用于抑制实体瘤的转移、色素沉着过度和痛风的缓冲剂的肠胃外非全身性施用
阅读：623发布：2020-05-16
专利汇可以提供用于抑制实体瘤的转移、色素沉着过度和痛风的缓冲剂的肠胃外非全身性施用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且单独或组合的pH升高剂和其他抗转移剂的肠胃外 给药 (除了直接全身性给药外)是有效的，并且克服了静脉内施用和口服施用在 治疗 实体瘤、黄褐斑和痛 风 中的缺点。，下面是用于抑制实体瘤的转移、色素沉着过度和痛风的缓冲剂的肠胃外非全身性施用专利的具体信息内容。
1.一种抑制受试者的实体瘤的转移的方法，所述方法包括向需要这样的抑制的受试者肠胃外地、非全身地施用有效量的抗转移剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述剂选自由以下组成的组：足以升高所述肿瘤的环境中的pH的缓冲剂、蛋白酶抑制剂、Na+/H+交换剂活性的抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂、含src同源区2的蛋白酪氨酸酶磷酸酶(Shp2)的抑制剂、醉茄素A及其组合。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述施用通过使所述受试者的完整的皮肤与含有所述剂的制剂接触来进行，由此所述剂通过大体上完整的皮肤或擦伤的皮肤被提供至所述受试者。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述施用针对完整的皮肤，并且所述制剂还包含影响所述剂的皮肤渗透性质的渗透剂。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述渗透剂包含：
以提供所述制剂的0.5-20％w/w的量的醇；以及
以提供所述制剂的25-70％w/w的量的两性离子。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述渗透剂包含：
以提供所述制剂的0.5-20％w/w的量的醇；以及
以提供所述制剂的1-50％w/w的量的两性离子。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述渗透剂还包含以提供所述制剂的1-25％w/w的量的非离子型表面活性剂和至少以所述非离子型表面活性剂的摩尔过量的量的极性溶剂，或者是无水的。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂是泊洛沙姆，并且所述极性溶剂是水。
9.如权利要求4所述的方法，其中所述渗透剂使得所得到的制剂包含：
i)胆盐:卵磷脂:两亲化合物的约1:1:1等摩尔混合物；
ii)足以赋予所述制剂粘度和粘弹性的一种或更多种电解质；
iii)一种或更多种表面活性剂；以及
iv)苄醇或其类似物。
10.如权利要求4所述的方法，其中所述渗透剂还包含角蛋白溶解剂，所述角蛋白溶解剂有效地减少硫醇连接，破坏氢键合和/或实现角蛋白溶解；和/或
其中所述渗透剂还包含至少一种皮肤渗透肽(SPP)；和/或
其中所述渗透剂还包含渗透增强剂；和/或
其中所述制剂包含胶束。
11.如权利要求3所述的方法，其中所述接触是与擦伤的皮肤接触，或者其中所述制剂被施加在封闭贴片下。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述皮肤被微针装置或砂纸等同物擦伤。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述抗转移剂包括缓冲剂。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述缓冲剂是碳酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、tris缓冲剂、赖氨酸缓冲剂或氯乙酸盐缓冲剂。
15.如权利要求13所述的方法，其还包括测试所述受试者的肿瘤对pH调节的敏感性或抗性。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述测试包括评估培养物中的肿瘤的活检细胞。
17.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述抗转移剂包括醉茄素A；和/或蛋白酶抑制剂；和/或
Na+/H+交换剂的抑制剂；和/或
表皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂；和/或
含src同源区2的蛋白酪氨酸酶磷酸酶(Shp2)的抑制剂。
18.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述剂包括剂的组合。
19.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类、兽医学受试者或动物模型。
20.一种治疗受试者的痛风或色素沉着过度的方法，所述方法包括向需要这样的治疗的受试者肠胃外地、非全身地施用一定量的缓冲剂，所述一定量的缓冲剂足以升高在所述痛风或色素沉着过度的部位的pH。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述施用通过使所述受试者的完整的皮肤与含有所述剂的制剂接触来进行，由此所述剂通过大体上完整的皮肤或擦伤的皮肤被提供至所述受试者。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述施用针对完整的皮肤，并且所述制剂还包含影响所述剂的皮肤渗透性质的渗透剂。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述接触是与擦伤的皮肤接触，或者其中所述制剂被施加在封闭贴片下。
24.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类、兽医学受试者或动物模型。
