蚯蚓细胞色素P450基因及其编码的蛋白
阅读：1026发布：2020-08-24
专利汇可以提供蚯蚓细胞色素P450基因及其编码的蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种蚯蚓细胞色素P450基因及其编码的蛋白，本发明涉及的蚯蚓细胞色素P450蛋白 氨 基酸序列如SEQ ID No.16所示；本发明涉及的编码如 权利要求 所述蚯蚓细胞色素P450蛋白的基因的CDS序列如SEQ ID No.15所示。本发明用赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)，依据细胞色素P450基因的保守序列和与蚯蚓比较接近的线性动物 门 的P450序列设计引物，通过RT?PCR扩增出一条蚯蚓P450基因 片段 。根据此基因片段设计特异引物，使用RACE?PCR的方法扩增其未知的序列片段；获得了一条蚯蚓细胞色素P450的全长基因序列。预测其表达的蛋白含有细胞色素P450的特征序列，具有其他动物P450蛋白的基本结构与解毒功能，可对进入体内的外源性化合物进行 生物 转化，对 机体 具有保护作用。，下面是蚯蚓细胞色素P450基因及其编码的蛋白专利的具体信息内容。
1.一种蚯蚓细胞色素P450蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
2.一种编码如权利要求1所述的蚯蚓细胞色素P450蛋白的基因，其特征在于，其CDS序列如SEQ ID No.15所示。
3.一种获得编码如权利要求1所述蚯蚓细胞色素P450蛋白的基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：通过RT-PCR获得所述基因的片段序列，通过Race PCR获得所述基因的3’端序列；拼接所述片段序列与所述3’端序列，即得；
其中，所述片段序列如SEQ ID No.7所示；所述3’端序列如SEQ ID No.12所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR采用的简并引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR的反应体系具体为：以反应体系40μl计，各组分及用量具体如下：
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR的反应条件如下：94℃反应
2min，运行一个循环；94℃，30sec；54℃30sec；72℃1min，反应38个循环；72℃，5min，反应一个循环，然后72℃恒温保存。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Race PCR采用的上游特异性引物如SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11所示；下游引物采用Oligo dT。
8.根据权利要求3或7所述的方法，其特征在于，所述Race PCR的反应体系具体为：以反应体系40μl计，各组分及用量具体如下：
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Race PCR的反应条件为：94℃反应
2min，运行一个循环；94℃，30sec；54℃30sec；72℃1min，反应38个循环；72℃，5min，一个循环，然后72℃恒温保存。
蚯蚓细胞色素P450基因及其编码的蛋白
技术领域
背景技术
[0002] 目前关于蚯蚓细胞色素P450基因的报道仅有本研究组发表在《上海交通大学学报》农业科学版2015年33卷第4期上的一篇论文蚯“蚓细胞色素P450基因的克隆及序列分析”。该论文采样RT-PCR法克隆到一条P450基因片段，长度为670bp。除此之外，国内外未见任何关于蚯蚓P450基因的报道。该文采用的RT-PCR法克隆的基因片段很短，其表达的氨基酸序列构成的蛋白质太过简单，虽具有P450的基本功能，但显然仅仅是该基因的一小部分片段。根据在其他动物上的经验，蚯蚓体内的P450基因应该有多条，而且片段长度一般应该比该文报道的片段要长，编码的蛋白质结构应该具有更完善的功能。因而，本发明在借鉴该文的基础上，重新设计了引物进行RT-PCR，并在此基础上进一步采用Race-PCR技术扩增出了更长的基因片段，其能编码功能较完善的蛋白质，推测得到的是一条相对较完整的蚯蚓细胞色素P450基因。
发明内容
[0004] 本发明采用的蚯蚓为赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)，是一种最常用的养殖蚯蚓品种以及实验用蚯蚓品种，在全世界广泛使用，从其体内提取的基因具有代表性。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] 第一方面，本发明提供一种蚯蚓细胞色素P450蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
