转基因在棉花中的保卫细胞特异性表达
阅读：982发布：2020-05-12
专利汇可以提供转基因在棉花中的保卫细胞特异性表达专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在一个方面中，本 申请 披露了一种 棉 花 植物 细胞，该棉花植物细胞包括：(a)一种嵌合基因，该嵌合基因包括一种第一核酸序列，该第一核酸序列包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先启动子活性；(b)一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列；以及(c)一种转录终止和多聚腺苷 酸化 序列。另外，本申请披露了以下：一种棉花植物，在胁迫条件下、在棉花中表达转基因的方法，生产棉花植物的方法，检测转基因在胁迫条件下的表达的方法以及用于调节棉花植物对胁迫的抗性的方法，如在 权利要求 书中所表征的。，下面是转基因在棉花中的保卫细胞特异性表达专利的具体信息内容。
1.一种包括嵌合基因的棉花植物细胞，该嵌合基因包括
(a)一种第一核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少
80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先启动子活性；
(b)一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列；以及任选地
(c)一种转录终止和多腺苷酸化序列。
2.如权利要求1所述的棉花植物细胞，其中所述感兴趣的表达产物是
(i)在介导气孔开度中任选涉及的蛋白质或肽或
(ii)能够调节一种被包含在所述棉花植物中的基因的表达的RNA分子，其中被包含在所述棉花植物中的所述基因任选地在介导气孔开度中涉及。
3.如权利要求2所述的棉花植物细胞，其中任选地在介导气孔开度中涉及的所述蛋白质或所述基因选自碳酸酐酶、S型通道、OST1、HT1、在介导ABA应答中涉及的蛋白质。
4.如权利要求2或3所述的棉花植物细胞，其中所述RNA分子包括一种第一RNA区和一种第二RNA区，其中
1.所述第一RNA区包括与被包含在所述棉花植物中的所述基因的核苷酸序列具有至少约94％序列一致性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；
2.所述第二RNA区包括与所述第一RNA区的所述19个连续核苷酸互补的核苷酸序列；
并且
3.所述第一RNA区和所述第二RNA区能够碱基配对以在所述第一区与第二区的至少所述19个连续核苷酸之间形成双链RNA分子。
5.如权利要求1至4中任一项所述的棉花植物细胞，其中所述第一核酸序列包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
6.如权利要求1至5中任一项所述的棉花植物细胞，其中所述第一核酸序列由SEQ ID NO：1组成。
7.一种转基因棉花植物或其种子或一种棉花植物部分，包括
(a)一种嵌合基因，包括
a.一种第一核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少
80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先启动子活性；
b.一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列；以及
c.一种转录终止和多腺苷酸化序列；或
(b)根据权利要求1至6中任一项所述的棉花植物细胞。
8.一种在棉花中实现感兴趣的产物的气孔优先或气孔特异性表达的方法，该方法包括：
(a1)将一种嵌合基因引入一种棉花植物并且使该植物生长，该嵌合基因包括：一种第一核酸序列，该第一核酸序列包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少
80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者赋予所述嵌合基因的气孔优先或气孔特异性表达，一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列，以及一种转录终止和多腺苷酸化序列；或
(a2)使权利要求7所述的棉花植物生长或使来自权利要求7所述的种子的植物生长。
9.一种生产棉花植物或增加棉花植物的产量的方法，包括：
-引入或基因掺入一种嵌合基因，该嵌合基因包括一种第一核酸序列，该第一核酸序列包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先启动子活性，一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列，以及一种转录终止和多聚腺苷酸化序列；或
-使权利要求7所述的植物生长或使来自权利要求7所述的种子的植物生长。
10.一种检测转基因的表达的方法，该方法包括
(a)提供权利要求1至6中任一项所述的棉花植物细胞或权利要求7所述的植物，其中所述感兴趣的表达产物是该转基因；并且
(b)检测该转基因的表达。
11.一种用于调节棉花植物的水分利用率的方法，该方法包括
-向棉花植物中引入一种嵌合基因，该嵌合基因包括
a.一种第一核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少
80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先启动子活性；
b.一种编码在介导气孔开度中涉及的感兴趣的表达产物的第二核酸序列；以及c.一种转录终止和多腺苷酸化序列；
-使所述棉花植物生长。
12.如权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述嵌合基因是描述于权利要求1至6中任一项中的嵌合基因。
13.以下各项的用途
(a)权利要求7所述的棉花植物或种子；
(b)一种嵌合基因，包括
a.一种第一核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少
80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先启动子活性；
b.一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列；以及任选地
c.一种转录终止和多腺苷酸化序列；或
(c)一种核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先启动子活性；
用于一种转基因在棉花中的气孔优先表达，用于调节棉花植物的水分利用率或用于增加棉花产量。
14.如权利要求13所述用于气孔优先表达的用途，其中所述嵌合基因是描述于权利要求1至6中任一项中的嵌合基因。
转基因在棉花中的保卫细胞特异性表达
[0001] 在一个方面中，本申请披露了一种棉花植物细胞，该棉花植物细胞包括：(a)一种嵌合基因，该嵌合基因包括一种第一核酸序列，该第一核酸序列包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先启动子活性；(b)一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列；以及(c)一种转录终止和多腺苷酸化序列。此外，本申请披露了以下：一种棉花植物，在胁迫条件下、在棉花中表达转基因的方法，生产棉花植物的方法，检测转基因在胁迫条件下的表达的方法以及用于调节棉花植物对胁迫的抗性的方法，如在权利要求书中所表征的。
[0002] 近些年来，全球变暖、减少的淡水供应的现象以及两者对作物植物生产的作用已经成为一个关键问题。在植物科学水平解决这个难题几乎唯一地是应付植物胁迫的问题。现在，国际农业和环境研究机构重新发现植物胁迫是全球变暖对当地和全球的粮食生产的作用的主要组分。用于满足这些挑战的研究涉及在广泛发散的学科中的知识，例如大气科学、土壤科学、植物生理学、生物化学、遗传学、植物育种、分子生物学、以及农业工程。
[0003] 非生物植物环境胁迫构成对作物生产的主要限制。在全世界具有当代经济重要性的主要植物环境胁迫是水胁迫(包括干旱和洪水)、寒冷(低温和冻害)、高温、盐度、水涝、土壤矿物质缺乏、土壤矿质毒性以及氧化胁迫。这些因素都不是孤立的，而是相互关联并且相互影响。
[0004] 脱落酸(ABA)是在许多植物发育过程(包括芽休眠)中发挥作用的一种植物激素。此外，ABA在植物中介导对水胁迫、高盐胁迫、寒冷胁迫(Mansfield(曼斯菲尔德)1987，Yamaguchi-Shinozaki(山口-筱崎)1993，Yamaguchi-Shinozaki(山口-筱崎)1994)以及植物病原茵(Se0(赛欧)和Koshiba(小芝)，2002)的反应的胁迫应答。ABA是部份地经由叶绿体以及其他质体中的甲羟戊酸途径而产生的倍半萜类化合物(15-碳)。它部份地在叶绿体中合成并且因此生物合成主要发生在叶里。ABA的生产通过胁迫(例如水分流失和冷冻温度)而增加。人们相信，生物合成间接地通过类葫萝卜素的产生而发生。
[0006] 植物与植物之间的基础ABA水平可以非常不同。例如，在非胁迫拟南芥叶中的ABA的基础浓度是2至3ng／g鲜重(Lopez-Carbonell(洛佩兹-卡博内尔)和Jàuregui(豪雷吉)，2005)。在水胁迫条件下，ABA浓度达到是10至21ng／g鲜重。在另一方面中，在非胁迫棉花中，叶中的ABA浓度在145至2490ng／g鲜重之间变化(Ackerson(阿克森)，1982)。
[0007] 保卫细胞位于叶表皮中并且成对地围绕气孔，这允许用于光合作用碳固定的CO2流入以及经由蒸发向大气中的水分流失。保卫细胞中的信号转导机理整合了众多不同的刺激素用于调节气孔开度。气孔响应光而开放。响应干旱胁迫，植物合成触发气孔关闭的ABA。离子和水通过通道蛋白而转运穿过质膜和液泡膜改变膨胀和保卫细胞体积，由此调节气孔开度(Pandey(潘迪)等人，2007；Schroeder(施罗德)等人，2001；Kim(金姆)等人，2010)。
[0008] 如今，在农业实践和研究中的一个主要挑战是如何以一种经济并且环境可持续的途径来应付植物环境胁迫。鉴于已经存在的向非生物胁迫暴露的区域以及进行中的气候变化，改善或赋予对至少一种非生物胁迫的耐受性的转基因植物的供应仍然是一个主要目标，以也实现在全世界向此类非生物胁迫暴露的区域中的令人满意的营养状况。