用于抑制实体瘤的转移、色素沉着过度和痛风的缓冲剂的肠
胃外非全身性施用
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2017年4月17日提交的美国序号62/602,227；于2017年4月20日提交的美国序号62/602,358；于2017年4月20日提交的美国序号62/602,359；于2017年9月18日提交的美国序号62/559,947；于2017年9月15日提交的美国序号62/559,360；于2017年9月25日提交的美国序号62/562,725；于2017年12月22日提交的美国序号62/609,982；和于
2018年3月7日提交的美国序号62/639,904的临时申请的优先权。这些文件的内容通过引用以其整体并入本文。
2018年3月7日提交的美国序号62/639,904的临时申请的优先权。这些文件的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及肠胃外地、非全身地、特别是局部地施用的抗转移剂(包括缓冲剂)导致肿瘤对转移的抗性的用途。升高pH的缓冲剂在治疗色素沉着过度和痛风中也是有用的。本身是非全身性的局部施用和其他肠胃外施用两者都被认为克服了被设计成升高局部pH的缓冲剂的口服施用和全身性肠胃外施用的困难。
背景技术
[0004] 尽管在治疗性地靶向转移病变方面做出了巨大努力，但转移的进展仍然是癌症患者的死亡率最高的风险。与肿瘤进展相关的肿瘤侵袭和转移是癌症死亡的主要原因，并且理解决定恶性细胞经由侵袭至远处组织的转移扩散的机制可能是肿瘤学中的核心问题。
[0005] 已知原发性肿瘤中的微环境酸中毒增加了细胞运动性和侵袭性，导致增加的转移，并且实体瘤存在于相对低pH的微环境中，大概是因为这样的肿瘤的低氧性质、葡萄糖的增加的糖酵解代谢和不良的灌注。早在1979年，Turner,GA,Experientia(1979)35:1657-1658就报导了酸性pH促进通过胶原酶的肿瘤细胞的释放，由此促进转移。Curvier,C.等人,Clin.Exp Metastasis(1997)15:19-25报导了由于葡萄糖饥饿(glucose starvation)、低氧和酸中毒引起的肿瘤细胞的增强的侵袭能力。Rofstad,E.K.等人,Cancer Res(2006)66:
6699-6706报导了人类黑素瘤细胞的酸性细胞外pH促进小鼠中的转移。
6699-6706报导了人类黑素瘤细胞的酸性细胞外pH促进小鼠中的转移。
[0006] 恶性实体瘤的细胞外pH是酸性的，在6.5至6.9的范围内，而正常组织的pH是明显更加碱性的7.2至7.5。这些观察结果已经导致“酸介导的侵袭假说”，其中源自肿瘤的酸通过促进正常细胞死亡和生长的肿瘤周围的实质(parenchyma)的细胞外基质(ECM)降解来促进肿瘤侵袭。
[0008] 以在Cancer Res(2009)69:2260-2267中的出版物开始，Robey,I.F.等人的一系列文章证明了，口服碳酸氢盐减少了转移性乳腺癌的小鼠模型中自发性转移的形成。另外的出版物诸如Robey,I.F.等人,BMC Cancer(2011)11:235-245和Robey,I.F.,等人,BioMed Res International(2013)第1-10页以及Robey,I.F.等人,J.Integr.Uncol.(2015)4:1-8描述了首先在小鼠中，并且然后在人类志愿者中口服施用碳酸氢盐作为转移的抑制剂。
[0009] Ribeiro,M.de L.,等人,J.Nutr Food Sci(2013)2:6-16给食品(包括葡萄酒(wine))分配不同的pH评分，并且还描述了在患有前列腺癌的小鼠中口服施用赖氨酸缓冲剂和碳酸氢盐。此外，Silva,A.S.等人,Cancer Res(2009)2677-2684描述了全身性缓冲剂在减少转移中的作用。Sircus,M.出版了书籍，Sodium Bicarbonate:Nature’s Unique First Aid Remedy,Garden City Park,New York:Square One Publishers,2014，提倡碳酸氢钠作为用于各种状况的治疗法(remedy)。
[0010] 然而，已经发现缓冲剂的口服施用具有副作用，包括腹泻、恶心、呕吐和腹部不适。静脉内施用即全身性施用也已经是不足以信任的。
[0011] 虽然癌症的治疗和转移的预防是本发明方法的重要应用，但在其他背景下，pH的全身性调节也是重要的。这些背景包括，例如，疼痛的治疗。此外，在最近未公布的结果中，South Pasadena,California的ET Science证明，局部应用碳酸氢钠有效地降低运动后血乳酸，以及增强循环中的性能。
[0012] 然而，并不是所有的癌症都对于通过施用缓冲剂来调节微环境pH有响应。Bailey KM,等人；Neoplasia,(2014)16:354-364表明，在一些肿瘤模型中，无论使用何种缓冲剂，转移都不被缓冲剂抑制。在利用pH依赖性机制用于成功转移的细胞表型中，示出了高度糖酵解表型，其使局部肿瘤微环境酸化，导致形态学变化，而缓冲剂抗性细胞系表现出非pH依赖性转移机制，该机制涉及基质降解蛋白酶的组成型分泌，而没有升高的糖酵解。
[0013] 除了直接缓冲以调节pH之外，不利的细胞外pH问题可以使用可选择的靶DNA+/H+交换剂1(NHE1)蛋白来解决，所述可选择的靶DNA+/H+交换剂1(NHE1)蛋白可以是抗转移剂的靶。例如，Loo,S.Y.等人,Curr.Pharm.Des.(2012)18:1372-1382将NHE1描述为作为抗癌策略的有前途的药物靶。因此，靶向该蛋白质的治疗剂在本发明中也是有用的。Amith,S.R.和Fliegel,L.Cancer Res.(2013)73:1-6列出了也影响该蛋白质的许多因子，并且因此也构成了合适的靶。
