，通过60μl反应体系的PCR扩增及胶回收，胶回收目的片段用T7 RNAi Transcription kit试剂盒体外转录合成figla-dsRNA。SEQ ID NO:4(Figla-dsRNA序列)：
[0068]
[0069] 2 DsRNA注射
[0070] 2.1牙鲆的饲养：将牙鲆(100g±20g)饲养在1m3养殖桶中，每日投喂商业饵料2次；
[0071] 2.2设置实验组和对照组：将养殖的42尾雌性牙鲆均分到2个实验组和1个对照组中。其中对照组注射EGFP-dsRNA，2个实验组注射figla-dsRNA；
[0072] 2.3注射浓度及时间：EGFP-dsRNA用量30μg，figla-dsRNA用量为15和30μg。一个月内对卵巢共注射3次，注射时间记为d1、d8和d20。
[0073] 3注射效果检测
[0074] 3.1荧光定量：采用常规荧光定量方法检测基因表达变化，以牙鲆β-actin作为内参基因。提取d3卵巢RNA及反转录方法步骤如实施例1中2.1所述。
[0075] Figla特异引物为：
[0076] figla-qRT-S:5’-GTTTGAGCAATGACCTATGG-3’
[0077] figla-qRT-AS:5’-TCCTCTGTTACTGGTTCTGG-3
[0078] β-actin特异引物为：
[0079] β-actin-qRT-S:5’-GGAATCCACGAGACCACCTACA-3’
[0080] β-actin-qRT-AS:5’-CTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’
[0081] 反应条件为：95℃30s，然后95℃30，60℃30s，共40个循环，结果如图2显示。
[0082] 3.2 HE染色：采用HE染色对d10、d27的卵巢进行组织细胞学观察，石蜡切片制备步骤如实施例1中2.3.1所述。HE染色采用常规步骤，石蜡切片经二甲苯透明、梯度乙醇(100％→95％→80％→50％)以及自来水复水，经苏木精染色2min后自来水冲洗5min复蓝，伊红复染1min，再经95％乙醇、100％乙醇脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片，待片子晾干后于显微镜下观察，结果如图3(A-F)。
[0083] 3.3组织原位杂交：采用原位杂交对d27卵巢组织进行原位杂交，原位杂交步骤如实施例1中2.3所述。结果如图3(G-I)。
[0084] 由图2中根据荧光定量分析，表明实验组(Figla-dsRNA1和Figla-dsRNA 2)figla表达量与对照组(EGFP-dsRNA)相比明显下调，证明注射figla-dsRNA能够抑制该基因的表达。图3(A-F)HE染色显示d10的实验组(Figla-dsRNA 1和Figla-dsRNA 2)和对照组(EGFP-dsRNA)卵巢无差异，d27实验组卵巢中卵母细胞数量与对照组相比明显减少；原位杂交(图3，G-I)显示d27实验组卵巢剩余卵母细胞的杂交信号强度弱于对照组卵母细胞的信号强度，说明通过RNA干扰可以抑制figla表达，并引起了卵母细胞减少，因此，可以明确figla对卵母细胞增殖有重要作用。该方法可应用于牙鲆卵母细胞功能研究。
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