[0009] 因此，在一个方面中，本申请披露了一种棉花植物细胞，该棉花植物细胞包括一种嵌合基因，该嵌合基因包括：(a)一种第一核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先或气孔特异性启动子活性；(b)一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列；以及(c)一种转录终止和多腺苷酸化序列。
[0010] 在本说明书中引用了许多文件，包括专利申请和制造商手册。这些文件的公开内容被认为与本发明的专利性无关，通过引用以其全文形式而特此结合。更确切地说，所有对比文件通过引用而结合，该引用的程度如同每个单独的文件被特定地并且单独地指明通过引用并入本文一样。
[0011] 如在此使用，“棉花”或“棉花植物”包括棉属物种，例如陆地棉、海岛棉、亚洲棉以及草棉或来自此类物种与其他物种的杂交或此类物种之间的杂交的后代。
[0012] 一个棉花植物细胞可以是实质上包括定义一个棉花植物所需的遗传信息的任何细胞，除了在此披露的嵌合基因之外，可以通过一个或更多另外的转基因被补充。细胞可以衍生自形成一个棉花植物的不同的器官和／或组织，包括但不限于果实、种子、胚、生殖组织、分生组织区域、愈伤组织、叶片、根、芽、花、管状组织、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
[0013] 除非另外指明，以下针对在此披露的嵌合基因而描述的实施例也适用于在此披露的其他方面的对应的实施例。
[0014] 如在此使用，术语“包括”将被解释为指定如提及的陈述的特征、整体、步骤或组分的存在，但是并不排除一个或多个特征、整体、步骤或组分、或它们的组的存在或添加。因此，例如一种包括核苷酸的或氨基酸的序列的核酸或蛋白质可以包括比实际引用的更多的核苷酸或氨基酸，即被嵌入在一个更大的核酸或蛋白质中或被附接至另一个核酸的或蛋白的一段序列。一种包括功能上或结构上定义的DNA区的嵌合基因可以相应地包括另外的DNA区等。然而，在本披露的背景下，术语“包括”还包括“由...组成”。
[0015] 嵌合基因是通过将不相关基因的或其他核酸序列的片段可操作地连接而构建的人工基因。换言之，“嵌合基因”指代在植物物种中一般找不到的基因或是指其中该基因的启动子或一个或多个其他调节区与被转录的核酸的一部分或所有在本质上不相关联的任何基因，即相对于被转录的核酸是异源的。更具体地说，嵌合基因是通过将该第一核酸序列(包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先或气孔特异性启动子活性)与该第二核酸序列(编码一种非自然地可操作地连接至所述核酸序列的感兴趣的表达产物)可操作地进行连接而产生的一种人工的(即非天然发生的)基因。
[0016] 本发明还涉及用于在棉花中使用的如上所述的嵌合基因。
[0017] 术语“异源”是指衍生自不同来源的两种或更多核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，相对于一个可操作地连接的核酸序列(例如编码序列)，一个启动子是异源的，如果这种组合在自然界中一般找不到的话。此外，一个具体的序列就它插入到的细胞或器官而言可以是“异源”的(例如在这个具体的细胞或器官中不是自然发生的)。例如，在此披露的嵌合基因是一种异源核酸。
[0018] 核酸可以是单链的或双链的DNA或RNA。核酸可以用化学方法合成或通过在体外或甚至在体内生物表达来产生。
[0019] 可以使用适当受保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA／RNA合成仪来用化学方法合成核酸。RNA合成试剂的供应商是Proligo(德国汉堡)，Dharmacon Research(拉斐特，CO，USA)，Pierce Chemical(皮尔斯化学品公司)((Perbio Science)普达科学的一部分，罗克福德，IL，USA)，Glen Research(格伦研究公司)(Sterling(斯特林)，VA，USA)，ChemGenes(Ashland(亚什兰)，MA，USA)，以及Cruachem(格拉斯哥，UK)。
[0020] 与本披露的嵌合基因相联系，DNA包括cDNA和基因组DNA。
[0021] 所述第一核酸序列具有气孔优先启动子活性。换言之，在包括所述嵌合基因的植物的气孔中优先诱导所述嵌合基因的表达。
[0022] 如果由一个启动子控制的核酸序列的转录在保卫细胞中比在任何其他植物组织的细胞中高至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少50倍，那么所述启动子是气孔优先的。对于本发明而言，该启动子还可以是气孔特异性的。在本发明的背景下，“气孔特异性”表达(或等价的“转录”)意味着由转录调节元件(例如启动子)以下方式的对核酸序列的转录：所述核酸序列在保卫细胞中的转录在整个植物中在其发育的任何阶段的过程中为来自所述核酸序列的转录RNA的总量做出的贡献大于50％、优选大于60％、更优选大于70％、甚至更优选大于80％。
[0023] 因此，对该第一核酸序列的长度及其在SEQ ID NO：1内的位置进行选择，这样使得它是足够长的并且被定位的，这样使得包括该第一核酸序列的嵌合基因的表达在保卫细胞(气孔)中被优先地或特异性地诱导。
[0024] 对启动子序列或功能启动子片段的启动子活性(在本情况中是气孔优先或气孔特异性)的确认由本领域的普通技术人员来确定，例如使用在此描述的启动子序列的启动子报告基因构建体，该启动子序列可操作地连接至如在此进一步解释的一种容易可得分的标志物。此类容易可得分的标志物，例如处于报告基因的形式，可以是例如β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因、以及编码具有荧光或发磷光特性的蛋白(例如来自维多利亚多管发光水母(Aequora Victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶)的基因。随后，将这样的嵌合基因引入进植物中并且相对于标志物在该植物的其他部分中的表达模式对气孔中该标志物的表达模式进行分析。例如为了定义最小启动子，通过本领域中熟知的重组DNA技术将表示启动子的核酸序列可操作地连接至标志物(报告基因)基因的编码序列。该报告基因可操作地连接该启动子的下游，这样使得在该启动子处起始的转录本通过该报告基因进行。可以通过本领域中熟知并且在本申请中的其他地方描述的转化技术将包含在该启动子的控制下的该报告基因的表达盒引入进一个适当的细胞型。为测定该报告蛋白，细胞裂解液被配制并且本领域中熟知的用于报告蛋白的适当的测定方法被执行。例如，假如CAT是选择的报告基因，将用构建体(包含在研究的启动子控制下的CAT)转染的细胞转染裂解液与同位素标记的氯霉素和乙酰辅酶A(乙酰-CoA)混合在一起。该CAT酶转移来自乙酰-CoA的乙酰基至氯霉素的2-位或3-位上。该反应通过薄层色谱法监测，其从未反应的材料分离乙酰化的氯霉素。这些反应产物此后通过放射自显影法被可视化。酶活性的水平对应于产生的酶量，这反过来揭示了启动子或片段或其变体在不同细胞或组织中的表达水平和气孔优先或气孔特异功能性。这个表达水平也可以被用来与其他启动子比较以确定研究中的该启动子相对强度。一旦确认了活性和功能性，另外的突变和／或缺失分析可以被采用以确定例如起始转录所需的最小区域和／或序列。因此，序列可以在该启动子区的5′末端和／或该启动子区的3′末端、或该启动子序列内被缺失，和／或可以引入核苷酸替代物。然后，将这些构建体再次引入细胞并且如上所述确定及其活性和／或功能性。
[0025] 除了测量一个报告酶的活性外，不同细胞型或组织中的该转录启动子的活性(和功能性)也可以通过测量生产RNA的水平来确定。这种RNA水平，例如mRNA，可以在一个单一时间点或在一个多重时间点被检测并且像这种成倍增加的可以是平均成倍增加或一个衍生自实验检测值的外推值。由于它是一个比较的水平，任何检测mRNA水平的方法可以被使用。在一个实例中，比较的组织或器官是带有气孔的叶或叶组织，两者优选是不带有气孔。在另一个实例中，对多重组织或器官进行比较。多重比较的一个实例是与2、3、4、或选自下组的组织或器官进行比较的气孔，该组由以下各项组成：花组织、花原端、花粉、叶(优选是不带有气孔)、胚、芽、叶原基、芽原端、根、根尖、维管组织和子叶。如在此使用，植物器官的实例是种子、叶、根等，并且组织的实例是叶原基、芽原端、维管组织等。启动子的活性或强度按照它具体地生产mRNA或蛋白质积累的量被测量，这是相对于该mRNA或蛋白质的总量。
[0026] 在一些实例中，具有气孔优先或气孔特异性启动子活性的所述第一核酸序列可以相应地包括SEQ ID NO：1的至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少1100个、至少1200个、至少1300个、至少1400个、至少1500个或至少1600个连续核苷酸。在另一个实例中，所述第一核酸序列包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列。在又另一个实例中，所述第一核酸序列由SEQ ID NO：1组成。
[0027] 在一个实例中，如上所述的该第一核酸包括SEQ ID NO：1的3′末端。所述3′末端包括SEQ ID NO：1的至少前100个碱基，至少前200个碱基，至少前300个碱基，至少前400个碱基，至少前500个碱基，至少前600个碱基，至少前700个碱基，至少前800个碱基，至少前900个碱基，至少前1000个碱基，至少前1100个碱基或至少前1200个碱基。
[0028] 在一个方面中，提供了用于具有气孔优先或气孔特异活性的启动子的核酸序列，这些核酸序列包括与SEQ ID NO：1具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的核苷酸序列。此类核酸序列还包括人工衍生的核酸序列，例如像通过使用SEQ ID NO：1的位点定向诱变产生的那些。通常，在此披露的核苷酸序列变体与SEQID NO：1的核酸序列可以具有至少70％，例如72％、74％、76％、78％，至少80％，例如，81％至84％；至少85％、例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、至98％、以及99％的序列一致性。