[0014] 许多其他因子也与肿瘤转移相关，并且在许多情况下，靶向它们的治疗剂实际上是可用的。其中是基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9(MMP-2和MMP-9)以及某些组织蛋白酶，特别是组织蛋白酶B、组织蛋白酶D和组织蛋白酶L。例如，作为癌症靶的组织蛋白酶B由Gondi,C.S.和Rao,J.S.Expert Opin.Ther.Targets(2013)17:281-291描述，并且组织蛋白酶类整体上由Olson,O.C.和Joyce,J.A.,Nat.Rev.Cancer(2015)15:712-729描述为这样的靶。MMP在癌症的进展中的作用的一般讨论在Gialeli,C.等人,FEBS J.(2011)278:16-27的文章中描述。根据这篇文章，MMP在模型化细胞外基质中起广泛的作用，因此允许癌细胞从实体瘤中逃逸。
[0015] 这些蛋白质的小分子抑制剂是已知的，例如，各种N-磺酰基氨基酸衍生物由Tamura,Y.等人,J.Med.Chem.(1988)41:640-649描述，并且此后已经开发了许多另外的剂。此外，存在天然存在的内源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂。内源性CPI构成单一的蛋白质超家族，半胱氨酸蛋白酶抑制剂类(cystatins)，诸如l型半胱氨酸蛋白酶抑制剂；具有11,775Da的分子量的stefins A(或半胱氨酸蛋白酶抑制剂A)和具有11,006Da的分子量的stefins B(或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B)。半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)是非常紧密结合的伪不可逆抑制剂(pseudo-irreversible inhibitor)。
[0016] 其他抗转移剂包括含src同源区2的蛋白酪氨酸酶磷酸酶(Shp2)的抑制剂。该活性的多种抑制剂是已知的，包括Fumosorine、PHPS(NSC-87877)和NSC-117199、苯腙基吡唑啉酮磺酸盐(phenylhydrazonopyrazolonesulfonate)(PHPS1)、DCA、隐丹参酮(cryptotanshinone)、11-B08和#220-324。
[0017] 另一种抗转移剂基于表皮生长因子受体(EGFR)和/或整合素在驱动肿瘤进展中的熟知的作用，并且熟知的是，这两类受体都刺激NHE1活性。若干种抗EGFR化合物(例如埃罗替尼(erlotinib))已经被批准抑制转移，并且一种抗整合素药物(西仑吉肽(cilengitide))正在临床试验中。卡立泊来德(Cariporide)、依泊来德(eniporide)和/或阿米洛利(amiloride)已经通过所有临床阶段。
[0018] 最后，具有抗氧化和抗炎性质的植物化学物质被认为在癌症的预防和/或治疗中起重要作用。迄今为止，通过使用多种多样的临床前实验模型，已经对许多植物化学物质检查了它们的潜在抗癌性质。
[0019] 特别地，大量基于实验室的研究已经证明了药用植物南非醉茄(Withania somnifera)的抗癌效果。这些抗癌性质可归因于包括醉茄素A(WFA)的一类生物活性成分醉茄内酯(withanolide)。醉茄内酯是一组天然存在的C28-甾族内酯。它们含有四个环烷烃环结构、三个环己烷环和一个环戊烷环。WFA是源自Acnistus arboescens、南非醉茄和茄科(Solanaceae family)的其他成员的甾族内酯。传统上，它已经在印度医学(ayurvedic medicine)中使用。它是麦角甾烷型产物的醉茄内酯类中的第一个被发现的成员。
[0020] 如下文描述的，许多前述剂可以组合使用。
[0021] 现在已发现，生物相容性缓冲剂和其他转移性剂的肠胃外、非全身性施用，包括这样的缓冲剂和剂的局部施用，对癌症具有积极效果，包括抑制转移、抑制生长以及在一些情况下的肿瘤收缩。升高pH的缓冲剂的这样的施用也可用于治疗痛风和黄褐斑(melasma)(色素沉着过度)。
[0022] 局部施用可以使用局部地或全身地改善经皮运输(transdermal transit)的渗透剂。合适的渗透剂例如在PCT公布WO/2016/105499和WO/2017/127834中描述。
[0023] 存在已经被推荐用于治疗黄褐斑的多种剂，包括酪氨酸酶抑制剂氢醌、曲酸(kojic acid)、壬二酸(azelaic acid)、各种酚和熊果苷(arbutin)。这些剂似乎不是完全地成功的，并且具有不期望的副作用。黄褐斑的病因是多种多样的，并且状况的特征在于尺寸、形状和分布上不同的色素沉着过度的病变的多样性。根据下文描述的本发明的方法，可以通过升高局部pH来合适地治疗这些病变。
[0025] 发明的公开内容
[0026] 申请人已经发现，缓冲剂和其他抗转移剂的静脉内施用和口服施用的缺点可以通过非全身地肠胃外地施用这些剂来克服，诸如通过腹膜内注射、皮下注射或肌内注射，并且特别是通过局部施用这些剂来克服。局部施用最方便地是经皮的，但还包括跨膜施用，例如通过栓剂或鼻内应用。
[0027] 因此，在一个方面中，本发明涉及抑制受试者含有的实体瘤的转移和/或生长的方法，该方法包括通过非全身性肠胃外途径向需要这样的抑制的受试者施用有效量的抗转移剂。在一些实施方案中，抗转移剂可以是足以升高实体瘤的微环境的pH的缓冲剂、或蛋白酶抑制剂、Na+/H+交换剂活性的抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂、含src同源区2的蛋白酪氨酸酶磷酸酶(Shp2)的抑制剂、醉茄素A或其组合。施用通过非全身性肠胃外途径进行，并且包括局部施用，特别是经皮施用。
[0028] 对于经皮局部施用，特别是对于除缓冲剂之外的剂，合适的制剂通常包含增强皮肤的渗透的渗透剂，并且在一些实施方案中包含化学渗透增强剂(CPE)。在一些情况下，它还可以包括被设计成渗透细胞的肽，即细胞渗透肽(CPP)，也被称为皮肤渗透肽(SPP)。制剂可以按原样应用，或者通过封闭装置诸如贴片的手段应用。