[0007] 第二方面，本发明提供一种编码所述蚯蚓细胞色素P450蛋白的基因，其CDS序列如SEQ ID No.15所示。
[0008] 第三方面，本发明提供一种获得所述蚯蚓细胞色素P450蛋白的基因的方法，所述方法具体为：通过RT-PCR获得所述基因的片段序列，通过Race PCR获得所述基因的3’端序列；连接所述片段序列与所述3’端序列，即得；
[0009] 其中，所述片段序列如SEQ ID No.7所示；所述3’端序列如SEQ ID No.12所示。
[0010] 优选地，所述RT-PCR采用的简并引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
[0011] 优选地，所述RT-PCR的反应体系共计40μl，具体如下：
[0012]
[0013] 优选地，所述RT-PCR的反应条件如下：94℃反应2min，运行一个循环；94℃，30sec；54℃30sec；72℃1min，反应38个循环；72℃，5min，反应一个循环，然后72℃恒温保存。
[0014] 优选地，所述Race PCR采用的上游引物对如SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11所示；下游引物采用Oligo dT。
[0015] 优选地，所述Race PCR的反应体系共计40μl，具体如下：
[0016]
[0017] 优选地，所述Race PCR的反应条件为：
[0018] 94℃反应2min，运行一个循环；94℃，30sec；54℃30sec；72℃1min，反应38个循环；72℃，5min，一个循环，然后72℃恒温保存。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0020] 根据蛋白质结构中的几个螺旋结构，确定克隆到的是P450基因。本发明为继续进行蛋白质功能的研究，阐明蚯蚓机体的解毒机理以及其他动物P450基因的研究提供了参考，对于蚯蚓生态毒理学的理论和技术发展具有一定的促进作用。附图说明
[0021] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0022] 图1为蚯蚓细胞色素P450基因的蛋白质三维结构模拟图。
具体实施方式
[0023] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0024] 1.RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)提取CYP450(细胞色素P450)基因[0025] 1.1总RNA(核糖核酸)的提取
[0027] 1)取10μl Buffer(缓冲液)A放入1.5ml离心管中，剪取约50mg蚯蚓放入离心管中，快速用剪刀剪碎。
[0028] 2)添加990μl Buffer A，振荡混匀，室温静置3分钟。
[0029] 3)加入氯仿200μl，充分混匀，12000r，4℃离心5min。取上清。
[0031] 5)加入700μl的75％乙醇，12000r，4℃离心3min，去除上清。
[0032] 6)重复步骤5一次。
[0033] 7)室温倒置10min，晾干试管。加入50μl DEPC处理水溶解沉淀。-80℃保存。
[0035] 1.2 cDNA反转录
[0036] 反转录体系如下：
[0037]
[0038]
[0039] 反转录条件为：30℃反应10min，然后55℃30min，99℃5min，5℃5min。
[0040] 1.3引物设计
[0041] 用DNAMAN软件对Genbank上已知细胞色素P450序列进行比对，选择和蚯蚓比较接近的软体动物门物种如线虫、血吸虫等，并结合P450序列的保守区域(F xx G xxx C x G)设计引物如下：
[0042] F1(SEQ ID No.1)：5’-AGATTGTTCTGGTCGCCA-3’；
[0043] R1(SEQ ID No.2)：5’-CGGGTTCCTTGGGTCTAACT-3’；
[0044] F2(SEQ ID No.3)：5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’；
[0045] R2(SEQ ID No.4)：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；
[0046] F3(SEQ ID No.5)：5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’；
[0047] R3(SEQ ID No.6)：5’-CTCACTATAGGGCGAATTGG-3’。