97％、至98％、以及99％的序列一致性。
[0029] 如在此使用，术语“序列一致性百分数”是指一个最优比对的DNA窗口的两个区段之间的一致性核苷酸的百分数。用于比对一个比较窗口的最优序列比对对于本领域的普通技术人员是熟知的并且可以通过以下工具进行，例如Smith(史密斯)和Waterman(沃特曼)的局部同源算法(Waterman(沃特曼)，M.S.，Chapman&Hall.伦敦，1995)，Needleman(内德勒曼)和Wunsch(文施)的同源比对算法(1970)，Pearson(皮尔逊)和Lipman(李普曼)的相似性方法的查找(1988)，并且优选地通过这些算法的计算机化实施，例如GAP、BESTFIT、FASTA和作为GCG(注册商标)、威斯康星软件套装(Wisconsin Package)(来自加州圣迭戈的材料科学软件有限公司(Accelrys Inc.)的注册商标)的部分可获得的TFASTA。一种用于一个测试序列和一个参考序列的经比对的区段的“一致性分数”是这两个经比对的序列分享的相同组分的数目除以该参考序列区段(即，该全部参考序列或该参考序列的一个更小定义部分)中的组分的总数目。百分数序列一致性被表示为一致性分数乘以100。一种或更多DNA序列的比较可以是与一种全长DNA序列或其一部分或与一种更长DNA序列比较。基于较短的核苷酸序列计算序列一致性。
[0030] 只有具有上面表明程度的序列一致性、具有气孔优先或气孔特异性启动子活性的第一核酸序列才被本发明涵盖。表示在此披露的气孔优先或气孔特异性启动子的核酸序列还可以包括，但不限于：序列的缺失，单个或多个点突变，在具体的限制性内切酶识别位点处的改变，功能性元件的添加，或可以增强或以另外的方式改变启动子表达的其他分子修饰手段，只要基本保留气孔优先或气孔特异活性。用于获得此类衍生物的技术在本领域中是熟知的(参见例如，J.F.Sambrook(萨姆布鲁克)，D.W.Russell(罗素)，以及N.Irwin(欧文)，2000)。例如，一个本领域的普通技术人员可以在在此披露的该启动子中界定这些功能性元件并且缺失任何非必要元件。这些功能性元件可以被修饰或组合以增加本发明的序列用于任何具体应用的效用和表达。本领域的普通技术人员对于描述用于构建、操作和分离高分子(例如DNA大分子、质粒等)的具体条件和过程的标准来源材料，连同重组有机体的产生和筛选和DNA分子的分离是熟悉的。
[0031] 例如，可以改变具有SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸的启动子序列以及如在此所描述的它的变体以包含例如用于协助升高基因表达的“增强子DNA”。如本领域所熟知的，某些DNA元件可以被使用以增强DNA的转录。这些增强子经常在真核细胞中行使功能的启动子的转录起始5’端被发现，但是可以经常被插入至编码序列的上游(5’)或下游(3’)。在一些情况中，这些增强子DNA元件是内含子。在这些内含子中作为增强子DNA有用的是来自水稻肌动蛋白1基因(参见US5641876)、水稻肌动蛋白2基因、拟南芥组蛋白4内含子、玉米乙醇脱氢酶基因、玉米热激蛋白70基因(参见US5593874)、玉米萎缩1基因、马铃薯光敏1基因、以及矮牵牛热激蛋白70基因(参见US5659122)的5’端内含子。因此，如在此考虑，一个启动子或启动子区包括通过插入或缺失调控区、使该启动子经受随机诱变或位点定向诱变等而衍生的启动子变异。如上所述，一个启动子的活性或强度可以通过按照它生产RNA的量被测定，或通过在一个细胞或组织中蛋白质积累量被测定，这是相对于一个转录活性以前被测定过的启动子而言。
[0032] 表达产物指代由编码此类产物的核酸、DNA或RNA(例如在此所描述的第二核酸)的转录以及可任选地翻译而产生的中间产物或终产物。在转录过程期间，在调节区(特别是启动子)的控制下的DNA序列被转录为RNA分子。RNA分子可以本身形成表达产物亦或当它能够被翻译为肽或蛋白质时可以是中间产物。当作为一个基因的表达的终产物的RNA例如能够与另一个核酸或蛋白质相互作用的时，就说该基因编码作为表达产物的RNA分子。RNA表达产物的实例包括抑制性RNA，例如像正义RNA(共抑制)、反义RNA、核糖核酸酶、miRNA或siRNA、mRNA、rRNA以及tRNA。当一个基因的表达的终产物是蛋白质或肽时，就说该基因编码作为表达产物的蛋白质。
[0033] 在本披露的范围内，还可以使用与上述第一核酸序列和第二核酸序列组合的其他调节序列，这些调节序列位于包括一个启动子的所述第一核酸序列与包括表达产物的编码序列的所述第二核酸序列之间。此类调节序列的非限制性实例包括转录激活子(“增强子”)，例如描述于申请WO87／07644中的烟草花叶病毒(TMV)的翻译激活子，或由Carrington&Freed(卡林顿&弗里德)1990，J.Virol.(《病毒性杂志》)64：1590-1597描述的烟草蚀纹病毒(TEV)的翻译激活子，或如在本申请的其他地方描述的内含子。其他适合的调节序列包括5'UTR。如在此使用，5'UTR，也被称为前导序列，是信使RNA(mRNA)的一个特定区域，位于转录起始位点与编码区的起始密码子之间。在mRNA稳定性和翻译效率中涉及到它。例如，可以利用35S转录起始位点下游的矮牵牛叶绿素a／b结合蛋白基因的5′非翻译前导区来增加报告基因表达的稳态水平(Harpster(哈帕斯特)等人，1988，Mol Gen Genet.(《分子遗传学和普通遗传学》)212(1)：182-90)。WO95／006742描述了使用来源于编码热激蛋白的基因的5′非翻译前导序列来增加转基因表达。
[0034] 嵌合基因还可以包括在植物细胞，特别是棉花植物细胞中可操作的转录终止或多腺苷酸化序列。作为转录终止或多腺苷酸化序列，可以使用细菌来源的任何相对应的序列，例如像根瘤农杆菌的nos终止子；病毒来源的任何相对应的序列，例如像CaMV35S终止子；或植物来源的任何相对应的序列，例如像描述于公开的专利申请EP0633317A1中的组蛋白终止子。
[0035] SEQ ID NO：1的核苷酸序列代表发现于拟南芥属(Yang(杨)等人，2008)中3’-5’方向的启动子。该启动子包括至少两种类型的顺式作用元件，其中之一ABRE样在ABA-相关联的胁迫应答中涉及并且另一个表示已经被证明有助于保卫细胞特异性基因表达的基序(T／A)AAAG。
[0036] 在本发明的过程中已经显示，对应于来自拟南芥的GC启动子(pGC)的SEQ ID NO：1的核酸序列(Yang(杨)等人，Plant Methods(《植物方法》)2008，4：6)足够用于激活可操作地连锁基因在棉花叶的气孔中的优先或特异性转录。
[0037] 一些植物中ABA的丰富浓度可以导致ABA-应答启动子的组成型诱导，因此阻止所述启动子在某些组织或器官中的特异性表达。
[0038] 拟南芥叶中的ABA的基础浓度是2-3ng／g鲜重(López-Carbonell(洛佩兹-卡博内尔)和Jàuregui(豪雷吉)，2005)。在干旱胁迫条件下，ABA浓度达到是10-21ng g-1鲜重(f.w.)。然而，在非胁迫棉花植物中，叶中的ABA浓度已经在145至2490ng g-1f.w.之间变化(Ackerson(阿克森)，1982)。预计棉花中这个范围的浓度将是永久地激活当被引入进棉花中时对ABA应答的启动子。
[0039] 诸位发明人使用在包括ABA-应答元件(ABRE)的GC1启动子的控制下的GUS报告基因生产了转基因棉花植物。在本发明的过程中，出人意料地发现该启动子区触发棉花植物的叶的气孔中的GUS特异性表达。出人意料地，尽管棉花叶中的ABA内源水平是高的，但是GC1启动子的活性在气孔中被选择性诱导。
[0040] 下面将描述上述嵌合基因连同在此披露的不同其他方面的效用。例如，可以使用本申请的披露来调节棉花植物中的气孔开度，例如以促进在棉花植物的一生中被至少一次暴露于一种或多种非生物胁迫的区域中的棉花植物的生长。
[0041] 在如在此所描述的棉花植物细胞的一个实例中，所述感兴趣的表达产物是(i)可任选地在介导气孔开度中涉及的蛋白质或肽或(ii)能够调节被包含在所述棉花植物中的基因的表达的RNA分子，其中可任选地，在介导气孔开度中涉及被包含在所述棉花植物中的所述基因。被包含在棉花植物中的基因对于该棉花植物而言可以是内源的或可以是已经被引入进所述棉花植物中。后者特别适用于对于棉花植物而言不是内源的靶表达产物或适用于在棉花植物中是内源的但来源于其他有机体的表达产物的同系物。
[0042] 如在此使用，术语“蛋白质”描述了一组由多于30个氨基酸组成的分子，但是术语“肽”描述了由最多30个氨基酸组成的分子。蛋白质和肽可以进一步形成二聚体、三聚体和更高的寡聚物，例如组成多于一个(聚)肽分子。形成的此类二聚体、三聚体等的蛋白质或肽类分子可以是相同的或不同的。结果是，相应的更高级结构被叫做同源二聚体或异源二聚体，同源三聚体或异源三聚体等。术语“蛋白质”和“肽”也指天然地修饰蛋白质或肽，其中修饰由例如糖基化、乙酰化、磷酸化等实现。这些修饰在本领域是熟知的。
[0043] 所述感兴趣的表达产物还可以是能够调节被包含在所述棉花植物中的基因的表达的RNA分子，其中在介导气孔开度中可任选地涉及所述基因。
[0044] 在介导气孔开度中可任选地涉及、适合作为表达产物的蛋白质和核酸(例如基因)的实例包括：
[0045] 在介导气孔开度中涉及的基因的实例包括编码碳酸酐酶、OST1、HT1或在介导ABA应答中涉及的蛋白质的那些。
[0046] 对于RNA分子的情况而言，将清楚的是，每当参照相对应的DNA分子的核苷酸序列来定义RNA分子的核苷酸序列，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)应该被尿嘧啶(U)替代。无论参照RNA分子还是DNA分子，从本申请的背景中都将是清楚的。
[0047] 术语“能够调节基因的表达”尤其涉及RNA分子(例如如在此所描述的抑制性RNA分子)以不同方式对靶基因的表达水平的影响的作用。这可以通过抑制靶基因的表达来实现，靶基因表达的抑制通过直接与驱动所述表达的组分相互作用，例如基因本身或转录的mRNA，这导致表达的减少；或在抑制基因的表达中涉及的另一个基因，其中在介导气孔开度中可任选地涉及所述基因。