[0029] 如果活性剂是缓冲剂，则缓冲体系的选择基于在合适的pH(通常在7和8之间)的缓冲能力的标准，以及缓冲体系本身的生物相容性和缓冲体系与制剂的其余组分的相容性。相反地，制剂被选择成与所选择的缓冲剂相容；渗透剂的量通常少于通常对于治疗剂有利的量。
[0030] 当为了抑制转移的目的而调节pH时，在治疗之后是有效性的评估。更重要的是，如上文所述，已经发现一些肿瘤对于缓冲剂治疗具有抗性–即，升高pH不具有转移抑制效果。参见，例如，Bailey,KM,等人,Neoplasia(2014)16:354-364(上述)。因此，本发明的一个方面是评估用缓冲剂治疗的潜在受试者的肿瘤对pH调节的敏感性/抗性，例如，通过培养活检。
[0031] 升高黄褐斑和痛风附近的pH也是一种有效的治疗。本发明的方法也可以有用地应用于这些状况的治疗。因此，在本发明的另一个方面，这样的治疗方法针对疾病诸如黄褐斑和痛风的治疗。
[0034] 图2示出了以图1的制剂和剂量在施用碳酸氢钠的制剂之后的作为时间的函数的实验受试者的平均每日尿pH。
[0035] 图3示出了使用可选择的局部制剂在3天时间段内尿pH的时间进程。
[0036] 实施本发明的模式
[0037] 如上文所述，本发明的一个方面是抑制癌症生长和转移的方法，包括通过非全身性肠胃外施用抗转移剂来减少癌症质量，所述非全身性肠胃外施用包括局部施用，所述抗转移剂包括导致缓冲肿瘤细胞(包括实体瘤和黑素瘤)的直接环境的那些剂。对于非全身性肠胃外施用，诸如肌内施用、腹膜内施用或皮下施用，标准制剂是足够的。这些制剂包含标准赋形剂和其他辅助成分诸如抗氧化剂、合适的盐浓度以及其他。例如，这样的制剂可以在最新版本的Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA—各种施用类型的标准参考中找到。
[0039] 本发明的一个重要方面是基于这样的上文所述的认识：一些肿瘤对于缓冲剂治疗没有响应，因为它们的微环境不是酸性的，并且这些肿瘤中的至少一些通过升高某些分解细胞外基质(ECM)的蛋白水解酶来实现转移。如果考虑缓冲剂治疗，则因此优选地在治疗前培养和测试来自受试者的实体瘤的活检的肿瘤细胞，以确保对缓冲剂的响应性。这样的评估可以通过任何合适的手段来进行，包括测量pH，评估相关蛋白酶的水平，以及如受缓冲剂治疗影响的侵袭测定，如上文Bailey,K.M.等人(2014)中所描述的。一个重要的这样的测定是如其中所描述的糖酵解应激测定。如这样的测定所示表现得对缓冲剂治疗无响应的活检肿瘤的细胞培养物可能从其他抗转移剂的施用中受益，并且在包含缓冲剂的本发明组合物中包含这样的剂也将是有益的。因此，仅用含有缓冲剂的组合物的治疗可以是禁忌的，并且受试者不被施用缓冲剂作为唯一的活性剂，而是转向可选择的治疗。当然，这并不意味着缓冲剂必须从用于施用可选择的活性剂的制剂中省略。
[0040] 对于局部施用，并且特别是经皮施用，制剂将包含渗透剂，所述渗透剂包括化学渗透剂(CPE)和基于肽的细胞渗透剂(CPP)中的任一种或两种，该渗透剂促进跨过真皮和/或跨过包括细胞膜的膜的传递，特别是对于通过栓剂的施用或鼻内施用将是这样的情况，但对于经皮施用也是如此。特别地用于含有除了缓冲剂外的至少一种剂的那些制剂的特别合适的渗透剂包括在上文提及的WO2016/105499和WO2017/127834中描述的那些渗透剂。除了具有渗透剂的制剂之外，经皮递送可以通过机械地破坏皮肤的表面以促进渗透来实现，或者简单地通过在封闭贴片下提供施加至皮肤的制剂来实现。
[0041] 简而言之，上文提及的PCT申请中描述的渗透剂基于协同作用组分的组合。许多这样的渗透剂基于醇诸如苄醇和存在于渗透剂中的卵磷脂有机凝胶的组合，所述醇提供最终制剂的0.5-20％w/w的浓度，所述存在于渗透剂中的卵磷脂有机凝胶提供制剂的25-70％w/w。典型地，这些制剂是基本上极性的，例如水性制剂，其包含足够的非离子型表面活性剂以便以最终制剂的1-25％w/w存在，以及过量的极性溶剂；或者可选择地是无水制剂，其中渗透剂的另外的组分包括提供制剂的1-15％w/w的足够的胆盐和存在以提供制剂的20-60％w/w的表面活性剂。当抗转移剂是缓冲剂时，这些渗透剂也是有用的，但可能需要更少的卵磷脂有机凝胶–例如，当缓冲剂以高浓度存在时，需要按重量计1-50％。虽然以卵磷脂为例，但也可以使用其他两性离子。
[0042] 可选择地或另外地，渗透剂是这样的，使得所得到的制剂包含胆盐:卵磷脂和补足组分(completion component)的约1:1:1等摩尔混合物以及足以赋予粘度和粘弹性的一种或更多种电解质、一种或更多种表面活性剂和苄醇或其类似物。补足组分可以是极性液体、非极性液体或两亲性物质；然而，两亲性物质是高度优选的。
[0043] 关于这种类型的组合物的行为，特别是在水性溶剂中的行为的细节公开在Chen,C-Y,等人,Langmuir(2014)30:10224-10230中，对于其制备用于活性剂的经皮施用的有利胶束组合物的方法的公开内容具体地通过引用并入本文。如所描述的，卵磷脂和胆盐以约1:1摩尔比的混合物，并且特别是在电解质的存在下，在水中形成稳定的粘性蠕虫状胶束。
这些胶束有助于实现活性剂特别是高分子量的剂跨过皮肤的转移。虽然1:1的摩尔比是最佳的，但申请人已经发现从该理想值的变化是可行的–即当上文描述的“1:1:1”体系中的补足组分是脂肪酸酯诸如棕榈酸异丙酯时，从1:0.5至1:5。因此，“约1:1:1摩尔比”指的是该范围。
这些胶束有助于实现活性剂特别是高分子量的剂跨过皮肤的转移。虽然1:1的摩尔比是最佳的，但申请人已经发现从该理想值的变化是可行的–即当上文描述的“1:1:1”体系中的补足组分是脂肪酸酯诸如棕榈酸异丙酯时，从1:0.5至1:5。因此，“约1:1:1摩尔比”指的是该范围。