[0048] 1.4 PCR扩增
[0049] 反应体系如下：
[0050]
[0051] 将配置好的PCR体系加入到含有已合成的cDNA的PCR管中，旋涡混匀。
[0052] 按以下条件进行PCR反应：在94℃反应2min，运行一个循环；94℃，30sec；54℃30sec；72℃1min，反应38个循环；72℃，5min，反应一个循环，然后72℃恒温保存。
[0053] 1.5凝胶电泳检测及测序
[0054] 1)琼脂糖凝胶的制备：准确量取0.25g琼脂糖，添加25ml 1×TAE，充分溶解，降温到60℃，吸取2.5μl GelRed，加到制胶板上，放置30min。
[0055] 2)把配制完全的1×TAE加到电泳槽内，以刚浸没胶板为宜。
[0056] 3)上样：分别取2.5μl样品和2.5μl Loading Buffer混匀，加入胶孔中，再加入2Kb DNA Marker 5μl.110V跑胶30min。
[0057] 4)凝胶成像仪分析。
[0058] 5)经胶回收，质粒转化及蓝白斑筛选后，结果交于华大基因公司测序。
[0059] 结果得到了一段535bp的P450基因片段，与人的P45027家族同源性大于40％，证明了该片段是目的基因P450基因的一部分。其基因序列如下SEQ ID No.7所示：
[0060]TTGGCCCAGATCCTAACACATTTAGAGGTATAGATTGTTCTGGTCGCCAATGCCATTAAAAAGTTAATTCATTCATTCTGGCCACTTCTATAACGCCCCTTCCAGTCCTCTACTACTCAGAGGCGCTCCCGACTACAGCACGGATACTGTATCGGAGTTTCACGCCGAAGCGCCACACGCAACTGTAGGTAAAGGACTTGCCGAAGTTTCCTACGTGGCGGCTAGAGCGGGAGTCGAACTCACGATCGTCCGGTTAAAAGTTATCGACTCAACCAATGCGCCACCACGTCCCACAATGCGCCACCACGTTATACCCAACAAAAGTTATACCTAAAATACCATGGGCACCCAAGGGGGTGGATACCACACCCCTGTCGTTTATCGACTATAACGTACATATTATGTATTTGCGAAATTAACATAGAAAGTAATTAGGCCATTCTTTAGAGGGAATGTGAGGCTACATTTTGCCTACTTATTLACTATTTTGGGGCGAAAACTGGAAGTGCGTATAGTTAGACCCAAGAACCCGGAC。
[0061] 2.采用Race PCR(巢式聚合酶链式反应)法扩增P450基因片段
[0062] 在上述克隆出的蚯蚓细胞色素P450基因片段的基础上，继续用RACE法克隆其3’端的片段，最终得到一条完整的蚯蚓CYP450基因。具体如下：
[0063] 2.1蚯蚓总RNA的提取：采用1.1提取的蚯蚓的总RNA。
[0064] 2.2 3’RACE特异性引物的设计
[0065] 根据获得的上述蚯蚓P450基因片段，使用Primer5.0软件，分别设计了2套特异性上游引物，用于扩增，下游引物选用了试剂盒自带的Oligo dT。
[0066] RF11(SEQ ID No.8)：5’-CGGGTTCCTTGGGTCTAACT-3’；
[0067] RF12(SEQ ID No.9)：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’；
[0068] RF21(SEQ ID No.10)：5’-GTTTTCCCAGTCACGACG-3’；
[0069] RF22(SEQ ID No.11)：5’-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3’。
[0070] 2.3蚯蚓P450基因3’端的扩增
[0072]
[0073] 反转录反应条件为：30℃反应10min，然后55℃30min，99℃5min，5℃5min。
[0074] 2.4 PCR扩增
[0075] 第一轮PCR扩增以试剂盒中含有的Oligo dT为下游引物与特异性上游引物来扩增；将第一轮扩增产物作为模板，以Oligo dT为下游引物与第二条特异性上游引物进行第二次扩增(巢式扩增)。PCR体系如下：
[0076]
[0077] 将上述体系吸取到PCR管中，旋涡混匀。
[0078] 按以下条件进行PCR反应：在94℃反应2min，运行一个循环；94℃，30sec；54℃30sec；72℃1min，反应38个循环；72℃，5min，一个循环，然后72℃恒温保存。巢式扩增两轮的试剂量和时间基本一致，以第一次得到的结果为母液，加入体系后开始新一轮扩增。
[0079] 2.5电泳检测及测序
[0080] 1)琼脂糖凝胶的制备：准确量取0.25g琼脂糖，添加25ml 1×TAE，充分溶解，降温到60℃，吸取2.5μl GelRed，加到制胶板上，放置30min。