[0048] 抑制性RNA分子减少其靶表达产物的mRNA的水平，例如可用于翻译为所述靶蛋白的靶蛋白。以此方式，可以抑制蛋白质的表达，例如在气孔开放或关闭(开度)中涉及的那些。这可以通过已建立的技术实现，包括共抑制(正义RNA抑制)、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、或微小RNA(miRNA)。
[0049] 作为如在此披露的表达产物的RNA分子包括编码靶表达产物(例如靶蛋白或RNA)的核苷酸序列的一部分或同源序列，以下调所述靶表达产物的表达。作为表达产物用于在下调表达中使用的RNA分子的另一个实例是反义RNA分子，该反义RNA分子包括与编码表达产物(例如感兴趣的蛋白质或RNA)的核苷酸序列的至少一部分或同源序列互补的核苷酸序列。在这里，例如可以通过引入这种反义RNA或编码此类RNA分子的嵌合DNA来实现下调。在又另一个实例中，可以通过引入一个双链RNA分子来下调感兴趣的表达产物(例如感兴趣的蛋白质或RNA)的表达，该双链RNA分子包括对应于并且分别与编码所述感兴趣的表达产物的基因序列的至少一部分互补的正义RNA区和反义RNA区，该正义RNA区和反义RNA区能够与彼此形成双链RNA区。此类双链RNA分子可以由如上所述的正义分子和反义分子以及由正在被处理以形成siRNA(例如如描述于EP1583832中)或miRNA的单链分子来编码。
[0050] 在一个实例中，可以通过引入嵌合DNA构建体来下调靶蛋白的表达，该嵌合DNA构建体产生能够通过共抑制来下调表达的正义RNA分子。转录时转录的DNA区将产生一种所谓的正义RNA分子，，该正义RNA分子能够以一种转录或转录后方式减少编码靶表达产物(例如靶蛋白或RNA)的基因在靶植物或植物细胞中的表达。转录的DNA区(和生成的RNA分子)包括与编码存在于该植物细胞或植物中的靶表达产物(例如靶蛋白)的核苷酸序列的相对应的部分具有至少95％序列一致性的至少20个连续核苷酸。
[0051] 可替代地，用于下调靶表达产物(例如靶蛋白或RNA)的表达的表达产物是反义RNA分子。以一种转录或转录后方式实现感兴趣的表达产物在靶棉花植物或植物细胞中的表达的下调或减少。转录的DNA区(和生成的RNA分子)包括与编码存在于该植物细胞或植物中的所述靶表达产物的核酸序列的相对应的部分的补体具有至少95％序列一致性的至少20个连续核苷酸。
[0052] 然而，编码靶表达产物的核酸序列的约20nt的反义RNA区或正义RNA区的最小核苷酸序列可以被包含在一个更大的RNA分子内，该RNA分子的大小从20nt至等于靶基因的长度变化。因此，提及的反义核苷酸区或正义核苷酸区可以是约从约21nt至约5000nt长，例如长度为21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt或甚至约5000nt或更大。此外，以下不是本发明的目的所要求的：使用的抑制性RNA分子的核苷酸序列或转基因的编码区与编码靶表达产物的靶基因完全相同或互补，该靶基因对该植物而言可以是内源的或已经被引入，该靶表达产物的表达被靶向以在该植物细胞中被减少。序列越长，对总体序列一致性的要求越不严格。因此，正义区或反义区与靶基因或其补体的核苷酸序列可以具有约40％或50％或60％或70％或80％或90％或100％的总体序列一致性。然而，如所提及，反义区或正义区应该包括与编码靶基因的核苷酸序列具有约95％至约100％序列一致性的20个连续核苷酸的核苷酸序列。约95％至约100％序列一致性的一段序列可以是约50nt、75nt或100nt。
[0053] 还可以通过包含DNA元件来进一步增强上面提及的嵌合基因用于反义RNA或正义RNA介导的基因表达水平下调的效率，这些DNA元件导致异常的、非多腺苷酸化抑制性RNA分子的表达。适合该目的的这样一种DNA元件是编码自我剪接核酶的DNA区，如描述于WO00／01133中。如描述于WO03／076619中，还可以通过为产生的RNA分子提供核定位信号或核保留信号来增强效率。
[0054] 此外，如在此所描述的表达产物可以是产生能够下调编码靶表达产物的基因的表达的双链RNA分子的核酸序列。当DNA区的转录时，RNA能够通过正义区与反义区之间的常规碱基配对来形成dsRNA分子，由此该正义区和该反义区是如在上文所描述的核苷酸序列。根据WO99／53050的披露，根据本发明的作为dsRNA的表达产物可以进一步包括位于例如正义RNA区与反义RNA区之间的间隔区序列中的内含子，例如异源内含子。为了实现这样的一种转基因的构建，可以使用描述于WO02／059294A1中的载体。
[0055] 在一个实例中，所述RNA分子包括一种第一RNA区和一种第二RNA区，其中1.所述第一RNA区包括与被包含在所述棉花植物中的所述基因的核苷酸序列具有至少约94％序列一致性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；2.所述第二RNA区包括与所述第一RNA区的所述19个连续核苷酸互补的核苷酸序列；3.所述第一RNA区和所述第二RNA区能够碱基配对以在所述第一区与第二区的至少所述19个连续核苷酸之间形成双链RNA分子。
[0056] 感兴趣的表达产物的另一个实例是能够引导从编码靶表达产物(例如蛋白质或RNA)的DNA转录的将被翻译为所述靶表达产物的mRNA的切割的微小RNA分子(可以从前体微小RNA分子进行加工的miRNA)。可以通过如在此所描述的嵌合基因的表达将miRNA分子或前体miRNA分子方便地引入进植物细胞，该嵌合基因包括一种编码感兴趣的表达产物的(第二)核酸序列，像miRNA、前体miRNA或初级miRNA转录本。
[0057] miRNA是不仅在植物中，而且在其他真核生物中调节基因表达的小的内源RNA。如在此使用，“miRNA”是可以被加载进RISC复合体中并且指导靶RNA分子的切割的长约19个至22个核苷酸的RNA分子，其中该靶RNA分子包括与该miRNA分子的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列。在一个实例中，以下错配中的一种或多种可以出现在miRNA分子的基本上互补的序列中：
[0058] -在所述miRNA的5’末端的核苷酸与靶RNA分子中的相对应的核苷酸序列之间的错配；
[0059] -在所述miRNA的位置1至位置9中的任一核苷酸与靶RNA分子中的相对应的核苷酸序列之间的错配；
[0060] -在所述miRNA的位置12至位置21中的任一核苷酸与靶RNA分子中的相对应的核苷酸序列之间的三个错配，其条件是不存在多于两个连续错配；
[0061] -在miRNA的位置10至11处不允许错配(所有miRNA位置从该miRNA分子的5’末端开始表明)。
[0062] 如在此使用，“前体miRNA”分子是具有约100个至约200个核苷酸、优选是约100个至约130个核苷酸的RNA分子，它可以采用一种二级结构，该二级结构包括dsRNA茎和单链RNA环并且在双链RNA茎中进一步包括miRNA的核苷酸序列以及它的补体(miRNA*)的序列。优选地，miRNA及其补体位于从miRNA dsRNA茎的自由端的约10个至约20个核苷酸处。单链环区的长度和序列不是关键的并且可以变化相当大，例如长度在30nt与50nt之间。优选地，在未配对RNA结构与配对RNA结构之间的自由能的差异在-20千卡／摩尔与-60千卡／摩尔之间，特别是在-40千卡／摩尔附近。miRNA与miRNA*之间的互补性不需要是完美的并且可以容忍未配对的核苷酸的约1个至3个凸起。可以通过本领域中常规的计算机算法(例如mFold、UNAFold以及RNAFold)来预测RNA分子采用的二级结构。来自前体miRNA的由DCL活性释放并且被装载到RISC复合体上的dsRNA茎的具体的链由5’末端的互补性的程度决定，由此在其5’末端最少涉及被切割的dsRNA茎的不同链的核苷酸之间的氢键作用的链被装载到RISC复合体上并且将决定靶RNA分子降解的序列特异性。然而，如果以经验为主地，因为“错的”链被装载到RISC复合体上，来自具体合成的前体miRNA分子的miRNA分子是非功能性的，那么将立即明显的是这个问题可以通过交换miRNA分子及其补体在前体miRNA分子的dsRNA茎的对应的链上的位置来解决。如本领域中已知的，涉及两个氢键的A与U之间的结合、或涉及两个氢键的G与U之间的结合比涉及三个氢键的G与C之间的结合要弱。
[0063] miRNA分子可以被包含在其天然发生的前体miRNA分子内，但是还可以通过将正常地加工自此类已经存在的前体miRNA分子的miRNA分子的核苷酸序列换为感兴趣的另一个miRNA的核苷酸序列来将它们引入进已经存在的前体miRNA分子支架中。前体miRNA的支架还可以是完全合成的。同样地，合成的miRNA分子可以被包含在已经存在的前体miRNA分子支架或合成的前体miRNA分子支架中，并且从其中加工。
[0064] 表达产物的实例还可以是催化其自身切割或其他RNA的切割的核酶。
[0065] 在此披露的棉花植物细胞的一个实例中，调节是增加，介导是抑制，并且所述第二核酸序列编码一种RNA，当被转录时其产生能够增加被包含在所述棉花植物中的第一基因的表达的RNA分子，例如，通过靶向在下调所述第一基因的表达中涉及的基因。
[0066] 在此披露的棉花植物细胞的另一个实例中，调节是减少，介导是激活，并且所述第二核酸序列编码一种RNA，当被转录时其1.产生能够减少被包含在所述棉花植物中的第一基因的表达的RNA分子，例如，通过靶向在上调所述基因的表达中涉及的基因；或2.产生能够减少被包含在所述棉花植物中的所述基因的表达的RNA分子，例如通过直接靶向这一基因。
[0067] 基于RNA的表达产物的实例包括抑制性RNA，例如miRNA、siRNA、反义RNA或靶向PARP(聚(ADP-核糖)聚合酶)家族的酶的核酶，其实例还披露于国际专利申请PCT／EP2010／003438中。
[0068] 有待靶向的基因的实例可以编码在介导气孔开度的信号转导途径中涉及的蛋白质(参见例如Hubbard(哈伯德)等人，2010)。
[0069] 在此描述的棉花植物细胞的一个实例中，所述嵌合基因的所述第一核酸序列包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性并且具有气孔优先或气孔特异性启动子活性的一种核酸序列。
[0070] 在此描述的棉花植物细胞的另一个实例中，所述嵌合基因的所述第一核酸序列由SEQ ID NO：1或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性并且具有气孔优先或气孔特异性启动子活性的一种核酸序列组成。