[0044] 在任何情况下，渗透剂还可以包括有效地减少硫醇连接、破坏氢键合和/或影响角蛋白溶解的角蛋白溶解剂(keratinolytic agent)和/或细胞渗透肽(有时被称为皮肤渗透肽)和/或渗透增强剂。如上文所列出的另外的组分可以被包含在提供最终制剂的0.5-20％苄醇和25-70％w/w的卵磷脂有机凝胶的渗透剂中，以及被包含在包含足够的胆盐:卵磷脂:补足组分以向制剂提供这些物质的1:1:1等摩尔比的上述渗透剂中。
[0045] 在向完整的皮肤局部地施用的可选择方案中，皮肤的表面也可以通过使用弹簧系统、激光动力系统、由洛伦兹力或由气体或冲击波(包括超声波)推动的系统，并且可以使用微晶磨皮术(microdermabrasion)，诸如通过使用砂纸或其等同物或使用微针或电穿孔装置而被机械地破坏。渗透完整的皮肤的剂的简单溶液以及上文列出的制剂可以使用封闭贴片来应用，诸如呈微贴片形式的那些贴片。也可以使用用于延长施用的制剂的外部储库。
[0046] 活性缓冲剂组分是将在肿瘤细胞的微环境中导致7-8的pH的任何温和的碱性化合物或组合。除了碳酸氢盐之外或代替碳酸氢盐的这样的缓冲剂包括赖氨酸缓冲剂、氯乙酸盐缓冲剂、tris缓冲剂(即，使用三(羟甲基)氨基乙烷的缓冲剂)、磷酸盐缓冲剂和使用与赖氨酸具有类似的pKa值的非天然氨基酸的缓冲剂。例如，这些可以是这样的氨基酸的天然形式的对映异构体或者具有较长碳链或较短碳链的赖氨酸的类似物或其支链形式。还可以使用组氨酸缓冲剂。典型地，组合物中缓冲剂的浓度在1-40％wt/wt的范围内。碳酸氢钠或碳酸钠或两者作为pH调节剂的更典型的范围是按重量计5-35％。在这些浓度下缺乏炎症副作用是令人惊讶的，如在使用较低的浓度以治疗其他状况，诸如关节炎的US 5,176,918中注意到的。
[0047] 在所有前述情况下，可以使用另外的抗癌组分，例如化疗剂，诸如伊立替康、氟尿苷、柔红霉素、阿糖胞苷以及类似物。
[0048] 如上文所述，应理解，一些肿瘤对于用缓冲剂治疗没有响应，但由于攻击肿瘤周围的细胞外基质的蛋白酶的升高的水平而明显地转移。无论如何，ECM的分解将促进转移。因此，任选地被包含在本发明的组合物中的另外的活性剂是一种或更多种适当的蛋白酶抑制剂。特别重要的是组织蛋白酶的抑制剂，例如组织蛋白酶B的抑制剂和基质金属蛋白酶(MMP)的抑制剂。这些组分单独是有活性的，或者增强缓冲剂对于对缓冲剂治疗不具有抗性肿瘤的效果。
[0049] 另一种活性剂是醉茄素A。醉茄素A抑制肿瘤转移并且显现出其他抗癌活性，例如，抑制与癌症相关的新血管形成以及细胞增殖。醉茄素A也是具有强的抗糖尿病性质的瘦素敏化剂，其可以诱导健康的体重减轻和对葡萄糖代谢的有益效果。
[0050] 除了直接缓冲以调节pH之外，不利的细胞外pH问题可以使用可以是抗转移剂的靶的可选择的靶DNA+/H+交换剂1(NHE1)蛋白来解决。其他抗转移剂包括含src同源区2的蛋白酪氨酸酶磷酸酶(Shp2)的抑制剂。已知该活性的多种抑制剂，包括Fumosorine、PHPS(NSC-87877)和NSC-117199、苯腙基吡唑啉酮磺酸盐(PHPS1)、DCA、隐丹参酮、11-B08和#220-324、金属蛋白酶-2和金属蛋白酶-9(MMP-2和MMP-9)以及某些组织蛋白酶，特别是组织蛋白酶B、组织蛋白酶D和组织蛋白酶L。
[0051] 其他剂包括上皮钙黏着蛋白(E-cadherin)的抑制剂和表皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂。已知的抑制剂包括埃罗替尼、抗整合素药物(西仑吉肽)、卡立泊来德、依泊来德和阿米洛利。
[0052] 制剂可以包含充当赋形剂或用于除活性抗肿瘤作用外的目的的其他组分。例如，可以包含防腐剂如抗氧化剂，例如抗坏血酸或α-硫辛酸，以及抗菌剂。除了治疗活性成分和作为皮肤渗透的主要效应物的组分之外的其他组分可以包括为美学目的提供的那些组分，诸如薄荷醇或其他芳香剂，以及影响组合物的物理状态的组分，诸如乳化剂，例如(其是热塑性聚氨酯和聚碳酸酯的混合物)。典型地，这些成分以组合物的非常小的百分比存在。应理解，这些后一类的辅助剂既不是治疗成分，它们也不是主要负责渗透皮肤的组分。主要影响皮肤渗透的组分已经被详细描述，如上文所描述的。然而，这些物质中的一些具有一定的影响皮肤渗透的能力。参见，例如，Kunta,J.R.等人,J.Pharm.Sci.(1997)86:1369-1373，其描述了薄荷醇的渗透性质。也就是说，它们在可用于本发明的制剂中的存在不是实现活性剂的经皮运输所需的，并且它们可以从制剂中省略。
[0053] 在一些实施方案中，用于经皮施用的最终制剂可以呈胶束组合物的形式。典型的胶束尺寸在10-100nm的范围内。用于提供胶束形式的方法在本领域中是已知的。胶束形成由能够进行胶束形成的组分的适当水平以及机械搅拌的运用来促进。(参见Cheng,C-Y等人(2014)上述)。用于促进胶束形成的各种装置是商业上可获得的。
[0054] 例如，通过碾磨来增强胶束的形成。增强的水平由碾磨发生的压力和速度以及通过磨机的次数来确定。随着通过的次数以及速度和压力增加，胶束制剂的水平提高。
[0055] 当磨机是 销售的Dermamill 100(Blaubrite)时，典型的速度包括在1至100之间的任何变化，其中1是最慢的，并且100是最快的。压力选自1至5，其中1是最高的，并且5是最低的。在一些实施方案中，预期了多次通过，例如2-10次或更多次通过。中间值也被包括。对于每次通过，速度和压力可以变化。
[0056] 也可以使用可选择的磨机，并且通过与Dermamill 100上的等同物进行比较，来重复可比较的速度、压力和通过的次数。可选择地，胶束密度可以在显微镜下进行比较，以确保与用Dermamill 100获得的那些结果等同的结果。在一些实施方案中，胶束密度是至少20％，并且在许多情况下胶束密度是至少30％或更大。
[0057] 典型地，胶束的尺寸在纳米范围内–例如，10-150nm，包括中间值。