[0081] 2)把配制完全的1×TAE加到电泳槽内。
[0082] 3)上样：分别取2.5μl样品和2.5μl Loading Buffer混匀，加入胶孔中，再加入2Kb DNA Marker 5μl.110V跑胶30min。
[0083] 4)凝胶成像仪分析。
[0084] 5)将目的条带回收，转移载体和大肠杆菌培养后，进行结果检查并到基因公司进行测序。
[0085] 结果获得蚯蚓P4503’端序列如下SEQ ID No.12所示：
[0086]TAAGGTTATTCATTGTACAATGCCAATAGGTGCTCGATCCTGTTTCAACGACACCGTGAACATTCCAAGAGATGATAAGTTAAAGCTACCTGGAGGTCGATTTGGATTGTATGCAGTGCACCAGCTCTTTACTTACCTGGCAGCTCACCCCAGCCCGGAAATCACAAAGTCCATGTCAGATACAAGTTCTTTATTGTATCGATTTACTCTAATGTTCCATGAGACACCAGACGCAATACATCGAACAGAACTGCCCCACATTGCTCATGCAGCCGGGAGCCTCACACTCACTTGGCCTGCAAACTTCTCTCTGGCGGAACAGACGGAAAATATGCAAAGAGAGGAGGCCTATGCTAGCGTTGTGCCCTTCGGCTTACAAGAGGCAATGACGGTAGCTGGTCGTTTGGCATTCGAAAGGGCTATGCTCATTTTCAACAAACAACTTTCAACCGTTTGGAATGTGACACCAAAACTTCTGCTTGATATTATCCAGTCCGTT(共计499bp)。
[0087] 3.蚯蚓P450全长序列的克隆与分析
[0088] 根据上面两部分所获得的序列设计引物，同时以第一部分中提取到的总RNA为模板，进行全长P450序列的cDNA合成和PCR扩增。
[0089] 上游引物(SEQ ID No.13)：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’；
[0090] 下游引物(SEQ ID No.14)：5’-CTCACTATAGGGCGAATTGG-3’。
[0091] 3.1 cDNA第一链的合成
[0092] 反应体系如下：
[0093]
[0094]
[0095] 反转录反应条件为：30℃反应10min，然后55℃30min，99℃5min，5℃5min。
[0096] 3.2 PCR反应
[0097] 反应体系如下：
[0098]
[0099] 将配置好的PCR体系加入到含有已合成的cDNA的PCR管中，旋涡混匀。
[0100] 按以下条件进行PCR反应：在94℃反应2min，运行一个循环；94℃，30sec；54℃30sec；72℃1min，反应38个循环；72℃，5min，一个循环，然后72℃恒温保存。
[0101] 3.3电泳与测序。
[0102] 反应完成后，吸2.5μl结果进行琼脂糖凝胶电泳，将检测结果在凝胶成像仪上拍照分析。结果显示，PCR产物的特异性非常好，可经过胶回收、载体连接、转化大肠杆菌等步骤后测序。
[0103] 3.4蚯蚓CYP450基因序列
[0104] 上述克隆得到的蚯蚓P450序列总共1033bp，表达344个氨基酸。使用DNAMAN软件推测获得该序列的氨基酸基本组成：预测蛋白含有细胞色素P450的特征序列，包括血红素结合区域FXXGXXXCXG，P450蛋白活性位点螺旋I；位于螺旋C中与亚铁结合有关的序列W xxx R；位于螺旋K中的序列E xx R，这是所有P450蛋白中最容易识别的序列，其结构特征基本不变。其基因(如SEQ ID No.15所示)与氨基酸序列(如SEQ ID No.16所示)如下：
[0105] TTGGCCCAGATCCTCACACATTTACAGGTATAGATTGTTCTGGTCGCCAATGCCATTAAA[0106] W P R S G H I N R Y R L F W S P M P L K
[0107] AAGTTTATTCATTCATTCTGGCCACTTCTATAACGCCCCTTCCAGTCCTCTACTACTCAG[0108] S P F I H S G H F Y N A P S S P L L L R
[0109] AGGCGCTCCCGACTACAGCACGGATACTGTATCGGAGTTTCACGCCGAAGCGCCACACGC[0110] G A P D Y S T D T V S E F H A E A P H A
[0111] AACTGTAGGTAAAGGACTTGCCGAAGTTTCCTACGTGGCGGCTAGAGCGGGAGTCGAACT[0112] T V G K G L A E V S Y V A A R A G V E L