[0071] 在本申请的实例中已经显示，转基因或嵌合基因可以在棉花植物的保卫细胞(气孔)中的GC1启动子的控制下高效表达。这使能够通过为该植物提供编码增强水分利用率的表达产物的序列来减轻某些胁迫条件(例如干旱)的作用。此类表达产物将通常是抑制气孔开放的那些或抑制在激活气孔开度中涉及的机制的那些。
[0072] 干旱是对于农业而言遍及全世界的最严重的问题之一。全世界十分之四的农业用地位于干旱或半干旱地区。短暂的干旱可以导致家畜死亡、饥荒以及社会混乱。其他农业地区始终具有低的雨量并且依赖灌溉来维持产量。在两种情况下，可以最有效率的使用水并且维持可接受的产量的作物植物将处于优势地位。
[0073] 在另一个方面中，本申请披露了一种棉花植物或其种子或植物部分，包括：(a)一种嵌合基因，该嵌合基因包括a.一种第一核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先或气孔特异性启动子活性；b.一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列；以及c.一种转录终止和多腺苷酸化序列；或(b)在此描述的棉花植物细胞。(a)中描述的嵌合基因可以是如在上文所描述的嵌合基因，包括与其相关的所有变种。
[0074] 在一些实施例中，在此描述的棉花植物细胞是非繁殖植物细胞或不能被再生为植物的植物细胞或不能通过光合作用通过从无机物(例如水、二氧化碳、以及无机盐)合成碳水化合物和蛋白质来维持其生命的植物细胞。
[0075] 种子通过一个胚体形成，与贮藏的营养物质一起被种皮包围。它是裸子植物和被子植物成熟胚珠的产物，棉花属于后者，其发生在受精后并且在某种程度上在木本植物中生长。
[0076] 在另一个方面中，披露了在棉花中实现感兴趣的产物的气孔优先或气孔特异性表达的方法：(a1)将一种嵌合基因引入棉花植物并且使该植物生长，该嵌合基因包括：一种第一核酸序列，该第一核酸序列包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先或气孔特异性启动子活性，一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列，以及一种转录终止和多腺苷酸化序列；或(a2)使在此描述的该棉花植物生长或使来自在此描述的种子的植物生长。(a1)中描述的嵌合基因可以是如在上文所描述的嵌合基因，包括与其相关的所有变种。
[0077] 与本申请相联系的“引入”涉及在一个植物细胞或植物中通过人工手段放置遗传信息。这可以通过本领域中用于向植物细胞、组织、原生质体或全植物中引入RNA或DNA的任何方法来实现。此外，“引入”还包括掺入如下进一步定义的基因。
[0078] 许多方法可以用于将DNA转移至植物细胞中。棉花的农杆菌介导的转化已被描述例如在US专利5,004,863，在US专利6,483,013和WO2000／71733。
[0079] 植物也可以通过粒子轰击转化：金粒子或钨粒子涂覆DNA然后发射进入幼小植物细胞或植物胚。这种方法也允许植物原生质体的转化。通过粒子轰击的棉花转化在例如WO92／15675中被报道。
[0080] 病毒转化(转导)可以被用于基因的瞬间或稳定表达，这依赖该病毒基因组的性质。该希望的遗传物质被打包进入一个合适的植物病毒并且该修饰的病毒被允许感染植物。该感染的植物的后代是无病毒的并且也是无插入基因的。用于病毒转化的合适方法被描述或进一步详细说明例如在WO90／12107，WO03／052108或WO2005／098004中。
[0081] “基因掺入”意味着通过天然手段在植物的基因组中整合基因，即通过将包括在此描述的嵌合基因的植物与不包括所述嵌合基因的植物进行杂交。可以针对包括该嵌合基因的那些对后代进行选择。
[0082] 进一步的转化和基因掺入方案还可以发现于US专利7,172,881中。
[0083] 可以例如通过转化将嵌合基因引入进可以从其中衍生胚性愈伤组织的棉花植物中，例如Coker312、Coker310、Coker5Acala SJ-5、GSC25110、FIBERMAX819、Siokra1-3、T25、GSA75、Acala SJ2、Acala SJ4、Acala SJ5、Acala SJ-C1、Acala B1644、Acala B1654-26、Acala B1654-43、Acala B3991、Acala GC356、Acala GC510、Acala GAM1、Acala C1、Acala Royale、Acala Maxxa、Acala Prema、Acala B638、Acala B1810、Acala B2724、Acala B4894、Acala B5002、非Acala“采摘者(picker)”Siokra、“stripper”品种FC2017、Coker315、STONEVILLE506、STONEVILLE825、DP50、DP61、DP90、DP77、DES119、McN235、HBX87、HBX191、HBX107、FC3027、CHEMBRED A1、CHEMBRED A2、CHEMBRED A3、CHEMBRED A4、CHEMBRED B1、CHEMBRED B2、CHEMBRED B3、CHEMBRED C1、CHEMBRED C2、CHEMBRED C3、CHEMBRED C4、PAYMASTER145、HS26、HS46、SICALA、PIMA S6ORO BLANCO PIMA、FIBERMAX FM5013、FIBERMAX FM5015、FIBERMAX FM5017、F用ERMAX FM989、FIBERMAX FM832、FIBERMAX FM966、FIBERMAX FM958、FIBERMAX FM989、FIBERMAX FM958、FIBERmAX FM832、FIBERMAX FM991、FIBERMAX FM819、FIBERMAX FM800、FIBERMAX FM960、FIBERMAX FM966、FIBERMAX FM981、FIBERMAX FM5035、FIBERMAX FM5044、FIBERMAX FM5045、FIBERMAX FM5013、FIBERMAX FM5015、FIBERMAX FM5017或FIBERMAX FM5024以及具有其衍生基因型的植物。
[0084] 在一个进一步的方面中，本申请披露了一种生产棉花植物或增加棉花组的产量的方法，包括：引入一种嵌合基因，该嵌合基因包括：一种第一核酸序列，该第一核酸序列包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先或气孔特异性启动子活性，一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列，以及一种转录终止和多腺苷酸化序列；或使在此描述的植物生长或使来自在此披露的种子的植物生长。引入的嵌合基因可以是如在上文所描述的嵌合基因，包括与其相关的所有变种。如在本申请的其他地方描述的，由被包含在所述嵌合基因中的所述第二核酸序列编码的感兴趣的表达产物可以在气孔开度的介导中涉及。
[0085] 在此还披露了一种使棉花生长的方法，包括(a1)提供在此所描述的转基因植物或由在此所描述的生产棉花植物的方法产生的转基因植物；或(a2)在植物中引入在此所描述的嵌合基因；(b)使(a1)或(a2)的植物生长；以及(c)收获由所述植物产生的棉花。
[0086] 在此还披露了一种检测转基因的表达的方法，包括(a)提供在此披露的棉花植物细胞或植物，其中所述感兴趣的表达产物是该转基因并且；(b)检测该转基因的表达。
[0087] 术语“转基因的表达”涉及使用在棉花细胞中发挥作用的适当的表达控制元件，在此披露的嵌合基因的可转录以及任选地可翻译部分的转录以及任选地翻译。如上所描述，在此披露的第一核酸序列具有气孔优先或气孔特异性启动子活性并且因此适合在棉花的气孔中表达选择的表达产物(对应于第二核酸序列)。
[0088] 能以多种方式实现“检测转基因的表达”。在该转基因是报告基因的情况下，取决于使得它成为报告基因的特征，所述报告基因的表达是简单地可检测的。例如，如果该报告基因是能够将底物转化为视觉上可检测的产物的酶，那么可以通过依赖所述产物的颜色或依赖由所述产物射出的光的波长的适当的手段来检测所述产物。在该转基因不是常规的报告基因但是具有酶活性的情况下，可以由了解所述酶活性的熟练的人员来设计测定以用合适方法追踪并且量化它。此外，具有已知核酸序列的转基因的表达可以通过以下方法进行测量：PCR方法，包括披露于Zanoni(扎诺尼)等人(Nature(《自然》)2009，460，p：264-269，还参见Nature Protocols(《自然方案》)：mRNA expression analysis by Real-Time PCR(通过实时PCR的mRNA表达分析)；ISSN：1754-2189)以及Logan(洛根)，Edwards(爱德华兹)和Saunders(桑德斯)(编辑；实时PCR：Current Technology and Applications(《当前技术和应用》)，Caister Academic Press(Caister学术出版社)2009，ISBN：978-1-904455-39-4)中的PCR方法；通过测序技术，包括披露于在http：／／www.illumina.com／documents／products／datasheets／datasheet_mrna_expression.pdf可获得的Illumina数据表“mRNA表达分析”(2010)中的测序技术；以及通过杂交技术，例如披露于Chaudhary(乔杜里)等人(2008)中的杂交技术。
[0089] 在此还披露了一种用于调节棉花植物的水分利用率(WUE)的方法，包括：向棉花植物中引入一种嵌合基因，该嵌合基因包括a.一种第一核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先或气孔特异性启动子活性；b.一种编码在气孔开度的介导中涉及的感兴趣的表达产物的第二核酸序列；以及c.一种转录终止和多腺苷酸化序列；并且使所述植物生长。
[0090] 在用于调节棉花植物的水分利用率的方法的一个实例中，调节是增加。在这种情况下，所述第二核酸序列可以编码一种RNA，当被转录时其1.产生能够增加被包含在所述棉花植物中的第一基因的表达的RNA分子，该RNA分子触发气孔关闭，例如通过靶向在下调所述第一基因的表达中涉及的基因；或2.产生能够减少被包含在所述棉花植物中的基因的表达的RNA分子，该RNA分子触发气孔开放，例如通过直接靶向这一基因。