[0058] 制剂的这种形式在含有胆盐的那些制剂中是特别重要的。在其中将胆盐添加至苄醇和卵磷脂有机凝胶的组合中而不是用水性介质补足(topping off)的实施方案中，本来相对球形的胶束可以变得细长和蠕虫状，由此允许更好地渗透表皮的角质层。胶束的蠕虫状形成特别有助于容纳较高分子量的治疗剂。如所已知的，胆盐是表面两亲物(facial amphiphiles)，并且包括牛磺胆酸(taurocholic acid)、甘氨胆酸(glycocholic acid)、牛磺鹅脱氧胆酸(taurochenodeoxycholic acid)、甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid)、胆酸、脱氧胆酸的盐。除垢剂也可用于代替胆盐，并且包括 80和80。
[0059] 胆盐的包括因此促进胶束的超变形性，这转而促进低分子量药物和高分子量药物以及其他活性剂诸如核酸和蛋白质的通过。这些组合物通过沿着细胞间密封脂质挤压自身由此遵循跨过角质层的自然梯度，来克服皮肤渗透屏障。当被压靠或吸引至窄孔时，这有助于局部地和可逆地改变膜组成。
[0060] 因此，与卵磷脂有机凝胶组合的胆盐促进了在经皮药物递送中至关重要的胶束稳定性、增强的粘度和粘弹性的因素。热力学稳定性和动力学稳定性两者通过添加背景电解质诸如氯化钠和柠檬酸钠被增强。这些电解质可以更有效地增加胶束的粘度和粘弹性，并且以最小浓度屏蔽(screen)胆盐阴离子之间的排斥。
[0061] 在一些实施方案中，胆盐与卵磷脂的摩尔比是1:1，并且电解质的浓度通过将溶液滴定至透明和如当溶液容器被倒置时所确定的增强的粘度来确定。
[0062] 被设计成用于活性成分特别是缓冲剂和其他治疗有效化合物以及任何辅助组分的经皮施用的制剂可以以各种已知的方案来测试它们的性质以及它们在实现跨过皮肤的运输中的有效性。例如，胶束形成的水平可以通过在商业上可获得的流变仪(rheometrics)RDA-3应变受控流变仪上的流变学研究来确定。在来自暴露于渗透组合物的受试者的皮肤中细胞外基质的胶原和蛋白聚糖组分的水平可以用组织学方法来测量，例如使用H&E和阿尔西亚蓝(Alician blue)。皮肤模型已经使用人类来源的表皮角质形成细胞被制备为三维构建体，并且在正常人类来源的真皮成纤维细胞上培养，以创建人类真皮和表皮的多层高度分化的模型。失水测量也可以是相关的，并且这些可以使用Cortex Technology,Hadsun,Denmark销售的商业上可获得的dermalab蒸发测量系统来测量。胶原信息水平也可以使用标准技术来测量，并且人类表皮的渗透性可以通过确定电导率来测量。监测暴露于各种制剂的皮肤的电导率将确定在增加渗透性方面最有效的制剂。示踪剂元素诸如铜和铁也可以用于确定渗透的有效性，穿过皮肤层的组分的色谱分析也可以用于确定渗透的有效性。
[0063] 仅用于说明，以下是针对细胞外基质的综合协同CPE制剂(integrative cooperative CPE formulation)的实例。
[0064] –鲸蜡基三甲基溴化铵(从约2.0％至约10.0％)
[0065] –胆酸钠:卵磷脂(96％纯):肉豆蔻酸异丙酯(等摩尔1:1:1，从约10％至约40.0％)[0066] –柠檬酸钠(滴定至透明/#2的增量粘度)
[0067] –苄醇(从约2.0％至约30.0％)
[0068] –顺式棕榈油酸(BA的从约20.0％至约30％)
[0069] –甲基吡咯烷酮(0.4％)/十二烷基吡啶鎓(1.1％)(从约0.5％至约5.0％)[0070] –Pluronic 127(qs至100％)
[0071] 针对SC渗透性屏障的细胞组分的CPP制剂的实例是：
[0072] –ACSSSPSKHCG，[丙氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-丝氨酸-丝氨酸-脯氨酸-丝氨酸-赖氨酸-组氨酸-半胱氨酸-甘氨酸]，标识为TD-1
[0073] –巯基乙酸(TGA)(从约2.0％至约7.0％浓度)[可以被其他还原剂替代][0074] –蛋白酶K(从约5mg/mL至约15mg/mL)
[0075] 本发明的包括施用缓冲剂以便在实体瘤的环境或在痛风或黄褐斑附近局部地升高pH的方面，扩展了本发明的方法适用的适应症。已经发现，一般来说，在缓冲剂作为活性剂的情况下，对皮肤的有效渗透的要求不如对可用于预防癌症转移的可选择的剂需要的那些要求严格。虽然上文详细地描述的渗透剂是有用的，但在这些情况下，更宽浓度范围的例如卵磷脂有机凝胶是有效的。在一些情况下，包含除了有机凝胶中的卵磷脂之外的额外的卵磷脂。此外，尽管对于这些适应症，递送至实体瘤(包括黑素瘤)或黄褐斑或痛风的位置是期望的，但当采用局部施用时，有效的全身性pH改变可以被用作诊断渗透有效性的方式。因此，在下文实施例中的一些中，在诸如小鼠的模型系统中尿的pH的升高可以用于验证制剂中的渗透剂的有效性，尽管对pH的影响期望地局限于肿瘤、黄褐斑或痛风。
[0076] 以下实施例意图说明本发明而不是限制本发明。
[0077] 实施例1
[0078] 用于缓冲剂的施用的特定制剂
[0079] 已经制备了以下组合物，并且发现它们可用于本发明的方法中。在下表中，“LIP”表示卵磷脂有机凝胶，其包含含有96％磷脂酰胆碱的大豆卵磷脂和棕榈酸异丙酯的1:1摩尔混合物；“BA”表示苄醇；PLU-F127表示除垢剂泊洛沙姆F127颗粒；PLU-水表示溶解在去离子水中的PLU-F127。(可选择地，可以使用商业上可获得的Pluronic F127 30％凝胶)并且是商业上可获得形式的乳化剂。
[0080] 在下表中，碳酸氢钠和碳酸钠按原样提供。使用pH 8.1的Tris缓冲液。磷酸盐“缓冲剂”以NaH2PO4提供。百分比是wt/wt，即，重量百分比。
[0081] 表1-碳酸氢盐制剂
[0082] IB IIBLIP 30.00％ 25.00％
乙醇 1.50％ 0.00％
BA 1.00％ 1.00％
薄荷醇 0.50％ 0.90％
碳酸氢钠 33.50％ 5.76％
PLU-F127 10.05％ 10.50％
具有PLU的凝胶中的水 23.45％ 24.50％
另外的水 30.34％
Durasoft 2.00％
总计 100.00％ 100.00％
乙醇 1.50％ 0.00％
BA 1.00％ 1.00％