[0113] CACGATCGTCCGGTTAAAAGTTATCGACTCAACCAATGCGCCACCACGTCCCACAATGCG[0114] T I V R L K V I D S T N A P P R P T M R
[0115] CCACCACGTTATACCCAACAAAAGTTATACCTCAAATACCATGGGCACCCAAGGGGGTGG[0116] H H V I P N K S Y T G N T M G T Q G G G
[0117] ATACCACACCCCTGTCGTTTATCGACTAAAACGTACATATTATGTATTTGCGAAATTAAC[0118] Y H T P V V Y R L K R T Y Y V F A K L T
[0119] ATGGAAAGTAATTAGGCCATTCTTTAGAGGGAATGTGAGGCTACATTTTGCCTACTTATT[0120] W K V I R P F F R G N V R L H F A Y L L
[0121] ACTATTTTGGGGCGAAAACTGGAAGTGCGTATCGTTAGACGGAAGAACCCGGACTAAGGT[0122] L F W G E N W K C V V L D E R T R T K V
[0123] TATTCATTGTACAATGCCAATAGGTGCTCGATCCTGTTTCAACGACACCGTGAACATTCC[0124] I H C T M P I G A R S C F N D T V N I P
[0125] AAGAGATGATAAGTTAAAGCTACCTGGAGGTCGATTTGGATTGTATGCAGTGCACCAGCT[0126] R D D K L K L P G G R F G L Y A V H Q L
[0127] CTTTACTTACCTGGCAGCTCACCCCAGCCCGGAAATCACAAAGTCCATGTCAGATACAAG[0128] F T Y L A A H P S P E I T K S M S D T S
[0129] TTCTTTATTGTATCGATTTACTCTAATGTTCCATGAGACACCAGACGCAATACATCGAAC[0130] S L L Y R F T L M F H E T P D A I H R T
[0131] AGAACTGCCCCACATTGCTCATGCAGCCGGGAGCCTCACACTCACTTGGCCTGCAAACTT[0132] E L P H I A H A A G S L T L T W P A N F
[0133] CTCTCTGGCGGAACAGACGGAAAATATGCAAAGAGAGGAGGCCTATGCTAGCGTTGTGCC[0134] S L A E Q T E N M Q R E E A Y A S V V P
[0135] GTATGCAGTGCACCAGAAACAACTTTCAACCGTTTGGAATGTGACACCACCAATACCTTT[0136] Y A V H Q K Q L S T V W N V T P P I P F
[0137] CTCTCTGGGTGCTCGATCCTGTCCTGGAGGTCGATTTGCAAACAAACTTCTGCTTGATAT[0138] S L G A R S C P G G R F A N K L L L D I
[0139] TATCCAGTCCGTT
[0140] I Q S V
[0141] 5.蚯蚓P450基因的蛋白同源模拟
[0142] 应用网络蛋白模拟软件Phyre2，以Fasta格式输入蚯蚓P450的氨基酸序列，在该数据库已登录的三维结构中，发现与其同源性最高的属于CYP45027B，其中与人体内已知的CYP 27B(P08684)家族同源性最高，三维结构相似度高达97％；而与黑猩猩的CYP27B家族(P05183)三维结构相似度为95％；与小鼠的CYP24A1的相似度为66％(c3k9vb)；与青鱂鱼的CYP26B1(q98t91)相似度为77％。由此可推断，该蚯蚓序列属于CYP45027家族。该蛋白质具有其他动物P450蛋白所具有的解毒功能，对进入体内的外源性化合物进行生物转化，对机体具有保护作用。
[0143] 综上所述，本发明基于现有技术获得P450基因片段普遍较小的缺陷，创造性地设计了引物进行RT-PCR，并在此基础上进一步采用Race-PCR技术扩增出了更长的基因片段，其能编码功能较完善的蛋白质，一条相对较完整的蚯蚓细胞色素P450基因。
[0144] 根据蛋白质结构中的几个螺旋结构，确定克隆到的是P450基因。本发明为继续进行蛋白质功能的研究，阐明蚯蚓机体的解毒机理以及其他动物P450基因的研究提供了参考，对于蚯蚓生态毒理学的理论和技术发展具有一定的促进作用。
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