[0091] 在用于调节棉花植物的水分利用率的方法的另一个实例中，调节是减少。在这种情况下，所述第二核酸序列可以编码一种RNA，当被转录时其1.产生能够增加被包含在所述棉花植物中的第一基因的表达的RNA分子，该RNA分子触发气孔开放，例如通过靶向在下调所述第一基因的表达中涉及的基因；或2.产生能够减少被包含在所述棉花植物中的基因的表达的RNA分子，该RNA分子触发气孔关闭，例如通过直接靶向这一基因。
[0092] 在此还披露了(a)在此披露的棉花植物或种子；或(b)一种嵌合基因，该嵌合基因包括a.一种第一核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先或气孔特异性启动子活性；b.一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列；以及c.一种转录终止和多腺苷酸化序列；或(c)一种核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的核酸序列，其中任一者具有气孔优先或气孔特异性启动子活性；用于在棉花中的转基因的气孔优先或气孔特异性表达，用于调节棉花植物的水分利用率或如上所述用于增加棉花的产量的用途。在这个用途中利用的嵌合基因可以是与本发明的方法联系的如在上文描述的嵌合基因。否则的话，所有定义本用途的术语具有如在本申请的其他地方所描述的意义。
[0093] 在此还披露了(a)一种核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先或气孔特异性启动子活性；或(b)一种嵌合基因，该嵌合基因包括a.一种第一核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先或气孔特异性启动子活性；b.一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列；以及c.一种转录终止和多腺苷酸化序列；用来检测棉花纤维中的转基因的用途。
[0094] 在此进一步披露的是从在此披露的植物可获得的或已获得的棉花纤维和棉花籽油。在此披露的棉花纤维可以通过采用在WO2010／015423中披露的检测方法，并且检查在纤维中(a)的核酸或(b)的嵌合基因的存在来与其它纤维区分。
[0095] 在此还披露的是产自在此披露的纤维的纱线和纺织品连同包括或由在此披露的棉籽油组成的食物和饲料。一个用于获得棉籽油的方法包括从在此披露的棉花植物收获棉花籽并且也被披露的是从所述的种子提取所述油。进一步的一个用于生产棉花纤维的方法包括培养在此披露的棉花植物并且也被披露的是从所述的棉花植物收获棉花。
[0096] 在此还披露了一种用于减轻干旱对棉田的作用的方法，包括：(a)获得包括(i)一种嵌合基因的棉花植物，该嵌合基因包括a.一种第一核酸序列，包括SEQ ID NO：1的至少700个连续核苷酸或与其具有至少80％序列一致性的一种核酸序列，这些序列中任一者具有气孔优先或气孔特异性启动子活性；b.一种编码感兴趣的表达产物的第二核酸序列；以及c.一种转录终止和多腺苷酸化序列；或其后代；并且(b)在所述田地中种植所述棉花植物。
[0097] 在此披露的或由在此描述的方法获得的转化的棉花植物细胞和棉花植物除了上述嵌合基因之外，还可以包含至少一个其他的包括编码感兴趣的表达产物的核酸的嵌合基因。此类表达产物的实例包括RNA分子或蛋白质，例如像用于对除草剂的抗性的酶。抗除草剂的棉花植物是例如耐草甘膦的植物，即耐除草剂草甘膦或其盐的植物。可以通过不同的手段使植物对草甘膦耐受。例如，可以通过用编码酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因转化该植株而获得草甘膦耐受植物。此类EPSPS基因的实例是细菌鼠伤寒沙门菌的AroA基因(突变体CT7)(Comai(措美)等人，1983，Science(《科学》)221，370-371)、细菌农杆菌属的CP4基因(Barry(巴里)等人，1992，Curr.Topics Plant Physiol.7，139-145)、编码矮牵牛EPSPS(Shah(沙阿)等人，1986，Science(《科学》)233，478-481)、番茄EPSPS(Gasser(加塞尔)等人，1988,J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)263，4280-4289)、或蟋蟀草属EPSPS(WO01／66704)的基因。它还可以是如描述于例如EP0837944、WO00／66746、WO00／66747或WO02／26995中的突变的EPSPS。还可以通过表达编码草甘膦氧化还原酶的一种基因来获得耐草甘膦的植物，如描述于美国专利号5,776,760和5,463,175中。还可以通过表达编码草甘膦乙酰转移酶的一种基因获得耐草甘膦的植物，如描述于例如WO02／36782、WO03／092360、WO05／012515以及WO07／024782中。还可以通过选择含有上述基因的天然发生的突变的植株获得耐草甘膦的植物，如描述于例如WO01／024615或WO03／013226中。表达赋予草甘膦耐受性的EPSPS基因的植物描述于例如美国专利申请号11／517,991、10／739,610、12／139,408、12／
352,532、11／312,866、11／315,678、12／421,292、11／400,598、11／651,752、11／
681,285、11／605,824、12／468,205、11／760,570、11／762,526、11／769,327、11／
769,255、11／943801或12／362,774中。包括赋予草甘膦耐受性的其他基因(例如脱羧酶基因)的植物描述于例如美国专利申请11／588,811、11／185,342、12／364,724、
11／185,560或12／423,926中。
352,532、11／312,866、11／315,678、12／421,292、11／400,598、11／651,752、11／
681,285、11／605,824、12／468,205、11／760,570、11／762,526、11／769,327、11／
769,255、11／943801或12／362,774中。包括赋予草甘膦耐受性的其他基因(例如脱羧酶基因)的植物描述于例如美国专利申请11／588,811、11／185,342、12／364,724、
11／185,560或12／423,926中。
[0098] 其他抗除草剂的植物是例如使其对抑制酶谷氨酰胺合成酶的除草剂(例如双丙氨磷、草铵膦(phosphinothricin)或草丁膦(glufosinate))耐受的棉花植物。可以通过表达一种对该除草剂解毒的酶或一种抵抗抑制的突变的谷氨酰胺合成酶获得此类植物，例如描述于美国专利申请号11／760,602中。一种这样的有效的解毒酶是编码草铵膦乙酰转移酶的酶(例如来自链霉菌属的bar或pat蛋白)。表达一种外源性草铵膦乙酰转移酶的植物是例如描述于美国专利号5,561,236；5,648,477；5,646,024；5,273,894；5,637,489；5,276,268；5,739,082；5,908,810以及7,112,665中。
[0099] 另外的耐除草剂的棉花植物还是使其对抑制酶羟基苯丙酮酸双氧化酶(HPPD)的除草剂耐受的植物。HPPD是催化其中的对羟基苯丙酮酸(HPP)被转化成尿黑酸盐的反应的酶。可以用编码天然发生的抗HPPD酶的一种基因或编码突变的或嵌合的HPPD酶的一种基因转化对HPPD抑制剂耐受的植物，例如描述于WO96／38567、WO99／24585、WO99／24586、WO2009／144079、WO2002／046387、或US6,768,044中。还可以通过用编码某些使得能够形成尿黑酸盐的酶的基因转化植物来获得对HPPD抑制剂的耐受性，尽管HPPD抑制剂抑制了该天然的HPPD酶。此类植物和基因描述于WO99/34008和WO02／36787中。除了编码HPPD耐受酶的基因之外，还可以通过用一种编码具有预苯酸脱氢酶(PDH)活性的酶的基因转化植物来改善植物对HPPD抑制剂的耐受性，例如描述于WO2004／024928中。而且，可以通过向其基因组中添加一种编码能够代谢或降解HPPD抑制剂的酶的基因来使得植物对HPPD抑制剂除草剂更加耐受，例如示于WO2007／103567和WO2008／150473中的CYP450酶。
[0100] 再另外的抗除草剂的棉花植物是那些使其对乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂耐受的植物。已知的ALS抑制剂包括例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶类、嘧啶氧(硫)苯甲酸酯类、和／或磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂。已知在ALS酶(也被称为乙酰羟酸合成酶，AHAS)中的不同突变赋予了对不同除草剂以及除草剂的组的耐受性，如描述于例如Tranel(特瑞纳)和Wright(赖特)(2002，Weed Science(《杂草科学》)50：700-712)中，以及在美国专利号5,605,011、5,378,824、5,141,870、以及5,013,659中。耐磺酰脲的植物以及耐咪唑啉酮的植物的生产描述于美国专利号5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937；以及5,378,824；
以及国际公开WO96／33270中。其他的耐咪唑啉酮的植物还描述于例如WO2004／040012、WO2004 ／ 106529、WO2005 ／ 020673、WO2005 ／ 093093、WO2006 ／ 007373、WO2006 ／
015376、WO2006／024351、以及WO2006／060634中。另外的耐硫酰脲以及耐咪唑啉酮的植物还描述于例如WO07／024782以及美国专利申请号61／288958中。