薄荷醇 0.50％ 0.90％
碳酸氢钠 33.50％ 5.76％
PLU-F127 10.05％ 10.50％
具有PLU的凝胶中的水 23.45％ 24.50％
另外的水 30.34％
Durasoft 2.00％
总计 100.00％ 100.00％
[0083] 表2-碳酸盐制剂
[0084]
[0085] 表3-Tris制剂
[0086] IT IIT IIIT IVTLIP 25.00％ 25.00％ 30.00％ 38.40％
乙醇 0.00％ 0.00％ 1.50％ 1.50％
BA 1.00％ 1.00％ 1.00％ 1.00％
薄荷醇 0.90％ 0.90％ 0.50％ 0.50％
TRIS缓冲液，pH 8.1 13.37％ 23.00％ 33.50％ 14.93％
PLU-F127 10.50％ 10.00％ 10.05％ 12.80％
具有PLU的凝胶中的水 24.50％ 23.33％ 23.45％ 29.87％
另外的水 22.73％ 15.77％ 0.00％ 0.00％
Durasoft 2.00％ 1.00％ 0.00％ 1.00％
总计 100.00％ 100.00％ 100.00％ 100.00％
乙醇 0.00％ 0.00％ 1.50％ 1.50％
BA 1.00％ 1.00％ 1.00％ 1.00％
薄荷醇 0.90％ 0.90％ 0.50％ 0.50％
TRIS缓冲液，pH 8.1 13.37％ 23.00％ 33.50％ 14.93％
PLU-F127 10.50％ 10.00％ 10.05％ 12.80％
具有PLU的凝胶中的水 24.50％ 23.33％ 23.45％ 29.87％
另外的水 22.73％ 15.77％ 0.00％ 0.00％
Durasoft 2.00％ 1.00％ 0.00％ 1.00％
总计 100.00％ 100.00％ 100.00％ 100.00％
[0087] 表4-磷酸盐制剂
[0088] IP IIP IIIP IVPLIP 25.00％ 25.00％ 30.00％ 37.25％
乙醇 0.00％ 0.00％ 1.50％ 1.50％
BA 1.00％ 1.00％ 1.00％ 1.00％
薄荷醇 0.90％ 0.90％ 0.50％ 0.50％
磷酸一钠 16.02％ 27.55％ 33.50％ 17.36％
PLU-F127 10.50％ 10.00％ 10.05％ 12.42％
具有PLU的凝胶中的水 24.50％ 23.33％ 23.45％ 28.97％
另外的水 20.08％ 11.22％ 0.00％ 0.00％
Durasoft 2.00％ 1.00％ 0.00％ 1.00％
总计 100.00％ 100.00％ 100.00％ 100.00％
乙醇 0.00％ 0.00％ 1.50％ 1.50％
BA 1.00％ 1.00％ 1.00％ 1.00％
薄荷醇 0.90％ 0.90％ 0.50％ 0.50％
磷酸一钠 16.02％ 27.55％ 33.50％ 17.36％
PLU-F127 10.50％ 10.00％ 10.05％ 12.42％
具有PLU的凝胶中的水 24.50％ 23.33％ 23.45％ 28.97％
另外的水 20.08％ 11.22％ 0.00％ 0.00％
Durasoft 2.00％ 1.00％ 0.00％ 1.00％
总计 100.00％ 100.00％ 100.00％ 100.00％
[0089] 表5-碳酸盐、TRIS、磷酸盐组合制剂
[0090]
[0091]
[0092] 表6–可选择的缓冲剂
[0093]
[0094] 表7-无水制剂
[0095]
[0096]
[0097] 实施例2
[0098] 碳酸氢盐的局部施用
[0099] 24只NCR裸5周龄雄性小鼠用于本研究，分成四组，每组6只小鼠。将局部组合物每天三次从臀部到肩部施加至每只小鼠的背部持续连续8天，总计24次施加。对照组通过口施用在水中的碳酸氢钠。所述组如下：
[0100]组1.在H2O中的碳酸氢钠
组2.经皮碳酸氢盐剂量#1(30μL)(10μLx3剂)
组3.经皮碳酸氢盐剂量#2(220μL)(73μL x3剂)
组4.经皮碳酸氢盐剂量#3(1110μL)(2x185μLx3剂)
组2.经皮碳酸氢盐剂量#1(30μL)(10μLx3剂)
组3.经皮碳酸氢盐剂量#2(220μL)(73μL x3剂)
组4.经皮碳酸氢盐剂量#3(1110μL)(2x185μLx3剂)
[0101] 经皮制剂包含渗透剂，以导致如下制剂：LIP-30.0％，EtOH-1.5％，BA-1.0％，薄荷醇-0.5％，碳酸氢钠-33.5％，PLU-F127-10.1％，PLU-水-23.5％；即，表1中的制剂IB。对照组中碳酸氢钠的浓度是200mM，并且消耗是随意的。经皮制剂中碳酸氢钠的浓度是33.5％wt/wt。
[0102] 尿样品在第一次药物施加之后1小时、3小时和6小时收集，并且储存在4℃用于随后的pH确定。在第2-12天，每天两次地收集尿—在第一次施加之前，和在最后一次施加之后15分钟。在第8天在最后一次药物施加之后1小时处死小鼠，并且收获背部皮肤并且放置在吸水纸上。
[0103] 为了在不给药的情况下设定pH的基线，在开始方案之前，在单日期间在三个时间点在0900在7只小鼠中、在1300在5只小鼠中以及在1630在4只小鼠中测量尿pH。尿的pH具有5.57的总平均值，该值在该时间段内没有变化。
[0104] 如图1所示，在治疗的前6个小时，所有组均显示出尿pH的增加。最显著的增加发生在施用220微升的制剂的组3中。
[0105] 尽管该研究被设计成进行持续两周(周一至周五)，但由于组2(1,110微升)的成员发展了皮肤刺激，该研究在第8天后终止；即使在接受30微升的低剂量组(即组2)中也显示了这一点。
[0106] 图2示出了在8天研究的进程中的尿pH值。尽管存在一些变化，但接受最高剂量的组(组4)能够在研究的进程中维持高的pH。
[0107] 使用表6中的制剂25、制剂28和制剂29重复研究，结果在表8中示出，并且使用表7中的制剂重复研究，结果在图3中示出。
[0108] 表8-在第一天的两个收集时间点和总计的平均尿pH。
[0109] 尿1 尿2 总计SB水 6.30 6.03 6.15
25 6.36 6.77 6.62
28 6.92 6.86 6.89
29 6.82 7.31 6.97
25 6.36 6.77 6.62
28 6.92 6.86 6.89
29 6.82 7.31 6.97
[0110] 如所示出的，经皮施用比口服施用更有效。
[0111] 实施例3
[0112] 人类的经皮吸收
[0113] 18-60岁的健康人类受试者被纳入双盲的、安慰剂对照的、随机的且交叉设计的研究。每个随机化组的受试者被施加0.6g/kg体重的表9的制剂，如下：从脚踝到大腿顶部的腿；从手腕到肩膀(包括三角肌)的手臂或在15分钟、1小时15分钟、2小时15分钟、3小时15分钟饮用0.13盎司的水/kg体重(对于140磅受试者，相当于约8盎司)，以控制尿的稀释。
[0114] 表9
[0115] LIP 30.0％乙醇 1.5％
BA 1.0％
薄荷醇(或亲脂性的柠檬烯) 0.5％
碳酸氢钠 33.5％
PLU-F127 10.1％
PLU-水 23.5％
BA 1.0％
薄荷醇(或亲脂性的柠檬烯) 0.5％
碳酸氢钠 33.5％
PLU-F127 10.1％
PLU-水 23.5％
[0116] 从施加的开始时间以每小时的间隔(在1小时、2小时、3小时和4小时)，受试者被收集10-20ml(约一汤匙)的尿并且确定pH。结果在表10中示出。
[0117] 表10-对于每个治疗和时间点的平均尿pH值
[0118]
[0119] 没有显示出不良作用，并且经皮制剂的表现优于口服施用。
[0120] 实施例4
[0121] 人类痛风的治疗
[0122] 对于减轻与急性痛风发作(acute gout flare)相关的疼痛的局部碱化治疗的功效和安全性进行了随机的、双盲的、安慰剂对照的研究，以确定局部施加在经皮递送系统中碳酸氢钠和薄荷醇是否可以有效地且安全地减轻与急性痛风发作相关的疼痛，以及缓解的时间是否被缩短。
[0123] 将40名过去具有痛风病史并且在临床上呈现在36小时内开始的痛风发作并且已经被开出秋水仙素的18+岁受试者随机分成20人的组。
[0124] 所使用的制剂在表11中示出。
[0125] 表11-痛风制剂
[0126]成分 对照 活性
薄荷醇 0.00％ 0.50％
乙醇 1.50％ 1.50％
苄醇 1.00％ 1.00％
鲸蜡醇 2.00％ 2.00％
杏仁油 3.00％ 3.00％
卵磷脂 10.00％ 7.00％
IPP 10.00％ 7.00％
丙二醇 5.00％ 5.00％
泊洛沙姆/Pluronic粉末 9.00％ 5.40％
水 57.50％ 33.60％
碳酸氢钠 0.00％ 33.00％
Durosoft PK-SG 1.00％ 1.00％
100.00％ 100.00％
薄荷醇 0.00％ 0.50％
乙醇 1.50％ 1.50％
苄醇 1.00％ 1.00％
鲸蜡醇 2.00％ 2.00％
杏仁油 3.00％ 3.00％
卵磷脂 10.00％ 7.00％
IPP 10.00％ 7.00％
丙二醇 5.00％ 5.00％
泊洛沙姆/Pluronic粉末 9.00％ 5.40％
水 57.50％ 33.60％
碳酸氢钠 0.00％ 33.00％
Durosoft PK-SG 1.00％ 1.00％
100.00％ 100.00％
[0127] 受试者每天三次向每个受影响关节的整个肢体施加10ml的对照霜或活性霜。一个确定的“靶关节”和高达2个另外的关节被跟踪。
[0128] 受试者报告了如使用11分制量表所测量的关节疼痛(0-10，其中0作为“无疼痛”，并且10作为“可能的最严重的疼痛”)。活性组(两名受试者)的靶关节的疼痛的减轻在30分钟和24小时之后均为-3.0分，并且在4天和6天时为-3.5分。对照组中的受试者在30分钟和2天时未显示出减轻，并且在24小时之后和在4天和6天时仅减轻-1分。活性组的第二关节的疼痛的最大减轻为-2分，相对地对照组的疼痛减轻较少或没有减轻。
[0129] 早在产品施加之后15分钟，就观察到与活性产品使用相关的疼痛的减轻。
[0130] 实施例5
[0131] 人类黄褐斑的治疗
[0132] 进行了随机的、双盲研究，评估氨甲环酸(Tranexamic Acid)在经皮递送系统中单独或与皮肤更新剂(turnover agent)一起用于改善黄褐斑，以评估以下的功效和安全性：1)氨甲环酸(TA)，2)TA和5％乙醇酸(GA)以及3)与视黄酸(RA)组合使用的TA以对照黄褐斑的改善。包括对照在内的所有制剂都是碱性的。所使用的制剂在表12中示出。
[0133] 表12-黄褐斑制剂
[0134]
[0135] 36名18-65岁患有中度至重度黄褐斑的女性被分成每组12人的组，并且受试者每天在黄褐斑的部位施加两次制剂。所述组如下：组1：对照；组2：氨甲环酸(TA)6％制剂；组3：TA 6％+乙醇酸5％(GA)组合制剂；组4：TA 6％制剂和视黄酸0.25％(RA)(单独的产品，在RA之前立即施加TA)。
[0136] 结果测量是通过标准化2D摄影，5视角-正面、45度和90度进行的，并且包括与基线相比的盲的研究者总体改善评估(Investigator Global Assessment of Improvement)；与基线相比的受试者自我改善评估和VISIA系统摄影(一个部位)。还评估了不良事件。
[0137] 随访是在2周、4周、8周和12周通过3天的电话和拜访来进行的。在包括对照的所有这些组中，50％-65％的受试者在30天之后通过独立评估和自我评估两者显示出色素的减少。与组2相比，对于组3和组4，结果总体上被改善–在30天的独立评估中发现，组2的受试者中的50％被改善，并且组3和组4中分别有60％和65％的受试者被改善。(自我评估结果示出了小的差异，全部在约60％)。
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