以及国际公开WO96／33270中。其他的耐咪唑啉酮的植物还描述于例如WO2004／040012、WO2004 ／ 106529、WO2005 ／ 020673、WO2005 ／ 093093、WO2006 ／ 007373、WO2006 ／
015376、WO2006／024351、以及WO2006／060634中。另外的耐硫酰脲以及耐咪唑啉酮的植物还描述于例如WO07／024782以及美国专利申请号61／288958中。
[0101] 可以通过诱导的诱变、在除草剂存在下在细胞培养中的选择或突变育种来获得对咪唑啉酮和／或磺酰脲耐受的其他棉花植物，如描述于例如针对大豆的美国专利5,084,082中、针对水稻的WO97／41218中、针对甜菜的美国专利5,773,702和WO99／
057965中、针对莴苣的美国专利5,198,599中、或针对向日葵的WO01／065922中。
057965中、针对莴苣的美国专利5,198,599中、或针对向日葵的WO01／065922中。
[0102] 另外的感兴趣的表达产物赋予棉花植物抗虫性，即对被某些靶昆虫攻击的抗性。可以通过遗传转化、或通过包含给予此类抗虫性的突变的植物的选择来获得此类植物。
[0103] 抗虫植物包括包含至少一个转基因的任何植物，该转基因包括编码以下的编码序列：
[0104] 1)一种来自苏芸金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白或其一个杀虫部分，如由Crickmore(克里克莫尔)等人列举的杀虫晶体蛋白(1998，Microbiology and Molecular Biology Reviews(《微生物学与分子生物学评论》)，62：807-813)，由Crickmore(克里克莫尔)等人(2005)在苏芸金芽胞杆菌毒素命名法中更新，在线在：http：／／www.lifesci.sussex.ac.uk／Home／Neil_Crickmore／Bt／)，或其杀虫部分，例如Cry蛋白类
Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1F、Cry2Ab、Cry3Aa、或Cry3Bb的蛋白质或其杀虫部分(例如EP1999141和WO2007／107302)，或由合成基因编码的此类蛋白质，如描述于例如美国专利申请号12／249,016中；或
Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1F、Cry2Ab、Cry3Aa、或Cry3Bb的蛋白质或其杀虫部分(例如EP1999141和WO2007／107302)，或由合成基因编码的此类蛋白质，如描述于例如美国专利申请号12／249,016中；或
[0105] 2)一种来自苏芸金芽胞杆菌的晶体蛋白或其一个部分，该部分在一个来自苏芸金芽胞杆茵的第二其他晶体蛋白或其一个部分的存在下是杀虫的，例如由Cry34和Cry35晶体蛋白构成的二元毒素(Moellenbeck(姆伦拜克)等人，2001，Nat.Biotechnol.(《自然生物技术》)19：668-72；Schnepf(史涅夫)等人2006，Applied Environm.Microbiol.(《使用环境微生物学》)71，1765-1774)或由Cry1A或Cry1F蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白构成的二元毒素(美国专利申请号12／214,022和EP08010791.5)；或
[0106] 3)一种包括来自苏芸金芽胞杆菌的不同的杀虫晶体蛋白的部分的杂交杀虫蛋白，例如以上1)的蛋白质的一种杂交体或以上2)的蛋白质的一种杂交体，例如由玉米事件MON89034(WO2007／027777)产生的Cry1A.105蛋白；或
[0107] 4)以上1)至3)的任意一种蛋白质，其中一些，具体是1至10个氨基酸，已经被另一个氨基酸替代以便获得一个对靶昆虫物种的更高的杀虫活性、和／或用以扩大所影响的靶昆虫物种的范围、和／或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化的缘故，例如在玉米事件MON863或MON88017中的Cry3Bb1蛋白、或在玉米事件MIR604中的Cry3A蛋白；或[0108] 5)一种来自苏芸金芽胞杆茵或蜡样芽胞杆菌的杀虫分泌蛋白或其一个杀虫部分，例如列举在：http：／／www.lifesci.sussex.ac.uk／home／Neil Crickmore／Bt／vip.html的营养期杀虫蛋白(VIP)，例如来自VIP3Aa蛋白类的蛋白质；或
[0109] 6)一种来自苏芸金芽胞杆茵或蜡样芽胞杆菌的分泌蛋白，该分泌蛋白在来自苏芸金芽胞杆菌或蜡样芽胞杆菌的一个第二分泌蛋白的存在下是杀虫的，例如由VIP1A和VIP2A蛋白构成的二元毒素(WO94／21795)；或
[0110] 7)一种包括来自苏芸金芽胞杆菌或蜡样芽胞杆菌的不同的分泌蛋白的部分的杂交杀虫蛋白，例如以上1)中的蛋白质的一种杂交体或以上2)中的蛋白质的一种杂交体；或[0111] 8)以上5)至7)的任意一种蛋白质，其中一些，具体是1至10个氨基酸，已经被另一个氨基酸替代以便获得一个对靶昆虫物种的更高的杀虫活性、和／或用以扩大所影响的靶昆虫物种的范围、和／或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化的缘故(尽管仍然编码一种杀虫蛋白)，例如在棉花事件COT102中的VIP3Aa蛋白；或
[0112] 9)一种来自苏芸金芽胞杆菌或蜡样芽胞杆菌的分泌蛋白，该分泌蛋白在来自苏芸金芽胞杆菌的晶体蛋白的存在下是杀虫的，例如由VIP3和Cry1A或Cry1F构成的二元毒素(美国专利申请号61／126083和61／195019)、或由VIP3蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白构成的二元毒素(美国专利申请号12／214,022和EP08010791.5)；
[0113] 10)以上9)的一种蛋白质，其中一些，具体是1至10个氨基酸，已经被另一个氨基酸替代以便获得一个对靶昆虫物种的更高的杀虫活性、和／或用以扩大所影响的靶昆虫物种的范围、和／或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化的缘故(尽管仍然编码一种杀虫蛋白)。
[0114] 还包括抗虫的转基因植物，其包括编码上面种类1至10中任一蛋白质的基因的组合。在一个实施例中，抗虫的植物包含多于一种编码上面种类1至10中任一蛋白质的转基因，以当使用指向不同靶昆虫物种的不同蛋白质时用以扩大所影响的靶昆虫物种的范围，或通过使用对同一靶昆虫物种具有杀虫活性但是具有不同作用模式(例如与该昆虫中不同的受体结合位点结合)的杀虫蛋白来延迟昆虫对植物的抗性的发展。
[0115] 抗虫的植物进一步包括以下植物，这些植物包含至少一种转基因，该至少一种转基因包括当表达时产生双链RNA的序列，当被植物害虫摄取时该双链RNA抑制这种害虫的生长，如描述于例如WO2007／080126、WO2006／129204、WO2007／074405、WO2007／080127以及WO2007／035650中。
[0116] 另外感兴趣的表达产物赋予对非生物胁迫的耐受性。可以通过遗传转化、或通过包含给予此类胁迫抗性的突变的植物的选择来获得具有此类耐受性的植物。特别有用的胁迫耐受植物包括：
[0117] 1)在植物细胞或植物中包含能够减少聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)基因的表达和／或其活性的一种转基因的植物，如描述于WO00／04173、WO／2006／045633、EP04077984.5、或EP06009836.5中。
[0118] 2)包含能够减少植物或植物细胞的PARG编码基因的表达和/或其活性的一种胁迫耐受增强转基因的植物，如描述于例如WO2004／090140中。
[0119] 3)包含用于编码一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径的植物功能性酶的一种胁迫耐受增强转基因的植物，这些酶包括烟酰胺酶、烟酸磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺嘌呤转移酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶或烟酰胺磷酸核糖基转移酶，如描述于例如EP04077624.7、WO2006／133827、PCT／EP07／002433、EP1999263、或WO2007／107326中。
[0120] 还可以根据本发明进行处理的植物或植物栽培品种(可以通过植物生物技术方法、例如基因工程获得)是具有改变的纤维特征的植物，例如棉花植物。可以通过遗传转化、或通过包含给予此类改变的纤维特征的突变的植物的选择来获得此类植物，并且此类植物包括：
[0122] b)包含改变形式的rsw2或rsw3同源核酸的植物，例如棉花植物，如描述于WO2004／053219中
[0123] c)具有增加的蔗糖磷酸合成酶的表达的植物，例如棉花植物，如描述于WO01／17333中
[0124] d)具有增加的蔗糖合成酶的表达的植物，例如棉花植物，如描述于WO02／45485中
[0125] e)其中在纤维细胞的底部的胞间连丝门控的时机被改变的植物，例如棉花植物，例如通过纤维选择性β-1,3-葡聚糖酶的下调，如描述于WO2005／017157中，或如描述于EP08075514.3或美国专利申请号61／128,938中
[0126] f)具有改变的反应性的纤维的植物，例如棉花植物，例如通过N-乙酰葡糖胺转移酶基因(包括nodC和壳多糖合酶基因)的表达，如描述于WO2006／136351中
[0127] 在编码为转化的植物赋予有用的农艺特性的蛋白质或RNA的基因之中，可以进一步提及编码赋予对某些昆虫的耐受性的蛋白质或赋予对某些疾病的耐受性的那些蛋白质的DNA序列。
[0128] 此类基因描述于例如公开的PCT专利申请WO91／02071和WO95／06128中。
[0129] 在此描述的转化的植物细胞和植物(例如通过在此描述的方法获得的那些)可以进一步在本领域中熟知的育种程序中使用，例如杂交、自交以及回交。育种程序可以涉及杂交以产生F1(第一子代)代，随后是自交的若干代(产生F2、F3等)。育种程序还可以涉及回交(BC)步骤，由此后代与亲本之一回交，被叫做回归亲本。
[0130] 因此，在此还披露了一种用于生产包括在此披露的嵌合基因的植物的方法，该方法包括将在此披露的棉花植物与另一个植物或与其自身的杂交步骤并且选择包括所述嵌合基因的后代。
[0131] 通过在此披露的方法获得的转基因的植物细胞和植物还可以被进一步用于随后的转化程序，例如用来引入一种另外的嵌合基因。
[0132] 包括在此披露的嵌合基因或通过在此披露的方法获得的棉花植物或种子还可以进一步用棉花除草剂，例如敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑酮草酯、烯草酮、吡氟禾草灵-丁基、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧硫草醚钠、三氟啶磺隆、吡喃草酮、草丁膦(Glufosinate)、丙炔氟草胺、噻苯隆；棉花杀虫剂，例如高灭磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿维菌素、啶虫脒、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、α-氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氟虫双酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、Dinetofuran、氟虫双酰胺、氰虫酰胺(Cyazypyr)、多杀菌素、乙基多杀菌素、γ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、除虫菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、砜虫啶；以及棉花杀茵剂，例如嘧茵酯、Bixafen、啶酰茵胺、多茵灵、百茵清、铜(Copper)、环丙唑醇、苯醚甲环唑、醚茵胺、氟环唑、咪唑茵酮、氟啶胺、氟吡茵酰胺、氟嘧茵酯、氟唑茵酰胺(Fluxapyroxad)、扑海因、吡唑萘茵胺(Isopyrazam)、异噻菌胺(Isotianil)、代森锰锌、代森锰、苯氧茵胺、吡噻菌胺、啶氧菌酯、甲基代森锌、丙硫茵唑、唑菌胺酯、五氯硝基苯、戊唑醇、四氟醚唑、甲基硫菌灵、肟茵酯进行处理。对于用棉花除草剂进行处理而言，所述棉花植物或种子优选地进一步包括赋予对应的除草剂耐受性的性状。
[0133] 出于本发明的目的，两个相关的核苷酸或氨基酸序列的“序列一致性”(表示为一个百分数)是指在这两个最佳比对序列中的具有相同残基的位置的数目(x100)除以所比较的位置的数目。一个空位，即在比对中的一个位置，其中一个残基存在于一个序列中，但不存在另一个序列中，其被视为具有不相同残基的位置。通过Needleman(内德勒曼)和Wunsch(文施)算法(Needleman(内德勒曼)和Wunsch(文施)1970)进行这两个序列的比对。可以常规地使用标准软件程序，例如作为威斯康星软件套装版本10.1(Wisconsin Package Version10.1)的一部分的GAP(美国威斯康星州的麦迪逊的遗传学计算机集团(Genetics Computer Group))，使用50的空位产生罚分和3的空位延伸罚分的默认打分矩阵进行上面的计算机辅助序列比对。
[0134] 包含在23千字节(如在Microsoft 中测量的大小)被命名为“BCS11-2004-WO1_ST25”的文件中的序列表包含两个序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，通过以电子方式提交被特此存档并且通过引用被结合在此。
[0136] 图1：GC1：：GUS转基因棉花植物中的GC1启动子的表达。
[0137] 来自GC1：：GUS转基因TO植物的叶组织显示GUS报告基因在气孔中局部表达。箭头指示染成蓝色的气孔。
[0138] 图2：与非转基因的对照相比，GC1：：GUS转基因棉花植物中的相对GUS表达。黑色条：保卫细胞。灰色条：表皮细胞。
[0139] 以下实例说明了本发明。应该理解的是，这些实例并不限制在此披露的主题的精神和范围。
[0140] 除非在实例中另行说明，所有的重组DNA技术是根据如描述于Sambrook(萨姆布鲁克)等人(1989)Molecular Cloning(《分子克隆》)：A Laboratory Manual(实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，NY和如描述于Ausubel(奥苏贝尔)等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology(《分子生物学的当前方案》)，Current Protocols(《当前方案》)，USA的卷1和卷2中的标准方案来进行的。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于由R.D.D.Croy撰写的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版。标准分子生物学技术的其他参考包括Sambrook(萨姆布鲁克)和Russell(罗素)(2001)Molecular Cloning(《分子克隆》)：A Laboratory Manual(实验室手册)，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，NY，Brown(布朗)(1998)Molecular Biology LabFax，第二版，Academic Press(学术出版社)(UK)的卷I和卷II。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可以在Dieffenbach(迪芬巴赫)和Dveksler(代维司格尔)(1995)PCR Primer(PCR引物)：A Laboratory Manual(实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)中，以及在McPherson(麦弗逊)等人(2000)PCR-Basics(PCR-基础)“From Background to Bench(《从背景到工作台》)，第一版，Springer Verlag(施普林格出版社)，德国中找到。
[0141] 实例
[0142] 材料
[0143] 除非另外指明，实例中的化学制剂和试剂是从西格玛化学公司(SigmaChemical Company)获得的，限制性内切核酸酶是从Fermentas或罗氏-勃林格公司(Roche-Boehringer)获得的，并且关于生化试剂和分子生物测定的其他修饰酶或试剂盒是从Qiagen(凯杰公司)、Invitrogen(英杰公司)和Q-BIOgene公司获得的。细菌菌株来自Invitrogen(英杰公司)。进行的克隆步骤如由Sambrook(萨姆布鲁克)(1989)描述的进行，克隆步骤是例如像限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、连接DNA片段、大肠杆菌细胞的转化、使细菌生长、繁殖噬菌体以及重组DNA的序列分析。根据Sanger(桑格)的方法，使用ABI激光荧性DNA测序仪进行重组DNA分子的测序。实例1：具有来自可操作地连接至GUS报告基因的GC1启动子(pGC1)的1719bp区的表达构建体的产生
[0144] 表达载体的产生：
[0145] 将拟南芥的GC1基因的1719bp启动子(SEQ ID NO：1的5′至3’位置4110至2392)、具有内含子的GUS基因(SEQ ID NO：1的5′至3’位置2387至390)以及CaMV35S基因的3’非翻译区(UTR)的片段(SEQ ID NO：1的5′至3’位置313至92)组装在包含2mepsps选择性标记盒(SEQ ID NO：1的位置6669至8006)的载体中，以产生表达载体pTCD99(SEQ ID NO：2)。
[0146] 实例2：包括pGC1：：GUS的转基因植物的产生
[0147] 在接下来的步骤中，使用胚性愈伤组织转化方案，使用包括实例1的表达盒的重组载体(即栽体pTCD99)来稳定地转化陆地棉coker312。实例3：pGC1：：GUS的气孔特异性表达
[0148] 在相对应的活性测定中，用显色的底物X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸)在植物中监测用pTCD99转化的植物的β-葡萄糖醛酸酶活性(Jefferson RA(杰斐逊RA)等人(1987)EMBO J.20；6(13)：3901-7)。用于启动子活性的确定，将植物组织如(例如Pien S.(皮安S.)等人(2001)PNAS98(20)：11812-7)描述的解剖、嵌入、染色并且分析。因此，通过由于底物X-Gluc的酶代谢的蓝色的存在来证明在转化的植物中的β-葡萄糖醛酸酶的活性。
[0149] 在具有足够水分供应地使30个独立的TO植物生长之后，针对GUS表达对植物进行检查。从这些植物中取下来自第一对叶的叶样品并且针对GUS报告基因表达进行测试(例如，Pien S.(皮安S.)等人(2001)PNAS98(20)：11812-7)。
[0150] 观察到GUS仅在气孔中表达(参见图1)。
[0151] 使用工具ImageJ将保卫细胞亦或非保卫细胞(表皮细胞)中的GUS着色量化。通过确定在包括pGC1：：GUS的转基因事件与阴性对照中的染色的比例来将染色相对于在非转化对照中的背景染色进行修正。表1和图2显示仅仅保卫细胞而非表皮细胞在背景水平上显示出GUS活性，这显示GC1启动子驱动在棉花叶中的保卫细胞特异性表达。
[0152] 表1：相对于非转化对照，在包括pGC1：：GUS的不同转基因事件(事件1-5)的保卫细胞和表皮细胞中的GUS着色。使用工具ImageJ将着色量化。
[0153]保卫细胞 表皮细胞
事件1 1.55 0.94
事件2 3.43 1.11
事件3 2.40 1.03
事件4 2.55 1.13
事件5 1.85 0.96
阴性对照 1 1
事件1 1.55 0.94
事件2 3.43 1.11
事件3 2.40 1.03
事件4 2.55 1.13
事件5 1.85 0.96
阴性对照 1 1
[0154] 参考文件
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